JP3195432B2 - Ｅ．ｃｏｌｉの迅速検出法 - Google Patents
Ｅ．ｃｏｌｉの迅速検出法Info
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- JP3195432B2 JP3195432B2 JP22025392A JP22025392A JP3195432B2 JP 3195432 B2 JP3195432 B2 JP 3195432B2 JP 22025392 A JP22025392 A JP 22025392A JP 22025392 A JP22025392 A JP 22025392A JP 3195432 B2 JP3195432 B2 JP 3195432B2
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- medium
- coli
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- glucuronide
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は尿、その他の臨床材料、
食品、医薬品、化粧品、飲料水等にＥ．ｃｏｌｉが存在
するか否かを簡便、迅速かつ正確に判定する方法に関す
る。
食品、医薬品、化粧品、飲料水等にＥ．ｃｏｌｉが存在
するか否かを簡便、迅速かつ正確に判定する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】Ｅ．ｃｏｌｉは大腸菌群の中でも代表的
な病原性の強い細菌であり、食品、薬品、臨床材料等の
中にＥ．ｃｏｌｉが存在するか否かを判定することは、
臨床細菌検査上及び微生物学的品質管理上重要である。
従来から行われているＥ．ｃｏｌｉの検出法としては、
マッコンキー培地等の腸内細菌の鑑別培地を用いて２４
時間培養した後発育した菌のコロニーを確認し、さらに
種々の生化学的性状を同定する方法又は４−メチル−ウ
ンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド等の蛍光基質を
用いて判定する方法等がある。
な病原性の強い細菌であり、食品、薬品、臨床材料等の
中にＥ．ｃｏｌｉが存在するか否かを判定することは、
臨床細菌検査上及び微生物学的品質管理上重要である。
従来から行われているＥ．ｃｏｌｉの検出法としては、
マッコンキー培地等の腸内細菌の鑑別培地を用いて２４
時間培養した後発育した菌のコロニーを確認し、さらに
種々の生化学的性状を同定する方法又は４−メチル−ウ
ンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド等の蛍光基質を
用いて判定する方法等がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、生化学
的性状により同定する方法は操作が煩雑であるとともに
その実施には熟練を要するとともに時間がかかるという
問題があった。また、蛍光基質を用いる方法は、生成し
た蛍光物質に紫外線を照射して励起された蛍光強度を計
測するという操作が必要であり、簡便性の面で充分満足
できるものではなかった。従って、本発明の目的は簡便
な操作で、迅速かつ正確にＥ．ｃｏｌｉを検出する方法
を提供することにある。
的性状により同定する方法は操作が煩雑であるとともに
その実施には熟練を要するとともに時間がかかるという
問題があった。また、蛍光基質を用いる方法は、生成し
た蛍光物質に紫外線を照射して励起された蛍光強度を計
測するという操作が必要であり、簡便性の面で充分満足
できるものではなかった。従って、本発明の目的は簡便
な操作で、迅速かつ正確にＥ．ｃｏｌｉを検出する方法
を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記実状に
鑑み、簡便性、迅速性を求めて培地、着色性基質を種々
検討した結果、着色性基質である５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド又はその塩
を添加した特定組成の培地を用いれば、短時間の簡便な
操作で高感度にＥ．ｃｏｌｉを検出できることを見出
し、本発明を完成するに至った。
鑑み、簡便性、迅速性を求めて培地、着色性基質を種々
検討した結果、着色性基質である５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド又はその塩
を添加した特定組成の培地を用いれば、短時間の簡便な
操作で高感度にＥ．ｃｏｌｉを検出できることを見出
し、本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は重量で、ペプトン１．
０〜２．５％、塩化ナトリウム０．２５〜０．５％、酵
母エキス０．４〜０．６％、リン酸一水素二カリウム
０．２〜０．５％、ピルビン酸ナトリウム０．０５〜
５．０％、硝酸カリウム０．０５〜１．０％、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニ
ド又はその塩、並びにドデシル硫酸ナトリウム０．０１
〜１．０％及び／又は牛胆汁末１．０〜２．０％を含有
する培地に被検体を加えて培養し、当該培地の着色の有
無を検出することを特徴とするＥ．ｃｏｌｉ検出法を提
供するものである。また、本発明は上記成分を含有する
Ｅ．ｃｏｌｉ検出用培地を提供するものである。
０〜２．５％、塩化ナトリウム０．２５〜０．５％、酵
母エキス０．４〜０．６％、リン酸一水素二カリウム
０．２〜０．５％、ピルビン酸ナトリウム０．０５〜
５．０％、硝酸カリウム０．０５〜１．０％、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニ
ド又はその塩、並びにドデシル硫酸ナトリウム０．０１
〜１．０％及び／又は牛胆汁末１．０〜２．０％を含有
する培地に被検体を加えて培養し、当該培地の着色の有
無を検出することを特徴とするＥ．ｃｏｌｉ検出法を提
供するものである。また、本発明は上記成分を含有する
Ｅ．ｃｏｌｉ検出用培地を提供するものである。
【０００６】本発明のＥ．ｃｏｌｉ検出用培地に配合さ
れる５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−グルクロニド又はその塩は、着色性基質であり、Ｅ．
ｃｏｌｉが発育する段階で特異的に産生する酵素、すな
わちグルクロニダーゼにより分解し、下記反応式の如く
青色又は青緑色を呈する縮合体を生成する。
れる５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−グルクロニド又はその塩は、着色性基質であり、Ｅ．
ｃｏｌｉが発育する段階で特異的に産生する酵素、すな
わちグルクロニダーゼにより分解し、下記反応式の如く
青色又は青緑色を呈する縮合体を生成する。
【０００７】
【化１】
【０００８】かかる反応により、培地上のＥ．ｃｏｌｉ
が産生した酵素が存在する範囲が着色し、培地（通常寒
天平板）上に形成された実際のコロニーの大きさよりも
見かけ上大きい範囲が着色する。従って、より早期に肉
眼によるコロニーの確認が可能となる。
が産生した酵素が存在する範囲が着色し、培地（通常寒
天平板）上に形成された実際のコロニーの大きさよりも
見かけ上大きい範囲が着色する。従って、より早期に肉
眼によるコロニーの確認が可能となる。
【０００９】５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
−β−Ｄ−グルクロニドの塩としては、シクロヘキシル
アンモニウム塩が好ましい。また、当該基質の培地中へ
の配合量は、１×１０-4〜１×１０-2Ｍが好ましい。
−β−Ｄ−グルクロニドの塩としては、シクロヘキシル
アンモニウム塩が好ましい。また、当該基質の培地中へ
の配合量は、１×１０-4〜１×１０-2Ｍが好ましい。
【００１０】本発明の培地には上記基質以外にペプト
ン、塩化ナトリウム、酵母エキス、リン酸一水素二カリ
ウム、ピルビン酸ナトリウム、硝酸カリウム、並びにド
デシル硫酸ナトリウム及び／又は牛胆汁末が含まれる
が、ドデシル硫酸ナトリウム及び牛胆汁末はそれぞれ単
独又は混合して配合してもよいが、いずれか一方を配合
するのが好ましい。また、本発明培地にはさらにグリセ
ロールを０．５〜１．５重量％配合することもできる。
ン、塩化ナトリウム、酵母エキス、リン酸一水素二カリ
ウム、ピルビン酸ナトリウム、硝酸カリウム、並びにド
デシル硫酸ナトリウム及び／又は牛胆汁末が含まれる
が、ドデシル硫酸ナトリウム及び牛胆汁末はそれぞれ単
独又は混合して配合してもよいが、いずれか一方を配合
するのが好ましい。また、本発明培地にはさらにグリセ
ロールを０．５〜１．５重量％配合することもできる。
【００１１】本発明の培地は、前記成分を混合して液体
培地として用いることもできるが、これに寒天０．１〜
１．５重量％配合して寒天培地として用いるのが好まし
い。
培地として用いることもできるが、これに寒天０．１〜
１．５重量％配合して寒天培地として用いるのが好まし
い。
【００１２】本発明のＥ．ｃｏｌｉ検出用培地を用い
て、被検体中のＥ．ｃｏｌｉの存在を検出するには、当
該培地に被検体を加えて３０〜４４．５℃で数時間〜十
数時間培養した後、当該培地の着色の有無を肉眼観察す
ればよい。
て、被検体中のＥ．ｃｏｌｉの存在を検出するには、当
該培地に被検体を加えて３０〜４４．５℃で数時間〜十
数時間培養した後、当該培地の着色の有無を肉眼観察す
ればよい。
【００１３】ここで被検体としては尿、血漿等の臨床材
料、食品、薬品、化粧品、飲料等が挙げられるが、これ
らの検体を予めトリプトソーヤブイヨン等の培地で培養
した培養液を用いることもできる。
料、食品、薬品、化粧品、飲料等が挙げられるが、これ
らの検体を予めトリプトソーヤブイヨン等の培地で培養
した培養液を用いることもできる。
【００１４】
【実施例】以下、実施例を挙げてさらに詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１５】実施例１ 臨床材料の尿から分離した表２記載の菌株をトリプトソ
ーヤブイヨンで３７℃、２４時間培養した。この培養液
１０μl を下記表１の培地に画線塗抹後、３７℃、２４
時間培養し、培地の着色の有無を肉眼観察した。その結
果を表２に示す。
ーヤブイヨンで３７℃、２４時間培養した。この培養液
１０μl を下記表１の培地に画線塗抹後、３７℃、２４
時間培養し、培地の着色の有無を肉眼観察した。その結
果を表２に示す。
【００１６】
【表１】
【００１７】
【表２】
【００１８】表２から明らかなように、Ｅ．ｃｏｌｉは
１００％着色が観察されたのに対し、他の菌株では全く
着色が見られず、本発明方法が正確であることが確認さ
れた。
１００％着色が観察されたのに対し、他の菌株では全く
着色が見られず、本発明方法が正確であることが確認さ
れた。
【００１９】実施例２ Ｅ．ｃｏｌｉの臨床分離株６５株をトリプトソーヤブイ
ヨンで３７℃、２４時間培養した。この培養液１０μl
を表１の組成α培地又はマッコンキー培地に画線塗抹
後、３７℃、２４時間培養し、培地の着色の有無を肉眼
観察した。その結果を表３に示す。
ヨンで３７℃、２４時間培養した。この培養液１０μl
を表１の組成α培地又はマッコンキー培地に画線塗抹
後、３７℃、２４時間培養し、培地の着色の有無を肉眼
観察した。その結果を表３に示す。
【００２０】
【表３】
【００２１】表３から明らかなように、本発明培地を用
いた場合には１００％着色したのに対し、マッコンキー
培地を用いた場合には７株が赤濁せず、陽性と判断でき
なかった。
いた場合には１００％着色したのに対し、マッコンキー
培地を用いた場合には７株が赤濁せず、陽性と判断でき
なかった。
【００２２】実施例３ 表４及び表５に示した菌株をトリプトソーヤブイヨンで
３７℃、２４時間培養した。この培養液１０μl を表１
記載の培地、ペプトンタージトール培地〔Ｊ．Ｆｏｏｄ
Ｐｒｏｔ．，５１，４０２〜４０４（１９８８）に記
載の培地〕、ラウリルトリプトース培地〔Ａｐｐｌ．Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４，１８７４
〜１８７５（１９８８）に記載の培地〕又はｍＴＥＣ培
地〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，５４，１８７４〜１８７５（１９８８）に記載の
培地〕に画線塗抹後、３７℃、２４時間培養し、各菌株
の発育と発色を比較した。その結果を表４及び表５に示
す。
３７℃、２４時間培養した。この培養液１０μl を表１
記載の培地、ペプトンタージトール培地〔Ｊ．Ｆｏｏｄ
Ｐｒｏｔ．，５１，４０２〜４０４（１９８８）に記
載の培地〕、ラウリルトリプトース培地〔Ａｐｐｌ．Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４，１８７４
〜１８７５（１９８８）に記載の培地〕又はｍＴＥＣ培
地〔Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，５４，１８７４〜１８７５（１９８８）に記載の
培地〕に画線塗抹後、３７℃、２４時間培養し、各菌株
の発育と発色を比較した。その結果を表４及び表５に示
す。
【００２３】
【表４】
【００２４】
【表５】
【００２５】表４及び表５から明らかなように、本発明
培地を用いればＥ．ｃｏｌｉの場合のみ発育及び発色と
もに観察され、他の培地を用いた場合には発色が充分で
なかったり、発育が悪かったりし、感度及び精度に欠け
ていた。
培地を用いればＥ．ｃｏｌｉの場合のみ発育及び発色と
もに観察され、他の培地を用いた場合には発色が充分で
なかったり、発育が悪かったりし、感度及び精度に欠け
ていた。
【００２６】
【発明の効果】本発明の検出方法によれば、Ｅ．ｃｏｌ
ｉを短時間の簡便な操作で、感度よくかつ確実に検出す
ることができる。
ｉを短時間の簡便な操作で、感度よくかつ確実に検出す
ることができる。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−51900（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−2596（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−14699（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／12888（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/20
Claims (2)
- 【請求項１】 重量で、ペプトン１．０〜２．５％、塩
化ナトリウム０．２５〜０．５％、酵母エキス０．４〜
０．６％、リン酸一水素二カリウム０．２〜０．５％、
ピルビン酸ナトリウム０．０５〜５．０％、硝酸カリウ
ム０．０５〜１．０％、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−グルクロニド又はその塩、並びに
ドデシル硫酸ナトリウム０．０１〜１．０％及び／又は
牛胆汁末１．０〜２．０％を含有する培地に被検体を加
えて培養し、当該培地の着色の有無を検出することを特
徴とするＥ．ｃｏｌｉ検出法。 - 【請求項２】 重量で、ペプトン１．０〜２．５％、塩
化ナトリウム０．２５〜０．５％、酵母エキス０．４〜
０．６％、リン酸一水素二カリウム０．２〜０．５％、
ピルビン酸ナトリウム０．０５〜５．０％、硝酸カリウ
ム０．０５〜１．０％、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−グルクロニド又はその塩、並びに
ドデシル硫酸ナトリウム０．０１〜１．０％及び／又は
牛胆汁末１．０〜２．０％を含有するＥ．ｃｏｌｉ検出
用培地。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22025392A JP3195432B2 (ja) | 1992-08-19 | 1992-08-19 | Ｅ．ｃｏｌｉの迅速検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22025392A JP3195432B2 (ja) | 1992-08-19 | 1992-08-19 | Ｅ．ｃｏｌｉの迅速検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0662893A JPH0662893A (ja) | 1994-03-08 |
| JP3195432B2 true JP3195432B2 (ja) | 2001-08-06 |
Family
ID=16748294
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22025392A Expired - Lifetime JP3195432B2 (ja) | 1992-08-19 | 1992-08-19 | Ｅ．ｃｏｌｉの迅速検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3195432B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6391578B2 (en) | 1997-04-09 | 2002-05-21 | 3M Innovative Properties Company | Method and devices for partitioning biological sample liquids into microvolumes |
| US6174699B1 (en) | 1999-03-09 | 2001-01-16 | 3M Innovative Properties Company | Disc assay device with inoculation pad and methods of use |
-
1992
- 1992-08-19 JP JP22025392A patent/JP3195432B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0662893A (ja) | 1994-03-08 |
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|---|---|---|---|
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