AT393080B - Pharmazeutische verwendung von arginin (salzen) - Google Patents

Description

AT 393 080 B

Die Erfindung beschäftigt sich mit der Behandlung von durch Glucose ausgelöste Quervemetzung von Collagen bei Diabetes mellitus-Patienten durch Arginin.

Die Quervemetzung von langlebigen Proteinen, wie Collagen, wird im diabetischen Zustand (Diabetes-mellitus Patienten) beschleunigt und verändert (S. L. Schnider und R. R. Kohn, J. Clin. Invest. 66,1179-1181 5 (1980), 61» 1630-1635 (1981)). Diese Erkenntis bildete die Grundlage für intensive Untersuchungen nach einer nicht enzymatischen Glycosylierung dieser Proteine. Neuere Arbeiten nehmen an, daß fortgeschrittene, nicht enzymatische Glycosylierungsprodukte die von Glucose abgeleiteten Quervemetzungen des Collagens bilden (vgl. V. Monnier, Cerami, A., Science 211. 491-493 (1981) und M. J. C. Kent, N. D. Light, A. J. Bailey, Biochemical J. 226,745-752 (1985)). Ein Reaktionsmechanismus für diese abnormale Quervemetzung ist in der 10 beigefügten Zeichnung Reaktionsschema (Mitte) wiedergegeben.

Glucose reagiert mit Aminogruppen von Proteinen in einer reversiblen, nukleophilen Additionsreaktion zu einem Schiffschen Basen-Addukt (Aldimin), das sich dann in einer Amadori-Umlagerung in das stabilere, aber dennoch reaktionsfähige Amadori-Produkt umwandelt (vgl. Η. B. Mortensen und C. Christophersen, Clin. Chim. Acta 124,317-326 (1983)). 15 Die so erhaltenen Amadori-Produkte durchlaufen dann eine Reihe weiterer langsamer Reaktionen mit Aminogruppen anderer Proteine, um von Glucose abgeleitete, intermolekulare Quervemetzungen zu bilden, wie das unlängst beschriebene, fortgeschrittene Glycosylierungsprodukt, nämlich 2-(2-Furoyl)-4(5)-(2-furanyl)-lH-imidazol (S. Pongor, P. C. Ulrich. F. A. Bencsath, A. Cerami, Proc. Naü. Acad. Sei. USA, 21, 2684-2688 (1984)). 20 Fortgeschrittene Glycosylierungsprodukte häufen sich über längere Zeiträume fortlaufend auf langlebigen Proteinen, wie Collagen, an (M. Brownlee, H. Vlassara, A. Cerami in: Diabetes Complications Scientifique and Clinical Aspects. M. J. C. Grabbe, Ed. (Pitman, London 1986)).

Im Collagen von diabetischen Personen wird diese altersbedingte Anhäufung von fortgeschrittenen Glycosylierungsprodukten durch den über längere Zeit erhöhten Glucosespiegel beschleunigt (Monnier, V., 25 Kohn, R. R. Cerami, A„ Proc. Natl. Acad. Sei. USA 21,583-587 (1984)).

Ausgehend von der Überlegung, daß die durch Glucose induzierte Bildung von Proteinquervemetzungen verhindert worden könnte, wenn die reaktiven Carbonyle der anfänglichen Glycosylierungsprodukte (Ketoamine) pharmakologisch blockiert werden könnten, untersuchten Brownlee und Mitarbeiter den Einfluß einer nukleophilen Hydrazinverbindung (Aminoguanidin, H2N-C(=NH)-NH-NH2) auf diesen Reaktionsablauf 30 (Brownlee, Μ., H. Vlassara, A. Kooney, P. Ulrich, A. Cerami Science 232. 1629-1632 (1986) und EP-A-222 313). Diese Autoren zeigten, daß Aminoguanidin in vitro die Bildung fortgeschrittener Glycosylierungsprodukte und die durch Glucose induzierte Collagenquervemetzung verhindert, wie dies in der Zeichnung im linken Reaktionsschema gezeigt ist). Ihre Ergebnisse zeigten auch, daß an Ratten verabreichtes Aminoguanidin die durch Diabetes induzierte Anhäufung von fortgeschrittenen Glycosylierungsprodukten und 35 eine abnormale Quervemetzung von Protein im Bindegewebe von Arterienwänden verhindert Der Einfluß von Aminoguanidin auf die Bildung fortgeschrittener Glycosylierungsprodukte wurde durch Messen der spezifischen Fluoreszenz, wie sie früher für Collagen beschrieben worden ist beurteilt

Betreffend die Albuminglycosylierung wurde festgestellt, daß durch Aminoguanidin die Bildung eines fortgeschrittenen Albuminglycosylierungsproduktes verhindert wurde, wogegen die Amadori-Umwandlung im 40 wesentlichen unverändert stattfand.

Die Wirkung von Aminoguanidin auf die Collagenquervemetzung in vitro wurde durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelectrophorese (SDS-PAGE) von Cyanbromidspaltprodukten nativer Collagenfibrillen bestimmt Mit der Zeit zeigte das Gelmuster von Cyanbromidspaltprodukten aus Collagen, das mit Glucose inkubiert wurde, erhöhte Werte an quervemetzten Peptiden mit hohem Molekulargewicht Die Anwesenheit von 45 Aminoguanidin in der Inkubationsmischung verringerte die Menge an quervemetzten Peptiden mit hohem Molekulargewicht signifikant

Die in vivo-Wirkung von Aminoguanidin wurde an nichtdiabetischen und alloxandiabetischen Ratten gezeigt Es wurden täglich intraperitoneal Injektionen von Aminoguanidin verabreicht. Es wurde die Menge an entstandenen, fluoreszierenden, fortgeschrittenen nicht enzymatischen Glycosylierungsprodukten, bestimmt Der 50 Grad der Quervemetzung des Aortenbindegewebes war in Aminoguanidin-Tieren kleiner als bei solchen, die kein

Aminoguanidin erhielten.

Die Löslichkeit von Collagen, ein anderes Kennzeichen für die Quervemetzung, ging bei mit Aminoguanidin behandelten Tieren auf normale Wate zurück.

So wie die meisten Hydrazine, besitzt auch Aminoguanidin eine außerordentlich hohe Toxizität. Es ist somit 55 in da Praxis nicht einsetzbar.

In der DE-OS 3 115 322 wird ein oral verabreichbares Mittel, das eine Kombination aus Arginin und Lysin enthält zur Stimulierung des Körpowachstums und da Gewichtszunahme vorgeschlagen. Die Wirkung dieses Mittels soll durch die kombinierte Verabreichung von Arginin und Lysin erreicht werden und in erster Linie auf einer Stimulierung der Freisetzung des Wachstumshormons beruhen. Darüber hinaus soll das aus der 60 DE-OS 3 115 322 bekannte Mittel, wie an sich bekannt, auch die Freisetzung von Insulin stimulioen.

Aus da FR-OS 2 508 797 ist es bekannt, daß Reaktionsprodukte aus bestimmten CI bis C6-Karbonsäuren -2-

AT 393 080 B und basischen Aminosäure, z. B. Arginin, die antitumorale Wirkung von Interferon und die Wirkung von Immunstimulantia erhöhen bzw. stimulieren.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Substanz anzugeben, welche zur Herstellung von Arzneimitteln geeignet ist, die die Bildung von Quervemetzungen in Collagenproteinen verhindern und die nicht toxisch ist.

5 Die Erfindung schlägt die Verwendung von Arginin, insbesondere L(+)-Arginin (HCiXiC-CHCPffi^HCS^V NH-C(NH)-NH2) oder von einem Salz desselben, vor. Dies ist eine Aminosäure, die nicht toxisch ist und die in allen Proteinen in der täglichen Nahrung enthalten ist. Für die nachstehenden Untersuchungen wurde die freie Base von L-Arginin verwendet.

Es wurden folgende in vitro Untersuchungen ausgeführt: 10 1. Fluoreszenztest nach dem Verfahren von Monnier V. et. äl. (s. oben) 2. SDS-PAGE von mit Glucose inkubierten, isolierten Collagenen mit und ohne L-Arginin, wobei Amino-guanidin als Vergleichssubstanz herangezogen wurde. 3. Inkubationsversuche mit verschiedenen Collagenpräparaten, interstitiellen Collagenen und Basalmembran- IS collagen.

Es wurden folgende in vivo-Experimente ausgeführt, wobei sowohl Schweizer Mäuse als auch spontan diabetische KK-Mäuse verwendet wurden: 20 4. Löslichkeitsversuche 5. SDS-PAGE von isolierten Collagenen 6. Bestimmung des Nierengewichtes durch Autopsie (Serumparameter: Fructosamin) 7. Nichtenzymatische Glycosylierungstestreihen und 8. Fluoreszenz testreihen. 25 Für die in vivo-Versuche wurden zwei verschiedene Versuchstierarten, nämlich Schweiz»* Mäuse und spontan diabetische KK-Mäuse verwendet.

Die täglich oral verabreichte Dosis betrug 50 mg/kg Körpermasse über einen Zeitraum von 5 Wochen.

Es wurde weder klinisch noch bei einer durchgeführten Autopsie Nebenwirkungen festgestellt 30 Dies stimmt mit klinischen Berichten von Wissenschaftern überein, die Arginin für andere Zwecke, z. B. für

Diätergänzung im gesunden Zustand und für Krankheiten, wie Argininosuccinasemangel, Asthenospermie und Immunomodulation untersucht hatten. Überdies ist Arginin im Handel, z. B. in Apotheken, rezeptfrei erhältlich und wurde in den USA durch die FDA bereits als Diätzusatzmittel zugelassen. 35 Die in vitro Versuche zeigten folgende Ergebnisse:

1. Fluoreszenzversuchsreihe von in vitro nicht enzymatisch glycosyliertem Collagen Type I (interstitielles Collagen) und Type HL

Collagen in seinem nativen Zustand wurde in 200 mM Glucose sowohl in Gegenwart als auch in 40 Abwesenheit von Arginin bzw. Aminoguanidin in equimolaren Verhältnissen nach dem Verfahren von Brownlee (Brownlee, Μ., H. Vlassara, A. Kooney, P. Ulrich, A. Cerami Science 232. 1629-1632 (1986)) inkubiert Collagene ohne Glucose im Inkubationsmedium wurden als Vergleichsproben verwendet Eine signifikante Hemmung der Fluoreszenz gemäß der Methodik von Monnier und Mitarbeitern (Monnier, V., Kohn, R. R., Cerami, A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA £1, 583 (1984)) wurde für Aminoguanidin und Arginin bei allen 45 Collagenarten beobachtet 2. Eine SDS-PAGE gemäß dem Verfahren von Brownlee mit der Abänderung, daß die Collagenspaltprodukte durch Collagenasedigestion statt durch Bromcyanspaltung erhalten wurden, zeigte höhermolekulargewichtige Collagenspaltprodukte in den Proben ohne Aminoguanidin bzw. Arginin. Bei den Proben, die Arginin bzw. 50 Aminoguanidin enthielten, wurde ein Molekulargewichts-Muster ähnlich dem von nichtglycosyliertem Collagen beobachtet 3. Ein analoger Versuch mit Basalmembrancollagen der Type IV zeigte die Aktivität von Arginin gegenüber diesem vaskulären Collagensystem auf. 55 Die in vivo Versuche zeigten folgende Ergebnisse:

Bei diesen Versuchen wurden normale Schweizer Mäuse, 10 Stück je Gruppe, weiß, weiblich, 1 Jahr alt, 6 Wochen lang mit Arginin behandelt, wobei je Tag 50 mg/kg Körpermasse Arginin oral in Leitungswasser verabreicht wurden. Die Versuchstiere hatten freien Zugang zu fester Nahrung, nämlich Standard-Mäusenahrung. Zehn entsprechende Tiere dienten als Vergleichstiere. -3- 60

AT 393 080 B 4. Löslichkeitsversuch:

Collagen wurde aus der Haut, der Leber und der Niere der Versuchstiere extrahiert. Es zeigte sich kein Unterschied in der Extrahierbarkeit von Collagen bei behandelten und unbehandelten Gruppen von Versuchstieren. 5. Bei SDS-PAGE wurden keine Unterschiede zwischen den extrahierten Collagenen beider Gruppen von Versuchstieren aufgezeigt, was zeigt, daß keine Beeinflussung der normalen Quervemetzung vorliegt. 6. Bei einer Autopsie wurden keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen von Versuchstieren festgestellt. Es wurden weder Unterschiede in den Gewichten von Organen noch pathologische Feststellungen ermittelt 7. Es bestand ein signifikanter Unterschied bei der nicht enzymatischen Glycosylierung von Serumprotein, wie sich durch einen Fructosamin-Versuch ausdrücken ließ. Die mit Arginin behandelte Gruppe zeigte niedrige Gehalte an nicht enzymatischen Glycosylierungen des Serumproteins. Dies zeigt eine Wirkung auf die nichtenzymatische Glycosylierung, die bis zu einem gewissen Ausmaß auch unter physiologischen Bedingungen stattfindet. 8. Fluoreszenztestreihen nach der oben beschriebenen Methode von aus der Haut der Leber und der Niere extrahiertem Collagen zeigten signifikante Unterschiede, die den positiven Einfluß auf die nichtenzymatische Glycosylierung, nämlich eine Verminderung dieses Prozesses, aufzeigte. 10 Monate alte KK-Mäuse, weiß, weiblich, fettleibig und diabetisch wurden 5 Wochen lang mit Arginin behandelt Es wurde die gleiche Dosierung wie oben angegeben verwendet Zehn KK-Mäuse dienten als Vergleichstiere, wobei das Protokoll wie für die Schweizer Mäuse erstellt wurde. 9. Löslichkeitsversuch:

Collagen wurde aus der Haut der Leber und der Niere der Versuchstiere extrahiert. Es gab einen signifikanten Unterschied, da die Löslichkeit bei den behandelten Tieren erheblich höher war als bei den nichtbehandelten Vergleichstieren, was einen positiven pharmakologischen Effekt von Arginin anzeigt da die geringe Löslichkeit im diabetischen Zustand einer da pathogenen Faktoren für Langzeitkomplikationen bei dieser Krankheit ist 10. Bei SDS-PAGE wurden signifikante Unterschiede aufgezeigt Nichtbehandelte KK-Mäuse zeigten Collagenspaltprodukte mit höherem Molekulargewicht als behandelte KK-Mäuse. Dies zeigt die positive Wirkung von Arginin auf die Quervemetzung von Collagen und die nichtenzymatische Glycosylierung auf. 11. Bei einer Autopsie wurden keine Unterschiede im allgemeinen Erscheinungsbild festgestellt Es wurden in beiden Gruppen keine makroskopischen pathologischen Feststellungen ermittelt jedoch wurde bei der Autopsie von diabetischen Mäusen (analog dem Menschen) festgestellt, daß nichtbehandelte Mäuse ein signifikant höheres Nierengewicht besitzen als mit Arginin behandelte Mäuse. 12. Die Serumfructosaminkonzentrationen ausgedrückt als Morpholinfructose waren bei den mit Arginin behandelten Tieren statistisch signifikant kleiner, was einen positiven pharmakologischen Effekt auf die nicht enzymatische Glycosylierung aufzeigt. 13. Fluoreszenzversuche von aus den Mäusen isolierten Collagenen zeigten signifikant geringere Werte bei den behandelten Tieren, was eine positive Wirkung auf die nicht enzymatische Glycosylierung aufzeigt.

Die oben wiedergegebenen Daten zeigten die positive, der Wirkung von Aminoguanidin ähnliche Aktivität von Arginin in vitro und in vivo, nämlich die Hemmung von fataler, glucose-induzierter Quervemetzung von Collagen im diabetischen Zustand.

Der Reaktionsmechanismus für Collagen-Protein in seiner glycosylierten Form mit Arginin ist in dem in der Zeichnung (Fig. 1) dargestellten Reaktionsschema rechts wiedergegeben, wobei Arginin mit einer seiner reaktionsfähigen, durch ein Sternchen hervorgehobenen Stellen mit der aktiven Karbonylgruppe des Ketoamins reagieren kann.

An Stelle von Arginin kann ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben (z. B. das Glutamat) verwendet werden. -4-

Claims (2)

1. AT393 080 B 5 PATENTANSPRÜCHE 1. Verwendung von Arginin oder einem Salz desselben, z. B. dem Glutamat, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung pathologischer Quervemetzung in Collagen bei Diabetes-Patienten.
2. 2. Verwendung von L(+)-Arginin oder einem Salz desselben, z. B. dem Glutamat nach Anspruch 1. 15 Hiezu 1 Blatt Zeichnung