NO151119B

NO151119B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av terapeutisk aktive ornithin og argininsalter av forgrenede ketosyrer

Info

Publication number: NO151119B
Application number: NO790903A
Authority: NO
Inventors: Mackenzie M D Walser
Original assignee: Univ Johns Hopkins
Priority date: 1978-03-17
Filing date: 1979-03-16
Publication date: 1984-11-05
Also published as: AU517505B2; IE790993L; AU4515479A; GB2017094B; NO790903L; BE874900A; SE7902401L; FI790901A; FI72118B; ES478710A1; DE2910221A1; LU81057A1; NO151119C; FR2419723B1; CA1115729A; JPS54163518A; DK110879A; NL7902136A; IT1202904B; DE2910221C2

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive ornithin og argininsalter av ketoanaloger av forgrenede essensielle aminosyrer.

Forskjellige leverforstyrrelser er karakterisert ved hyperammonemia og portalsystemisk encefalopati som skylles høye konsentrasjoner av ammoniakk i blodet og cerebrospinalvæske. Tilstandene fastslås klinisk etter inntak av proteiner ved brek-ninger, agitasjon, sløvhet og svekkede mentale og fysikalske pro-sesser. Tidligere behandling av disse tilstander har generelt vært basert på forsøk på å redusere produksjonen av ammoniakk i tarmene og begrense diet protein.

Ornithin og arginin har lenge vært kjent for å gi be-skyttelse mot toksiske effekter av ammoniakksalter. Se Greenstein et al. Archives Of Biochemistry And Biofhysics 64:342 (1956): Gullino et al. Archives Of Biochemistry And Biophysics 64:319

(1956) : Najarian and Harper, Proceedings of the Society of Ecperimental Biology and Medicine 92:560 (1956); Salvatore et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 107:499 (1964); Roberge and Charbonneau, Life Sciences 8:369 (1969). Det har vært gjort forsøk på å anvende disse forbindelser terapeutisk i hyperammone-miske pasienter, se Fahey, American Journal of Medicine 22:860

(1957) ; Cachin, La Presse Medicale 69:1473 (1961); og Michel,

La Presse Medicale 79:867 (1971). Imidlertid er anvendelse av ornithin eller arginin per se begrenset i slike pasienter på grunn av deres nedsatte nitrogentoleranse.

Individer som lider av hyperammonemia og portal systemisk encefalopati har vanligvis proteinmangel på grunn av deres intoleranse for diet protein. Derfor har nitrogenfri analoger av essensielle aminosyrer også vært anvendt terapeutisk i hyperam-monemiske pasienter for reduksjon av ammoniakk i blodstrømmen og samtidig for å aktivere proteinsyntesen. DS patentskrift 4 100 293 og 4 100 160 beskriver anvendelse av blandinger av keto og/eller hydroxyanaloger av essensielle'aminosyrer ved behandling av leverforstyrrelser. Se også Maddrey et al., Gastroenterology 71:190 (1976); Batshaw et al., New England Journal of Medicine 292:1083 (1975) og Batshaw et al., Pediatrics 58:227 (1976). Imidlertid har de nitrogenfrie analoger av essensielle aminosyrer en noe utilfredsstillende smak og har en begrenset løselighet som kalsiumsalter.

Ifølge oppfinnelsen fremstilles nye forbindelser ved omsetning av arginin eller ornithin med en a-ketoanalog av en for grenet essensiell aminosyre (enkelte ganger angitt som forgrenede ketosyrer eller forgrenede essensielle ketosyrer). De resulterende ornithin og argininsalter av forgrenedé ketosyrer er sterkt løselige i vann og har en rimelig god smak, i særdeleshet i motsetning til arginin, ornithin eller forgrenede ketosyrer (som natrium eller calciumsalter) gitt alene.

En eller flere av ornithin eller argininsaltene av forgrenede ketosyrer kan administreres oralt eller parenteralt til pasienter som lider av hyperammonemia eller portal systemisk encefalopati for å lindre disse tilstander. Fortrinnsvis behand-les slike tilstander i en blanding av ornithinsaltene av alle de tre forgrenede ketosyrer, nemlig a-ketoanalogene av valin, leucin og isoleucin.

Oppfinnelsen angår således en analogifremgangsmåte

for fremstilling av terapeutisk aktive forbindelser av formelen

AK.xH90

hvori A er arginin eller ornithin,

K er en a-ketoanalog av en forgrenet essensiell aminosyre, og

x er O eller 1.

Når det gjelder ornithinsaltene, er det ikke noe hydratvann, og x er følgelig lik null. Vannfri argininsalter er ikke blitt fremstilt, og det er ikke kjent hvorvidt vannet i den ovenfor angitte formel er hydratvann eller fritt eller bundet vann på grunn av ufullstendig tørking av reaksjonsproduktet.

De forgrenede essensielle aminosyrer innbefatter valin, leucin og isoleucin, og deres tilsvarende a-ketoanaloger er a-ketoisovalerinsyre, a-ketoisocapronsyre og a-keto-|3-methylvale-rinsyre. Disse forgrenede ketosyrer er kommersielt tilgjengelige som calcium eller natriumsalter. Metoder for fremstilling av ketosyrene er også velkjent innen faget, ue fri syrer kan fremstilles fra saltene ved tilsetning av overskudd saltsyre og etter-følgende ekstraksjon med ether og fordampning.

Arginin (også kjent som guanidin-aminovalerinsyre eller 2-amino-4-guanidovalerinsyre) er en semi-essensiell aminosyre for rotter. Arginin foreligger naturlig i L(+)-form, og er kommersielt tilgjengelig som arginin fri base, som glutamatet (se US patentskrift 2 851 482) og som hydrokloridet. •

Analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjenne-tegnet ved at arginin eller ornithin omsettes med en a-ketoanalog av en forgrenet essensiell aminosyre i nærvær av en fortrinnsvis liten mengde vann.

Vann fjernes deretter ved fordampning. Reaksjonen kan utføres ved standardbetingelser hva gjelder temperatur og trykk, og hverken reaksjonsmetoden eller vannfordampningsmetoden er kritisk.

Ornithin (også kjent som 2,5-diaminovalerinsyre) er en ikke-essensiell aminosyre som fremstilles av kroppen. Ornithin fremstår i to krystallinske former, nemlig L(+)-ornithin og DL-ornithin, men bare L-formen er egnet for bruk.

Ornithin er ikke generelt tilgjengelig kommersielt, men kan fremstilles i sirupform inneholdende en liten mengde vann ved omsetning av ornithinhydroklorid med ammoniumhydroxyd som beskrevet i det etterfølgende.

Ornithinsaltene fremstilt ifølge oppfinnelsen, fremstilles ved bland-ding av L-ornithinsirup med den ønskede forgrenede* essensielle ketosyre. Ketosyrene anvendes også fortrinnsvis i væskeform med en liten mengde vann. Reaksjonsproduktet krystalliseres deretter ved avkjøling og tilsetning av ethanol.

De resulterende nye forbindelser som

dannes ved de ovenfor angitte metoder innbefatter arginin a-ketoisocaproat, arginin a-ketoisovalerat, arginin a-keto-3-methylvalerat, ornithin a-ketoisocaproat, ornithin a-ketoisovalerat og

ornithin a-keto-3-methylvalerat. Den kjemiske identifikasjon av disse forbindelser er vist i tabell 1.

Ornithin og argininsaltene av a-ketosyreanaloger av de forgrenede essensielle aminosyrer foreligger ikke i vann fordi de dissosierer fullstendig, antageligvis i aminosyrekationet og ketosyreanionet. Videre kan de vanlige' kriterier for identifikasjon av organiske forbindelser ikke anvendes for å fastslå at et salt er til stede, i motsetning til en fysikalsk blanding, på grunn av at mesteparten av slike metoder, slik som infrarød spektrum, ganske enkelt gir tilleggsspektra"for komponentene når det gjelder disse salter. På lignende måte kan smeltepunkter ikke bestemmes på grunn av at disse forbindelser gjennomgår irreversibel spaltning ved temperaturer på 136 - 142° C. Denne spaltning består av tap av et mol vann og dannelse av.de tilsvarende Schiff-baser.

Imidlertid bekrefter røntgenkrystallografiske data at forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen, er organiske salter og ikke bare fysikalske blandinger. Eksempelvis kan røntgenkrystallogra-fiske data for ornithin a-keto-(3-methylvålerat summeres som føl-ger: Krystallene er klassifisert som romgruppe C222^. Celle-dimensjonene er a=8,03+0,02 Ångstrom (Å), b=9,69+0,02 Å og c= 39,52+0,05 Å. Molekyler pr. celle er lik 8. Målt tetthet er 1,14 7 g pr. cm . Volum av enhetscelle lik 3 075 cubikk Ångstrom. Vekt av asymmetrisk enhet lik 265,4 gram pr. mol (beregnet som 253 gram pr. mol for et 1:1 salt).

Fremgangsmåten for fremstilling av de nye forbindelser vil bli beskrevet i detalj i det etterfølgende.

Fremstilling av ornithin g- ketoisocaproat

a-ketoanalogene av leucin, nemlig a-ketoisocapronsyre fremstilles først fra calciumsaltet av ketoanalogen som ble erholdt kommersielt fra Rexim Paris, Frankrike. Calciumsaltet ble suspendert i vann under dannelse av en oppslemming til hvilken det ble tilsatt et overskudd av saltsyre. Den resulterende klare løsning ble deretter filtrert, og filtratet ble ekstrahert med ether. Etherekstraktet som inneholder den fri syre, ble deretter fjernet og underkastet fordampning ved redusert trykk og 30° C. Fordampning av etheren etterlot den fri ketosyre, som er en væske.

Ornithin-fri base ble erholdt ved å helle en konsentrert løsning av kommersielt tilgjengelig ornithin hydroklorid gjennom en stor kolonne inneholdende en kationbytter, slik som Dowex^O i hydrogenform. Etter vasking med vann for å fjerne alle spor av klorid, ble ornithinet deretter eluert ved tilsetning av 2N ammoniumhydroxyd. Eluatet ble deretter underkastet fordampning under redusert trykk ved ca. 40° C. Dette førte til fjerning av den inneholdte fri ammoniakk og mesteparten av vannet, under dannelse av en sirup som er ornithin-fri base.

Et mol rent a-ketoisocapronsyre (130 g) ble tilsatt langsomt under omrøring til et avkjølt kar inneholdende et mol ornithin-fri base (132 g) som ble erholdt som en sirup. Tilstrekkelig vann (ca. 100 ml) ble tilsatt under dannelse av en klar løs-ning. Tilstrekkelig absolutt ethanol (ca. 1 liter) ble tilsatt under omrøring inntil et bunnfall begynte å dannes uten reoppløs-ning ved omrøring. Blandingen ble lagret over natten ved ca.

50° C. Det hvite krystallinske bunnfall, som er ornithin a-ketoisocaproat, ble filtrert og tørket i luft i 24 timer.

Fremstilling av arginin a- ketoisocaproat

1 mol kommersielt tilgjengelig arginin-fri base (174 g) ble løst i ca. 100 ml vann og avkjølt. Til denne løsning ble langsomt tilsatt under omrøring 1 mol a-ketoisocapronsyre (130 g) som var blitt fremstilt etter den ovenfor beskrevne prosedyre. Vann ble deretter fjernet ved fordampning under redusert trykk ved ca. 4 0° C under dannelse av et glassaktig residuum. Tilstrekkelig ethanol (ca. 250 ml) ble tilsatt for å oppløse dette residuum. Den resulterende løsning ble deretter fordampet til tørrhet under nedsatt trykk ved 40° C. Det ble således erholdt et hygro-fckopisk hvitt pulver som er arginin a-ketoisocaproat.

Om ønsket kan forbindelsene anvendes

i andre former ved siden av de enkle organiske salter. Eksempelvis gir oppvarming av forbindelsene oppad de tilsvarende Schiff-baser. I motsetning til saltene er Schiff-basene stabile

i vandig løsning. Schiff-basene vil sannsynligvis hydrolyseres i kroppen og gi opphav til arginin eller ornithin og de respektive forgrenede ketosyrer. På tilsvarende måte kan saltsyre eller andre syresalter dannes fra AK'xt^O-saltene om ønsket. Disse vil selvsagt gi en syreløsning når de løses i vann, i motsetning til de tilnærmet nøytrale løsninger som erholdes når AK-x^O-saltene oppløses i vann.

De nye forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen, er anvendbare ved behandling av hyperammonemia og portalsystemisk encefalopati som er karakteristisk for forskjellige former for leversykdommer. Gunstige virkninger av de nye forbindelser når de anvendes for å behandle disse tilstander oppnås ved administrering i effektive doser enten individuelle forbindelser eller en blanding av de nye forbindelser, slik som en blanding av alle tre argininsaltene. En blanding av ornithin a-ketoisocaproat,

ornithin a-ketoisovalerat og ornithin a-keto-p-methylvalerat foretrekkes ved behandlingen.

De effektive daglige doser av de nye forbindelser vil variere alt etter pasientens vekt, tilstandens grad, og andre faktorer. En midlere daglig dose på 30 til 40 mmol av en for-bindelse eller av en total blanding av forbindelser er blitt funnet å være effektiv. Hvor en blanding av forbindelser anvendes, foretrekkes det at forbindelsene er til stede i blandingen i ca . ekvimolare mengder.

De nye forbindelser kan administreres enten oralt

eller parenteralt. De eneste kjente preparater som var av verdi ved behandling av hyperammonemia, var nitrogenfrie (keto og hydroxy) analoger av essensielle aminosyrer administrert som natrium- eller calciumsalter. De nye forbindelser har den fordel overfor disse kjente preparater ved at de er meget løselige i vann (ønskelig for fremstilling av vandige parenterale løsninger) og meget mer velsmakende (ønskelig med hensyn til oral administrering) . Forbindelsene kan administreres oralt i tørr form, slik som tabletter.eller pulvere.

Den terapeutiske effektivitet for behandling av mennes-ker med de nye forbindelser vil bli illustrert ved de følgende spesifikke eksempler.

Eksempel 1

En pasient som led av alvorlig portal systemisk encefalopati, ble behandlet oralt med en blanding av de tre argininsaltene av forgrenede essensielle ketosyrer fremstilt ifølge oppfinnelsen. Etter en kontrollperiode på 6 dager mottok pasienten en blanding av de tre salter på en total dose på 17 mmol pr. dag i de 3 derpå føl-gende dager. I de følgende 12 dager ble pasienten gitt en total dose på 34 mmol av blandingen pr. dag, etterfulgt av en annen kontrollperiode på 6 dager. Under behandlingen og kontrollperiodene umiddelbart før og etter behandlingen, forble dietnitrogen-inntaket konstant.

Tabell 2 oppsummerer behandlingen av denne pasient og viser resultatene av en kontrollert nitrogenbalanseundersøkelse under behandlingen og kontrollperiodene. Nitrogenbalansen var negativ i den første kontrollperiode så vel som i de første 3 dager av behandlingen med de mindre mengder av blandingen. Under de neste 12 dager av behandlingen med de større mengder av blandingen var imidlertid nitrogenbalansen positiv. Ved tilbaketrek-ning av terapien ble igjen nitrogenbalansen negativ. Som vist avtok plasmaammoniakkinnholdet under behandlingen. I tillegg fant det sted en betydelig forbedring av de kliniske tegn på portalsystemisk encefalopati under behandlingsperioden.

Eksempel 2

En kvinne som led av portal systemisk encefalopati ble behandlet oralt med arginin a-ketoisocaproat alene, og resultatene er oppført i Tabell 3. Under de første 5 dager av kontrollperioden var hun i stand til å spise men var apatisk og utviste asterixis (flaksende skjelving) og et unormalt encefalogram.

I løpet av dagene 6 til og med 9 ble hun praktisk talt passiv og periodevis halvsløv. Proteininntaket falt og nitrogenbalansen, som allerede var negativ, ble enda mer negativ på grunn av at nitrogenproduksjonen ikke ble forandret. Den midlere ammoniakk-konsentrasjon i blodet under kontrollperioden var 90 + 15 yM.

Under de første 4 dager av terapien (dager 10 - 13) ble det observert bare en minimal forbedring i kliniske tegn men blodammoniakkonsentrasjonen falt noe (til 73 uM). Nitrogenproduksjonen øket med en mengde praktisk talt lik nitrogeninnholdet i legemidlet, slik at nitrogenbalansen ikke ble forandret.

Under de neste 7 dager (dager 14 - 20) av legemiddel-behandlingen, ble de kliniske tegn hurtig forbedret, asterixis forsvant og unormalitetene i elektroencefalogrammet avtok til et minimum. Pasienten ble i stand til å spise og nitrogenbalansen ble positiv (0,1 + 0,5 g/dag) selv om denne ikke var statistisk signifikant. Blodammoniakkonsentrasjonen falt til 50 og 55 uM.

Under den avsluttende 4-dagers kontrollperiode (dag

21 - 24) ble ingen forverring observert.

Eksempel 3

En 58 år gammel mann med portalsystemisk encefalopati etter en porto-caval shunt operasjon var alvorlig symptomatisk ved konvensjonell terapi, innbefattet restriksjon av diet protein til 30 g pr. dag, 30 ml lactulose tre ganger daglig, og tilstrekkelig laxativer for å opprettholde to avføringer pr. dag. Han ble undersøkt ved en konstant diet i løpet av en 26-dagers perio-de. Etter de første 8 dager av kontrollobservasjonen tok han en blanding av 13 mmol ornithin a-ketoisocaproat, 10 mmol ornithin a-keto-Ø-methylvalerat og 11 mmol ornithin a-ketoisovalerat daglig oralt i tre oppdelte doser i 10 dager. En ytterligere kontrollperiode på 8 dager fulgte.

I løpet av den første kontrollperiode ble hans elektroencefalogram gradert som grad 3 unormal, på en skala fra 1 (normal) til 6 (sterkt unormal). Under behandlingsperioden ble hans elektroencefalogram gradert som grad 1,25. Under den påfølgende kontrollperiode var den igjen grad 3.

Under den første kontrollperiode utviste han uttalt asterixis (flaksende skjelvinger), ataxi, langsom sløret tale og var ikke i stand til å lese avisen. Under behandlingsperioden forsvant asterixis ved den tredje dag, ataxia ble forbedret, tale og evne til å lese vendte tilbake til normal eller nærmest normal tilstand. I den andre kontrollperiode vendte asterixis tilbake ved den andre dag, gangen ble igjen ataxisk, og pasienten mistet igjen interessen for omgivelsene.

Det var ingen signifikante forandringer i plasma ammoniakkverdier (55 og 50 yM før behandling, 49, 49 og 61 uM under behandlingen, og 52 og 52 yM etter behandlingen) til trots for økning i nitrogeninntak (fra 4,8 g/dag, fra dieten, til 5,8 g/dag fra dieten plus nitrogeninnholdet i medikamentet). Det var heller ingen signifikante forandringer i plasma urea nitrogen-verdier (13 mg/dl før behandling, 14 og 12 mg/dl under behandling, og 11 og 9 mg/dl etter behandling), som innebærer at ytterligere nitrogen ble bibeholdt for anabole forhold i stedet for å utskil-les .

Selv om søkeren ikke ønsker å være bundet til noen spe-siell teori> er det antatt at saltene fremstilt ifølge oppfinnelsen dissosierer i kroppsvæsker under dannelse av de forgrenede ketosyrer pluss arginin og/eller ornithin. De forgrenede ketosyrer etter-fyller deretter kroppslagrene av forgrenede aminosyrer (leucin, valin og isoleucin) på bekostning av labile nitrogenforbindelser, aktiverer proteinsyntesen, og inhiberer økende hjerneopptak av aromatiske aminosyrer som ses i pasienter med leversykdom.

De gunstige effekter av bruk av arginin eller ornithin a-ketoisocaproat alene (se Eksempel 2) er antatt å skyldes en regulerende rolle som den essensielle aminosyre leucin spiller i proteinsyntesen. En nylig publikasjon av Sherwin og Felig viser at leucin alene i en dose på ca. 15 g pr. dag vil indusere nitrogenknapphet hos tykke personer som gjennomgår total sultekur. Envidere er det funnet at ketosyreanalogene av leucin kan ha mulige anabole egenskaper som ikke deles av leucin alene.

I tillegg til hva som er beskrevet i eksempel 2 ble ornithin a-ketoisocaproat alene administrert til en pasient som led av alvorlig portal-systemisk encefalopati. Pasienten var halv-bevistløs og reagerte dramatisk på oral administrering av 10 g ornithin a-ketoisocaproat gitt ved magesonde. Pasitenten var våken og kvikk de følgende dager men utviklet uheldigvis peritonitis, en vanlig komplikasjon hos slike pasienter, og døde.

Mekanismen ved hvilken arginin og ornithin fremkaller gunstige effekter på grunn av deres nærvær i

preparatene, er ikke fullt kjent eller forstått. Imidlertid er det kjent at ornithin kreves og anvendes katalytisk i ureasyklusen, hvor det siste trinn av ureacyklusen er splitting av arginin til ornithin pluss urea. Det er også kjent at ornithin ikke finnes i protein og kan derfor bare erholdes fra splitting av diet arginin eller fra arginin avledet fra vevnedbrytning.

Det er nylig fastslått at ornithin ødelegges av et enzym (ornithin transaminase) praksisk talt så hurtig som det får adgang til de indre av mitochondrion, hvor det anvendes i ureasyklusen (se J. E. McGivan et al. Biochemistry Journal 162: 147-156 (1977)). Envidere kan graden av transport av ornithin inn i mitochondrion være gradsbegrensende for ureadannelsen.

Selv om ornithin er en katalysator som hverken produseres eller forbrukes ved ureasyklusen, er det derfor mulig at overskudd av ornithin under visse omstendigheter kan være nødvendig for å kompensere for det ornithin som ødelegges av dette enzym som ikke er en del av syklusen.

Ved undersøkelse av neonatal citrullinemia er det nylig blitt fastslått at unormalt store mengder av arginin (og sannsynligvis også ornithine) er nødvendig for å forhindre hyperammonemia ved denne sykdom. Til trots for den fremdeles lite forståtte stimulerende effekt av ornithin< på urinsyklusen, kan man konklu-dere med at en høy konsentrasjon av arginin'. (som en kilde for ornithin.) eller en høy konsentrasjon av ornithin i seg selv vil lede til en relativt høyere grad av ureadannelse for ethvert gitt nivå av ureaforløper (innbefattet ammoniakk) konsentrasjonen i kroppsvæsker.

Bortsett fra de ovenfor teoretiske mekanismer, sees det at administrering av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen, gir synergistiske effekter som er større enn de totale effekter av administrering enten av arginin eller ornithin alene eller administrering av forgrenede ketosyrer alene. Denne synergistiske effekt kan forklares fra den mekanisme hvorved det ornitin : (gitt som sådant eller avledet fra arginin.) som ødelegges av ornithin transaminase fremkaller nitrogen i form av glutamat som deretter reagerer med ketosyren under dannelse av essensielle aminosyrer som deretter anvendes for proteinsyntesen. I motsetning til dette vil de kjente arginin og ortnithinesalter av organiske syrer, slik som maleatene eller a-ketoglutaratene eller sitratene, alle meget hurtig oxyderes i kroppen til carbondioxyd og vann. Det er tvilsomt om disse sistnevnte organiske syrer alene ville ha noen gunstige effekter ved behandlingen av hyperammonemia .

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive forbindelser av formelen hvori A er arginin eller ornithin, K er en a-ketoanalog av en forgrenet essensiell aminosyre, og x er 0 eller 1, karakterisert ved at arginin eller ornithin omsettes med en a-ketoanalog av en forgrenet essensiell aminosyre i nærvær av en fortrinnsvis liten mengde vann.

2. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som a-ketoanalog av forgrenet, essensiell aminosyre anvendes a-ketoisocapronsyre, a-ketoisovaleriansyre eller a-keto-&-methylvaleriansyre.