JP2913419B2 - 大腸菌群の増殖及び検出用培地 - Google Patents
大腸菌群の増殖及び検出用培地Info
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- Japan
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は大腸菌群の増殖用培地、更に詳しくは、ジェ
ネレイションタイムが速く、増殖率がよく、ラッグフェ
イズがなく、大腸菌群の検出用培地に適した培地に関す
る。
ネレイションタイムが速く、増殖率がよく、ラッグフェ
イズがなく、大腸菌群の検出用培地に適した培地に関す
る。
近年、微生物の汚染を防止するという社会的要請の強
まりによって、食品、医薬品、化粧品、飲料水、尿等中
に存在する大腸菌群を検査することが盛んになってき
た。
まりによって、食品、医薬品、化粧品、飲料水、尿等中
に存在する大腸菌群を検査することが盛んになってき
た。
従来から行われている大腸菌群の検査法としては、デ
ゾキシコレート培地を用いて24時間培養した後、発育し
た菌のコロニー数を算出する方法、あるいはブリリアン
トグリーン乳糖ブイヨン（BGLB）、乳糖ブイヨン等を用
いて24〜48時間培養した後、ガスの産生が認められる試
験管の本数を数えて菌数を算定する方法が知られてい
る。
ゾキシコレート培地を用いて24時間培養した後、発育し
た菌のコロニー数を算出する方法、あるいはブリリアン
トグリーン乳糖ブイヨン（BGLB）、乳糖ブイヨン等を用
いて24〜48時間培養した後、ガスの産生が認められる試
験管の本数を数えて菌数を算定する方法が知られてい
る。
しかし、これらの方法は長時間を要し、現在の流通体
制に適合するためには迅速な検査法が望まれ、微生物が
増殖する際に変化する電気的抵抗を利用した迅速検出法
や、微生物のもつATPを測定する方法等が開発された。
しかし、これらの方法は、選択性及び精度性の点で必ず
しも満足できるものではなかった。
制に適合するためには迅速な検査法が望まれ、微生物が
増殖する際に変化する電気的抵抗を利用した迅速検出法
や、微生物のもつATPを測定する方法等が開発された。
しかし、これらの方法は、選択性及び精度性の点で必ず
しも満足できるものではなかった。
また、近年、４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ
−ガラクトシド（4-MUGal）を含む栄養培地を使用し
て、大腸菌群が産生するβ−ガラクトシダーゼによって
4-MUGalを４−メチル−ウンベリフェロン（4-MU）に変
化させ、この4-MUの蛍光を測定する大腸菌群の迅速検出
法が報告された（特開昭56-64797号及び特開昭57-14499
5号）。
−ガラクトシド（4-MUGal）を含む栄養培地を使用し
て、大腸菌群が産生するβ−ガラクトシダーゼによって
4-MUGalを４−メチル−ウンベリフェロン（4-MU）に変
化させ、この4-MUの蛍光を測定する大腸菌群の迅速検出
法が報告された（特開昭56-64797号及び特開昭57-14499
5号）。
しかるところ、4-MUGalを用いる検出法では、大腸菌
群数が試料原液1mlあたり10-4〜10-5以上必要なため、
食品等の比較的菌数の少ない大腸菌群を検出するには培
養操作が必要となり、大腸菌群をより速く増殖させる培
地が要求される。
群数が試料原液1mlあたり10-4〜10-5以上必要なため、
食品等の比較的菌数の少ない大腸菌群を検出するには培
養操作が必要となり、大腸菌群をより速く増殖させる培
地が要求される。
そして、従来再もよいとされている大腸菌群増殖用培
地は、特開昭56-64797号公報に記載のブレインハートイ
ンフュージョンブロス・ブイヨン培地（BHI）である
が、これも未だ充分に満足できるものでなく、よりジェ
ネレイションタイムが速く、増殖率がよく、しかもラッ
グフェイズがない大腸菌群増殖用培地が望まれていた。
地は、特開昭56-64797号公報に記載のブレインハートイ
ンフュージョンブロス・ブイヨン培地（BHI）である
が、これも未だ充分に満足できるものでなく、よりジェ
ネレイションタイムが速く、増殖率がよく、しかもラッ
グフェイズがない大腸菌群増殖用培地が望まれていた。
斯かる実情において、本発明者は鋭意研究を行った結
果、上記目的にあった培地を得ることに成功した。
果、上記目的にあった培地を得ることに成功した。
すなわち、本発明は、重量で、ペプトン1.0〜2.5％、
塩化ナトリウム0.25〜0.5％、酵母エキス0.4〜0.6％、
グリセロール0.5〜1.5％、リン酸一水素二カリウム0.2
〜0.5％、ピルビン酸ナトリウム0.05〜5.0％、硝酸カリ
ウム0.05〜1.0％、牛胆汁末1.0〜2.0％及び寒天0.1〜0.
3％を含有する大腸菌群増殖用培地に係る第１の発明
と、この培地に更に、４−メチル−ウンベリフェリル−
β−Ｄ−ガラクトシド又は４−メチル−ウンベリフェリ
ル−β−Ｄ−グルクロニドを含む大腸菌群検出用培地に
係る第２の発明を提供するものである。
塩化ナトリウム0.25〜0.5％、酵母エキス0.4〜0.6％、
グリセロール0.5〜1.5％、リン酸一水素二カリウム0.2
〜0.5％、ピルビン酸ナトリウム0.05〜5.0％、硝酸カリ
ウム0.05〜1.0％、牛胆汁末1.0〜2.0％及び寒天0.1〜0.
3％を含有する大腸菌群増殖用培地に係る第１の発明
と、この培地に更に、４−メチル−ウンベリフェリル−
β−Ｄ−ガラクトシド又は４−メチル−ウンベリフェリ
ル−β−Ｄ−グルクロニドを含む大腸菌群検出用培地に
係る第２の発明を提供するものである。
本明細書において、「ジェネレイションタイム」と
は、初発菌数より10倍以上増殖したときの時間をもっ
て、その時の菌数（対数値）から初発菌数（対数値）を
差し引いた値に係数3.3を乗じた値で、その時までの時
間を除して得られる値であり、「増殖率」とは、初発菌
数より10倍以上増殖したときの時間をもって、その時の
菌数（対数値）から初発菌数（対数値）を差し引いた値
に係数3.3を乗じた値を、その時までの時間で除して得
られる値であり、また「ラッグフェイズ」とは、増殖率
測定時において、ある時点でサンプリングした菌が、そ
の前にサンプリングしたときの菌数より少なくなってい
る時をいうものである。そして、大腸菌群検出用培地と
しては、ジェネレイションタイムが３分未満、増殖率が
0.35以上で、ラッグフェイズがない培地が好ましい。
は、初発菌数より10倍以上増殖したときの時間をもっ
て、その時の菌数（対数値）から初発菌数（対数値）を
差し引いた値に係数3.3を乗じた値で、その時までの時
間を除して得られる値であり、「増殖率」とは、初発菌
数より10倍以上増殖したときの時間をもって、その時の
菌数（対数値）から初発菌数（対数値）を差し引いた値
に係数3.3を乗じた値を、その時までの時間で除して得
られる値であり、また「ラッグフェイズ」とは、増殖率
測定時において、ある時点でサンプリングした菌が、そ
の前にサンプリングしたときの菌数より少なくなってい
る時をいうものである。そして、大腸菌群検出用培地と
しては、ジェネレイションタイムが３分未満、増殖率が
0.35以上で、ラッグフェイズがない培地が好ましい。
本発明者は、従来公知の多くの培地について大腸菌群
の生育性を試験した結果、増殖率がよく、かつラッグフ
ェイズがなかったのはBHIのみであった。そこで、このB
HI培地中のどの組成成分が増殖因子になっているかを調
べるために次の実験を行った。
の生育性を試験した結果、増殖率がよく、かつラッグフ
ェイズがなかったのはBHIのみであった。そこで、このB
HI培地中のどの組成成分が増殖因子になっているかを調
べるために次の実験を行った。
実験１ E.coli.ATCC 11775（普通ブイヨンで37℃、24時間培
養したものを小分けし、ドライアイス・アルコールで瞬
間凍結した後−80℃で保存したものを、用時融解して使
用する）を第１表に示す各培地に接種し、37℃のウオー
ターバスで培養し、定期的にサンプリングした後、菌数
を測定し、ジェネレイションタイムと増殖率を算出し
た。これと同時にラッグフェイズの有無を観察した。
養したものを小分けし、ドライアイス・アルコールで瞬
間凍結した後−80℃で保存したものを、用時融解して使
用する）を第１表に示す各培地に接種し、37℃のウオー
ターバスで培養し、定期的にサンプリングした後、菌数
を測定し、ジェネレイションタイムと増殖率を算出し
た。これと同時にラッグフェイズの有無を観察した。
尚、本明細書において、菌数測定は次のようにして行
われる。すなわち、細菌を接種した培地を原液とし、10
倍段階希釈し、その1mlを滅菌シャーレにとり、ここに
あらかじめ加温溶解し45℃ぐらいにたもってあるデゾキ
シコレート培地を注ぎ、ただちにシャーレを静かに動か
し、よく培地と菌液を混合し、平板に固まらせ37℃24時
間培養した後、菌数を測定する。
われる。すなわち、細菌を接種した培地を原液とし、10
倍段階希釈し、その1mlを滅菌シャーレにとり、ここに
あらかじめ加温溶解し45℃ぐらいにたもってあるデゾキ
シコレート培地を注ぎ、ただちにシャーレを静かに動か
し、よく培地と菌液を混合し、平板に固まらせ37℃24時
間培養した後、菌数を測定する。
その結果を第２表に示す。
この実験の結果から、ポリペプトン、塩化ナトリウム
及びリン酸一水素二カリウムが大腸菌群の増殖に関与し
ていることが明らかとなった。
及びリン酸一水素二カリウムが大腸菌群の増殖に関与し
ていることが明らかとなった。
また、特開昭57-144995号公報には、肝汁酸を添加し
て大腸菌群以外の微生物の生育を抑制することができる
ことが記載されている。そこで、本発明者は、牛胆汁末
の添加効果について次の実験を行った。
て大腸菌群以外の微生物の生育を抑制することができる
ことが記載されている。そこで、本発明者は、牛胆汁末
の添加効果について次の実験を行った。
実験２ ポリペプトン１％、塩化ナトリウム0.5％及びリン酸
一水素二カリウム0.25％を含む基礎培地に種々の濃度で
牛胆汁末を添加した培地にE.coliを接種し、実験１と同
様にして培養して菌数を測定した。その結果を第３表に
示す。
一水素二カリウム0.25％を含む基礎培地に種々の濃度で
牛胆汁末を添加した培地にE.coliを接種し、実験１と同
様にして培養して菌数を測定した。その結果を第３表に
示す。
この実験から、牛胆汁末は大腸菌群以外の微生物の生
育を抑制するばかりでなく、大腸菌群の生育を促進させ
ること、並びにその培地中の最適濃度は1.0〜2.0％であ
ることが見出された。
育を抑制するばかりでなく、大腸菌群の生育を促進させ
ること、並びにその培地中の最適濃度は1.0〜2.0％であ
ることが見出された。
更にまた、大腸菌群の生育に有用であることが予想さ
れる成分について次の実験を行った。
れる成分について次の実験を行った。
実験３ 実験２の基礎培地に牛胆汁末1.5％を添加した培地
（牛胆汁末添加基礎培地）に各物質を添加した第４表に
示す培地にE.coliを接種し、実験１と同様にして培養後
菌数を測定した。その結果を第５表に示す。
（牛胆汁末添加基礎培地）に各物質を添加した第４表に
示す培地にE.coliを接種し、実験１と同様にして培養後
菌数を測定した。その結果を第５表に示す。
この実験の結果、牛胆汁末添加基礎培地に硝酸カリウ
ム及びピルビン酸ナトリウムを添加した培地が、ジェネ
レイションタイム及び増殖率において優れていた。
ム及びピルビン酸ナトリウムを添加した培地が、ジェネ
レイションタイム及び増殖率において優れていた。
本発明の培地において、ピルビン酸ナトリウムは、菌
体内で各種の代謝経路を結ぶ重要な中間生成物で、ピル
ビン酸を添加することにより、菌体内活性を促進する作
用をするものであり、その添加量は0.05〜5.0％が好ま
しい。また硝酸カリウムはエネルギー獲得手段として大
腸菌群にとって重要であり、その添加量は0.05〜1.0％
が好ましい。
体内で各種の代謝経路を結ぶ重要な中間生成物で、ピル
ビン酸を添加することにより、菌体内活性を促進する作
用をするものであり、その添加量は0.05〜5.0％が好ま
しい。また硝酸カリウムはエネルギー獲得手段として大
腸菌群にとって重要であり、その添加量は0.05〜1.0％
が好ましい。
以上の組成の本発明培地は大腸菌群の増殖が速いの
で、これに４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド〔4-MUGal〕又は４−メチル−ウンベリフェ
リル−β−Ｄ−グルクロニド〔4-MUGul〕を含有せしめ
れば優れた大腸菌検出用培地が得られる。
で、これに４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド〔4-MUGal〕又は４−メチル−ウンベリフェ
リル−β−Ｄ−グルクロニド〔4-MUGul〕を含有せしめ
れば優れた大腸菌検出用培地が得られる。
本発明で大腸菌群とは、ラクトースを分解する能力を
有する一群の微生物で、エシェリキヤ属、サイトロバク
ター属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、セラチ
ヤ属に属するものである。
有する一群の微生物で、エシェリキヤ属、サイトロバク
ター属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、セラチ
ヤ属に属するものである。
本発明の培地の基質である4-MUGal及び4-MUGulは培地
中に10-4Ｍ〜10-2Ｍ程度添加するのが好ましい。
中に10-4Ｍ〜10-2Ｍ程度添加するのが好ましい。
本発明の大腸菌群検出用培地を用いて、被検体中の大
腸菌群の存在を検出するには、当該培地に被検体を加え
て約37℃で数時間〜十数時間培養する。基質の4-MUGal
及び4-MUGulは無色であるが、被検体中に大腸菌群が存
在すると、これが産生するβ−ガラクトシダーゼの作用
によって４−メチル−ウンベリフェロン（4-MU）が生成
され、4-MUは、蛍光性物質であり、330nmの波長で励起
されて、450nmの蛍光を発するので、これを測定するこ
とにより大腸菌群の存在を確認することができる。
腸菌群の存在を検出するには、当該培地に被検体を加え
て約37℃で数時間〜十数時間培養する。基質の4-MUGal
及び4-MUGulは無色であるが、被検体中に大腸菌群が存
在すると、これが産生するβ−ガラクトシダーゼの作用
によって４−メチル−ウンベリフェロン（4-MU）が生成
され、4-MUは、蛍光性物質であり、330nmの波長で励起
されて、450nmの蛍光を発するので、これを測定するこ
とにより大腸菌群の存在を確認することができる。
次に実施例を挙げて説明する。
実施例１ 下記組成の本発明大腸菌群検出用培地を調整した。
トリプチケースペプトン（BBL） 10g フィトンペプトン（BBL） 5g 塩化ナトリウム 5g 酵母エキス（Difco） 5g グリセロール 10g リン酸一水素二カリウム 2.5g ピルビン酸ナトリウム 1g 硝酸カリウム 1g 牛胆汁末 15g 寒天 3g 4-MUGul １×10-3モル イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド １×10-3モル 精製水 1000ml pH7.0±0.1 実施例２ ハートインフュージョン培地に4-MUGul 1×10-3モル
及びイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド１×
10-3モルを添加した培地及び実施例１の大腸菌群検出用
培地を用いて初発菌数と蛍光発現時間との関係を比較し
た。その結果を表−１に示す。
及びイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド１×
10-3モルを添加した培地及び実施例１の大腸菌群検出用
培地を用いて初発菌数と蛍光発現時間との関係を比較し
た。その結果を表−１に示す。
なお、比較方法は両方の培地を96穴透明Ｕプレートに
100μｌずつ分注しておき、各濃度の菌を100μｌ接種
し、MTP-32 MICROPLATE READER（CORONA）で蛍光の発現
する時間を一時間ごとに測定した。
100μｌずつ分注しておき、各濃度の菌を100μｌ接種
し、MTP-32 MICROPLATE READER（CORONA）で蛍光の発現
する時間を一時間ごとに測定した。
実施例３ 実施例２と同じ培地を用いて、食肉製品における初発
菌数と蛍光発現時間との関係を比較した。比較方法は実
施例２と同様にして行った。その結果を表−２に示す。
菌数と蛍光発現時間との関係を比較した。比較方法は実
施例２と同様にして行った。その結果を表−２に示す。
実施例４ 実施例２と同じ培地を用いて、市販食肉及び食肉製品
の大腸菌群の検査を行った。その結果を表−３に示す。
の大腸菌群の検査を行った。その結果を表−３に示す。
検査方法は両方の培地を96穴透明Ｕプレートに100μ
ｌずつ分注しておき、そこにストマッカーで処理した検
体原液100μｌを接種し、37℃で培養しながら一時間ご
とにMTP-32 MICROPLATE READER（CORONA）で測定し蛍光
発現時間を計った（プレート法）。それと同時に、検体
原液を適当に希釈しデゾキシコレート培地で混釈し（De
so混釈法）大腸菌群のコロニー発現数を測定した。
ｌずつ分注しておき、そこにストマッカーで処理した検
体原液100μｌを接種し、37℃で培養しながら一時間ご
とにMTP-32 MICROPLATE READER（CORONA）で測定し蛍光
発現時間を計った（プレート法）。それと同時に、検体
原液を適当に希釈しデゾキシコレート培地で混釈し（De
so混釈法）大腸菌群のコロニー発現数を測定した。
プレート法は従来のDeso混釈法とよく一致しているの
がよくわかり、しかもDeso混釈法は最低18時間の培養時
間が必要だが、プレート法は最高８時間で大腸菌群の確
認ができた。更に、ハートインフュージョンを使用する
よりも本発明の培地を使用した方が明かに蛍光発現時間
の短縮が認められる。
がよくわかり、しかもDeso混釈法は最低18時間の培養時
間が必要だが、プレート法は最高８時間で大腸菌群の確
認ができた。更に、ハートインフュージョンを使用する
よりも本発明の培地を使用した方が明かに蛍光発現時間
の短縮が認められる。
〔発明の効果〕 本発明の培地は大腸菌群をジェネレイションタイムが
速く、増殖率がよく、ラッグフェイズがなく増殖させる
ことができ、大腸菌群の検出用培地として有利に使用で
きる。
速く、増殖率がよく、ラッグフェイズがなく増殖させる
ことができ、大腸菌群の検出用培地として有利に使用で
きる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｑ 1/10 Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｑ 1/10 Ｃ１２Ｒ 1:425） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 1/20 C12Q 1/10 ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ
Claims (2)
- 【請求項１】重量で、ペプトン1.0〜2.5％、塩化ナトリ
ウム0.25〜0.5％、酵母エキス0.4〜0.6％、グリセロー
ル0.5〜1.5％、リン酸一水素二カリウム0.2〜0.5％、ピ
ルビン酸ナトリウム0.05〜5.0％、硝酸カリウム0.05〜
1.0％、牛胆汁末1.0〜2.0％及び寒天0.1〜0.3％を含有
する大腸菌群増殖用培地。 - 【請求項２】重量で、ペプトン1.0〜2.5％、塩化ナトリ
ウム0.25〜0.5％、酵母エキス0.4〜0.6％、グリセロー
ル0.5〜1.5％、リン酸一水素二カリウム0.2〜0.5％、ピ
ルビン酸ナトリウム0.05〜5.0％、硝酸カリウム0.05〜
1.0％、牛胆汁末1.0〜2.0％、寒天0.1〜0.3％及び４−
メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド又は
４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド
を含有する大腸菌群検出用培地。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15706490A JP2913419B2 (ja) | 1990-06-15 | 1990-06-15 | 大腸菌群の増殖及び検出用培地 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15706490A JP2913419B2 (ja) | 1990-06-15 | 1990-06-15 | 大腸菌群の増殖及び検出用培地 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0451890A JPH0451890A (ja) | 1992-02-20 |
| JP2913419B2 true JP2913419B2 (ja) | 1999-06-28 |
Family
ID=15641430
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15706490A Expired - Lifetime JP2913419B2 (ja) | 1990-06-15 | 1990-06-15 | 大腸菌群の増殖及び検出用培地 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2913419B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6391578B2 (en) | 1997-04-09 | 2002-05-21 | 3M Innovative Properties Company | Method and devices for partitioning biological sample liquids into microvolumes |
| US6984499B2 (en) * | 1997-10-02 | 2006-01-10 | Idexx Laboratories, Inc. | Method and apparatus for concurrently detecting pathogenic organisms and antimicrobial susceptibility |
| US6174699B1 (en) | 1999-03-09 | 2001-01-16 | 3M Innovative Properties Company | Disc assay device with inoculation pad and methods of use |
| JP2008075088A (ja) * | 2000-04-17 | 2008-04-03 | Mitsubishi Chemicals Corp | 臭気成分が低減された抗酸化剤 |
| CA2690809A1 (en) * | 2007-06-15 | 2008-12-24 | Microphage Incorporated | Method of detection of microorganisms with enhanced bacteriophage amplification |
-
1990
- 1990-06-15 JP JP15706490A patent/JP2913419B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0451890A (ja) | 1992-02-20 |
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