JPWO2008041774A1 - 骨伝導能を有する徐放性製剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を含む徐放性製剤であって、前記破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と前記多孔質粒子の孔内面全体とが二価金属イオンを介して結合していることを特徴とする、骨伝導能に優れた破骨細胞形成抑制因子OCIF/OPGの徐放性製剤に関する。
Description
本発明は、破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体が多孔質粒子の孔内面全体に結合されてなる徐放性製剤に関する。
タンパク質等の生理活性物質の徐放性製剤には、生理活性物質を高分子によって直接包埋する方法が汎用されている。
これまでに、リン酸カルシウムの一種であるアパタイトを用いた徐放性製剤が、報告されている(非特許文献1及び2)。非特許文献1では、抗生物質を吸着させ、徐放させたこと、一方、非特許文献2では結晶の大きさに応じてカルシウムの溶解により吸着タンパク質が放出されることが報告されている。さらに、非特許文献3は、比表面積3m2/g〜22m2/gで粒子径200nm〜500nmのアパタイト粒子を用いたヒト成長ホルモンの徐放を報告している。また、非特許文献4は、粒子径40μm〜80μmのアパタイト粒子に1%程度のヒト成長ホルモンを吸着させ、徐放させたことを報告している。しかし、これらに報告されるアパタイトを用いた徐放性製剤は、積極的に薬物をリン酸カルシウムから徐放させる形態のものではなかった。
また、W.Paulらは、リン酸カルシウム顆粒からのタンパク質の徐放技術を数多く報告している(非特許文献5〜8)。これらの報告では、徐放化のためにポリ乳酸(PLA)やポリエチレン酢酸ビニル(PEVA)等の生分解性高分子を用いたコーティングを行っている。用いる粒子は、200μm〜1000μmの大きさで、1100℃で焼成した緻密体である。
さらに、アパタイト粒子(バルクは除く)を用いた注射投与可能なタンパク質の徐放性製剤が、例えば特許文献1〜2及び非特許文献9に開示されている。特許文献1には、多孔性ハイドロキシアパタイト微粒子に存在する細孔に生物学的活性薬剤、ヒト血清タンパク質、ムコ多糖類を充填し、2価金属イオンを加えることにより栓塞することを特徴とする徐放性組成物が開示されている。
また、特許文献2には、多孔性アパタイト誘導体と、その多孔性アパタイト誘導体に含有されるヒト成長ホルモン及び水溶性2価金属化合物から成ることを特徴とするヒト成長ホルモンの徐放性微粒子製剤が開示されている。
非特許文献9では、多孔性アパタイト粒子内にインターフェロンα等のタンパク質を含浸させ、亜鉛イオンを加えることで徐放させている。
特許文献3には、スプレイドライ法により製造するカルシウム化合物とグリコサミノグリカンとの複合粒子及びその製造方法が開示されている。しかしながら、特許文献3には、当該複合粒子が骨充填材、細胞の足場材料、クロマトグラフィー用素材として有用な材料であることが記載されているものの、徐放性製剤に利用できることは記載されていない。
一方、破骨細胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor:OCIF)(又はオステオプロテジェリン(osteoprotegerin:OPG)とも呼ばれる:以下では「OCIF/OPG」と呼ぶ)を含めた生理活性タンパク質の徐放に使用される技術が特許文献4に開示されている。本技術は、アルジネートゲルビーズを用いた生理活性タンパク質に汎用できる徐放性組成物に関するものである。しかしながら、特許文献4には、OCIF/OPGの徐放性の最適化検討は報告されておらず、また、徐放試験の実施例も記載されていない。
また、OCIF/OPGの血中濃度の維持とin vivoでの生物活性の向上に利用できる製剤化技術が特許文献5〜8に開示されている。これら特許文献には、OCIF/OPGと多糖及びその誘導体とから成る複合体、又はOCIF/OPGとPolyPEG(copolmer of poly(ethylene glycol)allylmethylether and maleamic acid sodium salt)とから成る複合体が開示されており、これら複合体によれば、血中滞留性を向上させることによってOCIF/OPGの生物活性が増強されることが報告されている。しかしながら、これらの技術は、OCIF/OPGの局所投与を指向したものではなく、骨への適合性も考慮されていない。
特開2004−75662号公報
特開2005−8545号公報
特開2004−236895号公報
国際公開第98/46211号パンフレット
特開2003−160601号公報
米国特許出願公開第2003/0045456号明細書
特開2005−206569号公報
米国特許出願公開第2006/0062754号明細書
K.Yamamuraら,「Journal of Biomedical Materials Research」,1992年,第26巻,p.1053−1064
T.Matsumotoら,「Biomaterials」,2004年,第25巻,p.3807−3812
H.Gautierら,「Journal of Biomedical Materials Research」,1998年,第40巻,p.606−613
J.Guicheuxら,「Journal of Biomedical Materials Research」,1997年,第34巻,p.165−170
W.Paul及びCP.Sharma,「Journal of Materials Science Letters」,1997年,第16巻,p.2050−2051
W.Paul及びCP.Sharma,「Journal of materials Science−materials in medicine」,1999年,第10巻.p.383−388
W.Paulら,「Journal of Biomedical Materials Research」,2002年,第61巻,p,660−662
W.Paul及びCP.Sharma,「Journal of Biomaterials Applications」2003年,第17巻,p.253−264
Y.Mizushimaら,「Journal of Controlled Release」,2006年,第110巻,第2号,p.260−265
これまでに、リン酸カルシウムの一種であるアパタイトを用いた徐放性製剤が、報告されている(非特許文献1及び2)。非特許文献1では、抗生物質を吸着させ、徐放させたこと、一方、非特許文献2では結晶の大きさに応じてカルシウムの溶解により吸着タンパク質が放出されることが報告されている。さらに、非特許文献3は、比表面積3m2/g〜22m2/gで粒子径200nm〜500nmのアパタイト粒子を用いたヒト成長ホルモンの徐放を報告している。また、非特許文献4は、粒子径40μm〜80μmのアパタイト粒子に1%程度のヒト成長ホルモンを吸着させ、徐放させたことを報告している。しかし、これらに報告されるアパタイトを用いた徐放性製剤は、積極的に薬物をリン酸カルシウムから徐放させる形態のものではなかった。
また、W.Paulらは、リン酸カルシウム顆粒からのタンパク質の徐放技術を数多く報告している(非特許文献5〜8)。これらの報告では、徐放化のためにポリ乳酸(PLA)やポリエチレン酢酸ビニル(PEVA)等の生分解性高分子を用いたコーティングを行っている。用いる粒子は、200μm〜1000μmの大きさで、1100℃で焼成した緻密体である。
さらに、アパタイト粒子(バルクは除く)を用いた注射投与可能なタンパク質の徐放性製剤が、例えば特許文献1〜2及び非特許文献9に開示されている。特許文献1には、多孔性ハイドロキシアパタイト微粒子に存在する細孔に生物学的活性薬剤、ヒト血清タンパク質、ムコ多糖類を充填し、2価金属イオンを加えることにより栓塞することを特徴とする徐放性組成物が開示されている。
また、特許文献2には、多孔性アパタイト誘導体と、その多孔性アパタイト誘導体に含有されるヒト成長ホルモン及び水溶性2価金属化合物から成ることを特徴とするヒト成長ホルモンの徐放性微粒子製剤が開示されている。
非特許文献9では、多孔性アパタイト粒子内にインターフェロンα等のタンパク質を含浸させ、亜鉛イオンを加えることで徐放させている。
特許文献3には、スプレイドライ法により製造するカルシウム化合物とグリコサミノグリカンとの複合粒子及びその製造方法が開示されている。しかしながら、特許文献3には、当該複合粒子が骨充填材、細胞の足場材料、クロマトグラフィー用素材として有用な材料であることが記載されているものの、徐放性製剤に利用できることは記載されていない。
一方、破骨細胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor:OCIF)(又はオステオプロテジェリン(osteoprotegerin:OPG)とも呼ばれる:以下では「OCIF/OPG」と呼ぶ)を含めた生理活性タンパク質の徐放に使用される技術が特許文献4に開示されている。本技術は、アルジネートゲルビーズを用いた生理活性タンパク質に汎用できる徐放性組成物に関するものである。しかしながら、特許文献4には、OCIF/OPGの徐放性の最適化検討は報告されておらず、また、徐放試験の実施例も記載されていない。
また、OCIF/OPGの血中濃度の維持とin vivoでの生物活性の向上に利用できる製剤化技術が特許文献5〜8に開示されている。これら特許文献には、OCIF/OPGと多糖及びその誘導体とから成る複合体、又はOCIF/OPGとPolyPEG(copolmer of poly(ethylene glycol)allylmethylether and maleamic acid sodium salt)とから成る複合体が開示されており、これら複合体によれば、血中滞留性を向上させることによってOCIF/OPGの生物活性が増強されることが報告されている。しかしながら、これらの技術は、OCIF/OPGの局所投与を指向したものではなく、骨への適合性も考慮されていない。
本発明は、上述した実情に鑑み、骨伝導能に優れたOCIF/OPGの徐放性製剤を提供することを目的とする。
前記特許文献3と同様な方法で製造したリン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とから成る複合多孔質粒子から薬物を放出させる製剤化方法等の鋭意検討を進めた結果、OCIF/OPGを徐放させる基材として当該複合多孔質粒子が最適であり、さらに徐放化させる際に、二価金属イオンを用いることで初期バーストを制御したゼロ次放出を達成することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は以下を包含する。
(1)OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を含む徐放性製剤であって、前記OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と前記多孔質粒子の孔内面全体とが二価金属イオンを介して結合していることを特徴とする、前記徐放性製剤。
(2)前記多孔質粒子において、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とが均一に分散していることを特徴とする、(1)記載の徐放性製剤。
(3)前記リン酸カルシウムが、カルシウムと共に、或いはカルシウムの一部に置換して、マグネシウム、亜鉛、ストロンチウム及びバリウムから成る群より選択される二価金属を含有することを特徴とする、(1)又は(2)記載の徐放性製剤。
(4)前記リン酸カルシウム中のリンに対するカルシウムのモル比が1.3〜3.4であることを特徴とする、(1)〜(3)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(5)前記リン酸カルシウムが炭酸基を含有することを特徴とする、(1)〜(4)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(6)前記リン酸カルシウムナノ結晶の長径が1×102nm以下であることを特徴とする、(1)〜(5)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(7)前記長径が1nm〜1×102nmであることを特徴とする、(6)記載の徐放性製剤。
(8)前記多糖類が、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸から成る群より選択されるものであることを特徴とする、(1)〜(7)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(9)前記多糖類がコンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸であることを特徴とする、(8)記載の徐放性製剤。
(10)前記多糖類の含有量が4×10重量%以下であることを特徴とする、(1)〜(9)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(11)前記含有量が4×10重量%〜1×10−1重量%であることを特徴とする、(10)記載の徐放性製剤。
(12)前記多孔質粒子の直径が1×102μm以下であることを特徴とする、(1)〜(11)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(13)前記直径が1μm〜1×102μmであることを特徴とする、(12)記載の徐放性製剤。
(14)前記多孔質粒子の比表面積が5×10m2/g〜2×102m2/gであることを特徴とする、(1)〜(13)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(15)前記多孔質粒子の気孔率が3×10%〜8×10%であることを特徴とする、(1)〜(14)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(16)前記多孔質粒子の生体内吸収が6ヶ月以内であることを特徴とする、(1)〜(15)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(17)前記多孔質粒子がスプレイドライによって作製されたものであることを特徴とする、(1)〜(16)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(18)前記二価金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン及び銅イオンから成る群より選択されるものであることを特徴とする、(1)〜(17)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(19)前記二価金属イオンが亜鉛イオンであることを特徴とする、(18)記載の徐放性製剤。
(20)骨代謝異常症治療剤であることを特徴とする、(1)〜(19)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(21)骨折治癒促進剤であることを特徴とする、(1)〜(19)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(22)(1)〜(19)のいずれか1記載の徐放性製剤を含有する骨欠損部充填材。
(23)リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む懸濁液をスプレイドライに供し、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を得る工程と、前記多孔質粒子を、OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体を含有する溶液に含浸し、OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体を前記多孔質粒子の孔内面全体に担持する工程と、前記OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体を担持した多孔質粒子に、二価金属イオン含有溶液を添加し、これにより、前記OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と前記多孔質粒子の孔内面全体とを前記二価金属イオンを介して結合する工程とを含むことを特徴とする、徐放性製剤の製造方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2006−271102号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
前記特許文献3と同様な方法で製造したリン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とから成る複合多孔質粒子から薬物を放出させる製剤化方法等の鋭意検討を進めた結果、OCIF/OPGを徐放させる基材として当該複合多孔質粒子が最適であり、さらに徐放化させる際に、二価金属イオンを用いることで初期バーストを制御したゼロ次放出を達成することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は以下を包含する。
(1)OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を含む徐放性製剤であって、前記OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と前記多孔質粒子の孔内面全体とが二価金属イオンを介して結合していることを特徴とする、前記徐放性製剤。
(2)前記多孔質粒子において、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とが均一に分散していることを特徴とする、(1)記載の徐放性製剤。
(3)前記リン酸カルシウムが、カルシウムと共に、或いはカルシウムの一部に置換して、マグネシウム、亜鉛、ストロンチウム及びバリウムから成る群より選択される二価金属を含有することを特徴とする、(1)又は(2)記載の徐放性製剤。
(4)前記リン酸カルシウム中のリンに対するカルシウムのモル比が1.3〜3.4であることを特徴とする、(1)〜(3)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(5)前記リン酸カルシウムが炭酸基を含有することを特徴とする、(1)〜(4)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(6)前記リン酸カルシウムナノ結晶の長径が1×102nm以下であることを特徴とする、(1)〜(5)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(7)前記長径が1nm〜1×102nmであることを特徴とする、(6)記載の徐放性製剤。
(8)前記多糖類が、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸から成る群より選択されるものであることを特徴とする、(1)〜(7)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(9)前記多糖類がコンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸であることを特徴とする、(8)記載の徐放性製剤。
(10)前記多糖類の含有量が4×10重量%以下であることを特徴とする、(1)〜(9)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(11)前記含有量が4×10重量%〜1×10−1重量%であることを特徴とする、(10)記載の徐放性製剤。
(12)前記多孔質粒子の直径が1×102μm以下であることを特徴とする、(1)〜(11)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(13)前記直径が1μm〜1×102μmであることを特徴とする、(12)記載の徐放性製剤。
(14)前記多孔質粒子の比表面積が5×10m2/g〜2×102m2/gであることを特徴とする、(1)〜(13)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(15)前記多孔質粒子の気孔率が3×10%〜8×10%であることを特徴とする、(1)〜(14)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(16)前記多孔質粒子の生体内吸収が6ヶ月以内であることを特徴とする、(1)〜(15)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(17)前記多孔質粒子がスプレイドライによって作製されたものであることを特徴とする、(1)〜(16)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(18)前記二価金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン及び銅イオンから成る群より選択されるものであることを特徴とする、(1)〜(17)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(19)前記二価金属イオンが亜鉛イオンであることを特徴とする、(18)記載の徐放性製剤。
(20)骨代謝異常症治療剤であることを特徴とする、(1)〜(19)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(21)骨折治癒促進剤であることを特徴とする、(1)〜(19)のいずれか1記載の徐放性製剤。
(22)(1)〜(19)のいずれか1記載の徐放性製剤を含有する骨欠損部充填材。
(23)リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む懸濁液をスプレイドライに供し、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を得る工程と、前記多孔質粒子を、OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体を含有する溶液に含浸し、OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体を前記多孔質粒子の孔内面全体に担持する工程と、前記OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体を担持した多孔質粒子に、二価金属イオン含有溶液を添加し、これにより、前記OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と前記多孔質粒子の孔内面全体とを前記二価金属イオンを介して結合する工程とを含むことを特徴とする、徐放性製剤の製造方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2006−271102号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
図1は、各OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子から徐放されたrh−OCIF−Fcを経時的に示す。
図2は、10mg又は20mgの各OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子から徐放されたrh−OCIF−Fcを経時的に示す。
図3は、生産細胞とアミノ酸配列の異なるOCIF/OPGを担持したHAp/ChS多孔質粒子から徐放されたrh−OCIF−Fc及びrh−OCIFを経時的に示す。
図4は、OCIF/OPG担持量を増加させたOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子から徐放されたrh−OCIFを経時的に示す。
図5は、各ChS濃度のHAp/ChS多孔質粒子埋入の2週間又は4週間後のBV/TV及びOb.S/BSの算出結果を示す。
図6は、実施例8におけるμCT画像解析の結果を示す。
図7は、実施例8におけるビラヌーバ・ゴールドナー染色の結果を示す。
図8は、実施例8におけるHE染色及びトルイジンブルー染色の結果を示す。
図9は、実施例8における骨量及び相対類骨量の定量結果を示す。
図10は、実施例8においてDXA法により計測した骨密度の結果を示す。
図11は、実施例9におけるOCIF−HAp/ChS及びOCIF−HAp/ChS−Znをラットに腹腔内投与した場合の血清中rh−OCIF濃度の経時変化を示すグラフである。
図12は、実施例9におけるOCIF−HAp/ChS及びOCIF−HAp/ChS−Znをラットに皮下投与した場合の血清中rh−OCIF濃度の経時変化を示すグラフである。
図13は、実施例9におけるPBSに溶解したrh−OCIFをラットに腹腔内投与した場合の血清中rh−OCIF濃度の経時変化を示すグラフである。
図14は、実施例9におけるPBSに溶解したrh−OCIFをラットに皮下投与した場合の血清中rh−OCIF濃度の経時変化を示すグラフである。
図2は、10mg又は20mgの各OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子から徐放されたrh−OCIF−Fcを経時的に示す。
図3は、生産細胞とアミノ酸配列の異なるOCIF/OPGを担持したHAp/ChS多孔質粒子から徐放されたrh−OCIF−Fc及びrh−OCIFを経時的に示す。
図4は、OCIF/OPG担持量を増加させたOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子から徐放されたrh−OCIFを経時的に示す。
図5は、各ChS濃度のHAp/ChS多孔質粒子埋入の2週間又は4週間後のBV/TV及びOb.S/BSの算出結果を示す。
図6は、実施例8におけるμCT画像解析の結果を示す。
図7は、実施例8におけるビラヌーバ・ゴールドナー染色の結果を示す。
図8は、実施例8におけるHE染色及びトルイジンブルー染色の結果を示す。
図9は、実施例8における骨量及び相対類骨量の定量結果を示す。
図10は、実施例8においてDXA法により計測した骨密度の結果を示す。
図11は、実施例9におけるOCIF−HAp/ChS及びOCIF−HAp/ChS−Znをラットに腹腔内投与した場合の血清中rh−OCIF濃度の経時変化を示すグラフである。
図12は、実施例9におけるOCIF−HAp/ChS及びOCIF−HAp/ChS−Znをラットに皮下投与した場合の血清中rh−OCIF濃度の経時変化を示すグラフである。
図13は、実施例9におけるPBSに溶解したrh−OCIFをラットに腹腔内投与した場合の血清中rh−OCIF濃度の経時変化を示すグラフである。
図14は、実施例9におけるPBSに溶解したrh−OCIFをラットに皮下投与した場合の血清中rh−OCIF濃度の経時変化を示すグラフである。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る徐放性製剤は、OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を含むものである。本発明に係る徐放性製剤において、当該OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体は、多孔質粒子の孔内面全体に担持されている。また、本発明に係る徐放性製剤は、二価金属イオンを介してOCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と多孔質粒子の孔内面全体とが結合している。
ここで、OCIF/OPGは、破骨細胞形成抑制活性を指標として単離され、破骨細胞の分化/成熟を抑制する活性を有するタンパク質である(国際公開第96/26217号及び米国特許第6,855,808号)。
具体的には、OCIF/OPGは、下記の(a)〜(d)に記載の物理化学的性質を有し、且つ、破骨細胞の分化及び/又は成熟抑制活性を有するタンパク質を意味する(国際公開第96/26217号及び米国特許第6,855,808号)。
(a)分子量(SDS−PAGEによる):約60kD(還元条件下)、約60kD及び約120kD(非還元条件下)。
(b)親和性:陽イオン交換体及びヘパリンに親和性を有する。
(c)熱安定性:70℃、10分間又は56℃、30分間の加熱処理により、破骨細胞の分化・成熟抑制活性が低下し、90℃、10分間の加熱処理により破骨細胞の分化・成熟抑制活性が失われる。
(d)内部アミノ酸配列:配列番号1〜3記載のアミノ酸配列を内部アミノ酸配列として有する。
なお、配列番号1〜3記載のアミノ酸配列において、Xaaは任意のアミノ酸を取りうるが、好ましくは、配列番号1において1位のXaaはThrであり、配列番号2において1位のXaaはArgであり、5位のXaaはSerであり、13位のXaaはLeuであり、配列番号3において1位のXaaはThrである。
上記(a)の物理化学的性質から判るようにOCIF/OPGは、一量体と二量体の形態をとりうる(国際公開第96/26217号及び米国特許第6,855,808号)。OCIF/OPGを発現する細胞(例えば、天然にはヒト胎児肺線維芽細胞IMR−90(ATCC寄託−受託番号CCL186))を含む培養液等には、当該一量体と二量体とが通常混在する。そこで、通常の分離方法によりいずれか一方の形態のOCIF/OPGを精製し、本発明において使用してもよい。
ヒトOCIF/OPGは、シグナルペプチドを含む前駆体(cDNA:配列番号4及びアミノ酸配列:配列番号5)として合成され、シグナルペプチドが切断され、成熟型タンパク質(配列番号5に示すアミノ酸配列において、シグナルペプチド(第−21番目〜第−1番目のアミノ酸配列)を除くアミノ酸配列)となる。本発明において、OCIF/OPGは、上述のヒト由来のシグナルペプチドを含む前駆体及び成熟型タンパク質のいずれをも含むが、成熟型タンパク質が好ましい。
OCIF/OPG類縁体とは、OCIF/OPGをコードする塩基配列と相補的な塩基配列から成るDNAとハイブリダイズするDNAによりコードされ、且つ破骨細胞分化及び/又は成熟抑制活性を有するタンパク質を意味する。例えば、動物細胞、体液又は組織由来のcDNAライブラリーを鋳型として、ヒトOCIF/OPGのcDNA(配列番号4)と相補的な塩基配列から成るDNAをプローブとし、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされる、破骨細胞分化及び/又は成熟抑制活性を有するタンパク質である。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成される条件をいう。このようなストリンジェントな条件は、当業者には周知であり、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1−6.3.6に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的例としては、約45℃の6X塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)におけるハイブリダイゼーション後、50℃〜65℃の0.2 X SSC、0.1%SDSで1回以上洗浄するものが挙げられる。具体的なOCIF/OPG類縁体としては、例えば、国際公開第96/26217号及び米国特許第6,855,808号に開示のOCIF2(cDNA:配列番号6及びアミノ酸配列:配列番号7)、OCIF3(cDNA:配列番号8及びアミノ酸配列:配列番号9)、OCIF4(cDNA:配列番号10及びアミノ酸配列:配列番号11)及びOCIF5(cDNA:配列番号12及びアミノ酸配列:配列番号13)が挙げられる。なお、OCIF2〜5におけるシグナルペプチドのアミノ酸配列及び成熟型タンパク質のアミノ酸配列は、以下の表1に示す通りである。
また、OCIF/OPG変異体とは、上述のOCIF/OPG又はOCIF/OPG類縁体において、1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ破骨細胞分化及び/又は成熟抑制活性を有するタンパク質を意味する。上記複数のアミノ酸は、数個(例えば、1〜10個、好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個)であってもよい。ヒトOCIF/OPG(配列番号5記載のアミノ酸配列)においては、C末端から204アミノ酸までを欠失させたC末端欠失変異体においても、破骨細胞分化及び/又は成熟抑制活性が確認されており、生物活性は主にN末端側のドメインによるものと考えられている(国際公開第96/26217号、米国特許第6,855,808号及びYamaguchi K.ら,The Journal of Biological Chemistry(1998),Vol.273,No.9,pp.5117−5123)。
OCIF/OPG変異体の好適な態様としては、ヒトOCIF/OPG(配列番号5記載のアミノ酸配列)において数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列から成り、且つ破骨細胞分化及び/又は成熟抑制活性を有するタンパク質、及びヒトOCIF/OPG(配列番号5記載のアミノ酸配列)において第1番目のGluをN末端とし、第176番目〜第379番目のいずれかのアミノ酸をC末端とするタンパク質であって、破骨細胞分化及び/又は成熟抑制活性を有するタンパク質が挙げられる。
さらに、OCIF/OPG変異体には、上述のOCIF/OPG又はOCIF/OPG類縁体をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも約60%〜約65%、好ましくは約70%〜約75%、さらに好ましくは約80%〜約85%、特に好ましくは約90%〜約95%以上同一であるヌクレオチド配列によりコードされ、且つ破骨細胞分化及び/又は成熟抑制活性を有するタンパク質が含まれる。
OCIF/OPG修飾体は、例えば、上述したOCIF/OPG、その類縁体又は変異体へのペプチドや糖鎖の酵素的又は化学的修飾体、或いはポリマー等の高分子化合物や多糖類の修飾体を意味する。OCIF/OPG修飾体としては、例えばタンパク質の翻訳後修飾(例えば、糖の付加、プロテインキナーゼによるリン酸化やホスファターゼによる脱リン酸化)、水溶性ポリマー(ポリエチレングリコール、エチレングリコール/プロピレングリコール共ポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、PolyPEG(copolymer of poly(ethyleneglycol)allylmethylether and maleamic acid sodium salt)、ヘパリン、デキストラン硫酸等)等の化学修飾等の修飾がなされたOCIF/OPG、その類縁体又は変異体が挙げられる。さらに、例えば、OCIF/OPG、その類縁体又は変異体とFc(IgG等の免疫グロブリン由来のFc領域)やアルブミン等のペプチドやタンパク質との融合タンパク質、OCIF/OPG、その類縁体又は変異体と多糖類(ヘパリン、デキストラン硫酸等)との複合体、及びOCIF/OPG、その類縁体又は変異体とPolyPEGとの複合体もOCIF/OPG修飾体に含まれる。
具体的には、OCIF/OPG、その類縁体又は変異体のポリエチレングリコールによる修飾体は、例えば、国際公開第97/23614号に記載の方法により製造できる。また、OCIF/OPG、その類縁体又は変異体の多糖類による修飾体において、多糖類としてはデキストラン硫酸、特にデキストラン硫酸ナトリウム5(DS5)が好ましく、このような修飾体は、例えば特許文献5及び6に記載の方法により製造できる。さらに、OCIF/OPG、その類縁体又は変異体のPolyPEGによる修飾体は、例えば特許文献7及び8に記載の方法により製造できる。
なお、ヒト以外の動物(例えば、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、並びにニワトリ、ガチョウ、シチメンチョウ等の鳥類)由来のOCIF/OPGも、上述の定義の範囲内にあれば、OCIF/OPG類縁体、変異体又は修飾体に含まれる。
OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体(以下、「OCIF/OPG物質」という)は、動物の組織や体液等から、又は動物細胞の培養物等からタンパク質として抽出、精製された天然型のタンパク質として、或いはこれらOCIF/OPG物質をコードするDNA断片又は当該DNA断片を含有するベクターで動物細胞や大腸菌等の宿主を形質転換し、生産される遺伝子組換え型(以下では、「rh」という場合がある)タンパク質として、更にはこれらの修飾体として取得することができる。例えば、国際公開第96/26217号(及び米国特許第6,855,808号)に開示のOCIF/OPGの製造方法に準じて、OCIF/OPG物質をOCIF/OPG物質産生細胞より単離・精製することができる。具体的には、OCIF/OPG物質産生細胞を培養し、培養液をヘパリンカラム(ヘパリン−セファロースCL−6B、ファルマシア社)に供し、2M NaClを含む10mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)で溶出する。次いで、得られたヘパリン吸着性OCIF/OPG物質画分をQ・陰イオン交換カラム(HiLoad−Q/FF、ファルマシア社)に供し、その非吸着画分を集める。このようして、ヘパリン吸着性により塩基性のOCIF/OPG物質画分を得ることができる。得られたOCIF/OPG物質活性画分をS・陽イオン交換カラム(HiLoad−S/HP、ファルマシア社)、ヘパリンカラム(ヘパリン−5PW、トーソー社)、シバクロンブルーカラム(ブルー−5PW、トーソー社)、逆相カラム(BU−300 C4、パーキンエルマー社)に供することにより、OCIF/OPG物質を単離・精製することができる。
OCIF/OPG物質の破骨細胞分化及び/又は成熟抑制活性は、例えば、久米川正好らの方法(蛋白質・核酸・酵素,1989,Vol.34,p.999)及びTakahashi N.らの方法(Endocrinology,1988,Vol.122,p.1373)に従って測定することができる。即ち、例えば生後約17日のマウス骨髄細胞を標的細胞として用い、活性型ビタミンD3(Calcitriol)存在下での破骨細胞の形成抑制を、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性の誘導の抑制として試験することができる。
なお、OCIF/OPG物質のうち、好適にはOCIF/OPG又はその修飾体であり、より好適にはOCIF/OPG又はそのFc融合タンパク質である。
一方、リン酸カルシウムナノ結晶とは、リン酸三カルシウム(Ca3(PO4)2)、リン酸八カルシウム(Ca8H2(PO4)6・5H2O)、アパタイト化合物等であって、大きさが1μmより小さい結晶の総称を意味する。また、アパタイト化合物とは、一般式Ca10(PO4X)6Y2(式中、Xは炭酸基又は欠損を、Yは水酸基、炭酸基、ハロゲン基又は欠損を示す)で表される水酸アパタイト、炭酸アパタイト、フッ素アパタイト、塩素アパタイト等を意味する。さらに、リン酸カルシウムは、カルシウムと共に、或いはカルシウムの一部に置換して、マグネシウム、亜鉛、ストロンチウム及びバリウム等の1種以上の二価金属を含有していてもよい。なお、リン酸カルシウムにおけるリンに対するカルシウムのモル比は、例えば、1.3〜3.4、好ましくは1.5〜3.0である。
リン酸カルシウムナノ結晶の製造に関しては、例えば、水酸アパタイトナノ結晶を製造する場合には、湿式法により製造することができ、下記の式に従って行うことができる(H.Aoki,「Medical Applications of hydroxyapatite」,1994,Ishiyaku EuroAmerica,Inc.,Tokyo,St.Lousi)。
このようにして、製造したリン酸カルシウムナノ結晶の長径は、例えば、1×102nm以下、好ましくは1nm〜1×102nm、特に好ましくは1×10nm〜5×10nmである。
また、本発明において多糖類としては、例えば、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸が挙げられ、コンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸が好ましい。なお、本発明に係る徐放性製剤における多糖類含有量は、例えば、4×10重量%以下、好ましくは4×10重量%〜1×10−1重量%、特に好ましくは1重量%〜2×10重量%である。なお、多糖類としてコンドロイチン硫酸を用いる場合には、例えば、分子量10kDa〜40kDa、好ましくは15kDa〜35kDaのものを用いる。
本発明に係る徐放性製剤は、以上に説明したOCIF/OPG物質、リン酸カルシウムナノ結晶、及び多糖類から製造する。
本発明に係る徐放性製剤の製造方法(以下、「本方法」という)においては、先ずリン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む懸濁液をスプレイドライに供することで、これらリン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を製造する。当該多孔質粒子において、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とが均一に分散していることが好ましい。リン酸カルシウムナノ結晶に対する多糖類の量は、例えば、リン酸カルシウムナノ結晶に対して、1重量%〜2×10重量%、好ましくは2重量%〜1×10重量%とする。また、懸濁液のpHは、例えば5〜9、好ましくは6〜8に調整する。さらに、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む懸濁液は、撹拌操作を継続しながら複合化を促進するために、例えば0時間〜12時間(好ましくは1時間〜4時間)熟成させた後、スプレイドライに供する。ここで、熟成とは、最終pHを7.5〜8.0の範囲に一定に保ち、複合化により得られる結晶の表面状態を生体とほぼ同じpHに保つことで安定させることをいう。具体的には、強アルカリ(水酸化カルシウム)と強酸(リン酸)の中和反応を用いて前記最終pHに設定することにより、熟成を行う。
スプレイドライは、例えばBuchi社、ヤマト科学社、大川原工業社等の二流体ノズル及び四流体ノズルを装備した市販の装置を用いて定法により行うことができるが、表面積を大きくするために、懸濁液を1μm〜5×102μm程度の微細な液滴にし、1×102℃〜3×102℃の熱風中に噴出させ、乾燥させる。
このようにして、スプレイドライ後に得られる多孔質粒子の直径は、例えば1×102μm以下、好ましくは1μm〜1×102μm、特に好ましくは1μm〜3×10μmである。また、多孔質粒子は、例えば、比表面積5×10m2/g〜2×102m2/g、気孔率3×10%〜8×10%である。多孔質粒子の比表面積が5×10m2/gより小さい場合には、十分な量のOCIF/OPG物質を担持させることができず、目的とする放出期間にわたって徐放することができない。一方、多孔質粒子の気孔率が3×10%未満である場合には、OCIF/OPG物質を粒子内部まで均一に担持できず、また8×10%を超える場合には、多孔質粒子が製剤化途中で壊れる。
スプレイドライ後に得られる多孔質粒子の生体内吸収は、例えば6ヶ月以内、好ましくは1/2ヶ月〜3ヶ月、特に好ましくは1ヶ月〜2ヶ月である。
次いで、本方法では、スプレイドライ後に得られる多孔質粒子を、OCIF/OPG物質含有溶液(例えば、OCIF/OPG物質を含む水溶液の形態)に含浸し、混合することで、均一に分散させ、当該多孔質粒子の孔内面全体にOCIF/OPG物質を担持させる。OCIF/OPG物質の添加量は、例えば多孔質粒子1mg当たり1×10−1μg〜2×102μg、好ましくは1μg〜1×102μgとする。多孔質粒子とOCIF/OPG物質との混合は、例えば1時間〜12時間(好ましくは3時間〜6時間)転倒撹拌することにより行われる。
さらに、混合終了後、多孔質粒子とOCIF/OPG物質とを含む混合物を遠心分離に供し、上清(上澄み)を除去する。なお、この段階で、遠心分離を行わずに、二価金属イオンによる結合処理に供することもできる。
多孔質粒子の孔内面全体にOCIF/OPG物質が担持されたことの評価は、上述の遠心分離後に除去した上清(上澄み)をOCIF/OPG物質に対する特異的抗体を用いた免疫学的手法(例えば、ELISA)に供し、上清に残存するOCIF/OPG物質量を測定することにより行うことができる。このような評価により、上清中にOCIF/OPG物質が僅かにしか残存していないことを確認することにより、多孔質粒子の孔内面全体にOCIF/OPG物質が十分担持されたと判断することができる。
次いで、得られたOCIF/OPG物質を担持した多孔質粒子を含む混合物に二価金属イオン含有溶液を添加し、結合処理に供する。この工程により、OCIF/OPG物質と、これを担持した多孔質粒子との結合が行われる。
本発明において、結合とは、リン酸カルシウム表面とOCIF/OPG物質とを金属イオンを介した配位・イオン・共有性の結合等により担持・結合させること、又は多糖類とOCIF/OPG物質との官能基同士の結合を誘起させること、又はリン酸カルシウム表面とOCIF/OPG物質と多糖類との間全てに結合を誘起させることを意味する。当該結合によれば、OCIF/OPG物質と多孔質粒子の孔内面全体とが二価金属イオンを介して結合されることとなる。
結合に用いる二価金属イオンとしては、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン及び銅イオンが挙げられるが、亜鉛イオンが最適である。OCIF/OPG物質を担持した多孔質粒子に対する二価金属イオン量は、例えばOCIF/OPG物質を担持した多孔質粒子1mg当たり1×10−3mg〜1mg、好ましくは1×10−2mg〜1×10−1mgとする。
結合処理では、OCIF/OPG物質を担持した多孔質粒子を含む混合物に二価金属イオン含有溶液を添加した後、転倒撹拌する。次いで、転倒撹拌後、混合物を遠心分離に供し、上清(上澄み)を除去する。さらに、上清を除去することで得られた残渣を例えば精製水で洗浄した後、沈殿物を例えば1時間〜24時間(好ましくは1時間〜12時間)凍結乾燥又は真空乾燥に供する。このようにして、本発明に係る徐放性製剤を得ることができる。
本発明に係る徐放性製剤は、担持するOCIF/OPG物質について少なくとも7日以上の長期間の徐放性を発揮する。また、本発明に係る徐放性製剤は、多孔質粒子が天然骨と同じ成分を有するものである。さらに、本発明に係る徐放性製剤は、粒子自体に起因して、骨伝導能を有している。なお、ここで、骨伝導能とは、骨欠損部位に材料を移植した際に、骨形成を阻害せず、骨芽細胞による骨形成を促進することを意味する。本発明に係る徐放性製剤の骨伝導能は、例えば本発明に係る徐放性製剤を骨欠損部位に適用した後、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色、トルイジンブルー染色、アルカリフォスファターゼ(ALP)染色、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ(TRAP)染色、ビラヌーバ・ゴールドナー染色等の骨形態計測による骨芽細胞面等の測定によって評価することができる。また、本発明に係る徐放性製剤は、OCIF/OPG物質を担持することにより骨量の減少を抑制する効果を有する。
従って、本発明に係る徐放性製剤は、単独で、或いは薬学的に許容される添加物と共に用いることができる。本発明に係る徐放性製剤による治療対象の疾患としては、例えば、骨代謝異常症が挙げられる。即ち、本発明に係る徐放性製剤は、骨代謝異常症治療剤として使用することができる。骨代謝異常症とは、実質的な骨量の減少を特徴とするあらゆる疾患であり、それを治療するか或いは予防するためには骨吸収又は骨吸収速度を抑制する必要がある疾患を意味する。本発明に係る徐放性製剤を用いて治療又は予防される骨代謝異常症には、一次性骨粗鬆症(老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症及び特発性若年性骨粗鬆症)、内分泌骨粗鬆症(甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群及び末端肥大症)、性機能低下に伴う骨粗鬆症(下垂体機能低下症、Klinefelter症候群及びTurner症候群)、遺伝性及び先天性形態の骨粗鬆症(骨形成不全、ホモシスチン尿症、メンケス症、ライリー−デイ症候群並びにOCIF遺伝子の欠損に起因する若年性パジェット病及び高リン血症)、重力負荷軽減又は四肢の固定や不動化による骨減少症、骨パジェット病、骨髄炎、骨喪失による感染性病巣、固形腫瘍(乳癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌等)に起因する高カルシウム血症、血液学的悪性疾患(多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病)、特発性高カルシウム血症、甲状腺機能亢進症又は腎臓機能不全に伴う高カルシウム血症、ステロイド投与に起因する骨減少症、他の薬物(メトトレキセート及びシクロスポリンA等の免疫抑制剤、リューブリン等の抗アンドロジェン剤、ヘパリン及び抗てんかん薬)投与に起因する骨減少症、腎臓機能不全に伴う骨減少症、外科手術、内臓器疾患(小腸障害、大腸障害、慢性肝炎、胃切除、原発性胆汁性肝硬変及び肝硬変)に伴う骨減少症、関節リウマチ等の各種リウマチによる骨減少症、ムチランス型を含む関節リウマチ等の各種リウマチによる骨破壊及び関節破壊、変形性関節症、歯周骨喪失、癌の骨転移(骨溶解性転移)、人工関節のゆるみ(人工関節周囲における骨溶解)、動脈の石灰化、歯周病等の感染症に伴う骨減少症、外傷性負傷、ゴシェ病、鎌状赤血球貧血、全身性紅性狼創若しくは非外傷性負傷に伴う骨壊死又は骨細胞死、腎性骨異栄養症等の骨異栄養症、低アルカリフォスファターゼ血症、糖尿病に伴う骨減少症、栄養障害又は摂食障害に伴う骨減少症、その他の骨減少症等が包含される。また、本発明における骨代謝異常症は、前記固形腫瘍、癌の骨転移(骨溶解性転移)、又は血液学的悪性疾患による悪液質をも包含する(特開2000−178200号公報参照)。
本発明に係る徐放性製剤は、患部近傍に埋め込んで使用できるため、歯周骨喪失、癌の骨転移(骨溶解性転移)、人工関節のゆるみ(人工関節周囲における骨溶解)、動脈の石灰化、歯周病等の感染症に伴う骨減少症、外傷性負傷若しくは非外傷性負傷に伴う骨壊死又は骨細胞死のような、局所的に骨減少が起こる疾患に特に適している。ただし、本発明に係る徐放性製剤は、全身性の疾患に対しても効果が期待できる。
また、上述した本発明に係る徐放性製剤の特徴や効果により、本発明に係る徐放性製剤は、骨折治癒促進剤としての使用に特に適している。
本発明に係る徐放性製剤は、各種剤形に調製し、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。本発明に係る徐放性製剤を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等に製剤化するか、使用する際に再溶解させる乾燥生成物であってよい。また、本発明に係る徐放性製剤を非経口投与する場合は、静脈内注射剤(点滴を含む)、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等に製剤化し、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜選択し、常法により製造することができる。
本発明に係る徐放性製剤の投与経路としては、用途に応じて適宜決定することができるが、例えば、経口、腹腔内、静脈内、動脈内、経皮、皮下、筋肉内等が挙げられる。また投与経路としては、患部付近への直接投与も挙げられる。特に、骨の患部又は患部付近に、インプラント等で直接投与することが好ましい。
本発明に係る徐放性製剤の投与量は、投与対象の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数等に応じて適宜決定することができる。例えば、包含されるOCIF/OPG物質の有効量として、1回につき体重1kgあたり1×10−2mg〜1×102mgの範囲の投与量を選ぶことができ、1日数回から1ヶ月数回の頻度で投与することが好ましい。特に、骨の患部又は患部付近に、インプラント等で直接投与する場合には、包含されるOCIF/OPG物質の有効量として、1投与部位につき1×10−2mg〜1×102mgの範囲の投与量を選ぶことができ、週1回以下の頻度で投与することが好ましい。
さらに、上述したように、本発明に係る徐放性製剤は、多孔質粒子が天然骨と同じ成分を有するものであり、且つ骨伝導能を有するものであること、さらにはOCIF/OPG物質を担持することにより骨量の減少を抑制する効果を有することから、骨欠損部充填材の主成分として使用することができる。骨欠損部充填材には、本発明に係る徐放性製剤以外に、例えば、生体分解性又は生体溶解性高分子である合成高分子(ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、乳酸−カプロラクトン共重合体、ポリアンハイドライド、ポリオルソエステル、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリアクリルシアノアクリレート、ポリハイドロキシアルカノエート、ポリフォスフォエステル、ポリアミノ酸、メタアクリル酸コポリマー、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテート、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリN−アルキルアクリルアミド等)、天然高分子(ゼラチン、コラーゲン、デキストラン、デンプン、アルギン酸ナトリウム、寒天、プルラン、アルブミン、カラギーナン、ペクチン、キサンタンガム、ジェランガム、カゼイン、キトサン、フィブリノーゲン等)、及び多孔質インプラント(ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、アパタイト/コラーゲン複合体等)を含有することができる。また、骨欠損部充填材中の本発明に係る徐放性製剤の含有量は、上述の本発明に係る徐放性製剤に包含されるOCIF/OPG物質の有効量に関する記載に準じて適宜決定することができる。
以上に説明したように、本発明に係る徐放性製剤(例えば、骨代謝異常症治療剤、骨折治癒促進剤)又は骨欠損部充填材によれば、一定期間安定してOCIF/OPG物質を徐放することで、安定的に骨量の減少を抑制することができる。また、本発明において、担体として使用する多孔質粒子は、骨の主成分であるリン酸カルシウムと多糖類を含むものであり、骨芽細胞を活性化することにより担体を核としてアパタイトの結晶が成長すると共に、主成分に骨の細胞外基質である多糖類を有するため内軟骨性骨化を生じて骨形成を促進することができる。
このように、本発明によれば、OCIF/OPG物質の破骨細胞分化抑制による骨吸収の抑制作用と、リン酸カルシウムナノ結晶を核とした骨形成の促進作用の両作用が同時に得られることにより、優れた骨量減少の改善又は骨折治癒効果が期待できる。
また、本発明に係る徐放性製剤は、特許文献1記載の徐放性組成物とは異なり、ヒト血清タンパク質を含まず、またムコ多糖類等を粒子の孔に充填する必要がない。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
本発明に係る徐放性製剤は、OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を含むものである。本発明に係る徐放性製剤において、当該OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体は、多孔質粒子の孔内面全体に担持されている。また、本発明に係る徐放性製剤は、二価金属イオンを介してOCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と多孔質粒子の孔内面全体とが結合している。
ここで、OCIF/OPGは、破骨細胞形成抑制活性を指標として単離され、破骨細胞の分化/成熟を抑制する活性を有するタンパク質である(国際公開第96/26217号及び米国特許第6,855,808号)。
具体的には、OCIF/OPGは、下記の(a)〜(d)に記載の物理化学的性質を有し、且つ、破骨細胞の分化及び/又は成熟抑制活性を有するタンパク質を意味する(国際公開第96/26217号及び米国特許第6,855,808号)。
(a)分子量(SDS−PAGEによる):約60kD(還元条件下)、約60kD及び約120kD(非還元条件下)。
(b)親和性:陽イオン交換体及びヘパリンに親和性を有する。
(c)熱安定性:70℃、10分間又は56℃、30分間の加熱処理により、破骨細胞の分化・成熟抑制活性が低下し、90℃、10分間の加熱処理により破骨細胞の分化・成熟抑制活性が失われる。
(d)内部アミノ酸配列:配列番号1〜3記載のアミノ酸配列を内部アミノ酸配列として有する。
なお、配列番号1〜3記載のアミノ酸配列において、Xaaは任意のアミノ酸を取りうるが、好ましくは、配列番号1において1位のXaaはThrであり、配列番号2において1位のXaaはArgであり、5位のXaaはSerであり、13位のXaaはLeuであり、配列番号3において1位のXaaはThrである。
上記(a)の物理化学的性質から判るようにOCIF/OPGは、一量体と二量体の形態をとりうる(国際公開第96/26217号及び米国特許第6,855,808号)。OCIF/OPGを発現する細胞(例えば、天然にはヒト胎児肺線維芽細胞IMR−90(ATCC寄託−受託番号CCL186))を含む培養液等には、当該一量体と二量体とが通常混在する。そこで、通常の分離方法によりいずれか一方の形態のOCIF/OPGを精製し、本発明において使用してもよい。
ヒトOCIF/OPGは、シグナルペプチドを含む前駆体(cDNA:配列番号4及びアミノ酸配列:配列番号5)として合成され、シグナルペプチドが切断され、成熟型タンパク質(配列番号5に示すアミノ酸配列において、シグナルペプチド(第−21番目〜第−1番目のアミノ酸配列)を除くアミノ酸配列)となる。本発明において、OCIF/OPGは、上述のヒト由来のシグナルペプチドを含む前駆体及び成熟型タンパク質のいずれをも含むが、成熟型タンパク質が好ましい。
OCIF/OPG類縁体とは、OCIF/OPGをコードする塩基配列と相補的な塩基配列から成るDNAとハイブリダイズするDNAによりコードされ、且つ破骨細胞分化及び/又は成熟抑制活性を有するタンパク質を意味する。例えば、動物細胞、体液又は組織由来のcDNAライブラリーを鋳型として、ヒトOCIF/OPGのcDNA(配列番号4)と相補的な塩基配列から成るDNAをプローブとし、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされる、破骨細胞分化及び/又は成熟抑制活性を有するタンパク質である。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成される条件をいう。このようなストリンジェントな条件は、当業者には周知であり、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1−6.3.6に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的例としては、約45℃の6X塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)におけるハイブリダイゼーション後、50℃〜65℃の0.2 X SSC、0.1%SDSで1回以上洗浄するものが挙げられる。具体的なOCIF/OPG類縁体としては、例えば、国際公開第96/26217号及び米国特許第6,855,808号に開示のOCIF2(cDNA:配列番号6及びアミノ酸配列:配列番号7)、OCIF3(cDNA:配列番号8及びアミノ酸配列:配列番号9)、OCIF4(cDNA:配列番号10及びアミノ酸配列:配列番号11)及びOCIF5(cDNA:配列番号12及びアミノ酸配列:配列番号13)が挙げられる。なお、OCIF2〜5におけるシグナルペプチドのアミノ酸配列及び成熟型タンパク質のアミノ酸配列は、以下の表1に示す通りである。
OCIF/OPG変異体の好適な態様としては、ヒトOCIF/OPG(配列番号5記載のアミノ酸配列)において数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列から成り、且つ破骨細胞分化及び/又は成熟抑制活性を有するタンパク質、及びヒトOCIF/OPG(配列番号5記載のアミノ酸配列)において第1番目のGluをN末端とし、第176番目〜第379番目のいずれかのアミノ酸をC末端とするタンパク質であって、破骨細胞分化及び/又は成熟抑制活性を有するタンパク質が挙げられる。
さらに、OCIF/OPG変異体には、上述のOCIF/OPG又はOCIF/OPG類縁体をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも約60%〜約65%、好ましくは約70%〜約75%、さらに好ましくは約80%〜約85%、特に好ましくは約90%〜約95%以上同一であるヌクレオチド配列によりコードされ、且つ破骨細胞分化及び/又は成熟抑制活性を有するタンパク質が含まれる。
OCIF/OPG修飾体は、例えば、上述したOCIF/OPG、その類縁体又は変異体へのペプチドや糖鎖の酵素的又は化学的修飾体、或いはポリマー等の高分子化合物や多糖類の修飾体を意味する。OCIF/OPG修飾体としては、例えばタンパク質の翻訳後修飾(例えば、糖の付加、プロテインキナーゼによるリン酸化やホスファターゼによる脱リン酸化)、水溶性ポリマー(ポリエチレングリコール、エチレングリコール/プロピレングリコール共ポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、PolyPEG(copolymer of poly(ethyleneglycol)allylmethylether and maleamic acid sodium salt)、ヘパリン、デキストラン硫酸等)等の化学修飾等の修飾がなされたOCIF/OPG、その類縁体又は変異体が挙げられる。さらに、例えば、OCIF/OPG、その類縁体又は変異体とFc(IgG等の免疫グロブリン由来のFc領域)やアルブミン等のペプチドやタンパク質との融合タンパク質、OCIF/OPG、その類縁体又は変異体と多糖類(ヘパリン、デキストラン硫酸等)との複合体、及びOCIF/OPG、その類縁体又は変異体とPolyPEGとの複合体もOCIF/OPG修飾体に含まれる。
具体的には、OCIF/OPG、その類縁体又は変異体のポリエチレングリコールによる修飾体は、例えば、国際公開第97/23614号に記載の方法により製造できる。また、OCIF/OPG、その類縁体又は変異体の多糖類による修飾体において、多糖類としてはデキストラン硫酸、特にデキストラン硫酸ナトリウム5(DS5)が好ましく、このような修飾体は、例えば特許文献5及び6に記載の方法により製造できる。さらに、OCIF/OPG、その類縁体又は変異体のPolyPEGによる修飾体は、例えば特許文献7及び8に記載の方法により製造できる。
なお、ヒト以外の動物(例えば、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、並びにニワトリ、ガチョウ、シチメンチョウ等の鳥類)由来のOCIF/OPGも、上述の定義の範囲内にあれば、OCIF/OPG類縁体、変異体又は修飾体に含まれる。
OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体(以下、「OCIF/OPG物質」という)は、動物の組織や体液等から、又は動物細胞の培養物等からタンパク質として抽出、精製された天然型のタンパク質として、或いはこれらOCIF/OPG物質をコードするDNA断片又は当該DNA断片を含有するベクターで動物細胞や大腸菌等の宿主を形質転換し、生産される遺伝子組換え型(以下では、「rh」という場合がある)タンパク質として、更にはこれらの修飾体として取得することができる。例えば、国際公開第96/26217号(及び米国特許第6,855,808号)に開示のOCIF/OPGの製造方法に準じて、OCIF/OPG物質をOCIF/OPG物質産生細胞より単離・精製することができる。具体的には、OCIF/OPG物質産生細胞を培養し、培養液をヘパリンカラム(ヘパリン−セファロースCL−6B、ファルマシア社)に供し、2M NaClを含む10mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)で溶出する。次いで、得られたヘパリン吸着性OCIF/OPG物質画分をQ・陰イオン交換カラム(HiLoad−Q/FF、ファルマシア社)に供し、その非吸着画分を集める。このようして、ヘパリン吸着性により塩基性のOCIF/OPG物質画分を得ることができる。得られたOCIF/OPG物質活性画分をS・陽イオン交換カラム(HiLoad−S/HP、ファルマシア社)、ヘパリンカラム(ヘパリン−5PW、トーソー社)、シバクロンブルーカラム(ブルー−5PW、トーソー社)、逆相カラム(BU−300 C4、パーキンエルマー社)に供することにより、OCIF/OPG物質を単離・精製することができる。
OCIF/OPG物質の破骨細胞分化及び/又は成熟抑制活性は、例えば、久米川正好らの方法(蛋白質・核酸・酵素,1989,Vol.34,p.999)及びTakahashi N.らの方法(Endocrinology,1988,Vol.122,p.1373)に従って測定することができる。即ち、例えば生後約17日のマウス骨髄細胞を標的細胞として用い、活性型ビタミンD3(Calcitriol)存在下での破骨細胞の形成抑制を、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性の誘導の抑制として試験することができる。
なお、OCIF/OPG物質のうち、好適にはOCIF/OPG又はその修飾体であり、より好適にはOCIF/OPG又はそのFc融合タンパク質である。
一方、リン酸カルシウムナノ結晶とは、リン酸三カルシウム(Ca3(PO4)2)、リン酸八カルシウム(Ca8H2(PO4)6・5H2O)、アパタイト化合物等であって、大きさが1μmより小さい結晶の総称を意味する。また、アパタイト化合物とは、一般式Ca10(PO4X)6Y2(式中、Xは炭酸基又は欠損を、Yは水酸基、炭酸基、ハロゲン基又は欠損を示す)で表される水酸アパタイト、炭酸アパタイト、フッ素アパタイト、塩素アパタイト等を意味する。さらに、リン酸カルシウムは、カルシウムと共に、或いはカルシウムの一部に置換して、マグネシウム、亜鉛、ストロンチウム及びバリウム等の1種以上の二価金属を含有していてもよい。なお、リン酸カルシウムにおけるリンに対するカルシウムのモル比は、例えば、1.3〜3.4、好ましくは1.5〜3.0である。
リン酸カルシウムナノ結晶の製造に関しては、例えば、水酸アパタイトナノ結晶を製造する場合には、湿式法により製造することができ、下記の式に従って行うことができる(H.Aoki,「Medical Applications of hydroxyapatite」,1994,Ishiyaku EuroAmerica,Inc.,Tokyo,St.Lousi)。
また、本発明において多糖類としては、例えば、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸が挙げられ、コンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸が好ましい。なお、本発明に係る徐放性製剤における多糖類含有量は、例えば、4×10重量%以下、好ましくは4×10重量%〜1×10−1重量%、特に好ましくは1重量%〜2×10重量%である。なお、多糖類としてコンドロイチン硫酸を用いる場合には、例えば、分子量10kDa〜40kDa、好ましくは15kDa〜35kDaのものを用いる。
本発明に係る徐放性製剤は、以上に説明したOCIF/OPG物質、リン酸カルシウムナノ結晶、及び多糖類から製造する。
本発明に係る徐放性製剤の製造方法(以下、「本方法」という)においては、先ずリン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む懸濁液をスプレイドライに供することで、これらリン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を製造する。当該多孔質粒子において、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とが均一に分散していることが好ましい。リン酸カルシウムナノ結晶に対する多糖類の量は、例えば、リン酸カルシウムナノ結晶に対して、1重量%〜2×10重量%、好ましくは2重量%〜1×10重量%とする。また、懸濁液のpHは、例えば5〜9、好ましくは6〜8に調整する。さらに、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む懸濁液は、撹拌操作を継続しながら複合化を促進するために、例えば0時間〜12時間(好ましくは1時間〜4時間)熟成させた後、スプレイドライに供する。ここで、熟成とは、最終pHを7.5〜8.0の範囲に一定に保ち、複合化により得られる結晶の表面状態を生体とほぼ同じpHに保つことで安定させることをいう。具体的には、強アルカリ(水酸化カルシウム)と強酸(リン酸)の中和反応を用いて前記最終pHに設定することにより、熟成を行う。
スプレイドライは、例えばBuchi社、ヤマト科学社、大川原工業社等の二流体ノズル及び四流体ノズルを装備した市販の装置を用いて定法により行うことができるが、表面積を大きくするために、懸濁液を1μm〜5×102μm程度の微細な液滴にし、1×102℃〜3×102℃の熱風中に噴出させ、乾燥させる。
このようにして、スプレイドライ後に得られる多孔質粒子の直径は、例えば1×102μm以下、好ましくは1μm〜1×102μm、特に好ましくは1μm〜3×10μmである。また、多孔質粒子は、例えば、比表面積5×10m2/g〜2×102m2/g、気孔率3×10%〜8×10%である。多孔質粒子の比表面積が5×10m2/gより小さい場合には、十分な量のOCIF/OPG物質を担持させることができず、目的とする放出期間にわたって徐放することができない。一方、多孔質粒子の気孔率が3×10%未満である場合には、OCIF/OPG物質を粒子内部まで均一に担持できず、また8×10%を超える場合には、多孔質粒子が製剤化途中で壊れる。
スプレイドライ後に得られる多孔質粒子の生体内吸収は、例えば6ヶ月以内、好ましくは1/2ヶ月〜3ヶ月、特に好ましくは1ヶ月〜2ヶ月である。
次いで、本方法では、スプレイドライ後に得られる多孔質粒子を、OCIF/OPG物質含有溶液(例えば、OCIF/OPG物質を含む水溶液の形態)に含浸し、混合することで、均一に分散させ、当該多孔質粒子の孔内面全体にOCIF/OPG物質を担持させる。OCIF/OPG物質の添加量は、例えば多孔質粒子1mg当たり1×10−1μg〜2×102μg、好ましくは1μg〜1×102μgとする。多孔質粒子とOCIF/OPG物質との混合は、例えば1時間〜12時間(好ましくは3時間〜6時間)転倒撹拌することにより行われる。
さらに、混合終了後、多孔質粒子とOCIF/OPG物質とを含む混合物を遠心分離に供し、上清(上澄み)を除去する。なお、この段階で、遠心分離を行わずに、二価金属イオンによる結合処理に供することもできる。
多孔質粒子の孔内面全体にOCIF/OPG物質が担持されたことの評価は、上述の遠心分離後に除去した上清(上澄み)をOCIF/OPG物質に対する特異的抗体を用いた免疫学的手法(例えば、ELISA)に供し、上清に残存するOCIF/OPG物質量を測定することにより行うことができる。このような評価により、上清中にOCIF/OPG物質が僅かにしか残存していないことを確認することにより、多孔質粒子の孔内面全体にOCIF/OPG物質が十分担持されたと判断することができる。
次いで、得られたOCIF/OPG物質を担持した多孔質粒子を含む混合物に二価金属イオン含有溶液を添加し、結合処理に供する。この工程により、OCIF/OPG物質と、これを担持した多孔質粒子との結合が行われる。
本発明において、結合とは、リン酸カルシウム表面とOCIF/OPG物質とを金属イオンを介した配位・イオン・共有性の結合等により担持・結合させること、又は多糖類とOCIF/OPG物質との官能基同士の結合を誘起させること、又はリン酸カルシウム表面とOCIF/OPG物質と多糖類との間全てに結合を誘起させることを意味する。当該結合によれば、OCIF/OPG物質と多孔質粒子の孔内面全体とが二価金属イオンを介して結合されることとなる。
結合に用いる二価金属イオンとしては、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン及び銅イオンが挙げられるが、亜鉛イオンが最適である。OCIF/OPG物質を担持した多孔質粒子に対する二価金属イオン量は、例えばOCIF/OPG物質を担持した多孔質粒子1mg当たり1×10−3mg〜1mg、好ましくは1×10−2mg〜1×10−1mgとする。
結合処理では、OCIF/OPG物質を担持した多孔質粒子を含む混合物に二価金属イオン含有溶液を添加した後、転倒撹拌する。次いで、転倒撹拌後、混合物を遠心分離に供し、上清(上澄み)を除去する。さらに、上清を除去することで得られた残渣を例えば精製水で洗浄した後、沈殿物を例えば1時間〜24時間(好ましくは1時間〜12時間)凍結乾燥又は真空乾燥に供する。このようにして、本発明に係る徐放性製剤を得ることができる。
本発明に係る徐放性製剤は、担持するOCIF/OPG物質について少なくとも7日以上の長期間の徐放性を発揮する。また、本発明に係る徐放性製剤は、多孔質粒子が天然骨と同じ成分を有するものである。さらに、本発明に係る徐放性製剤は、粒子自体に起因して、骨伝導能を有している。なお、ここで、骨伝導能とは、骨欠損部位に材料を移植した際に、骨形成を阻害せず、骨芽細胞による骨形成を促進することを意味する。本発明に係る徐放性製剤の骨伝導能は、例えば本発明に係る徐放性製剤を骨欠損部位に適用した後、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色、トルイジンブルー染色、アルカリフォスファターゼ(ALP)染色、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ(TRAP)染色、ビラヌーバ・ゴールドナー染色等の骨形態計測による骨芽細胞面等の測定によって評価することができる。また、本発明に係る徐放性製剤は、OCIF/OPG物質を担持することにより骨量の減少を抑制する効果を有する。
従って、本発明に係る徐放性製剤は、単独で、或いは薬学的に許容される添加物と共に用いることができる。本発明に係る徐放性製剤による治療対象の疾患としては、例えば、骨代謝異常症が挙げられる。即ち、本発明に係る徐放性製剤は、骨代謝異常症治療剤として使用することができる。骨代謝異常症とは、実質的な骨量の減少を特徴とするあらゆる疾患であり、それを治療するか或いは予防するためには骨吸収又は骨吸収速度を抑制する必要がある疾患を意味する。本発明に係る徐放性製剤を用いて治療又は予防される骨代謝異常症には、一次性骨粗鬆症(老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症及び特発性若年性骨粗鬆症)、内分泌骨粗鬆症(甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群及び末端肥大症)、性機能低下に伴う骨粗鬆症(下垂体機能低下症、Klinefelter症候群及びTurner症候群)、遺伝性及び先天性形態の骨粗鬆症(骨形成不全、ホモシスチン尿症、メンケス症、ライリー−デイ症候群並びにOCIF遺伝子の欠損に起因する若年性パジェット病及び高リン血症)、重力負荷軽減又は四肢の固定や不動化による骨減少症、骨パジェット病、骨髄炎、骨喪失による感染性病巣、固形腫瘍(乳癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌等)に起因する高カルシウム血症、血液学的悪性疾患(多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病)、特発性高カルシウム血症、甲状腺機能亢進症又は腎臓機能不全に伴う高カルシウム血症、ステロイド投与に起因する骨減少症、他の薬物(メトトレキセート及びシクロスポリンA等の免疫抑制剤、リューブリン等の抗アンドロジェン剤、ヘパリン及び抗てんかん薬)投与に起因する骨減少症、腎臓機能不全に伴う骨減少症、外科手術、内臓器疾患(小腸障害、大腸障害、慢性肝炎、胃切除、原発性胆汁性肝硬変及び肝硬変)に伴う骨減少症、関節リウマチ等の各種リウマチによる骨減少症、ムチランス型を含む関節リウマチ等の各種リウマチによる骨破壊及び関節破壊、変形性関節症、歯周骨喪失、癌の骨転移(骨溶解性転移)、人工関節のゆるみ(人工関節周囲における骨溶解)、動脈の石灰化、歯周病等の感染症に伴う骨減少症、外傷性負傷、ゴシェ病、鎌状赤血球貧血、全身性紅性狼創若しくは非外傷性負傷に伴う骨壊死又は骨細胞死、腎性骨異栄養症等の骨異栄養症、低アルカリフォスファターゼ血症、糖尿病に伴う骨減少症、栄養障害又は摂食障害に伴う骨減少症、その他の骨減少症等が包含される。また、本発明における骨代謝異常症は、前記固形腫瘍、癌の骨転移(骨溶解性転移)、又は血液学的悪性疾患による悪液質をも包含する(特開2000−178200号公報参照)。
本発明に係る徐放性製剤は、患部近傍に埋め込んで使用できるため、歯周骨喪失、癌の骨転移(骨溶解性転移)、人工関節のゆるみ(人工関節周囲における骨溶解)、動脈の石灰化、歯周病等の感染症に伴う骨減少症、外傷性負傷若しくは非外傷性負傷に伴う骨壊死又は骨細胞死のような、局所的に骨減少が起こる疾患に特に適している。ただし、本発明に係る徐放性製剤は、全身性の疾患に対しても効果が期待できる。
また、上述した本発明に係る徐放性製剤の特徴や効果により、本発明に係る徐放性製剤は、骨折治癒促進剤としての使用に特に適している。
本発明に係る徐放性製剤は、各種剤形に調製し、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。本発明に係る徐放性製剤を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等に製剤化するか、使用する際に再溶解させる乾燥生成物であってよい。また、本発明に係る徐放性製剤を非経口投与する場合は、静脈内注射剤(点滴を含む)、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等に製剤化し、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜選択し、常法により製造することができる。
本発明に係る徐放性製剤の投与経路としては、用途に応じて適宜決定することができるが、例えば、経口、腹腔内、静脈内、動脈内、経皮、皮下、筋肉内等が挙げられる。また投与経路としては、患部付近への直接投与も挙げられる。特に、骨の患部又は患部付近に、インプラント等で直接投与することが好ましい。
本発明に係る徐放性製剤の投与量は、投与対象の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数等に応じて適宜決定することができる。例えば、包含されるOCIF/OPG物質の有効量として、1回につき体重1kgあたり1×10−2mg〜1×102mgの範囲の投与量を選ぶことができ、1日数回から1ヶ月数回の頻度で投与することが好ましい。特に、骨の患部又は患部付近に、インプラント等で直接投与する場合には、包含されるOCIF/OPG物質の有効量として、1投与部位につき1×10−2mg〜1×102mgの範囲の投与量を選ぶことができ、週1回以下の頻度で投与することが好ましい。
さらに、上述したように、本発明に係る徐放性製剤は、多孔質粒子が天然骨と同じ成分を有するものであり、且つ骨伝導能を有するものであること、さらにはOCIF/OPG物質を担持することにより骨量の減少を抑制する効果を有することから、骨欠損部充填材の主成分として使用することができる。骨欠損部充填材には、本発明に係る徐放性製剤以外に、例えば、生体分解性又は生体溶解性高分子である合成高分子(ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、乳酸−カプロラクトン共重合体、ポリアンハイドライド、ポリオルソエステル、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリアクリルシアノアクリレート、ポリハイドロキシアルカノエート、ポリフォスフォエステル、ポリアミノ酸、メタアクリル酸コポリマー、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテート、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリN−アルキルアクリルアミド等)、天然高分子(ゼラチン、コラーゲン、デキストラン、デンプン、アルギン酸ナトリウム、寒天、プルラン、アルブミン、カラギーナン、ペクチン、キサンタンガム、ジェランガム、カゼイン、キトサン、フィブリノーゲン等)、及び多孔質インプラント(ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、アパタイト/コラーゲン複合体等)を含有することができる。また、骨欠損部充填材中の本発明に係る徐放性製剤の含有量は、上述の本発明に係る徐放性製剤に包含されるOCIF/OPG物質の有効量に関する記載に準じて適宜決定することができる。
以上に説明したように、本発明に係る徐放性製剤(例えば、骨代謝異常症治療剤、骨折治癒促進剤)又は骨欠損部充填材によれば、一定期間安定してOCIF/OPG物質を徐放することで、安定的に骨量の減少を抑制することができる。また、本発明において、担体として使用する多孔質粒子は、骨の主成分であるリン酸カルシウムと多糖類を含むものであり、骨芽細胞を活性化することにより担体を核としてアパタイトの結晶が成長すると共に、主成分に骨の細胞外基質である多糖類を有するため内軟骨性骨化を生じて骨形成を促進することができる。
このように、本発明によれば、OCIF/OPG物質の破骨細胞分化抑制による骨吸収の抑制作用と、リン酸カルシウムナノ結晶を核とした骨形成の促進作用の両作用が同時に得られることにより、優れた骨量減少の改善又は骨折治癒効果が期待できる。
また、本発明に係る徐放性製剤は、特許文献1記載の徐放性組成物とは異なり、ヒト血清タンパク質を含まず、またムコ多糖類等を粒子の孔に充填する必要がない。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
ヒドロキシアパタイト/コンドロイチン硫酸複合(以下、「HAp/ChS」という)多孔質粒子(本発明における多孔質粒子に相当)の合成及び当該粒子の粒径測定
コンドロイチン硫酸(以下、「ChS」という;分子量15kDa)を分散させた0.25mol/lの水酸化カルシウム懸濁液に、0.15mol/lのリン酸水溶液を滴下し、最終pHを7.5〜8.0に調整し、HAp/ChSゲルを作製した。なお、ChS添加量は理想的に得られるヒドロキシアパタイト(以下、「HAp」という)重量に対して2、5、10、20重量%になるように加えた。12時間熟成させた後、スプレイドライヤー(商品名:ミニスプレイドライヤー、Buchi社製)によりHAp/ChS多孔質粒子を得た。
また、得られたHAp/ChS多孔質粒子を粒度分布測定に供した。その結果、得られたHAp/ChS多孔質粒子は、1μm〜20μmの分布を有し、平均粒子径4μmであった。
コンドロイチン硫酸(以下、「ChS」という;分子量15kDa)を分散させた0.25mol/lの水酸化カルシウム懸濁液に、0.15mol/lのリン酸水溶液を滴下し、最終pHを7.5〜8.0に調整し、HAp/ChSゲルを作製した。なお、ChS添加量は理想的に得られるヒドロキシアパタイト(以下、「HAp」という)重量に対して2、5、10、20重量%になるように加えた。12時間熟成させた後、スプレイドライヤー(商品名:ミニスプレイドライヤー、Buchi社製)によりHAp/ChS多孔質粒子を得た。
また、得られたHAp/ChS多孔質粒子を粒度分布測定に供した。その結果、得られたHAp/ChS多孔質粒子は、1μm〜20μmの分布を有し、平均粒子径4μmであった。
OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子(本発明に係る徐放性製剤に相当)の製造
OCIF/OPGとしては、Sf21細胞で発現させた遺伝子組換え型OCIF/OPG−Fc(以下、「rh−OCIF−Fc」という;全長ヒトOCIFタンパク質とヒトIgGのFc領域との融合タンパク質、R&D社製)を用いた。当該全長ヒトOCIFタンパク質は、配列番号5に示すアミノ酸配列において、シグナルペプチド(第−21番目〜第−1番目のアミノ酸配列)を除くアミノ酸配列から成る成熟型タンパク質である。
5μg/mlになるようにrh−OCIF−Fcを5mlの10%PBSに溶解し、次いで実施例1で作製したHAp/ChS(2重量%)多孔質粒子250mgをそれぞれ加えた(0.1μg/1mg;rh−OCIF−Fc/HAp/ChS多孔質粒子)。当該混合物を、室温にて4時間転倒撹拌に供した。
4時間の転倒撹拌後、結合処理を、塩化亜鉛水溶液(10mg/ml、pH5.5)を3ml加えてさらに転倒撹拌に供することで行った。当該結合処理によれば、rh−OCIF−Fcと多孔質粒子の孔内面全体とが亜鉛イオンを介して結合されることとなる。
2時間の転倒撹拌後、遠心分離(3500rpm、10分)にて上清(上澄み)を分抽し、残渣を精製水にて洗浄を行った後、沈殿物を一晩凍結乾燥させた。このようにして、OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子を製造した。また、結合処理を施さないものに関しても同様の方法により作製した。
また、上述の遠心分離後の上澄みに残存しているrh−OCIF−Fcを、ELISA法(Human Osteoprotegerin ELISA,Biovendor Laboratory Medicine,Inc.)により定量した。その結果、いずれの系でも99%のrh−OCIF−FcがHAp/ChS多孔質粒子に吸着していることが分かった。
OCIF/OPGとしては、Sf21細胞で発現させた遺伝子組換え型OCIF/OPG−Fc(以下、「rh−OCIF−Fc」という;全長ヒトOCIFタンパク質とヒトIgGのFc領域との融合タンパク質、R&D社製)を用いた。当該全長ヒトOCIFタンパク質は、配列番号5に示すアミノ酸配列において、シグナルペプチド(第−21番目〜第−1番目のアミノ酸配列)を除くアミノ酸配列から成る成熟型タンパク質である。
5μg/mlになるようにrh−OCIF−Fcを5mlの10%PBSに溶解し、次いで実施例1で作製したHAp/ChS(2重量%)多孔質粒子250mgをそれぞれ加えた(0.1μg/1mg;rh−OCIF−Fc/HAp/ChS多孔質粒子)。当該混合物を、室温にて4時間転倒撹拌に供した。
4時間の転倒撹拌後、結合処理を、塩化亜鉛水溶液(10mg/ml、pH5.5)を3ml加えてさらに転倒撹拌に供することで行った。当該結合処理によれば、rh−OCIF−Fcと多孔質粒子の孔内面全体とが亜鉛イオンを介して結合されることとなる。
2時間の転倒撹拌後、遠心分離(3500rpm、10分)にて上清(上澄み)を分抽し、残渣を精製水にて洗浄を行った後、沈殿物を一晩凍結乾燥させた。このようにして、OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子を製造した。また、結合処理を施さないものに関しても同様の方法により作製した。
また、上述の遠心分離後の上澄みに残存しているrh−OCIF−Fcを、ELISA法(Human Osteoprotegerin ELISA,Biovendor Laboratory Medicine,Inc.)により定量した。その結果、いずれの系でも99%のrh−OCIF−FcがHAp/ChS多孔質粒子に吸着していることが分かった。
亜鉛イオン結合処理効果−徐放性1
実施例2で作製したOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子を10mg秤取り、5mlのPBSに分散させ、37℃で転倒撹拌を行った。放出試験は、1時間〜7日間の期間で行った。なお、実施例1で作製したHAp/ChS(5重量%)多孔質粒子を用いて、rh−OCIF−Fcを担持させ、亜鉛イオンを用いる結合処理を行うことで作製したOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子も同様に、放出試験を行った。
撹拌させた試料について、実施例2と同じ条件にて遠心分離し、得られた上澄みのrh−OCIF−Fcの定量をELISA法を用いて行った。結果を図1に示す。
図1は、各OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子から徐放されたrh−OCIF−Fcを経時的に示す。図1において、各略号は、以下の通りである。
「HAp」:ヒドロキシアパタイトのみ、「HAp/ChS2%」:OCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理なし)、「HAp/ChS2%+Zn」:OCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理あり)、「HAp/ChS5%+Zn」:OCIF/OPG担持HAp/ChS(5重量%)多孔質粒子(結合処理あり)
図1に示すように、未結合(結合処理なし)OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子と亜鉛イオンを用いて結合処理したOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子では、直線的なrh−OCIF−Fcの放出が観察されたが、亜鉛イオンを加えることにより明らかに放出量が制御されていることが分かった。
実施例2で作製したOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子を10mg秤取り、5mlのPBSに分散させ、37℃で転倒撹拌を行った。放出試験は、1時間〜7日間の期間で行った。なお、実施例1で作製したHAp/ChS(5重量%)多孔質粒子を用いて、rh−OCIF−Fcを担持させ、亜鉛イオンを用いる結合処理を行うことで作製したOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子も同様に、放出試験を行った。
撹拌させた試料について、実施例2と同じ条件にて遠心分離し、得られた上澄みのrh−OCIF−Fcの定量をELISA法を用いて行った。結果を図1に示す。
図1は、各OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子から徐放されたrh−OCIF−Fcを経時的に示す。図1において、各略号は、以下の通りである。
「HAp」:ヒドロキシアパタイトのみ、「HAp/ChS2%」:OCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理なし)、「HAp/ChS2%+Zn」:OCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理あり)、「HAp/ChS5%+Zn」:OCIF/OPG担持HAp/ChS(5重量%)多孔質粒子(結合処理あり)
図1に示すように、未結合(結合処理なし)OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子と亜鉛イオンを用いて結合処理したOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子では、直線的なrh−OCIF−Fcの放出が観察されたが、亜鉛イオンを加えることにより明らかに放出量が制御されていることが分かった。
OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子量による放出挙動−徐放性2
実施例2で作製したOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子を10mg又は20mg秤取り、実施例3と同様の方法で徐放性を検討した。結果を図2に示す。
図2は、10mg又は20mgの各OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子から徐放されたrh−OCIF−Fcを経時的に示す。図2において、各略号は、以下の通りである。
「HAp/ChS2%(10mg)」:10mgのOCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理なし)、「HAp/ChS2%(20mg)」:20mgのOCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理なし)、「HAp/ChS2%+Zn(10mg)」:10mgのOCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理あり)、「HAp/ChS2%+Zn(20mg)」:20mgのOCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理あり)
図2に示すように、5mlのPBS中での各OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子による徐放は直線的であった。未結合OCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子の場合には、7日後に2.5ng/ml(重量10mg)と5.0ng/ml(重量20mg)となり、一方、亜鉛イオンを用いて結合処理したOCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子の場合には、7日後に0.7ng/ml(重量10mg)と1.4ng/ml(重量20mg)となり、加える粒子量により正の相関があることが分かる。
実施例2で作製したOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子を10mg又は20mg秤取り、実施例3と同様の方法で徐放性を検討した。結果を図2に示す。
図2は、10mg又は20mgの各OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子から徐放されたrh−OCIF−Fcを経時的に示す。図2において、各略号は、以下の通りである。
「HAp/ChS2%(10mg)」:10mgのOCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理なし)、「HAp/ChS2%(20mg)」:20mgのOCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理なし)、「HAp/ChS2%+Zn(10mg)」:10mgのOCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理あり)、「HAp/ChS2%+Zn(20mg)」:20mgのOCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理あり)
図2に示すように、5mlのPBS中での各OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子による徐放は直線的であった。未結合OCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子の場合には、7日後に2.5ng/ml(重量10mg)と5.0ng/ml(重量20mg)となり、一方、亜鉛イオンを用いて結合処理したOCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子の場合には、7日後に0.7ng/ml(重量10mg)と1.4ng/ml(重量20mg)となり、加える粒子量により正の相関があることが分かる。
生産細胞とアミノ酸配列の異なるOCIF/OPGを用いた徐放性試験
OCIF/OPGとして、実施例1で用いた市販のrh−OCIF−Fc(Sf21細胞で発現)と国際公開第96/26217号及び米国特許第6,855,808号に記載の方法に準じてCHO細胞で発現させ、精製したrh−OCIFとを用いた。なお、CHO細胞で発現させたrh−OCIFタンパク質は、配列番号5に示すアミノ酸配列において、シグナルペプチド(第−21番目〜第−1番目のアミノ酸配列)を除くアミノ酸配列から成る成熟型タンパク質である。
10μg/mlになるようにrh−OCIF−Fcとrh−OCIFをそれぞれ5mlの10%PBS中に分散させ、実施例1で作製したHAp/ChS(2重量%)多孔質粒子125mgをそれぞれ加えた(0.4μg/1mg;rh−OCIF−Fc又はrh−OCIF / HAp/ChS多孔質粒子)。当該混合物を、室温にて4時間転倒撹拌に供した。
4時間の転倒撹拌後、結合処理を、塩化亜鉛水溶液(10mg/ml、pH5.5)を3ml加えてさらに転倒撹拌に供することで行った。当該結合処理によれば、rh−OCIF−Fc又はrh−OCIFと多孔質粒子の孔内面全体とが亜鉛イオンを介して結合されることとなる。
2時間の転倒撹拌後、遠心分離(3500rpm、10分)にて上澄み液を分抽し、精製水にて洗浄を行った後、沈殿物を一晩凍結乾燥させた。このようにして、生産細胞とアミノ酸配列の異なるOCIF/OPGを担持したHAp/ChS多孔質粒子を製造した。また、結合処理を施さないものに関しても同様の方法により作製した。
次いで、作製したOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子を10mg秤取り、5mlのPBSに分散させて、37℃で転倒撹拌を行った。放出試験は、1時間〜1週間の期間で行った。
撹拌させた試料について、実施例2と同じ条件にて遠心分離し、得られた上澄みのrh−OCIF−Fcとrh−OCIFの定量をELISA法を用いて行った。結果を図3に示す。
図3は、生産細胞とアミノ酸配列の異なるOCIF/OPGを担持したHAp/ChS多孔質粒子から徐放されたrh−OCIF−Fcとrh−OCIFを経時的に示す。図3A(Sf2細胞で発現させたrh−OCIF−Fc)及び図3B(CHO細胞で発現させたrh−OCIF)において、各略号は、以下の通りである。
「HAp/ChS2%」:OCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理なし)、「HAp/ChS2%+Zn」:OCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理あり)
図3に示すように、未結合OCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子では、市販のrh−OCIF−Fc(Sf2細胞で発現)がCHO細胞で生産したrh−OCIFに対して高い放出量を示した。また、未結合の場合はどちらも不安定な放出であった。一方、亜鉛イオンを用いて結合処理したOCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子では、いずれにおいても一次直線的な増加が観測された。放出量は市販のrh−OCIF−Fc(Sf2細胞で発現)の方が若干高い値を示した。
OCIF/OPGとして、実施例1で用いた市販のrh−OCIF−Fc(Sf21細胞で発現)と国際公開第96/26217号及び米国特許第6,855,808号に記載の方法に準じてCHO細胞で発現させ、精製したrh−OCIFとを用いた。なお、CHO細胞で発現させたrh−OCIFタンパク質は、配列番号5に示すアミノ酸配列において、シグナルペプチド(第−21番目〜第−1番目のアミノ酸配列)を除くアミノ酸配列から成る成熟型タンパク質である。
10μg/mlになるようにrh−OCIF−Fcとrh−OCIFをそれぞれ5mlの10%PBS中に分散させ、実施例1で作製したHAp/ChS(2重量%)多孔質粒子125mgをそれぞれ加えた(0.4μg/1mg;rh−OCIF−Fc又はrh−OCIF / HAp/ChS多孔質粒子)。当該混合物を、室温にて4時間転倒撹拌に供した。
4時間の転倒撹拌後、結合処理を、塩化亜鉛水溶液(10mg/ml、pH5.5)を3ml加えてさらに転倒撹拌に供することで行った。当該結合処理によれば、rh−OCIF−Fc又はrh−OCIFと多孔質粒子の孔内面全体とが亜鉛イオンを介して結合されることとなる。
2時間の転倒撹拌後、遠心分離(3500rpm、10分)にて上澄み液を分抽し、精製水にて洗浄を行った後、沈殿物を一晩凍結乾燥させた。このようにして、生産細胞とアミノ酸配列の異なるOCIF/OPGを担持したHAp/ChS多孔質粒子を製造した。また、結合処理を施さないものに関しても同様の方法により作製した。
次いで、作製したOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子を10mg秤取り、5mlのPBSに分散させて、37℃で転倒撹拌を行った。放出試験は、1時間〜1週間の期間で行った。
撹拌させた試料について、実施例2と同じ条件にて遠心分離し、得られた上澄みのrh−OCIF−Fcとrh−OCIFの定量をELISA法を用いて行った。結果を図3に示す。
図3は、生産細胞とアミノ酸配列の異なるOCIF/OPGを担持したHAp/ChS多孔質粒子から徐放されたrh−OCIF−Fcとrh−OCIFを経時的に示す。図3A(Sf2細胞で発現させたrh−OCIF−Fc)及び図3B(CHO細胞で発現させたrh−OCIF)において、各略号は、以下の通りである。
「HAp/ChS2%」:OCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理なし)、「HAp/ChS2%+Zn」:OCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理あり)
図3に示すように、未結合OCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子では、市販のrh−OCIF−Fc(Sf2細胞で発現)がCHO細胞で生産したrh−OCIFに対して高い放出量を示した。また、未結合の場合はどちらも不安定な放出であった。一方、亜鉛イオンを用いて結合処理したOCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子では、いずれにおいても一次直線的な増加が観測された。放出量は市販のrh−OCIF−Fc(Sf2細胞で発現)の方が若干高い値を示した。
OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子の徐放化
実施例2〜5に示したように、徐放性に関して亜鉛イオン結合処理が有効であることが明らかとなったので、さらにHAp/ChS多孔質粒子1mg当たりのOCIF/OPG担持量を増加させて徐放性試験を行った。試験には、実施例5においてCHO細胞で生産したrh−OCIFを用いた。
80μg/mlになるようにrh−OCIFを5mlの10%PBS中に分散させ、実施例1で作製したHAp/ChS(2重量%)多孔質粒子50mgを加えた(8μg/1mg;rh−OCIF/HAp/ChS多孔質粒子)。当該混合物を、室温にて4時間転倒撹拌に供した。
4時間の転倒撹拌後、結合処理を、塩化亜鉛水溶液(10mg/ml、pH5.5)を3ml加えてさらに転倒撹拌に供することにより行った。当該結合処理によれば、rh−OCIFと多孔質粒子の孔内面全体とが亜鉛イオンを介して結合されることとなる。
2時間の転倒撹拌後、遠心分離(3500rpm、10分)にて上澄み液を分抽し、精製水にて洗浄を行った後、沈殿物を一晩凍結乾燥させた。このようにして、OCIF/OPG担持量を増加させたOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子を製造した。また、結合処理を施さないものに関しても同様の方法により作製した。
次いで、作製したOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子を5mg秤取り、5mlのPBSに分散させて37℃で転倒撹拌を行った。放出試験は、1時間〜1週間の期間で行った。
撹拌させた試料について、実施例2と同じ条件にて遠心分離し、得られた上澄みのrh−OCIFの定量をELISA法を用いて行った。結果を図4に示す。
図4は、OCIF/OPG担持量を増加させたOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子から徐放されたrh−OCIFを経時的に示す。図4において、各略号は、以下の通りである。
「HAp/ChS2%」:OCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理なし)、「HAp/ChS2%+Zn」:OCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理あり)
図4に示すように、実施例5と同様に亜鉛イオン結合処理を行わない場合は、初期に薬物(rh−OCIF)の大量放出(バースト)が観測されるが、亜鉛イオン結合処理を行うことで殆ど初期バーストを無くすことができた。この実験から、OCIF/OPGの効果が十分に発揮される濃度範囲(1日当たりED508ng/ml〜24ng/ml)に到達させるためには、OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子30mg程度で十分であることが明らかであった。
実施例2〜5に示したように、徐放性に関して亜鉛イオン結合処理が有効であることが明らかとなったので、さらにHAp/ChS多孔質粒子1mg当たりのOCIF/OPG担持量を増加させて徐放性試験を行った。試験には、実施例5においてCHO細胞で生産したrh−OCIFを用いた。
80μg/mlになるようにrh−OCIFを5mlの10%PBS中に分散させ、実施例1で作製したHAp/ChS(2重量%)多孔質粒子50mgを加えた(8μg/1mg;rh−OCIF/HAp/ChS多孔質粒子)。当該混合物を、室温にて4時間転倒撹拌に供した。
4時間の転倒撹拌後、結合処理を、塩化亜鉛水溶液(10mg/ml、pH5.5)を3ml加えてさらに転倒撹拌に供することにより行った。当該結合処理によれば、rh−OCIFと多孔質粒子の孔内面全体とが亜鉛イオンを介して結合されることとなる。
2時間の転倒撹拌後、遠心分離(3500rpm、10分)にて上澄み液を分抽し、精製水にて洗浄を行った後、沈殿物を一晩凍結乾燥させた。このようにして、OCIF/OPG担持量を増加させたOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子を製造した。また、結合処理を施さないものに関しても同様の方法により作製した。
次いで、作製したOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子を5mg秤取り、5mlのPBSに分散させて37℃で転倒撹拌を行った。放出試験は、1時間〜1週間の期間で行った。
撹拌させた試料について、実施例2と同じ条件にて遠心分離し、得られた上澄みのrh−OCIFの定量をELISA法を用いて行った。結果を図4に示す。
図4は、OCIF/OPG担持量を増加させたOCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子から徐放されたrh−OCIFを経時的に示す。図4において、各略号は、以下の通りである。
「HAp/ChS2%」:OCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理なし)、「HAp/ChS2%+Zn」:OCIF/OPG担持HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子(結合処理あり)
図4に示すように、実施例5と同様に亜鉛イオン結合処理を行わない場合は、初期に薬物(rh−OCIF)の大量放出(バースト)が観測されるが、亜鉛イオン結合処理を行うことで殆ど初期バーストを無くすことができた。この実験から、OCIF/OPGの効果が十分に発揮される濃度範囲(1日当たりED508ng/ml〜24ng/ml)に到達させるためには、OCIF/OPG担持HAp/ChS多孔質粒子30mg程度で十分であることが明らかであった。
担体材料(HAp/ChS多孔質粒子)の骨形成能の評価
生後10週の日本白色雄性家兎8匹を使用し、ウサギの両下肢骨孔内(計16肢、ドリルホールは32個)に、生理食塩水、実施例1で作製したHAp/ChS多孔質粒子(ChS重量:2重量%、10重量%、20重量%)の4種類をそれぞれ埋入し、比較した。
ウサギを手術台上に仰臥位で固定し、後肢大腿骨内顆中央と脛骨近位内側中央で骨膜を剥離した。次いで、電動ドリルで直径4mmの骨孔を対側皮質骨まで穿った。
さらに、骨膜、軟部組織、皮膚を4−0ナイロンにて縫合した後、生理食塩水又は各ChS濃度のHAp/ChS多孔質粒子を23G針付き注射筒(1ml)にてホール内に埋入した。
埋入の2週間又は4週間後に、ウサギを屠殺し、その後、ドリルホール部分の骨を2分割(水平断)し、近位側をホルマリン固定、遠位側を70%Ethanol固定に供した。
固定後、それぞれの試料について、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色、トルイジンブルー染色、アルカリフォスファターゼ(ALP)染色、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ(TRAP)染色、ビラヌーバ・ゴールドナー染色を行い、標本を作製した。
各標本の骨形態計測を行い、骨孔内の骨量(Bone volume/Total volume,BV/TV)、骨芽細胞面(Osteoblast surface / Bone surface;Ob.S/BS)を算出した。結果を図5に示す。
図5は、各ChS濃度のHAp/ChS多孔質粒子埋入の2週間又は4週間後のBV/TV及びOb.S/BSの算出結果を示す。図5A及びBは、それぞれ埋入2週間後のBV/TV及びOb.S/BSの算出結果である。また、図5C及びDは、それぞれ埋入4週間後のBV/TV及びOb.S/BSの算出結果である。図5A〜Dにおいて、各略号は、以下の通りである。
「Saline」:生理食塩水、「2%ChS」:HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子、「10%ChS」:HAp/ChS(10重量%)多孔質粒子、「20%ChS」:HAp/ChS(20重量%)多孔質粒子
図5に示すように、BV/TV及びOb.S/BSは、HAp/ChS多孔質粒子投与群で生理食塩水投与群に比べて増加していた。HAp/ChS(20重量%)多孔質粒子投与群は、Ob.S/BSが埋入2週間後に大きく、BV/TVが埋入4週間後に大きいことから、骨芽細胞の活性化により骨形成を促進する可能性が示唆された。
生後10週の日本白色雄性家兎8匹を使用し、ウサギの両下肢骨孔内(計16肢、ドリルホールは32個)に、生理食塩水、実施例1で作製したHAp/ChS多孔質粒子(ChS重量:2重量%、10重量%、20重量%)の4種類をそれぞれ埋入し、比較した。
ウサギを手術台上に仰臥位で固定し、後肢大腿骨内顆中央と脛骨近位内側中央で骨膜を剥離した。次いで、電動ドリルで直径4mmの骨孔を対側皮質骨まで穿った。
さらに、骨膜、軟部組織、皮膚を4−0ナイロンにて縫合した後、生理食塩水又は各ChS濃度のHAp/ChS多孔質粒子を23G針付き注射筒(1ml)にてホール内に埋入した。
埋入の2週間又は4週間後に、ウサギを屠殺し、その後、ドリルホール部分の骨を2分割(水平断)し、近位側をホルマリン固定、遠位側を70%Ethanol固定に供した。
固定後、それぞれの試料について、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色、トルイジンブルー染色、アルカリフォスファターゼ(ALP)染色、酒石酸耐性酸性フォスファターゼ(TRAP)染色、ビラヌーバ・ゴールドナー染色を行い、標本を作製した。
各標本の骨形態計測を行い、骨孔内の骨量(Bone volume/Total volume,BV/TV)、骨芽細胞面(Osteoblast surface / Bone surface;Ob.S/BS)を算出した。結果を図5に示す。
図5は、各ChS濃度のHAp/ChS多孔質粒子埋入の2週間又は4週間後のBV/TV及びOb.S/BSの算出結果を示す。図5A及びBは、それぞれ埋入2週間後のBV/TV及びOb.S/BSの算出結果である。また、図5C及びDは、それぞれ埋入4週間後のBV/TV及びOb.S/BSの算出結果である。図5A〜Dにおいて、各略号は、以下の通りである。
「Saline」:生理食塩水、「2%ChS」:HAp/ChS(2重量%)多孔質粒子、「10%ChS」:HAp/ChS(10重量%)多孔質粒子、「20%ChS」:HAp/ChS(20重量%)多孔質粒子
図5に示すように、BV/TV及びOb.S/BSは、HAp/ChS多孔質粒子投与群で生理食塩水投与群に比べて増加していた。HAp/ChS(20重量%)多孔質粒子投与群は、Ob.S/BSが埋入2週間後に大きく、BV/TVが埋入4週間後に大きいことから、骨芽細胞の活性化により骨形成を促進する可能性が示唆された。
骨延長におけるHAp/ChS多孔質粒子の骨誘導評価
日本白色家兎14匹(1.9kg〜2.2kg)を用い、対照群(n=7)とHAp/ChS多孔質粒子投与群(n=7)との2群に分け、実験を行った。
全身麻酔下に全ウサギの右脛骨に対して創外固定器を装着し、脛骨骨切り術を行った。骨切り術の1週間後より1日1mmの骨延長を14日間行った。
骨延長開始後7日目に、対照群に対しては生理食塩水0.2ml、HAp/ChS多孔質粒子投与群には実施例1で作製したHAp/ChS(2重量%)多孔質粒子100mgと生理食塩水0.2mlとの混合液0.2mlを注入した。その後6週間の固定期間後にウサギを安楽死させた。
骨誘導評価を、TRAP染色、ビラヌーバ・ゴールドナー染色及びALP染色により、順に破骨細胞数(N.Oc/BS)と相対類骨量(Osteoid volume / Bone volume)、骨量(Bone volume)、骨芽細胞数を算出した。また、HE染色及びトルイジンブルー染色を、実施例7に記載の方法と同様にして行った。
μCT画像解析をTRI/3D−BON(ラトックシステムエンジニアリング(株)、東京)により行った。
さらに、DXA(Dual energy X−ray absorptiometry device)法による骨密度計測を、DCS−600(アロカ(株)、東京)により行った。
結果を図6〜10に示す。
図6は、μCT画像解析の結果を示す。図6から判るように、対照群及びHAp/ChS多孔質粒子投与群は、両者ともに骨形成が良好であった。HAp/ChS多孔質粒子投与群は、対照群と比して良好な骨髄内海綿骨の形成が観察された。
図7は、ビラヌーバ・ゴールドナー染色の結果を示す。また、図8は、HE染色及びトルイジンブルー染色の結果を示す。図7及び8より、HAp/ChS多孔質粒子投与群は対照群と比して良好な海綿骨を形成することがビラヌーバ・ゴールドナー染色及びHE染色で示された。また、図8の如く、対照群では骨髄内で内軟骨性骨化が生じ(太い矢印)、lacunaeには立方形の活性化した骨芽細胞が並んでいた(細い矢印)。一方、図8に示すように、HAp/ChS多孔質粒子投与群でも同様に骨髄内で内軟骨性骨化が生じていた(太い矢印)。一部には髄内に数層の線維芽細胞に包まれてHAp/ChS多孔質粒子の顆粒が残存している個体も確認できた。
図9は、骨量(図9A)及び相対類骨量(図9B)の定量結果を示す。図9A及びBにおいて、「対照」は対照群の結果を示し、「HAp/ChS」はHAp/ChS多孔質粒子投与群の結果を示す。図9に示すように、HAp/ChS多孔質粒子投与群においては、骨量が多く、相対類骨量が少ない傾向にあった。これはHAp/ChS多孔質粒子投与群で新生骨形成とその成熟が促進されていることを示す。
図10は、DXA法により計測した骨密度の結果を示す。図10において、「対照」は対照群の結果を示し、「HAp/ChS」はHAp/ChS多孔質粒子投与群の結果を示す。図10に示すように、DXA法により計測した骨密度もHAp/ChS多孔質粒子投与群が高い傾向にあり、組織像とともにHAp/ChS多孔質粒子の骨形成促進能を裏付けていた。
日本白色家兎14匹(1.9kg〜2.2kg)を用い、対照群(n=7)とHAp/ChS多孔質粒子投与群(n=7)との2群に分け、実験を行った。
全身麻酔下に全ウサギの右脛骨に対して創外固定器を装着し、脛骨骨切り術を行った。骨切り術の1週間後より1日1mmの骨延長を14日間行った。
骨延長開始後7日目に、対照群に対しては生理食塩水0.2ml、HAp/ChS多孔質粒子投与群には実施例1で作製したHAp/ChS(2重量%)多孔質粒子100mgと生理食塩水0.2mlとの混合液0.2mlを注入した。その後6週間の固定期間後にウサギを安楽死させた。
骨誘導評価を、TRAP染色、ビラヌーバ・ゴールドナー染色及びALP染色により、順に破骨細胞数(N.Oc/BS)と相対類骨量(Osteoid volume / Bone volume)、骨量(Bone volume)、骨芽細胞数を算出した。また、HE染色及びトルイジンブルー染色を、実施例7に記載の方法と同様にして行った。
μCT画像解析をTRI/3D−BON(ラトックシステムエンジニアリング(株)、東京)により行った。
さらに、DXA(Dual energy X−ray absorptiometry device)法による骨密度計測を、DCS−600(アロカ(株)、東京)により行った。
結果を図6〜10に示す。
図6は、μCT画像解析の結果を示す。図6から判るように、対照群及びHAp/ChS多孔質粒子投与群は、両者ともに骨形成が良好であった。HAp/ChS多孔質粒子投与群は、対照群と比して良好な骨髄内海綿骨の形成が観察された。
図7は、ビラヌーバ・ゴールドナー染色の結果を示す。また、図8は、HE染色及びトルイジンブルー染色の結果を示す。図7及び8より、HAp/ChS多孔質粒子投与群は対照群と比して良好な海綿骨を形成することがビラヌーバ・ゴールドナー染色及びHE染色で示された。また、図8の如く、対照群では骨髄内で内軟骨性骨化が生じ(太い矢印)、lacunaeには立方形の活性化した骨芽細胞が並んでいた(細い矢印)。一方、図8に示すように、HAp/ChS多孔質粒子投与群でも同様に骨髄内で内軟骨性骨化が生じていた(太い矢印)。一部には髄内に数層の線維芽細胞に包まれてHAp/ChS多孔質粒子の顆粒が残存している個体も確認できた。
図9は、骨量(図9A)及び相対類骨量(図9B)の定量結果を示す。図9A及びBにおいて、「対照」は対照群の結果を示し、「HAp/ChS」はHAp/ChS多孔質粒子投与群の結果を示す。図9に示すように、HAp/ChS多孔質粒子投与群においては、骨量が多く、相対類骨量が少ない傾向にあった。これはHAp/ChS多孔質粒子投与群で新生骨形成とその成熟が促進されていることを示す。
図10は、DXA法により計測した骨密度の結果を示す。図10において、「対照」は対照群の結果を示し、「HAp/ChS」はHAp/ChS多孔質粒子投与群の結果を示す。図10に示すように、DXA法により計測した骨密度もHAp/ChS多孔質粒子投与群が高い傾向にあり、組織像とともにHAp/ChS多孔質粒子の骨形成促進能を裏付けていた。
ラットにおける徐放性の評価
800μg/mlになるようにrh−OCIF(実施例5に示した、CHO細胞で生産したもの)を12.5mlの10%PBS中に分散させ、実施例1で作製したHAp/ChS(2重量%)多孔質粒子125mgを加えた(80μg/mg;rh−OCIF / HAp/ChS多孔質粒子)。当該混合物を、室温にて4時間転倒撹拌に供した。また、結合処理を施さないものに関しても同様の方法により作製した。以下では、結合処理を施していない粒子を、「OCIF−HAp/ChS」という。
4時間の転倒撹拌後、結合処理を、塩化亜鉛水溶液(10mg/ml、pH5.5)を0.75ml加えてさらに2時間の転倒撹拌に供することにより行った。当該結合処理によれば、rh−OCIFと多孔質粒子の孔内面全体とが亜鉛イオンを介して結合されることとなる。以下では、結合処理を施した粒子を「OCIF−HAp/ChS−Zn」という。
OCIF−HAp/ChS−Znについて、2時間の転倒撹拌後、遠心分離(3500rpm、10分)にて上澄み液を分抽し、精製水にて洗浄を行った。当該洗浄を3回行った。2時間の転倒撹拌後に分抽した上澄み溶液と3回洗浄後の上澄み溶液のrh−OCIF濃度をADV01(Advanced Protein Assay Reagent)で定量することで吸着量を算出した。同様に、OCIF−HAp/ChSについても上澄み溶液のrh−OCIF濃度を定量し、吸着量を算出した。その結果、OCIF−HAp/ChS及びOCIF−HAp/ChS−Znのrh−OCIF吸着量は、それぞれ79.60±0.09μg/mg及び79.76±0.02μg/mgであり、共に理論量とほぼ同じ吸着量を示していた。以下のラットにおける徐放性の評価においては、当該OCIF−HAp/ChS及びOCIF−HAp/ChS−Znを用いた。
OCIF−HAp/ChSとOCIF−HAp/ChS−Znをそれぞれ200mg/kgの用量で、F344ラット(12週齢の雌、日本チャールスリバー)に腹腔内(i.p.)投与又は背部へ皮下(s.c.)投与した。なお、ラットは各群5匹とした。
OCIF−HAp/ChS又はOCIF−HAp/ChS−Znの投与前及び投与1、2、3、4及び7日後に、各ラットより0.2mlずつ採血し、それぞれの血液サンプルから調製した血清中のrh−OCIF濃度をOCIF−ELISA(K.Yano et al.,J.Bone Miner.Res.,14,p518,1999)で測定した。腹腔内投与の結果を図11に、皮下投与の結果を図12に示す。図11及び12において、縦軸は血清中のrh−OCIF濃度であり、横軸は表示されている投与後の経過日数におけるサンプルを示す。
一方、対照実験として、PBS(pH6.0)で希釈したrh−OCIFを16.0mg/kgの用量で、F344ラット(12週齢の雌、日本チャールスリバー)に腹腔内(i.p.)投与又は背部へ皮下(s.c.)投与した。なお、ラットは各群5匹とした。
rh−OCIFの投与前及び投与の0.5、1、2、4、6、24時間後に、各ラットより0.2mlずつ採血し、それぞれの血液サンプルから調製した血清中のrh−OCIF濃度をOCIF−ELISAで測定した。腹腔内投与の結果を図13に、皮下投与の結果を図14に示す。図13及び14において、縦軸は血清中のrh−OCIF濃度であり、横軸は表示されている投与後の経過時間におけるサンプルを示す。
図13及び14に示すように、製剤化していないrh−OCIFは、いずれの投与経路によっても投与2〜6時間後をピークに、血清中濃度が急速に減少していた。
それに対し、図11に示すように、rh−OCIFをHAp/ChS多孔質粒子に担持させた場合、腹腔内投与においては投与1日後でも1000ng/ml以上(OCIF−HAp/ChS−Znでは1300ng/ml以上)という高い血清中rh−OCIF濃度を保持した。更にOCIF−HAp/ChS−Znにおいては、2日後でも500ng/mlに近い血清中rh−OCIF濃度を維持しており、優れた徐放効果が示された。
また、図12に示すように、皮下投与のOCIF−HAp/ChS−Zn(亜鉛イオンを用いて結合処理した場合)では、投与4日後まで安定して100ng/ml以上の血清中rh−OCIF濃度を維持しており、非常に優れた徐放効果を示した。皮下投与のOCIF−HAp/ChS(亜鉛イオンを用いて結合処理していない場合)では、OCIF−HAp/ChS−Znと比較すると維持期間は短いものの、2日後においても100ng/ml以上の血清中rh−OCIF濃度を維持しており、この製剤も優れた徐放効果を有することが示された。
いずれの投与経路においても、亜鉛イオンを用いた結合処理をしていないrh−OCIFを担持したHAp/ChS多孔質粒子でも一定の徐放効果が得られ、亜鉛イオンを用いた結合処理をすることによりその効果が顕著に促進された。また、その効果は皮下投与において顕著であることが示された。
このように、実験動物への投与においても、本発明に係る製剤化技術をOCIFに適用することにより、長期間にわたってOCIFの血中濃度を維持させることができることが実証された。
800μg/mlになるようにrh−OCIF(実施例5に示した、CHO細胞で生産したもの)を12.5mlの10%PBS中に分散させ、実施例1で作製したHAp/ChS(2重量%)多孔質粒子125mgを加えた(80μg/mg;rh−OCIF / HAp/ChS多孔質粒子)。当該混合物を、室温にて4時間転倒撹拌に供した。また、結合処理を施さないものに関しても同様の方法により作製した。以下では、結合処理を施していない粒子を、「OCIF−HAp/ChS」という。
4時間の転倒撹拌後、結合処理を、塩化亜鉛水溶液(10mg/ml、pH5.5)を0.75ml加えてさらに2時間の転倒撹拌に供することにより行った。当該結合処理によれば、rh−OCIFと多孔質粒子の孔内面全体とが亜鉛イオンを介して結合されることとなる。以下では、結合処理を施した粒子を「OCIF−HAp/ChS−Zn」という。
OCIF−HAp/ChS−Znについて、2時間の転倒撹拌後、遠心分離(3500rpm、10分)にて上澄み液を分抽し、精製水にて洗浄を行った。当該洗浄を3回行った。2時間の転倒撹拌後に分抽した上澄み溶液と3回洗浄後の上澄み溶液のrh−OCIF濃度をADV01(Advanced Protein Assay Reagent)で定量することで吸着量を算出した。同様に、OCIF−HAp/ChSについても上澄み溶液のrh−OCIF濃度を定量し、吸着量を算出した。その結果、OCIF−HAp/ChS及びOCIF−HAp/ChS−Znのrh−OCIF吸着量は、それぞれ79.60±0.09μg/mg及び79.76±0.02μg/mgであり、共に理論量とほぼ同じ吸着量を示していた。以下のラットにおける徐放性の評価においては、当該OCIF−HAp/ChS及びOCIF−HAp/ChS−Znを用いた。
OCIF−HAp/ChSとOCIF−HAp/ChS−Znをそれぞれ200mg/kgの用量で、F344ラット(12週齢の雌、日本チャールスリバー)に腹腔内(i.p.)投与又は背部へ皮下(s.c.)投与した。なお、ラットは各群5匹とした。
OCIF−HAp/ChS又はOCIF−HAp/ChS−Znの投与前及び投与1、2、3、4及び7日後に、各ラットより0.2mlずつ採血し、それぞれの血液サンプルから調製した血清中のrh−OCIF濃度をOCIF−ELISA(K.Yano et al.,J.Bone Miner.Res.,14,p518,1999)で測定した。腹腔内投与の結果を図11に、皮下投与の結果を図12に示す。図11及び12において、縦軸は血清中のrh−OCIF濃度であり、横軸は表示されている投与後の経過日数におけるサンプルを示す。
一方、対照実験として、PBS(pH6.0)で希釈したrh−OCIFを16.0mg/kgの用量で、F344ラット(12週齢の雌、日本チャールスリバー)に腹腔内(i.p.)投与又は背部へ皮下(s.c.)投与した。なお、ラットは各群5匹とした。
rh−OCIFの投与前及び投与の0.5、1、2、4、6、24時間後に、各ラットより0.2mlずつ採血し、それぞれの血液サンプルから調製した血清中のrh−OCIF濃度をOCIF−ELISAで測定した。腹腔内投与の結果を図13に、皮下投与の結果を図14に示す。図13及び14において、縦軸は血清中のrh−OCIF濃度であり、横軸は表示されている投与後の経過時間におけるサンプルを示す。
図13及び14に示すように、製剤化していないrh−OCIFは、いずれの投与経路によっても投与2〜6時間後をピークに、血清中濃度が急速に減少していた。
それに対し、図11に示すように、rh−OCIFをHAp/ChS多孔質粒子に担持させた場合、腹腔内投与においては投与1日後でも1000ng/ml以上(OCIF−HAp/ChS−Znでは1300ng/ml以上)という高い血清中rh−OCIF濃度を保持した。更にOCIF−HAp/ChS−Znにおいては、2日後でも500ng/mlに近い血清中rh−OCIF濃度を維持しており、優れた徐放効果が示された。
また、図12に示すように、皮下投与のOCIF−HAp/ChS−Zn(亜鉛イオンを用いて結合処理した場合)では、投与4日後まで安定して100ng/ml以上の血清中rh−OCIF濃度を維持しており、非常に優れた徐放効果を示した。皮下投与のOCIF−HAp/ChS(亜鉛イオンを用いて結合処理していない場合)では、OCIF−HAp/ChS−Znと比較すると維持期間は短いものの、2日後においても100ng/ml以上の血清中rh−OCIF濃度を維持しており、この製剤も優れた徐放効果を有することが示された。
いずれの投与経路においても、亜鉛イオンを用いた結合処理をしていないrh−OCIFを担持したHAp/ChS多孔質粒子でも一定の徐放効果が得られ、亜鉛イオンを用いた結合処理をすることによりその効果が顕著に促進された。また、その効果は皮下投与において顕著であることが示された。
このように、実験動物への投与においても、本発明に係る製剤化技術をOCIFに適用することにより、長期間にわたってOCIFの血中濃度を維持させることができることが実証された。
本発明によれば、安定に、且つ多量にOCIF/OPGを担持した徐放性製剤が提供される。本発明に係る徐放性製剤は、二価金属イオンによって多孔質粒子とOCIF/OPGとの結合性が改善されており、初期バーストがほとんど無く、一定期間安定してOCIF/OPGを徐放することができる。また、本発明に係る徐放性製剤は、骨の主成分であるリン酸カルシウム化合物及び多糖類を含む多孔質粒子を担体として用いており、骨芽細胞を活性化することにより担体を核としてアパタイトの結晶が成長すると共に、主成分に骨の細胞外基質である多糖類を有するため内軟骨性骨化を生じて骨形成が促進されるという、これまでの徐放性製剤には無い特徴を有する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
[配列表]
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
[配列表]
Claims (23)
- 破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と、
リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を含む徐放性製剤であって、
前記破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と前記多孔質粒子の孔内面全体とが二価金属イオンを介して結合していることを特徴とする、前記徐放性製剤。 - 前記多孔質粒子において、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とが均一に分散していることを特徴とする、請求項1記載の徐放性製剤。
- 前記リン酸カルシウムが、カルシウムと共に、或いはカルシウムの一部に置換して、マグネシウム、亜鉛、ストロンチウム及びバリウムから成る群より選択される二価金属を含有することを特徴とする、請求項1又は2記載の徐放性製剤。
- 前記リン酸カルシウム中のリンに対するカルシウムのモル比が1.3〜3.4であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項記載の徐放性製剤。
- 前記リン酸カルシウムが炭酸基を含有することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項記載の徐放性製剤。
- 前記リン酸カルシウムナノ結晶の長径が1×102nm以下であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項記載の徐放性製剤。
- 前記長径が1nm〜1×102nmであることを特徴とする、請求項6記載の徐放性製剤。
- 前記多糖類が、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン及びヘパラン硫酸から成る群より選択されるものであることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項記載の徐放性製剤。
- 前記多糖類がコンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸であることを特徴とする、請求項8記載の徐放性製剤。
- 前記多糖類の含有量が4×10重量%以下であることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項記載の徐放性製剤。
- 前記含有量が4×10重量%〜1×10−1重量%であることを特徴とする、請求項10記載の徐放性製剤。
- 前記多孔質粒子の直径が1×102μm以下であることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項記載の徐放性製剤。
- 前記直径が1μm〜1×102μmであることを特徴とする、請求項12記載の徐放性製剤。
- 前記多孔質粒子の比表面積が5×10m2/g〜2×102m2/gであることを特徴とする、請求項1〜13のいずれか1項記載の徐放性製剤。
- 前記多孔質粒子の気孔率が3×10%〜8×10%であることを特徴とする、請求項1〜14のいずれか1項記載の徐放性製剤。
- 前記多孔質粒子の生体内吸収が6ヶ月以内であることを特徴とする、請求項1〜15のいずれか1項記載の徐放性製剤。
- 前記多孔質粒子がスプレイドライによって作製されたものであることを特徴とする、請求項1〜16のいずれか1項記載の徐放性製剤。
- 前記二価金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン及び銅イオンから成る群より選択されるものであることを特徴とする、請求項1〜17のいずれか1項記載の徐放性製剤。
- 前記二価金属イオンが亜鉛イオンであることを特徴とする、請求項18記載の徐放性製剤。
- 骨代謝異常症治療剤であることを特徴とする、請求項1〜19のいずれか1項記載の徐放性製剤。
- 骨折治癒促進剤であることを特徴とする、請求項1〜19のいずれか1項記載の徐放性製剤。
- 請求項1〜19のいずれか1項記載の徐放性製剤を含有する骨欠損部充填材。
- リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む懸濁液をスプレイドライに供し、リン酸カルシウムナノ結晶と多糖類とを含む多孔質粒子を得る工程と、
前記多孔質粒子を、破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体を含有する溶液に含浸し、破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体を前記多孔質粒子の孔内面全体に担持する工程と、
前記破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体を担持した多孔質粒子に、二価金属イオン含有溶液を添加し、これにより、前記破骨細胞形成抑制因子、その類縁体若しくは変異体又はそれらの修飾体と前記多孔質粒子の孔内面全体とを前記二価金属イオンを介して結合する工程と、
を含むことを特徴とする、徐放性製剤の製造方法。
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