MXPA99009030A - Un método y dispositivo para dividir muestras biológicas liquidas en microvolumenes - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para dividir una muestra líquida biológica acuosa en microvolúmenes discretos para la detección y enumeración de los microorganismos. El método involucra la distribución de microvolúmenes de una muestra a una pluralidad de zonas que retienen líquido hidrofílico de un dispositivo de cultivo, en donde cada zona que retiene líquido estácircundada por una porción de unárea"campo"hidrofóbico. También se describen dispositivos para llevar a cabo estos métodos.

Description

UN MÉTODO Y DISPOSITIVO PARA DIVIDIR MUESTRAS BIOLÓGICAS LIQUIDAS EN MICROVOLUMENES CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a métodos y dispositivos para dividir muestras biológicas en alícuotas de microvolúmenes , basados en la tendencia de los líquidos acuosos a ser retenidos dentro de las zonas idrófilas de los dispositivos mientras que son sustancialmente excluidos de las áreas hidrófobas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La detección y enumeración de microorganismos se realiza en numerosos campos, incluyendo la industria procesadora de alimentos (pruebas para determinar la contaminación de los alimentos por microorganismos tales como E . coli y S . a ureus ) , la industria de la sanidad (pruebas de muestras de pacientes y otras muestras clínicas para determinar infecciones o contaminaciones), la industria de las pruebas ambientales, la industria farmacéutica y la industria cosmética. La detección y la enumeración de microorganismos basadas en los cultivos se realiza comúnmente usando o bien medios nutritivos líquidos REF.: 31449 (análisis del número más probable (MPN) ) o medios nutritivos semisólidos (cajas de petri con agar). La enumeración usando el método MPN líquido se logra típicamente mediante la colocación de una serie de 10 diluciones de una muestra de interés en grupos de tubos de replicación que contienen medios selectivos e indicadores químicos. Los tubos son incubados a temperatura elevada (24-48 horas) realizándose luego el examen del cultivo de los organismos. Se usa una fórmula estadística, basada en el número de tubos positivos y negativos correspondiente a cada grupo, para estimar la cantidad de organismos presentes en la muestra inicial . Este método para realizar análisis del MPN tiene varias desventajas. Requiere mucho trabajo debido a los múltiples pasos de dilución y pipeteado necesarios para realizar el análisis. Además, en la práctica sólo es conveniente usar conjuntos de replicación de aproximadamente tres a cinco tubos por cada dilución. Como resultado, los limites de confianza de 95% para un cálculo del MPN de la concentración microbiana son demasiado amplios. Por ejemplo, un cálculo del MPN de tres tubos de 20 tiene limites de confianza de 95% que oscilan entre 7 y 89.

A diferencia del método descrito más arriba, se puede lograr un recuento directo de microorganismos viables en una muestra distribuyendo la muestra sobre un área definida usando medios nutritivos que contienen un agente gelificante. El agente gelificante (agar) evita la difusión de los organismos durante la incubación (24-48 horas), produciendo una colonia en el área en donde se depositó el organismo original. Existe, sin embargo, un límite para el número de colonias que pueden entrar en un área dada de medio nutritivo antes de que la fusión con las colonias cercanas haga difícil el recuento. Esto generalmente requiere la realización de varias diluciones para cada muestra. Además, las clases de moléculas de indicadores químicos que se pueden usar para identificar los tipos individuales de microorganismos presentes dentro de una población mezclada se limitan a aquellas que producen un producto que es insoluble en el medio gelificado. Además de estas desventajas, tanto el análisis del MPN usado comúnmente como los sistemas basados en gel requieren un tiempo de incubación relativamente largo antes de que se pueda detectar un resultado positivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se basa en el descubrimiento de que las muestras de líquido biológico pueden ser divididas en microvolúmenes separados con una manipulación mínima por parte del operador. El método de la división utiliza dispositivos que tienen zonas hidrófilas que retienen líquido rodeadas por áreas de "superficie" hidrófobas. Los métodos y dispositivos proveen un sistema para la detección y enumeración de microorganismos y otros materiales biológicos que resuelve los problemas asociados con los sistemas usados corrientemente. El sistema es un sistema basado en líquidos que permite la división eficiente y efectiva de la muestra en microvolúmenes separados para la prueba y permite una rápida detección y enumeración. En el caso del análisis del MPN para la detección y enumeración de microorganismos, las propuestas aquí descritas tienen en cuenta el uso de especies indicadoras solubles, en agua y reducen o eliminan la necesidad de realizar las diversas diluciones que se requieren típicamente en los análisis del MPN corrientes. En general, la invención presenta un método para dividir una muestra de liquido acuosa en microvolúmenes separados, que comprende: a) proveer un dispositivo para cultivar un microorganismo, teniendo dicho dispositivo una superficie de ensayo, comprendiendo la superficie de ensayo zonas hidrófilas que retienen líquido y un área de superficie hidrófoba entre las zonas, teniendo cada zona una capacidad de microvolumen de retención de líquido; y b) poner en contacto la muestra de líquido con la superficie de ensayo de tal modo que la muestra de líquido se divide en las zonas hidrófilas que retienen líquido. Las zonas pueden comprender un recubrimiento o deposición de un reactivo de ensayo, tal como un medio nutritivo o una sustancia indicadora. Las sustancias indicadoras apropiadas incluyen sin limitación indicadores cromógenos, indicadores fluorescentes, indicadores luminiscentes e indicadores electroquímicos. Para el propósito de esta solicitud el término "electroquímico" significa un indicador químico que cambia la resistencia o conductancia de la muestra después de reaccionar con el microorganismo. Las zonas pueden tener un tamaño uniforme, teniendo cada zona una capacidad de retención de líquido de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 25 microlitros, más preferentemente aproximadamente 1 a aproximadamente 2 microlitros. El dispositivo para cultivo puede tener, por ejemplo, de aproximadamente 10 a aproximadamente 10.000 zonas hidrófilas que retienen líquido, más preferentemente aproximadamente 400 a aproximadamente 600 zonas hidrófilas que retienen líquido. Las zonas hidrófilas que retienen líquido pueden comprender cavidades de microvolumen rodeadas por un área de superficie hidrófoba. Alternativamente, el dispositivo para cultivo puede tener un área de superficie que comprende una película nanoestructurada tratada. En formas de realización alternativas adicionales, las zonas hidrófilas que retienen líquido pueden comprender material de fibra hidrófilo que sobresale de la superficie de ensayo. El material de fibra puede estar compuesto por discos absorbentes hidrófilos o material de bucle de fibra no tejida hidrófila. En una forma de realización alternativa, el dispositivo para cultivo puede comprender numerosos grupos de zonas hidrófilas que retienen líquido, teniendo cada uno de los grupos zonas de tamaño uniforme, variando en los grupos la capacidad de retención de líquido, y teniendo el dispositivo por lo menos dos grupos de zonas. En otro aspecto, la invención presenta un dispositivo de cultivo para la detección o enumeración de microorganismos, dispositivo que comprende una superficie de ensayo, comprendiendo la superficie de ensayo zonas hidrófilas que retienen líquido y un área de superficie hidrófoba entre las zonas, teniendo cada zona una capacidad de microvolumen de retención de líquido y comprendiendo por lo menos alguna de las zonas un reactivo de ensayo . Como se usa aquí, el término "microorganismo" incluye todos los organismos vivientes microscópicos y células, incluyendo sin limitación bacterias, micoplasmas, rickettsias, espiroquetas, levaduras, mohos, protozoos, así como también formas microscópicas de células eucariotas, por ejemplo, células simples (cultivadas o derivadas directamente de un tejido u órgano) o pequeños grupos de células. Los microorganismos son detectados y/o enumerados no sólo cuando se detectan células completas directamente, sino también cuando tales células se detectan indirectamente, tal como a través de detección o cuantificación de fragmentos de células, moléculas biológicas derivadas de células o subproductos de células. Los términos "hidrófobo" e "hidrófilo" tienen aquí el significado que se les adjudica comúnmente en la técnica. Por lo tanto, un material "hidrófobo" tiene poca afinidad o no tiene afinidad por el agua o medios acuosos, mientras que un material 'hidrófilo" tiene afinidad relativamente fuerte por el agua o medios acuosos. Las hidrofobicidades e hidrofilicidades de los dispositivos aquí descritos son tales como para asegurar la división de las muestras líquidas sustancialmente en las zonas hidrófilas que retienen líquidos descritas después de la aplicación de la muestra. Los niveles requeridos de hidrofobicidad e hidrofilicidad . pueden variar dependiendo de la naturaleza de la muestra, pero pueden ser ajustados fácilmente en base a simples observaciones empíricas de la muestra de líquido cuando se aplican a los dispositivos. Otras ventajas de la invención serán evidentes de la siguiente descripción detallada y de las figuras.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una vista en perspectiva de una forma de realización de un dispositivo de ensayo. La Figura 2 ilustra una vista superior de un dispositivo de ensayo que tiene grupos de zonas hidrófilas que retienen líquidos que varían en cuanto a la capacidad de microvolumen de retención de líquido . La Figura 3 es una representación esquemática de un dispositivo de ensayo que incluye una película nanoestructurada hidrófoba. La Figura 4 es una representación esquemática de un dispositivo de ensayo en donde las zonas hidrófilas que retienen líquido están constituidas por discos de papel. La Figura 5a es una vista en perspectiva de un dispositivo de ensayo en donde las zonas hidrófilas que retienen líquido están constituidas por material de bucle de fibra no tej ida. La Figura 5b es una vista superior ampliada del dispositivo ilustrado en la Figura 5a. La Figura 6a es una fotografía de una vista superior de un dispositivo de ensayo en donde la superficie de ensayo es hidrófila. La Figura 6b es una fotografía de una vista superior de un dispositivo de ensayo con zonas hidrófilas que retienen líquidos y áreas de superficie hidrófobas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a la división de muestras biológicas en alícuotas de muestras de líquidos de microvolumen para la detección y enumeración de microorganismos en muestras de líquidos que se basan en señales. Entre los problemas hallados en la técnica con respecto a la prueba de muestras de líquidos para determinar microorganismos se encuentran: tiempos de incubación relativamente largos, la necesidad de realizar múltiples operaciones de pipeteado para las alícuotas que se ensayan, y la necesidad de un volumen relativamente grande de muestra para la prueba. La presente invención provee una solución a estos y otros problemas asociados con tales pruebas. Los métodos y los dispositivos sé proveen para dividir una muestra de líquido en compartimentos de microvolumen de un dispositivo de prueba, requiriéndose sólo una manipulación mínima de la muestra de líquido por el técnico de laboratorio u otro operador. Un "microvolumen", como se usa el término aquí, se refiere a un volumen de menos de aproximadamente 25 microlitros e incluye volúmenes en el rango de submicrolitros . Los presentes inventores han descubierto que el uso de microvolúmenes en la detección de microorganismos en muestras de líquidos basada en señales da por resultado que se requieren tiempos de incubación notablemente más cortos para producir una señal detectable. Como en este campo son muy convenientes tiempos de incubación más cortos, esta característica de la invención provee una clara ventaja. Además de alcanzar tiempos de incubación más cortos, el uso demicrovolúmenes en el ensayo de muestras de líquidos permite usar muestras de prueba sustancialmente más pequeñas. A veces se requieren muestras de prueba de volumen muy pequeño debido a que las fuentes de muestras son de volumen muy pequeño. A veces también se desean muestras de prueba de líquidos de volumen pequeño, por ejemplo, para facilitar el manipuleo o el transporte de la muestra a una instalación de prueba.

Los presentes inventores han desarrollado varios dispositivos nuevos para dividir muestras de líquidos biológicos en microvolúmenes separados dentro de zonas hidrófilas que retienen líquidos (también denominadas aquí "zonas que retienen líquidos" o "zonas"). Ejemplos no limitativos de estos dispositivos incluyen: películas microestampadas o prensadas que tienen numerosos microcompartimentos, por ejemplo, cavidades de microvolumen, que funcionan como zonas que retienen líquidos, siendo el área entre las cavidades ("área de superficie" ) hidrófoba y las cavidades hidrófilas; películas hidrófobas nanoestructuradas en donde las zonas que retienen líquidos, separadas, de la película, son hidrófilas y están adaptadas para retener microvolúmenes de una muestra de líquido para prueba; y dispositivos que tienen zonas hidrófilas que retienen líquidos y áreas de superficie hidrófobas, en donde una zona hidrófila dada es fabricada con material de fibra hidrófilo y se proyecta hacia arriba o hacia abajo a partir del plano del área de superficie circundante. Ventajosamente, los dispositivos resumidos más arriba, permiten la prueba de muestras de líquido usando alícuotas de microvolumen en un solo dispositivo, eliminando el requerimiento de recipientes separados en tales pruebas. Una muestra de prueba puede ser distribuida entre cientos o incluso miles de zonas que retienen líquidos, separadas, aumentando sustancialmente el número de puntos de datos en una prueba de la muestra de liquido . Una aplicación particularmente útil de estos métodos y dispositivos es para la detección y enumeración de microorganismos en muestras de prueba de líquidos basadas en cultivos. Tales detecciones y enumeraciones basadas en los cultivos son muy importantes para probar muestras de alimentos, ambientales, clínicas, farmacéuticas, cosméticas y otras, para determinar la contaminación por microorganismos. Los métodos y dispositivos de esta invención permiten una prueba de estas muestras eficiente, exacta, conveniente, y efectiva en relación al costo. Un uso preferido de los métodos y dispositivos de esta invención en tales pruebas microbiológicas es en el MPN. En el MPN tradicional, una muestra de interés es diluida en forma seriada (10 veces) y pipeteada en cantidades iguales en conjuntos de tubos para replicación que contienen medio de cultivo selectivo e indicadores químicos. Los tubos son incubados a temperatura elevada durante aproximadamente 24-48 horas realizándose luego el examen del crecimiento de los organismos.. Se usa una fórmula estadística, basada en el número de tubos positivos y negativos correspondientes a cada conjunto, para calcular el número de organismos presentes en la muestra inicial. Como se usa comúnmente, este método tradicional tiene varias desventajas. Requiere mucho trabajo debido a los múltiples pasos de dilución y pipeteado necesarios para realizar el análisis. Sólo es práctico usar conjuntos de replicación de aproximadamente tres a cinco tubos por cada dilución. Como resultado, los límites de confianza de 95% para un cálculo del MPN de la concentración microbiana son demasiado amplios. Por ejemplo, un cálculo del MPN de un tubo de nueve (3 diluciones de 10 veces) de 20 tiene límites de confianza de 95% que oscilan entre 7 y 89. El uso de los métodos y dispositivos de la presente invención en análisis del MPN soluciona varias de las desventajas mencionadas más arriba. La cantidad de trabajo se reduce mucho debido a que no es necesario pipetear a tubos individuales y se requiere muy poca agitación u otras manipulaciones, o no se requiere ninguna. En cambio, la muestra de líquido es distribuida en zonas que retienen líquidos en microvolúmenes poniendo en contacto simplemente la muestra de líquido con el dispositivo. Además, se requieren menos diluciones de muestras cuando se encuentran presentes en las muestras números más grandes de zonas que retienen líquidos. El número relativamente grande de zonas que retienen líquidos también provee un cálculo más exacto de la concentración microbiana. Esto se debe a que el número correspondientemente más grande de puntos de datos provee un intervalo de límites de confianza correspondientemente más estrecho. Por consiguiente, la presente invención provee uri método para detectar (incluyendo enumerar) un microorganismo en una muestra de prueba de líquidos. El método comprende distribuir microvolúmenes de la muestra de prueba en numerosas zonas hidrófilas que retienen líquidos de un dispositivo de ensayo. El dispositivo de ensayo puede ser cualquier dispositivo que incluya una superficie de ensayo con numerosas zonas hidrófilas que retienen líquidos, en donde cada zona tiene una - capacidad de retención de líquidos de microvolumen. El dispositivo incluye también un área de superficie entre las zonas que es hidrófoba y permanece sustancialmente libre de líquidos después que la muestra biológica se ha distribuido en las zonas que retienen líquidos. Ejemplos no limitativos de tales dispositivos de ensayo incluyen aquellos aquí descritos. Las zonas que retienen líquido en el dispositivo de ensayo tienen preferentemente un tamaño uniforme y cada zona tiene una capacidad de retención de líquido de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 25' microlitros de la muestra de líquido. Preferentemente, cada zona tiene una capacidad de retención de líquido de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 microlitros, y más preferentemente de aproximadamente 1 a 2 microlitros. El dispositivo de ensayo contiene preferentemente entre 1 y aproximadamente 100.000 zonas que retienen líquido, más preferentemente 10 a aproximadamente 10.000 zonas, aún más preferentemente aproximadamente 200 a aproximadamente 5.000 zonas y más preferentemente todavía aproximadamente 400 a aproximadamente 600 zonas. El uso de un dispositivo que tiene aproximadamente 400 a aproximadamente 600 zonas hidrófilas que retienen líquido es particularmente útil en el contexto de una prueba de una muestra de líquido para determinar la concentración de microorganismos usando MPN. Algunos requerimientos reglamentarios pueden prescribir que un método de prueba tiene que poder detectar un microorganismo en una muestra de uno a cinco mililitros. Ese tamaño de prueba es estándar en la industria que procesa alimentos para la prueba microbiológica . Así, por ejemplo, un dispositivo de ensayo que tiene 500 zonas hidrófilas que retienen líquido, en donde cada zona tiene una capacidad de líquido de aproximadamente 2 microlitros, sería muy útil para probar una muestra de 1 mi. Una zona de retención de líquidos que tiene una capacidad de 2 microlitros permite un rápido desarrollo de una señal detectable de acuerdo con la invención, y el uso de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 zonas provee un número suficientemente grande de puntos de datos para mejorar sustancialmente el intervalo de confianza para un cálculo del MPN. Además, es posible realizar un recuento manual de zonas que retienen líquido que dan positivas para los microorganismos. El uso de dispositivos que tienen sustancialmente más de 400 zonas que retienen líquido puede requerir, como una cuestión práctica, un recuento automatizado o asistido por instrumentos. La muestra de prueba de líquidos puede ser cualquier muestra de interés, de cualquier origen. La muestra puede ser distribuida en las numerosas zonas que retienen líquidos directamente, o la muestra puede ser diluida antes de la distribución a las zonas. La determinación con respecto a qué muestra de dilución será necesaria dependerá de diversos factores tales como por ejemplo, origen y edad, y tal determinación es una cuestión de rutina para los expertos en la técnica. La muestra de prueba de líquidos puede incluir medios de cultivo nutritivos selectivos para los microorganismos de interés y/o una sustancia indicadora que produce una señal en presencia del microorganismo que es cultivado. Opcionalmente, el medio nutritivo puede incluir un agente gelificante que ayuda a "encapsular" a los microorganismos que se cultivan. Tales agentes gelificantes son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen cualquier material que absorbe agua que se transforma en gel después de la adición de un líquido acuoso. Alternativamente, uno o ambos de los medios de cultivo nutritivos selectivos y la sustancia indicadora pueden estar presentes como un recubrimiento u otra deposición dentro de una zona de retención de líquidos, en cantidades suficientes para lograr concentraciones deseadas cuando se distribuye un microvolumen de la muestra de prueba de líquido en la zona. Tal recubrimiento puede lograrse, por ejemplo, colocando o distribuyendo una solución del medio nutritivo (con o sin agente gelificante) y/o una sustancia indicadora en la zona que retiene líquidos y secando la solución para producir un recubrimiento o deposición del medio nutritivo y/o la sustancia indicadora en la zona. Se conoce una amplia variedad de medios de cultivo selectivos para una amplia variedad de microorganismo, de interés, como también una amplia variedad de sustancias indicadoras para una amplia variedad de microorganismos y cualquiera de estos medios o sustancias indicadoras es adecuado para ser usado en el método de la invención. Una ventaja de la presente invención es que se pueden usar indicadores solubles, ya que se evita la difusión por el confinamiento del líquido de muestra biológica acuoso en las zonas hidrófilas que retienen líquidos. Se pueden emplear varios métodos para distribuir una muestra de prueba de líquido en las zonas que retienen líquidos. Se puede aplicar más de un método a un dispositivo particular, aunque el método preferido puede depender en alguna medida de la configuración de un dispositivo de ensayo particular. Por ejemplo, para dispositivos de películas que contienen cavidades de microvolúmenes hidrófilas 0 para dispositivos en donde las zonas comprenden material de fibra hidrófilo que sobresale del plano de la superficie de ensayo, la muestra puede ser vertida o pipeteada sobre el dispositivo y la muestra es distribuida en las zonas que retienen líquidos inclinando o agitando suavemente el dispositivo. Alternativamente, la superficie de ensayo del dispositivo puede ser sumergida en la muestra como se describió en el Ejemplo 4. Después de la remoción de la superficie de ensayo de la muestra de líquido, el líquido es retenido en las zonas hidrófilas que retienen líquidos y es excluido sustancialmente del área de superficie hidrófoba . Después que la muestra es distribuida en las zonas hidrófilas que retienen líquidos del dispositivo de ensayo, se pueden realizar varios ensayos dependiendo de los usos deseados. Para la detección o enumeración microbiana, el dispositivo de ensayo puede ser incubado durante un tiempo suficiente para permitir por lo menos un ciclo de división celular del microorganismo. Para tal propósito, el dispositivo se incuba generalmente entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 45°C, más preferentemente entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 37°C. El tiempo de incubación para la detección bacteriana variará. El tiempo de detección para la mayoría de las bacterias oscilará entre aproximadamente 20 minutos y aproximadamente 24 horas para producir crecimiento detectable como lo demuestra la sustancia indicadora en la muestra de prueba de liquido incubada. Este tiempo de incubación relativamente corto representa una clara ventaja sobre los métodos de detección que se usan corrientemente, que requieren típicamente tiempos de incubación de aproximadamente 24 horas o más. Después de la incubación del dispositivo de ensayo, se detecta la presencia o ausencia del microorganismo en las zonas que retienen líquidos (y por lo tanto en la muestra de prueba de líquidos) . El modo de detección depende del tipo de sustancia indicadora que se usa en el método. Se puede usar cualquier sustancia indicadora que es capaz de proveer una señal detectable. Tales indicadores incluyen, pero no están limitados a, indicadores fluorescentes, cromógenos, luminiscentes y electroquímicos. Se puede detectar la presencia o ausencia de un microorganismo en una zona visualmente a simple vista o microscópicamente, si se usa un indicador cromógeno o luminiscente. Si se usa una sustancia indicadora fluorescente, se pueden emplear equipos y métodos para detectar una señal fluorescente. Hay numerosas sustancias indicadoras y sistemas de detección de señales, incluyendo sistemas para detectar cambios electroquímicos, conocidos en la técnica para detectar microorganismos y se puede usar cualquiera de estas sustancias o sistemas de acuerdo con la presente invención. La detección de microorganismos en la muestra de líquido puede comprender además la enumeración de un recuento de microorganismos en la muestra de prueba de líquido. En una forma de realización preferida, la enumeración se realiza usando el MPN. Una vez que se determina el número de zonas que retienen líquido que contienen el microorganismo de interés, se puede realizar un cálculo del MPN usando técnicas de MPN conocidas. Si se desea, se puede determinar luego el número de microorganismos en una zona individual usando técnicas conocidas, por ejemplo, la intensidad de señal comparada con un estándar conocido, o colocando en placas el contenido de la zona. Ventajosamente, el gran número de zonas que ' retienen líquido usado en el método de la invención permite intervalos más estrechos para los limites de confianza de 95% en un análisis del MPN de una muestra de prueba de líquido . Debido al gran número de zonas que retienen líquido que se pueden preparar en un solo dispositivo, es posible usar un solo dispositivo para la detección y enumeración de múltiples microorganismos de interés, reteniéndose las ventajas de la invención. Por ejemplo, una sola muestra de prueba de líquido puede ser probada con respecto a la presencia o concentración de E . col i y S . a ureus . Una parte de un dispositivo de ensayo puede contener zonas hidrófilas que retienen líquidos para la detección y enumeración de uno de estos microorganismos, mientras que un segundo grupo de zonas puede ser orientado a la detección y enumeración de otro microorganismo de interés. Esto se logra, por ejemplo, incluyendo nutrientes y/o sustancias indicadoras específicos para los organismos en los grupos respectivos de las zonas que retienen líquidos. Alternativamente, todas las zonas que retienen líquidos pueden contener reactivos de ensayo diseñados para la detección simultánea de múltiples microorganismos. Por ejemplo, se puede detectar E . col i con una sustancia indicadora fluorescente mientras que, al mismo tiempo, se detectan otros coliformes con una sustancia indicadora cromógena. En otra forma de realización, el paso de distribución puede comprender la distribución de alícuotas de la muestra de prueba de líquido en numerosas zonas hidrófilas que retienen líquidos de un dispositivo de ensayo, en donde el dispositivo de ensayo incluye numerosos grupos de zonas. Cada grupo tiene zonas de tamaño uniforme, y el dispositivo tiene por lo menos dos grupos de zonas. Por ejemplo, el dispositivo de ensayo puede incluir numerosas bandas, teniendo las zonas hidrófilas que retienen líquidos en una banda particular la misma capacidad de retención de líquidos. Esta característica permite la distribución de la muestra de prueba de líquido en diferentes tamaños de volumen de prueba dentro de un solo dispositivo de ensayo. En el MPN, esta característica provee una ventaja significativa en cuanto a que para una muestra altamente concentrada se puede seleccionar un tamaño de volumen apropiado y se puede realizar un análisis del MPN usando un paso de distribución simple en un solo dispositivo sin la necesidad de diluciones seriadas. Como se indicó más arriba, los métodos de esta invención pueden ser llevados a la práctica usando cualquier dispositivo de ensayo que contenga zonas hidrófilas que retengan líquido y un área de superficie hidrófoba, dependiendo de la forma de realización particular que se utiliza. Los presentes inventores han desarrollado varios dispositivos nuevos adecuados para el uso en los métodos de esta invención. Los siguientes son ejemplos no limitativos de tales dispositivos. Con referencia a la Figura 1, un dispositivo 10 comprende un substrato 12 que tiene numerosas zonas hidrófilas que retienen líquido en forma de cavidades hidrófilas de microvolumen 14. El substrato 12 puede ser fabricado de cualquier material en el cual se puedan formar las cavidades de microvolumen y en donde las cavidades de microvolumen retengan sus formas respectivas durante toda la vida útil del dispositivo 10. El substrato 12 puede ser fabricado, por ejemplo, de películas polímeras u otros materiales apropiados. Los polímeros apropiados incluyen sin limitación polietileno, polipropileno, poliimidas, fluoropolímeros , policarbonatos , poliuretanos y poliestirenos . Si un polímero particular no fuera suficientemente hidrófilo, puede ser tratado para impartirle hidrofilicidad. Por ejemplo, se puede incluir un tensioactivo en la película para impartirle hidrofilicidad . Los expertos en la técnica conocerán otros medios para impartir hidrofilicidad a la superficie. Las cavidades de microvolumen 14 pueden ser formadas mediante cualquier procedimiento apropiado en el material del substrato 12. Tales procedimientos incluyen sin limitación estampado térmico, estampado por colada, perforación con láser, grabado con materiales reactivos o laminación de una hoja de material de acuerdo con un diseño que contiene numerosas aberturas pequeñas sobre una película de soporte. Las películas de polietileno o polipropileno pueden ser estampadas por compresión o estampadas por extrusión, por ejemplo, y pueden incluir varios pigmentos y tensioactivos. Con referencia nuevamente a la Figura 1, el área 13 entre las cavidades de microvolumen 14 ("área de superficie") es fabricada para ser hidrófoba. Esto sirve para evitar que el líquido acuoso se desplace entre las cavidades de microvolumen 14, evitando así una contaminación cruzada. El área de superficie 13 se puede hacer hidrófoba de diversas maneras. Por ejemplo, el área de superficie en una película de polietileno estampada por extrusión, hecha hidrófila por la incorporación de un tensioactivo, puede transformarse en hidrófoba transfiriendo una capa delgada de silicona acrilada u otro material hidrófobo al área de superficie. El dispositivo 10 puede incluir cualquier número deseado de cavidades de microvolumen. Adicionalmente, el dispositivo 10 puede incluir reservorios relativamente grandes u otros compartimentos adaptados para guardar volúmenes más grandes de líquido para mantener un nivel de humedad apropiado dentro del dispositivo. Aunque el número de cavidades de microvolumen puede ser relativamente pequeño (por ejemplo, 2-50) para algunas aplicaciones tales como el rastreo preliminar, los pequeños tamaños de las cavidades de microvolumen permiten que se forme una cantidad relativamente grande de cavidades en un solo dispositivo 10. Preferentemente, el dispositivo tiene aproximadamente 10 a aproximadamente 10.000 zonas que retienen líquido, aún más preferentemente aproximadamente 200 a aproximadamente 5.000 zonas y más preferentemente todavía aproximadamente 400 a aproximadamente 600 zonas. El dispositivo 10 puede tener una cantidad de cavidades de microvolumen 14 de tamaño uniforme, aunque las cavidades no necesitan tener un tamaño uniforme. Por ejemplo, un dispositivo 16 como el que se ilustra en la Figura 2 puede tener grupos (por ejemplo, filas) de cavidades de microvolumen en las cuales los volúmenes son constantes dentro de un grupo, pero varían entre los distintos grupos. Como se ilustra en la Figura 2, los volúmenes pueden variar en forma creciente en un conjunto de grupos de cavidades, teniendo las cavidades más pequeñas 18 volúmenes en submicrolitros y las cavidades más grandes 20 volúmenes en microlitros. Es imposible incluso que las cavidades más grandes de un dispositivo tal como el ilustrado en la Figura 2 incluyan cavidades 22 que no se clasificarían como cavidades de "microvolumen" . Tales cavidades pueden tener una capacidad de retención de líquido, por ejemplo, de sustancialmente más de 25 microlitros.

En una forma de realización alternativa, el substrato 12 puede ser recubierto con una película nanoestructurada hidrófoba. Por ejemplo, tejidos de poliimida o fluoropolímero pueden ser recubiertos por vapor con pigmentos orgánicos, plomo, oro y otros materiales para crear películas nanoestructuradas específicas, que se tornan hidrófobas luego por recubrimiento con un conjunto molecular organizado, tal como octadecilmercaptano o un tiol fluorocarburo-hidrocarburo, como se describe en la solicitud de patente WO 96/34697. Las cavidades de microvolumen relativamente hidrófilas y otras zonas que retienen líquido pueden ser formadas retirando los elementos nanoestructurados hidrófobos de áreas seleccionadas del substrato 12. Esto puede lograrse de diversas maneras, incluyendo sin limitación encapsulación/deslaminación y ablación por láser como se describe en el Ejemplo 3, más abajo. Un dispositivo de película nanoestructurada hidrófoba 24 representativo es ilustrado esquemáticamente en la Figura 3. Tales dispositivos pueden ser cargados con muestras simplemente introduciéndolos en una solución de muestra acuosa. Para tal fin, el dispositivo 24 puede incluir una manija 26. La manija 26 permite que un operador coloque el dispositivo 24 en una muestra de líquido a cualquier profundidad deseada e incluyendo la inmersión total del dispositivo 24 en la muestra de líquido, evitando al mismo tiempo el contacto de los dedos del operador con la muestra. Después de retirar el dispositivo 24 de la muestra, la muestra de líquido permanece adherida al dispositivo sólo en los lugares de las zonas hidrófilas que retienen líquido 28. Luego se realizan la incubación y la detección como se describe más arriba . Los dispositivos de ensayo también pueden ser fabricados con zonas hidrófilas que retienen líquido construidas de materiales absorbentes hidrófilos ordenados en una superficie hidrófoba. Por ejemplo, las zonas pueden ser construidas de papeles absorbentes que tienen forma circular, ovalada, cuadrada, poligonal u otras formas apropiadas. Como se ilustra en la Figura 4, por ejemplo, se pueden laminar discos de papel de linteres de algodón sin ligante 30 en forma de una película recubierta de silicona 32 para formar áreas hidrófilas que retienen líquido 34 que sobresalen del plano de la superficie hidrófoba 36 circundante. Alternativamente, las zonas hidrófilas que retienen líquido pueden ser construidas de material de bucle de fibra no tejida que sobresale (se proyecta) igualmente a partir del plano del área de superficie hidrófoba circundante. Por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 5a y 5b, el dispositivo de ensayo 38 puede comprender una hoja de película de polipropileno hidrófoba 40 que contiene conjuntos de salientes 42 fabricadas de material de bucle de fibra no tejida de polipropileno que contiene t nsioactivo . Los reactivos del ensayo pueden ser aplicados en forma de capa o depositados de otra manera dentro de las zonas que retienen líquido de los dispositivos de ensayo. Tales reactivos de ensayo pueden incluir sin limitación nutrientes para el crecimiento de microorganismos; agentes gelificantes; sustancias indicadoras tales como indicadores cromógenos, indicadores fluorescentes, indicadores luminiscentes e indicadores electroquímicos. Los reactivos de ensayo pueden ser inmovilizados en las zonas que retienen líquido mediante cualquiera de los numerosos métodos para inmovilizar reactivos de ensayo sobre substratos sólidos conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos incluyen, por ejemplo, secar líquidos que contienen reactivos de ensayo en las zonas, así como también otros métodos para unir en forma no covalente biomoléculas y otros reactivos de ensayo a un substrato sólido. Alternativamente, se pueden emplear diversos métodos para unir en forma covalente reactivos de ensayo al material del substrato 12 dentro de las cavidades 14 por medio de métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Como se mencionó mas arriba, la presencia de zonas hidrófilas que retienen líquido con capacidad de retención de líquido de microvolumen en un dispositivo de ensayo permite la separación de una muestra de prueba de líquido en un número relativamente grande de volúmenes de prueba. La capacidad de separar una muestra de líquido en alícuotas de microvolumen y realizar el MPN u otros ensayos sin contaminación cruzada entre alícuotas es una ventaja del método y de los dispositivos presentes. Todas las referencias y publicaciones aquí mencionadas se incorporan expresamente como referencia a esta presentación. Las formas de realización particulares de esta invención serán discutidas en detalle y se ha hecho referencia a posibles variaciones dentro del alcance de esta invención. Existen diversos procedimientos y técnicas alternativos a disposición del experto en la técnica que permitirán similarmente llevar a cabo en forma exitosa la presente invención.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ayudar a comprender la presente invención y no deben interpretarse como limitativos del alcance de la misma. A menos que se indique otra cosa, todas las partes y porcentajes son en peso.

Ejemplo 1 Dispositivos para cultivo de película estampada Los dispositivos para cultivo de película estampada que contienen numerosos microcompartimentos y que pueden ser usados para la detección de microorganismos en una muestra de prueba de líquido fueron construidos como se describe en este ejemplo. Las zonas hidrófilas que retienen líquido pueden ser formadas en un substrato por diversos procedimientos, ejemplos de los cuales son estampado térmico, estampado por colada, perforación con láser y grabado de la superficie con material reactivo. Descripciones detalladas de cómo hacer recesos o cavidades de microvolumen en películas polímeras se proveen en las patentes estadounidenses 5.192.548; 5.219.462; 5.344.681; y 5.437.754. Las siguientes descripciones son representativas de dispositivos para cultivo de películas estampadas específicos usados en los ejemplos subsiguientes.

A. Películas estampadas por compresión que contienen numerosas cavidades de microvolumen Se extruyó por fusión polietileno (Eastman Chemical Company Resin #18BOA) conteniendo 10% en peso de Ti02 (50% TiO2/50% de concentrado de pigmento de polietileno) y 0.5% en peso de tensioactivo Tritón X-35 (Sigma Chemical Company) o polipropileno, como una película (espesor 4 mil). La película se cortó en hojas y se apilaron las mismas (-20 hojas) sobre una matriz de aleación de magnesio grabada en forma fotolitográfica, como se describe en la patente estadounidense 5.219.462, diseñada para formar numerosas cavidades de microvolumen. La matriz de magnesio grabada contenía salientes ubicadas de acuerdo con los modelos descritos en los ejemplos subsiguientes Las hojas de polietíleno apiladas fueron estampadas en una prensa hidráulica calentada (132°C, 1.4 N/m2, permanencia 120 segundos) como se describió en la patente estadounidense 5.219.462. Las muestras se dejaron enfriar, momento en el cual se retiró la matriz para proveer una película de una sola capa que contenía la imagen "negativa" de la matriz.

B. Películas estampadas por extrusión que contienen numerosas cavidades de microvolumen Una matriz maestra de magnesio grabada en forma fotolitográfica fue unida a un cilindro de acero usando adhesivo de transferencia sensible a la presión. La composición de polietileno, pigmento y tensioactivo descrita en el Ejemplo 1A fue mezclada y colada por extrusión sobre el rodillo como se describió en la patente estadounidense 5.192.548. También se prepararon de esta manera películas estampadas que no tenían el tensioactivo Tritón X-35.

C. Películas estampadas por extrusión con áreas de superficie "hidrófobas" Se prepararon películas de polietileno estampadas por extrusión que contenían tensioactivo Tritón X-35 de acuerdo con el Ejemplo IB. El área entre las cavidades de microvolumen (área de "superficie") se hizo hidrófoba transfiriendo una capa delgada de silicona acrilada (Goldschmdt FC 711) que contenía 4.8% de un agente de entrecruzamiento (Darocur 1173) con un aparato de recubrimiento cilindro a cilindro (Straub Design Co.). El recubrimiento hidrófobo fue curado exponiendo la película a radiación ultravioleta bajo atmósfera de nitrógeno usando una lámpara UV de Fusión Systems con un bulbo H que proporcionaba una dosis de 85 milij oules/cm2.

Ejemplo 2 Método de inoculación (Método que utiliza numerosas cavidades de microvolumen) A. Inoculación con solución indicadora Una solución acuosa que contenía el indicador rojo fenol (para proveer contraste) fue aplicada por medio de una pipeta sobre películas estampadas de polietileno tratadas con silicona y no tratadas con silicona (Ejemplos 1C y IB, respectivamente) que contenían numerosas cavidades de microvolumen (aproximadamente 1,3 µl/cavidad) . Las cavidades de microvolumen fueron ubicadas en un ordenamiento hexagonal (~19 cavidades/cm2 ) y cada cavidad tenía la forma de un cono truncado invertido, con un diámetro de aproximadamente 1.9 mm en la superficie y 1.0 mm en la parte inferior siendo la profundidad de aproximadamente 1.1 mm. Las cavidades de microvolumen fueron llenadas como se describió en la patente estadounidense 5.219.462 extendiendo la solución de muestra diluida sobre la película con el filo de una navaja. Las muestras tratadas con el recubrimiento de silicona hidrófobo mostraron que el líquido se distribuía en las cavidades de microvolumen individuales sin que hubiera un pasaje entre las cavidades, mientras que en las películas no tratadas se observó un pasaje de líquido.

B. Inoculación con muestras que contienen microorganismos Se demostró en este ejemplo el método de inocular dispositivos para cultivo de película estampada que contienen numerosas cavidades de microvolumen con medio que contiene bacterias. Los dispositivos inoculados fueron utilizados para detectar y enumerar las bacterias E . coli .

Un caldo de cultivo de E . col i ATCC 51813 de una noche (~109 CFU/ml en medio de caldo de soja tríptico (TSB)) fue diluido en forma seriada en medio de bilis rojo violeta (VRB) (7.0 g/l de Bacto peptona, 3.0 g/l de extracto de levadura, y 1.5 g/l de sales biliares) que contenía 4-metilumbeliferil-ß-D-glucurónido (0.5 mg/ml (MUG, Biosynth International, Naperville, IL) La dilución fue preparada a la concentración bacteriana aproximada de 100 CFU/ml. La muestra diluida (0.5 mi) fue aplicada mediante una pipeta sobre las películas estampadas de polietileno tratadas con silicona y no tratadas con silicona (406 cavidades de microvolumen) como se describió en el Ejemplo 2A. Las películas estampadas 43 inoculadas fueron colocadas dentro de cajas de petri e incubadas durante 12 horas a 37°C. Veintiocho cavidades de microvolumen 44 presentaron manchas fluorescentes separadas, fuertes, sobre la película tratada con silicona 46 (Figura 6b). Por el contrario, se observó una contaminación cruzada entre las cavidades en la película no tratada (Figura 6a). Para la película tratada con silicona, 28 cavidades positivas corresponden a un número más probable (MPN) de 58 CFU/ml, según se calculó usando la fórmula MPN = N ln (N/N-X) en donde N es el número total de cavidades llenadas y X es el número total de cavidades que muestran una reacción positiva. Los resultados de este ejemplo muestran que los microorganismos pueden ser detectados y enumerados rápidamente usando un dispositivo para cultivo de película estampada con numerosas cavidades de microvolumen y que se puede eliminar la contaminación cruzada entre las cavidades recubriendo el área de superficie entre las cavidades con una sustancia hidrófoba.

Ejemplo 3 Dispositivo para cultivo de película nanoestructurada Se construyeron dispositivos para cultivo de película nanoestructurada conteniendo numerosas zonas hidrófilas de microvolumen que retienen líquido ordenadas en un substrato recubierto con una película nanoestructurada hidrófoba como se describe en este ejemplo.

A. Película nanoestructurada Procedimientos para generar superficies nanoestructuradas se revelan en las patentes estadounidenses 4.812.352 y 5.039.561. Brevemente, el pigmento orgánico C.I. pigmento 149 rojo (American Hoechst-Celanese, Somerset, N.J.) fue depositado por vapor al vacío con un espesor de 250 nm sobre una capa de tejido de poliimida de 30 x 30 cm, de 0.0125 nm de espesor, que había sido recubierta previamente con metal por vapor con 700 Á de platino. La muestra fue recocida en un horno de vacío a 264°C durante más de 30 minutos, que fueron suficientes para convertir el pigmento PR 149 en una densa distribución de hilos cristalinos separados orientados en forma perpendicular al tejido substrato. Los hilos fueron recubiertos por vapor con una masa de espesor equivalente de 2500 Á de oro, lo que dio por resultado un recubrimiento de conformación de partículas de oro, ~2 µm de alto y ~0.15 µm de diámetro con una densidad de número areal de 5 por (µm)2, como se determinó por SEM. Alternativamente, la poliimida fue reemplazada por un poliéster de fluorenona transparente (FPE, 3M Co . ) y recubierta por vapor con 50 Á de oro, lo que evitó la carga de la superficie durante la deposición del PR 149, permaneciendo esencialmente transparente.

B. Película nanoestructurada hidrófoba La película nanoestructurada fue hecha hidrófoba sumergiéndola en una solución 0.1 mM de C8F?7 (CH2) íiSH en etanol durante 4 horas, seguido por enjuague con etanol puro y secado al aire. La superficie altamente hidrófoba resultante fue medida para tener ángulos de contacto de avance y retroceso idénticos de 178° para el agua. Este procedimiento se describe en la solicitud de patente WO 96/34697.

C. Dispositivos para cultivo de película nanoestructurada Se construyeron dispositivos para cultivo de película nanoestructurada usando un procedimiento de encapsulación/deslaminación de películas nanoestructuradas descrito en la patente estadounidense 5.336.558. Brevemente, piezas de la película hidrófoba nanoestructurada fueron cortadas en bandas de 1.5 x 2.0 cm. Una hoja de acero perforada de 0.25 mm de espesor, con un ordenamiento cuadrado de agujeros de 1.5 mm de diámetro separados por ~4 mm, fue colocada sobre el lado nanoestructurado de las bandas. Un encapsulado de vinilpolisiloxano de curado rápido (3M EXPRESS material de impresión dental, 3M Co . ) fue aplicado generosamente sobre la placa de acero para hacer que el material penetrara a través de los agujeros y encapsulara los hilos nanoestructurados . Después de varios minutos, el material de impresión se endureció y la hoja de acero se retiró, quitando así los elementos nanoestructurados limpiamente del tejido de poliimida sólo en el sitio de la serie de agujeros. El substrato de poliimida recubierto con metal expuesto era relativamente hidrófilo en las áreas bajo los agujeros en comparación con el resto de la superficie. Esto se demostró sumergiendo las bandas en una solución acuosa y controlando que las gotas pequeñas permanecieran unidas sólo en la serie de áreas de manchas o zonas expuestas. Alternativamente y preferentemente, se utilizó ablación por láser para retirar los elementos nanoestructurados del tejido de poliimida para proveer la serie deseada de zonas relativamente hidrófilas que retienen líquido. Las bandas de película hidrófoba nanoestructurada fueron cortadas mediante un láser Nd-YAG con un rayo colimado de 1 mm de diámetro y operado en un modo Q conmutado con aproximadamente 2 mJoule, pulsos de 60 nanosegundos . Se usaron pulsos simples para cortar filas de zonas de 1 mm de diámetro con separaciones de 4 y 5 mm entre los centros. Zonas más grandes, de ~1.6 x 1.6 mm cuadrados, fueron producidas superponiendo una matriz de 3 x 3 de nueve zonas de 1 mm de diámetro. El dispositivo para cultivo de película nanoestructurada resultante con 40 (4 x 10) zonas fue sumergido en agua durante 1 minuto inicialmente para hacer que las áreas de la zona cortada se tornaran hidrófilas. Después de retirar la placa, cada una de las 40 zonas tenía una gota hemisférica, de ~1 mm de diámetro, unida a la misma.

Ejemplo 4 Método de inoculación (Método gue utiliza dispositivos para cultivo de película nanoestructurada) A. Inoculación con muestra de líquido acuoso Para inocular y medir la cantidad de líquido captada selectivamente por los dispositivos para cultivo de película nanoestructurada (Ejemplo 3C), se sumergió en agua pura una placa con 12 zonas hidrófilas que retienen líquido, que tienen un tamaño que oscila entre 1 y 2.5 mm de diámetro (promedio 2 mm) , y se midió gravimétricamente la cantidad de agua extraída en las zonas. La placa se sumergió primero a una velocidad de remoción lenta de ~3 segundos/cm. Después de la remoción, se tocó la parte posterior de la placa con papel tisú para quitar las gotas de agua que colgaban de la parte posterior de la placa de poliimida, y la placa se colocó luego en una balanza de masas (0.1 mg de sensibilidad mínima) y se registró la masa 15 segundos después. Esto se repitió 15 veces. La desviación promedio y estándar de la masa de las 12 zonas de agua fue de 3.7 ± 0.2 mg, dando un volumen de zona promedio de 0.310 µl ± 5%. El procedimiento se repitió luego a una velocidad de remoción rápida sacando la placa del agua en un tiempo estimado en ~0.1 segundo. A esta velocidad la cantidad de líquido que permaneció en las zonas hidrófilas fue mayor porque el líquido no tuvo tiempo de "estirarse" y equilibrarse dinámicamente. La desviación promedio y estándar de las 15 pruebas fue de 6.0 ± 0.5 mg, dando un volumen de zona promedio de 0.500 µl ± 12%.

B. Inoculación con muestras que contienen S . a ureus Se demostró en este ejemplo el método de inoculación de dispositivos para cultivo de película nanoestructurada que presentan numerosas zonas de microvolumen que retienen líquido con medio que contiene bacterias. Los dispositivos inoculados fueron utilizados para detectar y enumerar bacterias S. a ureus (Ejemplo 4B) y E . col i (Ejemplo 4C) . Se aplicó una mezcla (5 µl) de medio de cultivo bacteriológico fundido (~60°C) BHI (infusión de cerebro y corazón, Becton Dickinson and Co.) y agar (1.2% peso/volumen) en forma de manchas sobre las zonas hidrófilas de los dispositivos para cultivo de película nanoestructurada preparados como se describe en el Ejemplo 3C. Las "manchas" de agar se dejaron enfriar y solidificar a temperatura ambiente. Se sumergió brevemente una placa en un cultivo de Staphyl ococcus a ureus (~108 células/ml) en medio de cultivo BHI . Se sumergieron otras placas en forma similar en diluciones 1:10 y 1:1000 del cultivo de S . a ureus , representando 10' y 105 células/ml, respectivamente. Las placas fueron colocadas en cajas de petri de plástico que contenían papel de filtro saturado con agua para mantener la humedad, e incubadas a 37°C durante 4 horas. Luego se sumergieron las placas en una solución que contenía 900 µl de tampón HEPES (Sigma Chemical Co . , pH 8.0); 120 µl de solución indicadora fluorescente (1.0 mg/ml de Boc-Val-Pro-Arg-AMC HCl (NovaBiochem, San Diego, CA) en 72 mM de trietanolamina, 144 mM de NaCl, pH 8.4); y 30 µl de protrombina humana (Sigma Chemical Co . , 50 mg/ml en 5 M de tampón Tris, 50 mM de NaCl, pH 8.0). Las placas fueron incubadas durante una hora adicional bajo las mismas condiciones descritas más arriba y luego examinadas bajo luz UV (-366 nm, Mineralite, UVP, Inc., San Gabriel, CA) . Las zonas que contenían medio de agar, suspensión bacteriana y solución indicadora mostraron todas fluorescencia azul intensas visible, en comparación con falta de fluorescencia en las muestras control, que fueron preparadas sin bacterias. No se observó contaminación cruzada entre zonas .

C. Inoculación con muestras que contienen E . col i Se preparó medio con agar combinando los siguientes ingredientes: digesto pancreático de gelatina (10 g, Peptona G, Acumedia Manufacturers, Inc., Baltimore, MD) ; Sales biliares Bacto Número 3 (2.5 g, Difco Labs, Detroit, MI); agar (6 g, Difco Labs); y agua desionizada (500 mi). La mezcla se agitó y se calentó a 100°C hasta que el agar se fundió, se colocó en autoclave a 121°C durante 15 minutos para esterilizar y luego se enfrió a temperatura ambiente para solidificar. Se preparó una solución stock IPTG a partir de isopropil-ß-D-galactósido (0.2 mm) esterilizado por filtro (IPTG, CalBiochem Corp., La Jolla, CA) en agua desionizada (200 mg/ml) y se almacenó a -20°C hasta que se usó. Se preparó una solución stock de MU-Gal a partir de 4-metilumbeliferil-ß-D-galactósido (MU-Gal) en N, N-dimetilformamida (10 mg/ml) y se almacenó a 4°C hasta que se usó. Inmediatamente antes de usar se fundió el medio de agar a 100°C y se transfirieron 25 mi a un tubo de 50 mi estéril. La solución stock IPTG (12.5 mi) y la solución stock de MU-Gal (150 mi) fueron mezcladas luego en la suspensión de agar enfriada (~60°C). La mezcla fue transferida inmediatamente (alícuotas de 4 µl) a las zonas del dispositivo para cultivo de película nanoestructurada como se describió en el Ejemplo 4B. Después de enfriar a temperatura ambiente, las placas fueron sumergidas en un cultivo exponencial medio de E . coli ATCC 51813 (-109 células/ml en medio LB 3) e incubadas en cajas de petri humedecidos individuales a 37°C. Después de 4 horas de incubación las placas fueron controladas para determinar la fluorescencia con una lámpara de UV Mineralite. Las zonas inoculadas presentaron ligeramente más fluorescencia que la observada en las zonas no inoculadas. Las placas fueron incubadas luego durante 16 horas adicionales y controladas nuevamente. Las zonas inoculadas mostraron fluorescencia significativamente más azul que las zonas no inoculadas. La placa preparada con substrato de película transparente (Ejemplo 3A utilizando FPE) era particularmente conveniente para medir debido a que podía ser iluminada desde un lado y vista o fotografiada del otro lado. No se observó contaminación cruzada entre zonas .

Ejemplo 5 Dispositivos para cultivo de disco absorbente Se construyeron dispositivos para cultivo de disco absorbente que contienen numerosos discos absorbentes hidrófilos ordenados en una superficie hidrófoba y que pueden ser usados para la detección y enumeración de microorganismos en una muestra de prueba de líquido como se describió en este ejemplo. Una hoja de material absorbente (Papel Scheicher & Schuell Grado 903; absorción aproximadamente 4.5 g de agua/100 cm2) fue laminada a una película recubierta con silicona Rexam (Grado #15819 D 2MIL CL PET MM34P/000 que tiene una película de poliéster de 2 mil de espesor como substrato, Rexame Reléase, Oak Brook, IL) con un adhesivo sensible a la presión de acrilato (PSA) que contiene el indicador cromógeno cloruro de 2, 3, 5-trifenil-2H-tetrazolio (TTC) (Amresco, Solón, OH) . El material fue saturado con nutrientes de cultivo TSB que contienen 0.5% de los indicadores fluorescentes fosfato de 4-metilumbeliferilo (100 µg/ml, Sigma, St. Louis, MO) y 4-metilumbeliferil-a-D-glucósido (50 µg/ml, Sigma) , limpiado con una varilla envuelta en alambre y secado a 110°C durante 10 minutos. Discos circulares de aproximadamente 0.635 cm de diámetro fueron punzonados del laminado y se retiró la capa posterior de la película recubierta con silicona. Los discos con PSA fueron adheridos luego a otra hoja de película recubierta con silicona Rexam de modo que los discos fueron distribuidos en filas paralelas separadas por distancias iguales. El conjunto de película y discos fue irradiado con rayos gamma a un nivel de 8.9 kGy, cortados al tamaño adecuado y luego colocados en una caja de petri de tal modo que cada caja contenía una pieza de película con 20 discos. Basado en mediciones gravimétricas, cada disco de los dispositivos de cultivo resultantes tenía una capacidad de retener aproximadamente 40 µl de líquido.

Ejemplo 6 Método de inoculación (Método gue utiliza dispositivos para cultivo de discos absorbentes) El método de inocular dispositivos para cultivo de discos absorbentes conteniendo numerosas zonas de microvolumen que retienen líquido (discos absorbentes) con medios que contienen bacterias fue demostrado en este ejemplo. Los dispositivos inoculados fueron utilizados para detectar y enumerar bacterias E . col i . Se diluyó un cultivo de E . col i ATCC 51813 para producir suspensiones que contenían aproximadamente 10 CFU/ml y 1 CFU/ml. Se aplicaron muestras (1 a 2 mi) de las suspensiones por medio de una pipeta a los dispositivos para cultivo de discos absorbentes descritos en el Ejemplo 5. El exceso de la muestra de líquido fue retirado, dejando así aproximadamente 0.8 mi retenidos en el dispositivo (20 discos, aproximadamente 40 µl de líquido por disco) . Los dispositivos inoculados fueron incubados a 35°C durante 23 horas e inspeccionados bajo luz ultravioleta. El número de discos que presentaban fluorescencia fue contado para cada dispositivo y se calcularon los valores del número más probable (MPN) usando la fórmula descrita en el Ejemplo 2B. El MPN por mililitro fue calculado dividiendo el valor obtenido por el volumen total de la muestra (0.8 mi). Los resultados se presentan en la Tabla 6a y se comparan con recuentos obtenidos de las pruebas estándar con placas de recuento de coliformes PETRIFILMMR ( 3M Co.). Los discos fluorescentes mostraron frecuentemente el color TTC rojo, generalmente como manchas separadas dentro de los discos. No se observó contaminación cruzada entre los discos absorbentes.

Los resultados de este ejemplo muestran que los dispositivos para cultivo de discos absorbentes que tienen numerosos discos absorbentes ordenados en una película hidrófoba pueden ser inoculados fácilmente con muestras de líquido que contienen bacterias y que los dispositivos inoculados pueden ser utilizados para la detección y enumeración de E . col i , siendo los valores obtenidos comparables a los obtenidos con las placas para recuento de celiformes PETRIFILMMR comerciales.

Ejemplo 7 Método de inoculación (Método gue utiliza dispositivos para cultivo de fibra hidrófila) El método de construcción e inoculación de dispositivos para cultivo de fibra hidrófila que contienen numerosas zonas de microvolumen que retienen líquido (bucles de fibra no tejida) con solución indicadora y con medio que contiene bacterias fue demostrado en este ejemplo. Los dispositivos inoculados fueron utilizados para detectar y enumerar bacterias E . col i .

A. Construcción de dispositivos Se preparó una hoja de película de polipropileno hidrófoba conteniendo un conjunto de salientes de bucles de fibra no tejida de polipropileno que contenía tensioactivo, relativamente hidrófila, como se describió en la patente estadounidense 5.256.231. La hoja fue cortada al tamaño adecuado y colocada en el fondo de una caja de petri para formar un dispositivo para cultivo. Cada dispositivo contenía película que tenía aproximadamente 200 salientes de bucles de fibra distribuidas hexagonalmente en filas paralelas separadas por distancias iguales. Cada saliente hemisférica era hexagonal en su base (longitud del lado aproximadamente 3 mm, altura aproximadamente 2 mm) y tenía una capacidad para retener aproximadamente 15 µl de líquido.

B. Inoculación con solución indicadora Se aplicó una muestra (1 mi) de tampón fosfato (" Butterfield" , Fisher Scientific) que contenía indicador rojo fenol (para proveer contraste) por medio de una pipeta sobre la película en el centro del dispositivo. Se observó que el líquido corría por las salientes de bucle de fibra hidrófila radialmente desde el punto de inoculación. Se observó que el líquido se distribuía rápidamente en las salientes de bucle mientras que "drenaba" de las áreas de superficie de polipropileno hidrófobas. Se llenaron aproximadamente 65 de las 200 salientes. No se observó un pasaje del líquido coloreado a través de las áreas de superficie entre las salientes de bucle.

C. Inoculación con una muestra que contiene microorganismos Un cultivo de una noche de E . coli (ATCC 51813, -10" CFU/ml en medio TSB) fue diluido seriadamente en medio VRB (7.0 g/l de Bacto peptona, 3.0 g/l de extracto de levadura, 1.5 g/l de sales biliares) que contenía 4-metilumbeliferona-ß-D-glucurónido (0.5 mg/ml). Se preparó una dilución de 10"8 correspondiente a una concentración bacteriana de aproximadamente 10 CFU/ml. Se pipeteó una muestra (1 mi) sobre la película en el centro de un dispositivo para cultivo de fibra hidrófila (Ejemplo 7A) como se describió en el Ejemplo 7B. Después de la inoculación, se cubrió la caja de petri y se selló usando cinta aislante para evitar la evaporación. Luego se invirtió el dispositivo y se incubó a 37°C durante 19 horas. Después de la incubación, se contó el número de salientes que presentaban fluorescencia bajo una irradiación de 365 nm. Se observó que cinco salientes separadas tenían fluorescencia significativa. No se observó fluorescencia entre las salientes, indicando que no había contaminación cruzada. Se calculó que el valor MPN era de 5 CFU/ml, usando la fórmula descrita en el Ejemplo 2B. Los resultados de este ejemplo muestran que los dispositivos para cultivo de fibra hidrófila que tienen numerosas zonas de fibra hidrófila ordenadas en una película hidrófoba pueden ser inoculados fácilmente con muestras de líquido que contienen bacterias y que los dispositivos inoculados pueden ser utilizados para la detección y enumeración de E . coli . Varias modificaciones y alteraciones de esta invención serán evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance y el espíritu de esta invención, y debería entenderse que esta invención no está limitada a las formas de realización ilustrativas aquí presentadas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante, para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método para conducir un mayor número probable de análisis, en donde una muestra de líquido acuoso es dividida en volúmenes discretos, caracterizado porque, el método comprende: a) proveer un dispositivo para cultivar un microorganismo, teniendo dicho dispositivo una superficie de ensayo, comprendiendo dicha superficie de ensayo zonas hidrofílicas que retienen líquido y un área de superficie hidrófoba entre dichas zonas, b) poner en contacto dicha muestra de líquido con dicha superficie de ensayo de tal modo que dicha muestra de líquido se divide en dichas zonas hidrófilas que retienen líquido. c) la incubación de dicho dispositivo; d) la detección de una señal que indica los microorganismos que se hacen crecer en la zona; y e) la conducción de un mayor análisis probable basado en el número de zonas en donde se detecta una señal.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dichas zonas comprenden un recubrimiento o deposición de reactivo de ensayo.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque dicho reactivo de ensayo comprende un medio nutritivo.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque dicho reactivo de ensayo comprende al menos una sustancia indicadora seleccionada entre el grupo compuesto por un indicador cromógeno, un indicador fluorescente, un indicador luminiscente y un indicador electroquímico .

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho dispositivo para cultivo comprende aproximadamente 400 a aproximadamente 600 zonas hidrófilas que retienen líquido.

6. Un dispositivo de cultivo para usar en la puesta en práctica del método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho dispositivo comprende una superficie de ensayo, dicha superficie de ensayo comprende zonas hidrófilas que retienen líquido y un área de superficie hidrófoba entre dichas zonas, comprendiendo por lo menos algunas de dichas zonas un reactivo de ensayo, en donde dicho reactivo de ensayo comprende un medio nutritivo y dicho reactivo de ensayo está presente como un revestimiento en dichas zonas que retienen líquido hidrófilas.

7. El dispositivo de cultivo de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque dicho dispositivo tiene aproximadamente 10 a aproximadamente 10.000 zonas.

8. El dispositivo de cultivo de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque cada una de dichas zonas tiene una capacidad de retención de líquido de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 25 microlitros.

9. El dispositivo de cultivo de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque dicho reactivo de ensayo comprende una sustancia indicadora.