BR112017010761B1

BR112017010761B1 - Tratamento de doenças associadas à ativação de célula estrelada hepática com o uso de terapias de redução de amônia

Info

Publication number: BR112017010761B1
Application number: BR112017010761-9A
Authority: BR
Inventors: Rajiv Jalan; Rajeshwar Prosad Mookerjee; Krista Rombouts; Fausto Andreola; Francesco De Chiara; Karen Louise Thomsen
Original assignee: Ucl Business Plc
Priority date: 2014-11-24
Filing date: 2015-11-23
Publication date: 2022-10-18
Also published as: EP3223829A1; JP2017535575A; HK1243651A1; IL252405B; ZA201703779B; EP3223829A4; CA2968544A1; DK3223829T3; AU2015353703B2; JP2020169180A; KR20230018526A; MX2020010194A; KR20170095894A; US20190070142A1; AU2015353703A1; EA201790913A1; EP3685841A1; US20200206175A1; SG11201704011XA; JP7199400B2

Abstract

São revelados no presente documento métodos para prevenir, tratar e atrasar o início ou a progressão de doenças associadas às células estreladas hepáticas (HSCs), tal como doença hepática gordurosa não alcóolica (NAFLD), fibrose e câncer hepático, com o uso de terapias de redução de amônia.

Description

Aplicações Relacionadas

[001] O presente pedido reivindica a prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido Provisório n° U.S. 62/083.814, depositado em 24 de novembro de 2014, que está expressamente incorporado ao presente documento em sua totalidade.

Antecedentes Campo

[002] O presente pedido refere-se aos campos de química farmacêutica, bioquímica e medicina. Um aspecto se refere ao tratamento e/ou prevenção de doenças associadas à ativação de célula estrelada hepática (HSC) com o uso de terapias de redução de amônia.

Descrição da Técnica Relacionada

[003] As células estreladas hepáticas (HSCs) são pericitos encontrados no espaço perisinusoidal do fígado. Dentro do fígado, as células estreladas exercem um papel importante na manutenção da integridade arquitetural do fígado e estão envolvidas no desenvolvimento de fibrose e câncer hepático. No fígado normal, as HSCs estão em um estado quiescente. Quando o fígado é danificado, as HSCs podem mudar para um estado ativado. A célula estrelada ativada é caracterizada por proliferação, contratilidade e quimiotaxia. Várias doenças podem resultar da ativação de HSCs, por exemplo, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), afecções fibróticas e câncer hepático.

[004] Várias estratégias de prevenção, tratamento e controle para doenças associadas à ativação de HSCs estão atualmente disponíveis dependendo da gravidade dos sintomas. Existe uma necessidade de terapias adicionais para tratar ou prevenir essas doenças.

Sumário

[005] Algumas modalidades reveladas no presente documento fornecem um método para tratar uma doença associada à ativação de célula estrelada hepática (HSC), em que o método compreende realizar uma terapia de redução de amônia em um indivíduo que precisa do mesmo. É também revelado um método para atrasar o início ou a progressão de uma doença associada à ativação de HSC, em que o método compreende realizar uma terapia de redução de amônia em um indivíduo que precisa do mesmo. Em algumas modalidades, realizar a terapia de redução de amônia compreende administrar um agente de redução de amônia ao indivíduo.

[006] Em algumas modalidades, a doença associada à ativação de HSC é doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD). A NAFLD pode ser, por exemplo, esteato-hepatite não alcoólica (NASH) ou esteatose.

[007] Em algumas modalidades, a doença associada à atividade de HSC é câncer hepático. Em algumas modalidades, a doença associada à atividade de HSC é uma afecção fibrótica. A afecção fibrótica pode ser, por exemplo, fibrose hepática. Em algumas modalidades, o indivíduo está sofrendo de doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD).

[008] Algumas modalidades fornecem um método para prevenir doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), em que o método compreende realizar uma terapia de redução de amônia em um indivíduo que precisa do mesmo. Por exemplo, a NAFLD pode ser esteato-hepatite não alcoólica (NASH) ou esteatose. Em algumas modalidades, realizar a terapia de redução de amônia compreende administrar um agente de redução de amônia ao indivíduo.

[009] Em algumas modalidades, o agente de redução de amônia é, ou compreende, um fosfato de magnésio (MGP), fenilbutirato de glicerol (GPB), fenilacetato de sódio, fenilbutirato de sódio (NaPBA), glutamina, benzoato de sódio, L-arabinose, um laxante, um antibiótico, ornitina em combinação com pelo menos um dentre fenilacetato e fenilbutirato ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o agente de redução de amônia é, ou compreende, ornitina em combinação com pelo menos um dentre fenilacetato e fenilbutirato.

[010] Nos métodos revelados no presente documento, em algumas modalidades, sais farmaceuticamente aceitáveis separados da ornitina e pelo menos um dentre fenilacetato e fenilbutirato são administrados ao indivíduo. Em algumas modalidades, pelo menos um dentre fenilacetato e fenilbutirato é administrado como um fenilacetato de sódio ou fenilbutirato de sódio. Em algumas modalidades, a ornitina é administrada como um aminoácido monomérico livre ou sal fisiologicamente aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, a ornitina e fenilacetato é administrada como ornitina fenilacetato.

[011] Em algumas modalidades, a administração é administração oral, intravenosa, intraperitoneal, intragástrica ou intravascular. Em algumas modalidades, a administração é administração intravenosa. Em algumas modalidades, a administração é administração oral

Breve descrição dos Desenhos

[012] As Figuras 1A a 1C mostram que a amônia reduz, de uma maneira dependente de dose, a proliferação celular e o metabolismo em Células Estreladas Hepáticas humanas primárias in vitro. A Figura 1A mostra que a amônia inibe a síntese de DNA (BrdU) e a atividade metabólica (MTS), e a Figura 1B mostra que a inibição é atingida sem induzir a morte celular. A Figura 1C mostra que a amônia induziu fortes alterações morfológicas de uma maneira dependente de dose, isto é, de células semelhantes a miofibroblasto em fibroblastos fusiformes conforme foi observado por microscopia de luz e por teste de viabilidade de Células Vermelhas Neutras (20X, 40X). Os gráficos de barras mostram as médias de três valores independentes ± SD. *P< 0,05, **P < 0,01 e ***P< 0,001 versus valores correspondentes de meio sem soro (SFM).

[013] As Figuras 2A a 2F mostram que a amônia induz alterações em tensão citoplasmática, que coincide com alterações no metabolismo/função celular, contração e arquitetura do citoesqueleto de actina. A Figura 2A são imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) que mostram que a amônia de uma maneira dependente de dose causou alterações morfológicas drásticas com aparência de vacúolos citoplasmáticos (V=vacúolos; N=núcleo). A Figura 2B mostra a recuperação de proliferação celular após a depleção de meio de cultura rico em amônia. Os gráficos de barras mostram as médias de três valores independentes ± SD. *P< 0,05 e ***P< 0,001 versus SFM. As Figuras 2C e 2D representam os resultados de um ensaio de contração de gel de colágeno que mostram que a amônia induz a contração de hHSC. Os gráficos de barras mostram as médias de 2 experimentos independentes (valores ± SD. *P< 0,05 e **P< 0,01 versus valores correspondentes de SFM. A Figura 2E mostra que a contração de HSC induzida por amônia coincide com alterações na morfologia. A Figura 2F mostra que o tratamento prolongado (72 h) com amônia induz, de uma maneira dependente de dose, a reorganização de actina filamentosa (coloração com faloidina - TRITC).

[014] As Figuras 3A a 3C mostram que a amônia induz a produção de ROS. A Figura 3A mostra que o tratamento prolongado de hHSC com amônia por 72 horas induz a produção de ROS em hHSC. A formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) foi medida com o uso de Kit de Detecção de Espécies Reativas de Oxigênio Verdes Image-IT™ LIVE. Na Figura 3B, a intensidade de fluorescência média (MFI) de sinal de ROS foi normalizada de acordo com o número de células (Hoechst 33342) e expressa como porcentagem de controle. Os gráficos de barras mostram as médias de três valores independentes ± SD. ***P< 0,001 versus valores correspondentes de SFM. A Figura 3C mostra que a hiperamonemia aumenta os níveis de expressão de mRNA de marcador de ROS SOD2 em 3 e 24 horas. Os gráficos de barras mostram as médias de 2 valores independentes ± SD. ***P< 0,001 versus valores correspondentes de SFM. A Figura 3D mostra que o sequestrante ROS induzido por NAC reduz a expressão de mRNA SOD2 induzida por amônia em 24 horas. Os gráficos de barras mostram as médias de 2 valores independentes ± SD. *P< 0,05 **P < 0,01 versus valores correspondentes de SFM.

[015] As Figuras 4A a 4C mostram que a amônia modifica a expressão de mRNA e o nível de proteína de diversos marcadores de atividade de HSC e pró-inflamatórios. A Figura 4A mostra que a amônia afeta a expressão de proteína de α-SMA, vimentina, PDGF-Rβ, Miosina IIa e IIb e p-38 MAPK. A Figura 4B mostra que a amônia induz a regulação positiva de mRNA de MMP2 enquanto mRNA de TIMP1 é regulado negativamente. A Figura 4C mostra que a expressão de mRNA de Interleucina 1β e a Interleucina IL6 não reguladas de modo positivo. Os gráficos de barras mostram as médias de três valores independentes ± SD. *P< 0,05, **P< 0,01 e ***P< 0,001 versus valores correspondentes de SFM.

[016] As Figuras 5A e 5B mostra que o tratamento de hiperamonemia intensifica ainda mais os marcadores de HSC induzidos por BDL in vivo. A Figura 5A mostra que os níveis plasmáticos de amônia são significativamente regulados de modo positivo em animais BDL e animais alimentados com AAs em comparação com ratos operados de modo simulado (*P< 0,05 e **P< 0,01 versus Simulado). O tratamento de OP reduz significativamente a amônia em animais alimentados com BDL- AAs em comparação com animais BDL (**P< 0,01). A Figura 5B mostra que o tratamento de hiperamonemia em fibrose induzida por BDL mostrou um aumento significativo adicional em Miosina IIb, Colágeno tipo I e expressão de proteína PDGF-Rβ em comparação com fibrose induzida por BDL (**P< 0,01 e ***P < 0,001). Em contraste, o tratamento com OP anulou o efeito forte de BDL alimentado com AAs em todos os marcadores de ativação relacionados a HSC (*P< 0,05, **P< 0,01 e ***P< 0,001).

[017] A Figura 6 mostra a expressão de proteína ornitina transcarbamilase (OTC) e gene em ratos alimentados com uma dieta normal e de alto teor de colesterol e alto teor de gordura por 10 meses e recuperação por 2 meses.

[018] A Figura 7 mostra a expressão gênica de OTC em camundongos alimentados com uma dieta com deficiência de metionina-colina (MCD) por 4 semanas e tratados com ou sem carbono.

[019] A Figura 8 mostra a expressão gênica de OTC em pacientes humanos com NAFLD com esteatose simples ou NASH+fibrose durante cirurgia bariátrica.

Descrição Detalhada

[020] Na descrição detalhada a seguir, é feita referência aos desenhos anexos, que formam uma parte do presente documento. As realizações ilustrativas descritas na descrição detalhada, desenhos, e reivindicações não são destinados a ser limitadores. Outras realizações podem ser utilizadas, e outras mudanças podem ser feitas, sem que se afaste do espírito ou escopo de a matéria apresentada aqui. Será prontamente entendido que os aspectos da presente revelação, conforme descrito de modo geral no presente documento, podem ser dispostos, substituídos, combinados e projetados em uma vasta variedade de configurações diferentes, todas as quais são contempladas explicitamente e fazem parte desta revelação.

Definições

[021] Conforme usado no presente documento, um “indivíduo” se refere a um animal que é o objeto de tratamento, observação ou experimento. “Animal” compreende vertebrados e invertebrados de sangue frio e quente, tais como peixes, mariscos, répteis, em particular, mamíferos. “Mamífero” compreende, sem limitação, camundongos; ratos; coelhos; porquinhos-da-índia; cães; gatos; ovelhas; cabras; vacas; cavalos; primatas, tais como macacos, chimpanzés e símios, e, em particular, seres humanos.

[022] Conforme usado no presente documento, um “paciente” se refere a um indivíduo que está sendo tratado por um profissional médico, tal como um Doutor em Medicina (isto é, Doutor de medicina alopática ou Doutor de medicina osteopática) ou um Doutor de Medicina Veterinária, para tentar curar, ou pelo menos atenuar os efeitos, uma doença ou distúrbio particular ou prevenir que a doença ou distúrbio ocorra primeiramente.

[023] Conforme usado no presente documento, "administração" ou "administrar" se refere a um método para dar uma dosagem de um ingrediente farmaceuticamente ativo a um vertebrado.

[024] Conforme usado no presente documento, uma “dosagem unitária” se refere a uma quantidade de agente terapêutico administrada a um paciente em uma dose única.

[025] Conforme usado no presente documento, uma “dosagem diária” se refere à quantidade total de agente terapêutico administrada a um paciente em um dia.

[026] Conforme usado no presente documento, “quantidade terapeuticamente eficaz” ou “quantidade farmaceuticamente eficaz” significa uma quantidade agente terapêutico que tem um efeito terapêutico. As dosagens de um ingrediente farmaceuticamente ativo que são úteis no tratamento são quantidades terapeuticamente eficazes. Assim, conforme usado no presente documento, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa aquelas quantidades de agente terapêutico que produzem o efeito terapêutico desejado conforme julgado por resultados de testes clínicos e/ou estudos de animal modelos.

[027] Conforme usado no presente documento, um “efeito terapêutico” alivia, em alguma extensão, um ou mais dos sintomas de uma doença ou um distúrbio. Por exemplo, um efeito terapêutico pode ser observado por uma redução do desconforto subjetivo que é comunicado por um indivíduo (por exemplo, desconforto reduzido notado no questionário autoadministrado pelo paciente).

[028] “Tratar”, “tratamento” ou “que trata”, conforme usado no presente documento, se refere a administrar um composto ou uma composição farmacêutica a um indivíduo para propósitos profiláticos e/ou terapêuticos. O termo “tratamento profilático” se refere a tratar um indivíduo que não exibe ainda sintomas de uma doença ou afecção, mas que está suscetível a ou, de outro modo, em risco de uma doença ou afecção particular, em que o tratamento reduz a probabilidade de que o paciente desenvolva a doença ou a afecção. O termo “tratamento terapêutico” se refere a administrar tratamento a um indivíduo que já sofre de uma doença ou uma afecção.

Abreviações

[029] BDL = ligação do duto biliar.

[030] OP = ornitina, fenilacetato

[031] OTC = ornitina transcarbamilase

[032] GS = glutamina sintetase

[033] HSC = célula estrelada hepática

Terapias de Redução de Amônia

[034] São reveladas no presente documento várias terapias de redução de amônia que podem ser usadas para reduzir o nível de amônia em um indivíduo. Por exemplo, um ou mais agentes de redução de amônia podem ser usados na terapia para reduzir o nível de amônia no indivíduo. Conforme usado no presente documento, o termo “agente de redução de amônia” se refere a uma substância que pode ser usada para reduzir o nível de amônia em um indivíduo. O mecanismo pelo qual o agente de redução de amônia reduz o nível de amônia pode variar. Por exemplo, o agente de redução de amônia pode reduzir o nível de amônia em um indivíduo por redução da geração de amônia no indivíduo ou por absorção da amônia no indivíduo, ou extração de amônia no cólon e remoção de amônia através de um efeito laxante ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o nível de amônia no indivíduo pode ser o nível de amônia no sangue (por exemplo, plasma) do indivíduo. Em algumas modalidades, a terapia de redução de amônia compreende administrar um ou mais agentes de redução de amônia ao indivíduo.

[035] Os exemplos não limitantes de agentes de redução de amônia compreendem produto de fosfato de magnésio (MGP), fenilbutirato de glicerol (GPB), fenilacetato de sódio, fenilbutirato de sódio (NaPBA), glutamina, benzoato de sódio, clorofila, L-arabinose, laxantes, antibióticos, ornitina em combinação com pelo menos um dentre fenilacetato e fenilbutirato e qualquer combinação dos mesmos. Os agentes de redução de amônia podem estar presentes, por exemplo, em uma composição farmacêutica, uma composição nutracêutica, uma composição probiótica ou qualquer combinação dos mesmos. Os laxantes são substâncias que podem soltar as fezes e aumentar os movimentos intestinais. Os laxantes podem ser usados para reduzir os níveis de amônia no trato gastrointestinal de um indivíduo, por exemplo, alterando-se a flora bacteriana no trato gastrointestinal do indivíduo e tornando-se alguns organismos disponíveis para produzir amônia. Os exemplos de laxantes compreendem, porém, sem limitação, lactulose.

[036] O agente de redução de amônia pode ser, ou compreender, um ou mais antibióticos. Por exemplo, o agente de redução de amônia pode ser administrado pela via oral para permitir que o antibiótico (ou antibióticos) atuem no trato gastrointestinal. Sem se ater a qualquer teoria particular, se acredita que o antibiótico (ou antibióticos) pode reduzir as bactérias produtores de amônia do intestino para reduzir o nível de amônia no indivíduo. Os exemplos não limitantes dos antibióticos compreendem neomicina, vancomicina e rifaximina (Xifaxan).

[037] Em algumas modalidades, diferentes agentes de redução de amônia são usados em combinação para reduzir o nível de amônia no indivíduo. Por exemplo, um ou mais laxantes e um ou mais antibióticos podem ser administrados ao indivíduo para reduzir o nível de amônia no indivíduo.

[038] Como outro exemplo não limitante, a terapia de redução de amônia pode ser, ou compreender, ajustar a composição de microbiota intestinal no indivíduo. Em algumas modalidades, ajustar a composição de microbiota intestinal do indivíduo compreende transplantação bacteriano, tal como transplantação fecal. Em algumas modalidades, ajustar a composição da microbiota intestinal no indivíduo compreende aumentar o nível de uma ou mais espécies bacterianas que carecem ou têm baixa atividade de urase na microbiota intestinal do indivíduo. Em algumas modalidades, ajustar a composição da microbiota intestinal no indivíduo compreende substituir a microbiota intestinal nativa do indivíduo por uma composição que tem alto nível de uma ou mais espécies bacterianas que carecem ou têm baixa atividade de urase. Em algumas modalidades, ajustar a composição de microbiota intestinal no indivíduo compreende administrar ao indivíduo uma composição que compreende uma ou mais espécies bacterianas que carecem ou têm baixa atividade de urase. Os exemplos das bactérias que carecem ou têm baixa atividade de urease compreendem, porém, sem limitação, Parabacteroides, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Eubacterium, Mucispirillum, Lactobacillus e Clostridium. Em algumas modalidades, as bactérias que carecem ou têm atividade de urease mais baixa são Clostridia, Mucispirillum schaedleri, Parabacteroides, Lactobacilli ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a terapia de redução de amônia compreende transplantar a flora de Schaedler (ASF), que consiste em 8 cepas bacterianas comensais intestinais murinas que foram montadas nos anos 70 e padronizadas pelo Instituto Nacional do Câncer em 1978 (Dewhirst et al., Appl. Environ Microbiol. 1999; 65(8):3.287 a 3.292, ao indivíduo. Sem se ater a qualquer teoria particular, se acredita que a urease bacteriana converta ureia derivada do hospedeiro em amônia e dióxido de carbono, contribuindo para a hiperamonemia, e a microbiota intestinal que tem atividade de urease nula ou reduzida pode reduzir a produção de amônia e, assim, o nível de amônia no indivíduo.

[039] Adicionalmente, a terapia de redução de amônia pode ser, ou compreender, terapia gênica para corrigir defeitos que contribuem para a hiperamonenia no indivíduo. Por exemplo, a hiperamonemia pode ser causada por defeitos em genes que codificam enzimas envolvidas no ciclo da ureia, incluindo, porém, sem limitação, gene de Ornitina Transcarbamilase (OTC), gene de Carbamil Fosfato Sintetase (CPS1), Ácido Argininossuccínico Sintetase (AAS), Argininossuccinato Liase (ASL) e Arginase (AG). A hiperamonemia pode ser também causada por defeitos no gene de cistationa beta sintase (CBS) e gene de glutamina sintetase. A terapia gênica pode ser realizada por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, vetores virais recombinantes (por exemplo, vetores virais adenoassociados e vetores de baculovírus) podem ser usados para entregar (por exemplo, entrega direcionada a células hepáticas) o gene (ou genes) faltante ao indivíduo para reduzir o nível de amônia no indivíduo. Consultar, por exemplo, Torres-Vega et al. Gene Therapy (2015) 22, 58 a 64 (cujo conteúdo total está incorporado ao presente documento a título de referência). Em algumas modalidades, vetores de AAV que compreendem o gene de OTC intacto são administrados em um indivíduo que precisa do mesmo para reduzir o nível de amônia no indivíduo. Em algumas modalidades, vetores de AAV que compreendem o gene de glutamina sintetase intacto são administrados em um indivíduo que precisa do mesmo para reduzir o nível de amônia no indivíduo.

Tratamento e Prevenção de Doenças Associadas à Atividade de HSC

[040] As células estreladas hepáticas (HSCs) são células do mesênquima fígado-específicas que exercem papéis importantes na fisiologia e fibrogênese hepática e manutenção da integridade arquitetural do fígado. As HSCs estão, de modo geral, localizadas no espaço de Disse e mantêm interações próximas com células endoteliais sinusoidais e células epiteliais hepáticas. As HSCs controlam muitas funções importantes no fígado e sua disfunção está associada a várias afecções patológicas. As HSCs podem impactar a diferenciação, a proliferação e a morfogênese de outros tipos de células hepáticas durante o desenvolvimento e a regeneração do fígado.

[041] No fígado normal, as HSCs estão em um estado quiescente. As HSCs podem mudar para um estado ativado quando o fígado está danificado. Por exemplo, após lesão hepática aguda ou crônica, as HSCs sofrem transformação fenotípica de células “quiescente” (não proliferante e não contrátil) para “ativada” (semelhantes a miofibroblastos promitogênicas, profibrogênicas e pró-inflamatórias). Além disso, durante o processo de ativação, as HSCs se tornam altamente contráteis e têm o mecanismo necessário para contrair e relaxar em resposta a diversas substâncias/estímulos vasoativos. As HSCs ativadas podem produzir uma ampla variedade de citocinas e quimiocinas que podem intensificar diretamente a proliferação de células progenitoras hepáticas e hepatócitos. As HSCs estão envolvidas, por exemplo, no desenvolvimento de fibrose e câncer hepático. A atividade de HSC pode levar a várias doenças, afecções e sintomas, compreendendo, porém, sem limitação, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), afecções fibróticas (por exemplo, fibrose hepática), câncer hepático e qualquer combinação dos mesmos. Os exemplos não limitantes de câncer hepático compreendem carcinoma hepatocelular (HCC) e hepatoblastoma. Em algumas modalidades, os métodos para tratar e/ou prevenir doenças associadas à atividade de HSC compreendem identificar um indivíduo que sofre de ou está em risco de desenvolver uma doença associada à atividade de HSC. Em algumas modalidades, a doença associada à atividade de HSC pode ser NAFLD, fibrose hepática, câncer hepático ou qualquer combinação dos mesmos.

[042] NAFLD se refere a um grupo de afecções em que há acúmulo de gordura em excesso no fígado de pessoas que bebem pouco ou nenhum álcool. NFALD é um distúrbio hepático comum em países desenvolvidos. A forma mais comum de NAFLD é uma afecção não grave chamada de fígado gordo. NAFLD ocorre quando a gordura está depositada (esteatose) no fígado. Embora ter gordura no fígado não seja normal, por si só a mesma provavelmente não danifica o fígado. NAFLD é uma causa comum de fibrose. Suspeita-se algumas vezes de NAFLD em uma pessoa com sobrepeso ou obesa que se conclui que tenha elevações moderadas em seus testes hepáticos durante um teste de sangue de rotina ou incidentalmente detectadas em investigações radiológicas, tal como ultrassonografia abdominal ou varredura CT.

[043] A esteato-hepatite não alcoólica (NASH)é uma forma mais grave de NAFLD. Em NASH, o acúmulo de gordura está associado à inflamação de células hepáticas e diferentes graus de cicatrização. NASH é uma afecção potencialmente grave que pode levar à cicatrização hepática grave e cirrose. Sem se ater a qualquer teoria particular, se acredita que NASH esteja associado à expressão e à função reduzidas de ornitina transcarbamoilase (OTC, também chamada de ornitina carbamoiltransferase) em seres humanos e roedores. Por exemplo, em NASH experimental, a expressão de gene e proteína da enzima do ciclo de ureia mitocondrial ornitina transcarbamilase (OTC) é reduzida significativamente, resultando em redução funcional na capacidade in vivo para ureagênese, que resulta em hiperamonemia. Em pacientes com NASH comprovado por biópsia, os níveis plasmáticos de amônia são aumentados significativamente mais do que em pacientes com esteatose simples. Em mamíferos, a enzima OTC é parte do ciclo da ureia. Em um mamífero deficiente em OTC, o nível de amônia acumulará, o que pode causar hiperamonemia e subsequentemente problemas neurológicos.

[044] É revelado pela primeira vez na presente revelação que a amônia produz alterações morfológicas e funcionais marcadas em HSCs humanas e in vivo em ratos com duto biliar ligado (por exemplo, tensão oxidativa, citocinas aumentadas, expressão de marcadores de ativação, alterações na secreção de proteínas de matriz e perturbação morfológica grave). Se se ater a qualquer teoria particular, se acredita que a hiperamônia pode ativar HSCs in vivo e in vitro, o que pode favorecer a progressão de NAFLD (por exemplo, NASH) e fibrose. Conforme descrito no presente documento, uma redução em nível de amônia em um indivíduo pode prevenir a ativação de HSCs no indivíduo e reduz, por exemplo, doenças associadas à atividade de HSC.

[045] Algumas modalidades descritas no presente documento fornecem métodos para tratar uma doença associada à atividade de HSC em um indivíduo que precisa do mesmo realizando-se no indivíduo uma terapia de redução de amônia. Algumas modalidades descritas no presente documento fornecem métodos para atrasar o início ou a progressão de uma doença associada à atividade de HSC em um indivíduo que precisa do mesmo realizando-se no indivíduo uma terapia de redução de amônia. Em algumas modalidades, realizar a terapia de redução de amônia compreende administrar um agente de redução de amônia ao indivíduo. Em algumas modalidades, o agente de redução de amônia é, ou compreende, um fosfato de magnésio (MGP), fenilbutirato de glicerol (GPB), fenilacetato de sódio, fenilbutirato de sódio (NaPBA), glutamina, benzoato de sódio, L-arabinose, um laxante, um antibiótico, ornitina em combinação com pelo menos um dentre fenilacetato e fenilbutirato ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, os métodos compreendem coadministrar ao indivíduo ornitina em combinação com fenilacetato e/ou fenilbutirato. Em algumas modalidades, a doença associada à atividade de HSC é NAFLD, por exemplo, NASH ou esteatose. Em algumas modalidades, a doença associada à atividade de HSC é câncer hepático, por exemplo, HCC ou hepatoblastoma. Em algumas modalidades, a doença associada à atividade de HSC é uma afecção fibrótica, por exemplo, fibrose hepática. Em algumas modalidades, o indivíduo que sofre de câncer hepático e/ou da afecção fibrótica pode sofrer de NAFLD também. Em algumas modalidades, dois ou mais agentes de redução de amônia são coadministrados ao indivíduo. Em algumas modalidades, um ou mais agentes de redução de amônia são coadministrados com outro ingrediente farmaceuticamente ativo ao indivíduo. Em algumas modalidades, a composição de microbiota intestinal no indivíduo é ajustada para tratar uma doença associada à atividade de HSC. Em algumas modalidades, terapia gênica é usada como a terapia de redução de amônia para tratar uma doença associada à atividade de HSC.

[046] São também revelados no presente documento métodos para prevenir NAFLD realizando-se uma terapia de redução de amônia em um indivíduo que precisa do mesmo. Em algumas modalidades, realizar a terapia de redução de amônia compreende administrar um agente de redução de amônia ao indivíduo. Qualquer um dos agentes de redução de amônia revelados no presente documento pode ser usado nos métodos, incluindo, porém, sem limitação, produto de fosfato de magnésio (MGP), fenilbutirato de glicerol (GPB), fenilacetato de sódio, fenilbutirato de sódio (NaPBA), glutamina, benzoato de sódio, L-arabinose, laxantes, antibióticos, ornitina em combinação com pelo menos um dentre fenilacetato e fenilbutirato e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, os métodos compreendem coadministrar ao indivíduo ornitina em combinação com fenilacetato e/ou fenilbutirato. Em algumas modalidades, a composição da microbiota intestinal no indivíduo é ajustada para prevenir NAFLD. Em algumas modalidades, a terapia gênica é usada como a terapia de redução de amônia para prevenir NAFLD.

[047] Algumas modalidades descritas no presente documento fornecem métodos para tratar uma afecção fibrótica realizando-se uma terapia de redução de amônia em um indivíduo que precisa do mesmo. A terapia de redução de amônia pode compreender, em algumas modalidades, coadministrar a um indivíduo que precisa do mesmo um agente de redução de amônia, tal como ornitina em combinação com fenilacetato e/ou fenilbutirato. Algumas tais modalidades compreendem tratamento terapêutico. Outras modalidades compreendem tratamento profilático. Conforme usado no presente documento, uma “afecção fibrótica” se refere a uma afecção, uma doença ou um distúrbio que é caracterizado por proliferação ou atividade desregulada de fibroblastos e/ou acúmulo anormal de fibronectina e/ou acúmulo patológico ou excessivo de tecido colagenoso. Tipicamente, qualquer tal doença, distúrbio ou afecção é receptivo ao tratamento por administração de um composto que tem atividade antifibrótica. Os distúrbios fibróticos compreende, porém, sem limitação, fibrose hepática (por exemplo, fibrose hepática associada à hepatite ativa crônica). Assim, algumas modalidades compreendem métodos para tratar a fibrose hepática coadministrando-se a um indivíduo que precisa do mesmo ornitina em combinação com fenilacetato e/ou fenilbutirato. Algumas modalidades compreendem identificar um indivíduo como tendo ou estando em risco de desenvolver uma afecção fibrótica (por exemplo, fibrose hepática) antes de administrar a ornitina em combinação com fenilacetato e/ou fenilbutirato.

[048] Por “coadministração”, quer-se dizer que dois ou mais agentes podem ser encontrados na corrente sanguínea do paciente ao mesmo tempo, a despeito de quando ou como os mesmos são realmente administrados. Em algumas modalidades, os agentes são administrados simultaneamente. Em tal modalidade, a administração em combinação é realizada combinando-se os agentes em uma forma de dosagem única. Em algumas modalidades, os agentes são administrados sequencialmente. Em algumas modalidades, os agentes são administrados através da mesma via, tal como via oral. Em algumas modalidades, os agentes são administrados através de diferentes vias, tal como um sendo administrado por via oral e o outro sendo administrado i.v.

[049] Conforme descrito no presente documento, NASH está associado à expressão e à função reduzidas da enzima do ciclo da ureia, nível de ornitina transcarbamoilase (OTC) em seres humanos e roedores, o que resulta em hiperamonemia. Sem se ater a qualquer teoria particular, se acredita que a amônia seja elevada em NAFLD e esteja envolvida na progressão de NAFLD e câncer hepático. Adicionalmente, os agentes de redução de amônia (por exemplo, OP) são úteis para reduzir o nível de amônia no sangue no indivíduo que tem hiperamonemia, tal como a hiperamonemia associada a NASH e, assim, prevenir, limitar ou retardar a progressão de NAFLD, progressão de fibrose em NASH e o desenvolvimento de câncer hepático (por exemplo, HCC). Em algumas modalidades, o agente de redução de amônia é útil para reduzir o nível de amônia no sangue, que trata e atrasa o início ou a progressão de NASH.

[050] Algumas modalidades compreendem tratar uma afecção fibrótica (por exemplo, fibrose hepática) realizando-se uma terapia de redução de amônia em um indivíduo que precisa. Por exemplo, a terapia de redução de amônia pode compreender administrar a um indivíduo que precisa um agente de redução de amônia, por exemplo, ornitina em combinação com fenilacetato e/ou fenilbutirato. Algumas tais modalidades compreendem tratamento terapêutico. Algumas modalidades compreendem tratamento profilático. Algumas modalidades compreendem identificar um indivíduo como tendo ou estando em risco de desenvolver a afecção fibrótica (por exemplo, fibrose hepática) antes de administrar o agente de redução de amônia.

[051] Algumas modalidades compreendem métodos para tratar um câncer hepático realizando-se uma terapia de redução de amônia em um indivíduo que precisa. Por exemplo, a terapia de redução de amônia pode compreender coadministrar a um indivíduo que precisa do mesmo um agente de redução de amônia, por exemplo, ornitina em combinação com fenilacetato e/ou fenilbutirato. Algumas tais modalidades compreendem tratamento terapêutico. Algumas modalidades compreendem tratamento profilático. Algumas modalidades compreendem identificar um indivíduo como tendo ou estando em risco de desenvolver câncer hepático antes de administrar o agente de redução de amônia. Algumas modalidades compreendem tratar câncer hepático administrando-se ornitina em combinação com fenilacetato e/ou fenilbutirato, por exemplo, ornitina fenilacetato, ao indivíduo. O câncer hepático pode ser, por exemplo, HCC ou hepatoblastoma.

[052] O nível de amônia em um indivíduo pode ser determinado por vários métodos convencionais. Por exemplo, a amônia é rotineiramente medida em plasma de uma amostra de sangue venoso (ou arterial). A mesma pode ser também medida em sangue total, eritrócitos, saliva, suor e urina. As medições de amônia podem ser usadas para diagnosticar hiperamonemia. A amônia pode ser medida por métodos diretos e indiretos. Por exemplo, a amônia pode ser medida pela alteração de cor de um indicador de amônio, por exemplo, a medição de amônia Vitros® (Ortho Diagnostic Ltd.) que utiliza azul de bromofenol. Como outro exemplo, uma membrana seletiva para NH4+ que é tipicamente baseada em uma mistura de antibióticos nonatina e monoactina pode ser também usada para medir o nível de amônia. Em algumas modalidades, os métodos revelados no presente documento compreendem determinar o nível de amônia no indivíduo antes e/ou após a administração do agente de redução de amônia. Em algumas modalidades, o nível de amônia no indivíduo é monitorado por todo o período em que o indivíduo está recebendo o tratamento por agente de redução de amônia. A redução em níveis de amônia in vivo pode reduzir a inflamação (NF!B), tensão oxidativa e expressão de αSMA e aumentar em atividade e função de óxido nítrico sintase (eNOS).

Sais

[053] Em algumas modalidades, os agentes de redução de amônia (tal como ornitina em combinação com fenilacetato e/ou fenilbutirato) são administrados como sais farmaceuticamente aceitáveis. O termo “sal farmaceuticamente aceitável” se refere a sais que retêm a eficácia biológica e as propriedades de um composto e que não são indesejáveis biologicamente ou de outro modo para uso em um produto farmacêutico. Em muitos casos, os agentes de redução de amônia revelados no presente documento têm a capacidade de formar sais ácidos e/ou básicos em virtude da presença de grupos amino e/ou carboxila ou grupos similares aos mesmos. Os sais de adição ácidos farmaceuticamente aceitáveis podem ser formados com ácidos inorgânicos e ácidos orgânicos. Os ácidos inorgânicos dos quais os sais podem ser derivados compreendem, por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e similares. Os ácidos orgânicos dos quais sais podem ser derivados compreendem, por exemplo, ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malônico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico e similares. Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser também formados com o uso de bases orgânicas e inorgânicas. As bases inorgânicas das quais os sais podem ser derivados compreendem, por exemplo, bases que contêm sódio, potássio, lítio, amônio, cálcio, magnésio, ferro, zinco, cobre, manganês, alumínio e similares; são particularmente preferenciais os sais de amônio, potássio, sódio, cálcio e magnésio. Em algumas modalidades, o tratamento dos compostos revelados no presente documento com uma base inorgânica resulta em perda de um hidrogênio lábil do composto para proporcionar a forma de sal, compreendendo um cátion inorgânico, tal como Li+, Na+, K+, Mg2+ e Ca2+ e similares. As bases orgânicas das quais os sais podem ser derivados compreendem, por exemplo, aminas primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas, compreendendo aminas substituídas de ocorrência natural, aminas cíclicas, resinas de troca iônica básicas e similares, especificamente tais como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina e etanolamina. Muitos tais sais são conhecidos na técnica, conforme descrito no documento WO 87/05297, Johnston et al., publicado em 11 de setembro de 1987 (incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade).

[054] Em algumas modalidades, ornitina é administrada como o sal HCl de ornitina. Em algumas modalidades, fenilacetato ou fenilbutirato é administrado como seus sais de sódio. Em algumas modalidades, ornitina e fenilacetato ou fenilbutirato são administrados como sais um do outro (por exemplo, fenilacetato de ornitina).

Composições Farmacêuticas e Vias de Administração

[055] O agente de redução de amônia (tal como ornitina em combinação com fenilacetato e/ou fenilbutirato) pode ser formulado para administração com um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável. O agente de redução de amônia pode ser, em algumas modalidades, formulado como um medicamento com um carreador (ou carreadores) e/ou excipiente (ou excipientes) farmaceuticamente aceitáveis como é rotina na técnica farmacêutica. A natureza exata da formulação dependerá de diversos fatores, compreendendo a via de administração desejada. Por exemplo, o agente de redução de amônia (por exemplo, a ornitina e o fenilacetato e/ou fenilbutirato) pode ser formulado para administração oral, intravenosa, intragástrica, intravascular ou intraperitoneal. Técnicas de formulação farmacêutica padrão podem ser usadas, tais como aquelas reveladas em Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21aEdição, Lippincott Williams & Wilkins (2005), incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[056] A ornitina (por exemplo, L-ornitina) e o fenilacetato ou o fenilbutirato podem ser administrados separadamente ou em uma forma de dosagem única. Em algumas modalidades, a combinação é administrada como o sal fenilacetato de ornitina ou como uma solução do sal fenilacetato de ornitina.

[057] As diferentes formas de composição de ornitina em combinação com pelo menos um dentre fenilacetato (ou sais acetato de fenila) e fenilbutirato foram descritas nas Publicações de Patente n° U.S. US2008/0119554 e US2010/0280119, que estão incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, ornitina e fenilacetato estão presentes e/ou são administrados como fenil acetato de ornitina ou um sal fisiologicamente aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, a ornitina está presente e/ou é administrada como um aminoácido monomérico livre ou sal fisiologicamente aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos um dentre fenilacetato e fenilbutirato está presente e/ou é administrado como um fenilacetato de sódio ou fenilbutirato de sódio. Em algumas modalidades, um sal fisiologicamente aceitável de ornitina e um sal fisiologicamente aceitável de pelo menos um dentre fenilacetato e fenilbutirato são administrados ao indivíduo.

[058] Conforme revelado no presente documento, a ornitina e o fenilacetato e/ou o fenilbutirato podem ser formulados para administração em uma composição farmacêutica que compreende agentes ativos de superfície fisiologicamente aceitáveis, carreadores, diluentes, excipientes, agentes de alisamento, agentes de suspensão, substâncias de formação de file, auxiliares de revestimento ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a ornitina e o fenilacetato e/ou o fenilbutirato são formulados para administração com um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável. A ornitina e o fenilacetato e/ou o fenilbutirato podem ser formulados como um medicamento com um carreador (ou carreadores) e/ou excipiente (ou excipientes) farmaceuticamente aceitáveis como é rotina na técnica farmacêutica. A natureza exata da formulação dependerá de diversos fatores, compreendendo a via de administração desejada. Tipicamente, a ornitina e o fenilacetato e/ou o fenilbutirato são formulados para administração oral, intravenosa, intragástrica, intravascular ou intraperitoneal. Técnicas de formulação farmacêutica padrão podem ser usadas, tais como aquelas reveladas em Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21aEdição, Lippincott Williams & Wilkins (2005), incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[059] O termo “carreador farmaceuticamente aceitável” ou “excipiente farmaceuticamente aceitável” compreende qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de atraso de absorção e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto, na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível como ingrediente ativo, seu uso nas composições terapêuticas é contemplado. Adicionalmente, vários adjuvantes tais como são comumente usados na técnica podem ser compreendidos. As considerações para a inclusão de vários componentes em composições farmacêuticas são descritas, por exemplo, em Gilman et al. (Eds.) (1990); Goodman e Gilman’s: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8a Edição, Pergamon Press, que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[060] Alguns exemplos de substâncias, que podem servir como carreadores ou componentes farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, são açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; amidos, tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como carboximetil celulose sódica; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; lubrificantes sólidos, tais como ácido esteárico e estearato de magnésio; sulfato de cálcio; óleos vegetais, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, azeite de oliva, óleo de milho e óleo de cacau; polióis, tal como propileno glicol, glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; ácido algínico; emulsificantes, tais como o TWEENS; agentes de umectação, tal como lauril sulfato de sódio; agentes corantes; agentes flavorizantes; agentes de formação de tablete, estabilizantes; antioxidantes; conservantes; água sem pirógeno; solução salina isotônica; e soluções de tampão fosfato.

[061] A escolha de um carreador farmaceuticamente aceitável a ser usado em conjunto com o composto da presente invenção é basicamente determinada pela forma que o composto deve ser administrado.

[062] As composições descritas no presente documento são, de preferência, fornecidas na forma de dosagem unitária. Conforme usado no presente documento, uma "forma de dosagem unitária" é uma composição contendo uma quantidade de um composto que é adequada para administração a um animal, de preferência, indivíduo mamífero, em uma única dose, de acordo com a boa prática médica. A preparação de uma forma de dosagem única ou unitária, no entanto, não implica que a forma de dosagem é administrada uma vez por dia durante o curso da terapia. Tais formas de dosagem são contempladas sendo administradas uma vez, duas vezes, três vezes ou mais por dia e podem ser administradas como infusão durante um período de tempo (por exemplo, de cerca de 30 minutos a cerca de 2 a 6 horas) ou administradas como uma infusão contínua e podem ser dadas mais de uma vez durante um curso de terapia, embora uma administração única não seja especificamente excluída. O especialista no assunto reconhecerá que a formulação não contempla especificamente o curso inteiro da terapia e tais decisões são deixadas para aqueles que são especialistas no assunto de tratamento em vez de formulação.

[063] As composições úteis conforme descrito acima podem estar em qualquer uma de uma variedade de formas adequadas para uma variedade de vias para administração, por exemplo, para vias de administração oral, nasal, retal, tópica (compreendendo transdérmica), ocular, intracerebral, intracraniana, intratecal, intra-arterial, intravenosa, intramuscular outras vias parentais. O especialista no assunto perceberá que composições orais e nasais compreendem composições que são administradas por inalação e produzidas com o uso de metodologias disponíveis. Dependendo da via de administração particular desejada, uma variedade de carreadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica pode ser usada. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis compreendem, por exemplo, cargas sólidas ou líquidas, diluentes, hidrotropias, agentes ativos de superfície e substâncias de encapsulação. Podem ser compreendidos materiais farmaceuticamente ativos opcionais que não interfiram substancialmente na atividade inibitória do composto. A quantidade de carreador empregada em conjunto com o composto é suficiente para fornecer uma quantidade prática do material para administração por dose unitária do composto. As técnicas e composições para produzir formas de dosagem úteis nos métodos descritos no presente documento são descritas nas seguintes referência, todas incorporadas a título de referência no presente documento: Modern Pharmaceutics, 4aEdição, Capítulos 9 e 10 (Banker &Rhodes, editores, 2002); Lieberman et al., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (1989); e Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 8a Edição (2004).

[064] Várias formas de dosagem oral podem ser usadas, compreendendo tais formas sólidas como tabletes, cápsulas e grânulos. Os tabletes podem ser compactados, triburato em tabletes, revestidos entericamente, revestidos com açúcar, revestidos com filme ou múltiplo-compactado, contendo aglutinantes, lubrificantes, diluentes, agentes de desintegração, agentes corantes, agentes flavorizantes, agentes de indução de fluxo e agentes de fusão adequados. As formas de dosagem oral líquidas compreendem soluções aquosas, emulsões, suspensões, soluções e/ou suspensões reconstituídas a partir de grânulos não efervescentes e preparações efervescentes reconstituídas a partir de grânulos efervescentes, contendo solventes adequados, conservantes, agentes emulsificantes, agentes de suspensão, diluentes, adoçantes, agentes de fusão, agentes corantes e agentes flavorizantes.

[065] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados para a preparação de formas de dosagem unitárias para administração peroral são bem conhecidos na técnica. Os tabletes tipicamente compreendem aglutinantes farmaceuticamente compatíveis convencionais como diluentes inertes, tal como carbonato de cálcio, carbonato de sódio, manitol, lactose e celulose; aglutinantes, tal como amido, gelatina e sacarose; desintegradores, tal como amido, ácido algínico e croscarmelose; lubrificantes, tal como estearato de magnésio, ácido esteárico e talco. Deslizantes, tal como dióxido de silício, podem ser usados para aprimorar as características de fluxo da mistura em pó. Agentes corantes, tal como os corantes FD&C, podem ser adicionados para aparência. Adoçantes e agentes flavorizantes, tal como aspartame, sacarina, mentol, hortelã pimenta e sabores de fruta, são adjuvantes úteis para tabletes mastigáveis. As cápsulas tipicamente compreendem um ou mais diluentes sólidos revelados acima. A seleção de componentes carreadores depende de considerações secundárias como sabor, custo e estabilidade durante o armazenamento, que não são críticos, e podem ser prontamente produzidos por um especialista no assunto.

[066] Composições perorais também compreendem soluções líquidas, emulsões, suspensões e similares. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados para preparação de tais composições são bem conhecidos na técnica. Os componentes típicos de carreadores para xaropes, elixires, emulsões e suspensões compreendem etanol, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, sacarose líquida, sorbitol e água. Para uma suspensão, os agentes de suspensão típicos compreendem carboximetil celulose sódica, AVICEL RC-591, tragacanto e alginato de sódio; os agentes umectantes típicos compreendem lecitina e polissorbato 80; e os conservantes típicos compreendem metil parabeno e benzoato de sódio. As composições líquidas perorais podem também conter um ou mais componentes, tais como adoçantes, agentes flavorizantes e corantes revelados acima.

[067] Outras composições úteis para atingir entrega sistêmica dos compostos da presente invenção compreendem formas de dosagem sublinguais, bucais e nasais. Tais composições tipicamente compreendem um ou mais dentre substâncias de carga solúveis, tal como sacarose, sorbitol e manitol; e aglutinantes, tal como acácia, celulose microcristalina, carboximetil celulose e hidroxipropil metil celulose. Deslizantes, lubrificantes, adoçantes, corantes, antioxidantes e agentes flavorizantes revelados acima podem estar também compreendidos.

[068] Para uso tópico, cremes, pomadas, géis, soluções ou suspensões, etc., contendo o composto revelado no presente documento são fornecidos. As formulações tópicas podem ser, de modo geram, compreendidas por um carreador farmacêutico, um cossolvente, um emulsificante, um intensificador de penetração, um sistema conservante e um emoliente.

[069] Para administração intravenosa, os compostos e as composições descritos no presente documento podem ser dissolvidos ou dispersos em um diluente farmaceuticamente aceitável, tal como uma solução salina ou solução de dextrose. Os excipientes adequados podem estar compreendidos para atingir o pH desejado, compreendendo, porém, sem limitação, NaOH, carbonato de sódio, acetato de sódio, HCl e ácido cítrico. Em várias modalidades, o pH da composição final está na faixa de 2 a 8 ou, de preferência, de 4 a 7. O excipiente antioxidante pode compreender bissulfito de sódio, bissulfito de sódio e acetona, formaldeído sódico, sulfoxilato, tioureia e EDTA. Outros exemplos não limitantes de excipientes adequados encontrados na composição intravenosa final podem compreender fosfatos de sódio ou potássio, ácido cítrico, ácido tartárico, gelatina e carboidratos, tal como dextrose, manitol e dextrano. Os excipientes aceitáveis adicionais são descritos em Powell, et al., Compendium of Excipients for Parenteral Formulations, PDA J Pharm Sci and Tech 1998, 52 238 a 311 e Nema et al., Excipients and Their Role in Approved Injectable Products: Current Usage and Future Directions, PDA J Pharm Sci and Tech 2011, 65 287 a 332, ambos os quais estão incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade. Agentes antimicrobianos pode também ser compreendidos para atingir uma solução bacteriostática ou fungistética, compreendendo, porém, sem limitação, nitrato fenilmercúrico, timerosal, cloreto de benzetônio, cloreto de benzalcônio, fenol, cresol e clorobutanol.

[070] As composições para administração intravenosa podem ser fornecidas a tratadores na forma de um ou mais sólidos que são reconstituídos com um diluente adequado, tal como água estéril, solução salina ou dextrose, em água pouco antes da administração. Em outras modalidades, as composições são fornecidas em solução pronta para administrar parenteralmente. Em ainda outras modalidades, as composições são fornecidas em uma solução que é, ainda, diluída antes da administração. Nas modalidades que compreendem administrar uma combinação de um composto descritos no presente documento e outro agente, a combinação pode ser fornecida a tratadores como uma mistura, ou os tratadores podem misturas os dois agentes antes da administração, ou os dois agentes podem ser administrados separadamente.

[071] Em estudos com animais não humanos, as aplicações de produtos potenciais são iniciadas em níveis de dosagem mais altos, em que a dosagem é diminuída até o efeito desejado não ser mais atingido ou efeitos colaterais adversos desaparecerem. A dosagem pode variar amplamente, dependendo dos efeitos desejados e da indicação terapêutica. Tipicamente, as dosagens podem estar entre cerca de 0,1 mg/kg e 4.000 mg/kg de peso corporal, por exemplo, entre cerca de 1 mg/kg e 1.600 mg/kg de peso corporal. Alternativamente, as dosagens podem ser baseadas e calculadas mediante a área superficial do paciente, conforme entendido por aqueles especialistas no assunto.

[072] Dependendo da severidade e responsividade da afecção a ser tratada, a dosagem pode ser também uma administração única de uma composição de liberação lenta, com o curso do tratamento durando de diversos dias a diversas semanas ou até a cura se efetuada ou a diminuição do estado doentio ser atingido. A quantidade de uma composição a ser administrada, obviamente, dependerá de muitos fatores, compreendendo o indivíduo que é tratado, a gravidade da enfermidade, a maneira de administração, o discernimento do médico prescritor. O composto ou a combinação de compostos revelados no presente documento pode ser administrado por via oral ou por meio de injeção a uma dose de 0,1 mg/kg a 4.000 mg/kg do peso corporal do paciente por dia. Uma faixa de dose para humanos adultos é, de modo geral, de 1 g a 100 g/dia. Tabletes ou outras formas de apresentação fornecidas em unidades distintas podem conter convenientemente uma quantidade do composto ou combinação de compostos revelados no presente documento que é eficaz em tal dosagem ou como um múltiplo da mesma, por exemplo, unidades contendo 1 g a 60 g (por exemplo, de cerca de 5 g a 20 g, de cerca de 10 g a 50 g, de cerca de 20 g a 40 g ou de cerca de 25 g a 35 g). A quantidade exata do composto administrado a um paciente será responsabilidade do médico responsável. Entretanto, a dose empregada dependerá de diversos fatores, compreendendo a idade e o sexo do paciente, o distúrbio exato que é tratado e sua gravidade. Além disso, a via de administração pode variar dependendo da afecção e de sua gravidade. Uma dose típica do agente de redução de amônia (por exemplo, de ornitina, ou de fenilacetato ou fenilbutirato) pode ser de 0,02 g a 1,25 g por kg de peso corporal, por exemplo, de 0,1 g a 0,5 g por kg de peso corporal, dependendo de tais parâmetros. Em algumas modalidades, uma dosagem do agente de redução de amônia pode ser de 1 g a 100 g, por exemplo, de 10 g a 80 g, de 15 g a 60 g, de 20 g a 40 g, ou de 25 g a 35 g. Em algumas modalidades, a ornitina e o fenilacetato/fenilbutirato podem ser administrados em uma razão ponderal de 10:1 a 1:10, por exemplo, de 5:1 a 1:5, de 4:1 a 1:4, de 3:1 a 1:3, de 2:1 a 1:2 ou cerca de 1:1. Um médico será capaz de determinar a dosagem exigida do agente de redução de amônia (por exemplo, ornitina e fenilacetato ou fenilbutirato) para qualquer indivíduo particular.

[073] A formulação exata, a via de administração e a dosagem para as composições farmacêuticas do composto ou combinação de compostos revelados no presente documento podem ser escolhidas pelo médico individual em vista da condição do paciente. (Consultar, por exemplo, Fingl et al. 1975, em "The Pharmacological Basis of Therapeutics", que está incorporado ao presente documento a título de referência, com referência particular ao capítulo 1). Tipicamente, a faixa de dose da composição administrada ao paciente pode ser de cerca de 0,1 a cerca de 4.000 mg/kg do peso corporal do paciente. A dosagem pode ser uma única ou uma série de duas ou mais dadas no curso de um ou mais dias, conforme for necessário pelo paciente. Nos casos em que dosagens humanas para compostos foram estabelecidas para pelo menos alguma afecção, a presente revelação usará aquelas mesmas dosagens, ou dosagens que estão entre cerca de 0,1% e cerca de 5.000%, mais preferencialmente, entre cerca de 25% e cerca de 1.000% da dosagem humana estabelecida. Nos casos em que nenhuma dosagem humana é estabelecida, conforme será o caso para compostos farmacêuticos recém-revelados, uma dosagem humana adequada pode ser inferida a partir dos valores de ED50 ou ID50 ou outros valores adequados derivados de estudos in vitro ou in vivo, conforme qualificado por estudos de toxicidade e estudos de eficácia em animais.

[074] Deve-se perceber que o médico responsável como e quando terminar, interromper ou ajustar a administração devido à toxicidade ou disfunções de órgão. De modo contrário, o médico responsável saberá também como ajustar o tratamento a níveis mais altos se a resposta clínica não for adequada (excluindo toxicidade). A magnitude de uma dose administrada no controle do distúrbio de interesse variará com a gravidade da afecção a ser tratada e a via de administração. A gravidade da afecção pode ser, por exemplo, avaliada, em parte, por métodos de avaliação prognósticos. Além disso, a dose, e talvez a frequência de dose, também variará de acordo com a idade, o peso e a resposta do paciente individual. Um programa comparável àquele discutido acima pode ser usado em medicina veterinária.

[075] Embora a dosagem exata seja determinada em uma base fármaco por fármaco, na maioria dos casos, algumas generalizações em relação à dosagem podem ser realizadas. Em casos de administração de um sal farmaceuticamente aceitável, as dosagens podem ser calculadas como a base livre. Em algumas modalidades, a composição é administrada 1 a 4 vezes por dia. Alternativamente, as composições do composto ou combinação de compostos revelados no presente documento podem ser administradas por infusão intravenosa contínua, de preferência, a uma dose de cada ingrediente ativo até 100 g por dia. Conforme será entendido por aqueles especialistas no assunto, em certas situações, pode ser necessário administrar o composto revelado no presente documento em quantidades que excedem, ou mesmo excedem bastante, a faixa de dosagem preferencial determinada acima a fim de tratar de modo eficaz e agressivo doenças e infecções particularmente agressivas. Em algumas modalidades, o composto ou a combinação de compostos revelado no presente documento será administrado por um período de terapia contínua, por exemplo, por uma semana ou mais, ou por meses ou anos.

[076] Em algumas modalidades, o regime de dosagem do composto (ou compostos) ou combinação de compostos revelados no presente documento é administrado por um período de tempo, em que o período de tempo pode ser, por exemplo, de pelo menos cerca de 1 semana a pelo menos cerca de 4 semanas, de pelo menos cerca de 4 semanas a pelo menos cerca de 8 semanas, de pelo menos cerca de 4 semanas a pelo menos cerca de 12 semanas, de pelo menos cerca de 4 semanas a pelo menos cerca de 16 semanas ou mais. O regime de dosagem do composto (ou compostos) ou combinação de compostos revelado no presente documento pode ser administrado três vezes ao dia, duas vezes ao dia, diariamente, em dias alternados, três vezes por semana, em semanas alternadas, três vezes por mês, uma vez por mês, de modo substancialmente contínuo ou continuamente.

Exemplos

[077] Alguns aspectos das modalidades do presente pedido são revelados em mais detalhes nos exemplos a seguir, que não se destinam a limitar de nenhuma forma o escopo da presente revelação.

Exemplo 1 Efeito In Vitroem HSCS Humana Primária

[078] Células estreladas hepáticas humanas primárias (hHSCs) foram cultivadas. Os efeitos de um estímulo com NH4Cl (0,1 a 10 mM durante 24 a 72 h) sobre a proliferação de hHSC (BrdU), atividade metabólica (ensaio de MTS), viabilidade (Vermelho Neutro), alterações ultraestruturais (TE-M) e expressão de gene/proteína (q-PCR/Western blot) foram estudados. Para recuperação do teste, células tratadas com amônia foram restauradas com glutamina e, em experimentos separados, pré-tratadas com L-metionina-sulfoximina (inibidor de MSO-GS) para determinar a importância da glutamina sintetase (GS).

[079] A hiperamonemia em hHSCs primárias induziu diminuições dependentes de tempo na proliferação e atividade metabólica, enquanto induziu dilatação celular e um fenótipo semelhante a miofibroblasto mesmo a 50 a 100 umol/l. Ultraestruturalmente, hHSC tratada com amônia teve alargamento de ER intracelular dependente de dose, e o mesmo foi reversível restaurando-se a cultura com L-glutamina. A inibição de NH3 de proliferação de hHSC foi dependente da atividade de GS visto que MSO e hiperamonemia induziram desprendimento celular e prevenção de recuperação, sugerindo que a glutamina é importante para sobrevivência de hHSC.

[080] Esses resultados sugerem que a hiperamonemia modifica as hHSCs e confere um fenótipo de miofibroblasto dilatado, que é reversível mediante a redução de amônia. De modo correspondente, é previsto que a terapia que reduz amônia possa prevenir e reverter surpreendentemente a fibrose hepática.

Exemplo 2 Efeito In Vivo em Ratos BDL

[081] Ratos com o duto biliar ligado (BDL) de 28 dias foram tratados com solução salina ou fenilacetato de ornitina por 5 dias. A pressão portal foi medida ao final, e tecidos foram coletados para estudos. Os ratos BDL com hiperamonemia tiveram expressão hepática aumentada de genes relacionados a hHSC pró-fibrogênica (α-SMA, PDGFb-R, Miosina IIA/IIB e Coll1), baixa atividade de eNOS e DDAH-1 e alta pressão portal, todos os quais foram corrigidos por tratamento com fenilacetato de ornitina.

[082] Esses resultados demonstram que redução de amônia n vivo com fenilacetato de ornitina diminui a expressão de proteína e gene de HSC ativada e pró- fibrogênica. Esses dados dão suporte ao uso de fenilacetato de ornitina no tratamento (compreendendo prevenção) de fibrose hepática e câncer hepático (a ativação de célula estrelada pode resultar em câncer hepático).

Exemplo 3 Amônia Modula Atividade de HSC Humana

[083] Esse exemplo mostra que a amônia produz efeitos morfológicos e funcionais deletérios em HSCs, e a disfunção induzida por amônia de HSCs é reversível com o uso de um agente de redução de amônia OP.

Métodos

[084] Nesse exemplo, as HSCs humanas primárias (hHSCs) foram isoladas e cultivadas. A proliferação (BrdU), atividade metabólica (MTS), morfologia (TEM, microscopia de imunofluorescência de luz-e), marcadores de atividade de HSC, capacidade de contrair e alterações em situação oxidante (ROS) foram avaliados para identificar os efeitos de estímulo com amônia (50 μM, 100 μM, 300 μM) durante 24 a 72 horas. Alterações em níveis plasmáticos de amônia, marcadores de atividade de HSC, pressão portal e atividade de eNOS hepática foram quantificados em animais BDL hiperamonêmicos e após o tratamento com OP.

Estudos In Vitro em HSC Humana

[085] As hHSCs primárias foram isoladas de seções triangulares de tecido hepático, obtido de pacientes que passaram por cirurgia no Royal Free Hospital após fornecer consentimento informado (EC01.14-RF). As células foram isoladas de acordo com Mederacke et al. (Nature Protocols 2015, 10:305 a 315) com modificações para fígado humano conforme descrito em Rombouts K, Carloni V. Determination and characterization of tetraspanin-associated phosphoinositide-4 kinases in primary and neoplastic liver cells. Em: Waugh MG, editor. Lipid Signaling Protocols, 2a edição, New York: Springer Science+Business Media; 2015 páginas 203 a 212). Brevemente, 10 g de tecido hepático humano total foram digeridos com 0,01% de Colagenase, 0,05% de Pronase e 0,001% de DNase I sem realizar perfusão. O homogenato foi filtrado através de um manchador de célula de 100 μm e o fluxo passante foi centrifugado a 50 xg por 2 minutos a 4 °C. Após lavar o sobrenadante, centrifugação gradiente foi realizada a 1.400 xg por 17 minutos a 4 °C com o uso de um gradiente Optiprep a 11,5%. Finalmente, a interface foi coletada e lavada. A pureza de hHSCS foi estabelecida por detecção de CD140b (PDGFRbeta), CD29 (Integrina beta 1) e Citoglobina (CYGB).

[086] As HSCs obtidas foram cultivadas em RPMI suplementado com 20% de soro fetal bovino (FBS), GLUTAMAX, aminoácidos não essenciais 1X, piruvato de sódio a 1,0 mM, 1X antibiótico-antimicótico (todos Life Technologies), denominado meio completo de HSC doravante. Os experimentos descritos nesse estudo foram realizados em hHSCs de pelo menos três preparações celulares independentes entre as passagens 3 e 8.

[087] As células foram semeadas (densidade 26 x 103/cm2) sob condições enriquecidas com soro básicas (meio completo de CM) por 24 horas, seguido por privação de soro por mais 24 horas (SFM). A glutamina exógena foi removida do meio de cultura para evitar geração descontrolada de amônia. O tratamento específico com tratamentos com NH4Cl foi substituído diariamente pela duração do experimento.

Modelos de Animal

[088] Todos os experimentos com animal foram conduzidos de acordo com as diretivas do Home Office sob o UK Animals in Scientific Procedures Act 1986 com aprovação do comitê de ética para cuidado de animais da University College London. Esse estudo foi realizado em ratos machos Sprague-Dawley (Charles River UK, Margate, UK), pesando 220 a 250 g.

[089] Em um modelo experimental, os ratos receberam uma dieta proteica/amoniagênica (AAs) por 5 dias. Além disso, todos os ratos passaram por BDL para induzir cirrose ou uma operação simulada conforme anteriormente descrito.

[090] Projeto do estudo. (i) No primeiro protocolo, as observações in vitro anteriores de efeitos induzidos por amônia sobre a biologia de células HSC foram adicionalmente exploradas in vivo. Nesse protocolo experimental, os animais passaram por cirurgia BDL e foram dadas 4 semanas para desenvolver lesão hepática. Durante a 4asemana, os animais BDL foram randomizados em 3 grupos: um grupo continha ratos BDL recebendo uma dieta rica em aminoácido (AAs) adicionalmente à injeção de solução salina intraperitoneal (i.p.) (n=4); um segundo grupo recebeu a dieta AAs e foi tratado com uma injeção i.p. do agente de redução de amônia fenilacetato de ornitina (OP) 0,3 g/kg duas vezes ao dia por 5 dias (n=4); o terceiro grupo consistiu em ratos BDL que receberam solução salina i.p. (n=4). Adicionalmente aos animais BDL, um grupo adicional de ratos operados por simulado recebeu solução salina (i.p.) (n=4). Os animais foram sacrificados no 5° dia de tratamento.

[091] (ii) Em um segundo protocolo, o efeito do agente de redução de amônia OP sobre a hipertensão portal induzida por amônia foi investigada. Quatro semanas após a operação BDL ou simulada, os ratos foram randomizados em três grupos: ratos operados por simulado que receberam solução salina (i.p.) (n=18) duas vezes ao dia durante o período experimental de 5 dias; ratos BDL (n=20) receberam solução salina i.p. duas vezes ao dia por 5 dias; um grupo adicional de ratos BDL (n=11) recebeu injeção i.p. de OP 0,3 g/kg duas vezes ao dia por 5 dias. Entre as semanas 4 e 5, após anestesia (2% de isofluorano), os ratos de cada grupo passaram por avaliação de pressão arterial média por meio de isolamento e canulação da artéria carótida direita. Adicionalmente, a pressão portal foi medida por canulação direta da veia portal principal. Todas as medições foram transduzidas em um Powerlab (4SP) ligado ao software Chart v5.0.1. A média de três leituras tomadas com um minuto de diferença foi registrada. Tecido hepático foi coletado e congelado rapidamente para armazenamento a -80 °C até ser analisado.

Análise Estatística

[092] Os resultados foram expressos como valores médios ± SEM e comparados com o uso de análise de variância de sentido único seguida por testes posteriores de comparação múltipla de Dunnet ou Tukey, nos casos adequados. Os valores P <0,05 foram considerados significativos.

[093] Os dados experimentais in vivo foram analisados por testes t e teste U de Mann-Whitney conforme for adequado; P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os resultados são apresentados como valores médios ± SEM com o uso do software GraphPad Prism (GraphPad, La Jolla, CA)

Resultados

[094] A amônia reduz a proliferação e o metabolismo celulares em Células Estreladas Hepáticas humanas (hHSCs) in vitro de uma maneira dependente de dose. As hHSCs tratadas com diferentes concentrações de amônia por 72 horas mostraram uma inibição significativa em proliferação celular (ensaio de BrdU) e atividade metabólica (ensaio de MTS) (Figura 1A). Além disso, o tratamento a longo prazo de células com amônia não causou morte celular em hHSCs conforme avaliado empregando-se o ELISA de Detecção de Morte Celular (Figura 1B). Além disso, esses efeitos induzidos por amônia coincidiram com fortes alterações na morfologia celular de uma maneira dependente de dose conforme observado por microscopia de luz (Figura 1C). hHSCs, conhecidas como células semelhantes a miofibroblasto, conforme mostrado em meio completo e sob inanição sérica, alteraram sua morfologia drasticamente em um fenótipo de fibroblasto fusiforme, com sinais de desregulação do compartimento endolisossômico quando tratadas com amônia conforme avaliado por Vermelho Neutro, um corante retido pelos lisossomos (Figura 1C). Concluiu-se que as hHSCs expressam glutamina sintetase (GS) no nível de mRNA e proteína. O pré-tratamento de células com L-Metionina sulfoximina (MSO, um inibidor bioquímico de GS), seguido por exposição à amônia não inibiu adicionalmente a proliferação e a atividade metabólica em comparação com tratamento com MSO somente.

[095] A amônia induz alterações em tensão citoplasmática, que coincide com alterações no metabolismo/função celular e arquitetura de citoesqueleto de actina. As alterações morfológicas observadas por microscopia de luz foram adicionalmente caracterizadas realizando-se estudos ultraestruturais. A amônia causou uma alteração dependente de dose drástica no citosol e marcou a presença de vacúolos translúcidos. Nem alterações mitocondriais nem a presença de estruturas autofágicas (caracterizadas por membranas duplas) foram observadas (Figura 2A). Foi notado que, quando meio rico em amônia foi removido e as células foram restauradas com meio completo, tanto a proliferação celular como a atividade metabólica foram restaurados (Figura 2B), suportando, assim, que o efeito observado da amônia é temporário. Além disso, hHSCs tratadas com amônia cultivadas em géis de colágeno mostraram uma capacidade significativa de contrair (Figura 2C, 2D) em comparação com o controle e isso ocorreu após 3 horas e foi prolongado após 24 horas de tratamento com amônia, que coincidiu com as alterações morfológicas anteriormente observadas (Figura 2E). Além disso, o tratamento a longo prazo com amônia (72 horas) induziu uma ruptura dependente de dose de actina filamentosa no citoesqueleto quando manchamento com TRICT-Faloidina foi empregado. A reorganização da rede de F-actina coincidiu com a presença de vacúolos translúcidos de uma maneira dependente de dose (Figura 2F).

[096] A hiperamonemia induz a produção de ROS em hHSC. O tratamento prolongado de células com amônia por até 72 horas mostrou um desenvolvimento gradual de ROS conforme detectado pela presença de carbóxi-DCF citosólico (Figura 3A). O desenvolvimento de produção de ROS induzida por amônia foi, ainda, quantitativamente medido conforme descrito em Mookerjee et al., (Gastroenterology, 2007, 132:2.533 a 2.541) e confirmado que hHSCs primárias tratadas com amônia produziram espécies reativas de oxigênio significativas (ROS) (Figura 3B). Em seguida, as células tratadas com amônia por diferentes pontos no tempo mostraram um forte aumento em expressão de mRNA de dismutase de superóxido 2 (SOD2) após 3 horas, que foi prolongado em 24 horas de tratamento com amônia (Figura 3C). Além disso, o pré-tratamento com N-acetil cisteína (NAC), um conhecido sequestrante de ROS, não mostrou impacto sobre o aumento anteriormente observado em expressão de mRNA de SOD2 após 3 horas de tratamento com amônia. Em contraste, o pré-tratamento com NAC seguido por tratamento com amônia por 24 horas, quase aboliu completamente a expressão de mRNA de SOD2 induzida por amônia.

[097] A amônia altera o perfil pró-fibrogênico/pró- inflamatório em hHSCs. Conforme mostrado na Figura 4A, a amônia mostrou aumentar significativamente a expressão de proteína α-SMA. A 300 μM de amônia, a síntese de vimentina (um importante filamento intermediário) foi aumentada. Tanto a Miosina IIa (exerce um importante papel na contração de HSC) como a Miosina IIb (implicada na atividade de HSC) foram moduladas significativamente aumentando-se as concentrações de amônia. Uma resposta dependente de dose à amônia foi também observada na expressão de P-38 MAPK. Além disso, PDGFR-β, importante na proliferação de células HSC, mostrou regulação positiva significativa sob influência de amônia, enquanto Colágeno tipo I mostrou uma tendência a aumentar por amônia, embora esses efeitos não tenham sido estatisticamente significativos (Figuras 4A). Além disso, a amônia induziu uma regulação positiva forte e significativa de expressão de mRNA de MMP2, enquanto a expressão de mRNA de TIMP1 foi regulada de modo negativo (Figura 4B). Além disso, a expressão de mRNA de Interleucina-1β pró- inflamatória foi significativamente induzida quando hHSCs foram tratadas com amônia a 300 μM por 72 horas (Figura 4C), enquanto a amônia em doses de 50 μM e 100 μM doses regularam significativamente de modo positivo o nível de expressão de mRNA de Interleucina 6. Em contraste, a amônia não modificou a expressão de mRNA de Interleucina 8 em HSC (Figura 4C). Esses dados mostram que a formação de ROS induzida por amônia causa alterações em marcadores de ativação relacionados à HSC e genes pró-inflamatórios.

[098] O tratamento com ligação de duto biliar e amônia modifica a biologia da célula HSC in vivo. O efeito de hiperamonemia sobre trajetórias de sinalização relacionadas a HSC em tecido hepático total foi investigado. As concentrações de amônia são significativamente elevadas no plasma de ratos BDL em comparação com ratos operados por simulado (149,3 μmol/l±51,1 versus 107,4 μmol/l±23,2, P <0,05). Os níveis plasmáticos de amônia aumentaram ainda mais quando os animais foram alimentados com uma dieta rica em aminoácido (AAs) em combinação com cirurgia BDL (199,1 μmol/l±43,6 versus 149,3 μmol/l±51,1, P< 0,05) (Figura 5A). De modo mais importante, os níveis plasmáticos de amônia diminuíram significativamente quando animais alimentados com BDL-AAs foram tratados com OP (123,9 μmol/l±16,1 versus 199,1 μmol/l μM±43,6, P< 0,001) (Figura 5A).

[099] O tratamento com OP mostrou resultar em uma acentuada diminuição na expressão de proteína de marcadores de ativação relacionados a HSC (Figura 5B). Mais especificamente, BDL em combinação com hiperamonemia (dieta AAs) mostrou um aumento significativo em expressão de proteína Miosina IIb, Colágeno tipo I e PDGF-Rβ em comparação com BDL. Em contraste, o tratamento com OP anulou o forte efeito de hiperamonemia em fígados de ratos BDL em relação aos marcadores de ativação relacionados a HSC testados (Figura 5B).

[0100] O exemplo mostra que concentrações de amônia patofisiológicas causaram alterações significativas e reversíveis na proliferação celular, atividade metabólica e marcadores de ativação de hHSCs in vitro. A amônia também induziu alterações significativas em morfologia celular caracterizadas por vacuolização citoplasmática, produção de ROS, contração de hHSC e alterações em expressão gênica pró- inflamatória juntamente com marcadores de ativação relacionados a HSC, tais como α-SMA, miosina IIa, IIb e PDGF- Rβ. O tratamento com agente redutor de amônia OP reduziu significativamente a amônia plasmática (BDL 199,1 μmol/l±43,65 versus BDL+OP 149,27 μmol/l±51,1, P<,05), o que foi associado à atividade de eNOS aumentada e anulação de marcadores de atividade de HSC.

Exemplo 4 Expressão Gênica de OTC e Manuseio de Nitrogênio de Ureia Hepática são Reduzidos em Animais com NAFLD e Recuperações com Modulação Dietária e Redução de Translocação Bacteriana

[0101] Esse exemplo mostra que a expressão de gene e proteína de ornitina transcarbamilase (OTC) é alterada em modelos de animal de NASH e a alteração é reversível com recuperação de animais restaurando-se a dieta e reduzindo- se a translocação bacteriana. Esse exemplo também mostra que a expressão gênica de OTC é alterada em pacientes com NAFLD.

[0102] Dois modelos de animal de NASH foram estudados: a) ratos Wistar foram alimentados com uma dieta com alto teor de colesterol e gordura (HFHC) por 10 meses e, então, recuperados por 2 meses em dieta padrão, e b) camundongos foram alimentados com uma dieta com deficiência de metionina- colina (MCD) por 4 semanas e tratados com Yaq-001 (Yaqrit Ltd.), um carbono nanoporoso mostrou reduzir a translocação bacteriana. Adicionalmente, biópsias do fígado de 16 pacientes humanos com NAFLD foram obtidas durante cirurgia bariátrica e a expressão gênica de OTC nessas biópsias de fígado foi medida.

[0103] Em ambo os modelos de animal com NASH, a expressão de gene e proteína de OTC foi reduzida significativamente, e a redução foi restaurada por modulação ou redução dietária em translação bacteriana. Por exemplo, nos ratos HFHC, a reversão de NASH alterando-se a dieta para ração normal restaurou a expressão gênica de OTC (0,53 (CI 0,41 a 0,68) versus 0,32 (CI 0,28 a 0,37), P<0,05; controles 1,00 (CI 0,85 a 1,17)) e expressão de proteína OTC (5,33 ± 0,21 versus 3,06 ± 0,20, P<0,01; controles 7,41 ± 0,68) (Figura 6). Nos camundongos MCD, a redução em translocação bacteriana preveniu o desenvolvimento de NASH e restaurou a expressão gênica de OTC (0,89 (CI 0,13 a 0,16) versus 0,35 (CI 0,08 a 0,09), P<0,01; controles 1,00 (CI 0,12 a 0,17)), sugerindo que a inflamação em NASH contribui para a expressão gênica de OTC (Figura 7).

[0104] Nos pacientes com NAFLD, aqueles com NASH e fibrose tiveram expressão gênica de OTC significativamente mais baixa do que pacientes com esteatose apenas (0,82±0,37 versus 1,15±0,24, P = 0,05) (Figura 8).

[0105] Conforme mostrado nesse exemplo, NASH experimental e humano resultou em uma redução em expressão gênica da enzima do ciclo de ureia OTC, prejudicando a homeostase de nitrogênio. As alterações foram reversíveis nos modelos de animal de NASH com intervenção dietária e também por redução da translocação bacteriana. Os resultados mostrados no presente documento indicam uma ligação entre NASH, redução em expressão gênica e função de OTC e translocação bacteriana. Além disso, a amônia produz alterações morfológicas e a ativação de HSCs, e a redução de OTC pode resultar em hiperamonemia e progressão em lesão hepática e fibrose. Esse exemplo suporta o direcionamento de amônia e translocação bacteriana como tratamentos para NASH.

Exemplo 5 Hiperamonemia Leva à Progressão de Doença e Administração de Agente Redutor de Amônia Reduz a Progressão de Nash e Fibrose

[0106] Dois Modelos de Animal são estudos nesse exemplo: (i) Ratos Sprague Dawley são subdivididos e alimentados com uma dieta enriquecida com alto teor de gordura e alto teor de colesterol (dieta HFHC) ou uma dieta padrão sem alto teor de gordura e colesterol (dieta padrão) por até 16 semanas; e (ii) Os ratos são alimentados com uma dieta com alto teor de gordura suplementada com Frutose (dieta HFD+F) por até 16 semanas.

[0107] Estudo de intervenções: (i) Terapia de prevenção - OP são dados simultaneamente com as dietas suplementadas com gordura ao rato;

[0108] (ii) A terapia de intervenção se inicia 8 semanas após NASH induzido por dieta para imitar uma intervenção terapêutica em modelo de rato com NASH estabelecido. Os subgrupos receberam OP (0,3 g/kg duas vezes ao dia, por via oral) ou placebo. No total, 6 grupos experimentais são investigados: 1) Dieta padrão + solução salina; 2) Dieta padrão + OP (semana 1 a 16); 3) Dieta padrão + OP (semana 8 a 16); 4) dieta HFHC + solução salina; 5) dieta HFHC + OP (semana 1 a 16) - terapia preventiva; e 6) dieta HFHC + OP (semana 8 a 16) - terapia de intervenção.

[0109] (iii) Hiperamonemia exagerada: Um grupo de ratos adicional que recebe uma dieta rica em aminoácido (AAs) para induzir hiperamonemia serve como um controle positivo.

[0110] Todos os animais são sacrificados, e tecidos são coletados para investigar os mecanismos que ligam a disfunção de OTC ao desenvolvimento de NASH e a modulação farmacológica de hiperamonemia.

[0111] O ponto final primário desses experimentos é avaliar a gravidade de NASH e fibrose nos vários grupos estudados. Para pontuação de NASH e fibrose, um estudo histológico é realizado, e o sistema de pontuação CRN de NASH é usado por um hepatopatologista experiente cego ao tipo de tratamento recebido pelos animais (TVL; APD). As variáveis comumente descritas em NASH são analisadas em seções manchadas com Hematoxilina-eosina: 1) esteatose macro/micro vesicular, 2) inflamação lobular, 3) balonamento hepatocelular e 4) corpos apoptóticos. A fibrose/acúmulo de colágeno é avaliada com o uso de seções manchadas com Sirius Red. Além disso, o manchamento com óleo vermelho O é realizado para investigar alterações em acúmulo de lipídio e manchamento Filipin para observar alterações no colesterol.

[0112] Para os pontos finais secundários: 1) amostras sanguíneas: análise de bioquímica plasmática (ALT sérico, AST, ureia, amônia, albumina, colesterol-LDL, colesterol-HDL colesterol e triglicerídeos) é realizada com do multianalisador Cobas Integra 400 com kits adequados (Roche Diagnostics, Burgess Hill, West Sussex, UK). 2) Medição de atividade enzimática de OTC e avaliação de OTC (e outras enzimas relacionadas ao ciclo da ureia) é realizada com o uso de qPCR e análise por Western blot. As alterações em localização/zonação de OTC são avaliadas com o uso de imuno- histoquímica. 3) Os marcadores de HSC relacionados à ativação pró-fibrogênicos são detectados. 4) Citocinas/quimiocinas pró-inflamatórias e marcadores de macrófagos são detectados. e 5) Marcadores relacionados à apoptose são detectados.

[0113] Para cálculos de potência e análise estatística, são realizados experimentos para demonstrar uma diferença significativa entre as diferentes condições sob investigação em um valor p de <0,05 com 80% de potência (com o uso de ANOVA com comparações pós-grupo selecionadas). Estudos anteriores indicam que n=12 animais em cada grupo é suficiente para demonstrar uma alteração significativa.

[0114] Espera-se que (i) os modelos de animal de NASH que simulam dieta Western densa em gordura e caloria tenham hiperamonemia e expressão e função de OTC reduzida; e (2) o tratamento com um agente redutor de amônia (por exemplo, OP) reduz índices bioquímicos, inflamatórios e histológicos de lesão hepática e reverta a disfunção de OTC e hiperamonemia.

Exemplo 6 Agente Redutor de Amônia Trata Câncer Hepático

[0115] Nesse exemplo, um modelo de rato de fibrose/HCC é usado para determinar se um agente redutor de amônia OP pode reduzir o risco de desenvolvimento de HCC.

[0116] Os animais são estudados até 16 semanas e examinados quanto ao desenvolvimento de HCC. Os animais (6 a 8/grupo) são tratados com dietilnitrosamina(DEN)/nitrosomorfolina (NMOR) para induzir fibrose/HCC conforme anteriormente descrito (Mohamed et al., Liver International 2015, 35(3):1.063 a 1.076). Os seis grupos de animais para estudo são listados na Tabela 1. Tabela 1. Grupos de Animais

Exemplo 7 Redução em Nível de Amônia Reduz a Progressão de NAFLD

[0117] NAFLD é induzida em ratos alimentando-se ratos machos com uma dieta líquida com alto teor de gordura (HFD) (71% em kcal de gordura) por até 16 semanas. Ratos Zucker obesos, que é um dos modelos mais comumente usados de NAFLD em ratos, são fornecidos. Ornitina em combinação com pelo menos um dentre fenilacetato e fenilbutirato, por exemplo, OP, é administrada aos ratos HFD e os ratos Zucker obesos. Espera-se que a administração de ornitina em combinação com pelo menos um dentre fenilacetato e fenilbutirato, que reduz a concentração de amônia nos ratos HFD e nos ratos Zucker obesos, seja eficaz na redução da progressão de NAFLD em modelos de rato com NAFLD induzida por dieta assim como em modelo de rato genético de NAFLD.

Exemplo 8 Hiperamonemia Piora a Progressão de NAFLD e Fibrose

[0118] NAFLDé induzida em ratos alimentando-se ratos machos com uma dieta líquida com alto teor de gordura (HFD) (71% em kcal de gordura) por três semanas. Ratos Zucker obesos, que é um dos modelos mais comumente usados de NAFLD em ratos, são fornecidos. A hiperamonemia espontânea é manipulada em modelos de rato com induzida por dieta como genética tornando-se os ratos deficientes em ornitina transcarbamoilase (deficiência de OTC). Os ratos deficientes em OTC são produzidos por mutação ou deleção do gene de OTC nos ratos. A hiperamonemia induzida é manipulada em modelos de rato com NAFLD tanto induzida por dieta como genética alimentando-se os ratos com dieta com alto teor de proteína. Espera-se que a hiperamonemia tanto espontânea como induzida piore a progressão de NAFLD e fibrose.

Exemplo 9 Redução de Peso Reduz a Progressão de NAFLD

[0119] NAFLD é induzida em ratos alimentando-se ratos machos com uma dieta líquida com alto teor de gordura (HFD) (71% em kcal de gordura) por três semanas. Ratos Zucker obesos, que é um dos modelos mais comumente usados de NAFLD em ratos, são fornecidos. A cirurgia de redução de peso é realizada nos ratos HFD e nos obesos. Espera-se que a cirurgia de redução de peso reduza a progressão de NAFLD em modelos de rato com NAFLD induzida por dieta assim como em modelo de rato genético de NAFLD. Espera-se também que a redução de peso aprimore o manuseio de nitrogênio hepático, a função e a expressão de gene/proteína de OTC nos modelos de rato com NAFLD.

[0120] Embora a presente revelação tenha sido descrita com referência às modalidades e exemplos, deve-se entender que inúmeras e várias modificações podem ser realizadas sem afastamento do espírito da presente revelação. De modo correspondente, a presente revelação é limitada apenas pelas reivindicações a seguir.

[0121] Todas as referências citadas no presente documento, incluindo patentes, pedidos de patente, trabalhos, livros de texto e similares, e as referências citadas nos mesmos, até o ponto em que já não estejam, estão incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. No caso em que um ou mais dos materiais de literatura incorporados e similares sejam diferentes ou contradigam este pedido, incluindo, porém, sem limitação, os termos definidos, o uso dos termos, as técnicas descritas, ou similares, este pedido prevalece.

[0122] Em pelo menos algumas das modalidades anteriormente descritas, um ou mais elementos usados em uma modalidade podem ser usados de forma intercambiável em outra modalidade, a não ser que tal substituição não seja tecnicamente exequível. Será entendido por aqueles que são especialistas no assunto que várias outras omissões, adições e modificações podem ser realizadas aos métodos e estruturas descritos acima sem afastamento do escopo da matéria reivindicada. Todas tais modificações e alterações são concebidas para estar dentro do escopo da matéria, conforme definido nas reivindicações anexas.

[0123] Com relação ao uso de substancialmente quaisquer termos no plural e/ou no singular no presente documento, aqueles especialistas no assunto podem traduzir do plural ao singular e/ou do singular ao plural conforme for adequado ao contexto e/ou aplicação. As várias permutações singular/plural podem ser expressamente apresentadas no presente documento para fins de clareza.

[0124] Será entendido por aqueles dentro da técnica que, em geral, os termos usados no presente documento, e especialmente nas reivindicações anexas (por exemplo, corpos das reivindicações anexas) são, de modo geral, concebidos como termos “abertos” (por exemplo, o termo “compreendendo” deve ser interpretado como “compreendendo, porém, sem limitação”, o termo “que tem” deve ser interpretado como “que tem pelo menos”, o termo “compreende” deve ser interpretado como “inclui, porém, sem limitação”, etc.). Será, ainda, entendido por aqueles dentro da técnica que, se um número específico de uma menção de reivindicação for intencionado, tal intenção será explicitamente mencionada na reivindicação e, na ausência de tal menção, nenhuma intenção está presente. Por exemplo, como um auxílio ao entendimento, as seguintes reivindicações anexas podem conter o uso dos sintagmas introdutórios "pelo menos um" e "um ou mais" para introduzir menções a reivindicações. Entretanto, o uso de tais sintagmas não deve ser interpretado implicando que a introdução de uma menção a reivindicação pelos artigos indefinidos "um" ou "uma" limita qualquer reivindicação particular que contém tal menção de reivindicação introduzida às modalidades que contêm apenas uma tal menção, mesmo quando a mesma reivindicação inclui os sintagmas introdutórios "um ou mais" ou "pelo menos um" e artigos indefinidos, tais como "um" ou "uma" (por exemplo, “um” e/ou “um”) devem ser interpretados significando “pelo menos um” ou “um ou mais”; o mesmo ocorre para o uso de artigos definidos usados para introduzir menções a reivindicações. Adicionalmente, mesmo se um número específico de uma menção a reivindicação introduzida for explicitamente mencionado, aqueles que são especialistas no assunto perceberão que tal menção deve ser interpretada significando pelo menos o número mencionado (por exemplo, a menção exposta de "duas menções", sem outros modificadores, significa pelo menos duas menções ou duas ou mais menções). Além disso, naqueles casos em que uma convenção análoga a “pelo menos um dentre A, B e C, etc.” é usada, em geral, tal construção é concebida no sentido em que um especialista no assunto entenderia a convenção (por exemplo, “ um sistema que tem pelo menos um dentre A, B e C” incluiria, porém, sem limitação, sistemas que têm A apenas, B apenas, C apenas, A e B juntos, A e C juntos, B e C juntos e/ou A, B, e C juntos, etc.). Naqueles casos em que uma convenção análoga a “pelo menos um dentre A, B ou C, etc.” é usada, em geral, tal construção é concebida no sentido em que especialista no assunto entenderia a convenção (por exemplo, “ um sistema que tem pelo menos um dentre A, B ou C” incluiria, porém, sem limitação, sistemas que têm A apenas, B apenas, C apenas, A e B juntos, A e C juntos, B e C juntos e/ou A, B, e C juntos, etc.). Será entendido, ainda, por aqueles dentro da técnica que virtualmente qualquer palavra e/ou sintagma disjuntivo que apresenta duas ou mais alternativas, seja na descrição, nas reivindicações ou nos desenhos, deve ser entendida contemplando as possibilidades de incluir um dos termos, qualquer um dos termos ou ambos os termos. Por exemplo, o sintagma “A ou B” será entendido incluindo as possibilidades de “A” ou “B” ou “A e B.”

[0125] Adicionalmente, nos casos em que recursos ou aspectos da revelação são descritos em termo de grupos Markush, aqueles especialistas no assunto perceberão que a revelação é também, assim, descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush.

[0126] Conforme será compreendido pelo especialista no assunto, para todo e qualquer propósito, tal como em termos de fornecer uma descrição escrita, todas as faixas reveladas no presente documento também abrangem toda e qualquer subfaixa possível e combinações de subfaixas das mesmas. Qualquer faixa listada pode ser facilmente reconhecida como descrevendo e possibilitando suficientemente que a mesma faixa seja dividida em pelo menos metades, terços, quartos, quintos, décimos, etc, iguais. Como um exemplo não limitante, cada faixa discutida no presente documento pode ser facilmente dividida em um terço inferior, um terço intermediário e um terço superior, etc. Conforme será entendido por um especialista no assunto, toda linguagem, tal como “até”, “pelo menos”, “maior que”, “menos que” e similares, inclui o número mencionado e se refere às faixas que podem ser subsequentemente divididas em subfaixas conforme discutido acima. Finalmente, conforme será entendido por um especialista no assunto, uma faixa compreende cada membro individual. Assim, por exemplo, um grupo que tem 1 a 3 artigos se refere a grupos que têm 1, 2 ou 3 artigos. Similarmente, um grupo que tem 1 a 5 artigos se refere aos grupos que têm 1, 2, 3, 4 ou 5 artigos e assim por diante.

[0127] Embora vários aspectos e modalidades tenham sido revelados no presente documento, outros aspectos e modalidades serão percebidos por aqueles especialistas no assunto. Os vários aspectos e modalidades revelados no presente documento são para propósitos ilustrativos e não se destinam a limitar, com o escopo e espírito verdadeiros sendo indicados pelas reivindicações a seguir.

[0128] Todas as referências citadas no presente documento, incluindo patentes, pedidos de patente, trabalhos, livros de texto e similares, e as referências citadas nos mesmos, até o ponto em que já não estejam, estão incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade. No caso em que um ou mais dos materiais de literatura incorporados e similares sejam diferentes ou contradigam este pedido, incluindo, porém, sem limitação, os termos definidos, o uso dos termos, as técnicas descritas, ou similares, este pedido prevalece.

Claims

1. Uso de um agente de redução de amônia caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença associada à ativação de célula estrelada hepática (HSC), em que o agente de redução de amônia é ornitina em combinação com pelo menos um de fenilacetato e fenilbutirato.

2. Uso de um agente de redução de amônia caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o atraso do início ou progressão de uma doença associada à ativação de célula estrelada hepática (HSC), em que o agente de redução de amônia é ornitina em combinação com pelo menos um de fenilacetato e fenilbutirato.

3. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o agente de redução de amônia compreende sais farmaceuticamente aceitáveis separados da ornitina e pelo menos um dentre fenilacetato e fenilbutirato.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o agente de redução de amônia compreende um fenilacetato de sódio ou fenilbutirato de sódio.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o agente de redução de amônia compreende um aminoácido monomérico livre ou sal fisiologicamente aceitável de ornitina.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o agente de redução de amônia compreende fenilacetato de ornitina.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para administração oral, intravenosa, intraperitoneal, intragástrica ou intravascular.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para administração intravenosa.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para administração oral.

10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a doença associada à ativação de HSC é doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD).

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a NAFLD é esteato-hepatite não alcoólica (NASH).

12. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a NAFLD é esteatose.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a doença associada à ativação de HSC é câncer hepático.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a doença associada à ativação de HSC é uma afecção fibrótica.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a afecção fibrótica é fibrose hepática.

16. Uso de um agente de redução de amônia caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para prevenção de doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), em que o agente de redução de amônia é ornitina em combinação com pelo menos um de fenilacetato e fenilbutirato.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a NAFLD é esteato-hepatite não alcoólica (NASH).

18. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a NAFLD é esteatose.

19. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que o agente de redução de amônia compreende sais farmaceuticamente aceitáveis separados da ornitina e pelo menos um dentre fenilacetato e fenilbutirato.

20. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que o agente de redução de amônia compreende um fenilacetato de sódio ou fenilbutirato de sódio.

21. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que o agente de redução de amônia compreende um aminoácido monomérico livre ou sal fisiologicamente aceitável de ornitina.

22. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que o agente de redução de amônia compreende fenilacetato de ornitina.

23. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 22, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para administração oral, intravenosa, intraperitoneal, intragástrica ou intravascular.

24. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 22, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para administração intravenosa.

25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 22, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para administração oral.