TW529954B - Agent for treating abnormal bone metabolism - Google Patents

Description

529954 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（1 ) [技術領域] 本發明係有關一種南活性及持效性之新穎骨骼代謝異 常治療劑。本發明之骨骼代謝異常治療劑對骨骼疏鬆症、 高鈣血症、慢性關節風濕症等骨骼代謝異常症具有優良治 療活性為有用的醫藥品。 [背景技術] 骨絡之功能不僅具有支撐身體之能力且為生體内鈣之 最大儲存器官，存在生體内之鈣有99%即儲存於骨骼。 此外，骨骼經常不斷經由骨骼吸收與骨骼形成之相反作 用’擔負維持血清鈣恆定性之重要角色。在骨骼吸收上擔 任重要角色之破骨細胞已知在受活化時，骨骼中過剩之鈣 即流入血液中而破壞血液中鈣之恆定性，因而造成高鈣血 症。南妈血症係由癌轉移至骨絡等而引發之疾病，因此可 以預測患者數將會增加，而亟須開發其治療劑。目前該高 約血症治療劑，係使用降鈣素及其衍生物，或雙磷酸醋柔 化合物。然而，此等物質之治療效果均不夠充分，因此亟 待開發新穎之藥劑來加以取代。 另外，一般所知之破骨細胞分化抑制蛋白性因子的破 骨細胞形成抑制因子（Osteoclastogenesis Inhibitory Factor ; 0CIF)(W096/26217號公報）已揭示具有降低血清 辦之作用（Biochemical and Biophysical Research

Communications, V〇1.245? pp382.387(1998) ; Endocrinology, ν〇1·139，ρρ4012·4015(1998))。雖然 OCIF 為可期待之全 新高鈣血症治療劑，但因〇CIF係蛋白質會在體内快速代 --l·-—-------------- 訂· _ (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1 310940 529954 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 A7 五、發明說明（ 謝因此之故，期望能開發出作用更安定之強力〇CIF製 劑。 [發明之開示] 本發明人等鑑於上述狀況刻意研究之結果，發現於 CIF中添加多糖類予以製劑化，可更增強〇ciF對骨骼 代謝異常症之效果。因此本發明之課題係提供一種骨骼代 謝異常症治療劑’可以更提高咖對骨骼代謝異常症之 效果，且效果更持久。 本發明係關於-種骨路代謝異常症治療劑，係由破骨 細胞形成抑制因子(〇ste〇clast〇genesis触齡―； 〇CIF)、其類似物、或其變異物之群中選擇之—種以上的 物質與多糖類或其衍生物所製成。 本發月中之上述多糖類最好是肝素，而上述多糖類衍 生物最好是硫酸葡聚糖。 依據本發明可提供一種對骨絡疏鬆症、高妈金症、慢 性關節風濕症等骨路代謝異常症有優良活性且具持效性之 治療劑’為有用之醫藥品。 另外，本發明/亦為有關一種使用多糖類及其衍生物以 提高破骨細胞形成抑制因子活性之方法。 本發明所使用之〇CIF可為例如依據⑴號 公報中記載之方法得到的天然型或基因重組型著，但其來 源並無特別限定，而以雜 人體1者較佳。此種天然型或基因 重、且里OCIF係在非還原條件下之中分子量為 約60KDa之單單I#刑 少\ ____—體1 ’或分子量為約120KDa之雙體型。 ^尺度_侧剛 310940 1----------------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 529954 A7 B7 五、發明說明（3 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 又，本發明中之OCIF亦可使用類似物或變異物。類 似物之例可舉例如以IMR-90細胞（ATCC CCL-186)之Poly (A) + RNA製成cDNA基因庫，再將以OCIFcDNA片段作 為探針依據雜合反應法得到的OCIF類似物之cDNA嵌於 表現載體上，再將該載體插入通常使用之寄主内，由寄主 表現後以一般方法精製而得者等等。具體之例可例舉如 W096/26217 號公報中記載之 0CIF2、0CIF3、OCIF4 或 0CIF5。 在W096/26217號公報中記載之此等物質，0CIF2係 在OCIFcDNA之核苷酸序列中欠缺第265號鳥嘌呤至第 2 85號鳥嘌呤的21bp，亦即欠缺OCIF之胺基酸序列上第 68號麩胺酸（Glu)至第74號麩醯胺酸（Gin)的7個胺基酸。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 OCIF3係OCIFcDNA之核苷酸序列中第9號胞嘧啶 變換為鳥嘌呤，亦即胺基酸序列中OCIF之胺基酸序列之 第-19號天冬醯胺酸（Asn)變換為離胺酸（LyS)。然而此點 應只有訊息序列中胺基酸之取代，尚不致影響0CIF3之 分泌。另外，亦有OCIFcDNA核杳酸序列之第872號鳥 嘌呤至第988號鳥嘌呤的117bp欠缺者胺基酸序列則為欠 缺OCIF之胺基酸序列之第270號蘇胺酸（Thr)至第308號 白胺酸的39個胺基酸者。 OCIF4係OCIFcDNA核苷酸序列上第9號胞嘧啶變 換為鳥嗓呤’胺基酸序列中OCIF胺基酸序列之第_ 1 9號 天冬醯胺酸（Asn)變換為離胺酸（Lys)。此外，第22號鳥 嘌呤變換為胸腺嘧啶，胺基酸序列則為〇CIF胺基酸序列 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 3 310940 529954 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4 A7 五、發明說明（4 , 第14遽丙胺酸（Ala)變換為絲胺酸（；§er)。然而僅如此應 有汛息序列中胺基酸之取代，而不致影響〇CiF4之分 必。同時，OCIFcDNA核苷酸序列中第4〇〇號及第4〇1號 間介有約4kb之插入序列2，開放譯讀架構（〇penReading Frame)即在其間終止。胺基酸序列係為由〇CIF胺基酸序 列之第112號丙胺酸（Ala)之後增加21個胺基酸所成之新 穎胺基酸序列。 0CIF5係OCIFcDNA核脊酸序列之第9號胞嘧啶變 換為鳥嘌呤，胺基酸序列中OCIF胺基酸序列之第-19號 天冬醯胺酸（Asn)變換為離胺酸（Lys)。然而此應只有訊息 序列中胺基酸之取代，並不致影響〇CIF5之分泌。另外， OCIFcDNA核苷酸序列中第400號及第4〇1號之間介有約 1.8kb之插入序列2之後半部份，開放譯讀架即在其間終 止。胺基酸序列係為由OCIF胺基酸序列之第112號丙胺 酸（Ala)之後增加12個胺基酸所成之新穎胺基酸序列。 變異物係OCIF之胺基酸序列中嵌入、增加、取代或 欠缺1個以上之胺基酸者。具體言之，可例舉如在 OCIFcDNA上以PCR法或限制酶切斷而取代或導入缺損 變異而製作OCIF變異體cDNA，將該cDNA嵌入表現載 體中，該載體再導入一般使用之寄主内，寄主表現後再以 一般方法純化即可得到該物質。 本發明中使用之多糖類係單糖的配糖體鍵結形成之聚 合物（聚葡萄糖）、以2種以上之單糖組成的雜多糖（雜聚 糠）為佳。具體言之，可使用例如天然多糖類，例如透曰月 本紙張尺度適用—中國國家標準（CNS)A4規格⑵G X 297公釐） 310940 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 訂----- 529954 A7 B7 五、發明說明（1 ) 質酸、硫酸軟骨素（chondroitin sulfate)、硫酸黏多釀素 (dermatan sulfate)、硫酸乙醯肝素、硫酸角質素、鹿角菜 膠、果膠及肝素等，或合成多糖類，可舉例如葡聚糖等， 又，合成多糖類之衍生物，可舉例如硫酸葡聚糖等。尤其 以使用硫酸醋化之聚匍匍糖為佳，例如使用分子量3 〇 〇 〇 至6000之肝素或分子量5000至1〇〇〇〇之硫酸葡聚糖。在 本發明之骨絡代謝異常症治療劑中，由〇CIF、其類似物 或變異物組群的一種以上之物質、及多糖類或其衍生物， 對OCIF、其類似物或其變異物，以其1至1〇〇倍量，尤 其是1至16倍量比例的多糖類或其類似物組成者為佳。 由OCIF、其類似物、或其變異物之群中選擇的i種以上 物質與多糖類或其衍生物組成之本發明製劑，為對例如骨 骼疏鬆症、高鈣血症、慢性關節風濕症等骨骼代謝異常二 有效，為較單獨投與OCIF時更具持效性及治療效果的2 骼代謝異常症治療劑。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明製劑可做為醫藥品安全地對人類或動物 非經口投藥。非經π投藥可例舉如靜脈注射、肌肉内注射: 皮下/主射、經鼻投藥、口腔内投藥、經黏膜投藥等 投藥途徑投藥時，可佑_妞抓A a & 此 J依般所知之製劑學製造法與藥理 容許之基劑、賦形劑、潜湖為丨 从 ^ α潤劑、耆色劑等藥劑共同製 藥品組成物投藥。調製注射劊 醫 表压射劑之％合，OCIF及多糠類 外’可視需要再添加 Η補銘添丨 Ρϋ調即劑，緩衝劑、安定劑、 劑等，應以一般方法·古、、、士 & ^ λ成庄射劑。此時亦可併用人 白蛋白或界面活性劑等一舻 血h __ _般所知之添加劑。界面活性劑 1 310940 529954 A7 五、發明說明（6 ) :舉如聚陰離子類或陰離子性界面活性劑等。注射劑可分 f於玻璃小瓶而成溶液製劑，或製成冷;東乾燥製劑，使用 t再適當以蒸餾水或生理食鹽水等溶解而調製。卿以 每天3或24mg/kg之用* ’ 1曰1次持續2週靜脈内投藥 於正㊉大鼠時，可確認骨骼密度及骨骼量增加，但未觀察 到38組織中有組織病理性異常或血球數之變動等（η

Yasuda et al· · Endocrin〇i〇gy，ν〇1139, ρρ1329· 1337(1998))。因此，預期QCIF的作用對㈣有高度專一 性且可安全地對人類投藥。 本發明之骨骼代謝異常症治療劑在投藥於患者時，投 藥量及投藥方法係視症狀程度 '患者年齡、健康狀態、體 重等條件而異並無特別限定，例如對成人每日以約〇 〇ι 至lmg/kg，1曰1至數次非經口投藥。此外，本發明製 齊J之活f生亦可由血清的濃度測定。例如於以適當之溶劑調 製之OCIF溶液中添加多糖類後以靜脈内投藥於大鼠，再 定時抽血以一般方法測定血清鈣濃度。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 同時’本發明亦為有關以多糖類或其衍生物提高破骨 細胞形成抑制因子之活性的方法。依據本發明，可增加血 中OCIF之濃度，增強0CIF降低血清鈣濃度之作用。 [圖示之簡單說明] 第1圖所示為實施例2中，以OCIF中添加多糖類之 製劑，在投藥3小時後的血清鈣濃度。 [符號說明] D_1 : OCIF 0.5mg/kg+硫酸葡聚糖(分子量 5,000)2mg/kg 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 310940 529954 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（7 ) D-2 : OCIF 0.5mg/kg+硫酸葡聚糖(分子量 8 000)2mg/kg D-3 ·· OCIF 0.5mg/kg+硫酸葡聚糖(分子量 lo ooo) 2mg/kg H-l ·· OCIF 0.5mg/kg+肝素(207.8 units/mg)2mg/kg H-2 · OCIF 0.5mg/kg+肝素(171.2 units/mg) 2mg/kg H-3 : OCIF 0.5mg/kg+肝素(分子量 3,〇〇〇)2mg/kg H-4 ·· OCIF 0.5mg/kg+肝素(分子量 6,000)2mg/kg * *危險率1%以下有顯著差 第2圖所示為實施例3中，以改變OCIF與多糖類之 混合比例投藥時’在投藥3小時後之血清#5濃度。 [符號說明] 氺* ··危險率1 %以下有顯著差 第3圖所示為實施例4中，以OCIF中添加多糖類之 製劑投藥時，在投藥3、6、9小時後之各血清妈濃度。 [符號說明] * * ··危險率1%以下有顯著差 第4圖所示為實施例5中，以OCIF中添加多糖類之 製劑投藥時，各時間之血中OCIF濃度之變化。 [符號說明] A:所示之圖為雙體型OCIF之血中濃度 B:所示之圖為單體型OCIF之血中濃度

* ： OCIF 〇：OCIF +硫酸葡聚糖 第5圖所示為實施例5中以OCIF中添加多糖類之製 劑投藥時，各時間血中單體型/雙體型OCIF比例之變化。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 7 310940 529954 A7 B7

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（8 ) [符號說明]

A ： OCIF

B : OCIF +硫酸葡聚糖 〇：雙體型OCIF △:單體型OCIF 第6圖所示為實施例6中，以OCIF中添加多糖類（硫 酸葡聚糖、蘋果果膠、或柑皮類果膠）之製劑、在投藥後 2及4小時後之血中OCIF濃度。 [符號說明] □ : 0.5mg/kg OCIF 單獨投藥 ◊ : 0.5mg/kg OCIF + 0.5%硫酸葡聚糖 〇：0.5mg/kgOCIF + 0.5%蘋果果膠 △ : 0.5mg/kgOCIF + 0.5%柑皮類果膠 第7圖所示為實施例6中，以OCIF中添加多糖類（硫 酸葡聚糠、蘋果果膠或鹿角菜膠）之製劑，在投藥I 2及 4小時後之血中OCIF濃度。 [符號說明] □ : 0.5mg/kg OCIF 單獨投藥 ◊ ·· 0.5mg/kg OCIF + 0.5%硫酸葡聚糖 〇：0.5mg/kgOCIF + 0.5%蘋果果膠 △ : 0.5mg/kg OCIF + 0.5%鹿角菜膠（λ -) 第8圖所示為實施例7中，以OCIF中添加多糖類（硫 酸葡聚糖或蘋果果膠）之製劑，在靜脈内投藥後之金中 OCIF濃度。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 310940 —---------------^—訂·-------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 8 529954 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 A7 五、發明說明（9 ) [符號說明] 〇：50/z g/kg OCIF單獨投藥 △ : 0.5 " g/kg OCIF + 0.1%硫酸葡聚糖 □ : 0.5 # g/kg OCIF + 0.15%蘋果果膠 第9圖所示為實施例7中，以OCIF中添加多糖類（硫 酸葡聚糖或蘋果果膠）之製劑，在肌肉内投藥後之血中 OCIF濃度。 [符號說明] 〇：lmg/kg OCIF單獨投藥 △ ·· lmg/kg OCIF + 0.1%硫酸葡聚糖 □ : lmg/kgOCIF + O.15%蘋果果膠 第10圖所示為實施例8中，以〇CIF中添加多糖類（蘋 果果膠）之製劑’在投藥4小時後之血清約濃度。 、 [實施發明之最佳樣態] [實施例] 以下以實施例具體說明本發明，但此等實施例為僅為 具體之例示，對本發明並未有任何限定。 [實施例1] 注射劑之製造· 1 將依據W096/26217號公報中記載之方法得到之人類 OCIF 500 // g 及肝素 2mg 溶解在含 〇 15M NaC1 及 〇

Tween 80之10mM磷酸鈉緩衝液（pH7 〇)5ml中該溶液> 以0·22 v m之除菌戚膜（Millex G V，Millipore公司）除菌 後，分注於玻璃瓶中即可得靜脈注射用注射劑。^囷 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐厂 9 310940 --------會·! —訂--------- S (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 529954 A7 五、發明說明（10 逢射劑之f浩· 7 將依據W096/26217號公報中記載之方法得到之人類 OCIF500 " g及2mg之硫酸葡聚糖溶解於含〇15M Na(^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 及 0·01ο/〇 Tween 80 之 10mM 磷酸鈉緩衝液（pH7 〇)5ml 中， 該溶液再以〇·22 // m之除菌濾膜（Millex G v，Millip〇re公 司）除菌後，分注於玻璃瓶中即可獲得靜脈注射用注射劑。 [實施例2] 多糖類之降血清鈣灑唐蚀爭·】 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將人類OCIF(雙體型）（依照W096/26217號公報記载 之方法得到之基因重組型0CIF)溶解於含〇 15MNaC1& 〇·〇1% Tween 80之10mM磷酸鈉緩衝液（pH7 〇)(以下稱為 溶劑）調製成之0.25mg/ml人類〇CIF溶液2ml中，溶解2mg 之硫酸葡聚糖（分子量8000至10000 : Sigma公司，及分 子量5000或50000:和光純藥公司）或肝素（2〇7 8或i7i 2 unit/mg ·和光純藥公司，及分子量3〇〇〇或 公司）後，在下靜置一晝夜。同時並將〇 25及2 5mg/ml 之人類型OCIF溶液及溶劑在4它下靜置i晝夜。準備之 各試驗樣液即為OCIF與硫酸葡聚糖投藥組（D組）、〇CIF ，、肝素技藥組（Η組）（D組及Η組投藥之〇CIF量為 〇 5mg/kg)、〇ciF單獨投藥組（投藥之〇CIF量為〇 5mg/kg 及5mg/kg) ’及溶劑投藥組。以2ml/kg用量單次靜脈内 投藥於4週齡之雌Wlstan系大鼠。投藥3小時後自眼眶 採^製血清，再以約一 c測試組套（和光純藥公司）測定 所知血β中之|弓濃度。結果示於第！圖。依此結果，以 ‘紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格⑵Q χ 297公髮丁 10 310940 529954 經 濟 部 智 慧 財 產 局 消 費 合 作 社 印 製 11 A7 B7 五、發明說明（11 ) 加各種硫酸葡聚糖或肝素之0 5mg/kg人類〇CIF投藥， 確有增強降低金清舞濃度作用之顯著之效果。因此，確定 添加多糖類可以提高人類〇CIF降低血清鈣濃度之作用。 [實施例3] 增強效旲 在與實施例2同法調製之2ml人類〇CIF 〇 25mg/ml 溶液中，溶解對人類〇(：汀之1、2、4、8、16倍重量的 硫酸葡聚糖（分子量5000:和光純藥公司）後，在4它下靜 置1晝仪。同樣將肝素（207 8 units/mg:和光純藥公司）依 相同比例溶解於2ml之人類型〇CIF 〇 25mg/ml溶液中， 於4°C下靜置1晝夜。 另外，以調製成4mg/ml之硫酸葡聚糖或肝素溶液， ，製成含0.25及2.5mg/ml之人類〇CIF溶液，另外亦取 單純之溶劑，同樣於4。〇下靜i】晝夜。該等試驗樣品液， 以2mg/kg用置單次靜脈内投藥於4週齡之雌系大 鼠’投藥後3小時自眼眶採血，調製其血清。再以妈心 測試組套（和光純藥公司）測定所得血清中之鈣濃度。該測 '•式，卫套係以螯合法（鄰甲酚酞型氨羧螯合劑（〇cpc)法）中添 加8-喹啉紛，為可排除鎂之影響且具有高度專一性者，’、、 於驗性條件下與0CPC結合即呈紫紅色，藉測定其吸光度 即可測得鈣之濃度。第2圖所示為其結果。依照此結果， 所添加硫酸葡聚糖之量對人類〇CIF達4倍以上之情況， 即可見有顯著之降低血清約濃度作用。另外，肝素在對人 類〇CIF以等量添加時亦可見有顯著之降低血清約濃度作 本紙張尺度適用中國國家標準見格（2】〇 χ挪公釐丁 310940 ------------曹.！ —訂--------- MW (請先閱讀背面之注咅Ρ事項再填寫本頁) 529954 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（！2 用。因此，可以確定人類〇CIF與多糖類以特定之比例同 時投藥時，可更加強OCIF降低血清鈣濃度之作用。 [實施例4] 1加多糖類掛OCIF之1久性增強紛爭 將20mg之硫酸葡聚糖（分子量5〇〇〇 :和光純藥公司） 溶解於以溶劑調製之2nd人類0CIF 2 5mg/ml溶液中之 後，於4C下靜置1晝夜。另取20mg之肝素（2〇7 8 和光純藥公司）亦溶解於2ml之人類〇CIF 2 5mg/mi溶液 中，同樣在4。(：中靜置1畫夜。另外調製2 5mg/ml之人 類OCIF溶液及溶劑，亦在4它下靜置i晝夜。得到之試 驗樣品液分別取用2ml/kg(〇CIF量為5mg/kg)之用量單次 靜脈内投藥於4週齡之雌Wistar系大鼠，投藥後於3、6、 9小時自眼眶抽血調製血清。所得之血清再以鈣_c_剛定 組套（和光純藥公司）測定血清中之鈣濃度。第3圖所^為 其結果。依據此結果，可知5mg/kg人類〇ciF溶液單獨… 投藥組在投藥後3小時可確認顯著地降低血清鈣濃度， 投藥6及9小時者，則並未見有降低血清鈣濃度之作用 另方面，添加有對人類OCIF為4倍量的硫酸葡聚。 及肝素之2.5mg/ml人類OCIF溶液，在投藥9小時後4 可見有顯著之降低血清鈣濃度作用。因此，以確〜 弋人 OCIF與多糖類同時投藥時具有增強持效性之效果。 [實施例5 ] 類對血中OCIF澧唐之_々紛 取lml之4mg/ml硫酸葡聚糖溶液加入與實施例 ___________ 之同 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 12 31〇94〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -—I — — 1' . I ^ « — — — — — — I— * 529954 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（U 法調製之1ml人類OCIF lmg/ml溶液中，於4艽下靜置工 晝仗。取該試驗樣品液以lml/kg用量單次靜脈内投藥於 9週齡之雄Wistar系大鼠，分別於投藥2、5、1〇、15、3〇、 45、60、120、240、360、480、600、720、1440 分鐘後 自眼眶抽血調製血清。所得血清中之人類〇CIF濃度則以 雙體型OCIF辨識單株抗體，單體型〇CIF辨識單株抗體 (Biochemical and Biophysical Research Communications, V〇l，245, pp382-387(1998))依照 W096/26217 號公報記載 之ELISA法測定。又，總0CIF濃度為雙單型〇CIF濃度 與單體型OCIF濃度之和。第4圖及第5圖所示為其結果。 依照此結果，添加有對人類OCIF為4倍量之硫酸葡聚糖 之人類OCIF溶液投藥組，明顯比單一 5〇〇 # m/kg人類 OCIF溶液投藥組更可維持高血中〇CIF濃度（第4圖）。同 時’亦確定可以抑制雙體型0CIF在金中變換成為單體型 OCIF(第5圖）。因此，添加多糖類可以持續維持〇CIf之 血中濃度’尤其是具有高度降金清#5濃度活性之雙體〇CII (Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol5 245, ρρ382·387(1998))。 [實施例6] 添加多糖類對血中OCIF濃度之持久效果· 2 取2ml同實施例2方法調製之〇.25mg/mlOCIF溶液 與等量之0.5%硫酸葡聚糖、蘋果果膠、或柑皮類果膠（均 為和光純藥公司）之溶液（溶劑··含0.1 5M NaCl，0.01 %聚 山梨酸酯80之10mM構酸鈉緩衝液（pH7.0))與混合，於 ——1-------——^---=丨丨訂--------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 13 310940 529954 A7 B7 五、發明說明（W ) 室溫下靜置4小時，製作成被試驗樣品液。另外，對照組 係僅取0.25mg/mlOCIF溶液（2ml)同樣與等量之溶劑以 ，於室溫下靜置4小時。取此等試驗樣品液以2喻口用 量單次靜脈内投藥於4週齡雄WiStar系大鼠，投藥2及4 小時後在乙醚麻醉下自眼眶抽血調製血清。再以|| 26217號公報記載之ELISA法測定得到之血清中人類型 OCIF之濃度。第6圖所示為其結果。 另外，以上述相同之方法，等量混合2ml之人類〇ciF 〇.25mg/ml溶液及〇 5%之硫酸葡聚糖、蘋果果膠、或鹿角 菜膠U_)(均為和光純藥公司）溶液、室溫下靜置*小時調 製成被試驗樣品液。另外，對照組則僅取〇 25mg/mi之〇ciF 洛液，同樣與等量之溶劑混合後於室溫下靜置4小時。取 此等被試驗樣品液以2ml/kg之用量單次靜脈内投藥於4 週齡雄Wistar系大鼠，投藥後2及4小時在乙鱗麻醉下 自眼眶抽血調製血清。再以w〇96/26217號公報記載之 ELISA法測定所得血清中人類型〇CIF之濃度。第7圖所 示為其結果。 依照上述結果可知，任一添加硫酸葡聚糖、蘋果果膠、 柑皮類果膠之試驗樣品投藥組均明顯較單獨以人類型 OCIF溶液投藥者更可維持血中之高〇C][F濃度（第6圖）。 消 吞丁 線 另外，添加鹿角菜膠之被試驗樣品投藥組亦同樣明顯可維 持血中之高OCIF濃度（第7圖）。因此，可以確定添加此 等多糖類可持續維持血中OCIF之濃度。 [實施例7] ^紙張尺度刺中(CN^^格⑵Q χ挪公羞） 14 310940 529954 A7 B7 五、發明說明（15 添加多_糖類對血中OCIF濃麿之持久敎吴· 3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 以硫酸葡聚糖或類果果膠（和光純藥公司）之多糖類 檢討不同投藥途徑之血中OCIF的持效效果。以溶劑（含 0.15M NaCl、0.01%聚山梨酸醋80之10mM磷酸鈉緩衝 液（ΡΗ7·0))稀釋人類OCIF以準備5〇e g/ml之靜脈投藥 用，1000 // g/ml之肌肉内投藥用OCIF溶液，再於其中添 加上述多糖類作成各試驗樣品液。此時，於靜脈投藥用及 肌肉投藥用OCIF溶液中，各自添加硫酸葡聚糖成〇1%。 另外，取蘋果果膠溶於溶劑調製成3mg/ml溶液，再與2 倍量之靜脈内投藥用或肌肉内投藥用OCIF溶液（各含有 l〇〇//g/ml及2000 /zg/ml)等量混合。各溶液以lml/kg用 量單次投藥於4週齡之雄Wistor系大鼠。投藥後，靜脈 内投藥在 2、5、10、15、30、45、60、120、240、360 分 鐘後，肌肉内投藥在30分鐘，1、2、3、4、5、6、8、1〇、 24小時後，分別在乙醚麻醉下自眼眶採血調製血清。得 到之血清再依照W〇96/26217號公報中記载之elisa法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 測定所得血清之人類型OCIF之濃度。第8圖及第9圖所 不為其結果。 由此結果，以添加硫酸葡聚糖或蘋果果膠之OCif溶 液靜脈内投藥（第8圖）或肌肉内投樂（第9圖），明顯可以 維持血中n OCIF濃度。因此，藉由觀察可以確定該多糖 類之添加可維持OCif在血中之濃度，同時血中ociF濃 度之持續效果與投藥途徑無關。 [實施例8] 本紙張[度適用ΤΪ0家標準（cis)A 1G χ 297 15 310940 529954 A7 B7 五、發明說明（I6 ) 多糖類對OCIF之降血清鈣濃度效旲· 2 蘋果果膠（和光純藥公司）之0.5%溶液（溶劑：含〇 15m NaCl，〇 〇ι〇/0聚山梨酸酯之i〇mM磷酸納緩衝液（ρΗ7·〇)) 與2ml實施例2同法調製的人類OCIF0.25mg/ml溶液等 量混合，再於室溫下靜置4小時，配製成被試驗樣品液。 同時再準備以OCIF溶液（2ml之人類OCIF0.25mg/ml溶液） 與溶劑等量混合之物及僅有溶劑者。各個被試驗樣品液以 2ml/kg之比例單次靜脈内投藥於4週齡之雄Wistar系大 鼠。投藥4小時後在麻醉下自眼眶採血調製血清，再以_ •C-測試組套（和光純藥公司）測定所得血清中之舞濃度。 第1〇圖所示為其結果。由該結果可見，單一之〇 5mg/kg 人類型OCIF溶液投藥組並無降血清鈣濃度之作用，而對 0.5mg/kg人類型OCIF添加蘋果果膠之投藥組，則可確認 有顯著之降血清鈣濃度作用。因此，可以確定添加多糖類 可增強人類型OCIF之降血清鈣濃度之作用。 [產業上利用之可能性] 本發明可以提供一種以由破骨細胞形成抑制因子、其 類似物’或其變異物中選擇之一種以上的物質、與多糖類 或其衍生物製成之骨骼代謝異常治療劑。本發明所提供之 骨骼代謝異常治療劑，為對骨骼疏鬆症、高鈣血症、俨性 關節風濕症等骨骼代謝疾病具有優良治療效果，可以長時 間維持其活性之有用醫藥品。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) ---- 16 310940 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)

I I I I S. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Claims (1)

1. 529954 H3 30 第881 18658號專利申請案 尉 z、 申請專利範圍修正本 (92年2月6曰） 1 · 一種骨絡代謝異常治療之醫藥組成物，係含有由破骨 、·田胞开v 成抑制因子（Osteoclastogensis Inhibitory Faetofy ’ 〇CIF)、其類似物、或其變異物之群中選擇 之一種以上的物質為有效成分，以及該物質之1至16 倍量之肝素、果膠、鹿角菜膠及/或硫酸葡聚糖為該有 效成分之増強劑所組成者。 2·如申請專利範圍第1項之骨骼代謝異常治療劑，其中 該0CIF為人類OCIF者。 經濟部中央標準局員工福利委員會印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210 X 297公釐） 310940