IT202000021130A1

IT202000021130A1 - Processo per ottenere un estratto comprendente oleosomi da pasta di olive

Info

Publication number: IT202000021130A1
Application number: IT102020000021130A
Authority: IT
Inventors: Isidoro Garella; Federica Nigro
Original assignee: I T P S R L Innovation & Tech Provider
Priority date: 2020-09-07
Filing date: 2020-09-07
Publication date: 2022-03-07
Also published as: EP3967156A1

Description

PROCESSO PER OTTENERE UN ESTRATTO

COMPRENDENTE OLEOSOMI DA PASTA DI OLIVE

Campo dell?Invenzione

La presente invenzione riguarda in generale il campo dei processi di estrazione di sostanze da prodotti naturali, e pi? precisamente si riferisce a un processo per l?estrazione di oleosomi, utili come emulsionanti in preparazioni alimentari, cosmetiche e/o farmaceutiche, a partire dalla pasta di olive.

Stato dell?Arte

Con il termine oleosomi, o oil bodies in Inglese, si identificano quelle strutture contenenti lipidi, presenti nelle cellule vegetali, in particolare nei semi ma anche in altre parti delle piante, incluse foglie e frutti. Si tratta di particelle sferiche, che consistono principalmente di triacilgliceroli circondati da uno strato di fosfolipidi nel quale si trovano immerse delle proteine dette oleosine ed altri composti come il tocoferolo; i fosfolipidi sono disposti con le code lipofile verso l?interno e le teste polari verso l?esterno creando cos? una vera e propria membrana all?interno della quale le oleosine contribuiscono a mantenere gli oleosomi separati gli uni dagli altri, in forma di strutture subcellulari distinte, come fossero goccioline, una vera e propria emulsione naturale olio-in-acqua.

I triacilgliceroli contenuti all?interno degli oleosomi sono costituiti da una porzione caratteristica di glicerolo in cui ciascun gruppo idrossile ? esterificato ad acido grasso. Mentre la struttura del triacil glicerolo ? sempre la stessa, gli acidi grassi ad essa attaccati cambiano a seconda della pianta, e in particolare pu? cambiare il loro grado di insaturazione, ossia di doppi legami, che si ripercuote poi sulle caratteristiche chimicofisiche dell?olio o degli oleosomi estratti dalla pianta e anche sul loro valore nutrizionale. Tanto maggiore ? la percentuale di grassi insaturi, che notoriamente favoriscono la formazione del colesterolo HDL e proteggono verso i radicali liberi, rispetto a quelli saturi, associati invece al rischio di malattie cardiovascolari, e tanto maggiore sar? il valore nutrizionale dell?olio. In questo senso l?olio vegetale pi? apprezzabile ? l?olio extravergine di oliva, per la sua elevata percentuale di acido oleico e di altri acidi grassi insaturi.

Gli oleosomi rappresentano per la pianta una vera e propria riserva lipidica, utilizzata come fonte di energia chimica dalla pianta nei periodi di metabolismo attivo, ad esempio durante la germinazione dei semi, quando si innesca un meccanismo di degradazione dei lipidi e di conversione in saccarosio mediante processi ossidativi ed idrolitici. Una degradazione degli oleosomi, e dunque dei lipidi in essi contenuti, pu? verificarsi anche quando le piante o loro parti contenenti oleosomi sono sottoposte a lavorazioni che danneggiano le strutture degli oleosomi sopra descritte. In condizioni normali, in vivo, gli oleosomi sono invece strutture stabili, in cui tutte le sostanze in essi contenute non si degradano.

Tipicamente, quando si vuole ricavare un olio vegetale da semi o da altre parti di una pianta che ne sono ricche, si applicano processi di estrazione in cui semi o frutti sono macinati e lavorati a tal punto da distruggere le strutture oleosomiche. Quindi gli olii estratti non conterranno pi? gli oleosomi con la loro qualit? di emulsioni naturali, ma componenti lipidiche pi? o meno trasformate, che avranno anche perso quella stabilit? all?ossidazione che le caratterizzava all?interno degli oleosomi.

La possibilit? di estrarre da fonti vegetali le componenti lipidiche ancora all?interno della struttura naturale intatta rappresentata dagli oleosomi ? gi? stata oggetto di diversi studi, allo scopo di poter sfruttare la capacit? emulsionante naturale degli oleosomi quando miscelati con composti acquosi, anche in assenza di altri emulsionanti e a temperatura ambiente. Nella domanda di brevetto Internazionale pubblicata con il N. WO2007/115899 ad esempio ? stato descritto un metodo per ottenere oleosomi da semi oleaginosi di varie piante, come semi di girasole o arachidi, macinando i semi, eliminando i solidi ed eseguendo lavaggi estrattivi con diversi soluzioni tampone a pH diverso. ? stata inoltre descritta in letteratura la possibilit? di caricare gli oleosomi cos? estratti da fonti vegetali con ingredienti attivi dal punto di vista farmaceutico o cosmetico, per formulare vaccini o nelle preparazioni alimentari industriali come agenti emulsionanti.

Le applicazioni degli oleosomi come agenti emulsionanti possono essere in effetti le pi? varie, dalla preparazione di emulsioni alimentari stabili alla formulazione di ingredienti attivi insolubili in acqua, come certe vitamine o nucleotidi, in emulsioni cosmetiche o farmaceutiche. In particolare per quel che riguarda il settore alimentare ? evidente come la composizione dei lipidi all?interno degli oleosomi abbia un peso sulla qualit? del prodotto finale. In altre parole, la sostituzione dei tradizionali additivi emulsionanti come lecitine o carragenine, spesso accusati di scatenare intolleranze o disturbi gastro-intestinali, con gli oleosomi, non avrebbe solo il vantaggio di migliorare la tollerabilit? del prodotto, ma potrebbe contribuire all?apporto di sostanze nutrizionali di maggior valore, quali acidi grassi insaturi, se gi? naturalmente presenti negli oleosomi.

Data la sempre maggiore attenzione alla qualit? delle preparazioni alimentari e l?aumentata sensibilit? dei consumatori per la naturalit? dei prodotti insieme alla richiesta di cibi funzionali, con un effetto positivo sull?organismo, ? pertanto sentita nel settore l?esigenza di poter disporre come additivi alimentari di emulsionanti di origine naturale che mantengano le caratteristiche organolettiche di un prodotto naturale di partenza come l?oliva, ricca di polifenoli e flavonoidi oltre all?elevata percentuale di acidi grassi insaturi. Alla luce di quanto spiegato sopra, a tale scopo ? necessario poter disporre di un processo in grado di estrarre oleosomi intatti dal prodotto di partenza, che ne mantenga le propriet? organolettiche e nutrizionali, senza trascurare la semplicit? e scalabilit? a livello industriale del processo.

Sommario dell'invenzione

Ora la Richiedente ha messo a punto un processo per ottenere un estratto ricco di oleosomi a partire dalla pasta di olive, che risolve le problematiche descritte sopra per i processi noti, grazie all?impiego di una particolare soluzione tampone, ed ha le caratteristiche descritte in dettaglio nel seguito.

In particolare, il processo di estrazione di questa invenzione consente di ottenere un estratto dalle propriet? organolettiche migliorate rispetto ai prodotti ottenibili con i processi noti, in particolare oleosomi aventi un elevato contenuto di polifenoli e di flavonoidi, che contribuiscono ad un migliorato potere antiossidante dell?estratto che ha mostrato inoltre una elevata stabilit? fisica, chimica e microbiologica.

Allo stesso tempo, il processo di estrazione di questa invenzione ? scalabile industrialmente, pi? semplice rispetto ai processi noti fino ad oggi utilizzati ma allo stesso tempo capace di fornire oleosomi con rese pi? elevate.

Rappresenta pertanto oggetto dell'invenzione un processo per ottenere un estratto comprendente oleosomi a partire da pasta di olive, le cui caratteristiche essenziali sono definite nella prima delle rivendicazioni annesse.

Ulteriore oggetto dell?invenzione ? l?estratto comprendente oleosomi ottenibile con il suddetto processo, le cui caratteristiche essenziali sono definite dalla rispettiva rivendicazione indipendente qui annessa.

Ancora un ulteriore oggetto dell?invenzione ? l?uso del suddetto estratto come additivo, in particolare come agente emulsionante, in un prodotto alimentare, cosmetico e/o farmaceutico, e il prodotto alimentare, cosmetico e/o farmaceutico che li comprende, le cui caratteristiche essenziali sono definite nelle rispettive rivendicazioni indipendenti qui annesse.

Altre importanti caratteristiche del processo di estrazione, dell?estratto, del suo uso e dei prodotti alimentari, cosmetici o farmaceutici che lo comprendono quale additivo, secondo l'invenzione sono riportate nella seguente descrizione dettagliata e definite nelle rivendicazioni dipendenti qui annesse.

Breve Descrizione delle Figure

Figura 1: immagine al microscopio di un estratto ottenuto con il processo dell?invenzione come descritto nell?Esempio 2 pi? avanti riportato; la freccia indica una struttura oleosomica.

Figura 2: immagine al microscopio dell?estratto di Figura 1 dopo aver sottoposto il vetrino da microscopio al riscaldamento a 50?C (a), a 100?C (B), a 150?C (c) e a 200?C (d); la freccia indica la medesima struttura oleosomica gi? indicata in Figura 1.

Figura 3: istogramma che mostra la variazione con la temperatura delle distribuzioni dimensionali D10, D50 e D90 degli oleosomi presenti nell?estratto dell?invenzione preparato come in Esempio 2.

Figura 4: andamento della viscosit? vs. velocit? di taglio per i tre prodotti indicati, estratto fresco contenente oleosomi preparato come in Esempio 2 (?); estratto contenente oleosomi dopo 10 giorni a 4?C (?); e maionese commerciale come controllo positivo (?).

Figura 5: curva di Stribeck per gli stessi tre prodotti testati in Figura 4, ottenuta come descritto nella parte sperimentale che segue.

Descrizione dettagliata dell'invenzione

Nel processo di questa invenzione il prodotto di partenza utilizzato ? la pasta di olive, un intermedio nella produzione dell?olio di oliva ottenuta dalla spremitura delle olive. Per quanto a conoscenza della Richiedente questo prodotto non ? mai stato utilizzato finora per estrarre oleosomi; i processi di estrazione dello stato dell?arte volti ad ottenere oleosomi partono infatti da semi oleaginosi.

Nell?ambito della presente invenzione, quando non altrimenti specificato, le percentuali in peso di un componente si intendono riferite al peso totale della composizione.

Oggetto di questa invenzione ? un processo per ottenere un estratto comprendente oleosomi a partire da pasta di olive, comprendente le seguenti fasi: i) macinazione ad umido di pasta di olive;

ii) separazione e recupero della fase oleosa del prodotto macinato;

iii) estrazione di detta fase oleosa con una soluzione tampone acquosa;

iv) separazione e recupero dell?estratto;

detto processo essendo caratterizzato dal fatto che detta soluzione tampone acquosa ha pH compreso tra circa 5.0 e circa 7.0, preferibilmente pH pari a circa 6.0, e densit? compresa tra circa 1.2 e circa 1.5 g/L, preferibilmente densit? pari a circa 1,4 g/L.

Le fasi di separazione ii) e iv) nel presente processo possono essere ad esempio condotte mediante centrifugazione e semplice recupero della fase oleosa per le successive lavorazioni.

In una forma realizzativa preferita del processo di questa invenzione, la fase di macinazione ad umido della pasta di olive ? preceduta da un pre-trattamento di crioconcentrazione, ossia di congelamento della pasta, ad esempio mediante raffreddamento a circa -20?C. Tale pre-trattamento pu? avere un effetto stabilizzante sul prodotto di partenza, eliminando le eventuali problematiche legate alla stagionalit? che potrebbero comportare uno stress eccessivo di processo, e pu? inoltre agevolare la separazione delle fasi libere, oleose ed acquose, dai solidi eventualmente presenti che dovranno essere scartati, ad esempio mediante filtrazione.

In una forma realizzativa preferita del processo di questa invenzione, quale mezzo di macinazione ad umido pu? essere utilizzata la stessa soluzione tampone acquosa comprendente anche saccarosio oltre al tampone, utilizzata per la successiva fase di estrazione. Ci? semplifica infatti ulteriormente il processo, riducendo reagenti, tempi e costi di produzione. Le tecniche di macinazione ad umido utilizzabili nell?ambito della presente invenzione sono quelle convenzionalmente utilizzate nei frantoi oleari, ad esempio la molitura o anche tecniche che sfruttano mezzi diversi di macinazione, quali la pressatura, il taglio e l?impatto (i.e. l?uso di sfere in ceramica o acciaio).

La soluzione tampone acquosa utilizzabile per la fase di estrazione nel processo di questa invenzione pu? essere scelta ad esempio tra un tampone citrato o fosfato, preferibilmente ? un tampone citrato, realizzabile ad esempio con acido citrico monoidrato e sodio idrossido. In una forma realizzativa, la soluzione tampone acquosa comprende inoltre saccarosio.

Al fine di permettere, nella fase di centrifugazione, una facile separazione dell?estratto comprendente oleosomi dalla soluzione acquosa, si ? rivelato essenziale che la densit? della soluzione tampone acquosa, determinata ad esempio dalla somma delle concentrazioni dei componenti della soluzione tampone e del saccarosio se presente, sia compresa nell?intervallo sopra indicato, ossia tra circa 1,2 e circa 1,5 g/L, e preferibilmente pari a circa 1,4 g/L.

Risultati ottimali in termini di estrazione si sono osservati utilizzando la soluzione tampone citrato addizionata con saccarosio; ma qualsiasi altra soluzione tampone equivalente ed avente un pH e una densit? nell?intervallo sopra indicato, rientrer? nell?ambito di questa invenzione.

In un aspetto, la quantit? di soluzione tampone acquosa utilizzata nella fase di estrazione pu? essere compresa tra circa 5.0 e circa 10 L/Kg di pasta di olive di partenza, e preferibilmente ? pari a circa 7.5 L/Kg.

Rispetto ai processi di estrazione di oleosomi dell?arte nota il processo di questa invenzione comprende preferibilmente una unica fase di estrazione con una unica soluzione tampone, invece di utilizzarne diverse. A fronte di questa grossa semplificazione l?efficienza di estrazione e le rese del processo sono tuttavia pi? alte.

Il processo di questa invenzione ha permesso inoltre di ottenere un estratto con oleosomi intatti derivati da pasta di olive, che ne mantengono la composizione lipidica e la presenza di altre sostanze desiderabili, quali flavonoidi e polifenoli. Il contenuto di tali molecole nell?estratto ? risultato compreso tra circa 0.70 e circa 1.80 mgGAE/g di estratto secco per i polifenoli e compreso tra circa 0.2 e circa 0.8 mgQE/g di estratto secco per i flavonoidi. Inoltre, il potere antiossidante mostrato dall?estratto ottenibile con il presente processo ? risultato compreso tra circa 12.0 e circa 28.0 mgTroloxE/g di estratto secco.

L?estratto comprendete oleosomi ottenibile con il presente processo, oltre alle propriet? stabilizzanti ed emulsionanti caratteristiche di ogni tipo di oleosomi, conservano anche quegli elementi antiossidanti presenti nelle olive che possono conferire ai prodotti finali a cui questi oleosomi vengono aggiunti una funzionalit? nutrizionale significativa e allo stesso tempo una prolungata shelf-life.

Le dimensioni degli oleosomi estratti, cos? come la distribuzione di tali dimensioni e la sfericit? degli oleosomi sono state valutate anche dopo aver sottoposto gli estratti a un forte riscaldamento, fino a 200?C, a seguito del quale si sono rilevate solo piccole variazioni nei tre parametri valutati, segno di una grande stabilit? termica del prodotto ottenuto con il presente processo.

Questi, che possono identificarsi in generale come i vantaggi tecnici principali della presente invenzione, diventano caratteristiche positive fondamentali per l?utilizzazione degli oleosomi estratti nel campo dell?industria alimentare, per quanto per le loro caratteristiche di composizione e capacit? emulsionante potrebbero risultare vantaggiose anche per la formulazione di attivi cosmetici e farmaceutici. In effetti il presente processo utilizza tutti reagenti food-grade e acqua come unico solvente, potendo cos? aspirare a fornire un estratto utilizzabile persino direttamente come alimento per il consumo umano, senza bisogno di alcuna purificazione ulteriore.

Un ulteriore vantaggio di questa invenzione ? rappresentato dalla facilit? e dalla rapidit? con cui ? possibile completare il processo. Una durata molto pi? breve rispetto allo stato dell?arte del presente processo, ad esempio di circa 2 ore, insieme alle rese elevate di estrazione degli oleosomi, rende il presente processo adatto all?uso estensivo anche su larga scala.

La presente invenzione rappresenta pertanto una soluzione ottimale da ogni punto di vista, e consente di superare gli inconvenienti messi in evidenza sopra nel descrivere lo stato dell'arte.

I seguenti esempi sono forniti allo scopo di illustrare la presente invenzione senza tuttavia costituirne una limitazione.

Parte Sperimentale

Materiali e metodi utilizzati

Il prodotto di partenza utilizzato era pasta di olive proveniente da olive di piante di olivo cultivar Leccino, coltivato nella zona di Perugia.

I seguenti reagenti commercializzati da Merck sono stati utilizzati nei processi di estrazione:

Saccarosio BioUltra >99.5%

Sodio Cloruro BioUltra >99.5%

Acido citrico monoidrato 99.5%

Sodio idrossido 98%

Il protocollo di estrazione descritto nello stato dell?arte considerato (domanda di brevetto Internazionale pubblicata con il N. WO 2007/115899) per l?estrazione di oleosomi da semi oleaginosi, ? stati ripetuto qui nell?Esempio 1 di confronto sotto riportato, adattando le quattro fasi operative descritte nel documento alla pasta di olive come prodotto di partenza. Nella prima fase ? stata fatta una macinazione ad umido utilizzando una soluzione di acqua e saccarosio 0.6 M come mezzo di macinazione. Le successive tre fasi sono state condotte utilizzando le seguenti soluzioni tampone acquose:

Tampone 1: Saccarosio (0.2 M) e NaCl (1 M);

Tampone 2: Saccarosio (0.1 M) e NaCl (1 M);

Tampone 3: NaCl (0.2 M).

Nelle tre fasi successive sono state preparate sospensioni mescolando per 2 minuti il materiale nella soluzione tampone relativa alla fase, quindi la sospensione ? stata centrifugata a 3226g per 40 minuti. Dopo ciascuna centrifugazione, lo strato solido ? stato separato e risospeso nel tampone successivo, quindi, nell?ultima centrifugazione, ? stata valutata la resa del processo di estrazione come rapporto tra il peso totale del prodotto estratto e il peso iniziale della pasta di olive secondo la seguente equazione (1):

Resa, %p = Peso (estratto finale)/Peso (materiale iniziale) (1) Il prodotto finale estratto con il processo dello stato dell?arte e con il processo dell?invenzione sono stati inoltre entrambi valutati effettuando le seguenti analisi, in cui tutti i reagenti usati sono stati acquistati da Merck ed avevano grado di purezza da laboratorio:

a) Composizione (contenuto di acqua, contenuto di olio, contenuto di proteine) Il contenuto di acqua ? stato misurato utilizzando una termobilancia (Kern DBS 60-3), impostando la temperatura di essiccamento a 60?C. Il contenuto dell?olio ? stato determinato invece utilizzando un estrattore Soxhlet continuo riempito con 40 g di estratto essiccato e 100 ml di n-esano. Il tempo di estrazione ? stato di 6 ore. Il contenuto totale delle proteine dell?estratto essiccato e sgrassato ? stato determinato utilizzato il metodo del saggio di Bradford (Bradford M., Anal. Biochem., vol.72, n.1-2, pp. 248-254). La concentrazione di proteine ? stata determinata utilizzando uno spettrofotometro UV-visibile Cary 50, Varian, a 595 nm. Come riferimento standard ? stato utilizzato BSA (albumina di siero bovino) in un intervallo di concentrazione tra 0.1 e 1.4 mg/ml.

b) Concentrazione di polifenoli

Per questa prova 1 g di estratto ? stato diluito in 8 ml di metanolo e mescolato per 12 ore a 23?C in provetta sigillata con paraffina per evitare l?evaporazione. Dopo centrifugazione a 2000 xg per 10 minuti, ? stato recuperato 1 ml di surnatante ed ? stato mescolato con 300?l di reagente Folin-Ciocalteu e con 1 ml di sodio carbonato 99% (7.5 p/v) e acqua deionizzata fino ad ottenere un volume totale di 10 ml. ? stata determinata la concentrazione di polifenoli leggendo la curva di assorbanza con lo spettrofotometro UV-visibile a 765 nm, utilizzando acido gallico come riferimento nell?intervallo 4.00-25.00?g/ml (Kim J.S. et al. (2013), J. Funct. Foods, vol.5, n.1, pp.

80-86).

c) Concentrazione di flavonoidi

Come per i polifenoli, ? stata effettuata come primo passaggio una estrazione metanolica, quindi 1 ml di surnatante ? stato mescolato con 0.500?l di cloruro di alluminio 99.9% (2% p/v) e acqua deionizzata fino a un volume totale di 10 ml. Quindi la soluzione ? stata incubata per 30 minuti al buio e si ? registrata l?assorbanza a 420 nm con uno spettrofotometro UV-visibile. La concentrazione di flavonoidi ? stata determinata mediante quantificazione con quercetina come riferimento standard, con una concentrazione tra 4.00 e 20.00?g/ml (Woisky R.G. et al. (1998), J. Apic. Res., vol. 37, n.2, pp.99-105).

d) Potere antiossidante

Sempre partendo con una estrazione metanolica, il potere antiossidante ? stato determinato utilizzando un saggio FRAP (Ferric Reducing Ability of Plasma): si ? mescolato 1 ml di surnatante con 1 ml di reagente FRAP come descritto da Benzie I.F.F. et al. (1996) Anal. Biochem., vol. 239, n. 1, pp. 70-76, e si ? aggiunta acqua distillata fino a un volume totale di 10 ml. Abbiamo quindi incubato la soluzione cos? preparata per 5 minuti e registrata l?assorbanza a 593 nm con uno spettrofotometro UV-visibile. I valori di potere antiossidante sono stati misurati in Trolox 97% equivalenti con concentrazione tra 1.2x10<-5 >e 6x10<-5 >mmol/ml sono stati usati come standard.

e) Analisi morfologica;

La forma e le dimensioni degli oleosomi nell?estratto sono stati valutati con un microscopio verticale Zeiss Axio Imager M1, munito di un obiettivo 40X, in una configurazione in luce riflessa. L?estratto ? stato deposto su una piastrina da microscopio e rigato con la punta di una pipetta, quindi sono state acquisite digitalmente le immagini della piastrina, analizzate poi con il software Fiji-ImageJ con la funzione analisi particella e il metodo di analisi di Nobuyuki Otsu descritto in Otsu N. (1979) IEEE Trans. Syst. Man. Cybern., vol.9, n.1, pp.62-66. ? stata cos? determinata la dimensione delle particelle, le dimensioni degli oleosomi e la loro forma circolare. Le caratteristiche di distribuzione degli oleosomi sono state anche valutate secondo i valori D10, D50 e D90. La mediana D50 ? definita come il diametro al di sotto del quale si colloca met? della popolazione. Analogamente, il 90% della popolazione ha diametro al di sotto di D90 e il 10% della popolazione al di sotto di D10.

f) Stabilit? termica degli oleosomi

La stabilit? termica dell?estratto contenente oleosomi ? stata valutata misurando la distribuzione dimensionale usando la stessa procedura descritta sopra al punto e) dopo aver tenuto la piastrina da microscopio su una piastra riscaldante (Hot Plate by Thermo Fisher) prima dell?osservazione al microscopio, per 10 minuti dopo il raggiungimento della temperatura impostata. Sono state fatte quattro prove a temperature diverse, pari a 50?C, 100?C, 150?C e 200?C.

g) Stabilit? dell?emulsione

Il protocollo adottato consisteva nel misurare l?altezza delle fasi liquide, ossia l?olio in alto e l?acqua in basso, che si separano nell?estratto, in una provetta Falcon da 15 ml, dopo un ciclo di centrifugazione effettuato a 2064g e a temperatura di 25?C. Il numero di centrifugazioni effettuate ? dipeso da quando si ? ottenuto un indice di stabilit? costante nella valutazione, al pari di quanto viene fatto nell?industria alimentare per valutare la stabilit? dei cibi in forma di emulsione. La valutazione ? stata condotta sull?estratto fresco e sull?estratto dopo riscaldamento in forno a microonde Whirlpool MWF 427 SL per 20 secondi fino a temperatura di 70?C. Il campione ? stato poi raffreddato a temperatura ambiente prima della valutazione di stabilit?.

L?indice di stabilit? % Si ? stato determinato con la seguente equazione (2)

Si = (Hs / Ht) x 100 (2)

in cui Hs ? la somma delle altezze degli strati superiore e inferiore misurate dopo ciascuna centrifugazione e Ht ? l?altezza totale del prodotto nel contenitore.

h) Comportamento reologico

Le propriet? reologiche degli oleosomi estratti negli esperimenti qui descritti sono state valutate in parallelo a una maionese commerciale scelta come controllo positivo, utilizzando un reometro rotazionale (Anton Paar MCR 102) con una geometria piattocono (D=50 mm,?=1?). Sono state condotte tre diverse prove:

-curva di flusso: ? una rappresentazione grafica della viscosit? fluida quando sottoposta a velocit? di taglio crescente e decrescente. Sono state testate le viscosit? degli estratti a t0 (estratti freschi) e a t1 (estratti dopo 10 giorni a 4?C), in parallelo alla viscosit? della maionese commerciale. Le curve di flusso sono state determinate usando un intervallo di velocit? di taglio 0.1-100 s<-1 >fissando la temperatura a 25?C per tutte le prove, quindi registrando l?andamento della viscosit? rispetto alla velocit? di taglio.

-rampa termica della curva di flusso: ? stato indagato il comportamento dei campioni di oleosomi a temperature crescenti con la rampa termica della curva di flusso entro un intervallo di temperatura di 10-80?C per valutare la variazione di viscosit? con una velocit? di riscaldamento dei campioni di 10?C al minuto. ? stato anche determinato il valore pi? basso dello stress di taglio al di sopra del quale il comportamento di un certo materiale ricorda un fluido e al di sotto del quale si comporta come un solido;

-sweep di frequenza: sono state determinate le differenze nella viscoelasticit? dei campioni valutando e confrontando G? (storage modulus o modulo elastico) e G?? (loss modulus o modulo dissipativo) alla frequenza di 1 Hz, che ? stata scelta per il suo valore rappresentativo della regione lineare viscoelastica precedentemente valutata. i) Comportamento tribologico (curva di Stribeck);

La curva di Stribeck ? stata misurata utilizzando la cella tribologica T-PTD 200 montata su un reometro rotazionale (Anton Paar MCR 102); questa curva ? generalmente utilizzata per valutare l?attrito tra due superfici lubrificate a liquido, in questo caso tra l?emulsione e la bocca di un consumatore. La sonda dell?apparecchio era munita di una sfera in vetro che simula la lingua e punte in PDMA che ricordano il palato nella bocca. La curva ottenuta ? divisa in tre regioni, di confine, mista e idrodinamica, a cui corrispondono coefficienti di frizione diversi, e diverse quantit? di campione tra lingua e palato. Le prove sono state condotte a temperatura ambiente confrontando il comportamento dell?estratto fresco e dell?estratto conservato per 10 giorni a 4?C, in parallelo a una maionese commerciale. Le analisi sono state svolte a pressione costante tra la sfera in vetro e le punte a un valore di 1 N, variando la velocit? di scorrevolezza nell?intervallo tra 1E<-9 >a 1E<-1 >(m/s).

ESEMPIO 1 ? CONFRONTO ? Estrazione di oleosomi secondo il processo descritto in WO 2007/115899

La pasta di olive ? stata congelata a -20?C, quindi scongelata e un campione da 40 g ? stato omogeneizzato con una soluzione di saccarosio 0.6 M. Si ? quindi applicato esattamente il protocollo descritto nel documento dello stato dell?arte sopra menzionato, effettuando tre successive diluizioni della crema raccolta in tre diversi tamponi liquidi, indicati sopra come Tampone 1, Tampone 2 e Tampone 3, senza ottenere nessuna separazione della fase solida da quella liquida.

Solo aggiustando il pH delle sospensioni a circa 6 e aumentando le concentrazioni di saccarosio e sodio cloruro nei tamponi come indicato qui sotto:

Tampone 1?: Saccarosio (0.8 M) e NaCl (1 M);

Tampone 2?: Saccarosio (0.4 M) e NaCl (1 M);

Tampone 3?: NaCl (3.2 M),

si ? potuta effettuare la separazione e arrivare al termine del processo di estrazione ottenendo per? una resa molto bassa, pari al 21,4%. Inoltre, dopo ogni centrifugazione la fase liquida non appariva limpida a causa di particelle solide sospese. Per recuperare tutto il prodotto solido il contenitore con la sospensione doveva essere ogni volta congelato per circa 3 ore, con un aggravio di tempi e difficolt? inaccettabili per un processo industriale.

ESEMPIO 2 ? Estrazione di oleosomi secondo il processo dell?invenzione La pasta di olive ? stata congelata a -20?C, quindi scongelata e un campione da 40 g ? stato omogeneizzato con una soluzione di saccarosio 0.6 M, quindi centrifugato e alla fase oleosa recuperata dopo centrifugazione ? stata aggiunta una soluzione acquosa tampone, avente la seguente composizione %:

-saccarosio: 27.4%

-acido citrico monoidrato: 5.2%

-sodio idrossido: 2.4%

Il pH della soluzione tampone utilizzata era 6.0. Dopo sospensione e centrifugazione le due fasi si sono nuovamente separate permettendo il recupero di 17 g di una crema contenente oleosomi ed avente le caratteristiche desiderabili sotto descritte nell?Esempio 3 (resa = 43%).

Il tempo complessivo del processo ? stato di 2 ore e la quantit? di reagenti utilizzata rispetto al procedimento dello stato dell?arte ? stata molto ridotta, ottenendo tuttavia una resa di estratto oleoso molto pi? elevata.

ESEMPIO 3 ? Caratterizzazione dell?estratto dell?invenzione

L?estratto ottenuto con il processo descritto sopra nell?Esempio 2 ? risultato essere composto principalmente da acqua e lipidi, rispettivamente per il 40% e il 26.76% in peso rispetto al peso totale della composizione, con un 6% in peso di componente proteica composta principalmente da oleosine e un 27.25% in peso di altri componenti costituiti principalmente da fibre.

Nella seguente Tabella 1 ? riportato il contenuto di polifenoli, flavonoidi e il potere antiossidante rilevato per lo stesso estratto.

Tabella 1

*le quantit? sono valutate sul peso dell?estratto secco

I valori rilevati erano sorprendentemente elevati, suggerendo un grosso potenziale dell?estratto in campo alimentare sia in termini di aumento della conservazione dei cibi sia in termini di effetti positivi del cibo sulla salute dei consumatori. Si tratta infatti di valori in linea con quelli corrispondenti riportati in letteratura per l?olio extra-vergine di oliva per quanto riguarda i polifenoli, mentre il potere antiossidante risulta molto pi? stabile di quello dell?olio, suggerendo che le emulsioni preparate utilizzando l?estratto di questa invenzione potrebbero essere molto pi? stabili.

Dalle indagini morfologiche al microscopio ottico ? stato possibile evidenziare nell?estratto la presenza delle strutture sferiche subcellulari, note come oleosomi. In figura 1 ? visibile un?immagine registrata a temperatura ambiente in campo luminoso, in cui la freccia indica una delle strutture oleosomiche.

La stessa piastrina da microscopio ? stata nuovamente osservata dopo i trattamenti termici a 50, 100, 150 e 200?C trovando variazioni non significative della struttura microscopica, come si pu? osservare nelle Figure 2 a), b), c), e d). Anche questo risultato ? molto promettente per un utilizzo industriale dell?estratto in quanto garantisce la sua stabilit? ad esempio dopo processi di sterilizzazione per riscaldamento. Tale risultato ? stato confermato anche dall?analisi delle dimensioni e delle distribuzioni delle dimensioni degli oleosomi nell?estratto, che mostrano una notevole costanza alle diverse temperature. In Figura 3 ? riportato un istogramma dei parametri dimensionali D10, D50 e D90 alle temperature testate, che conferma appunto la stabilit? del presente estratto alla degradazione termica, mostrando risultati in ogni caso comparabili a quelli ottenuti a temperatura ambiente.

? stata poi valutata la stabilit? termica del prodotto in termini di emulsione, andando ad osservare il grado di separazione dopo centrifugazione per il prodotto prima e dopo il riscaldamento a 70?C. I valori determinati dell?indice di stabilit? Si sono riportati nella seguente Tabella 2:

Tabella 2

Come si pu? vedere da questi risultati i valori del grado di separazione non variano molto anche dopo 6 passaggi di centrifugazione, sia per l?estratto fresco, sia per quello trattato con riscaldamento.

Sull?estratto sono state inoltre effettuate misurazioni di tipo reologiche come descritto sopra. In Figura 4 ? riportato ad esempio l?andamento rilevato per la viscosit? rispetto alla velocit? di taglio per l?estratto fresco e al tempo t1 sopra definito, in confronto con una maionese commerciale scelta come benchmark. Si osserva una stretta analogia con il prodotto commerciale ancora per l?estratto dopo 10 giorni di conservazione a 4?C, ed una pi? alta viscosit?.

Infine, le prove tribologiche che simulano la trasformazione del prodotto in bolo, effettuate anche queste in parallelo ad una maionese commerciale, hanno messo in evidenza un pi? basso fattore di frizione rispetto a quest?ultima, suggerendo quindi che gli oleosomi estratti con il presente processo dalla pasta di olive risultino pi? facili ad inghiottire di una maionese. In Figura 5 le curve di Stribeck registrate per la maionese commerciale scelta come controllo positivo e per i due estratti, fresco e dopo 10 giorni di conservazione.

La presente invenzione ? stata fin qui descritta con riferimento a una forma preferita di realizzazione. ? da intendersi che possano esistere altre forme di realizzazione che afferiscono al medesimo nucleo inventivo, come definito dall?ambito di protezione delle rivendicazioni qui di seguito riportate.

Claims

RIVENDICAZIONI

1. Un processo per ottenere un estratto comprendente oleosomi a partire da pasta di olive, comprendente le seguenti fasi:

i) macinazione ad umido di pasta di olive;

ii) separazione e recupero della fase oleosa del prodotto macinato;

iii) estrazione di detta fase oleosa con una soluzione tampone acquosa; iv) separazione e recupero dell?estratto;

detto processo essendo caratterizzato dal fatto che detta soluzione tampone acquosa ha pH compreso tra 5.0 e 7.0, e densit? compresa tra 1.2 e 1.5 g/L.

2. Il processo della rivendicazione 1, in cui detta soluzione tampone acquosa ha pH 6.0.

3. Il processo della rivendicazione 1 o 2, in cui detta soluzione tampone acquosa ? una soluzione in acqua di acido citrico e sodio idrossido.

4. Il processo di una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detta soluzione tampone acquosa comprende inoltre saccarosio.

5. Il processo di una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detta soluzione tampone acquosa ha una densit? pari a 1.4 g/L.

6. Il processo di una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, comprendente un?unica fase di estrazione mediante lavaggio con detta soluzione tampone acquosa.

7. Il processo di una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, comprendente inoltre una fase di congelamento della pasta di olive, prima di essere sottoposta a macinazione a umido una volta scongelata.

8. Il processo di una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detta fase di macinazione ad umido ? condotta omogeneizzando detta pasta di olive con la stessa soluzione tampone acquosa comprendente saccarosio della fase di estrazione, come mezzo di macinazione.

9. Estratto da pasta di olive comprendente oleosomi ottenibile con il processo come definito nelle rivendicazioni 1-8, avente un contenuto di polifenoli compreso tra 0.70 e 1.80 mgGAE/g di estratto secco, un contenuto di flavonoidi compreso tra 0.20 e 0.80 mgQE/g di estratto secco, e un potere antiossidante compreso tra 12.0 e 28.0 mgTroloxE/g di estratto secco.

10. Uso dell?estratto della rivendicazione 9, come agente emulsionante in preparazioni alimentari, in formulazioni cosmetiche e/o farmaceutiche.

11. Un prodotto alimentare, una formulazione cosmetica e/o farmaceutica comprendente un estratto come definito nella rivendicazione 9 come agente emulsionante.