MXPA01009024A - Dispositivo para analisis de disco con almohadilla de inoculacion y sus metodos de uso. - Google Patents

Abstract

Un dispositivo de analisis para la deteccion y enumeracion de microorganismos. El dispositivo incluye discos absorbentes sobre un sustrato, un vehiculo de inoculacion para inocular los discos con la muestra y una cubierta opcional. Tambien se presentan metodos de uso.

Description

DISPOSITIVO PARA ANÁLISIS DE DISCO CON ALMOHADILLA DE INOCULACIÓN Y SUS MÉTODOS DE USO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a dispositivos de disco y métodos de uso para la detección y enumeración de microorganismos presentes en una muestra. La detección y enumeración de microorganismos se lleva a la práctica en numerosos entornos, incluyendo la industria de procesamiento de alimentos (pruebas en materia de contaminación de alimentos por microorganismos tales como E. coli y S . a ureus) , la industria del cuidado de la salud (examen de muestras de pacientes y otras muestras clínicas en materia de infección o contaminación) , industria de tésteos ambientales, la industria farmacéutica, y la industria cosmética. La detección basada en el desarrollo y la enumeración de microorganismos se lleva a la práctica comúnmente usando medios nutrientes líquidos (por ejemplo, análisis de número más probable -MPN- o medios nutrientes semisólidos -placas de Petri de agar) . La enumeración utilizando el método de MPN líquido se logra habitualmente colocando diluciones en 10 seriadas de una REF. 132379 muestra de interés en conjuntos replicados de tubos que contengan medios selectivos e indicadores químicos. Los tubos se incuban durante 24-48 horas a temperaturas elevadas (30-37°C) para proseguir con el examen de desarrollo de organismos. Se utiliza una fórmula estadística, basada en el volumen de muestra testeada y la cantidad de tubos positivos y negativos para cada conjunto, para estimar la cantidad de organismos presentes en la muestra inicial. Este método para realizar el análisis MPN tiene varias desventajas. Es muy trabajoso debido a los múltiples pasos de dilución y colocación en pipetas requeridos para efectuar 'el análisis. Habitualmente, sólo es práctico cuando se trata del uso de conjuntos replicados de tres a cinco tubos para cada dilución. Como resultado, los límites de confiabilidad del 95% para un estimado MPN de concentración microbiana son extremadamente amplios. Por ejemplo, un estimado de 20 de un MPN con tres tubos tiene límites de confiabilidad del 95% comprendidos entre 7 y 89. Además, los resultados, habitualmente, no pueden obtenerse en menos de veinticuatro horas. Se han introducido dispositivos con cavidades múltiples para usar en relación con el análisis MPN. Un usuario inocula el dispositivo introduciendo una muestra del ítem a ser testeado, como por ejemplo alimento, en el sustrato que contiene las cavidades. Habitualmente, la muestra incluye medio de desarrollo e indicadores. Una vez inoculado, el usuario incuba el dispositivo y luego calcula el MPN basado en la cantidad de cavidades "positivas" . Los dispositivos de cavidades múltiples presentan muchos problemas potenciales. La inoculación podría verse obstaculizada por burbujas de aire que se forman en las cavidades durante la introducción de la muestra. Puede ser que no todas las cavidades reciban el mismo volumen de muestra. Además, el método de inoculación o el dispositivo pueden promover puentes y contaminación cruzada entre las cavidades, con el consiguiente riesgo potencial de afectar adversamente el cálculo MPN. Otro problema potencial en el caso de los dispositivos ulti-cavidad es que su uso puede resultar inconveniente. Por ejemplo, la mayoría de los dispositivos multi-cavidad se inoculan colocando directamente las muestras en las cavidades con pipeta o vertiendo muestra en el sustrato multi-cavidad. El uso de las pipetas es trabajoso y lleva mucho tiempo. El vertido requiere que las cavidades se llenen en forma uniforme y que el exceso de muestra sea removido. En cualquier_ caso, estos dispositivos pueden ser proclives a la contaminación por fuentes externas durante el procedimiento de inoculación. La presente invención se ocupa de varias de las desventajas del arte previo. • La invención provee dispositivos y métodos de análisis para la detección y enumeración rápidos de microorganismos. El dispositivo tiene un sustrato que incluye discos absorbentes fijados a los mismos y un vehículo de inoculación conectado al dispositivo, posicionado para inocular los discos absorbentes. Opcionalmente, el dispositivo puede incluir una cubierta. En un aspecto de la presente invención, el sustrato incluye dos tamaños diferentes de discos. Preferentemente, el sustrato incluye alrededor de cincuenta discos de un tamaño y cincuenta discos de otro tamaño. En una forma de realización particularmente preferida, el sustrato incluye discos capaces de contener aproximadamente dos microlitros de muestra y discos de diferente tamaño capaces de contener alrededor de dieciséis microlitros de muestra, y los discos de dieciséis microlitros rodean al menos parcialmente los discos de dos microlitros. El sustrato puede ser, además, hidrófobo, para ayudar a evitar la contaminación cruzada entre discos.

El dispositivo puede incluir opcionalmente un borde o margen exterior que define un espacio entre los discos y el extremo del sustrato. El borde o margen externo puede ser opcionalmente elevado. Preferentemente, el borde o margen exterior se dimensiona para permitir que la cubierta opcional quede sellada con el sustrato cuando el dispositivo se está utilizando . En otro aspecto de la presente invención, el vehículo de inoculación es una almohadilla absorbente de inoculación con un respaldo fijado a la misma. Preferentemente, el respaldo está fijado de forma de poder desprenderse a lo largo de una perforación en el dispositivo . En otro aspecto de la presente invención, la cubierta se fija al sustrato formando una articulación. El vehículo de inoculación puede ser fijado en forma adhesiva a la articulación de forma que el vehículo de inoculación sea capaz de inocular los discos absorbentes. • En ün método de la presente invención, se provee un dispositivo de análisis como el que se describe previamente. El usuario coloca la muestra a ser testeada en el vehículo de inoculación y coloca el vehículo de inoculación contra los discos absorbentes, con lo cual los discos se inoculan con la muestra. El usuario quita y desecha el vehículo de inoculación e incuba el dispositivo. A continuación el usuario realiza la detección de los microorganismos diana que se hubieran desarrollado durante la incubación y luego puede efectuar la enumeración de microorganismos. En una forma de realización preferida, el método puede ser realizado en veinticuatro horas o menos. La presente invención resuelve muchas de las deficiencias de los dispositivos y métodos del arte previo. El dispositivo puede ser inoculado rápida y uniformemente y en forma prácticamente simultánea, sin preocuparse por la formación de burbujas de aire. El vehículo de inoculación desprendible se desprende fácilmente y se desecha. Una vez desprendido, el vehículo de inoculación no permanece en el dispositivo y, por lo tanto, no presenta una fuente posible de contaminación. La cubierta provee protección adicional contra la contaminación y ayuda a evitar que se sequen los discos. En el caso del análisis MPN para la detección y enumeración de microorganismos, los enfoques aquí descritos permiten el uso de especies indicadoras solubles en agua, y reducen o eliminan la necesidad de llevar a cabo las varias diluciones que se requieren habitualmente en los análisis MPN actuales. Otras ventajas de la invención resultarán claras a partir de la siguiente descripción detallada y las figuras . La Figura 1 es una vista en perspectiva de un dispositivo de la presente invención. La Figura 2 es un corte transversal del dispositivo, a lo largo de la línea 2-2 en la Figura 1, en el que el dispositivo se ha rotado 180°. La Figura 3 es una vista en planta superior parcial de un dispositivo de la presente invención, detallando un vehículo de inoculación desprendible. La Figura 4 es una vista en extremo de un dispositivo de la presente invención luego de la remoción del vehículo de inoculación del dispositivo. La Figura 5a es una vista en planta superior de una configuración de un dispositivo de la presente invención. La Figura 5b es una vista en planta superior de una configuración alternativa de un dispositivo de la presente invención. La Figura 5c es una vista en planta superior de una configuración alternativa de un dispositivo de la presente invención.

La Figura 5d es una vista en planta superior de una configuración alternativa de un dispositivo de la presente invención. La Figura 5e es una vista en planta superior de una configuración alternativa de un dispositivo de la presente invención. Esta invención se refiere a dispositivos de disco y métodos de uso de los mismos para llevar a cabo la detección y enumeración de microorganismos basadas en señal. A los fines de la presente invención, los siguientes términos tendrán los siguientes significados: "Fijar" se refiere a la adherencia de los discos al sustrato mediante cualquier método o medio conocido en la técnica al momento de su fabricación, incluyendo adhesivo, soldadura ultrasónica, embutido, o fijación física. "Cubrir", cuando se utiliza como un verbo, no se limitará a una orientación espacial en particular, tal como cubrir la parte superior de un dispositivo. "Disco" no se limitará a la forma o configuración. Por ejemplo, los discos pueden ser circulares, ovales, cuadrados, o poligonales, o de cualesquiera otras formas apropiadas.

"Hidrófobo" e "hidrófilo" tienen los significados que se les asignan comúnmente en la técnica. Así, un material "hidrófobo" tiene poca o ninguna afinidad por el agua o medios acuosos, mientras que un material "hidrófilo" tiene una afinidad relativamente fuerte por el agua o medios acuosos. "Inoculación" se refiere a humedecer un disco o discos absorbentes de la presente invención con muestra. "Microorganismo" se refiere a todos los organismos y células vivos, incluyendo sin limitación bacterias, micoplasmas, rickettsias, espiroquetas, fermentos, mohos, protozoos, como así también formas microscópicas de células eucariotas, por ejemplo células simples (cultivadas o derivadas directamente de un tejido u órgano), o pequeñas agrupaciones celulares.

Los microorganismos no sólo se detectan y/o cuentan cuando se detectan células enteras directamente, sino también cuando dichas células se detectan indirectamente, tal como por medio de la detección o cuantificación de fragmentos celulares, moléculas biológicas derivadas de células, o sub-productos de las células . Con referencia a las Figuras 1 y 2, el sustrato 12 del dispositivo de análisis 10 puede ser fabricado con cualquier material que sea relativamente hidrófobo y provea una superficie o soporte adecuado para los discos 14 descritos más abajo. El sustrato 12 puede ser fabricado, por ejemplo, a partir de películas poliméricas u otros materiales apropiados. Los polímeros adecuados incluyen, sin limitación, polietileno, polipropileno, poliéster, poliimidas, fluopolímeros, policarbonatos, poliuretanos y poliestirenos . El sustrato 12, preferentemente, no exhibe propiedades fluorescentes o absorbentes de luz sustanciales que interferirían con cualquier sistema indicador fluorescente o basado en color que puede ser empleado a los fines de la detección. Preferentemente, el sustrato 12 no producirá la lixiviación de los productos químicos al ponerse en contacto con la muestra líquida. La hidrofobicidad del sustrato 12 ayuda a prevenir la contaminación cruzada de los discos 14. A este respecto, el sustrato 12 podrá ser tratado para impartir hidrofobicidad. Por ejemplo, se pueden agregar al sustrato 12 una capa delgada de silicona acrilatada u otro material hidrófobo. Los expertos en la técnica reconocerán otros medios para impartir hidrofobicidad a la superficie. Los discos absorbentes 14 se fijan al sustrato 12 para contener y retener la muestra líquida. De acuerdo con ello, los discos 14 pueden ser construidos a partir de una variedad de materiales absorbentes, incluyendo celulósicos, poliolefinas, poliésteres, y poliamidas, prefiriéndose los materiales celulósicos. Los materiales celulósicos adecuados incluyen papel, pulpa de madera y rayón, y pueden incluir celulósicos químicamente modificados, tales como esteres de celulosa. Las poliolefinas adecuadas incluyen fibras de polietileno hidrófilo o polipropileno hidrófilo. Las poliamidas adecuadas incluyen nylon. Los poliésteres adecuados incluyen ácido poliláctico. Los discos absorbentes 14 del dispositivo de análisis 10 son preferentemente de tamaño uniforme y cada disco tiene una capacidad de retención de líquido de alrededor de una décima de microlitro a cien microlitros de la muestra líquida.' Más preferentemente, cada disco tiene una capacidad de retención de líquido comprendida entre alrededor de dos microlitros y alrededor de dieciséis microlitros. Habitualmente, cuanto más alta sea la retención total en volumen de la muestra, mayor será la sensibilidad del dispositivo 10. De acuerdo con ello, es conveniente mantener un gran volumen de muestra. El dispositivo 10 puede incluir numerosos discos 14. El dispositivo para análisis 10 contiene preferentemente entre uno y alrededor de seiscientos discos, prefiriéndose cien discos aproximadamente . Los discos 14 pueden ser fijados al sustrato 12 mediante diversos medios conocidos en la técnica, incluyendo, sin limitación, la utilización de un adhesivo 16 o cinta adhesiva de ambos lados. Los adhesivos preferidos incluyen los adhesivos de isooctilacrilato insolubles en agua, como los presentados en la patente estadounidense N° 5.409.838. Un ejemplo de cinta adhesiva de ambos lados adecuada es la comercializada bajo el N° de Producto 1513, Double Stick Tape®, de 3M Co., St. Paul, Minnesota. Los discos 14 se fijan al sustrato 12 lo suficientemente separados de modo que la muestra, una vez inoculada en un disco 14, no pase por rozamiento directamente desde ese disco a otro. El dispositivo 10 puede contener también conjuntos de discos 14 con diferentes volúmenes. Al tener discos con diferentes volúmenes se podría ampliar significativamente el rango de enumeración del dispositivo en un análisis MPN, como podrá apreciar fácilmente un experto en la técnica. En esta forma de realización preferida, el dispositivo 10 incluye, preferentemente, alrededor de cien discos. Más preferentemente, el dispositivo 10 incluye aproximadamente cincuenta discos con un volumen de retención de líquido de alrededor de dieciséis microlitros y alrededor de cincuenta discos con un volumen de retención de líquido de alrededor de dos microlitros. Si hay discos 14 de más de un tamaño, se prefiere que los discos más grandes 14a sustancialmente rodeen los discos más pequeños 14b, como se ilustra en la Figura 1. Los discos más grandes 14a están ubicados entre los discos más pequeños 14b y el margen externo 30 de sustrato 12. Se cree que colocando los discos 14 de esta manera se ayuda a evitar que los discos más pequeños 14 se sequen, debido a que los discos más grandes 14a actúan para humidificar el área de los discos más pequeños 14b, como así también para proteger los discos más pequeños 14b contra flujos de aire que pudieran secar los discos más pequeños 14b, como podría suceder durante la incubación a alta temperatura. Con referencia al Ejemplo 3, más abajo, a los fines de lograr este resultado, no es necesario que los discos más grandes 14a rodeen completamente los discos más pequeños 14b, sea con respecto a los discos más pequeños 14b propiamente dichos o al margen exterior. Los discos 14 pueden ser de cualquier tamaño, forma y altura. Preferentemente, los discos 14 tienen una altura uniforme. La altura puede regularse para permitir que la cubierta 18 opcional quede sellada con el sustrato, como se describirá más en detalle a continuación . Con referencia a las Figuras 1-3, la presente invención 10 incluye un vehículo de inoculación 20. El vehículo de inoculación 20 es capaz de retener la muestra para la subsiguiente inoculación de los discos absorbentes 14. Los ejemplos de posibles vehículos de inoculación 20 incluyen almohadillas absorbentes, placas termo- formadas y depósitos. Con referencia a la Figura 3, el vehículo de inoculación 20 se fija al dispositivo de forma de permitir que el vehículo 20 se ponga en contacto con los discos absorbentes 14. Un método preferido es fijar el vehículo de inoculación 20 a lo largo de una perforación 22. En esta configuración, el vehículo de inoculación 20 puede retirarse del dispositivo 10 después del uso, simplemente desgarrando a lo largo de la perforación 22. El vehículo 20 cubre sustancialmente el área del sustrato 12 que tiene los discos 14. La muestra se distribuye en o dentro del vehículo 20 al colocarla sobre el mismo. A continuación, el usuario pone el vehículo de inoculación 20 en contacto con los discos 14. La muestra se transfiere desde el vehículo 20 hacia los discos 14, en forma prácticamente simultánea y uniforme. Preferentemente, el vehículo de inoculación 20 es una almohadilla de inoculación absorbente 24 con un respaldo 26 fijado a la misma. La almohadilla 24 puede estar hecha de cualquier cantidad de materiales absorbentes, tales como los mencionados previamente para el material del disco. A los fines de la fabricación, es conveniente que la almohadilla 20 este construida con el mismo material de los discos 14. La almohadilla 24 puede ser de cualquier tamaño o forma. Preferentemente, la almohadilla 24 cubre más área del sustrato 12 que la cubierta por los discos 14 y cubre todos los discos 14 para asegurar que todos sean inoculados cuando la almohadilla 24 se pone en contacto con los discos 14. El respaldo 26 se fija al sustrato 12. Preferentemente, el respaldo 26 se fija en forma desprendible, tal como a lo largo de una perforación 22. Los respaldos 26 preferidos son relativamente delgados y no lixivian químicos al ponerse en contacto con la muestra líquida. A los fines de la fabricación, el respaldo 26 puede ser fabricado del mismo material que el sustrato 12. La almohadilla 24 puede ser fijada al respaldo 26 de cualquiera de las formas conocidas en el arte, tal como con el adhesivo 28. Preferentemente, el respaldo 26 se fija en una forma que no resulte en la lixiviación de químicos al ponerse en contacto con una muestra de líquido . Opcionalmente, el dispositivo 10 puede incluir una cubierta 18 para proteger los discos 14 contra la contaminación o desecación una vez que la muestra se ha agregado al dispositivo 10. La cubierta 18 puede ser construida en cualquier cantidad de materiales. Preferentemente, la cubierta 18 es flexible, transparente en la medida en que se pueda efectuar la detección a través de la cubierta 18, compatible con los microorganismos en desarrollo y el sistema de detección a ser empleado en el dispositivo (p. ejemplo no exhibe luminiscencia o fluorescencia, u opacidad en un grado que pudiera interferir sustancialmente con la detección) y que no lixivie químicos no deseados al ponerse en contacto con la muestra de líquido. Con referencia a la Figura 4, la cubierta 18 se fija al dispositivo 10 de tal forma que cubre sustancialmente todos los discos 14 y preferentemente cubre todos los discos 14. Preferentemente, la cubierta 18 y el sustrato 12 están dimensionados de forma de permitir que la cubierta 18 haga contacto con el sustrato 12 y lo selle en el uso. A los fines de esta solicitud, "sellar" no requiere que la conexión entre el sustrato 12 y la cubierta 18 sea hermética. Por el contrario, la cubierta 18 se encuentra encima y entra eh contacto sustancial con el sustrato 12 para ayudar a evitar la contaminación durante el uso y a reducir el secado de los discos 14. Con referencia a la Figura 1, la cubierta 18, el sustrato 12 y el vehículo de inoculación 20 pueden fijarse entre sí en un extremo del dispositivo para formar una articulación 32. En esta configuración, preferentemente, el vehículo de inoculación 20 se fija entre la cubierta 18 y el sustrato 12. La muestra líquida de prueba puede ser cualquier muestra de interés, proveniente de cualquier fuente. La muestra líquida de prueba puede incluir medios de desarrollo nutrientes selectivos para el microorganismo de interés, y/o una sustancia indicadora que produzca una señal en presencia del microorganismo en desarrollo. Opcionalmente, el medio nutriente puede incluir un agente de gelificación que ayude a "encapsular" los microorganismos en desarrollo. Los expertos - en la técnica conocen dichos agentes de gelificación, e incluyen cualquier material absorbente de agua que se transforme en gel al agregar un líquido acuoso.

Preferentemente, el medio de desarrollo nutriente está presente como recubrimiento u otra deposición en o dentro de los discos absorbentes, en cantidades suficientes como para lograr concentraciones convenientes cuando se distribuye en el disco un volumen de la muestra de prueba líquida. Dicho recubrimiento puede lograrse, por ejemplo, colocando o distribuyendo una solución del medio nutriente (con o sin agente gelificante) sobre los discos y secando la solución para producir un recubrimiento o deposición del medio nutriente en los discos. Los componentes del medio pueden estar presentes en el adhesivo u otra sustancia que una los discos al sustrato (de ser aplicable) . Los medios finalmente se difunden dentro de la muestra. Se conoce una amplia variedad de medios de desarrollo selectivos para una gran variedad de microorganismos de interés, como así también una amplia variedad de sustancias indicadoras para una gran variedad de microorganismos, y cualquiera de estos medios o sustancias indicadoras es adecuado para usar en el método de la invención. Una ventaja de la presente invención es que pueden utilizarse indicadores solubles, ya que se evita la difusión mediante el confinamiento de la muestra biológica acuosa en los discos absorbentes.

Se pueden revestir o depositar de otra manera otros reactivos de análisis dentro de los discos absorbentes de los dispositivos para análisis. Dichos reactivos de análisis pueden incluir, sin limitación, agentes gelificantes y sustancias indicadoras tales como indicadores cromogénicos, fluorescentes, fluorogénicos, luminiscentes y electroquímicos. Los reactivos de análisis pueden ser inmovilizados en los discos absorbentes mediante cualquiera de los numerosos métodos para inmovilizar reactivos de . análisis en sustratos sólidos conocidos por el experto en la técnica. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, el secado de líquidos que contienen reactivos de análisis en los discos, como así también otros métodos para fijar en forma no covalente bio oléculas y otros reactivos de análisis en un sustrato sólido. Alternativamente, pueden emplearse varios métodos para fijar en forma covalente reactivos de análisis a los discos, los cuales son bien conocidos por el experto en la técnica. En la presente invención, se prefieren indicadores fluorogénicos porque pueden detectarse a concentraciones relativamente bajas. Los indicadores adecuados incluyen fosfato de 4-metilumbeliferilo y 4-metilu beleferil-B-D-glucopiranosida, L-fenilalaniña-7-amido-4-metilcourmarina. Otros pueden incluir acetato de 4-metilumbeliferilo y sulfato de 4-metilumbeliferilo. Los materiales de la presente invención son, preferentemente, biocompatibles, y pueden emplearse con indicadores fluorescentes. Los materiales no exhiben fluorescencia inherente significativa que pudiera interferir con el uso de los indicadores. Además, los discos preferentemente no exhiben una absorción significativa a la longitud de onda de emisión de los indicadores empleados. En el método de la presente invención, se prepara una muestra líquida para su testeo. Además de los alimentos, agua, etc.,' a ser testeados, la muestra puede incluir indicadores y otros reactivos. El usuario selecciona un dispositivo 10 que tenga medios de desarrollo selectivos para el microorganismo diana. Con referencia a la Figura 1, a los fines de comenzar el procedimiento, el usuario expone el vehículo de inoculación 20 y coloca la muestra en el vehículo 20. La muestra puede ser colocada en el vehículo 20 mediante vertido, con pipeta, u otro método adecuado. En el caso en que se emplee un vehículo absorbente 20, se prefiere colocar suficiente muestra en el vehículo 20 como para saturar sustancialmente tanto el vehículo 20 como los discos absorbentes 14. Bajo estas circunstancias, el vehículo absorbente 20 retiene un volumen de líquido más allá del nivel de saturación líquida del vehículo absorbente 20. Este volumen de líquido en exceso parece ayudar a distribuir rápidamente a través de la almohadilla 24 antes de la inoculación de los discos 14. Siguiendo con la Figura 1, el usuario pone el vehículo de inoculación 20 en contacto con los discos 14 de modo que la muestra se transfiera desde el vehículo 20 a los discos 14. Preferentemente, el vehículo 20 es de un tamaño tal de cubrir el área del sustrato 12 que tiene los discos 14. El usuario presiona sobre el vehículo 20 para ayudar a transferir la muestra del vehículo 20 a los discos 14. Por ejemplo, puede aplicarse una presión moderada presionando sobre la parte externa del dispositivo con una espátula de plástico. Este método da como resultado una inoculación casi simultánea de los discos 14. Cada disco 14 se satura sustancialmente y para cada disco 14 de igual tamaño, contiene aproximadamente la misma cantidad de muestra. Este método de inoculación, junto con la construcción del dispositivo, evita sustancialmente la contaminación cruzada entre discos 14. Los discos 14 absorben rápidamente la muestra, minimizando así el volumen de muestra que se distribuye al sustrato 12. La hidrofobicidad del sustrato 12 ayuda a asegurar que la muestra no produzca la contaminación cruzada de los discos 14 una vez efectuada la inoculación. Luego de la inoculación, el vehículo de inoculación 20 puede ser retirado y desechado. En una forma de realización preferida, el vehículo 20 es una almohadilla absorbente 24 con un respaldo 26. El respaldo 26 se fija al dispositivo a lo largo de una perforación 22. Luego de la inoculación, el respaldo 26 con la almohadilla 24 se desprende simplemente del dispositivo 10 y se desecha. Si se incluye una cubierta 18, se coloca sobre los discos 14 y se sella sobre el sustrato 12, como se ilustra en la Figura 4. Alternativamente, el dispositivo 10 puede ser incubado en una envoltura, bolsa, u otro recipiente para evitar el secado y/o contaminación de los discos 14. Luego de la distribución de la muestra desde el vehículo 20 a los discos 14, se pueden llevar a cabo diversos análisis dependiendo de los usos deseados. Para la detección o enumeración microbiana, el dispositivo de análisis puede ser incubado durante el tiempo suficiente como para permitir al menos un ciclo de división celular del microorganismo. Para estos fines, el dispositivo 10 se incuba generalmente a una temperatura comprendida entre alrededor de 25 °C y alrededor de 45°C, preferentemente entre alrededor de 30°C y alrededor de 37°C. El tiempo de incubación para la detección de microorganismos variará. El tiempo de detección también variará dependiendo de la velocidad de desarrollo y la cantidad de microorganismos presentes en la muestra. Teniendo en cuenta estas consideraciones, el tiempo de detección con fines de enumeración puede ser tan breve como aproximadamente 6-8 horas. Este tiempo de incubación relativamente breve representa una clara ventaja en comparación con los métodos de detección actuales, que habitualmente requieren tiempos de incubación de alrededor de 24 horas o más. Luego de la incubación del dispositivo de análisis, se detecta la presencia o ausencia de los microorganismos en los discos (y por ende en la muestra de prueba líquida) . La modalidad de detección depende del tipo de sustancia indicadora utilizada en el método. Puede utilizarse cualquier sustancia indicadora capaz de proveer una señal que pueda detectarse. Dichos indicadores incluyen, sin limitarse a ellos, indicadores fluorescentes, cromogénicos, luminiscentes y electroquímicos. La presencia o ausencia de un microorganismo en un disco puede detectarse visualmente, a simple vista o con un microscopio, si se utiliza un indicador cromogénico o luminiscente. El indicador puede revestirse o incorporarse de otra forma en los discos. Los indicadores pueden incluirse también en el adhesivo u otra sustancia que una los discos (de ser aplicable) al sustrato. En este caso, el indicador termina por difundirse en la muestra líquida. Si se usa una sustancia indicadora fluorescente, pueden emplearse para la detección equipos y métodos para detectar señales fluorescentes. Existen numerosas sustancias indicadoras y métodos de detección de señal, incluyendo sistemas para la detección de cambios electroquímicos, conocidos en la técnica de detección de microorganismos, y de acuerdo con la presente invención puede utilizarse cualquiera de dichas sustancias o sistemas. La detección de microorganismos en la muestra líquida puede incluir además la enumeración de un recuento de microorganismos en la muestra de prueba líquida. Una aplicación particularmente útil de estos métodos y dispositivos consiste en la enumeración de microorganismos en muestras de prueba líquidas basada en el desarrollo. Dicha enumeración es muy importante en el testeo de muestras de alimentos, ambientales, clínicas, farmacéuticas, cosméticas y otras en busca de contaminación por microorganismos. Los métodos y dispositivos de esta invención permiten el testeo eficiente, preciso, conveniente y efectivo en términos de costo de dichas muestras. Un uso preferido de los métodos y dispositivos de esta invención en dichas pruebas microbiológicas es en las técnicas de enumeración MPN. En los análisis MPN tradicionales, una muestra de interés se diluye serialmente (10 veces) y se coloca con pipetas en cantidades iguales en conjuntos replicados de tubos que contienen medios de desarrollo selectivos e indicadores químicos. Los tubos se incuban a temperatura elevada durante aproximadamente 24-48 horas, seguido por el examen del desarrollo de organismos. Se utiliza una fórmula estadística, basada en el volumen de la muestra y en la cantidad de tubos positivos y negativos para cada conjunto, para estimar la cantidad de organismos presentes (por volumen) en la muestra inicial. Tal como se usa actualmente, este método tradicional tiene varias desventajas. Es muy trabajoso debido a los múltiples pasos de dilución y colocación con pipetas requeridos para llevar a cabo el análisis. En materia de practicidad, sólo se utilizan conjuntos replicados de aproximadamente tres a cinco tubos para cada dilución. Como resultado, los límites de confiabilidad del 95% para un estimado MPN de concentración microbiana utilizando este método son extremadamente amplios. Por ejemplo, un estimado MPN de nueve tubos (dilución x 3) de 20 tiene límites del 95% de confiabilidad comprendidos entre 7 y 89. El uso de los métodos y dispositivos de la presente invención en análisis MPN resuelve varias de las desventajas mencionadas previamente. El trabajo se reduce en forma significativa porque no se hace necesario el uso de pipetas para los tubos individuales, y se requiere poca o ninguna agitación u otras manipulaciones. En lugar de ello, la muestra líquida se distribuye en discos absorbentes utilizando un vehículo de inoculación. Además, se requieren menos diluciones de muestra cuando hay grandes cantidades de discos absorbentes en el dispositivo. La cantidad relativamente grande de discos absorbentes también provee una estimación más precisa de concentración microbiana. Esto se debe a que la cantidad correspondientemente mayor de alícuotas de muestra provee un intervalo de límite de confiabilidad correspondientemente menor. Los métodos de la presente invención pueden ser automatizados y los dispositivos pueden analizarse mediante un sistema automatizado. Todas las referencias y publicaciones aquí citadas se incorporan a la presente por referencia. Se analizarán formas de realización de esta invención particulares en forma detallada y se ha hecho referencia a variaciones posibles dentro del alcance de la misma. Existe una variedad de técnicas y procedimientos alternativos a disposición de los expertos en el arte, que permitirían llevar a la practica la invención con forma exitosa, en forma similar. Los siguientes ejemplos se brindan con el fin de ayudar a comprender la presente invención y no deberán considerarse como limitativos del alcance de la misma. Salvo que se indique lo contrario, todas las partes y porcentajes son en peso.

EJEMPLO 1 Dispositivos do Análisis con Discos Absorbentes Se construyeron dispositivos de análisis con discos absorbentes que tienen un vehículo de inoculación que pueden ser empleados para la detección y enumeración de microorganismos en una muestra de prueba líquida, de acuerdo a como se describe en este ejemplo. Se cubrió con una lámina de material celulósico no tejido, absorbente (Grado de Producto 10201, Dexter, Windsor Locks, CT) una película de poliéster revestida con silicona Rexam (Grado 15819, grosor 2 mil, Rexam Reléase, west Chicago, IL) con un adhesivo sensible a la presión (PSA) de acrilato de isooctilo/acrilamida (relación de peso 96/4) . El material se saturó con un caldo acuoso que contiene los nutrientes de desarrollo y químicos indicadores expresados en la Tabla 1. Se eliminó el líquido excedente y el laminado se secó a alrededor de 100°C durante aproximadamente 10 minutos. Luego se cortaron discos circulares en el laminado seco usando una matriz de profundidad controlada que cortó sólo a través del material absorbente y las capas de adhesivo. El material que no consistía en disco se retiró del laminado y se desechó, para proveer una lámina de la película que contiene un conjunto de discos circulares. Los discos eran de dos medidas: discos pequeños de aproximadamente 4, 1 mm de diámetro y discos grandes de aproximadamente 8,3 mm de diámetro; y se agruparon y espaciaron como se ilustra en la Figura 1. Sobre la base de mediciones gravimétricas, los discos pequeños y grandes tenían capacidad de retener entre 2 y 16 microlitros de líquido, respectivamente. La lámina que contenía discos se cortó en rectángulos de 10, 9 cm x 12,1 cm para usar en la construcción de los dispositivos de análisis. Cada lámina rectangular individual contenía 52 pequeños discos agrupados en hileras paralelas dentro de un grupo circundante de 50 discos grandes en hileras paralelas, como puede verse en la Figura 1. La distancia entre el borde exterior de los discos grandes al borde de la lámina rectangular era de alrededor de 1,4 cm. Se preparó un vehículo de inoculación adhiriendo una almohadilla de 8,9 cm x 9,5 cm de material celulósico no tejido absorbente (Grado Producto 10201, Dexter) a una lámina rectangular de 10,9 cm x 13,7 cm de la película de poliéster recubierta con silicona Rexam usando el PSA basado en acrilato arriba descrito. El respaldo de la película se perforó en un extremo (como puede verse en la Figura 3) para facilitar la remoción de la almohadilla luego de la inoculación. El extremo de 10,9 cm del vehículo de inoculación se adhirió al extremo de 10, 9 cm de la lámina que contenía los discos con cinta con adhesivo de los dos lados (Producto 1513, 3M co . , St. Paul, MN) para formar una articulación, de forma que la almohadilla absorbente se alineó sobre los discos absorbentes enfrentando los mismos. A continuación, una lámina de 10,9 cm x 13,2 cm de película de polipropileno orientada biaxialmente (BOPP) (1,6 mi de grosor, 3M co . ) se adhirió con la cinta de adhesivo en ambos lados al borde articulado del vehículo de inoculación para hacer las veces de cubierta para el dispositivo. Véanse las Figuras 1-3, que muestran varias vistas del dispositivo completo terminado. Una vez completada la construcción, los dispositivos de análisis se sometieron a radiación gamma a un nivel de aproximadamente 10 kGy.

Tabla 1 EJEMPLO 2 Precisión del Paso de Inoculación El objetivo de este ejemplo fue el de determinar la reproducibilidad de la transferencia de una muestra líquida desde la almohadilla absorbente del vehículo de inoculación a la pluralidad de discos absorbentes de un dispositivo de análisis. Se inoculó un dispositivo como el descrito en el Ejemplo 1 con una muestra (3,5 mi) de Butterfield' s Buffer (Weber Scientific, Hamilton, NJ) como sigue. El dispositivo de ensayo se colocó en una superficie dura, plana, nivelada, con la película con los discos encima.

Se levantó la película con una mano a la vez que se colocaba con pipetas la muestra líquida en la región central de la almohadilla de inoculación. Luego de esperar alrededor de 2-5 segundos para que la almohadilla absorbiera la muestra, la película con los discos se desprendió y dejó caer en la película que contenía almohadillas. Se presionó una espátula plana, de plástico, transparente, contra la película de discos para promover la transferencia de la muestra líquida de la almohadilla a los discos. Esta transferencia de muestra se evidenció por un oscurecimiento del color de los discos. Luego de la inoculación de los discos, se quitó la almohadilla de inoculación por desgarro (en la perforación) del vehículo de inoculación desde el borde articulado, desechando luego la almohadilla. Se inocularon otros dos dispositivos de análisis de manera idéntica para dar un total de tres replicados. Inmediatamente después de la inoculación de los dispositivos de ensayo, se midió la absorbencia de luz por cada disco con un densitómetro Gretag AG Modelo D19C (Regensdorf, Suiza) . El fondo para las lecturas de absorbencia de luz era una banda de cinta eléctrica negra (SCOTCHS Super 33+, ancho 1,9 cm, 3M co . , St. Paul, MN) . También se tomaron mediciones de absorbencia de luz de los discos de cinco dispositivos de análisis inoculados a los fines de calcular una absorbencia de luz promedio para discos secos. Los resultados se presentan en la Tabla 2.

Tabla 2 Las desviaciones estándar relativamente pequeñas mostradas en la Tabla 2 respaldan la conclusión que existe una reproducibilidad relativamente alta de la transferencia de muestra líquida desde la almohadilla de inoculación absorbente a los discos absorbentes.

EJEMPLO 3 Evaporación de Agua de Discos Pequeños Durante Incubación El objetivo de este ejemplo fue el de determinar el efecto de la posición de los discos absorbentes en la evaporación de agua durante la incubación del dispositivo de análisis. Se esperaba que los discos pequeños fueran más susceptibles a la pérdida de agua durante la incubación, y por lo tanto constituyeron el objeto de este ejemplo.

Se construyeron dispositivos de análisis, cada uno de los cuales contenía 50 discos grandes y 52 discos pequeños como se describe en el Ejemplo 1, salvo que la orientación entre discos grandes a pequeños se modificó en cinco configuraciones diferentes como se muestra en la Figura 5a (Dispositivo A) , Figura 5b (Dispositivo B) , Figura 5c (Dispositivo C) , Figura 5d (Dispositivo D) , y Figura 5e (Dispositivo E) . Para cada configuración, se inocularon tres dispositivos de análisis con una muestra líquida (3,5 mi) de Butterfield' s Buffer como se describe en el Ejemplo 2. Inmediatamente después de la inoculación se tomaron las lecturas de absorbencia de luz de los discos pequeños, como se describe en el Ejemplo 2. Luego, los dispositivos de análisis se incubaron durante aproximadamente 22 horas a la temperatura ambiente (alrededor de 23°C), volviéndose a medir las lecturas de absorbencia de luz de los discos pequeños. Las diferencias entre las lecturas inicial (T=0) y final (T=22) proveyeron una indicación de la pérdida de agua de los discos pequeños por evaporación durante la incubación. Los resultados pueden verse en la Tabla 3.

Los datos de la Tabla 3 muestran que había cantidades relativamente altas de perdida de agua durante la incubación desde los discos pequeños contenidos dentro de los dispositivos de análisis A, B, C y D; sin embargo, se produjo una pérdida significativamente menor de agua dentro del dispositivo de análisis E. Los datos también indican una variabilidad mucho mayor de pérdida de agua, como lo demuestran las desviaciones estándar, con respecto a las configuraciones de análisis A, B, C, y D, en comparación con la pérdida de agua en la configuración E.

EJEMPLO 4 Detección y Enumeración de Microorganismos en una Muestra de Leche Usando el Dispositivo de Análisis con Discos Absorbentes El objetivo de este ejemplo fue utilizar un dispositivo de análisis con discos absorbentes de acuerdo con la invención a los fines de detectar y enumerar la cantidad de microorganismos en una muestra de leche, y comparar los resultados con aquellos obtenidos con una Placa estándar PETRIFILM™. Un dispositivo de análisis construido como se describe en el Ejemplo 1, excepto que contenía 50 discos grandes y 53 discos pequeños, se inoculó con una muestra (alrededor de 3 mi) de leche descremada pasteurizada como se describe en el Ejemplo 2. Como referencia, la misma muestra de leche descremada se aplicó separadamente en dos Placas. PETRIFILM™ de Recuento Aeróbico (3M Co . , St. Paul, MN) . El dispositivo de análisis y las Placas PETRIFILM™ se incubaron luego a 35°C durante 24 horas y 48 horas, respectivamente. Los dispositivos de análisis se guardaron en bolsas GLADLOCK ZIPPER™ (First Brands Corporation/ Danbury, CT) durante el período de incubación. El dispositivo de análisis se inspeccionó luego de la incubación y se encontró que 40 (de los 50) discos grandes mostraban fluorescencia bajo luz ultravioleta y 9 (de 53)' de los discos pequeños mostraban fluorescencia. La fluorescencia en cualquiera de los discos indica la presencia de microorganismos viables en ese disco. Usando la fórmula de MPN Estimado = (N/V)*In(N/(N-X) ) , donde N es la cantidad total de discos, V es el volumen total de todos los discos y X es la cantidad de discos que muestran una presencia positiva de microorganismos, se calcula un MPN de 93 unidades for adoras de colonias (cfu) /mi de los discos pequeños y un MPN de 101 cfu/ml de los discos grandes. La consistencia de estos resultados de MPN respalda la utilidad del dispositivo de análisis para la detección y enumeración de microorganismos en una muestra de alimento. Estos resultados son también consistentes con los recuentos de 88 y 98 cfu/ml obtenidos con las dos Placas PETRIFILM™ de Recuento Aeróbico.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un dispositivo de análisis para la detección o enumeración de microorganismos que comprende una almohadilla de inoculación absorbente y discos absorbentes fijados a un sustrato, caracterizado porque la almohadilla de inoculación absorbente se posiciona para liberar una porción de una muestra a los discos absorbentes . 2. El dispositivo de análisis de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque adicionalmente comprende una cubierta fijada al sustrato.
3. 3. El dispositivo de análisis de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la almohadilla de inoculación absorbente adicionalmente comprende un respaldo.
4. 4. El dispositivo de análisis de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el respaldo es separablemente montado al sustrato.
5. 5. El dispositivo de análisis de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el respaldo se fija al sustrato con una película perforada.
6. 6. El dispositivo de análisis de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los discos absorbentes comprenden dos tamaños diferentes capaces de contener diferentes volúmenes de muestra.
7. 7. El dispositivo de análisis para la detección o enumeración de microorganismos que comprende discos absorbentes unidos al sustrato, una almohadilla de inoculación absorbente unida al respaldo; y una cubierta, caracterizado porque el respaldo y cubierta se fijan de manera movible al 'sustrato.
8. 8. El dispositivo de análisis de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el respaldo y cubierta se unen al sustrato por una articulación y la almohadilla de inoculación absorbente se posiciona para liberar una poción de una muestra a los discos absorbentes.
9. 9. Un dispositivo de análisis de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el respaldo se une la almohadilla con una película perforada.
10. 10. El dispositivo de análisis de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque los discos absorbentes comprenden discos celulósicos de dos tamaños diferentes .
11. 11. El dispositivo de análisis de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque los discos absorbentes incluyen discos capaces de retener alrededor de dos microlitros de muestra y discos capaces de retener alrededor de dieciséis microlitros de muestra.
12. 12. El dispositivo de análisis de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el sustrato comprende adicionalmente un margen externo y los discos absorbentes capaces de retener alrededor de dieciséis microlitros de muestra se fijan al sustrato entre los discos capaces de retener alrededor de dos microlitros de muestra y al margen exterior.
13. 13. Un método para utilizar un dispositivo de análisis, caracterizado porque comprende las etapas de: proveerse de un dispositivo de ensayo que tiene una almohadilla de inoculación absorbente y discos absorbentes unidos a un sustrato en donde la almohadilla de inoculación absorbente se posiciona para liberar una porción de una muestra a los discos absorbentes, colocar una muestra en la almohadilla de inoculación absorbente, poner en contacto la almohadilla de inoculación absorbente con los discos absorbentes para efectuar la transferencia de la muestra desde la almohadilla de inoculación absorbente a los discos absorbentes, y retirar la almohadilla de inoculación absorbente del dispositivo de análisis.