AGENTE PARA EL TRATAMIENTO DEL PATOBOLISMO DE HUESOS CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a un nuevo agente para el tratamiento del patobolismo de huesos que tiene gran 5, actividad y alta persistencia. El agente para el tratamiento del patobolismo de huesos de la presente invención tiene excelente actividad terapéutica en el patobolismo de huesos como la osteoporosis , la hipercalcemia, o el reumatismo articular crónico y es útil como un medicamento. 10 ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA Los huesos no sólo tienen la habilidad de soportar el cuerpo, sino que también funcionan como el órgano de almacenamiento más grande del calcio en el organismo y el 99% del calcio presente en el organismo se acumula en los huesos.
15 Además, los huesos siempre se remodelan gracias a acciones opuestas de la resorción y la formación de los huesos. Esto juega un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis del calcio de suero. Se sabe que la activación de los osteoclastos los cuales tienen un papel importante en la
20 resorción de los huesos ocasiona que el flujo excesivo de calcio a la sangre de los huesos interrumpa la homeostasis de calcio en la sangre y provoca la hipercalcemia. La hipercalcemia es una enfermedad que ocurre debido a la osteectopía de un tumor y se espera que el número de pacientes
25 que la sufren aumente de manera que se desea la creación
inmediata de un agente para su tratamiento. En la actualidad, la calcitonina, sus derivados y los derivados de bisfosfonato se usan como agentes para el tratamiento de la hipercalcemia. Sin embargo, su efecto terapéutico no es satisfactorio y se desea el desarrollo de nuevos medicamentos que los reemplacen. Por otro lado, se ha informado que el factor inhibitorio de la osteoclastogénesis (FIOC) (W096/26217) conocido como una proteína que inhibe la diferenciación de los osteoclastos tiene una acción hipocalcémica [Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 245, páginas 382-387 (1998); Endocrinology, Vol. 139, páginas 40112-4015 (1998)]. El FIOC se espera como un agente muy nuevo para el tratamiento de la hipercalcemia. Sin embargo, puesco que es una proteína, el FIOC se metaboliza rápidamente en el organismo. En consecuencia de ello, se ha deseado el desarrollo de una preparación de FIOC que sea más segura y tenga acción mejorada . REVELACIÓN DE LA INVENCIÓN Bajo estas circunstancias, los inventores de la presente invención han hecho una amplia investigación y como resultado, han encontrado que el efecto de FIOC en el patobolismo de huesos puede aumentarse agregando un polisacárido a FIOC para formar una preparación. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un agente para el tratamiento del patobolismo de huesos en el cual el efecto de
&A j t FIOC en el patobolismo de huesos se haya aumentado y el efecto se haya vuelto persistente. La presente invención se refiere a un agente para el tratamiento del patobolismo de huesos que comprende por lo 5 menos tanto una sustancia seleccionada del grupo que consta del factor inhibitorio de la osteoclastogénesis (FIOC) , sus homólogos y sus variantes, como un polisacárido o sus derivados . En la presente invención, se prefiere la heparina como el 10 polisacárido anterior y se prefiere el sulfato de dextrano como el derivado de polisacárido anterior. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un agente terapéutico que tiene una excelente acción en el patobolismo de huesos como la osteoporosis, la hipercalcemia,
15 o. el reumatismo articular crónico y la persistencia de la actividad. El agente terapéutico es útil como un medicamento. La presente invención se refiere a un método para aumentar la actividad del factor inhibitorio de la osteoclastogénesis usando un polisacárido o sus derivados.
20 El FIOC usado en la presente invención es de tipo natural o recombinante obtenido por el método descrito en W096/26217 y su origen particularmente no está limitado. Sin embargo, el
FIOC particularmente preferido es el FIOC de tipo humano. Un
FIOC de tipo natural o recombinante incluye un tipo de
25 monómero que tiene un peso molecular de aproximadamente 60 kDa
y un tipo de dímero que tiene un peso molecular de casi 120 kDa según lo medido por SDS-PAGE bajo condiciones sin reducción. En la presente invención, pueden usarse los análogos y las variantes de FIOC. Los homólogos incluyen aquellos que se obtienen de la preparación de una biblioteca de cADN usando Poli (A)+ ARN de células IMR-90 (ATCC CCL-186) , obteniendo cADN del homólogo mediante un método de hibridación usando un fragmento de cADN de FIOC como una sonda, insertando el cADN a un vector de expresión, introduciendo el vector en un huésped generalmente usado, expresando el cADN en el huésped y purificando la proteína expresada mediante un método convencional. Más específicamente, los homólogos incluyen FIOC2, FTOC3, FIOC4 , u FIOC 5 como se describe en 096/26217. Como se describe en W096/26217, entre estos, FI0C2 tiene una supresión de 21 bp de la 265a guanina a la 285a guanina en la secuencia de base de cADN de FIOC y una supresión de 7 aminoácidos del 68° ácido glutámico (Glu) a la 74a glutamina (Gln) en la secuencia de aminoácidos. El FIOC3 tiene la misma secuencia de base que el cADN de FIOC excepto para los siguientes. La 9a citidina se reemplaza por guanina y la -19a asparagina (Asn) se reemplaza por lisina (Lys) en la secuencia de aminoácidos. Sin embargo, esta es la substitución de aminoácidos en la secuencia de señales y se considera que no tiene influencia en FIOC3 para que sea
- »*----«—"'- secretado. Además, FI0C3 tiene una supresión de 117 bp de la
872a guanina a la 988a guanina en la secuencia de base de cADN de FIOC y una supresión de 39 aminoácidos de la 270a treonina
(Thr) a la 308 leucina (Leu) en la secuencia de aminoácidos.
5 FIOC4 tiene la misma secuencia de base que el cADN de
FIOC excepto para los siguientes. La 9a citidina se reemplaza por guanina y la -19a asparagina (Asn) se reemplaza por lisina
(Lys) en la secuencia de aminoácidos. La 22° guanina se reemplaza por timidina y la -14a alanina (Ala) se reemplaza
10 por serina (Ser) en la secuencia de aminoácidos de FIOC. Sin embargo, esta es la substitución de aminoácidos en la secuencia de señales y se considera que no tiene influencia en FIOC4 para que sea secretado. Además, hay una inserción de intrón 2 de aproximadamente 4 kb entre el 400° y 401° en la
15 secuencia de base de cADN de FIOC y el esquema de lectura abierta se termina ahí. En la secuencia de aminoácidos, después de la 112a alanina (Ala) de la secuencia de aminoácidos de FIOC se agrega una nueva secuencia de aminoácidos que consta de 21 aminoácidos. 20 El FIOC5 tiene la misma secuencia de base que el cADN de
FIOC excepto para los siguientes. La 9a citidina se reemplaza por guanina y la -19a asparagina (Asn) se reemplaza por lisina (Lys) en la secuencia de aminoácidos. Sin embargo, esta es la substitución de aminoácidos en la secuencia de señales y se
25 considera que no tiene influencia en FIOC5 para que sea
-""-•*-"-—»*«* secretado. Además, hay una inserción de la última mitad de intrón 2 de aproximadamente 1.8 kb entre el 400° y 401° en la secuencia de base de cADN de FIOC y el esquema de lectura abierta se termina ahí. En la secuencia de aminoácidos, 5 después de la 112a alanina (Ala) de la secuencia de aminoácidos de FIOC se agrega una nueva secuencia de aminoácidos que consta de 12 aminoácidos. Las variantes incluyen aquellas en las que uno o más aminoácidos se han insertado en, agregado a, substituido en,
10 o suprimido de la secuencia de aminoácidos de FIOC. Más específicamente, las variantes incluyen aquellas que se obtienen de la preparación de cADN de variante de FIOC introduciendo la substitución o mutación por supresión por un método PCR o hendidura con una enzima de restricción,
15 insertando el cADN a un vector de expresión, incorporando el vector a un huésped generalmente usado, expresando el cADN en el huésped y purificando la proteína expresada por un método convencional . El polisacárido usado en la presente invención es un
20 polímero (glucano) formado gracias al enlace de glucósidos de los monosacáridos y de preferencia es un heteropolisacárido
(heteroglucano) teniendo 2 o más monosacáridos componentes. Más específicamente, los polisacáridos que pueden usarse incluyen polisacáridos naturales como ácido hialurónico,
25 condroitinsulfato, dermatansulfato, heparansulfato, queratán
-,-? - iHniritHiiliriliftiritT' iTpr sulfato, carrageenina, pectina y heparina, polisacáridos sintéticos como dextrano y derivados de polisacáridos sintéticos como sulfato de dextrano. De preferencia, particularmente se usa el éster de sulfato de glucano. Por ejemplo, se usa la heparina que tiene un peso molecular de 3,000 a 6,000 o el sulfato de dextrano que tiene un peso molecular de 5,000 a 10,000. El agente para el tratamiento del patobolismo de huesos de la presente invención de preferencia es una combinación de por lo menos una sustancia seleccionada del grupo que consta de FIOC, sus homólogos y sus variantes y un polisacárido o sus derivados en una proporción de 1 a 100 veces, particularmente de 1 a 16 veces en una cantidad del polisacárido o sus derivados al FIOC, sus derivados, o variantes. La preparación de la presente invención que comprende una combinación de por lo menos una sustancia seleccionada del grupo que consta de FIOC, sus análogos y sus variantes y un polisacárido o sus derivados es un agente para el tratamiento del patobolismo de huesos que tiene una excelencia persistencia y un gran efecto terapéutico en comparación con la administración de FIOC sólo y es eficaz en el patobolismo de huesos como la osteoporosis, la hipercalcemia, o el reumatismo articular crónico. La preparación de la presente invención se administra sin peligro en forma oral o parenteral a humanos o animales como un medicamento . La administración parenteral incluye inyección
-.-^-tt-d-^ -^ .^ ..^-^-fc-UMÜÜI intravenosa, inyección intramuscular, inyección subcutánea, administración nasal , administración intraoral , administración permucomembranosa, etc. Las preparaciones que se administrarán por estas vías de administración pueden formularse mediante un método conocido de producción farmacéutica y administrarse junto con vehículos, excipientes, lubricantes, colorantes, etc., farmacológicamente aceptables como una preparación de una composición médica. Cuando se prepara una inyección, se agregan FIOC y un polisacárido, opcionalmente un ajustador de pH, un amortiguador, un estabilizador, un solubilizante, etc., para formar inyecciones mediante un método convencional. En este caso, pueden usarse aditivos conocidos como la albúmina sérica humana y un tensioactivo en combinación. Como el tensioactivo, se citan polianiones y tensioactivos aniónicos. La inyección puede distribuirse en viales para formar una preparación de solución o prepararse como una preparación liofilizada la cual en el uso se disuelve en agua destilada, solución salina fisiológica o similar en el momento adecuado. En la administración de FIOC a ratas normales, una vez al día durante 2 semanas continuas en una dosis de 3 ó 24 mg/kg- día, se observaron aumentos en la densidad y cantidad ósea, respectivamente, pero no se observó ningún trastorno histopatológico en 38 tejidos ni cambios en la sangre [H. Yasuda y colaboradores : Endocrinology, Vol. 139, páginas 1329-1337 (1998)]. De esta manera, la acción de FIOC es muy específica al hueso y se espera que el FIOC pueda administrarse sin peligro a los humanos. La cantidad y el método de administración del agente para el tratamiento del patobolismo de huesos de la presente invención a los pacientes particularmente no están limitados, ya que pueden variar dependiendo de la severidad del síntoma, de la edad, de la condición del cuerpo y del peso corporal del paciente. Por ejemplo, el agente puede administrarse en forma parenteral de una a varias veces al día en una dosis de aproximadamente 0.01 a 1 mg/kg al día para adultos. La actividad de la preparación de la presente invención puede realizarse midiendo la concentración del calcio de suero. Por ejemplo, la solución de FIOC preparada con un solvente adecuado y agregándose a ella un polisacárido se administra en forma intravenosa a una rata, se recolecta la sangre a tiempo y se mide el nivel de calcio de suero mediante un método convencional . La presente invención se refiere a un método para elevar la actividad del factor inhibitorio de la osteoclastogénesis mediante el uso de un polisacárido o sus derivados. De acuerdo con la presente invención, el nivel de sangre de FIOC puede elevarse para mejorar la acción de FIOC reduciendo el nivel de calcio de suero. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1 muestra el nivel de calcio de suero después de 3 horas a partir de la administración de la preparación que contiene FIOC y un polisacárido en el Ejemplo 2. [Explicación de símbolos] D-l: 0.5 mg/kg FIOC + 2 mg/kg sulfato de dextrano (peso molecular 5,000) D-2: 0.5 mg/kg FIOC + 2 mg/kg sulfato de dextrano (peso molecular 8, 000) D-3: 0.5 mg/kg FIOC + 2 mg/kg sulfato de dextrano (peso molecular 10, 000) H-l: 0.5 mg/kg FIOC + 2 mg/kg heparina (207.8 unidades/mg) H-2: 0.5 mg/kg FIOC + 2 mg/kg heparina (171.2 unidades/mg) H-3 : 0.5 mg/kg FIOC + 2 mg/kg heparina (peso molecular 3,000) H-4: 0.5 mg/kg FIOC + 2 mg/kg heparina (peso molecular 6,000) **: Significativo (valores p 1 %) La Fig. 2 muestra el nivel de calcio de suero después de 3 horas a partir de la administración de FIOC y el polisacárido con varias proporciones de mezcla en el Ejemplo 3. [Explicación de símbolos] **: Significativo (valores p < 1 %) La Fig. 3 muestra el nivel de calcio de suero después de
^^f^^^^t^jgy 3, 6 y 9 horas, respectivamente, a partir de la administración de la preparación que contiene FIOC y un polisacárido en el Ejemplo 4. [Explicación de símbolos] **: Significativo (valores p < 1 %) La Fig. 4 muestra un cambio dependiente del tiempo en el nivel de FIOC en la sangre cuando se administró una preparación que contiene FIOC y un polisacárido en el Ejemplo 5. [Explicación de símbolos] A: Una figura que ilustra el nivel de sangre de FIOC de tipo de dímero. B: Una figura que ilustra el nivel de sangre de FIOC' de tipo de monómero. : FIOC : FIOC + sulfato de dextrano La Fig. 5 muestra un cambio dependiente del tiempo en la proporción de FIOC de tipo de monómero/FIOC de tipo de dímero en la sangre cuando se administró una preparación que contiene FIOC y un polisacárido en el Ejemplo 5. [Explicación de símbolos] A: FIOC B: FIOC + sulfato de dextrano O: FIOC de tipo de dímero : FIOC de tipo de monómero La Fig. 6 muestra el nivel de FIOC en la sangre después de 2 y 4 horas a partir de la administración de una preparación que contiene FIOC y un polisacárido (sulfato de dextrano, pectina de manzana, o pectina cítrica) en el Ejemplo 6. [Explicación de símbolos] : Administración de 0.5 mg/kg FIOC solo : 0.5 mg/kg FIOC + 0.5% sulfato de dextrano : 0.5 mg/kg FIOC + 0.5% pectina de manzana : 0.5 mg/kg FIOC + 0.5% pectina cítrica La Fig. 7 muestra el nivel de FIOC en la sangre después de 2 y 4 horas a partir de la administración de una preparación que contiene FIOC y un polisacárido (sulfato de dextrano, pectina de manzana, o carrageenina) en el Ejemplo 6. [Explicación de símbolos] : Administración de 0.5 mg/kg FIOC solo 0.5 mg/kg FIOC + 0.5% sulfato de dextrano : 0.5 mg/kg FIOC + 0.5% pectina de manzana : 0.5 mg/kg FIOC + 0.5% carrageenina (lambda) La Fig. 8 muestra el nivel de FIOC en la sangre después de la administración intravenosa de una preparación que contiene FIOC y un polisacárido (sulfato de dextrano o pectina de manzana) en el Ejemplo 7. [Explicación de símbolos] : Administración de 50 µg/kg FIOC solo : 50 µg/kg FIOC + 0.1% sulfato de dextrano : 50 µg/kg FIOC + 0.15% pectina de manzana La Fig. 9 muestra el nivel de FIOC en la sangre después de la administración intramuscular de una preparación que 5 contiene FIOC y un polisacárido (sulfato de dextrano o pectina de manzana) en el Ejemplo 7. [Explicación de símbolos] : Administración de 1 mg/kg FIOC solo : 1 mg/kg FIOC + 0.1% sulfato de dextrano 10 : 1 mg/kg FIOC + 0.15% pectina de manzana La Fig. 10 muestra el nivel de calcio de suero después de 4 horas a partir de la administración de una preparación que contiene FIOC y un polisacárido (pectina de manzana) en el Ejemplo 8. 15 EL MEJOR MODO DE REALIZAR LA INVENCIÓN [Ejemplos] Los siguientes ejemplos se presentan en orden para explicar más específicamente la presente invención con ejemplos. Sin embargo, sólo son ilustraciones de concreto y de 20 ninguna manera la presente invención está limitada a ello. [Ejemplo 1] Producción de Invecciones - 1 500 µg de FIOC humano obtenido por el método descrito en 096/26217 y 2 mg de heparina se disolvieron en 5 ml de
25 solución amortiguadora de fosfato de sodio a 10 mM (pH 7.0)
^S^= í§^gg£¡ conteniendo NaCl a 0.15 M y Tween 80 al 0.01% y la solución resultante se esterilizó pasándola a través de un filtro estéril de 0.22 µm (Millex GV, Millipore Co . ) y después se envasó en un vial para obtener inyecciones para inyección intravenosa. Producción de Inyecciones - 2 500 µg de FIOC humano obtenido por el método descrito en W096/26217 y 2 mg de sulfato de dextrano se disolvieron .en 5 ml de solución amortiguadora de fosfato de sodio a 10 mM (pH 7.0) conteniendo NaCl a 0.15 M y Tween 80 al 0.01% y la solución resultante se esterilizó pasándola a través de un filtro estéril de 0.22 µm (Millex GV, Millipore Co . ) y después se envasó en un vial para obtener inyecciones para inyección intravenosa . [Ejemplo 2] Efecto Hipocalcémico de FIOC por la Adición de un Polisacárido - 1 A 2 ml de solución de FIOC humano a 0.25 mg/ml preparada disolviendo el FIOC humano (de tipo de dímero) (FIOC de tipo recombinante obtenido por el método descrito en W096/26217) en solución amortiguadora de fosfato de sodio a 10 mM (pH 7.0) conteniendo NaCl a 0.15 M y Tween 80 al 0.01% (en lo sucesivo, referida como un solvente) , se disolvieron 2 mg de sulfato de dextrano (peso molecular 8,000 ó 10,000: Sigma AB y peso molecular 5,000 ó 50,000: Wako Puré Chemical Industry Co . ,
i Ltd.), o heparina (207.8 ó 171.2 unidad/mg: Wako Puré Chemical Industry Co . , Ltd. y peso molecular 3,000 ó 6,000: Sigma AB) y después la solución se incubó a 4°C durante un día. Al mismo tiempo, se incubaron soluciones de FIOC de tipo humano a 0.25 y 2.5 mg/ml y el solvente a 4°C durante un día. Estas soluciones de muestra de prueba se proporcionaron como grupo administrado de FIOC + sulfato de dextrano (grupo D) , grupo administrado de FIOC + heparina (grupo H) (se administraron el grupo D y el grupo H con 0.5 mg/kg FIOC), grupo administrado de FIOC solo (administrado con 0.5 mg/kg y 5 mg/kg FIOC, respectivamente) y grupo administrado de solvente. A ratas hembras Wistar de cuatro semanas de edad se les administró una sola vez en forma intravenosa las muestras a una dosis de 2 ml/kg. Después de 3 horas a partir de la administración, se recolectó sangre de la cuenca del ojo para preparar el suero. El nivel de calcio en el suero obtenido se midió usando Calcium C Test (Wako Puré Chemical Industry Co . , Ltd.). La Fig. 1 muestra los resultados. Como consecuencia, se observó que la administración de 0.5 mg/kg de FIOC humano al cual se agregó uno de los varios tipos de sulfato de dextrano o heparina presentó un efecto de mejora considerable en la acción hipocalcémica. Por lo tanto, se confirmó que la adición de un polisacárido puede mejorar la acción hipocalcémica del FIOC humano . [Ejemplo 3]
A . y - . . - , — o??.¿*?i? Efecto de la cantidad de polisacárido agregado en la mejora de la acción del FIOC En 2 ml de las soluciones de FIOC humano a 0.25 mg/ml preparadas de la misma forma que en el Ejemplo 2, se disolvió 5 sulfato de dextrano (peso molecular 5,000: Wako Puré Chemical Industry Co . , Ltd.) en una proporción de 1, 2, 4, 8, ó 16 veces en peso, basándose en la cantidad de FIOC respectivamente y las mezclas se incubaron a 4°C durante un día. Del mismo modo, se disolvió heparina (207.8 unidades/mg: 0 Wako Puré Chemical Industry Co . , Ltd.) en 2 ml de soluciones de FIOC humano a 0.25 mg/ml en la misma proporción y las mezclas se incubaron a 4°C durante un día. Además, una solución de sulfato de dextrano o heparina a 4 mg/ml, soluciones de FIOC humano a 0.25 y 2.5 mg/ml y el 5 solvente solo se incubaron del mismo modo a 4°C durante un día. Estas soluciones de muestra de prueba se administraron una sola vez en forma intravenosa a ratas hembras Wistar de cuatro semanas de edad a una dosis de 2 ml/kg. Después de 3 horas a partir de la administración, se recolectó sangre de la 0 cuenca del ojo para preparar el suero. El nivel de calcio en el suero obtenido se midió usando Calcium C Test (Wako Puré Chemical Industry Co . , Ltd.) . El estuche está construido basándose en un método de quelato (método COCP (orthocresol phthalein coplexon (OCPC) ) en el cual el efecto del magnesio 5 se elimina y la especificidad se aumenta con la adición de 8-
^i""-**-^— -• - - - - • - ~**»?* quinolinol. El calcio suscita el color rojo púrpura en el enlace a OCPC bajo condiciones alcalinas. La medición de la absorbencia permite la valoración de la concentración de calcio. La Fig. 2 muestra los resultados. Como consecuencia, 5 se reconoció la acción hipocalcémica considerable cuando se agregó sulfato de dextrano 4 veces tanto como el FIOC humano o más. También se observó acción hipocalcémica considerable cuando se agregó una cantidad equivalente de heparina al FIOC humano. Por lo tanto, se confirmó que la administración 10 simultánea de FIOC humano y un polisacárido en proporciones específicas puede mejorar la acción hipocalcémica de FIOC. [Ejemplo 4] Efecto de mejora en la persistencia de FIOC por la adición de un polisacárido 15 Después de disolver 20 mg de sulfato de dextrano (peso molecular 5,000: Wako Puré Chemical Industry Co . , Ltd.) en 2 ml de solución de FIOC humano a 2.5 mg/ml preparada con el solvente, la mezcla se incubó a 4°C durante un día. También se disolvieron 20 mg de heparina (207.8 unidades/mg: Wako Puré 20 Chemical Industry Co . , Ltd.) en 2 ml de la solución de FIOC humano a 0.25 mg/ml y del mismo modo se incubaron a 4°C durante un día. Además, una solución de FIOC humano a 2.5 mg/ml y el solvente se incubaron a 4°C durante un día. Estas soluciones de muestra de prueba se administraron en forma 25 intravenosa a ratas hembras Wistar de cuatro semanas de edad
^*-*"«***»*>^»* < - - • - - - — - , , . . . -H-rttÉ a una dosis de 2 ml/kg (5 mg/kg como la cantidad de FIOC) respectivamente. Después de 3 , 6 y 9 horas a partir de la administración, se recolectó sangre de la cuenca del ojo para preparar el suero. El nivel de calcio en el suero obtenido se 5 midió usando Calcium C Test (Wako Puré Chemical Industry Co . , Ltd.) . La Fig. 3 muestra los resultados. Como consecuencia, se observó una disminución considerable en el nivel de calcio de suero en el grupo que recibió sólo solución de FIOC humano a 5 mg/kg después de 3 horas a partir de la administración, pero 10 no se observó acción hipocalcémica considerable después de 6 y 9 horas, respectivamente, después de la administración. Por otro lado, la solución de FIOC humano a 2.5 mg/ml a la cual se agregó sulfato de dextrano o heparina, respectivamente, en cantidades 4 veces tanto como el FIOC 15 humano tuvo un efecto hipocalcémico considerable aún después de 9 horas a partir de la administración. Por lo tanto, se confirmó que la adición simultánea de FIOC humano y un polisacárido puede dar un efecto de mejora de persistencia. [Ejemplo 5] 20 Efecto de mejora de polisacáridos agregados en la persistencia del nivel de FIOC en circulación - 1 A 1 ml de la solución de FIOC humano a 1 mg/ml preparada de la misma manera que en el Ejemplo 2, se agregó 1 ml de sulfato de dextrano a 4 mg/ml y la mezcla obtenida se incubó 25 a 4°C durante un día. La solución de muestra de prueba se
^*— * I?* .. . . m i > ^yüir administró en forma intravenosa a ratas Wistar del sexo masculino de 9 semanas de edad a una dosis de 1 ml/kg. Después de 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240, 360, 480, 600, 720 y 1440 minutos a partir de la administración, se recolectó sangre de la cuenca del ojo para preparar suero. El nivel de FIOC humano en el suero obtenido se midió mediante el método ELISA descrito en W096/26217 usando anticuerpos monoclonales capaces de reconocer el FIOC de tipo de dímero, anticuerpos monoclonales capaces de reconocer el FIOC de tipo de monómero (Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 245, páginas 382-387 (1998)). El nivel total de FIOC se calculó como la suma del nivel de FIOC de tipo de dímero y el nivel de FIOC de tipo de monómero. Las Figs. 4 y 5 muestran los resultados. Como consecuencia, en comparación con el grupo que recibió sólo FIOC humano a 500 µg/kg, el grupo que recibió la solución de FIOC humano a la cual se agregó sulfato de dextrano 4 veces tanto como el FIOC humano mantuvo un nivel de FIOC en circulación evidentemente alto (Fig. 4) . Se confirmó que la conversión del FIOC de tipo de dímero a FIOC de tipo de monómero en la sangre se inhibió (Fig. 5) . Por lo tanto, la adición de un polisacárido permite que persista el nivel de FIOC en circulación, en particular el nivel en circulación del FIOC de tipo de dímero que tiene gran actividad hipocalcémica (Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 245, páginas 382-387 (1998)).
[Ejemplo 6] Efecto de mejora de polisacáridos agregados en la persistencia del nivel de FIOC en circulación - 2 A 2 ml de la solución de FIOC humano a 0.25 mg/ml 5 preparada de la misma manera que en el Ejemplo 2, volumen equivalente de solución al 0.5% [solvente: solución amortiguadora de fosfato de sodio a 10 mM (pH 7.0) conteniendo NaCl a 0.15, polisorbato 80 a 0.01%] de sulfato de dextrano, pectina de manzana, o una pectina cítrica (todos los productos
10 de Wako Puré Chemical Industry Co . , Ltd.) y la mezcla obtenida se incubó a temperatura ambiente durante 4 horas para preparar una solución de muestra de prueba. Como un control, del mismo modo la solución sola (2 ml) de FIOC a 0.25 mg/ml se mezcló con el volumen equivalente del solvente y la mezcla se incubó
15 a temperatura ambiente durante 4 horas . Estas soluciones de muestra de prueba se administraron en forma intravenosa a ratas Wistar del sexo masculino de 4 semanas de edad a una dosis de 2 ml/kg. Después de 2 y 4 horas a partir de la administración, se recolectó sangre de la cuenca del ojo bajo
20 eterización para preparar suero. El nivel de FIOC humano en el suero obtenido se midió mediante el método ELISA descrito en W096/26217. La Fig. 6 muestra los resultados. De la misma manera que arriba, se mezclaron 2 ml de solución de FIOC humano a 0.25 mg/ml con solución al 0.5% de
25 sulfato de dextrano, pectina de manzana, o carrageenina
(lambda) (todos los productos de Wako Puré Chemical Industry Co . , Ltd.) y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 4 horas para preparar soluciones de muestra de prueba. Como un control, del mismo modo la solución sola de FIOC a 0.25 mg/ml se mezcló con el volumen equivalente del solvente y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 4 horas. Estas soluciones de muestra de prueba se administraron en forma intravenosa a ratas Wistar del sexo masculino de 4 semanas de edad a una dosis de 2 ml/kg. Después de 2 y 4 horas a partir de la administración, se recolectó sangre de la cuenca del ojo bajo eterización para preparar suero. El nivel de FIOC humano en el suero obtenido se midió mediante el método ELISA descrito en W096/26217. La Fig. '/ muestra los resultados . Como resultado, en comparación con el grupo que recibió sólo solución de FIOC humano, cada uno de los grupos que recibieron la solución de muestra de prueba a la cual se agregó sulfato de dextrano, pectina de manzana y pectina cítrica, respectivamente, mantuvo un nivel de FIOC en circulación evidentemente alto (Fig. 6) . Del mismo modo, el grupo que recibió la solución de muestra de prueba agregándose a ella carrageenina aparentemente mantuvo un nivel alto de FIOC en circulación (Fig. 7) . Por lo tanto, se confirmó que la adición de los polisacáridos permite que persista el nivel de FIOC en circulación.
¡la.^^.. . . ,4. , . -»w [Ejemplo 7] Efecto de mejora de polisacáridos agregados en la persistencia del nivel de FIOC en circulación Usando sulfato de dextrano o pectina de manzana (Wako Puré Chemical Industry Co . , Ltd.) como un polisacárido, se estudió la diferencia en el efecto de la persistencia en el FIOC en circulación debido a la diferencia en la vía de administración. Se prepararon soluciones de FIOC diluidas con un solvente [solución amortiguadora de fosfato de sodio a 10 mM (pH 7.0) conteniendo NaCl a 0.15 M y polisorbato 80 a 0.01%] a 50 µg/ml para administración intravenosa y a 1,000 µg/ml para administración intramuscular. A estas soluciones se agregaron los polisacáridos anteriores, respectivamente, para obtener soluciones de muestra de prueba. En este caso, se agregó sulfato de dextrano a las soluciones de FIOC para administración intravenosa y para administración intramuscular cada una en una concentración de 0.1%. La pectina de manzana se disolvió en el solvente para preparar una solución de 3 mg/ml y la solución se mezcló con el mismo volumen de la solución de FIOC (conteniendo FIOC a 100 µg/ml y 2,000 µg/ml, respectivamente) , para administración intravenosa o administración intramuscular. Las soluciones respectivas se administraron a ratas Wistar del sexo masculino de 4 semanas de edad a una dosis de 1 ml/kg. Se recolectó sangre de la cuenca del ojo bajo eterización para preparar suero después de 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 120, 240 y 360 minutos a partir de la administración para la administración intravenosa y después de 30 minutos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 y 24 horas a partir de la administración para la administración intramuscular. El nivel de FIOC en el suero obtenido se midió mediante el método de ELISA descrito en W096/26217. Las Figs. 8 y 9 muestran los resultados . Como resultado, en la administración intravenosa (Fig. 8) y la administración intramuscular (Fig. 9) de las soluciones de FIOC a las cuales se agregó sulfato de dextrano o pectina de manzana respectivamente, se mantuvo un nivel de FIOC en circulación evidentemente alto. Por lo tanto, se confirmó que la adición de estos polisacáridos permite que se mantenga el nivel de FIOC en circulación y se observa el efecto de mejora en la persistencia del nivel de FIOC sin tomar en cuenta la vía de administración. [Ejemplo 8] Efecto hipocalcémico de FIOC mediante la adición de un polisacárido - 2 A 2 ml de la solución de FIOC humano a 0.25 mg/ml preparada de la misma manera que en el Ejemplo 2 se mezcló con un volumen equivalente de solución de pectina de manzana al 0.5% (Wako Puré Chemical Industry Co . , Ltd.) [solvente: solución amortiguadora de fosfato de sodio a 10 mM (pH 7.0) conteniendo NaCl a 0.15 M, Polisorbato 80 al 0.01%] y la mezcla obtenida se incubó a temperatura ambiente durante 4 horas para preparar una solución de muestra de prueba. Al mismo tiempo, se proporcionaron una solución de mezcla de volumen igual de la solución de FIOC (2 ml del FIOC humano a 0.25 mg/ml) y el solvente y el solvente solo. Las soluciones de muestra de prueba respectivas se administraron en forma intravenosa a ratas Wistar del sexo masculino de 4 semanas de edad a una dosis de 2 ml/kg. Después de 4 horas a partir de la administración, se recolectó sangre de l cuenca del ojo bajo eterización para preparar suero. El nivel de FIOC en el suero obtenido se midió usando Calcium C Test (Wakd Puré Chemical Industry Co . , Ltd.) . La Fig. 10 muestra los resultados. Como consecuencia, el grupo que recibió sólo la solución de FIOC humano a 0.5 mg/kg no mostró efecto hipocalcémico. Sin embargo, en el grupo que recibió el FIOC de tipo humano a 0.5 mg/kg al cual se agregó pectina de manzana, se observó un efecto hipocalcémico considerable. Por lo tanto, se confirmó que la adición de los polisacáridos mejora la acción hipocalcémica del FIOC de tipo humano. APLICABILIDAD INDUSTRIAL De acuerdo con la presente invención, se proporciona un agente para el tratamiento del patobolismo de huesos que comprende por lo menos una sustancia seleccionada del grupo que consta de factor inhibitorio de la osteoclastogénesis, sus homólogos y sus variantes y un polisacárido o sus derivados.
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25 De acuerdo con la presente invención, se proporciona un agente terapéutico que tiene un excelente efecto en el patobolismo de huesos como la osteoporosis, la hipercalcemia, o el reumatismo articular crónico y la persistencia de la actividad. El agente terapéutico es útil como un medicamento.