JP2007518984A - バイオセンサーおよび製造方法 - Google Patents
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Abstract
酸化還元酵素によって作用される基板を収容する流体の存在下で前記酵素の触媒活性を電流滴定的に示す非媒介バイオセンサーであって、(a)第1の基板と、(b)前記第1の基板の上の作用電極および基準電極と、(c)試験メーター装置と電気的に接続するため前記電極に接続された導電性トラックと、(d)前記第1の基板の一部を覆う第2の基板と、
(e)内部にチャネルを有し前記第1の基板と前記第2の基板との間に配置されるとともに、前記チャネルが隣接する面と協働してメッシュを含まず前記基板の少なくとも1つの端縁から前記電極へ延びる毛管流路を規定するようにしたスペーサ層とを有する。前記作用電極が、(f)樹脂によって互いに結合され細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物の粒子からなる導電性ベース層と、(g)前記ベース層の上で緩衝剤からなる最上層と、(h)前記ベース層および前記最上層の少なくとも1つに前記酸化還元酵素の触媒活性量とを備える。
【選択図】図1
(e)内部にチャネルを有し前記第1の基板と前記第2の基板との間に配置されるとともに、前記チャネルが隣接する面と協働してメッシュを含まず前記基板の少なくとも1つの端縁から前記電極へ延びる毛管流路を規定するようにしたスペーサ層とを有する。前記作用電極が、(f)樹脂によって互いに結合され細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物の粒子からなる導電性ベース層と、(g)前記ベース層の上で緩衝剤からなる最上層と、(h)前記ベース層および前記最上層の少なくとも1つに前記酸化還元酵素の触媒活性量とを備える。
【選択図】図1
Description
本発明は、液体内の検体濃度を例えば全血中のグルコースを測定するためのバイオセンサーに関する。また、本発明はこのバイオセンサーの製造方法を提供する。バイオセンサーは、通常、導電性の基板に積層または混合された酵素からなる酵素電極を備えている。この電極は、適切な検体の存在下でその酵素の触媒活性に電流滴定的に反応する。
電流滴定的バイオセンサーは公知技術である。典型的には、酵素は、以下の反応によって過酸化水素を生成する酸化還元酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、または、乳酸オキシダーゼである。
検体+O2−[オキシダーゼ] → 酸化生成物+H2O2
過酸化物は一定電位電極で以下のように酸化される。
過酸化物は一定電位電極で以下のように酸化される。
H2O2 → O2+2H++2e−
電極上の白金中心に過酸化水素が電気化学的に酸化されることにより、検体濃度に比例する電流を生成する電子の移動が過酸化物から電極へ生じる。グルコースが検体である場合、酸化生成物はグルコノラクトンである。日本国特許公開第56−163447号は、白金電極に固定されたグルコースオキシダーゼを使用するシステムを記載する。この電極は、導電性の炭素ベース上の一層の固定酵素からなる。このベースは、フルオロカーボン樹脂結合剤を10重量部まで含む成形グラファイトから形成され、その上に薄い(1μm未満)の白金フィルムが堆積されている。その発明は、白金表面に直接酵素を固定することによる問題を回避し、迅速な反応時間(5秒)、高感度、および耐久性を持つ酵素電極を生成すると言われている。しかしながら、米国特許第4970145号によれば、こうした電極を用いた近年の実験は、そのような利益を導き出せない。
電極上の白金中心に過酸化水素が電気化学的に酸化されることにより、検体濃度に比例する電流を生成する電子の移動が過酸化物から電極へ生じる。グルコースが検体である場合、酸化生成物はグルコノラクトンである。日本国特許公開第56−163447号は、白金電極に固定されたグルコースオキシダーゼを使用するシステムを記載する。この電極は、導電性の炭素ベース上の一層の固定酵素からなる。このベースは、フルオロカーボン樹脂結合剤を10重量部まで含む成形グラファイトから形成され、その上に薄い(1μm未満)の白金フィルムが堆積されている。その発明は、白金表面に直接酵素を固定することによる問題を回避し、迅速な反応時間(5秒)、高感度、および耐久性を持つ酵素電極を生成すると言われている。しかしながら、米国特許第4970145号によれば、こうした電極を用いた近年の実験は、そのような利益を導き出せない。
米国特許第4970145号は、本質的に樹脂結合炭素またはグラファイトからなる不均質な多孔質基板であって、その基板を介して実質的に不均一に分散させられた白金族金属を持った不均質な多孔質基板と、多孔質基板の表面に吸収または固定された酵素の触媒作用的な活性量とを備える酵素電極を記載している。この電極は、酵素を基板に架橋することにより、または90分間室温で酵素の緩衝液に多孔性基板を浮遊させることにより製造される。あるいは、電極への酵素の吸着は電気吸着法によって実施され、電極のベース材料は酵素溶液内の正電位で60分間浮遊される。この電極は、反応時間が早く(保護膜がなければ1〜2秒、膜があれば10〜30秒)、安定性に優れると言われている。作用範囲は広いと言われ、電極は通常よりも実質的に低い作動電位を必要とし(通常は650mVのところが325mV)、その作動電位で低い背景を示す。
米国特許第5160418号は、酵素と、細かく分離された白金族金属または酸化物との実質的に均一の混合物の薄膜からなる簡素な酵素電極を開示している。任意で、白金と結合されまたはパラジウムで処理され細かく分離された炭素またはグラファイトを使用してもよく、また任意で結合剤を使用してもよい。この膜は、それらの成分を含有する懸濁液をスクリーン印刷することで製造され得る。
前述のような先行技術のシステムが感度に関して遮断されることが多く、その結果、計測の精度が低くなることを発明者は見出した。また、必ずしも酵素の不安定性に関係しないが時間経過につれ感度が段階的に減衰することを発明者は見出した。
過酸化物から電極へ電子が運ばれた後に生じる電気信号のもう一つの測定方法として、あるバイオセンサーには、電子担体が、すなわち酸化型で酵素から電子を受け取った後に還元状態で電子を電極へと運び、そこで再度酸化される「媒介物」が含まれる。媒介物の先行技術の例には、フェロセン、フェロセン誘導体、フェリシアン化物、オスミウム複合体、2,6−ジクロロフェノールインドフェノール、ナイル青、およびメドラ青(Medola Blue)が含まれる。例えば、米国特許第5708247号、米国特許第6241862号、米国特許第6436256号、国際公開第98/55856号、および国際公開第99/13100号を参照。酸化還元媒介物を使用して酵素と電極との間に電子を運ぶバイオセンサーは、「媒介バイオセンサー」と呼ばれる。
媒介バイオセンサーは、化学的不安定性を含めた多数の問題を被っている。媒介物は特別な酸化還元状態で存在して機能しなければならないため、還元形態が空気によって酸化された場合には計測される電流は減少する。また、酸素は、電子を受け取って、媒介電極の電位で酸化されない過酸化物を形成することにより干渉することもある。電極の電位を増大させて酸化物を酸化する場合には、血液中に溶解されている他の試料から、例えばパラセタモール、アスコルビン酸塩、および尿酸からシステムが干渉されやすくなる。このように、血液中の酸素濃度が変化することによって、媒介システムにおいて測定されるグルコース反応は変化する。
使い捨てバイオセンサーにとって望ましい属性には以下のようなものが含まれる:
・校正後に変動係数(CV)を少なくするために、背景に関係する低い干渉;
・電子が許容するだけの高感度;
・安定性;
・優れた精度;
・再現可能な製造;
・迅速な反応;
・低コスト。
・校正後に変動係数(CV)を少なくするために、背景に関係する低い干渉;
・電子が許容するだけの高感度;
・安定性;
・優れた精度;
・再現可能な製造;
・迅速な反応;
・低コスト。
また、バイオセンサーは、少ない検体量を使って十分に正確な読み取り(例えば、数マイクロリットル未満の全血試料から血糖濃度の読み取り)を行うことができることが望ましい。米国特許第6436256号では、少ない検体量(2マイクロリットル未満)を必要とするバイオセンサーは、多層構造を有する媒介バイオセンサーによって達成される。この構造は、印刷スペーサ層によって分離されるとともに試料の導入用に一端で開いたキャビティを形成した2つの基板からなる。このキャビティは、スペーサ層を覆うモノフィラメントメッシュで充填され、界面活性剤またはカオトロピック剤でコーティングされている。このメッシュは、作用電極および基準電極を覆うとともに、上方の基板を越えて延びて一端でメッシュの露出領域を提供する。露出領域への液体試料の塗布はメッシュを溢れさせ、液体がメッシュを介して毛管作用により電極へ運ばれる。
メッシュの存在は、バイオセンサーの製造中に作用電極上に試薬を拡散させやすくするが、製造工程の複雑性を高める。また、作用電極を越えて試薬に拡散することは、作用電極が適切に処理されていることを確かめるにさらなる試薬が必要であることを意味する。
本発明は、少なくとも上記の基準のいくつかの点で向上された酵素電極およびバイオセンサーを提供することを追求するものである。
本発明の一態様によれば、酸化還元酵素によって作用される基板を収容する流体の存在下で前記酵素の触媒活性を電流滴定的に示す非媒介バイオセンサーが提供され、そのバイオセンサーは、
(a)第1の基板と、
(b)前記第1の基板の上の作用電極および基準電極と、
(c)試験メーター装置と電気的に接続するため前記電極に接続された導電性トラックと、
(d)前記第1の基板の一部を覆う第2の基板と、
(e)内部にチャネルを有し前記第1の基板と前記第2の基板との間に配置されるとともに、前記チャネルが隣接する面と協働してメッシュを含まず前記基板の少なくとも1つの端縁から前記電極へ延びる毛管流路を規定するようにしたスペーサ層とを有し、
前記作用電極が、
(f)樹脂によって互いに結合され細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物の粒子からなる導電性ベース層と、
(g)前記ベース層の上で緩衝剤からなる最上層と、
(h)前記ベース層および前記最上層の少なくとも1つに前記酸化還元酵素の触媒活性量とを備える。
(a)第1の基板と、
(b)前記第1の基板の上の作用電極および基準電極と、
(c)試験メーター装置と電気的に接続するため前記電極に接続された導電性トラックと、
(d)前記第1の基板の一部を覆う第2の基板と、
(e)内部にチャネルを有し前記第1の基板と前記第2の基板との間に配置されるとともに、前記チャネルが隣接する面と協働してメッシュを含まず前記基板の少なくとも1つの端縁から前記電極へ延びる毛管流路を規定するようにしたスペーサ層とを有し、
前記作用電極が、
(f)樹脂によって互いに結合され細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物の粒子からなる導電性ベース層と、
(g)前記ベース層の上で緩衝剤からなる最上層と、
(h)前記ベース層および前記最上層の少なくとも1つに前記酸化還元酵素の触媒活性量とを備える。
用語「非媒介」は、本明細書において、酸化還元型の媒介物の著しい量を含まない作用電極を有するバイオセンサーを指す。好ましくは、作用電極は、何らの酸化還元型の媒介物を含有していない。このため、グルコースオキシダーゼなどの酸化還元酵素を用いる場合には、測定される電流の全てまたは実質的に全てが、電極における過酸化物の酸化から生じる。
毛管流路がメッシュを含まないため、緩衝剤を含し塗布された液体は吸上げ作用によって作用電極から離れて運ばれることはない。バイオセンサーは、最上層内のより少量の緩衝材および/または他の試料を使って製造されてもよい。スペーサは、相対的に薄く、例えば60〜120μmであり、毛管流路の容積を減少させて、バイオセンサーがより少ない試料容積を必要とするようにしてもよい。これにより、バイオセンサーを被験者の身体の別の試料部位で使用することが可能になる。血液試料は、通常、被験者の指を刺すことによって採取されて、従来のバイオセンサーへの塗布のために比較的大きな血液の滴を提供する。指先には比較的多数の神経終末があるため、指先を刺すことにより痛みが伴われ、被験者が非常に頻繁に血糖レベルを調べるのを防ぐことできる。本発明によるバイオセンサーを使って、代替部位から読み取りを行う、例えば神経終末のより少ない被験者の上腕から読み取りを行うので、試料採取にはあまり痛みを伴わない。試料の容積は約0.8μlでよい。
少ない試料容積の採取を容易にするために、毛管流路は両方の基板に対向する端縁から電極へ延びて、試料をバイオセンサーに導入する地点で1つの基板が他方のものを越えて延びるリップがないようにすることが好ましい。リップの存在により、試料のいくらかまたは全てが残留する浪費スペースが提供される。
バイオセンサーの毛管充填を助長するために、毛管流路を規定する主要な表面の少なくとも1つは親水性であり、全血などの生体液によって容易に湿らされるようにしている。
最上層に緩衝剤を提供することにより、増大された安定性および感度とともに、従来の非媒介バイオセンサーよりも早い反応時間を得ることができることを発明者は見出した。発明者が考えている感度および反応時間の増大は、ストリップ上での高い緩衝能力を提供することにより達成される。過酸化水素の酸化は、緩衝材によって中和される水素イオンを作り出す。これには2つの効果がある。酵素周辺の局所的なpHを維持することによって酵素活性を維持し、それをもっと効率にする過酸化水素の酸化の平衡を移す。また、過酸化水素の酸化の効率を向上させることは、酸化還元酵素によって利用可能である大きな酸素の再循環をもたらす。また、酵素に対する緩衝剤の比率が望ましい反応の直線性を得る際におよび適当な感度の下限を得るために重要であることを発明者は見出した。さらに、最大の感度を達成するために緩衝剤および酵素が特別な閾値濃度を超える必要があり、この濃度を超えると酵素に対する緩衝剤の比率を使ってバイオセンサーの血糖への反応の特性を「調節」することを発明者が見出した。それは、実験結果という状況において後述されるだろう。
好ましい緩衝剤には、リン酸塩、ADA、MOPS、MES、HEPES、ACA、およびACESが含まれ、またはpKaが7.4±1である緩衝剤が含まれる。緩衝剤のpHの範囲は、システムの特定な化学特性に左右される。好ましい範囲は、pH7〜10、特に7〜8.5である。特に好ましい緩衝剤は、pHが約8のリン酸塩およびpHが約7.5のADAである。
白金族金属または酸化物は、米国特許第5160418号で記述されているように、ベース層が電気的な導電性であるのに十分な量の中に存在している。あるいは、ベース基は、細かく分離された炭素またはグラファイトの粒子も含有してもよい。便宜上、用語「触媒」は本明細書中では細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物を指すために用いられている。触媒は炭素またはグラファイトの粒子の表面に運ばれてもよい。好ましい態様では、触媒は、炭素またはグラファイトの粒子と親密な表面接触、例えば白金と合金になった炭素またはパラジウム処理された炭素と親密な表面接触をする。触媒は、粒子の表面に吸着、結晶化、または堆積されてもよい。
樹脂は、ベース層内で白金族金属または酸化物を結合するのに役立つ何らかの適合性を有する結合材料または結合剤、例えば、ポリエステル樹脂、エチルセルロース、またはエチルヒドロキシエチルセルロース(EHEC)を含んでもよい。
作用電極は、触媒を含むインクをベース基板に印刷し、印刷されたインクを乾燥させてベース層を形成し、次に緩衝剤からなるまたは緩衝剤を含むコーティング媒質の塗布により最上層を形成することによって製造されてもよい。コーティング媒質は好ましくは流体であり、特に緩衝剤を溶解した水溶液である。ただし、コーティング媒質は、例えばスプレーによって粘着性のベース層に塗布され緩衝材からなるまたは緩衝材を含む乾燥粉末からなる。コーティング液を塗布した時に最上層を形成する好適な方法には、印刷、スプレー、インクジェット印刷、ディップコーティング、またはスピンコーティングが含まれる。好ましいコーティング技術はコーティング液の滴下コーティングであり、本発明は、この好ましい方法を参照して明細書中で記載されるだろう。コーティング液をベース層に正確に滴下コーティングすることにより、必要になるコーティング液の容量は、例えば125nlまで減少されてもよい。
好ましい実施の形態では、酵素は、最上層に緩衝剤を設けられている。この配置は、酵素がより効率的に働くとともに白金族金属または酸化物が最適に働くレベルと典型的に異なるレベルまで、最上層の局所的環境でのpHの調節を容易にする。
システム安定剤は有利には最上層に含まれてもよい。好適な安定剤には、酵素によって作用されるものとは異なるポリオール、例えば、酵素がグルコースオキシダーゼであるトレハロース、マンニトール、ラクチトール、ソルビトール、またはスクロースが含まれる。システム安定剤は、容器封入して貯蔵時に3次構造の変化を妨げることによって、または酵素分子の周囲の水分活性を取り替えることによって酵素を安定化してもよい。グルコースオキシダーゼ酵素はきわめて安定な酵素であることが分かっており、安定剤の添加はこの酵素を保護するのに必須のものではない。安定剤は、空気酸化のために炭素表面を塞ぐとともに白金めっきされた炭素樹脂のベース層をコーティングすることによって、長期間の触媒パッシベーション効果を低下するのを助けると考えられている。
炭素粒子がベース層内に存在する場合、炭素粒子上の活性部位を遮断するために遮断剤がその層に任意で含まれても良い。これにより、炭素活性の貯蔵安定性および均一性が高められる。適切な遮断剤には、システム安定剤およびタンパク質も、例えばウシ血清アルブミン(BSA)が含まれる。高い表面の炭素の代わりにグラファイト粒子が使用された場合、その粒子は高い導電性を持つが、グラファイトの活性部位の数は炭素よりもはるかに少ないため遮断剤はあまり望ましくない。表面積が小さく表面の活性群が少なければ少ないほど、両者は干渉を低減させる傾向がある。検体が0mMの場合、干渉は、関連される表面積である容量成分から主になる。
基板は、塗布されるコーティングと両立するあらゆる好適な熱安定性材料で形成されても良い。熱安定性は、製造過程で印刷の良好な表示を確保するために重要である。好ましい基板は、Valox FR−1熱成形ポリエステルフィルム(ポリ(ブチレンテレフタレート)コポリ(ビスフェノール−A/テトラブロモビスフェノール−A−カーボネート)である。その他の好適な基板は、当業者にとって公知であり、例えば、PVC、ポリ(エテルスルフォン)(PES)、ポリ(エテルエテルケトン)(PEEK)、およびポリカーボネートである。
酵素はあらゆる好適な酸化還元酵素、例えばグルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、またはラクテートオキシダーゼであっても良い。
本発明の別の態様によれば、酸化還元酵素によって作用される基板を含む流体の存在下で前記酵素の触媒活性を電流滴定的に示す非媒介バイオセンサーを製造する方法が提供され、その方法は、
(a)上部に作用電極および基準電極を有する第1の基板と、試験メーター装置との電気的に接続のために前記作用電極および基準電極に接続される導電性トラックとを取り、
(b)細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物を含有するインクと樹脂結合剤とを前記導電性トラックの1つに印刷することによって前記作用電極を形成し、
(c)前記印刷インクを乾燥させて、樹脂によって互いに結合された前記白金族金属または白金族金属酸化物からなる導電性ベース層を形成させまたは形成可能にし、
(d)緩衝剤からなるまたは緩衝剤を含有するコーティング媒質で前記ベース層をコーティングすることにより、前記ベース層に最上層を形成し、
(e)前記印刷インクおよび前記コーティング媒質の少なくとも1つにおいて前記酸化還元酵素の触媒活性量を提供し、
(f)前記第1の基板の一部を覆う第2の基板を提供し、
(g)内部にチャネルを有し前記第1の基板と前記第2の基板との間に配置され、前記チャネルと隣接する表面とが、メッシュを含有せず前記基板の少なくとも1つの端縁から前記電極へ延びる毛管流路を一緒に規定するスペーサ層を提供する。
(a)上部に作用電極および基準電極を有する第1の基板と、試験メーター装置との電気的に接続のために前記作用電極および基準電極に接続される導電性トラックとを取り、
(b)細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物を含有するインクと樹脂結合剤とを前記導電性トラックの1つに印刷することによって前記作用電極を形成し、
(c)前記印刷インクを乾燥させて、樹脂によって互いに結合された前記白金族金属または白金族金属酸化物からなる導電性ベース層を形成させまたは形成可能にし、
(d)緩衝剤からなるまたは緩衝剤を含有するコーティング媒質で前記ベース層をコーティングすることにより、前記ベース層に最上層を形成し、
(e)前記印刷インクおよび前記コーティング媒質の少なくとも1つにおいて前記酸化還元酵素の触媒活性量を提供し、
(f)前記第1の基板の一部を覆う第2の基板を提供し、
(g)内部にチャネルを有し前記第1の基板と前記第2の基板との間に配置され、前記チャネルと隣接する表面とが、メッシュを含有せず前記基板の少なくとも1つの端縁から前記電極へ延びる毛管流路を一緒に規定するスペーサ層を提供する。
本発明のその他の態様および利点は、以下の明細書、図面、および請求項において明らかになる。
本発明は一例として以下の図面を参照してさらに記述されるだろう。
BSA−白金/炭素の調製
250mlのガラス瓶において、Miles社製のBSA6.4gをリン酸緩衝食塩水(PBS)80mlに溶解し、MCA社製の10%白金/XC72R炭素20gを常に撹拌しながら徐々に添加した。その瓶を回転ミキサーに置き室温で2時間インキュベーションした。
250mlのガラス瓶において、Miles社製のBSA6.4gをリン酸緩衝食塩水(PBS)80mlに溶解し、MCA社製の10%白金/XC72R炭素20gを常に撹拌しながら徐々に添加した。その瓶を回転ミキサーに置き室温で2時間インキュベーションした。
Whatman No.1(商標登録)の2枚のろ紙を使用してブフナー漏斗を準備した。混合物をこの漏斗および炭素に注ぎ、PBS約100mlで3回洗浄した。できるだけ多くの液体を抽出するために、真空によって炭素のケーキを通して約5分間吸引する。プラスチック製の容器の中に炭素のケーキを注意深くこすり落とし、へらで押しつぶした。それから、この炭素をオーブンに30℃で一晩置いて乾燥させた。この手順の目的は、炭素上の活性部位を遮断して炭素特性の貯蔵安定性および再現性を助けることである。
白金族金属/炭素インクの調製
BSA−白金/炭素を、ポリマー結合剤としてのMetech8101のポリエステル樹脂と、インクの溶媒としてのブチルセロソルブアセテート(BCA)との中で調整した。
BSA−白金/炭素を、ポリマー結合剤としてのMetech8101のポリエステル樹脂と、インクの溶媒としてのブチルセロソルブアセテート(BCA)との中で調整した。
インクの組成(I)
Metech8101の樹脂 45.32%
BSA−白金/炭素 18.67%
グラファイト 9.77%
BCA/シクロヘキサノン 23.26%
Tween20(登録商標) 2.98%
Tween20は、Sigma−Aldrich社によって供給される界面活性剤である。Tweenは、ICIAmericas社の登録商標である。溶媒はBCAおよびシクロヘキサノンの50%v/v混合物である。グラファイトは、英国ウースターシャー州イヴシャムのGSInorganics社からのTimrexKS15(粒径16μm未満)であった。
Metech8101の樹脂 45.32%
BSA−白金/炭素 18.67%
グラファイト 9.77%
BCA/シクロヘキサノン 23.26%
Tween20(登録商標) 2.98%
Tween20は、Sigma−Aldrich社によって供給される界面活性剤である。Tweenは、ICIAmericas社の登録商標である。溶媒はBCAおよびシクロヘキサノンの50%v/v混合物である。グラファイトは、英国ウースターシャー州イヴシャムのGSInorganics社からのTimrexKS15(粒径16μm未満)であった。
Tween20の樹脂と溶媒の約半分とを最初に混合した後に、炭素留分およびグラファイトを添加した。最初に、この組成を手で混合した後に、3重ロールミルに数回通した。それから、残った溶媒をインクに加え、インクが印刷に好適な粘度になるまで混合した。
さらなる試験組成にはインク内のGODが以下のように含まれた。
インクの組成(II)
Metech8101の樹脂 44.68%
BSA−白金Pt/炭素 18.42%
グラファイト 9.64%
BCA/シクロヘキサノン 22.94%
Tween20(登録商標) 2.94%
グルコースオキシダーゼ 1.38%
滴下コーティング溶液の調製
コーティング溶液は水を主成分とし、高濃度の緩衝液、好ましくはpH8のリン酸塩からなる。緩衝能力がイオン強度よりも重要であることが明らかになっている。本実施例では、この溶液はグルコースオキシダーゼおよびシステム安定剤を含有し、本実施例ではトレハロースを含有する。
Metech8101の樹脂 44.68%
BSA−白金Pt/炭素 18.42%
グラファイト 9.64%
BCA/シクロヘキサノン 22.94%
Tween20(登録商標) 2.94%
グルコースオキシダーゼ 1.38%
滴下コーティング溶液の調製
コーティング溶液は水を主成分とし、高濃度の緩衝液、好ましくはpH8のリン酸塩からなる。緩衝能力がイオン強度よりも重要であることが明らかになっている。本実施例では、この溶液はグルコースオキシダーゼおよびシステム安定剤を含有し、本実施例ではトレハロースを含有する。
試料の滴下コーティング溶液
緩衝液 KH2PO4/K2HPO4 385mM、pH8 Sigma社
酵素 グルコースオキシダーゼ 4080U/ml Biozyme社
安定剤 トレハロース 1% Sigma社
好ましい範囲
緩衝液 300〜1000mM、pH7〜10
酵素 500〜12000U/ml(1.85〜44.4mg/ml)
安定剤 0.5〜30%
グルコースオキシダーゼの活性度は、材料1ミリグラムにつき約270単位である(この酵素は他の凍結乾燥剤および安定剤とともに調製されているため、タンパク質1ミリグラムにつき約360単位)。
緩衝液 KH2PO4/K2HPO4 385mM、pH8 Sigma社
酵素 グルコースオキシダーゼ 4080U/ml Biozyme社
安定剤 トレハロース 1% Sigma社
好ましい範囲
緩衝液 300〜1000mM、pH7〜10
酵素 500〜12000U/ml(1.85〜44.4mg/ml)
安定剤 0.5〜30%
グルコースオキシダーゼの活性度は、材料1ミリグラムにつき約270単位である(この酵素は他の凍結乾燥剤および安定剤とともに調製されているため、タンパク質1ミリグラムにつき約360単位)。
酵素がベース層内に、例えばインク組成IIを用いて調製されたベース層内に位置する場合、滴下コーティング溶液は緩衝液のみを、任意で安定剤とともに含有してもよい。
製造方法
グルコース試験ストリップ(バイオセンサー)を、スクリーン印刷および滴下コーティング技術の組み合わせを用いて製造した。また、印刷およびコーティング技術における当業者にとって本質的に公知である他の印刷および/またはコーティング技術を用いてもよい。この例示された方法は図のみとする。それぞれの場合において種々の工程の実施順序は最終製品に影響を及ぼさずに変更されても良いことは理解されるだろう。図1〜図4はいずれも、上の列が加工工程を示し、下の列がバイオセンサーの逐次的積み重ねを示す。
グルコース試験ストリップ(バイオセンサー)を、スクリーン印刷および滴下コーティング技術の組み合わせを用いて製造した。また、印刷およびコーティング技術における当業者にとって本質的に公知である他の印刷および/またはコーティング技術を用いてもよい。この例示された方法は図のみとする。それぞれの場合において種々の工程の実施順序は最終製品に影響を及ぼさずに変更されても良いことは理解されるだろう。図1〜図4はいずれも、上の列が加工工程を示し、下の列がバイオセンサーの逐次的積み重ねを示す。
図1によれば、ベース基板2はポリエステル(Valox(商標登録))から形成される。英国のGwent Electronic Materials社の製品番号C80130D1の導電性カーボンペーストとして、導電性トラック4を基板2の上に印刷した。このインクの目的は、メーターインタフェースと、基準および作用電極との間に導電性トラックを設けることである。印刷後に、このインクを1分間、130℃の強制空気乾燥機で乾燥させた。導電性カーボン4の表層に印刷された第2のインクは、英国のGwent Electronic Materials社の製品番号C61003D7のシルバー/シルバー塩化物ポリマーペーストである。このインク6は、接触領域または作用領域の上には印刷されない。このインク6は本システムの基準電極22を形成する。それを1分間、130℃の強制空気乾燥機で乾燥させる。本明細書で用いる用語「基準電極」がそのような技術において公知である対電極としても機能する基準電極であることは、理解されるだろう。
次の層は、導電性カーボン4の上に印刷される白金族金属炭素インクで(インク組成IまたはII)である。このインクを1分間、90℃の強制空気乾燥機で乾燥させ、厚さ約12μmの導電性ベース層8を形成する。その後に、誘電体層10が、作用電極および基準電極が設置される作用領域12を除いて印刷される。この誘電層10は、英国のApollo社からのMV27である。この層の目的は、システムを絶縁することである。それを1分間、90℃の強制空気乾燥機で乾燥させる。場合によっては、ベース層8は誘電体層10の後に印刷可能である。ただし、誘電体層10を次に塗布することにより印刷の耐容要件のいくらかが取り除かれるので、ベース層8を最初に印刷するのが好ましい。
それから、BioDot滴下コーティング装置を用いて、滴下コーティング層をベース層8に塗布する。滴下コーティング溶液の使用量は125nlであり、それは一滴として塗布される。この滴下コーティング層を1分間、50℃の強制空気乾燥機で乾燥させる。
次に、スペーサ層14を誘電体層10の上に塗布する。図1に示す実施例では、スペーサ層14は厚さ約90μmの両面粘着テープから形成される。このテープは、Adhesives Research 90118であり、2つの32μmのAS−110アクリル医療用粘着層を持った26μmのPET担体からなる。
互いの先端部に積み重ねられた、例えば、倉庫内または試験メーターのカートリッジ内に積み重ねられたバイオセンサーでは、基板の端縁からの粘着剤のはみ出しを減少または排除し、隣接するバイオセンサー同士を接着しやすくするのが望ましい。この目的のためにスペーサ14として使用するのに好ましい材料は、Ireland、Limerick、Raheen Business Park、Adhesives Research Ireland社からの製品番号61−89−03である。このスペーサ材料は、36μmのPET膜の各側面上の感圧接着剤(PSA)25〜29μmからなる。さらに別のスペーサは、Adhesives Research Ireland社の製品番号64−14−04であり、それは23μmのPET膜の各側面上にUV硬化型PSAを有する。この粘着層はいずれも厚さ31〜35μmである。推奨される硬化条件は、D−バルブ(鉄でドープ処理された水銀)、1つのランプ、フルパワー、およびベルトスピード20m/分である。これらの条件下で期待されるエネルギーは、UVA=357J/cm2、UVB=0.128J/cm2、UVC=0.010J/cm2である。
スペーサ14は、バイオセンサーの毛管流路を決定するチャネル16を有する。第2の基板すなわち蓋18をスペーサ14に接着する。蓋18は、親水性熱密封粘着剤「HY9」約12.5μmでコーティングされた50μmのPETテープ(Adhesive Research 90119)からなる。蓋18は、狭い排出口19を設けられて、毛管流路からの空気を逃がすことができる。最後に、第2の基板18を切断して最終的なバイオセンサー20を作る。あるいは、スペーサ14を最初に第2の基板18に接着し、次に第1の基板に接着させることもできる。この順序の利点は、第2の基板18の両方の部分がスペーサ14によって正しい位置に保持されている間に、第2の基板18を切断して排出口19を設けることができる点である。
バイオセンサー20は、基準電極22および作用電極24を有する。作用電極24は、第1の基板2の上の導電性カーボン層4の上のベース層8と、緩衝液を含む表層とからなる。
大規模製造の場合には、最初に単一のブランクまたはウェブの上で互いに接続され、好ましくは2倍の基板長の深さで接続される複数の基板が設けられても良いし、ブランクまたはウェブ全体の上で実施される種々の加工工程の後に、複数のバイオセンサー20を製造する最終分離工程が続いた。
バイオセンサー20は、スペーサ14の中のチャネル16と、蓋18の内面と、第1の基板2とによって規定される(誘電体層10によって大部分覆われる)毛管流路を有する。この流路は、基板2、18のそれぞれの対立する短い端縁から基準電極および作用電極22、24へ延びている。蓋18の内面は、親水性になるように処理されて、血液による湿りを容易にする。酵素としてのグルコースオキシダーゼとともに、このバイオセンサーは血糖を測定するために用いられる。ユーザーは、自分の上腕などのような代替部位を針で刺して皮膚上に小さな血液の滴を作るとともに、その血液が置かれた皮膚にバイオセンサー20の適切な短い端縁を接触させることによって、読み取りを行うことができる。血液は迅速に作用領域12に吸引され、既知の手段で導電性トラック4に接続されたメーター(図示せず)によって読み取り可能な電流を作り出す。試料の量は約0.8nlで十分である。
代替の実施の形態が図2で示される。加工工程は以下を除いて図1と同じである。UV−硬化型樹脂(Nor−Cote 02−060 Halftone Base)を誘電体層10の上にスクリーン印刷するとともに、UV光(120w/cm中圧水銀蒸気放電ランプ)30m/分までで樹脂を硬化させることによってスペーサ14を形成する。この樹脂は、アクリレートオリゴマー(29〜55%)、N−ビニル−2−ピロリドン(5〜27%)、およびアクリレートモノマー(6〜28%)からなる。チャネル16に加え、スペーサ14は、毛管流路から空気を逃がすための排出口チャネル15を有する。蓋18は排出口の出口を必要とせず、親水性熱密封粘着剤(「HY9」でコーティングされたAdhesive Research 90119)でコーティングされた内面を有する単一のユニットとして形成されている。蓋18は、1〜2秒の熱および圧力(100℃、400kPa)の作用によってスペーサ14に接着される。
次に、図3を参照すると、さらなる実施の形態が例示される。本実施の形態は、図2と同じ構造を有するが、(図2と同じUV硬化型樹脂から形成された)スペーサ14aではチャネル16aは1つの長い端縁から他方の端縁へ延びている。この構成により、毛管の開口部は1つの長い端縁に設けられ、空気の排出口が他方の端縁に設けられる。
図4のバイオセンサーは、図3と類似の構造を有するが、導電性トラック4、導電性インク6、およびベース層8は配列されて、作用電極24および基準電極22が流路の中で並ぶように配置されている。この配置は、図1および図2に示すのと同じ効果を有するが、バイオセンサーの1つの長い端縁の開口部を介して試料が塗布される。毛管流路を介して流れる血液は、両方の電極の上にほぼ均一かつ同時に流れ、そのことは再現性および正確性において望ましい。
試験手順
試験手順は、試験ストリップをポテンシオスタット(定電位電解装置)に接続することを伴う。試料を、この実施例では静脈全血(WB)の試料を注入後に、電位350mVを作用電極および基準電極を通して作用させる。この電位を15秒間維持し、その後に電流を測定する。反応グラフを作成するのにこの電流を使用する。図5〜図13の結果は、インク組成Iと、それぞれGODおよび緩衝剤を含有する種々の滴下コーティング組成とを用いて得られた。試験ストリップは、図1に示す構造を有した。滴下コーティング(125nl)の後に、部分的に構成された試験ストリップは、積層の前に4日間、室温および低湿度で静置し、切断および注封を行った。
試験手順は、試験ストリップをポテンシオスタット(定電位電解装置)に接続することを伴う。試料を、この実施例では静脈全血(WB)の試料を注入後に、電位350mVを作用電極および基準電極を通して作用させる。この電位を15秒間維持し、その後に電流を測定する。反応グラフを作成するのにこの電流を使用する。図5〜図13の結果は、インク組成Iと、それぞれGODおよび緩衝剤を含有する種々の滴下コーティング組成とを用いて得られた。試験ストリップは、図1に示す構造を有した。滴下コーティング(125nl)の後に、部分的に構成された試験ストリップは、積層の前に4日間、室温および低湿度で静置し、切断および注封を行った。
図5は、リン酸カリウム緩衝剤385mMに対してGODレベル(酵素に対する緩衝剤の比率)の変化の結果を示す。それぞれの溶液においてトレハロースはGODと同じ濃度(100mlにつき数g)で存在した。0.83mM〜41.5mMの静脈血グルコース濃度に対して結果をプロットした。この結果が示していることは、GODの増加(緩衝剤/酵素の比を約20mmol/gから減少)が、より高いグルコース濃度に渡ってグルコースの感度の増大を与えることである。800mMまで増加された緩衝剤の濃度とのさらなる実験が示唆していることは、385mMまたは600mMでの変化よりも少ないように見えるので、安定性が若干向上されることである。しかしながら、GODの濃度を増加(比率を減少)させることは、ストリップの安定性を向上させるのに大きな効果を有するようである。GODレベルの増加は、低いグルコースの濃度の感度に影響を与え、反応を平坦化させる。このため、酵素の挿入を増加させることは、ボトムエンドの感度を低減させる可能性がある損失を除いて、試験ストリップの安定性を向上させる。
図6は、GODの挿入を100mlあたり0.39gから7.7gへの変更と、同量のトレハロースとの結果を描いている。GODの減少により低い濃度の反応が改善される。また、高いGODと高い緩衝剤の濃度とが、ある範囲のグルコースレベルで反応を低下させる傾向があることを見出した。この影響は、滴下コーティング溶液内の種々の濃度で酵素に対する緩衝剤の比率(mmol/g)を変更する結果を描く図8〜図12から観察される。
図7に示すように、トレハロース濃度を変更しても、低いグルコースの濃度に対しての反応に影響がほとんどない。トレハロースのより高いレベルは、低いグルコースレベルでの感度にとっての損失を持つバイオセンサーの安定性を高めるから好適である。
図13は、最上層の滴下コーティングと比較されたスプレーコーティングの結果を示す。滴下コーティングは、BioDot装置から125nlの一滴を用いた。スプレーコーティング装置は、距離1cmあたり容積0.4μlで(ベース層8よりもわずかに広い)幅約4mmの噴霧化されたスプレーを生成した。特に、高い血糖濃度値に対しては、濃度が高ければ高いほど大きな反応がもたらされる。385mMおよび38.5mmol/gで滴下コーティングされた作用電極は、同じ濃度値においてスプレーコーティングされた作用電極よりも顕著に大きな反応を示した。
個々の実施の形態の内容で明確に記載された本発明の特定の特徴は、単一の実施の形態での組み合わせでも提供可能であることが理解される。これとは逆に、簡潔に述べるために単一の実施の形態の内容で記載された本発明の種々の特徴は、個別にまたは任意の適切な小さな組み合わせで提供可能である。
本発明は具体的な実施の形態を参照して記述されたが、本発明の変更および変形は添付の請求項で規定された発明の範囲から逸脱しないで解釈されることは理解されるべきである。
Claims (32)
- 酸化還元酵素によって作用される基板を収容する流体の存在下で前記酵素の触媒活性を電流滴定的に示す非媒介バイオセンサーであって、
(a)第1の基板と、
(b)前記第1の基板の上の作用電極および基準電極と、
(c)試験メーター装置と電気的に接続するため前記電極に接続された導電性トラックと、
(d)前記第1の基板の一部を覆う第2の基板と、
(e)内部にチャネルを有し前記第1の基板と前記第2の基板との間に配置されるとともに、前記チャネルが隣接する面と協働してメッシュを含まず前記基板の少なくとも1つの端縁から前記電極へ延びる毛管流路を規定するようにしたスペーサ層とを有し、
前記作用電極が、
(f)樹脂によって互いに結合され細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物の粒子からなる導電性ベース層と、
(g)前記ベース層の上で緩衝剤からなる最上層と、
(h)前記ベース層および前記最上層の少なくとも1つに前記酸化還元酵素の触媒活性量とを備える、バイオセンサー。 - 前記緩衝剤が、リン酸塩、ADA、MOPS、MES、HEPES、ACA、およびACESからなるグループ、またはpKaが7.4±1である緩衝剤から選択される、請求項1に記載のバイオセンサー。
- 前記緩衝剤のpHが7〜10である、請求項1または2に記載のバイオセンサー。
- 前記緩衝剤のpHが7〜8.5である、請求項3に記載のバイオセンサー。
- 前記最上層にシステム安定剤をさらに含み、前記酵素によって作用されないポリオールからなる、請求項1〜4のいずれかに1項に記載のバイオセンサー。
- 前記システム安定剤がトレハロースである、請求項5に記載のバイオセンサー。
- 前記酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項1〜6のいずれか1項に記載のバイオセンサー。
- 前記ベース層も、細かく分離された炭素またはグラファイトの粒子を含有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載のバイオセンサー。
- 白金族金属または酸化物の前記細かく分離された粒子が、前記細かく分離された炭素またはグラファイトの表面に運ばれる、請求項8に記載のバイオセンサー。
- 前記細かく分離された粒子が炭素を包含し、前記ベース層が炭素の活性部位を遮断するための遮断剤をさらに含む、請求項8または9に記載のバイオセンサー。
- 前記遮断剤がタンパク質またはポリオールからなる、請求項10に記載のバイオセンサー。
- 前記遮断剤がウシ血清アルブミン(BSA)またはトレハロースである、請求項11に記載のバイオセンサー。
- 前記酸化還元酵素が実質的に前記最上層に配置されている、請求項1〜12のいずれか1項に記載のバイオセンサー。
- 酵素に対する緩衝剤の比率が10〜70mol/kgの範囲である、請求項1〜13のいずれか1項に記載のバイオセンサー。
- 前記酵素に対する緩衝剤の比率が20〜40mol/kgの範囲である、請求項14に記載のバイオセンサー。
- 前記毛管流路が第1および第2の基板の両方の平行端縁から前記電極へ延びる、請求項1〜15のいずれか1項に記載のバイオセンサー。
- 酸化還元酵素によって作用される基板を含む流体の存在下で前記酵素の触媒活性を電流滴定的に示す非媒介バイオセンサーを製造する方法であって、
(a)上部に作用電極および基準電極を有する第1の基板と、試験メーター装置との電気的に接続のために前記作用電極および基準電極に接続される導電性トラックとを取り、
(b)細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物を含有するインクと樹脂結合剤とを前記導電性トラックの1つに印刷することによって前記作用電極を形成し、
(c)前記印刷インクを乾燥させて、樹脂によって互いに結合された前記白金族金属または白金族金属酸化物からなる導電性ベース層を形成させまたは形成可能にし、
(d)緩衝剤からなるまたは緩衝剤を含有するコーティング媒質で前記ベース層をコーティングすることにより、前記ベース層に最上層を形成し、
(e)前記印刷インクおよび前記コーティング媒質の少なくとも1つにおいて前記酸化還元酵素の触媒活性量を提供し、
(f)前記第1の基板の一部を覆う第2の基板を提供し、
(g)内部にチャネルを有し前記第1の基板と前記第2の基板との間に配置され、前記チャネルと隣接する表面とが、メッシュを含有せず前記基板の少なくとも1つの端縁から前記電極へ延びる毛管流路を一緒に規定するスペーサ層を提供する、方法。 - 前記コーティング媒質が前記緩衝剤を含有するコーティング液であり、前記方法が前記ベース層に最上層を形成するためにさらに前記コーティング液を乾燥させまたは乾燥可能にする、請求項17に記載の方法。
- 前記コーティング液が滴下コーティングによって塗布される、請求項18に記載の方法。
- 前記ベース基に塗布されるコーティング液の容積が90〜160nlの範囲である、請求項19に記載の方法。
- 前記コーティング液がスプレーコーティングによって塗布される、請求項18に記載の方法。
- 前記酵素が前記コーティング媒質の中で提供される、請求項17〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コーティング液中の緩衝剤の濃度が300mmol/l〜1mol/lの範囲である、請求項18に記載の方法。
- 酵素に対する緩衝剤の比率が10〜70mmol/gの範囲である、請求項17〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵素に対する緩衝剤の比率が20〜40mmol/gの範囲である、請求項24に記載の方法。
- 前記緩衝剤がリン酸塩またはADAからなる、請求項17〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インク中の前記細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物が、細かく分離された炭素またはグラファイトの粒子の表面に運ばれる、請求項17〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コーティング液のpHが7〜8.5の範囲である、請求項18に記載の方法。
- 前記第1の基板にUV硬化型組成物を印刷し、その後に前記組成物を硬化させることによって、前記スペーサ層が形成される、請求項17〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記スペーサ層が両面粘着テープからなる、請求項17〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の基板が、親水性の内面を有するプラスチック材を備える、請求項17〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記親水性の内面が熱密封性粘着剤からなり、それによって、前記第2の基板が熱および圧力の作用によって前記スペーサ層に粘着される、請求項31に記載の方法。
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