MXPA04007411A - Tira de biosensor electroquimico para el analisis de muestras liquidas. - Google Patents

Abstract

Se describe un biosensor en la forma de una tira. En una modalidad, la tira de biosensor comprende un soporte de electrodo, un primer electrodo, es decir, un electrodo de trabajo, un segundo electrodo, es decir un contra electrodo, y un tercer electrodo, es decir, un electrodo de referencia. Cada uno de los electrodos esta dispuesto sobre y soportado por el soporte de electrodo. Cada uno de los electrodos esta separado de los otros dos electrodos. La tira de biosensor puede incluir una capa de cubierta, la cual define un espacio cerrado sobre los electrodos. Este espacio cerrado incluye una zona en donde un analito en la muestra reacciona con el reactivo(s) depositado en el electrodo de trabajo. Esta zona es denominada como la zona de reaccion. La capa de cubierta tiene una abertura para recibir una muestra para introducirse a la zona de reaccion. La tira de biosensor tambien puede incluir por lo menos una capa de malla interpuesta en el espacio cerrado entre la capa de cubierta y los electrodos en la zona de reaccion. Esta capa de malla facilita el transporte de la muestra a los electrodos en la zona de reaccion. En otra modalidad, una tira de biosensor puede ser construida para proporcionar una configuracion que permitira que la muestra sea introducida a la zona de reaccion a traves de la accion de una fuerza capilar. En esta modalidad, la capa de malla puede ser omitida. La invencion tambien proporciona un metodo para determinar la concentracion de glucosa en una muestra de sangre entera utilizando el biosensor de esta invencion.

Description

(88) Date of publication of the international search report: For two-letter codes and other abbreviations, refer to the "Guid- 25 September 2003 ance Notes on Codes and A bbreviations " appearing at the begin- ning of each regular issue of the PCT Gazette.

TIRA DE BIOSENSOR ELECTROQUIMICO PARA EL ANALISIS DE MUESTRAS LIQUIDAS ANTECEDENTES DE LA INVENCION 1. Campo de la invención La invención se refiere a biosensores para realizar análisis electroquímico para determinar concentraciones de analitos en líquidos. 2. Discusión de la técnica Se han desarrollado ensayos electroquímicos para determinar las concentraciones de enzimas o sus substratos en mezclas complejas de líquidos. Las tiras de biosensor (es decir, biosensores en la forma de tiras) son útiles en la investigación médica y en pruebas externas. En la investigación médica, las tiras de biosensor pueden funcionar en una manera invasiva (es decir, como sondas que entran en contacto con un fluido corporal, tal como sangre entera o fluido subcutáneo). En las pruebas externas, las tiras de biosensor pueden funcionar en una manera invasiva (es decir, las tiras que entran en contacto con sangre arrastrada por una jeringa o un dispositivo de lanceta). En particular, las tiras de biosensor para aplicaciones biomédicas (por ejemplo, análisis de sangre entera) han sido desarrolladas para la determinación de niveles de glucosa en muestras biológicas. En general, las tiras de biosensor comprenden celdas electroquímicas en las cuales puede haber electrodos de trabajo, contra electrodos y electrodos de referencia. El potencial del electrodo de trabajo es mantenido a un valor constante en relación a aquél del electrodo de referencia. Los sistemas electroquímicos convencionales que tienen tres electrodos emplea (1) un electrodo de trabajo, (2) un electrodo de referencia, y (3) un contra electrodo. La reacción que tiene lugar en el electrodo de trabajo es la reacción que es requerida para ser monitoreada y controlada. Las funciones de los electrodos de referencia y contra electrodos son para asegurar que el electrodo de trabajo realmente experimente las condiciones deseadas, es decir, el potencial correcto que se pretende aplicar. La función del electrodo de referencia es medir el potencial en la interface del electrodo de trabajo y la muestra de manera tan precisa como sea posible. En una situación ideal, ninguna corriente pasa a través del electrodo de referencia. La función del contra electrodo es asegurar que la diferencia de potencial correcta entre el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo se esté aplicando. La diferencia de potencial entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia es asumida por ser la misma que el potencial deseado en el electrodo de trabajo. SI el potencial medido en el electrodo de trabajo no es el potencial deseado en el electrodo de trabajo, el potencial que es aplicado entre el contra electrodo y el electrodo de trabajo es alterado de acuerdo con esto, es decir, el potencial es ya sea incrementado o disminuido. La reacción en el contra electrodo también es igual y opuesta a la reacción de transferencia de carga que ocurre en el electrodo de trabajo, es decir, si está ocurriendo una reacción de oxidación en el electrodo de trabajo, entonces una reacción de reducción tendrá lugar en el contra electrodo, permitiendo con ello que la muestra permanezca eléctricamente neutral.

Todas las tiras de biosensor comercialmente disponibles para determinar la concentración de glucosa emplean dos electrodos. En un sistema de dos electrodos, existen (1) un electrodo de trabajo, y (2) un electrodo de referencia/contra electrodo de propósito dual. El segundo electrodo es llamado un electrodo de referencia/contra electrodo de propósito dual debido a que este electrodo actúa como un electrodo de referencia así como un contra electrodo. Ninguna corriente pasa a través de un electrodo de referencia ideal, y tal electrodo mantiene un potencial estable; la corriente pasa a través de un electrodo de referencia/contra electrodo de propósito dual, y así, el electrodo de referencia/contra electrodo de propósito dual no mantiene un potencial estable durante la medición. A corrientes bajas y/o a duraciones de tiempo cortas para medición, el desplazamiento en potencial es suficientemente pequeño de manera que la respuesta en el electrodo de trabajo no es afectada significativamente, y de ahí que el electrodo de referencia/contra electrodo de propósito dual es designado un electrodo de referencia/contra electrodo de propósito dual. El electrodo de referencia/contra electrodo de propósito dual continúa realizando la función de un contra electrodo; sin embargo, en este caso, el potencial que es aplicado entre el electrodo de referencia/contra electrodo de propósito dual y el electrodo de trabajo no puede ser alterada para compensar cambios en potencial en el electrodo de trabajo. En otras palabras, mientras que las mediciones electroquímicas convencionales requieren tres electrodos, en todas las tiras de biosensor comercialmente disponibles, solo existen dos electrodos, en donde uno de los electrodos realiza dos funciones - la función de referencia y la función de contra. Como se indica previamente, un electrodo de referencia proporciona una referencia para el voltaje aplicado en el electrodo de trabajo. El voltaje aplicado debe ser suficiente para oxidar o reducir la especie (molécula o ión) de interés en la superficie del electrodo de trabajo. El voltaje requerido es determinado por la facilidad de remover o adicionar un electrón a la especie de interés. Debido a que este voltaje es aplicado externamente (por medio de un potencioestato o batería), el punto de referencia debería ser mantenido a un valor constante. Si el valor del punto de referencia cambia con el tiempo, el voltaje externo aplicado debería ser variado de acuerdo con esto. Las tiras de biosensor comercialmente disponibles son muy sensibles a la calidad del electrodo que realiza dos funciones (la función de referencia y la función de contra). Si ese electrodo es de pobre calidad, el voltaje aplicado en el electrodo de trabajo (por medio de una batería o potencioestato) no será mantenida a un valor constante, resultando en una variación en la respuesta de la tira de biosensor de muestra a muestra. Esta variación depende del hematocrito (el cual afecta la resistencia de solución) y la concentración del analito (la cual afecta la corriente). En la mayoría de las mediciones electroquímicas, la corriente es medida a un voltaje aplicado constante. En una tira de biosensor, los electrodos están separados unos de otros. El espacio entre los electrodos resulta en la pérdida de control de voltaje en el electrodo de trabajo. El voltaje experimentado en el electrodo de trabajo es, por lo tanto, menor que el aplicado. La diferencia entre el voltaje aplicado y el voltaje experimentado en el electrodo de trabajo es un producto de la corriente que pasa entre el electrodo de referencia/contra electrodo de propósito dual y el electrodo de trabajo y la resistencia de la solución. Además, considerando la corriente que pasa a través del circuito, el electrodo de referencia/contra electrodo de propósito dual se vuelve polarizado. En otras palabras, el flujo de corriente a través del electrodo de referencia/contra electrodo de propósito dual ocasiona una reacción de reducción en el electrodo, cambiando por ello la composición química del electrodo de referencia/contra electrodo de propósito dual. Este cambio en composición química ocasiona un cambio en el potencial en el electrodo de referencia/contra electrodo de propósito dual, y de ahí un cambio en el voltaje aplicado. Una tira de biosensor que tiene tres electrodos sería preferida en cualquier medición electroquímcia que involucre la aplicación de un voltaje externo y medición de corriente. Sin embargo, debido a las restricciones de volumen de muestra (requerimientos de volúmenes menores), todas las tiras de biosensor electroquímico comercialmente disponibles usan solo dos electrodos. El control preciso de la diferencia de voltaje entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia debe ser mantenido, pero tal control es difícil de lograr en un sistema de dos electrodos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, esta invención proporciona un biosensor en la forma de una tira. En una modalidad, la tira de biosensor comprende un soporte de electrodo, un primer electrodo, es decir, un electrodo de trabajo, un segundo electrodo, es decir, un contra electrodo y un tercer electrodo, es decir, un electrodo de referencia. Cada uno de los electrodos está dispuesto en y soportado por el soporte de electrodo. Cada uno de los electrodos está separado de los otros dos electrodos. La tira de biosensor puede incluir una capa de cubierta, la cual define un espacio encerrado sobre los electrodos. Este espacio encerrado incluye una zona donde un analito en la muestra reacciona con el o los reactivos depositados en el electrodo de trabajo. Esta zona es referida como la zona de reacción. La capa de cubierta tiene una abertura para recibir una muestra para introducirse en la zona de reacción. La tira de biosensor también puede incluir al menos una capa de malla interpuesta en el espacio encerrado entre la capa de cubierta y los electrodos en la zona de reacción. Esta capa de malla facilita el transporte de la muestra a los electrodos en la zona de reacción. Los electrodos pueden estar dispuestos en cualquier orden, con respecto al orden en el cual la muestra entra en contacto con cada electrodo. Sin embargo, se prefiere posicionar el contra electrodo corriente abajo del electrodo de trabajo y el electrodo de referencia, de manera que el electrodo de referencia y el electrodo de trabajo entran en contacto con la muestra antes de que lo haga el contra electrodo. Se prefiere que el electrodo de trabajo esté cubierto completamente por la muestra antes de que el monitor de analito indique que la muestra ha sido aplicada. En otra modalidad, la tira de biosensor puede ser construida para proporcionar una configuración que permitirá que la muestra sea introducida a la zona de reacción mediante acción de fuerza capilar. En esta modalidad, la capa de malla puede ser omitida. La tira de biosensor comprende un soporte de electrodo, una capa de cubierta, un primer electrodo, es decir, un electrodo de trabajo, un segundo electrodo, es decir, un contra electrodo y un tercer electrodo, es decir, un electrodo de referencia. Al menos uno de los electrodos está dispuesto sobre y soportado por el soporte de electrodo, y al menos uno de los dos electrodos restantes está dispuesto sobre y soportado por la capa de cubierta. El soporte de electrodo y la capa de cubierta están unidas mediante adhesión, tal como, por ejemplo, por una capa de adhesivo sensible a la presión. La capa de adhesivo sensible a la presión también sirve para proporcionar un espacio, es decir, un capilar, entre el soporte de electrodo y la capa de cubierta. La muestra es introducida en la zona de reacción por medio de flujo a través de este espacio. Como en la modalidad previamente descrita, cada uno de los electrodos está separado de los otros dos electrodos. En esta modalidad, se prefiere que la capa de malla sea omitida. En otro aspecto, la invención proporciona un método para determinar la concentración de glucosa en una muestra de sangre entera al usar el biosensor de esta invención. En un modo de medición que emplea tres electrodos, ninguna corriente fluye entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia, y en consecuencia, no hay diferencia entre el voltaje aplicado y el voltaje experimentado en el electrodo de trabajo. El contra electrodo se vuelve polarizado pero no afecta la medición de corriente. El cambio en la composición de la química en la superficie del contra electrodo no interfiere con la reacción bioquímica o electroquímica en el electrodo de trabajo. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de las descripciones de las modalidades de la misma.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La FIG. 1 es una vista esquemática de una tira de biosensor de acuerdo con una modalidad de esta invención. La FIG. 2 es una vista esquemática de una tira de biosensor de acuerdo con otra modalidad de esta invención. Las FIGS. 3A a 3E son diagramas esquemáticos que muestran las regiones de una tira de biosensor donde están dispuestos los electrodos.

La FIG. 4 es una gráfica que muestra curvas de respuesta de una tira de biosensor que tiene dos electrodos - un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia/contra electrodo de propósito dual. La FIG. 5 es una gráfica que muestra curvas de respuesta de una tira de biosensor que tiene tres electrodos - un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y un contra electrodo. La FIG. 6 es una gráfica que muestra la relación de la respuesta de una tira de biosensor de esta invención como una función de la concentración de glucosa en diferentes puntos en el tiempo en un ensayo.

La FIG. 7 es una gráfica que muestra la relación de la respuesta de una tira de biosensor de esta invención como una función de la concentración de glucosa, donde la tira contiene tres electrodos y el electrodo de referencia comprende una capa de carbono y el contra electrodo comprende una capa de carbono.

La FIG. 8 es una gráfica que muestra la relación de la respuesta de una tira de biosensor de esta invención como una función de la concentración de glucosa, donde la tira contiene tres electrodos y el electrodo de referencia comprende una capa de carbono, en la cual está impresa la capa que comprende glucosa deshidrogenasa, cofactor de nicotinamida y 1 , 1 O-fenantrolina quinona.

DESCRIPCION DETALLADA Como se usa en la presente, la expresión "electrodo de trabajo" significa un electrodo donde tiene lugar la reacción de interés. La corriente es proporcional a la concentración de un analito, por ejemplo, glucosa, en el electrodo de trabajo. La expresión "tinta de trabajo" significa la formulación que contiene los reactivos para realizar la reacción de interés. Normalmente, la tinta de trabajo es depositada sobre una capa de material eléctricamente conductor para formar el electrodo de trabajo. En el caso de glucosa, la tinta de trabajo contiene tanto un mediador redox como una substancia para reaccionar con el analito, por ejemplo, glucosa oxidasa. Dependiendo de la naturaleza del analito, la substancia para reaccionar con el analito puede ser una enzima o un substrato para una enzima. Las expresiones "mediador redox", "mediador" y similares, significan cualquier substancia que pueda oxidar o reducir otra molécula, normalmente una enzima. Los mediadores redox difunden la información de una reacción de oxidación/reducción desde una enzima hasta un electrodo. La expresión "zona de reacción" significa esa porción de la tira de biosensor donde la muestra líquida entra en contacto con los electrodos de trabajo, referencia y contra electrodo. La zona de reacción incluye además el o los químicos reactivos, es decir, el o los reactivos que reaccionan con un analito en la muestra líquida. Una tira de biosensor 10 adecuada para esta invención es ilustrada en FIG. 1. Haciendo referencia a la FIG. 1, un soporte de electrodo 11, de preferencia una tira alargada de material polimérico (por ejemplo, cloruro de polivinilo, policarbonato, poliéster o similares) soporta tres carriles 12a, 12b y 12c de tinta eléctricamente conductora, de preferencia comprendiendo carbono. Estos carriles 12a, 12b y 12c determinan las posiciones de contactos eléctricos 14a, 14b y 14c, un electrodo de referencia 16, un electrodo de trabajo 18 y un contra electrodo 20. Los contactos eléctricos 14a, 14b y 14c son insertables en un dispositivo de medición apropiado (no mostrado). Cada una de las porciones alargadas de los carriles conductores 12a, 12b y 12c pueden descansarse opcionalmente con un carril 22a, 22b y 22c de material conductor, de preferencia hecho de una mezcla comprendiendo partículas de plata y partículas de cloruro de plata. El área expuesta agrandada de carril 22b descansa sobre el electrodo de referencia 16. Una capa de un material eléctricamente aislante hidrofóbico 24 descansa adicionalmente los carriles 22a, 22b y 22c. Las posiciones del electrodo de referencia 16, el electrodo de trabajo 18, el contra electrodo 20 y los contactos eléctricos 14a, 14b y 14c no están cubiertas por la capa de material eléctricamente aislante hidrofóbico 24. Este material eléctricamente aislante hidrofóbico 24 sirve para prevenir cortos circuitos. La capa de material eléctricamente aislante hidrofóbico 24 tiene una abertura 26 formada en el mismo. Esta abertura 26 proporciona el límite para la zona de reacción de la tira de biosensor 10. Debido a que este material aislante es hidrofóbico, puede provocar que la muestra sea restringida a las porciones de los electrodos en la zona de reacción. El electrodo de trabajo 18 comprende una capa de un material eléctricamente conductor no reactivo, en el cual es depositada una capa 28 conteniendo una tinta de trabajo para realizar una reacción de oxidación-reducción. Al menos una capa de malla 30 descansa sobre los electrodos. Esta capa de malla 30 protege los componentes impresos de daño físico. La capa de malla 30 también ayuda a la muestra a humedecer los electrodos al reducir la tensión superficial de la muestra, permitiéndole con ello esparcirse uniformemente sobre los electrodos. Una cubierta 32 encierra las superficies de los electrodos que no están en contacto con el soporte de electrodo 11. Esta cubierta 32 es una membrana impermeable líquida. La cubierta 32 incluye una pequeña abertura 34 para permitir el acceso de la muestra aplicada a la capa de malla subyacente 30. La capa de tinta de trabajo 28 es depositada en esa porción del material eléctricamente conductor del electrodo de trabajo 18, donde va a tener lugar la reacción de oxidación-reducción cuando una muestra es introducida a la tira de biosensor 10. La capa de la tinta de trabajo 28 puede ser aplicada al electrodo de trabajo 18 como un área discreta que tiene una longitud fija. La tinta de trabajo comprende un o unos reactivos que responden al analito de interés depositado sobre el material eléctricamente conductor no reactivo. Los analitos normales de interés incluyen, por ejemplo, glucosa y cuerpos de cetona. Los materiales eléctricamente coonductores no reactivos normales incluyen, por ejemplo, carbono, platino, paladio y oro. Un material semiconductor, tal como óxido de estaño dopado con indio, puede ser usado como el material eléctricamente conductor no reactivo. En modalidades preferidas, la tinta de trabajo comprende una mezcla de un mediador redox y una enzima. De manera alternativa, en lugar de una enzima, la tinta de trabajo puede contener un substrato que es catalíticamente reactivo con una enzima a ser ensayada. Por ejemplo, cuando el analito a ser medido es glucosa en sangre, la enzima es, de preferencia, glucosa oxidasa, y el mediador redox es, de preferencia, ferroceno o un derivado del mismo. Otros mediadores que son adecuados para usarse en esta invención incluyen una sal de ferricianuro y una fenantrolina quinona o un derivado de la misma. En las tiras de biosensor de esta invención, el o los reactivos son aplicados, de preferencia, en la forma de un material particulado conteniendo tinta y que tiene un ligante o ligantes y, de acuerdo con esto, no se disuelven rápidamente cuando se someten a la muestra. En vista de esta característica, la reacción de oxidación-reducción ocurrirá en la interface de electrodo de trabajo 18 y la muestra. Las moléculas de glucosa se difunden a la superficie del electrodo de trabajo 18 y reaccionan con la mezcla de enzima/mediador. Además de ser aplicado al electrodo de trabajo 18, una capa de la tinta de trabajo puede ser aplicada a cualquiera de los demás electrodos, cuando se desea, como un área discreta que tiene una longitud fija. El espesor de la capa de material eléctricamente conductor no reactivo es determinado mediante el método de aplicar la capa. En el caso de una capa depositada por impresión, por ejemplo, impresión por pantalla, el espesor de la capa normalmente varía desde aproximadamente 10 micrómetros hasta aproximadamente 25 micrómetros. En el caso de una capa depositada por deposición de vapor, el espesor de la capa normalmente varía desde aproximadamente menos de 1 micrometro hasta aproximadmente 2 micrómetros. La capa de la tinta de trabajo 28 que ha sido depositada en el electrodo de trabajo 18, normalmente tiene un espesor seco desde aproximadamente 2 hasta aproximamente 50 micrómetros, de preferencia desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 25 micrómetros. El espesor seco real de la capa depositada de la tinta de trabajo 28, dependerá del grado sobre la técnica usada para aplicar la tinta de trabajo. Por ejemplo, un espesor desde aproximadamente 10 hasta 25 micrómetros es normal para una capa de tinta de trabajo aplicada por medio de impresión por pantalla. El electrodo de referencia 16 es formado normalmente al imprimir por pantalla una mezcla que comprende una mezcla de plata y cloruro de plata en el substrato de electrodo 11. Para materiales a los cuales tal mezcla no se adhiere fácilmente, se prefiere depositar una capa de carbono en el soporte de electrodo para actuar como una capa de iniciador para la mezcla. Esta mezcla es referida frecuentemente como una tinta. La mezcla normalmente tiene un portador que comprende un solvente orgánico. Alternativas a la mezcla de plata y cloruro de plata incluyen mezclas de Ag y AgBr, mezclas de Ag y Agí y mezclas de Ag y Ag20. La capa impresa asociada con el electrodo de referencia 16 se extienden para cubrir parcialmente el carril de la capa de carbono asociada con el electrodo de referencia 16, donde la capa impresa se extiende a la zona de reacción. Se prefiere cubrir partes de los carriles 12a, 12b y 12c fuera de la zona de reacción con la mezcla de plata y el compuesto de plata asociado con ella, de manera que la resistencia eléctrica total de cada carril es reducida. Debido a que ninguna corriente fluye a través del electrodo de referencia 16, pueden usarse electrodos de referencia no clásicos como el electrodo de referencia. Estos electrodos no clásicos pueden ser formados ya sea al emplear simplemente un material conductor, tal como, por ejemplo, carbono, platino o paladio, como el electrodo de referencia, o al tener la tinta de trabajo depositada en el material conductor que forma el electrodo de referencia. El electrodo de referencia 16 tiene, de preferencia, dimensiones iguales o menores comparadas con aquéllas del electrodo de trabajo 18. Si la tinta de trabajo es depositada sobre un material conductor para formar el electrodo de referencia 16, el o los reactivos son depositados solamente sobre la porción del electrodo que está en la zona de reacción para minimizar la resistencia eléctrica del carril 12c. En el caso de carbono siendo depositado para formar el electrodo de referencia 16 (es decir, un electrodo eléctricamente conductor sin reactivos de oxidación-reducción), ningún material adicional es requerido para ser depositado en la superficie del electrodo de referencia. El carbono puede ser dopado con partículas de metal para incrementar la conductividad del carbono. Un material eléctricamente conductor puede ser usado para formar el contra electrodo 20. Los materiales preferidos para formar el contra electrodo 20 incluyen, pero no están limitadas a, platino, palado, carbono, oro, plata y mezclas de plata y cloruro de plata (como en el electrodo de referencia 16). En otra modalidad, el o los reactivos que forman la tinta de trabajo pueden ser depositados en el material conductor del contra electrodo 20. Si la tinta de trabajo es depositada sobre un material conductor para formar el contra electrodo 20, el o los reactivos son depositados solamente en la porción del electrodo que está en la zona de reacción para minimizar la resistencia eléctrica del carril 12b. La FIG. 7 muestra las características de desempeño de una tira de biosensor, donde la tira contiene tres electrodos y el electrodo de referencia comprende una capa de carbono y el contra electrodo comprende una capa de carbono. Las dimensiones del contra electrodo 20 son de preferencia iguales a o mayores que, aquéllas del electrodo de referencia 16. Se prefiere que el contra electrodo 20 sea de un tamaño igual a o mayor que el electrodo de trabajo 18, aunque esta preferencia no es requerida a bajos niveles de corriente. En términos funcionales, el tamaño del electrodo de referencia no es crítico; el tamaño del electrodo de trabajo es seleccionado en base a la proporción de señal a ruido deseada; el tamaño del contra electrodo es seleccionado para minimizar la resistencia a flujo de corriente. El contra electrodo 20 debe estar en contacto eléctrico con el electrodo de trabajo 18 durante la medición. Cuando la corriente fluye a través del contra electrodo 20, el fujo de electrones produce una reacción electroquímica (una reacción de reducción) suficiente para permitir que los electrones fluyan. El contra electrodo 20 debe ser posicionado a una distancia suficiente del electrodo de trabajo 18, de manera que la especie reactiva generada en el contra electrodo 20 no se difunda al electrodo de trabajo 18. La zona de reacción puede tener un área total variando desde aproximadamente 1 mm2 hasta aproximadamente 20 mm2, de preferencia aproximadamente 5 mm2. El área del electrodo de trabajo normalmente varía desde aprximadamente 0.5 hasta aproximadamente 5 mm2, de preferencia aproixmadamente 1.0 mm2. El electrodo de referencia y el contra electrodo normalmente tienen áreas que varían desde aproximadamente 0.2 hasta aproximadamente 4.0 mm2, de preferencia aproximadamente 0.5 mm2. La tira de biosensor 10 normalmente tiene un ancho desde aproximadmente 4.5 hasta aproximadamente 6.5 mm. El soporte de electrodo 11 puede hacerse de cualquier material que tenga una superficie eléctricamente aislante, tal como, por ejemplo, cloruro de polivinilo, policarbonato, poliéster, papel, cartón, cerámica, metal recubierto con cerámica y mezclas de estos materiales (por ejemplo, una mezcla de policarbonato y poliéster). El material eléctricamente conductor puede ser aplicado al soporte de electrodo 11 mediante un método de deposición tal como impresión por pantalla. Este depósito de material eléctricamente conductor forma las áreas de contacto 14a, 14b y 14c, dichas áreas permiten al monitor de analito tener interface con la tira de biosensor 10. El material conductor proporciona además conexiones eléctricas entre las áreas de contacto con el o los reactivos activos depositados sobre el o los electrodos de la tira de biosensor 10. La formulación para el material eléctricamente conductor puede ser una composición secable con aire comprendiendo carbono disperso en un solvente orgánico. Formulaciones alternativas incluyen carbono disperso en un solvente acuoso. Los materiales eléctricamente conductores alternativos que pueden ser usados en lugar de carbono incluyen, pero no están limitados a, materiales tales como plata, oro, platino y paladio. Otros métodos para secar o curar las formulaciones conteniendo el material eléctricamente conductor incluyen el uso de radiación infrarroja, radiación ultravioleta y radiación de radio frecuencia. En un método alternativo de aplicación, el material eléctricamente conductor puede ser depositado por medio de una técnica de deposición de vapor. Como se declara previamente, las tintas adecuadas para usarse en esta invención pueden ser impresión por pantalla. Otras maneras de depositar las tintas incluyen recubrimiento por goteo, impresión con chorro de tinta, dosificación volumétrica, impresión por fotograbado, impresión flexográfica e impresión tipográfica. Las porciones eléctricamente conductoras de los electrodos son, de preferencia, impresas por pantalla o depositadas por medio de técnicas de deposición de vapor o electrónica. Los reactivos son depositados, de preferencia, al imprimir por pantalla o recubrir por goteo las formulaciones en la superficie de la porción eléctricamente conductora del electrodo. En el caso de impresión por pantalla, los reactivos pueden ser convertidos en forma particulada, en donde las partículas contienen carbono o sílice, prefiriéndose el carbono. En la formulación de recubrimiento por goteo, los reactivos pueden ser mezclados con una solución de polímero (tal como, por ejemplo, carboximetil celulosa, hidroxietil celulosa, alcohol polivinílico, etc.) para obtener una solución viscosa, la cual es dispensada entonces en el área de interés. Las tintas pueden incluir adicionalmente un polisacárido (por ejemplo, una goma guar, un alginato, una goma de algarroba, carragenina o xantana), una gelatina hidrolizada, un estabilizante de enzima (por ejemplo, glutamato o trehalosa), un polímero formador de película (por ejemplo, un alcohol polivinílico, hidroxietil celulosa, polivinil pirrol, acetato de celulosa, carboximetil celulosa, y po I i ( v i n i I oxazolidinona), un relleno conductor (por ejemplo, carbono), un agente desespumante, un amortiguador o combinaciones de los anteriores. Otros rellenos para las tintas incluyen, pero no están limitados a, dióxido de titanio, sílice y alúmina. Se prefiere que la longitud de la trayectoria a ser atravesada mediante la muestra (es decir, la zona de reacción), sa mantenida tan corta como sea posible con el fin de minimizar el volumen de muestra requerido. Con respecto al a tira de biosensor descrita en la presente, el volumen de muestra requerido de preferencia no es mayor que 5 microlitros y más preferiblemente varía desde aproximadamente 0.5 microlitros hasta aproximadamente 2.5 microlitros. La longitud máxima de la zona de reacción puede ser tan grande como la longitud de la tira de biosensor. Sin embargo, el aumento correspondiente en resistencia de la muestra limita la longitud de la zona de reacción a una distancia que permite que se genere la corriente de respuesta necesaria. Posicionar los electrodos en la manera descrita en la presente tiene la ventaja adicional de prevenir la terminación de un circuito (y así, prevenir la detección de una corriente de respuesta) antes de que el electrodo de trabajo 18 haya sido cubierto completamente por la muestra. El flujo de la muestra puede lograrse mediante un método de pabilo químico o mediante la acción de fuerzas capilares. El pabilo químico puede ser logrado al usar una malla recubierta de surfactante de grado fino. Como se muestra en la FIG. 1, una capa de malla 30 descansa sobre los electrodos. Como se declara previamente, esta capa de malla 30 protege los componentes impresos de daño físico, y la capa de malla 30 también ayuda a la muestra a humedecer los electrodos al reducir la tensión superficial de la muestra, permitiendo así esparcirse de manera uniforme sobre los electrodos. De preferencia, esta capa de malla 30 se extiende sobre la longitud completa del a zona de reacción, entre e incluyendo la posición a la cual la muestra es introducida y la región donde los electrodos están dispuestos. De preferencia, esta capa de malla 30 es construida de filamentos tejidos de poliéster. De manera alternativa, cualquier material tejido o no tejido puede ser usado, siempre que no ocluya la superficie del electrodo de manera que la difusión normal de la muestra sea obstruida. El espesor de la malla es seleccionado de manera que la profundidad de la muestra sea suficientemente baja que se produzca una alta resistencia de muestra. De preferencia, la capa de malla 30 no es más de 150 µ?? de espesor. Preferiblemente, la capa de malla 30 tiene un porcentaje de área abierta de aproximadamente 35% hasta aproximadamente 45%, una cuenta de fibra de aproximadamente 40 por cm hasta aproximadamente 60 por cm, un diámetro de fibra de aproximadamente 70 µ?? hasta aproximadamente 100 µ?t?, y un espesor desde aproximadamente 100 µ?? hasta aproximadamente 160 µ?t?. Una malla particularmente preferida es malla PE130 HD, disponible de Sefar (anteriormente ZBF), CH-8803, Ruschlikon, Suiza. La capa de malla 30 puede ser recubierta con un surfactante. Un recubrimiento de surfactante es necesario solamente si el material de la capa de malla 30 es por sí misma hidrofóbica (por ejemplo, nylon o poliéster). Si se usa una capa de malla hidrofílica, el recubrimiento de surfactante puede ser omitido. La elección particular de surfactante no es crítica, siempre y cuando permita un esparcimiento suficientemente uniforme de la muestra. Un surfactante preferido es surfactante fluoroquímico "FC 170C FLUORAD" (3M, St. Paul, MN). El surfactante "FLUORAD" es una solución de un aducto de oxietileno fluoroalifático, polietilenglicoles inferiores, 1,4-dioxano y agua. Una carga de surfactante desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 20 µg/mg de malla es preferida para la mayoría de las aplicaciones. La carga de surfactante preferida variará dependiendo del tipo de capa de malla y surfactante usados y la muestra a ser analizada. La carga de surfactante preferida puede ser determinada empíricamente al observar el flujo de la muestra a través de la capa de malla 30 con diferentes niveles de surfactante. La capa de malla 30 puede ser sostenida en su lugar por la capa de material eléctricamente aislante hidrofóbico 24. Esta capa de material eléctricamente aislante 24 es aplicada, de preferencia, al imprimir por pantalla la tinta sobre una porción de la periferia de la capa de malla 30.

Juntas, la capa de malla 30 y las capas de material eléctricamente aislante hidrofóbico 24 rodean y definen una zona de reacción 30, adecuada para que la muestra viaje desde la posición en la cual la muestra es introducida en un extremo de la tira hacia el electrodo de referencia 16, entonces hacia el electrodo de trabajo 18 y entonces hacia el contra electrodo 20. El material eléctricamente aislante hidrofóbico 24 impregna la capa de malla 30 fuera de la zona de reacción 30. El material eléctricamente aislante hidrofóbico 24, define así la zona de reacción 30 al prevenir la muestra de infiltrarse en las porciones de la capa de malla 30 cubierta por las capas de material eléctricamente aislante hidrofóbico 24. Un material eléctricamente aislante hidrofóbico 24 preferido para impregnar las capas de malla es "SERICARD" (Sericol, Ltd., Broadstairs, Kent, UK). Otro material eléctricamente aislante hidrofóbico preferido está comercialmente disponible como "POLYPLAST" (Sericol Ltd., Broadstairs, Kent, UK). Una capa de tinta dieléctrica puede ser aplicada opcionalmente para cubrir la mayoría del carbono impreso y los carriles de plata/cloruro de plata. En este caso, dos áreas son dejadas sin cubrir, a saber las áreas de contacto eléctrico y las áreas sensibles en la zona de reacción. Esta capa de tinta dieléctrica sirve para definir el área que consitituye la zona de reacción y para proteger los carriles expuestos de corto circuito. Como se muestra en la FIG. 1, una cubierta 32 encierra las superficies de los electrodos que no están en contacto con el soporte de electrodo 11. La cubierta 32 es una membrana impermeable líquida. Esta cubierta 32 puede ser una cinta flexible hecha de poliéster o material similar. La cubierta 32 incluye una pequeña abertura 34 para permitir el acceso de la muestra aplicada a la capa de malla subyacente 30. Esta cubierta 32 encierra las superficies expuestas del electrodo de trabajo 18, el electrodo de referencia 16 y el contra electrodo 20. Así, la cubierta 32 mantiene el espacio de muestra disponible sobre los electrodos a una profundidad fija, lo cual es equivalente al espesor de la capa de malla 30. El posicionamiento de esta cubierta 32 asegura que la resistencia de la muestra sea mantenida a un alto nivel. La abertura 34 es posicionada para descansar sobre un extremo del área de malla corriente arriba del electrodo de referencia 16, de manera que el área de malla expuesto por debajo de la abertura 34 pueda ser usada como un punto de acceso o aplicación para una muestra líquida, por lo cual la muestra contacta el electrodo de referencia 16 antes de que la muestra contacte el electrodo de trabajo 18 y el contra electrodo 20. Por supuesto, la abertura 34 debe descansar sobre un extremo del área de malla que no esté cubierta por la tinta eléctricamente aislante hidrofóbica 30. El tamaño de esta abertura 34 no es crítico, pero debería ser suficientemente grande para permitir que pase el volumen suficiente de muestra a través de la capa de malla 30. La abertura 34 no debería ser tan grande como para permitir que cualquier porción de la muestra líquida contacte alguno de los electrodos antes de contactar la capa de malla 30. La abertura 34 puede ser formada en la cubierta impermeable líquida 32 mediante cualquier método adecuado (por ejemplo, perforación con dado).

La membrana de cubierta impermeable a líquido 32 puede ser fijada a la tira de biosensor por medio de un método de adhesión adecuado. De preferencia, la fijación se logra al recubrir el lado inferior de la cinta flexible con una capa de pegamento de fusión en caliente y entonces soldar con calor la cinta a la superficie de la capa de tinta eléctricamente aislante hidrofóbica 24. La capa de pegamento de fusión en caliente normalmente tiene un peso de recubrimiento desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 g/m2, de preferencia desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30 g/m2. Los adhesivos sensibles a presión u otros métodos de adhesión equivalentes también pueden ser usados. Se debería tener cuidado cuando se aplique la cinta, debido a que el calor y la presión aplicados a la capa de cinta pueden fundir la tinta "SERICARD" y pueden provocar que se manche sobre áreas adjuntas. También se debería tener cuidado de manera que la cinta no cubra los electrodos, la zona de reacción o el área donde es aplicada la muestra. La superficie superior de la cubierta impremeable a líquido 32 también puede ser provista con una capa de silicón u otro material hidrofóbico. Esta capa adicional sirve para impulsar la muestra aplicada sobre la porción de capa de malla expuesta 30 en el punto de aplicación de muestra, haciendo por ello mucho más simple la aplicación de pequeños volúmenes de muestra. El flujo por medio de fuerza capilar puede ser logrado al usar una configuración de tira de biosensor del tipo mostrado en la FIG. 2. En la tira de biosensor 10' mostrada en la FIG. 2, los componentes representados por los números de referencia 11, 12a, 12b, 12c, 14a, 14b, 14c, 16, 168, 20, 22a, 22b, 22c pueden ser idénticos a aquéllos descritos previamente con respecto a la FIG. 1. La modalidad de la tira de biosensor 10' mostrada en la FIG. 2., emplea una capa de cubierta 40 y una capa separadora 42, tal como, por ejemplo, una capa de adhesivo, entre el soporte de electrodo 11 y la capa de cubierta 40 de la tira de biosensor 10'. El adhesivo puede ser un adehsivo sensible a la presión. Los adhesivos sensibles a la presión adecuados para formar la capa separadora están comercialmente disponibles y son bien conocidos para alguien de habilidad ordinaria en la técnica. La capa de cubierta 40 no tiene una abertura. La capa separadora 42 tiene una ranura 44 que proporciona el límite de la zona de reacción, en una manera un tanto análoga a la función de la abertura 26 al proporcionar el limite par la reacción de la tira de biosensor 10. La tira de biosensor 10' no tiene una capa de malla. La muestra líquida entra a la tira de biosensor 10' vía una abertura 46 formada en un extremo de la ranura 44 en un extremo de la tira de biosensor 10'. La muestra líquida es introducida a la abertura 46 y alcanza y atraviesa la zona de reacción por medio de la acción de fuerza capilar. En las modalidades que emplean una capa de cubierta 40, la capa de cubierta 40 puede hacerse a partir del mismo tipo de material que es adecuado para hacer el soporte de electrodo 11. En la modalidad de la tira de biosensor 10' mostrada en la FIG. 2, los electrodos 16, 18 y 20 no necesitan ser aplicados todos al soporte de electrodo 11. Al menos uno de los electrodos debería ser aplicado al soporte de electrodo 11. Sin embargo, al menos uno de los dos electrodos restantes pueden ser aplicados a la capa de cubierta 40, en cuyo caso, el electrodo o electrodos aplicados a la capa de cubierta 42 estarían entre la capa de cubierta 40 y la capa separadora 42. El único requerimiento es que la muestra debería ser capaz de contactar los tres electrodos en la zona de reacción. Las FIGS. 3A a 3E ilustran seis diferentes configuraciones de las regiones de electrodo de las tiras de biosensor de esta invención. En las FIGS. 3A a 3E, el electrodo de trabajo es representado por el número de referencia 101, el contra electrodo es representado por el número de referencia 102 y el electrodo de referencia es representado por el número de referencia 103. En uso, una tira de biosensor 10 de esta invención es conectada, vía contactos de electrodo 14a, 14b y 14c, a un dispositivo de medición (no mostrado). Una muestra líquida es aplicada a través de la abertura 34, y la muestra se mueve a lo largo de la zona de reacción. El progreso de la muestra es impedido lo suficiente por la capa de malla 30, permitiendo por ello que la muestra forme un frente de flujo uniforme. El aire es desplazado a través de la porción superior de la capa de malla 30 hasta y a través de la abertura 34. La muestra primero cubre completamente el electrodo de trabajo 18 y el electrodo de referencia 16, y únicamente se aproxima y cubre entonces el contra electrodo 20, completando por ello el circuito y provocando que una respuesta sea detectada por el dispositivo de medición. La tira de biosensor 10' es usada en la misma manera que la tira de biosensor 10, excepto que la muestra es aplicada en la abertura 46 y alcanza y atraviesa la zona de reacción por medio de la acción de una fuerza capilar. Los dispositivos de medición que son adecuados para usarse en esta invención incluyen cualquier monitor de analito comercialmente disponible que pueda acomodar una tira de biosensor teniendo un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y un contra electrodo. Tales monitores de analito pueden ser usados para monitorear analitos, tales como, por ejemplo, glucosa y cuerpos de cetona. En general, tal monitor debe tener una fuente de energía en conexión eléctrica con el electrodo de trabajo, el electrodo de referencia y el contra electrodo. El monitor debe ser capaz de suministrar una diferencia de potencial eléctrico entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia de una magnitud suficiente para provocar la oxidación electroquímica del mediador reducido. El monitor debe ser capaz de suministrar una diferencia de potencial eléctrico entre el electrodo de referencia y el contra electrodo de magnitud suficiente para facilitar el flujo de electrones del electrodo de trabajo al contra electrodo. Además, el monitor debe ser capaz de medir la corriente producida por la oxidación del mediador reducido en el electrodo de trabajo. En el método de esta invención, la muestra líquida puede ser una muestra de sangre entera. En otras tiras de prueba que sugieren el uso de tres electrodos, la muestra líquida es sangre entera que ha sido filtrada o tratada para remover los glóbulos rojos u otros hemocitos. En una medición que emplea una tira de biosensor 10, un voltaje constante es aplicado al electrodo de trabajo y la corriente es medida como una función de tiempo. Esta técnica es conocida como cronoamperometría. El voltaje aplicado debería ser igual o mayor al voltaje requerido para oxidar el mediador reducido. Así, el voltaje mínimo requerido en consecuencia es una función del mediador. La muestra es responsable de la resistencia de solución. La resistencia de solución inhibe el flujo de electrones. El efecto de la resistencia de solución sobre la medición es minimizado por esta invención. Disponer los electrodos cerca obviamente minimiza el efecto de resistencia de solución debido a que la resistencia de solución es una función de la separación entre los electrodos. Al permitir que la corriente fluya a través de un electrodo diferente, el efecto de resistencia de solución sobre el electrodo de trabajo puede ser minimizado. En una medición amperométrica, la corriente debería decaer con el tiempo de acuerdo con la ecuación de Cottrell. /', = nFAC0D01/2 1/2+1/2 p T donde ¡t = la corriente en el tiempo t n = número de electrones F = constante de Faraday A = área del electrodo C0 = concentración a granel de la especie electroquímicamene activa D0 = coeficiente de difusión de la especie electroquímicamente activa Por lo tanto, itt1/2 debería ser una constante. En una medición amperométrica, se aplica un voltaje constante al electrodo de trabajo con respecto al electrodo de referencia y se mide la corriente entre el electrodo de trabajo y el contra electrodo. La respuesta de la tira de biosensor tiene dos componentes, catalítico (componente de respuesta de glucosa) y Faradaico (componente de resistencia de solución). La resistencia de la solución es minimizada, la respuesta de la tira de biosensor en cualquier tiempo dado tendrá un componente de respuesta de glucosa substancialmente mayor, como se compara con el componente de resistencia de solución. Por lo tanto, uno es capaz de obtener una buena correlación con la concentración de la glucosa a partir de la respuesta de la tira de biosensor aún en tiempos de ensayo tan cortos como un segundo. Si la resistencia de la solución es alta, el voltaje experimentado en el electrodo de trabajo demorará significativamente del voltaje aplicado. Esta demora es significativamente mayor para un sistema de dos electrodos, como se compara con un sistema de tres electrodos. En el caso de sistema de dos electrodos, ninguna corriente fluye entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia y de ahí que la caída de voltaje es menor. Por lo tanto, una vez que la corriente de carga (corriente Faradaica) decae a un mínimo (dentro de dos a tres milisengudos), la corriente observada es toda corriente catalítica. En un sistema de dos electrodos, la corriente de carga no es disminuida hasta que el voltaje en el electrodo de trabajo alcanza un estado estable (alcanza el voltaje aplicado). Así, en un sistema de dos electrodos, existe un lento deterioro del perfil de respuesta. El tiempo de ensayo más corto actualmente disponible es cinco segundos. Este tiempo de ensayo está disponible con un sistema de dos electrodos. Otros sistemas con tiempos de ensayo tan cortos como 10 segundos están disponibles. En el sistema de tres electrodos descrito en la presente, son factibles tiempos de ensayo substancialmente instantáneos. Un tiempo de ensayo más corto, combinado con un volumen de muestra reducido, es preferido por el consumidor. Los tiempos de ensayo instantáneos pueden conducir a desarrollos tales como biosensor en una aguja, el cual no requiere el arrastre de sangre. La tira de biosensor de esta invención tiene ventajas de costo. Las concentraciones de la enzima y el mediador son bajas, minimizando por ello el costo de estos materiales. Además, la tira de biosensor no requiere que se imprima una mezcla de plata y cloruro de plata en el electrodo de referencia, si la tinta de trabajo es aplicada al electrodo de referencia. La eliminación de este requerimiento reduce los costos de material, asi como substrae un paso del proceso de fabricación. Con el fin de mostrar las ventajas de la tira de biosensor de esta invención, se aplicó voltaje de 200 mV al electrodo de trabajo con respecto al electrodo de referencia y se midió la respuesta entre el electrodo de trabajo y el contra electrodo. La FIG. 4 muestra la respuesta de una tira de biosensor teniendo dos electrodos como una función de tiempo para tres concentraciones diferentes de glucosa. La FIG. 5 muestra la respuesta para una tira de biosensor teniendo tres electrodos como una función de tiempo para tres concentraciones diferentes de glucosa. Las curvas de respuesta de medición de una tira de biosensor teniendo dos electrodos no tienen puntas tan altas como aquéllas de una tira de biosensor teniendo tres electrodos. La FIG. 6 muestra las respuestas como una función de concentración de glucosa en el extremo de 1 segundo, 2 segundos y 3 segundos para una tira de biosensor que tiene tres electrodos. La correlación de respuesta de la tira de biosensor con la concentración de glucosa es muy buena, indicando por ello que uno puede medir de manera precisa la concentración de glucosa en muestras en tiempos tan cortos como un segundo después del inicio del ensayo. Este beneficio resulta del rápido deterioro de la curva de respuesta. Las especies electroactivas son compuestos qúmicos que experimentan oxidación electroquímica en el electrodo de trabajo. Estos compuestos también son referidos como agentes de interferencia. La oxidación de estos compuestos en la superficie de electrodo se suma a la corriente generada por la oxidación de glucosa y de ahí resulta en una respuesta de glucosa elevada. Ejemplos son ácido úrico, ácido ascórbico, acetaminofen, ácido gentísico y similares. Conforme el voltaje en el electrodo de trabajo es incrementado, más y más de estos compuestos son oxidados. La señal adicional que resulta de la oxidación de estos agentes de interferencia resulta en una respuesta de glucosa elevada. De esta manera, el voltaje aplicado en una medición es un compromiso entre el potencial deseado para oxidación eficiente del compuesto de interés y la minimización de la interferencia de compuestos en la muestra que no son de interés. Por lo tanto, el requerimiento de voltaje menor de esta invención resulta en la reducción de interferencia. La oxidación electroquímica de un compuesto (por ejemplo, un mediador reducido), ocurre a un voltaje referido como potencial de oxidación. Sin embargo, en todos los experimentos de cronoamperometría, un potencial mayor que el potencial de oxidación es aplicado. Esta diferencia entre el potencial de oxidación y el potencial real requerido para realizar la reacción es designado sobre-potencial. El sobre-potencial representa la energía extra necesaria para forzar una reacción lenta a proceder a una velocidad deseada. Como se explica antes, en un sistema de dos electrodos, el voltaje experimentado en el electrodo de trabajo es menor que aquél aplicado. Esta situación llama la aplicación de mayor voltaje que la requerida para oxidación eficiente del mediador reducido bajo condiciones tales como mayores niveles de hematocrito. La aplicación de mayor voltaje no es requerida en un sistema de tres electrodos. Una tira de biosensor teniendo tres electrodos no requiere un buen electrodo de referencia debido a que ninguna corriente fluye en el circuito de referencia; de ahí, no hay ninguna deriva en el potencial aplicado en el electrodo de trabajo. Esta invención también demuestra que un electrodo eléctricamente conductor en contacto con un sistema de reactivos conteniendo enzima y mediador, también puede ser usado como un electrodo de referencia. En la técnica anterior que involucra una medición de punto substancialmente final, la concentración de la forma oxidada del mediador es mantenida a nivel muy alto, de manera que la reducción enzimática del mediador (que resulta de oxidación de glucosa) no cambia la proporción de la forma reducida del mediador a la forma oxidada del mediador de manera significativa. En esta invención, la concentración del mediador puede ser mantenida a una baja concentración, debido a una solubilidad limitada, y el electrodo de referencia así formado, sirve como un electrodo de referencia satisfactorio.

Ejemplos Los siguientes ejemplos pretenden ser ilustrativos y no limitantes de invención.

Ejemplo 1 Este ejemplo ilustra la composición química de una tinta de trabajo para la medición de la concentración de glucosa. En este ejemplo, la formulación de la tinta de trabajo para el electrodo de trabajo comprende, como componentes activos, glucosa deshidrogenasa como la enzima, un nicotinamida adenin dinucleótido como una coenzima y una fenantrolina quinona como el mediador. Los componentes inactivos incluyen amortiguador (para mantener el pH durante la preparación de la tinta), un ligante (hidroxietil celulosa), un estabilizante de proteina (trehalosa), un estabilizante para glucosa deshidrogenasa (alúmina de suero bovino), un agente antiespumante (clerol), una sal (cloruro de magnesio) y carbono (aditivo particulado conductor). El cloruro de magnesio ayuda a la solubilidad del mediador durante la reacción. Los rangos de estos ingredientes que son adecuados para esta invención son mostrados en la Tabla 1.

TABLA 1 Ejemplo 2 Este ejemplo ilustra la composición química de una tinta de trabajo para la medición de la concentración de cuerpos de cetona. En este ejemplo, la formulación de la tinta de trabajo para el electrodo de trabajo comprende, como los componentes activos, una 3- hidroxibutirato deshidrogenasa como la enzima, un nicotinamida adenin dinucleótido como una coenzima y una fenantrolina quinona como el mediador. Los componentes inactivos incluyen amortiguador (para mantener el pH durante la preparación de la tinta), ligante (goma guar), agente antiespumante (clorol), sal (cloruro de magnesio), carbono (aditivo particulado conductor) y un estabilizante de proteína. Los rangos de concentraciones de estos ingredientes por gramo de la tinta de trabajo que son adecuados para esta invención también son mostrados en la Tabla 1. Ejemplo 3 Este ejemplo ilustra otra modalidad de la composición química de una tinta de trabajo para la medición de la cncentración de glucosa. En este ejemplo, la formulación de la tinta de trabajo para el electrodo de trabajo comprende, como los componentes activos, glucosa oxidasa como la enzima y un derivado de ferroceno como el mediador. Los componentes inactivos son amortiguador (para mantener el pH durante la preparación de la tinta), ligantes (alcohol polivinílico, alginato), agente antiespumante (clerol), carbono (aditivo particulado conductor) y un estabilizante de proteína. Los rangos de concentraciones de estos ingredientes por gramo de la tinta de trabajo que son adecuados para esta invención son mostrados en la Tabla 2.

TABLA 2 Este ejemplo ilustra otra modalidad de la composición química de la tinta de trabajo para la medición de la concentración de glucosa. En este ejemplo, la formulación de la tinta de trabajo para el electrodo de trabajo comprende, como los componentes activos, glucosa oxidasa como la enzima y un ferricianuro de potasio como el mediador. Los componentes inactivos son amortiguador (para mantener el pH durante la preparación de tinta), un ligante, tal como un material celulósico, un relleno tal como sílice, un agente antiespumante (cloerol) y un estabilizante de proteína. Los rangos de concentraciones de estos ingredientes por gramo de la tinta de trabajo que son adecuados para esta invención son mostrados en la Tabla 3.

TABLA 3 Ejemplo 5 Este ejemplo describe un método para fabricar una tira de biosensor que emplea la tinta de trabajo descrita en los Ejemplos 1, 2 y 3. Tres carriles de material conductor 12a, 12b y 12c son impresos en una superficie de un soporte de electrodo 11. La tinta para preparar los carriles conductores comprende un material conductor, tal como carbono, platino, paladio, oro conductor, o material semiconductor, tal como óxido de estaño dopado con indio. Una mezcla de plata y cloruro de plata es impresa en cada carril conductor, pero ni las áreas de contacto 14a, 14b y 14c ni el área del electrodo de trabajo 18 en la zona de reacción son impresas con la mezcla de plata/cloruro de plata. La capa de tinta de trabajo 28 es impresa en el área del electrodo de trabajo 18 que está en la zona de reacción. Una capa aislante 24 es usada para cubrir la tira de biosensor completa, excepto por las áreas de contacto 14a, 14b y 14c y la zona de reacción. Una cinta 32 que tiene una abertura 34 es posicionada sobre la capa de malla 30 para definir el volumen de muestra a ser usada.

Ejemplo 6 Este ejemplo describe un método para fabricar una tira de biosensor que emplea la tinta de trabajo descrita en los Ejemplos 1, 2 y 4. Tres carriles de material conductor 12a, 12b y 12c son impresos en una superficie de un soporte de electrodo 11. La tinta para preparar los carriles conductores comprende un material conductor, tal como carbono, platino, paladio, oro conductor o material semiconductor, tal como óxido de estaño dopado con indio. La capa de tinta de traajo 28 es impresa en el área del electrodo de trabajo 18 en la zona de reacción y sobre el área del electrodo de referencia 16 en la zona de reacción. Una capa 30 de malla hidrofílica es colocada sobre la zona de reacción. Una capa aislante 24 es usada para cubrir la tira de prueba completa, excepto por las áreas de contacto 14a, 14b y 14c y la zona de reacción. Una cinta 32 que tiene una abertura 34 es posicionada sobre la capa de malla 30 para definir el volumen de muestra a ser usado. Una tira de biosensor preparada de acuerdo con este ejemplo tiene características de desempeño similares a aquéllas mostradas en la FIG. 8.

Ejemplo 7 Este ejemplo describe un método para fabricar una tira de biosensor que emplea la tinta de trabajo descrita en el Ejemplo 4. Tres carriles de material conductor 12a, 12b y 12c son impresas en una superficie de un soporte de electrodo 11. La tinta para preparar los carriles conductores comprende un material conductor, tal como carbono, platino, paladio, oro conductor, o material semiconductor, tal como óxido de estaño dopado con indio. La capa de tinta de trabajo 28 es impresa en la zona de reacción (es decir, la tinta de trabajo puede cubrir los tres electrodos). Una capa 30 de malla hidrofílica es colocada sobre la zona de reacción. Una capa aislante 24 es usada para cubrir la tira de prueba completa, excepto por las áreas de contacto 14a, 14b y 14c y la zona de reacción. Una cinta 32 que tiene una abertura 34 es posicionada sobre la capa de malla 30 para definir el volumen de muestra a ser usada. Varias modificaciones y alteraciones de esta invención se volverán evidentes para aquéllos expertos en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de esta invención, y debería entenderse que esta invención no será limitada indebidamente a las modalidades ilustrativas expuestas en la presente.

Claims (27)

39 REIVINDICACIONES

1. Una tira de biosensor que comprende: (a) un soporte de electrodo; (b) un primer electrodo dispuesto en dicho soporte de electrodo, siendo dicho primer electrodo un electrodo de trabajo, dicho electrodo de trabajo comprende una tinta de trabajo depositada sobre un material eléctricamente conductor; (c) un segundo electrodo dispuesto en dicho soporte de electrodo, siendo dicho segundo electrodo un electrodo de referencia; y (d) un tercer electrodo dispuesto en dicho soporte de electrodo, siendo dicho tercer electrodo un contra electrodo, dicho contra electrodo comprende un material eléctricamente conductor.

2. La tira de biosensor de la reivindicación 1, en donde dicho electrodo de referencia comprende una tira de referencia.

3. La tira de biosensor de la reivindicación 1, en donde dicho electrodo de referencia comprende un material conductor.

4. La tira de biosensor de la reivindicación 3, en donde dicho electrodo de referencia comprende además una tinta de trabajo depositada sobre dicho material conductor.

5. La tira de biosensor de la reivindicación 1, en donde dicha tinta de trabajo comprende una enzima y un mediador.

6. La tira de biosensor de la reivindicación 5, en donde dicha enzima es seleccionada del grupo que consiste de glucosa oxidasa y glucosa deshidrogenasa. 40

7. La tira de biosensor de la reivindicación 5, en donde dicho mediador es una sal de ferricianuro.

8. La tira de biosensor de la reivindicación 5, en donde dicho mediador es ferroceno o un derivado del mismo.

9. La tira de biosensor de la reivindicación 5, en donde dicho mediador es una fenantrolina quinona o un derivado de la misma.

10. La tira de biosensor de la reivindicación 1, que comprende además una capa de cubierta que define un espacio encerrado sobre dichos electrodos, dicha capa de cubierta tiene una abertura para recibir una muestra en dicho espacio encerrado.

11. La tira de biosensor de la reivindicación 10, que comprende además al menos una capa de malla interpuesta en el espacio encerrado entre dicha capa de cubierta y dichos electrodos.

12. La tira de biosensor de la reivindicación 1 , en donde dicho contra electrodo es posicionado en relación a dicho electrodo de trabajo y dicho electrodo de referencia, de manera que una muestra líquida contactará dicho electrodo de trabajo y dicho electrodo de referencia antes de entrar en contacto con dicho contra electrodo.

13. Un método para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido biológico, dicho método comprende los pasos de: (a) proporcionar la tira de biosensor de la reivindicación 1; (b) aplicar dicho fluido biológico a dicha tira de biosensor; (c) insertar dicha tira de biosensor en un monitor de analito; (d) aplicar un voltaje en el electrodo de trabajo con respecto al electrodo de referencia; 41 (e) medir la corriente que fluye entre el electrodo de trabajo y el contra electrodo; y (f) correlacionar la corriente medida a la concentración de dicho analito.

14. Una tira de biosensor que comprende: (a) un soporte de electrodo; (b) una capa de cubierta; (c) una capa separadora interpuesta entre dicho soporte de electrodo y dicha capa de cubierta; (b) un primer electrodo, siendo dicho primer electrodo un electrodo de trabajo, dicho electrodo de trabajo comprende tinta de trabajo depositada sobre un material eléctricamente conductor; (c) un segundo electrodo, siendo dicho segundo electrodo un electrodo de referencia; y (d) un tercer electrodo, siendo dicho tercer electrodo un contra electrodo, dicho contra electrodo comprende un material eléctricamente conductor, dicha superficie mayor que soporta electrodo de dicho primer soporte de electrodo mira dicha superficie que soporta electrodo de dicho segundo soporte de electrodo.

15. La tira de biosensor de la reivindicación 14, en donde dicho electrodo de referencia comprende una tinta de referencia.

16. La tira de biosensor de la reivindicación 14, en donde dicho electrodo de referencia comprende un material conductor.

17. La tira de biosensor de la reivindicación 16, en donde dicho 42 electrodo de referencia comprende además una tinta de trabajo depositada en dicho material conductor.

18. La tira de biosensor de la reivindicación 14, en donde dicha tinta de trabajo comprende una enzima y un mediador.

19. La tira de biosensor de la reivindicación 18, en donde dicha enzima es seleccionada del grupo que consiste de glucosa oxidasa y glucosa deshidrogenasa.

20. La tira de biosensor de la reivindicalcón 18, en donde dicho mediador es una sal de ferricianuro.

21. La tira de biosensor de la reivindicación 18, en donde dicho mediador es ferroceno o un derivado del mismo.

22. La tira de biosensor de la reivindicación 18, en donde dicho mediador es una fenantrolina quinona o un derivado de la misma.

23. La tira de biosensor de la reivindicación 14, en donde dicha capa separadora comprende un adhesivo.

24. La tira de biosensor de la reivindicación 23, en donde dicho adhesivo es un adhesivo sensible a la presión.

25. La tira de biosensor de la reivindicación 14, en donde al menos uno de dichos tres electrodos está dispuesto en dicho soporte de electrodo y al menos uno de dichos dos electrodos restantes está dispuesto en dicha capa de cubierta.

26. La tira de biosensor de la reivindicación 14, en donde dicho contra electrodo está posicionado en relación a dicho electrodo de trabajo y dicho electrodo de referencia, de manera que una muestra líquida contactará dicho electrodo de trabajo y dicho electrodo de referencia antes de 43 contactar dicho contra electrodo.

27. Un método para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido biológico, dicho método comprende los pasos de: (a) proporcionar la tira de biosensor de la reivindicación 14; (b) aplicar dicho fluido biológico a dicha tira de biosensor; (c) insertar dicha tira de biosensor en un monitor de analito; (d) aplicar un voltaje en el electrodo de trabajo con respecto al electrodo de referencia; (e) medir la corriente que fluye entre el electrodo de trabajo y el contra electrodo; y (f) correlacionar la corriente medida a la concentración de dicho analito.