JP6555815B2 - 殺菌試験方法及び装置 - Google Patents

Description

本発明は殺菌試験方法及び装置に関し，とくに殺菌剤で燻蒸する施設内の殺菌効果を評価する試験方法及び装置に関する。

衛生環境の維持が重要とされる病院，調剤薬局，医薬品製造工場，食品製造工場，実験動物等を用いる研究所等の建造物において，微生物濃度が管理されたクリーンルーム等の施設を設けることがある。このような施設は微生物による汚染が生じにくいように設計されているが，新規立ち上げ時，実験終了時，定期的な清掃時等に施設内を完全に殺菌することが求められ，例えばホルマリンガス（ホルムアルデヒドガス）等の殺菌剤を施設内に充満させて所要時間放置する燻蒸殺菌が実施されている（特許文献１参照）。ホルマリンガスは，一般細菌だけでなく，ウィルス，芽胞を作る微生物等をも死滅させる殺菌力を有しており，しかも細かな隙間や天井裏等にも進入して施設内の隅々まで殺菌できる利点を有している。

燻蒸殺菌では，例えば施設の外部に連通する開口を目張りしたうえで施設内に殺菌剤をガス状又はミスト（霧）状に導入して充満させ，施設内全体の微生物濃度が十分に低下する時間だけ放置する。燻蒸時間は施設内の隅々まで殺菌できるように設定するが（例えば２４時間以上），必要に応じて所定菌数（例えば１０^３〜１０^８）の微生物の芽胞を保持させた基材（例えば濾紙等）と培地入りアンプルとを組み合わせたバイオインジケータ（ＢＩ）を用いて殺菌効果を確認することができる（非特許文献１参照）。すなわち，燻蒸前の施設内の殺菌剤が最も到達しにくい箇所にバイオインジケータを載置しておき，燻蒸後にバイオインジケータの基材を培地入りアンプルに浸漬して培養する。施設内の殺菌が完全であれば微生物が増殖しないのでバイオインジケータの培地の色調に変化はないが，殺菌が不完全であると微生物が増殖して培地の色調が変化するので，この色調の変化により施設内全体の殺菌が完全であったか否か（所定菌数の微生物が全滅したか否か）を確認できる。

ただし，ホルマリンガスには毒性（皮膚に対する刺激性等）があり，最近は発がん性による規制対象にも指定されていることから（非特許文献２参照），取り扱い上の注意が必要であると共に燻蒸後の残留物等に対する対策が別途必要となっている。このため，燻蒸殺菌におけるホルマリンガスから代替殺菌剤への切り替えが進められおり，二酸化塩素ガスを用いる方法（非特許文献３参照），過酸化水素ガスを用いる方法，オゾンガスを用いる方法（非特許文献４参照），過酢酸水の希釈液をミスト状に噴霧する方法（非特許文献５参照），次亜塩素酸を用いる方法（非特許文献６参照），メタノールガスを用いる方法（非特許文献７）等が提案されている。

特開２００５−３２３８０９号公報

コスモ・バイオ株式会社「ＡＣＥｔｅｓｔバイオロジカルインジケータ（高圧蒸気滅菌用）仕様説明書」平成２７年８月検索，インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｓｅａｒｃｈ．ｃｏｓｍｏｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｃｏｓｍｏ＿ｓｅａｒｃｈ＿ｐ／ｓｅａｒｃｈ＿ｇａｔｅ２／ｄｏｃｓ／ＦＵＫ＿／Ｈ３７２３．２０１４０１２１．ｐｄｆ＞ 厚生労働省「平成２０年度化学物質による労働者の健康障害防止に係るリスク評価検討会報告書（医療現場におけるホルムアルデヒドについて）」平成２０年１１月，インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／ｂｕｎｙａ／ｒｏｕｄｏｕｋｉｊｕｎ／ａｎｚｅｎｅｉｓｅｉ１７／＞ イカリ消毒株式会社「二酸化塩素ガス発生装置Ｍｉｎｉｄｏｘ−Ｍ Ｇａｓ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ」平成２７年８月検索，インターネット＜ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｋａｒｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｓｅｒｖｉｃｅ／ｐｄｆ／ｍｉｃｒｏｂｅ＿ｎｉｓａｎｋａｔａｎｓｏ．ｐｄｆ＞ 大成建設株式会社「無菌製造室燻蒸に対してもっと有効な方法を導入したい」平成２７年８月検索，インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｌｉｂｒａｒｙｔａｉｓｅｉ．ｊｐ／ｓｌｉｂｒａｒｙ／ｍｏｎｏ／ｍｅｄｉｃｉｎｅ／ｆｕｊｉｙａｋｕｈｉｎ／ｉｎｄｅｘ＿０２．ｈｔｍｌ＞ 小津産業株式会社「過酢酸系除菌剤 ＭＩＮＮＣＡＲＥ ＡＣＴＲＩＬ」平成２７年８月検索，インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｚｕ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｄｆ／ｍｉｎｎｃａｒｅ＿０１．ｐｄｆ＞ 株式会社ピーステック「次亜塩素酸水ミクロテクト」平成２７年８月検索，インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｐｅａｃｅｔｅｃｈ−ｃｏ．ｃｏｍ／ｉｔｅｍｓ／ｓｔｅｒｉ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＞ 株式会社ウイングターフ「ＭＲＧシステムの環境殺菌対応」平成２７年８月検索，インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｎｇｔｕｒｆ．ｃｏｍ／ｐｄｆ／ＭＲＧ１．ｐｄｆ＞ 高野光男・横山理雄「食品の殺菌−その科学と技術」株式会社幸い書房，１９９８年６月２５日発行，ｐ６３ Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ，Ｈ．Ｏ． ａｎｄ Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｎ．Ｒ．"Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｔｏ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ： Ｉ． Ａ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ"，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２５ Ｎｏ．２，１９３３年２月，ｐｐ１０１−１２１

しかし，上述した従来の燻蒸殺菌は，何れも施設内の微生物濃度を低下させるが，殺菌効果が定量的に評価されていない問題点がある。すなわち，従来のホルマリン燻蒸で用いるバイオインジケータは，保持する所定菌数の全滅というエンドポインのみで殺菌効果を評価するものであり，仮に燻蒸後に生存する微生物が１桁であったとしても増殖して培地の色調が変化すれば不完全な殺菌と評価せざるをえない。このため，従来方法は過剰な殺菌となりがちであり，燻蒸時間が増えると共に，燻蒸後の残留物も増え，建材劣化も進む結果を招いている。必要最小限の燻蒸時間で施設内を効率的に殺菌する観点から，殺菌効果を定量的に評価できる試験技術の開発が求められている。

また，施設内の殺菌効果を定量的に評価することは，上述したホルマリンガスの代替殺菌剤を用いる場合にも重要である。すなわち，これらはホルマリンガスに代えて代替殺菌剤を施設内に充填する方法であるが，燻蒸時間や燻蒸方法は必ずしもホルマリンガスと同じではない。施設内の隅々まで殺菌できる範囲内で過剰な殺菌とならないような燻蒸時間を殺菌剤毎に設定する必要があり，燻蒸時間の設計のために殺菌効果の定量的な評価が必要となる。また，ガス状ではなくミスト状に殺菌剤を噴霧する場合は，施設内における伝搬（隙間等への進入態様）や殺菌作用がホルマリンガスの場合と異なることも想定されるので，殺菌剤毎に適切な燻蒸方法を設計するためにも殺菌効果の定量的な評価が重要となる。

そこで本発明の目的は，施設内を燻蒸する殺菌剤の殺菌効果を定量的に評価できる試験方法及び装置を提供することにある。

図１及び図２の実施例を参照するに，本発明による殺菌試験方法は，乾燥に耐える微生物の所定希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の各希釈液Ｓ０〜Ｓ７をそれぞれ基材１１上に列状に滴下し且つ複数回反復により行列状に乾燥付着させて初発菌数Ｎｐ（＝Ｎ０〜Ｎ７）の検定基材１０とし（図１及び図２の（Ａ）及び（Ｂ）参照），検定基材１０（１１＋Ｓ０〜Ｓ７）を殺菌剤Ｍで燻蒸する施設１内に設置して所定時間ｔ燻蒸したのち培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを添加して培養し（図１及び図２の（Ｃ）及び（Ｄ）参照），検定基材１０上の各希釈段階Ｄ０〜Ｄ７における微生物増殖が陽性（＋）の数からＭＰＮ法により生残菌数Ｎｔ又は菌生存率Ｎｔ／Ｎｐを求めて殺菌効果を評価してなるものである（図１及び図２の（Ｅ）及び（Ｆ）参照）。乾燥に耐える微生物は，例えば乾燥時に胞子が形成される微生物とすることができる。

また図１及び図２の実施例を参照するに，本発明による殺菌試験装置は，乾燥に耐える微生物の所定希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の各希釈液Ｓ０〜Ｓ７をそれぞれ基材１１上に列状に滴下し且つ複数回反復により行列状に乾燥付着させた初発菌数Ｎｐ（＝Ｎ０〜Ｎ７）の検定基材１０（図１及び図２の（Ｂ）参照），並びに検定基材１０に添加する培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅ（図１及び図２の（Ｄ）参照）を備えてなり，検定基材１０を殺菌剤Ｍで燻蒸する施設１内に設置して所定時間ｔ燻蒸したのち培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを添加して培養し（図１及び図２の（Ｃ）及び（Ｄ）参照），検定基材１０上の各希釈段階Ｄ０〜Ｄ７における微生物増殖が陽性（＋）の数からＭＰＮ法により生残菌数Ｎｔ又は菌生存率Ｎｔ／Ｎｐを求めて殺菌効果を評価してなるものである（図１及び図２の（Ｅ）及び（Ｆ）参照）。乾燥に耐える微生物は，例えば乾燥時に胞子が形成される微生物とすることができる。

例えば，図３に示すように，基材１２ａ上にＤ０〜Ｄ７の各希釈液Ｓ０〜Ｓ７を列状に滴下し且つＮ回（Ｎは６以上の整数）反復により行列状に付着させて検定基材１０（１２ａ＋Ｓ０〜Ｓ７）とし，燻蒸後に培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｍを添加した検定基材１０上の微生物増殖の陽性（＋）及び陰性（−）を共に含む希釈段階における微生物増殖が陽性（＋）の数Ｐ（Ｎ＞Ｐ＞０）から次式（１）により生残菌数Ｎｔを求める。
生残菌数Ｎｔ＝ｌｎ（Ｎ／（Ｎ−Ｐ）） ………………………………（１）

更に好ましい実施例では，図４〜図６に示すように，培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅが装填された検定基材１０の密封被覆材１５を設け，燻蒸後に検定基材１０を被覆材１５で密封すると同時に培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを添加する。例えば，図５に示すように，基材１１を行列状の窪みが形成された蓋材１２ｂ付きマイクロプレート１２ａとし，希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の各希釈液Ｓ０〜Ｓ７を蓋材１２ｂ又はマイクロプレート１２ａ上に列状に滴下し且つ複数回反復により行列状に乾燥付着させて検定基材１０（（１２ｂ＋Ｓ０〜Ｓ７）又は（１２ａ＋Ｓ０〜Ｓ７））とし，培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅをマイクロプレート１２ａ又は蓋材１２ｂに装填し，燻蒸後にマイクロプレート１２ａと蓋材１２ｂとを密着させて培養する。

本発明による殺菌試験方法及び装置は，乾燥に耐える微生物の所定希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の各希釈液Ｓ０〜Ｓ７をそれぞれ基材１１上に列状に滴下し且つ複数回反復により行列状に乾燥付着させて初発菌数Ｎｐ（＝Ｎ０〜Ｎ７）の検定基材１０とし，検定基材１０を殺菌剤Ｍで燻蒸する施設１内に設置して所定時間ｔ燻蒸したのち培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを添加して培養し，検定基材１０上の各希釈段階Ｄ０〜Ｄ７における微生物増殖が陽性（＋）の数からＭＰＮ法により生残菌数Ｎｔ又は菌生存率Ｎｔ／Ｎｐを求めて殺菌効果を評価するので，次の有利な効果を奏する。

（イ）希釈系列Ｄ０〜Ｄ７を付着させた初発菌数Ｎｐの検定基材１０の燻蒸殺菌後の微生物増殖状態から生残菌数Ｎｔ又は菌生存率Ｎｔ／Ｎｐを求めるので，その菌生存率Ｎｔ／Ｎｐ又は死滅桁数（＝ｌｏｇ（Ｎｔ／Ｎｐ））から殺菌効果を定量的に評価することができる。
（ロ）また，希釈系列Ｄ０〜Ｄ７を一列ではなく複数列（行列状）に付着させた検定基材１０を用い，その燻蒸殺菌後の微生物増殖状態からＭＰＮ法によって生残菌数Ｎｔを求めることにより，生残菌数Ｎｔの検出精度を高め，殺菌効果の定量的な評価の精度向上を図ることができる。
（ハ）検定基材１０は手のひら程度の小型なものとすることができ，殺菌剤Ｍで燻蒸する施設１内に複数の検定基材１０を設置して所定時間おきに生残菌数Ｎｔを連続的に検出することにより，殺菌剤Ｍ毎の最適な燻蒸時間を設計することができる。

（ニ）また，従来のバイオインジケータのようなエンドポインのみでの評価ではなく，施設内の複数位置の殺菌効果を定量的な菌生存率の分布として検出できるので，たとえばガス状殺菌剤Ｍとミスト状殺菌剤Ｍとの相違に応じた燻蒸方法を設計することも可能となる。
（ホ）検定基材１０を密封する被覆材１５に培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを装填し，検定基材１０を被覆材１５で密封すると同時に培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを添加することにより，検定基材１０の各希釈系列Ｄ０〜Ｄ７に対する殺菌時間を揃えることができる。
（ヘ）また，検定基材１０を被覆材１５で自動的に密封するシステム等を組み合わせることにより，例えば強力な殺菌剤Ｍが充満していて人の立ち入りができないような施設においても，生残菌数Ｎｔを精度よく検出することが可能となる。

以下，添付図面を参照して本発明を実施するための形態及び実施例を説明する。
は，本発明の殺菌試験装置の一実施例の説明図である。 は，本発明の殺菌試験装置の他の実施例の説明図である。 は，本発明の殺菌試験装置の更に他の実施例の説明図である。 は，検定基材の密封被覆材に培地及び殺菌中和剤を装填した本発明の殺菌試験装置の実施例の説明図である。 は，検定基材の密封被覆材に培地及び殺菌中和剤を装填した本発明の殺菌試験装置の他の実施例の説明図である。 は，検定基材の密封被覆材に培地及び殺菌中和剤を装填した本発明の殺菌試験装置の更に他の実施例の説明図である。 は，培養ユニット式検定基材を用いた本発明の殺菌試験装置の実施例の説明図である。

図１は，殺菌剤Ｍで燻蒸する施設１の殺菌効果を，本発明の殺菌試験装置を用いて評価する実施例を示す。図示例の殺菌試験装置は，図１（Ｂ）に示すように微生物の所定希釈系列Ｄ０〜Ｄ７を基材１１上に付着させた初発菌数Ｎｐの検定基材１０と，図１（Ｄ）に示すように検定基材１０に添加する培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅとを有している。図１（Ｃ）に示すように殺菌剤Ｍで燻蒸する施設１内に検定基材１０を所定時間ｔだけ設置したのち培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを添加し，図１（Ｅ）に示すように検定基材１０の各希釈段階Ｄ０〜Ｄ７の微生物増殖状態から生残菌数Ｎｔ又は菌生存率Ｎｔ／Ｎｐを求めて施設１内の殺菌効果を評価する。

図１（Ａ）及び（Ｂ）は，検定基材１０の作製方法を示している。先ず図１（Ａ）に示すように，乾燥に耐える微生物を滅菌蒸留水１０ミリリットに希釈して単位量当たり所定濃度の試料Ｄ０を作成し，７本の試験管にそれぞれ滅菌蒸留水を９ミリリットルずつ分注し，試料Ｄ０の１ミリリットルを滅菌蒸留水で１０倍ずつ７段階に希釈して，８段階の希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の希釈液Ｓ０〜Ｓ７を作成する。各希釈系列Ｄ１〜Ｄ７には，単位量当たり希釈系列Ｄ０の１０^−１〜１０^−７倍の微生物が含まれている。次いで図１（Ｂ）に示すように，希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の各希釈液Ｓ０〜Ｓ７をそれぞれ基材１１上にｄミリリットルずつ（例えば０．００５ミリ（５マイクロ）リットルずつ）滴下し，乾燥（例えば風乾）させて，初発菌数Ｎｐの微生物が付着した検定基材１０を作製する。検定基材１０（及び初発菌数Ｎｐ）を構造又は特性から直接特定することはおよそ実際的ではなく，検定基材１０は乾燥付着させる希釈系列Ｄ０〜Ｄ７によって特定できる。

本発明において初発菌数Ｎｐとは，希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の各希釈液Ｓ０〜Ｓ７を滴下した段階で検定基材１０に付着している微生物数を意味し，殺菌剤Ｍで燻蒸する施設１内に設置しなかった場合の本来の菌数のことを指す。図示例のように，８段階の希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の希釈液Ｓ０〜Ｓ７を検定基材１０に滴下したときは，各希釈液Ｓ０〜Ｓ７に含まれる異なる菌数Ｎ０〜Ｎ７の微生物が検定基材１０に付着しており，各希釈段階の初発菌数ＮｐはＮ０〜Ｎ７となる。施設内設置後の菌数計測では，何れかの希釈段階の微生物増殖状態から生残菌数Ｎｔ又は菌生存率Ｎｔ／Ｎｐを算出する。

乾燥に耐える微生物を用いる理由は，各希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の微生物を水分が失われた状態で施設１内の空気中の殺菌剤Ｍと接触させ，検定基材１０に含まれる水分による殺菌効果への影響を避けるため，基材１１上に滴下した各希釈液Ｓ０〜Ｓ７を乾燥させて検定基材１０とするからである。乾燥に耐える微生物は，例えば乾燥状態，飢餓状態等の環境ストレス時に胞子が形成される好気性細菌（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ属，Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属，Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属等），嫌気性細菌（例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属等），真菌であるカビ類の胞子（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ等），原虫・藻類等の胞子，シスト，休眠細胞等とすることができる。ただし，胞子を形成しなくても比較的短い時間の乾燥に耐えられる微生物を用いることは可能であり，微生物の乾燥菌体等が利用できる場合や細胞が完全に乾燥しない処理が可能である場合は，大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＢＲＣ３９７２）等を用いることもできる。

また図示例では，基材１１として８つの窪み（ウェル）が一列に形成された手のひら程度の小型な合成樹脂製プレートを用い，８段階の希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の希釈液Ｓ０〜Ｓ７を一列に付着させて検定基材１０としている。検定基材１１から複数の希釈段階Ｄ０〜Ｄ７の微生物増殖状態を読み取ることで，その検定基材１１の設置位置における生残菌数Ｎｔを求めることができる。ただし，例えば図６（Ｂ）に示すように，各希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の希釈液Ｓ０〜Ｓ７をそれぞれ別々の基材１１に付着させて検定基材１１としてもよい。この場合は，各希釈段階Ｄ０〜Ｄ７の検定基材１０を１セットとして用い，各希釈段階Ｄ０〜Ｄ７の検定基材１０の殺菌位置や殺菌時間にずれが生じないようにすることが必要である。なお，希釈系列の段階数は８段階未満又は８段階より多くしてもよい。

作製した検定基材１０を施設１内の所要位置に設置したのち，図１（Ｃ）に示すように従来の燻蒸殺菌と同様に殺菌剤Ｍをガス状又はミスト状にして施設１内に充満させる。検定基材１０の設置位置は，殺菌剤Ｍの最も到達しにくい箇所だけでなく，施設１内の複数の箇所とすることができる。従来のバイオインジケータのような所定菌数の全滅というエンドポインの検出と異なり，図１（Ｂ）検定基材１０ではその設置位置の定量的な菌生存率が検出できるので，施設１内の複数位置に検定基材１０を設置して各地点の菌生存率を検出することにより，施設１内における菌生存率の分布として殺菌効果を評価することができる。

図１（Ｄ）は，施設１内に所定時間ｔだけ設置した検定基材１０を施設１の外へ取り出し，培地Ｃ及び殺菌中和剤（殺菌反応停止剤）Ｅを添加して培養する処理を示している。培地Ｃは，微生物毎に適した培地を適宜選択できるが，一般的なブイヨン培地（ＮＢ培地）とすることもできる。また殺菌中和剤Ｅは，施設１内に設置した検定基材１０には殺菌剤Ｍが満ち込まれており，殺菌剤Ｍを残したまま検定基材１０を培養すると精確な生残菌数Ｎｔが得られないから，残存する殺菌剤Ｍの影響を排除するためのものである。殺菌中和剤Ｅは，殺菌剤Ｍの種類に応じて適宜選択して使用することができる（表１参照）。なお，ＮＢ培地はペプトン（タンパク質）を含んでいるので，タンパク質が中和剤として機能するような殺菌剤Ｍについては，ＮＢ培地を培地Ｃ及び中和剤Ｅとして機能させることができる。

図１（Ｅ）は，培地Ｃを添加した検定基材１０の培養結果の一例を表し，希釈段階Ｄ０〜Ｄ４（１０^０〜１０^−４）では微生物の増殖が検出される（陽性である）ことを示し，希釈段階Ｄ５〜Ｄ７（１０^−５〜１０^−７）では微生物の増殖が検出されない（陰性である）ことを示している。希釈段階Ｄ４は初発菌数Ｎ４であり，希釈段階Ｄ５は初発菌数Ｎ５であることから，図１（Ｅ）の微生物増殖状態から燻蒸殺菌処理後の菌生存率Ｎｔ／Ｎｐは（１／Ｎ５）以上（１／Ｎ４）未満であると算出することができ，菌生存率Ｎｔ／Ｎｐにより施設１内の殺菌効果を定量的に評価することができる。

図１（Ｆ）は，図１（Ｅ）に示す検定基材１０の各希釈段階Ｄ０〜Ｄ７の微生物増殖状態から，施設１内の殺菌効果，すなわち微生物の菌生存率を算出する評価装置２０の実施例を示す。評価装置２０の一例は，入力装置２１と出力装置２２と記憶手段２３とを有するコンピュータである。記憶手段２３には，上述した微生物の初発菌数Ｎｐ（＝Ｎ０〜Ｎ７）等を記憶する。また図示例のコンピュータ２０は，内蔵プログラムとして，検定基材１０の微生物増殖状態から菌生存率を算出する生存率算出手段２５と，算出した菌生存率を出力装置１５へ適宜出力する出力手段２６とを有している。

図１（Ｆ）の評価装置２０において，入力装置２１を介して検定基材１０の各希釈段階Ｄ０〜Ｄ７の微生物増殖状態（図１（Ｅ）の微生物増殖が検出された希釈段階）を生存率算出手段２５に入力すると，生存率算出手段２５が菌生存率Ｎｔ／Ｎｐを算出し，出力手段２６を介して出力装置２２に表示する。施設１内の複数位置に検定基材１０を設置すると共に記憶手段２３に各設置位置を記憶しておき，複数位置の検定基材１０の微生物増殖状態を入力することにより，出力手段２６によって施設１内の菌生存率の分布を出力装置２２に図示することもできる。また，施設１内の各位置に複数の検定基材１０を設置しておき，所定時間おきに検定基材１０を取り出して微生物増殖状態を入力することにより，出力手段２６によって施設１内の菌生存率の時間的な変化を評価することもできる。

図２は，殺菌剤Ｍで燻蒸する施設１の殺菌効果を評価する本発明の殺菌試験装置の他の実施例を示す。図２の殺菌試験装置も，検定基材１０（図２（Ｂ）参照）と培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅ（図２（Ｄ）参照）とで構成されているが，行列状の窪みが形成されたマイクロプレートを基材１２ａとして用い，８段階の希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の各希釈液Ｓ０〜Ｓ７を列状に滴下すると共に複数回にわたって反復し，乾燥（例えば風乾）させることにより，検定基材１０に希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の希釈液Ｓ０〜Ｓ７を行列状に付着させている。

上述したように，希釈系列Ｄ０〜Ｄ７を一列に付着させた図１（Ｂ）の検定基材１０を用いて燻蒸殺菌後の菌生存率Ｎｔ／Ｎｐを検出できるが，死滅桁数を検出できる程度であり，検出精度を高めることは難しい。これに対して，試料の希釈系列を一列ではなくＮ回反復して培養し，Ｎ回反復された各々における各希釈段階の微生物増殖状態から試料中の生残数を求める最確法（ＭＰＮ法）が開発されている（非特許文献８参照）。希釈を繰り返すと生菌数が０となる確率が出てくるが，ある希釈段階をＮ回反復したうちＫ個の生菌数が０となる確率は二項分布から計算される。ＭＰＮ法は，十分に希薄な微生物懸濁液を，新鮮な培地に繰り返し植菌・培養した場合の増殖有無の確率から，植菌した微生物の数を推算する手法である。

具体的には，反復数Ｎを３回とし，そのＮ回の全て又はほとんどで微生物の増殖があった最低の希釈段階における増殖検出個数Ｋ１と，その次の希釈（１０倍希釈）段階における増殖検出個数Ｋ２と，更に次の希釈（１００倍希釈）段階における増殖検出個数Ｋ３とをそれぞれ求め，その３つの数を並べたコード［Ｋ１，Ｋ２，Ｋ３］から原液中の生菌数を推定する。このコード［Ｋ１，Ｋ２，Ｋ３］からの推定値が最確数（ＭＰＮ）と呼ばれ，予め表２のようなＭＰＮ表を作成しておけば，そのＭＰＮ表に照らしてコード［Ｋ１，Ｋ２，Ｋ３］を生残菌数Ｎｔに換算することができる。反復数Ｎが３回の系ではＭＰＮ表は６４通りとなるが，反復数を更に増やして精度を高めることができ，反復数Ｎが５回の系では２１６通りのＭＰＮ表となる。

図２（Ａ）及び（Ｂ）は，８つの窪み（ウェル）が３列に形成されたマイクロプレートを基材１２ａとして用い，８段階の希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の希釈液Ｓ０〜Ｓ７を行列状（３×８）に付着させて検定基材１０を作製する方法を示す。先ず，図１の場合と同様に乾燥に耐える微生物の希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の希釈液Ｓ０〜Ｓ７を作成する。次いで，各希釈液Ｓ０〜Ｓ７を基材１２ａ上の各ウェルにｄミリリットルずつ（例えば５マイクロリットルずつ）列状に滴下すると共に３回にわたって反復し，更に乾燥（例えば風乾）させて検定基材１０（１２ａ＋Ｓ０〜Ｓ７）を作製する。ただし，反復回数は３回に限らず，例えば５回又はそれ以上の反復回数が付着できるマイクロプレートを用いることができる。

図２（Ｃ）に示すように作製した検定基材１０を殺菌剤Ｍで燻蒸する施設１内に所定時間ｔだけ設置したのち，図２（Ｄ）に示すように検定基材１０の各ウェルに培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを添加して培養する。図２（Ｅ）は，培地Ｃを添加した検定基材１０の培養結果の一例を表しており，３回反復の全てで微生物の増殖が検出された（陽性であった）最低の希釈段階Ｄ３の増殖検出個数Ｋ１（＝３）と，次の希釈段階Ｄ４の増殖検出個数Ｋ２（＝２）と，更に次の希釈段階Ｄ５の増殖検出個数Ｋ３（＝０）とからコード［３，２，０］が求まることを示している。表２を参照すると，このコードに対応するＭＰＮは０．９３であることから，コード中央部の希釈段階Ｄ４の生残菌数Ｎｔ（＝０．９３）を求めることができ，希釈段階Ｄ４の初発菌数Ｎｐ＝Ｎ４から菌生存率Ｎｔ（＝０．９３／Ｎ４）を算出することができる。

図２（Ｆ）は，図２（Ｅ）で求めたコード［Ｋ１，Ｋ２，Ｋ３］から，施設１内の殺菌効果として定量的な菌生存率を算出する評価装置２０の実施例を示す。図２の評価装置２０もコンピュータで構成されており，記憶手段２３には微生物の初発菌数Ｎｐと共に表２のようなＭＰＮ表Ｔが記憶されている。また，内蔵プログラムとして，生存率算出手段２５及び出力手段２６に加えて，検定基材１０の微生物増殖状態から生残菌数Ｎｔを算出する生残菌数算出手段２４を有している。入力装置２１から評価装置２０にコード［Ｋ１，Ｋ２，Ｋ３］を入力すると，生残菌数算出手段２４が上述したようにコード［Ｋ１，Ｋ２，Ｋ３］とＭＰＮ表Ｔとから生残菌数Ｎｔを算出し，生存率算出手段２５が菌生存率Ｎｔ／Ｎｐを算出し，出力手段２６を介して出力装置２２に表示する。図２のように，希釈系列Ｄ０〜Ｄ７を一列ではなく複数列（行列状）に付着させた検定基材１０を用い，ＭＰＮ法によって生残菌数を求めることにより，菌生存率の検出精度を高めることができ，図１の場合と比較して施設１内の殺菌効果の定量的な評価の精度向上を図ることができる。

好ましく，図３に示すようにＭＰＮ法の反復数Ｎを６回以上とし，希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の各希釈液Ｓ０〜Ｓ７を列状に滴下し且つ６回以上反復することにより行列状に付着させて検定基材１０を作製する。図２のような反復数Ｎが３回の場合と比較して，反復数Ｎを６回以上とすることにより菌生存率の検出精度を更に高めることができる。ただし，反復数Ｎが６回以上の系のＭＰＮ表は極めて大きく，作成も不可能ではないが煩雑である。これに対し，ＭＰＮ表を必要としないＭＰＮ法として，微生物の増殖が陽性（＋）及び陰性（−）を共に含む希釈段階の状態から次式（１）により生残菌数Ｎｔを求める方法が開発されている（非特許文献９参照）。式（１）において，Ｎは反復数を表し，Ｐは反復数Ｎのうち微生物の増殖が陽性（＋）の数（Ｎ＞Ｐ＞０）を表す。
生残菌数Ｎｔ＝ｌｎ（Ｎ／（Ｎ−Ｐ）） ………………………………（１）

図３（Ａ）は，８つの窪み（ウェル）が６列に形成されたマイクロプレートを基材１２ａとして用い，図２（Ａ）及び（Ｂ）と同様に，８段階の希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の希釈液Ｓ０〜Ｓ７を行列状（６×８）に付着させて作製した反復数Ｎ＝６の検定基材１０を示す。作製した検定基材１０を殺菌剤Ｍで燻蒸する施設１内に所定時間ｔだけ設置したのち，各ウェルに培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを添加して培養する。図３（Ｂ）は，培地Ｃを添加した検定基材１０の培養結果の一例を表し，希釈段階Ｄ４が微生物増殖の陽性（＋）及び陰性（−）を共に含んでいることを示している。希釈段階Ｄ４において反復数Ｎ＝６のうち微生物増殖が陽性（＋）の数は１であるから，（１）式により希釈段階Ｄ４の生残菌数Ｎｔ（＝ｌｎ（６／（６−１））≒０．１８２）を求めることができ，希釈段階Ｄ４の初発菌数Ｎｐ＝Ｎ４から菌生存率Ｎｔ（＝０．１８２／Ｎ４）を算出することができる。

図３（Ｃ）は，図３（Ａ）の検定基材１０を燻蒸殺菌処理せずに培養した結果の一例を示す。検定基材１０の初発菌数Ｎｐは，上述したように検定基材１０の作製時の希釈系列Ｄ０〜Ｄ７から計算できるが，実験中の不可抗力等を考慮して，図３（Ｂ）のような殺菌未処理の検定基材１０を培養して確認することができる。具体的には，図示例において希釈段階Ｄ６が微生物増殖の陽性（＋）及び陰性（−）を共に含んでおり，希釈段階Ｄ６では反復数Ｎ＝６のうち微生物増殖が陽性（＋）の数は２であるから，（１）式により希釈段階Ｄ６の生残菌数Ｎ（＝ｌｎ（６／（６−２））≒０．４０５）を求めることができ，そこから希釈段階Ｄ４の初発菌数Ｎｐ（＝０．４０５×１０^３）を算出することができる。従って，図３（Ｂ）に示す殺菌処理後の検定基材１０と図３（Ｃ）に示す殺菌未処理の検定基材１０とを同時に培養することにより，菌生存率Ｎｔ（＝０．１８２／０．４０５×１０^３）を求めて殺菌効果を評価することができる。

例えば図２（Ｆ）の評価装置２０において，記憶手段２３にＭＰＮ表Ｔに代えて反復数Ｎ＝６を記憶しておき，図３（Ｂ）のような殺菌処理後の検定基材１０の希釈段階Ｄ４における微生物増殖陽性（＋）の数Ｐを入力装置２１から評価装置２０へ入力することにより，生残菌数算出手段２４が（１）式により生残菌数Ｎｔを算出し，生存率算出手段２５が菌生存率Ｎｔ／Ｎｐを算出することができる。また，図３（Ｃ）のような殺菌未処理の検定基材１０の希釈段階Ｄ６における微生物増殖陽性（＋）の数Ｐを入力装置２１から評価装置２０へ入力することにより，生存率算出手段２５が希釈段階Ｄ４の初発菌数Ｎｐを算出して菌生存率Ｎｔ／Ｎｐを算出することもできる。

こうして，本発明の目的である「施設内を燻蒸する殺菌剤の殺菌効果を定量的に評価できる試験方法及び装置」の提供を達成することができる。

図４は，検定基材１０を密封する被覆材１５を設け，その被覆材１５に培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを装填し，検定基材１０を被覆材１５で密封することにより検定基材１０に培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを添加する実施例を示す。図１〜図３の実施例では，施設１内に設置した検定基材１０を所定時間ｔの経過後に外部へ取り出して培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを添加しており，検定基材１０の各希釈系列Ｄ０〜Ｄ７に対する培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅの添加タイミングに多少のずれを生じるおそれがあった。図４のように，検定基材１０を密封する被覆材１５に培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを装填することにより，検定基材１０を被覆材１５で密封すると同時に各希釈系列Ｄ０〜Ｄ７に培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを添加することが可能となり，添加タイミングのずれによる生残菌数Ｎｔの検出誤差を避けることができる。

図４（Ａ）は８つの窪み（ウェル）が一列に形成された合成樹脂製プレート１１を用いて作製した検定基材１０を示し，図４（Ｂ）はその検定基材１０を密封する同型シート状の被覆材１５を示す。図示例の被覆材１５は，片側表面に培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅが塗布された被覆材シート１５ａと，その培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅの表面に剥離可能に張り付ける汚染防止フィルム１５ｂとにより構成されている。例えば図４（Ａ）の検定基材１０を施設１内に所定時間ｔだけ設置したのち，図４（Ｂ）の被覆材シート１５ａの表面から汚染防止フィルム１５ｂを剥離し，図４（Ｃ）に示すように被覆材シート１５ａの培地塗布面を検定基材１０に押し当てて被覆する。

図４のように検定基材１０を被覆材１５で密封する方法によれば，施設１内に設置した検定基材１０を外部へ取り出す手間を省き，所定時間ｔの経過時に被覆材１５を持った作業員が施設１内に入って培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを簡単に添加することができる。また，図４（Ｄ）の示すような基材密閉システム３０を施設１内に設置しておけば，例えば強力な殺菌剤Ｍが充満していて人の立ち入りができないような施設１においても，所定時間ｔの経過時点において検定基材１０を被覆材１５で自動的に密封して培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを添加することもできる。

図４（Ｄ）の基材密閉システム３０は，検定基材１０を載置する環状ベルトを所定時間ｔの経過時に駆動する基材搬送ローラ３１と，その検定基材１０と対向するように被覆材１５を搬送する被覆材搬送ローラ３２と，その被覆材１５から汚染防止フィルム１５ｂを剥離するフィルム剥離ローラ３３とを有するベルトコンベア装置により構成されている。環状ベルト上に載置された検定基材１０は，所定時間ｔまではそのまま燻蒸殺菌される。所定時間ｔの経過時に基材搬送ローラ３１と被覆材搬送ローラ３２とフィルム剥離ローラ３３とが同時に駆動され，フィルム剥離ローラ３３によって被覆材１５から汚染防止フィルム１５ｂを剥離し，被覆材搬送ローラ３２によって被覆材シート１５ａの培地塗布面を環状ベルト上の検定基材１０に押し当てて被覆する。

図５は，行列状の窪みが形成された蓋材１２ｂ付きマイクロプレート１２ａを用い，所定希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の各希釈液Ｓ０〜Ｓ７をその蓋材１２ｂ上に行列状に付着させて検定基材１０（１２ｂ＋Ｓ０〜Ｓ７）を形成し，培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅをマイクロプレート１２ａに装填し，燻蒸殺菌後に蓋材１２ｂとマイクロプレート１２ａとを密着させて培養する実施例を示す。この実施例では，マイクロプレート１２ａが，検定基材１０である蓋材１２ｂを密封する被覆材１５として機能し，図４の場合と同様に，検定基材１０を被覆材１５で密封することにより検定基材１０に培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを添加することができる。

図５（Ａ）は，マイクロプレート１２ａの蓋材１２ｂ上に，図２（Ｂ）の場合と同様に８段階の希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の希釈液Ｓ０〜Ｓ７を行列状（３×８）に付着させて作製した検定基材１０を示す。また図５（Ｂ）は，マイクロプレート１２ａの行列状（３×８）のウェルにそれぞれ培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを装填して作製した被覆材１５を示す。例えば図５（Ａ）の検定基材（蓋材）１０を施設１内に所定時間ｔだけ設置したのち，図５（Ｃ）に示すように被覆材（マイクロプレート）１５を被せて検定基材１０を密封することにより，検定基材１０の各希釈系列Ｄ０〜Ｄ７に培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを同時に添加する。

図５のように平板な蓋材１２ｂ上に希釈液Ｓ０〜Ｓ７を付着させて検定基材１０とすることにより，図２のように窪み（ウェル）の中に希釈液Ｓ０〜Ｓ７を付着させて検定基材１０とした場合に比して，検定基材１０を施設１内に設置して燻蒸殺菌処理する際に，微生物を殺菌剤Ｍに均等に接触させることができる。すなわち，例えば殺菌剤Ｍがミスト状である場合に，窪み（ウェル）中に付着させた微生物はミストと均等に接触しないおそれがあるのに対し，平板な蓋材１２ｂ上に付着させた微生物であればミストと均等に接触させることができる。このため，図５のように平滑な検定基材１０を用いることにより，殺菌効果の評価精度の向上が期待できる。ただし，例えば殺菌剤Ｍがガス状である場合は，マイクロプレート１２ａと蓋材１２ｂとを交換し，マイクロプレート１２ａから検定基材１０を作製し，蓋材１２ｂから培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅの装填された被覆材１５を作製することも可能である（図６の実施例３を参照）。

図６は，蓋材付き検定基材１０を用い，その蓋材に培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを装填し，燻蒸殺菌後に蓋材を閉めて密着させて培養する実施例を示す。この実施例では，検定基材１０の蓋材が被覆材１５として機能し，図４及び図５の場合と同様に，検定基材１０を被覆材１５で密封することにより検定基材１０に培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを添加することができる。図６（Ａ）は複数の窪み（ウェル）が一列に形成された合成樹脂製プレート１１を用いて作製した蓋材１５付き検定基材１０を示し，図６（Ｂ）はそれぞれ１つの窪み（ウェル）が形成された合成樹脂製プレート１１を用いて形成した蓋材１５付き検定基材１０を示す。図６（Ｂ）のように各希釈段階Ｄ０〜Ｄ７を個別の検定基材１０とする場合は，例えば図６（Ｃ）に示すように各希釈段階Ｄ０〜Ｄ７の検定基材１０を１セットとして用い，各希釈段階Ｄ０〜Ｄ７の検定基材１０の殺菌位置や殺菌時間にずれが生じないようにすることができる。

図６（Ｃ）の基材密閉システム３０は，検定基材１０を載置する環状ベルトを所定時間ｔの経過時に駆動する基材搬送ローラ３１と，コンベアベルト上で搬送される検定基材１０の蓋材１５を閉めて密着させる多角ローラ３４とを有するベルトコンベア装置により構成されている。環状ベルト上に載置された検定基材１０は，所定時間ｔまでは蓋材１５を開放したまま燻蒸殺菌され，所定時間ｔの経過時に基材搬送ローラ３１が駆動されて移動し，その移動経路上の多角ローラ３４に蓋材１５が当接して閉まることにより検定基材１０を被覆する。図６（Ｃ）のように被覆材１５を被せて検定基材１０を密封することにより，検定基材１０の各希釈系列Ｄ０〜Ｄ７に培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを同時に添加することができる。なお，図５（Ｃ）の基材密閉システム３０は，図６（Ｂ）のように各希釈段階Ｄ０〜Ｄ７を個別に付着させた検定基材１０だけでなく，図６（Ａ）のように各希釈段階Ｄ０〜Ｄ７を一列に付着させた検定基材１０についても適用可能である。

図７は，粒状の検定基材１０を用い，その検定基材１０を収納する筒状容器４１に培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを内蔵させた培養ユニット式基材４０の実施例を示す。図７（Ａ）は，粒状基材１３に希釈系列Ｄ０〜Ｄ７の各希釈液Ｓ０〜Ｓ７を付着させて検定基材１０を作製する処理を示す。作製した粒状の検定基材１０は，図７（Ｂ）に示すような筒状容器４１に収納する。筒状容器４１には深さ方向中間部位に隔膜４３が張設されており，筒状容器４１の内側は隔膜４３によって開口側の領域と底壁４２側の領域とに仕切られている。底壁４２の側領には培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを装填し，開口側の領域に粒状の検定基材１０を収納する。例えば，図５（Ｂ）に示すようなマイクロプレート１２ａの複数の窪み（ウェル）をそれぞれ図７（Ｂ）のような筒状容器４１に差替え，各ウェルに培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅが内蔵された培養ユニット式基材４０とすることができる。

図７（Ｃ）は，筒状容器４１に密着して被せる蓋材４４を示す。図示例の蓋材４４は，筒状容器４１に被せたときに内側へ突出するニードル４５が取り付けられており，図７（Ｄ）に示すように蓋材４４の閉鎖時にニードル４５が容器４１の隔膜４３を突き破ることにより，底壁４２側に内蔵された培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを開口側へ浸透させることができる。ニードル４５には，培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅの浸透を促進する浸透促進溝４６を設けることが望ましい。また蓋材４４には，ニードル４５が隔膜４３を突き破ったときに培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅが飛散しないように，ニードル４５の周囲を覆う飛散防止スカート４７を設けることが望ましい。例えば，図５（Ａ）に示すようなマイクロプレートの蓋材１２ｂの窪み対向位置にそれぞれニードル３４及びスカート４７を取り付けて，培養ユニット式基材４０の蓋材４４とすることができる。

図７の培養ユニット式基材４０は，所定時間ｔまでは蓋材４４を開放したまま筒状容器（例えばマイクロプレートのウェル）４１に収納された検定基材１０を燻蒸殺菌し，所定時間ｔの経過時に蓋材（例えばマイクロプレートの蓋材）４４を閉鎖して検定基材１０を密封する。その蓋材４４の閉鎖と同時に，蓋材４４のニードル４５が容器４１の隔膜４３を突き破ることにより，培地Ｃ及び殺菌中和剤Ｅを浸透させて検定基材１０に添加することができる。

１…殺菌施設
１０…検定基材 １１…基材
１２ａ…基材（マイクロプレート） １２ｂ…基材（マイクロプレートの蓋材）
１３…基材（粒状基材） １５…被覆材
１５ａ…被覆材シート １５ｂ…汚染防止フィルム
１５ｃ…ヒンジ
２０…評価装置（コンピュータ） ２１…入力装置
２２…出力装置 ２３…記憶手段
２４…生残菌数算出手段 ２５…菌生存率算出手段
２６…出力手段
３０…基材密閉システム ３１…基材搬送ローラ
３２…被覆材搬送ローラ ３３…フィルム剥離ローラ
３４…多角ローラ
４０…培養ユニット式基材 ４１…筒状容器
４２…底壁 ４３…隔膜
４４…蓋材 ４５…ニードル
４６…浸透促進溝 ４７…飛散防止スカート
Ｃ…培地 Ｅ…中和剤
Ｄ…希釈系列 Ｍ…殺菌剤
Ｎ…反復数 Ｎｐ…初発菌数
Ｎｔ…生残菌数 Ｐ…陽性の数
Ｓ…希釈液 Ｔ…ＭＰＮ表

Claims (10)

1. 乾燥に耐える微生物の所定希釈系列の各希釈液をそれぞれ基材上に列状に滴下し且つ複数回反復により行列状に乾燥付着させて初発菌数の検定基材とし，前記検定基材を殺菌剤で燻蒸する施設内に設置して所定時間燻蒸したのち培地及び殺菌中和剤を添加して培養し，前記検定基材上の各希釈段階における微生物増殖が陽性の数からＭＰＮ法により生残菌数又は菌生存率を求めて殺菌効果を評価してなる殺菌試験方法。
2. 請求項１の方法において，前記乾燥に耐える微生物を，乾燥時に胞子が形成される微生物としてなる殺菌試験方法。
3. 請求項１又は２の方法において，前記基材上に前記希釈系列の各希釈液を列状に滴下し且つＮ回（Ｎは６以上の整数）反復により行列状に付着させて検定基材とし，前記燻蒸後に培地及び殺菌中和剤を添加した検定基材上の微生物増殖の陽性及び陰性を共に含む希釈段階における微生物増殖が陽性の数Ｐから次式により生残菌数を求めてなる殺菌試験方法。
   生残菌数＝ｌｎ（Ｎ／（Ｎ−Ｐ））
4. 請求項１から３の何れかの方法において，前記検定基材を密封する被覆材に前記培地及び殺菌中和剤を装填し，前記燻蒸後の検定基材を前記被覆材で密封すると同時に培地及び殺菌中和剤を添加してなる殺菌試験方法。
5. 請求項４の方法において，前記基材を行列状の窪みが形成された蓋材付きマイクロプレートとし，蓋材及びマイクロプレートの何れか一方に前記希釈系列の各希釈液を列状に滴下し且つ複数回反復により行列状に乾燥付着させて検定基材とし，希釈液を乾燥付着させていない他方に前記培地及び殺菌中和剤を装填し，前記燻蒸後にマイクロプレートと蓋材とを密着させて培養してなる殺菌試験方法。
6. 乾燥に耐える微生物の所定希釈系列の各希釈液をそれぞれ基材上に列状に滴下し且つ複数回反復により行列状に乾燥付着させた初発菌数の検定基材，並びに前記検定基材に添加する培地及び殺菌中和剤を備えてなり，前記検定基材を殺菌剤で燻蒸する施設内に設置して所定時間燻蒸したのち前記培地及び殺菌中和剤を添加して培養し，前記検定基材上の各希釈段階における微生物増殖が陽性の数からＭＰＮ法により生残菌数又は菌生存率を求めて殺菌効果を評価してなる殺菌試験装置。
7. 請求項６の装置において，前記乾燥に耐える微生物を，乾燥時に胞子が形成される微生物としてなる殺菌試験装置。
8. 請求項６又は７の装置において，前記基材上に前記希釈系列の各希釈液を列状に滴下し且つＮ回（Ｎは６以上の整数）反復により行列状に付着させて検定基材とし，前記燻蒸後に培地及び殺菌中和剤を添加した検定基材上の微生物増殖の陽性及び陰性を共に含む希釈段階における微生物増殖が陽性の数Ｐから次式により生残菌数を求めてなる殺菌試験装置。
   生残菌数＝ｌｎ（Ｎ／（Ｎ−Ｐ））
9. 請求項６から８の何れかの装置において，前記培地及び殺菌中和剤が装填された前記検定基材の密封被覆材を設け，前記燻蒸後の検定基材を前記被覆材で密封すると同時に培地及び殺菌中和剤を添加してなる殺菌試験装置。
10. 請求項９の装置において，前記基材を行列状の窪みが形成された蓋材付きマイクロプレートとし，蓋材及びマイクロプレートの何れか一方に前記希釈系列の各希釈液を列状に滴下し且つ複数回反復により行列状に乾燥付着させて検定基材とし，希釈液を乾燥付着させていない他方に前記培地及び殺菌中和剤を装填し，前記燻蒸後にマイクロプレートと蓋材とを密着させて培養してなる殺菌試験装置。