MX2013000353A - Mezcla fermentada a base de soya que comprende las isoflavonas - agliconas, equol y lunasil, proceso para su preparacion y usos relacionados en los campos alimenticios, medicos y cosmeticos. - Google Patents

Mezcla fermentada a base de soya que comprende las isoflavonas - agliconas, equol y lunasil, proceso para su preparacion y usos relacionados en los campos alimenticios, medicos y cosmeticos.

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Anna Benedusi
Raffaella Di Cagno
Marco Gobbetti
Sergio Baroni
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Abstract

La presente invención se refiere a una mezcla que comprende isoflavonas-agliconas, tales como diadzeina, genisteina y gliciteina, además de Equol y lunasina, dicha mezcla estando asada en soya fermentada usando bacterias de ácido láctico aisladas de las matrices alimenticias y usando dicha mezcla para la protección de la piel y similar y de células intestinales humanas con referencia particular a la prevención del estado inflamatorio y protección de funciones de barrera y tratamiento de pérdida de cabello.

Description

MEZCLA FERMENTADA A BASE DE SOYA QUE COMPRENDE LAS ISOFLAVONAS-AGLICONAS, EQUOL Y LUNASIL, PROCESO PARA SU PREPARACIÓN Y USOS RELACIONADOS EN LOS CAMPOS ALIMENTICIOS, MÉDICOS Y COSMÉTICOS La presente invención se refiere a una mezcla fermentada a base de soya que comprende isoflavonas-agliconas, Equol y lunasil, el procedimiento para la preparación y usos de los mismos en los campos alimenticio, médico y cosmético. En particular, la presente invención se refiere a una mezcla que comprende isoflavonas-agliconas, tales como daidzeina, genisteina y gliciteina, además de Equol y lunasina, dicha mezcla fermentada a base de soya con bacterias ácido lácticas aisladas a partir de las matrices de alimentos y el uso de dicha mezcla para protección de la piel y sus anexos y de las células intestinales humanas, con referencia particular a la prevención de estado inflamatorio y la protección de las funciones de barrera y el tratamiento de la pérdida del cabello.
Las isoflavonas son compuestos difenólicos que están presentes naturalmente en diferentes plantas y particularmente en la soya (Tsangalis et al., 2002. Transformación enzimática de los fitoestrógenos de isoflavona en la leche de soya por bifidobacterias productoras de ß-glucosidasa. Food Res. Int. Sci. 67:3104-3113). Las isoflavonas derivadas de soya y productos alimenticios a base de soya pertenecen a 4 clases de compuestos quimicos: agliconas, conjugados de malonilo, acetilo y ß-glucósido (Tsangalis et al., 2002 Transformación enzimática de los fitoestrógenos de isoflavona en la leche de soya por bifidobacterias productoras de ß-glucosidasa . Food Res. Int. Science. 67:3104-3113). Más del 90% de la concentración total de isoflavonas de soya se produce como derivados ß-glucosido. Debido al carácter hidrófobo notable y alta masa molecular, los derivados de ß-glucósido no son absorbidos por los seres humanos. Por lo tanto, con el fin de estar biodisponibles y por lo tanto dichos compuestos metabolizados deben ser hidrolizados a agliconas. La hidrólisis a agliconas tales como daidzeindaidzeina, la genisteína y la .gliciteina se producen durante el paso intestinal como resultado de la actividad de las bacterias intestinales y ß-glucosidasa . En forma libre, las agliconas tales son estructuralmente similares a los estrógenos e imitan la función de estradiol en el cuerpo humano (Setchell y Cassidi, 1999 Isoflavonas de la dieta: efectos biológicos y relevancia para la salud humana. J. Nutr. 131: 758 - 767). En general, el consumo de isoflavonas-agliconas se asocia con la reducción del riesgo de patologías hormonales (Kruzer 2000 Efectos' hormonales de las isoflavonas de la soya: Estudios en mujeres premenopáusicas y posmenopáusicas . J. Nutr. 130: 660-661), y, con una menor incidencia de la osteoporosis, la menopausia y la mortalidad por patologías cardiovasculares y el cáncer (Nagata et al. 1998. Disminución de la concentración de colesterol total en suero está asociada con un alto consumo de productos de soya en hombres y mujeres japoneses. J. Nutr. 128:209-213).
Equol es un compuesto de estrógenos no esteroideos perteneciente a la clase de isoflavona. La principal fuente de Equol para los seres humanos son los derivados de soya, lo que representa la reserva más abundante de la daidzeína y la daidzeína aglicona, el precursor más directos (de la misma Axelson et al., 1984. La soya es una fuente dietética de la Equol no esteroide estrógeno en el hombre y los animales. J. Endocrinol. 102:49-56). De forma diferente que otras isoflavonas-agliconas, Equol es el único que tiene un núcleo central quiral resultante de la ausencia del doble enlace en el anillo heterocíclico (Setchell et al., ! 2002. La importancia clínica de la Equol metabolito una clave para la efectividad de la soya y sus isoflavonas. Am. Soc. Sci. Nutr. 125: 3577-3583). Generalmente, el Equol es absorbido fácilmente a través de la pared del colon y es metabólicamente inerte (Setchell et al., 2002. La importancia clínica del metabolito Equol muestra la eficacia de la soya y sus isoflavonas. Am. Soc. Sci. Nutr. 125: 3577 -3583). En comparación con precursor daidzeína del mismo Equol muestra un interesante conjunto de propiedades: una mayor actividad estrogénica (Muthyala et al., 2004. El Equol, un metabolito natural estrogénico de las isoflavonas de soya: Preparación conveniente y resolución de R-y S-Equoles y su diferente unión y actividad biológica a través de los receptores de estrógenos alfa y beta. Chem. Bioorg. Med. 12:1559-1567), actividad anti-oxidante ( itchell et al., 1998. Eficacia antioxidante de los fitoestrógenos en sistemas modelo químicos y biológicos. Arch. Biochem. Biophys. 360:142-148), y la actividad antiandrogénica (Lund et al., 2004. Equol es un anti-andrógeno novedoso que inhibe el crecimiento de la próstata y la retroalimentación hormonal. Bio. Reprod. 70:1 188-1195) .
El metabolismo de isoflavona de soya en el hombre está bien documentado (Axelson et al., 1984. La soya es una fuente dietética del estrógeno Equol no esteroidal en el hombre y los animales. J. Endocrinol. 102:49-56; !Bannwart et al., 1984. Identificación de o-desmetilangolensina, un metabolito de daidzeína y matairesinol, probablemente un precursor de la planta de la enterolactona de lignanos en animales en la orina humana. Finn. Chem. Lett. 5:120-125). La capacidad de metabolizar los glucósidos de isoflavonas a agliconas y agliconas a Equol durante el paso intestinal se limita sólo a 30-50% de la población de los países occidentales (Frankefeld, et al. 2005. Alta concordancia de fenotipos metabolizadores de daidzeina en los individuos medidos con 1 a 3 años de diferencia. Brit. J. Nutr. 94:873-876) . Pueden llevarse a cabo dos estrategias principales con el fin de aumentar la biodisponibilidad de isoflavonas de soya obtenidas: aglicona y enriquecimiento Equol antes del consumo o la modulación de la microbiota intestinal por la ingestión de bacterias viables y vitales adecuadas para la síntesis in situ de tales compuestos (Tsangalis et al., 2004. Desarrollo o ventilación de leche de soya enriquecida con isoflavona aglicona con germen de soya, aislado de proteina de soya y bifidobacterias . Food Res. Intern. 37:301-312). Diversos estudios (Chun et al., 2007 Conversión de glucósido de isoflavona a agliconas de leche de soya por fermentación con bacterias de ácido láctico. J. Food. Sci. 72:39-44; Donkor y Shah 2008 Producción de ß-glucosidasa y la hidrólisis de fitoestrógenos de isoflavona de leche de soya de Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis y Lactobacillus casei en J. Food Sci. 73:15-20; Pham. y Shah 2007 Biotransformación de los glucósidos de isoflavona de Bifidobacterium animalis en la leche de soya suplementada con leche en polvo descremada. J. Food Sci. 72: 316-324; Tsangalis et al., 2002; Tsangalis et al., 2004; Wei et al., 2007. Uso de Lactobacillus y Bifidobacterium ' para producir los algicones de isoflavona en leche de soya fermentada. Int. J. Food Microbiol. 117: 120 - 124) han considerado el uso de bacterias del ácido láctico y bifidobacterias para la conversión de glucósidos de isoflavonas a agliconas y/o Equol durante la fermentación de la leche de soya. Sin embargo, algunas limitaciones son evidentes en estos estudios: (i) un número muy limitado de biotipo/especie bacteriana ha sido considerado; (ii) las bacterias utilizadas en procesos de fermentación son originadas exclusivamente a partir de materia fecal humana; (iii) un número muy limitado de sustratos para la fermentación, ninguna de las cuales implicaba el uso de harina de soya biológica ha sido considerada; (iv) las preparaciones se basan únicamente en isoflavona/agliconas o Equol, y en el caso de la producción de Equol la concentración máxima es 0.521 mg/100 mi (Tsangalis et al., 2002 Transformación enzimática de los fitoestrógenos de isoflavona en la leche de soya por bifidobacterias productoras de ß-glucosidasa . Food Res. Int. Sci. 67:3104-3113); (v) ningún estudio evaluó la eficacia biológica de las preparaciones, en particular para la protección de la piel; y (vi) ningún estudio formuló una preparación que contiene isoflavonas-agliconas, Equol y lunasina .
La lunasina es un péptido bioactivo (43 residuos de aminoácidos, peso molecular de aproximadamente 5400 Da) identificado por primera vez en la soya (Gálvez et al., 2001. Propiedad quimiopreventiva de un péptido de soya (lunasina) que se une a las histonas desacetiladas e inhibe la acetilación. Cáncer Res. 61 473-7478) y, sucesivamente, se ha encontrado también en la cebada (Jeong et al. 2002. La lunasina de cebada suprime la formación de colonias inducida por Ras inhibe la acetilación de histona en células de mamíferos. J. Agrie. Food Chem. 50:5903-5908), el trigo (Jeong et al. 2007. La lunasina de péptido preventivo cáncer de trigo inhibe la acetilación de las histonas del núcleo. Cáncer Lett. 255:42-48) y amaranto (Silva-Sánchez et al., 2008. Péptidos bioactivos en semillas de amaranto (Amaranthus hipocondriasis) J. Agrie. Food Chem. 56:1233-1240). La concentración de la lunasina en la soya puede variar dependiendo del cultivo, atmósfera pedoclimática de cultivo, y los granos han sido sometidos a procesos tecnológicos después de la cosecha. Se ha encontrado concentración muy alta de lunasina en cultivos Loda (alrededor de 11 mg/g) , mientras que en otras variedades de soya (por ejemplo, Imari) el contenido lunasina no excede 5-6 mg/g (Wang et al. 2008. Análisis de péptidos derivados de proteínas de soya y el efecto del cultivo, condiciones ambientales y procesamiento de la concentración de lunasina en soya y productos de soya. Intern J. AOAC. 91:936-944). La lunasina contiene 9 residuos de ácido aspártico en la cadena polipeptídica C-terminal. Esta composición favorece una afinidad elevada a las de regiones de cromatina hipo-acetilada, al cual el péptido puede unirse inhibiendo asi la desacetilación de acetilación-dinámica y, por lo tanto, actúa como supresor de tumor en la carcinogénesis . También se ha reportado que la lunasina pueden ejercer una actividad de prevención contra los fenómenos de la carcinogénesis, gracias a la inhibición de la proliferación celular inducida por el gen Ras y para la inhibición de la acetilación de la histona H3 (Jeong et al., 2003. Caracterización de la lunasina aislado de soya. J Agrie. Food Chem. 51: 7901 a 7906). De datos de la literatura que es evidente que ningún estudio ha examinado hasta ahora el enriquecimiento de lunasina para los derivados de soya por procesos de fermentación utilizando bacterias del ácido láctico .
En base a las consideraciones reportadas anteriormente, algunos elementos parecen mostrar un carácter innovador marcado: (i) emplear sustratos a base de soya, posiblemente de origen biológico; (ii) el empleo de bacterias de ácido láctico aisladas a partir de las matrices de alimentos y no de origen fecal; (iii) optimizar un proceso biotecnológico adecuado para favorecer la formulación de una preparación que contiene un mayor número de moléculas funcionales tales isoflavonas-agliconas, Equol y lunasina; (iv) demostrar, utilizando análisis in vitro y ex vivo, el efecto de la preparación resultante en cuanto a protección intestinal célula cutánea y humana, con particular referencia a la inhibición del estado inflamatorio y la función de barrera de mantenimiento.
Los autores de la presente invención han desarrollado ahora un nuevo proceso adecuado para proporcionar una mezcla fermentada a base de soya enriquecida en isoflavonas, agliconas, Equol y lunasina. La mezcla de acuerdo con la invención se obtiene por fermentación de soya usando una mezcla particular de bacterias del ácido láctico procedente exclusivamente de las matrices de alimentos y no de origen fecal. La mezcla de acuerdo con la invención, debido al alto contenido de isoflavonas-agliconas , Equol y lunasina, en particular lunasina, muestran una eficacia particular para la protección celular cutánea e intestinal humana con particular referencia a la prevención de estado inflamatorio y la función de barrera de mantenimiento.
Los autores de la presente invención han considerado que: (i) la selección de 103 bacterias aisladas de ácido láctico, derivadas exclusivamente de las ¡matrices de alimentos, de acuerdo con la actividad de ß-glucosidasa de p-nitrofenil- -D-glucopiranósido (PNPG) permitió la selección de 4 bacterias de ácido láctico, a saber, L. plantarum DPPMA24W (depositado en el DSMZ el 08 de julio 2010 el número DSM 23756) y DPPMASL33 (depositado en el DSMZ el 08 de julio 2010 el número DSM 23755), L. fermentum DPPMA114 (depositado en el DSMZ el 08 de julio 2010 número DSM 23757) y L. rhamnosus DPP AAZ1 (depositado en el DSMZ el 08 de julio 2010 el número DSM 23758), para ser utilizado como iniciador mixto para la fermentación de los sustratos basados en harina de soya; (ii) el uso de 14 diferentes sustratos a base de soya que se ha permitido seleccionar como la preparación óptima a base de harina de soya biológica para la fermentación usando iniciadores mixtos; (iii) la optimización del proceso de fermentación del sustrato biológico de harina de soya permitió la formulación de una preparación que comprende 1.45 mg/100 mi (57.0 µ?) de daidzeina, 3.9 mg/100 mi (140,3 µ?) de genisteina, 0.58 mg/100 mi (20.4 µ?) de gliciteina, 0.9 mg/100 mi (37.3 µ ) de Equol y 8.4 mg/100 mi de lunasina; (iv) la preparación a base de compuestos anteriormente mencionados funcionales muestra un efecto de protección de la epidermis cutánea y efecto positivo sobre la inhibición de estado inflamatorio y funciones de barrera de células intestinales.
Las bacterias de ácido láctico de acuerdo con la presente invención pertenecen a la especie Lactobacillus y se han aislado a partir de levaduras naturales utilizadas para hacer pan en el centro y el sur de Italia y quesos de "pasta hilada" envejecidos de tipo Pecorino de la región; de Puglia. Generalmente, las bacterias de ácido láctico aisladas a partir de las matrices de alimentos muestran características de adaptación metabólica y ambientales no demasiado diferentes de los microorganismos que colonizan el tracto gastrointestinal de seres humanos y animales. Se han seleccionado y usado L. plantarum DPPMA24 (depositado en el DSMZ el 8 de julio de 2010 Número DSM 23756) y L plantarum DPPMASL33 (depositado en el DSMZ el 8 de julio de 2010 Número DSM 23755), L. Fermentum DPPMA114 (depositado en el DSMZ el 8 de julio de 2010 Número DSM 23757) y L. rhamnosus DPPMAAZ1 (depositado en el DSMZ el 08 de julio 2010 el' número DSM 23758).
Un protocolo biotecnológico relativo a la fermentación mediante dichas cuatro bacterias lácticas sobre diversos sustratos de harina de soya basado, preferiblemente de origen biológico durante 48 - 96 h en 30 a 37 °C ha sido estandarizado y optimizado. Al final del proceso de fermentación, las células se pueden eliminar o no a partir de caldo de cultivo por medio de centrifugación y, someter el sobrenadante a un proceso de deshidratación mediante secado o liofilización .
A continuación se describe el : protocolo biotecnológico de fermentación biológica de la preparación a base de soya. I Propagación de 4 cultivos seleccionados de bacterias de ácido láctico a 30 °C durante 24 h, lavado, suspensión en agua a una densidad celular de 9,.0 log ufc/ml y el inoculo (1-4%) de leche de soya (varias harinas de soya, preferiblemente soya biológica) Cultivo de 30-37 °C durante 48 - 96 h i Eliminación de células por centrifugación 4 Deshidratación sobrenadante por secado o secado por congelación i Formulación de la preparación para aplicaciones médicas Como resultado de la fermentación de diversas preparaciones de leche de soya de la síntesis de 3.9 - 57.0 µ? de daidzeína, 7.8 - 140.3 µ? de genisteína, 6.7 -20.4 µ? de gliciteína, 7.6 - 37.3 µ? de Equol y aproximadamente 8.4 mg/100 mi de lunasina se ha obtenido. Los límites superiores de anteriores concentraciones reportadas se refieren a la fermentación de la leche de soya biológica derivada de la harina de soya. De acuerdo con una de las posibles formulaciones, la aplicación de los productos fermentados de soya biológica mostró ser adecuada para: (i) proteger la epidermis que potencian las funciones de barrera, del mismo; (ii) inhibir el estado inflamatorio de células' Caco-2/TC7 después de la inducción por ?-interferón (IFN-?) y lipopolisacárido (LPS) ; (iii) estimular las funciones de barrera como se demuestra por la resistencia de prueba transepitelial eléctrica (TEER) ; y (iv) inhibir la síntesis de interleuquina-8 (IL-8) .
Como se ha demostrado por análisis complementario usando técnicas microbiológicas, cromatográficas y análisis in vitro y en cultivos celulares ex vivo, la fermentación de harina de soya biológica por iniciador mixto compuesto de especies de bacterias de ácido láctico aisladas de matrices de alimentos y no utilizadas en estudios anteriores, de acuerdo con la presente invención, permite: (i) la síntesis concomitante de agliconas, Equol y lunasina, no se ha encontrado en estudios anteriores; y (ii) un efecto protector contra el estado inflamatorio, mejorando la función de barrera de la epidermis y las células intestinales humanas.
Por lo tanto, un objeto específico de la presente invención es un procedimiento para la preparación de una mezcla fermentada a base de soya, que comprende isoflavonas-agliconas, Equol y lunasina, por fermentación de soya usando una mezcla de las siguientes cuatro bacterias del ácido láctico: Lactobacillus plantarum DSM 23755, Lactobacillus plantarum DSM 23756, Lactobacillus fermentum DSM 23757 y Lactobacillus rhamnosus DSM 23758. La mezcla obtenida de acuerdo con el procedimiento de la invención es una mezcla enriquecida en isoflavonas-agliconas, lunasina, Equol, que contiene un mayor porcentaje de estos compuestos en comparación con mezclas conocidas obtenidas por procesos que utilizan bacterias del ácido láctico diferentes a los de la presente invención.
El proceso de acuerdo con la invención comprende o consiste en los siguientes pasos: a) cultivo que propaga los cuatro de Lactobacillus plantarum DSM 23755, Lactobacillus plantarum DSM 23756, Lactobacillus fermentum DSM 23757 y Lactobacillus mamnosus DSM 23758 bacterias de ácido láctico; b) inocular sustratos a base de soya con una suspensión acuosa de dichas bacterias de ácido láctico, preferiblemente los sustratos se inocularon con una suspensión acuosa de bacterias de ácido láctico en una cantidad de 1 a 4% del volumen total del sustrato, dicha suspensión acuosa que tiene una densidad celular sobre log 9.0 ufc/ml para cada biotipo; c) incubar a 30 - 37°C, preferiblemente 30°C, durante 48 a 96 h, preferiblemente 96 h.
Los sustratos a base de soya adecuados para ser utilizados son, por ejemplo, harina de soya, harina de soya preferiblemente biológica, leche de soya y otras formulaciones comerciales como se informó acuerdo con la presente solicitud.
El proceso de acuerdo con la invención puede comprender además la etapa d) de la centrifugación de caldo de cultivo con el fin de separar las células de bacterias de ácido láctico. En particular, la centrifugación del caldo de cultivo se puede llevar a cabo a 10, 000 xg durante 15 min a 4°C.
El proceso de acuerdo con la presente invención puede comprender además una etapa e) de la deshidratación del sobrenadante obtenido en la etapa d) por secado o liofilización . De acuerdo con una modalidad, la formulación puede contener bacterias viables de ácido láctico vitales omitiendo el paso d) . La preparación de una composición puede incluir, al final del proceso de deshidratación, la formulación con adición de excipientes adecuados, a fin de obtener la preparación de formas adecuadas para el uso oral o tópico dependiendo de las circunstancias.
Es un objeto adicional de la presente invención una mezcla, que comprende isoflavonas-agliconas, Equol y lunasina, a base de soya fermentada obtenible de acuerdo con el proceso como se ha definido anteriormente sin la etapa d) de la eliminación de bacterias de ácido láctico. Dicha mezcla, por lo tanto, contiene bacterias de ácido láctico mencionadas anteriormente de acuerdo con la presente invención. Como se ha indicado antes, la mezcla de acuerdo con la invención es una mezcla enriquecida de isoflavonas-agliconas, Equol y lunasina, es decir, que contiene un porcentaje más alto de estos compuestos de mezclas conocidas obtenidas por procesos que utilizan bacterias del ácido láctico diferentes a las de la presente invención.
La presente invención concierne, además, a una composición farmacéutica o cosmética que comprende o que consiste en la mezcla como se ha definido anteriormente junto con uno o más excipientes y/o adyuvantes farmacéutica o cosméticamente aceptables.
De acuerdo con una modalidad adicional, la mezcla de acuerdo con la invención se puede utilizar como un integrador de alimentos. Por ejemplo, la mezcla podría ser utilizada también para los alimentos tradicionales, por ejemplo los productos horneados o de pasta.
Además, la mezcla o composición de acuerdo con la invención se pueden usar para el tratamiento de trastornos o enfermedades de la piel o el intestino. En particular, se puede usar dicha mezcla o composición contra las modificaciones de la función de barrera de la piel, por ejemplo para la prevención o el tratamiento de la piel sensible, piel seca, psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis seborreica, caspa, irritativa dermatosis, eczema dermatosis, contacto dermatosis, úlceras, acné, envejecimiento de la piel. Además, la mezcla o composición de acuerdo con la invención se puede utilizar en caso de modificación de la función de barrera intestinal, por ejemplo para el tratamiento o la prevención de la enfermedad celiaca, intolerancia a los alimentos, la enfermedad de Crohn.
La mezcla o composición de acuerdo con la invención puede ser utilizada en el campo cosmético, por ejemplo para el tratamiento de la pérdida del cabello o en el campo médico para el tratamiento de la alopecia o defluvio telógeno.
Particularmente, la mezcla o composición de acuerdo con la invención se puede administrar por vía tópica, por ejemplo en forma de cremas, lociones, pastas, pomadas, geles, soluciones, emulsiones, suspensiones o sistémicamente, por ejemplo por via oral, por ejemplo como viales, tabletas masticables, pastillas, sobres, etc.
Por supuesto, también la mezcla obtenida de acuerdo con el proceso de la invención comprende la etapa d) de la eliminación de las bacterias de ácido láctico o una composición farmacéutica o cosmética que contiene el mismo puede utilizarse ventajosamente para las indicaciones antes indicadas, ya que contiene un porcentaje mayor de isoflavonas- agliconas, Equol y lunasina, que las mezclas conocidas obtenidos por medio de procesos que utilizan bacterias ácido lácticas diferentes que los de la presente invención.
Por otra parte, es un objeto de la presente invención una mezcla de las siguientes cuatro bacterias de ácido láctico, Lactobacillus plantarum DSM 23755, Lactobacillus plantarum DSM 23756, Lactobacillus fermentum DS 23757 y Lactobacillus rhamnosus DSM 23758. Finalmente es un objeto de la presente invención el Lactobacillus plantarum DSM 23755 o Lactobacillus plantarum DSM 23756 o DSM 23757 Lactobacillus fermentum o Lactobacillus rhamnosus DSM 23758.
La presente invención se describirá ahora por una forma ilustrativa, pero no limitativa, de acuerdo con realizaciones preferidas de la misma, con particular referencia a los dibujos adjuntos.
La Figura 1 muestra la actividad ß-glucosidasa de 103 bacterias de ácido láctico biotipos pertenecientes a especies diferentes en PNPG sustrato sintético. Todas las bacterias de ácido láctico utilizado en el análisis han sido previamente aisladas, en forma absolutamente innovadora, sólo a partir de las matrices de alimentos. Las bacterias del ácido láctico de biotipos se indica mediante el código, con el fin de identificar la correspondencia del mismo a las especies, por favor refiérase a la descripción del protocolo en el texto (ejemplo 1) . Los datos son el promedio de tres experimentos por triplicado. Se informa la elaboración estadística de diagrama de casillas.
La Figura 2A muestra el proceso de acidificación láctica llevada a cabo por iniciador mixto seleccionado en presencia de leche de soya a partir de 14 diferentes harinas. La Figura 2B muestra la densidad celular de biotipos de bacterias de ácido láctico que comprenden iniciadores mixtos seleccionados en presencia de leche de soya a partir de 14 diferentes harinas. Los datos son el promedio de tres experimentos por triplicado. Se informa la elaboración estadística de diagrama de casillas.
La Figura 3 muestra la síntesis de la lunasina (mg/100 mi) durante la fermentación de la leche de soya obtenida a partir de harina de soya biológica (OFS) utilizando el iniciador seleccionado mixto. Los datos son el promedio de tres experimentos por triplicado.
La Figura 4 muestra la resistencia transepitelial Eléctrica (TEER) (Ohms x cm2) de la epidermis reconstituida (SkinEthic ®) después de la exposición a las 0 y 24 h de fermentación biológica leche de soya (OFS) , utilizando el iniciador seleccionado mixto y regulador PBS. Los datos son el promedio de tres experimentos por triplicado.
La Figura 5 muestra la liberación de óxido nítrico (µ?) (NO) a partir de células Caco-2 TC7. Las células han sido previamente tratadas durante 24 h con compuestos químicos (10 µ?) utilizados como estándares (Equol, daidzeína, genisteína y gliciteína) y leche de soya, obtenidas a partir de harina de soya biológica,- no fermentada y fermentada que utiliza el iniciador mixto seleccionado, diluidas en concentración final de Equol de 10 µ y filtradas de manera estéril. Sucesivamente, las células han sido estimuladas con ?-interferón (IFN-?) (1000 U/ml) y lipopolisacárido (LPS) (100 ng/ml) durante 24 h. El medio de cultivo DMEM que contiene DMSO (1%, v/v) o metanol (0.5%, v/v) se ha utilizado como control negativo. Los datos son la media de tres experimentos por triplicado. El asterisco indica diferencias significativas (P <0.01) en comparación con el control negativo.
La Figura 6 muestra la resistencia transepitelial eléctrica (TEER) (Ohmios x cm2) de células Caco-2/TC7 después de 24, 48 y 72 h de incubación. La incubación se llevó a cabo en presencia de ?-interferón (IFN-?) (1000 U/ml (- ¦ -) ; IFN-? y la leche de soya, obtenido a partir de harina de soya biológica, no fermentadas (- Á) - o fermentada con el iniciador seleccionado mixto, se diluyó a una concentración final de Equol de 10 µ y filtrado estéril, (-x-) cultivo de DMEM que se ha utilizado como control negativo. (- ? -) . Los datos son el promedio de tres experimentos por triplicado. El asterisco indica diferencias significativas P' <0.01) en comparación con el control negativo.
La Figura 7 muestra la liberación ; (pg/ml) de interleucina-8 (IL-8) desde células Caco-2/TC7 estimuladas durante 24 h con la interleucina-'i ß (IL-I ß) (2 ng/ml) y se trató sucesivamente (24 h) con compuestos químicos (10 µ?) utilizados como estándares (Equol, daidzeína, genisteína y gliciteína) y con leche de soya, obtenidas a partir de harina de soya biológica, no fermentada y fermentada con el iniciador mixto seleccionado, se diluyó a una concentración final de Equol 10 µ? y se filtraron de manera estéril. El medio de cultivo DMEM que contiene DMSO (1%, v/v) o metanol (0.5%, v/v) se ha utilizado como control negativo. Los datos son la media de tres experimentos por triplicado. El asterisco indica diferencias significativas (P <0.01) en comparación con el control negativo.
La Figura 8 muestra el efecto de la lunasina biomasa conteniendo y no conteniendo lunasina en la proliferación celular.
La Figura 9 muestra el efecto de la lunasina biomasa conteniendo y no conteniendo lunasina en la expresión de proteínas de Bcl-2 y Bax.
Ejemplo 1: ß-glucosidasa de 103 biotipos de bacterias lácticas aisladas a partir de las 'matrices de alimentos Ciento tres biotipos de bacterias de ácido láctico que pertenecen a Lactobacillus alimentahus ( ON, 2B, 5A) , Lactobacillus brevis (5Z, DPPMA869) , Lactobacillus casei (LC10), Lactobacillus casei subsp. casei (2047, 2756, 2763, 2766), Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum (2742, 2745, 2749, 2750), Lactobacillus curvatus (13H5, 14H10, lHd, 2042, 2081, 2768, 2770, 2771, 2775, SAL23, SAL35) , Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgancus (11842, Bi5Z), Lactobacillus fermentum (DPPMA1 14, D13) , Lactobacillus gasseri (B30W) , Lactobacillus helveticus (15009, B26 V, PR ) , hilgardii Lactobacillus (51 B) , Lactobacillus paralimentarius (15a, 15ß, 16R, 8D, DPP A238), Lactobacillus paracasei (12H8, lHb, Bi4F5, Bi8S, B25F3, PF6, B6iF5) , Lactobacillus pacarbuckneri (Bi0F5, B48F3, B48F5, B9F5t, BFi, BF2), paraplantarum Lactobacillus (4DE, DPPMA667), pentosus Lactobacillus (8CF, 12H5, 12H6), Lactobacillus plantarum (14H4, 17N, 19A, 1A7, 2A, 30, 3D , 4H1, 4hl0, DB200, DPPMASL33, DPP A24W) , Lactobacillus rhamnosus (11, 19, DPP AAZ1, DPPMAAZ21) , Lactobacillus sakei (91, SALI, SAL 18), Lactobacillus rossiae (10A, 15R, 3D, 5C1, 5a, CF51, CI35, CR20, E18), Lactobacillus sanfranciscensis (16a, A17, BB12, DE9, E19, H10), Lactococcus lactis subsp. lactis (10?) , Pediococcus pentosaceus (CÍ6F51 C25F3, C3oF5t, C6F5, C7F3, C9F5t, C29F5) y especies de Weissella cibaha (10XA16, 3XA4 , 5S, 5XF12) se han usado en el presente estudio. Todos los biotipos pertenecen a la Collezione di colture del Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiología Applicata dell ' üniversita degli Studi di Bari, y han sido previamente aisladas de matrices alimentarias (levadura natural para la fabricación del pan y quesos) . Los biotipos de bacterias de ácido láctico han sido propagados a 30 °C durante 24 h en medio MRS (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) a 30 o 37 °C durante 24 h.
Las células se cultivoon durante 24 h, se cosecharon por centrifugación (10.000 xg durante 15 min a 4°C), se lavaron dos veces con solución reguladora fosfato 50 mM, pH 7.0 y se resuspendieron en agua a una densidad celular de 9.0 log ufc/ml se han utilizado para el análisis de actividad de ß-glucosidasa, ß-glucosidasa ha sido cuantificado como p-nitrofenol liberado a partir de p-nitrofenol-p-D-glucopiranósido (pNPG) como sustrato (Sigma Aldrich Chemical Corporate, St. Louis, Missouri, USA) . 900 µ? de pNPG (concentración final) en solución reguladora de fosfato 0.5 M, pH 7.5, y 100 µ? de suspensión de células se han utilizado para el análisis. La mezcla ha sido incubada a 40 °C y la reacción bloqueada por el tratamiento térmico a 95 °C durante 5 min. La absorbancia se ha medido a 410 nm. Uno ß-glucosidasa unidad (U) la actividad se ha definido como la cantidad de enzima necesaria para 1 nmol/min de p-nitrofenol a ser liberada en condiciones de análisis (De Angelis et al., 2005. Purificación y caracterización de una familia intracelular 3 ß-glucosidasa de Lactobacillus sanfranciscensis CB1. Ital. J. Food Sci.. 17:131-142).).
Ejemplo 2: Preparación y fermentación de la leche de soya Biológica (soya agricultura ecológica, OFS) (ECorNaturaSi, Verona, Italia) , proteína aislada de soya (SPI) (Supro Soya 80 Aptonia, Villeneuve d'Ascq, Francia) y varios preparados comerciales de harinas de soya (Cargill Texturizing Proteina de Soya Solutions, Gent, Bélgica) se han utilizado para la producción de la leche de soya. OFS lavó y se dejó reposar durante la noche en agua destilada. La soya húmeda e hinchada ha sido manualmente descortezada, diluida con agua caliente (aproximadamente 90 °C), una proporción 1:10 y se homogeneizó con un homogeneizador PBI Internacional (Milán, Italia) . La homogeneización se ha llevado a cabo a 10.000 xg durante 2 min, seguido de una pausa de 1 min y se trató de nuevo a 14, 000 xg durante 2 min. La suspensión ha sido centrifugó (7.000 xg, 10 min a 4°C) y la leche de soya estéril filtrada a través de filtro de de tamaño de poro de 0.22 µp? (Millipore Corporation, Bedford) . El pH fue de 6.2. El SPI ha sido diluido con agua destilada (40°C), a una relación de 0.4:10, y fue tratado térmicamente a aproximadamente 55 °C durante 30 min bajo agitación (120 rpm) . Después de enfriar a la temperatura ambiente, el pH se ajustó a 6.7 usando NaOH 5 M (Tsangalis et al. 2002). La esterilización se llevó a cabo en autoclave a 121°C durante 15 min. Las preparaciones comerciales de soya harina han sido diluido con agua destilada (40°C), a proporción 1:10, según el método descrito por Chun et al. (Chun et .al., 2007. Conversión de glucósido de isoflavona a agliconas de leche de soya por fermentación con bacterias de ácido láctico. J. Food Sci. 72:39-44). El valor de pH fue de aproximadamente 6.3. La esterilización se llevó a cabo en autoclave a 121°C durante 15 min.
Diferentes tipos de leche de soya han sido inoculados (1 - 4%, v/v) con una suspensión celular mixta de 4 bacterias de ácido láctico seleccionadas sobre la base de la actividad de ß-glucosidasa. La densidad celular inicial de cada 4 bacterias de ácido láctico biotipos fue 7.0 log ufc/ml. La fermentación se llevó a cabo a 30°C durante 96 h bajo agitación (120 rpm) . Para el análisis celular humano intestinal, la leche de soya ha sido congelado-secado, se resuspendieron en medio de cultivo D EM y se filtró de forma estéril.
Ejemplo 3: Monitoreo de las bacterias del ácido láctico, determinación de las isoflavonas-agliconas, Equol y lunasina El monitoreo de las bacterias de ácido láctico utilizadas como iniciador mixto (Lactobacillus plantarum DSM 23755 correspondiente a DPPMASL33, Lactobacillus plantarum DSM 23756 correspondiente a DPPMA24 , Lactobacillus fermentum DSM 23757 correspondiente a DPPMA114 y Lactobacillus rhamnosus DSM 23758 correspondiente a DPPMAAZ1) durante la fermentación de diversos tipos de leche de soya se ha llevado a cabo utilizando técnica RAPD-PCR. Dos iniciadores (Invitrogen, Milán, Italia) , con secuencias seleccionadas arbitrariamente (P7 5' AGCAGCGTGG 3' (SEC ID NO: 1), y M13, 5 ' GAGGGTGGCGGTTCT 3' (SEC ID NO: 2)), la amplificación al azar de regiones diferentes de ADN cromosómico y plásmido bacteriano (De Angelis et al., 2001. Caracterización de bacterias no-iniciadoras de ácido láctico (NSLAB) a partir de quesos de oveja italianas basado en los análisis de proteínas fenotípica, genotípica y de la pared celular. Appl . Environ. icrobiol. 67 :2011-2020; Rossetti e Giraffa, 2005 La identificación rápida de bacterias de ácido láctico por lácteos M13 generados, bases de datos de huellas dactilares RAPD-PCR J. Microbiol. 63:135-144 Met) se han utilizado para tipificación .
La extracción de isoflavonas-agliconas y Equol a partir de muestras de leche de soya fermentada se ha realizado de acuerdo con el método descrito por Otieno y Shah (Otieno y Shah, 2007. Una comparación de los cambios en la transformación de la leche de soya con isoflavonas en concentraciones variables de prebióticos exógerios y endógenos derivados de ß-glucosidasas . J. Appl. Microbiol. 103:601-612) . Se ha llevado a cabo el análisis cromatográfico HPLC para la determinación de compuestos de acuerdo con el método descrito por Maubach et al. (Maubach et al., 2003. Cuantificación de derivados fitoestrógenos de la soya en el tejido mamario humano y los fluidos biológicos por cromatografía líquida de alto rendimiento. J. Chromatogr. 784:137-144) .
La determinación de la lunasina en la leche de soya obtenida a partir de harina de soya biológica antes y durante la fermentación se ha llevado a cabo mediante cromatografía HPLC usando un sistema purificador AKTA (GE Healthcare) equipado con C18 columna aters Xterra y 214 nm Detector de UV, eluyendo con mezcla de disolventes que consiste de 5% de ACN + 0.05% de TFA (eluyente A) y ACN + 0.05% de TFA (eluyente B) (Wang et al. 2008. análisis de los péptidos de proteína de soya derivados y el efecto de cultivo, las condiciones ambientales y el procesamiento de la concentración de la lunasina en productos de grano de soya y soya. Intern J. AOAC. 91 :936-944). La lunasina sintética ha sido utilizada como estándar (EZBiolab Inc., Indianapolis, IN, EE.UU. ) .
Ejemplo 4: Análisis sobre epidermis reconstituida y medición TEER (resistencia eléctrica transepitelial) La epidermis humana reconstituida SkinEthic® (epidermis humana reconstruida) consiste en .queratinocitos normales de la epidermis humana como una multicapa. Es epidermis completamente diferenciada después del cultivo de queratinocitos humanos en un medio químicamente definido ( CDM 153) , sin adición de suero bovino fetal, en soporte inerte poroso de policarbonato en la interfaz aire-liquido durante 17 días. En esta etapa de crecimiento el análisis morfológico muestra una epidermis vital multi-estratificada y una capa corneal que consiste de más de diez capas celulares compactas. La epidermis humana reconstituida SkinEthic® se ha usado de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente (Di Cagno et al., 2009 Síntesis de ?-amino butírico (GABA) por Lactobacillus plantarum DSMZ19463: Uva funcional bebible y de aplicación dermatológica Appl. Microbiol. Biotechnol. DOI: 10.1007/s00253-009-2370 ) .
Se ha llevado a cabo la medición TEER utilizando Voltímetro Millicell-ERS (Millipore, Billerica, MA) . La medición ha sido expresada en ohmios x cm2.
Ejemplo 5: análisis sobre células Caco-2/TC7 Las células Caco-2 de origen humano (clon TC7) han sido cultivadas en Dulbecco (DMEM) , añadido con suero bovino fetal (10%), aminoácidos no esenciales (1%), gentamicina/estreptomicina (50 pg/ml) , glutamina (2 mM) y 4-2-hidroxietil-l-piperazinil-etanosulfónico (1%) (Di Cagno et al., 2010. Quorum sensing en Lactobacillus plantarum DC400 masa madre: inducción de plantaricina A (PinA) con el co-cultivo con otras bacterias del ácido láctico y el efecto de PinA en las células bacterianas y células Caco-2. Proteomics en prensa) . La viabilidad de las células se ha determinado mediante análisis de captación de colorante rojo neutro (Balls et al., 1987 Enfoques para la validación de los métodos alternativos en toxicologia, en: Goldber AM (Ed) NY Academic Press págs.. 45-58). Después del tratamiento durante 24 a 72 h con las diferentes preparaciones, las células se han lavado con solución reguladora PBS y se incubaron durante 4 horas a 37°C con una solución de rojo neutro (33 mg/1) . Luego, las células han sido lavadas de nuevo con solución reguladora PBS y se trató con solución de lisis (50% de etanol en agua que contiene 1% de ácido acético) . La lectura de la placa se ha llevado a cabo utilizando lector Novapath (Biorad, Hercules, CA) (Di Cagno et al., 2010).
La liberación de óxido nítrico (NO) de células Caco-2/TC7 se ha determinado mediante la medición de los productos de oxidación, es decir, nitrito y nitrato. Después de la incubación con las diferentes preparaciones, el sobrenadante de los cultivos celulares se ha mezclado con un volumen igual de reactivo de Griess (1%, p/v, ácido sulfanílico en 0.5 de HC1 y 0.1%, p/v, clorhidrato de N-l-naftiletilendiamina) . Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente, se ha medido la absorbancia a 540 nm, se ha determinado la concentración de nitrito con referencia a la curva patrón preparada con nitrito de sodio.
Para medición TEER de Caco-2, TC7 se han inoculado células (7.5 x 104 células/ml) en un recipiente de microplacas con 24 celdas y un polietileno de filtro (tamaño de poro 0.4 im) . Antes del tratamiento, las células han sido incubadas durante 21 días a 37°C. Los tratamientos con diversas preparaciones se han llevado a cabo durante 18, 24 y 48 h. Entonces se ha determinado la integridad de la capa celular por medio de mediciones de TEER.
Para la medición de células Caco-2/TC7de la interleucina-8 (IL-8) liberadas han sido previamente incubadas (24 h) con la interleucina-?ß y después se estimularon durante otras 24 h con las diferentes preparaciones. La síntesis de IL-8 pro-inflamatorio se ha determinado por análisis ELISA (Bender MedSystems) . La cuantificación se ha realizado utilizando una curva estándar de acuerdo con instrucciones del equipo.
Resultados (1) Selección de bacterias de ácido láctico en la base de la actividad de ß-glucosidasa Preliminarmente, la actividad de ß-glucosidasa de 103 biotipos de bacterias lácticas aisladas a partir de las matrices de alimentos ha sido probada en sustrato sintético PNPG. La actividad cambia de 0 a 202.3 U (Figura 1). Cuarenta y ocho biotipos que pertenecen en su mayoría a L. alimentarius, L. brevis, L. casei, L. delbrueckii subsp. bulgahcus, L. helveticus, L. hilgardiii, L. paralimentarius, L . paraplantarum, L. pentosus, L. sanfranciscensis, L. lactis subsp. lactis, L. parabuchneri y especies de W. cibaria no muestra actividad de ß-glucosidasa . El valor promedio de la actividad fue de 3 U y los valores correspondientes de porcentaje a 25° y 75° fueron 0 y 45.5 U. Veinticinco biotipos pertenecientes a diferentes especies de bacterias de ácido láctico han mostrado actividad de ß-glucosidasa mayor que 55 U. L plantarum DPPMA24W, L. Fermentum DPPMA114, L. rhamnosus DPPMAAZ1 y L. plantarum DPPMASL33 han dado muestras de mayor actividad (202.35 + 7.08, 6.52 ± 163.15, 146.60 ± 5.84 y 144.34 ± 7.19 U, respectivamente). Los valores de la actividad de ß-glucosidasa para estos biotipos han estado fuera de la gráfica de barras de casillas de error. Basándose en estos resultados los cuatro bacterias del ácido láctico se han seleccionado y usado para la formulación de un iniciador mixto para ser utilizado para la fermentación de los distintos tipos de leche de soya. (2) Fermentación de la leche de soya y ;la síntesis de compuestos funcionales La composición química, la proteína índice de dispersabilidad y el tamaño de partícula de diferentes tipos de harina de soya utilizadas para la preparación de leche de soya se presentan en la Tabla 1. La Tabla 1 muestra la composición química, la dispersabilidad de proteínas y tamaño de partícula de 14 harinas de soya utilizadas para la producción de compuesto funcional seleccionado por iniciadores mixtos que comprende Lactobacillus plantarum DSM 23755 correspondiente a DPPMASL33, Lactobacillus plantarum DSM 23756 correspondiente a DPPMA24W, Lactobacillus fermentum DSM 23757 correspondiente a DPPMA114 y Lactobacillus rhamnosus DSM 23758 correspondiente a DPPMAAZl.
Tabla 1. Composición química índice de dispersión de proteínas } granulometria de las harinas de soya comerciales Harina de soya Proteínas Lípidos Fibras Indice de Granulometria Descripción ( ) (%) (%} dispersibilidad (malla) * de proteínas OFS** 13. .1 6.7 1.1 65. .3 160 Semillas decodifcadas manualmente SPI*** 83 4.4 1.5 20, .1 72 Proteína aislada de soya, aromatizada con extracto de vainilla, endulzada con aspartame Prolia 68237 54 0.95 3.5 70 200 Desgrasada, tratamiento con calor moderado Prolia 68238 55 1.1 3.5 77. .5 200 Desgrasada, no tostada Provasoy 68288 54 1.25 3.5 22. .5 100 Desgrasada hecha enzimaticamente amarga Provasoy 68290 54 1.25 3.5 22. ,5 200 Desgrasada, hecha enzimáticamente amarga Provasoy 68282 54. .2 1.0 3.5 22, .5 100 Desgrasada, hecha enzimáticamente amarga Provafull 8147 39. .0 21.0 3.5 10. .3 72 Tostada Harina de soya 40 2 20 21. .6 120 Tostada Semolina de soya 38 22 12.4 18. .6 120 Descortezada y tostada Grits de soya 38 22 20 16. ,1 11 Descortezada y tostada Harina de soya de 38. .2 23 16.7 19. ,3 100 Descortezada mecánicamente grasas completas Harina de soya con 45. ,6 11.7 18.2 20. .1 100 Extruida, molida bajo contenido de mecánicamente grasas *Malla malla/kg, **OFS, soya orgánica, *** SPI, aislado de proteína de soya Catorce tipos de leche de soya fermentada han sido seleccionados mediante iniciador mixto que comprende L. plantarum DPPMA24W y DPPMASL33, L fermentum DPPMA114 y L. rhamnosus DPPMAAZl. Todos los sustratos han sido sometidos a un proceso de acidificación láctica (Figura 2A) . Después de 96 h de fermentación, los valores de ??? cambiaron de 0.59 ± 0.06 a 1.19 ± 0.09, para los tipos de leche de soya obtenidos a partir de 68288 Provasoy y bajos en grasa harinas de soya, respectivamente. El valor de ??? promedio fue de 0.93 y la gama correspondiente al porcentaje de valor de datos de 25° y 75° fue 0.79 y 1.01. Después de la fermentación, los valores de pH para todos los tipos de leche de soya estaban dentro del rango 5.1 - 5.3.
Las bacterias ácido lácticas crecieron durante la fermentación de todos los tipos de leche de soya (Figura 2B) . Los valores modificados Alog ufc/ml de 0.99 ± 0.29 a 1.61 ± 0.30, para los tipos de leche de soya a partir de harinas de soya llenos de grasa y bajo contenido de ' grasa, respectivamente. Valor promedio de incremento densidad celular fue de 1.31 Alog ufc/ml, que corresponde al valor absoluto de la densidad celular log 8.31 ufc/ml. Rango que corresponde al porcentaje de valor de datos de 25° y 75° fue de 1.21; y 1.43. El crecimiento de bacterias de ácido láctico fue completo en 24 a 36 h de incubación. Como se determinó por tipificación de RAPD-PCR, los cuatro biotipos de bacterias de ácido láctico utilizado en iniciador mixto creció en varios tipos de leche de soya hasta una densidad celular similar.
La concentración inicial de isoflavonas conjugadas en diversos tipos de leche de soya cambiaron de 142.3 ± 12.5 a 171.5 ± 10.8, 102.2 ± 8.6 a 123.0 ± 11.3, y de 10.5 ± 1.1 a 18.0 + 0.9 mm, respectivamente, para daidzina, genistina y glicitina. En las concentraciones contrario, baja (dé 0 a 7.8 ± 0.5 µ?) de agliconas se han observado en varios tipos de leche de soya (Tabla 2). La Tabla 2 muestra la concentración (µ?) de isoflavonas-agliconas (daidzeina, genisteina y gliciteina) y Equol durante la fermentación de leche de soya, obtenido a partir de 14 diferentes tipos de harina, utilizando el iniciador seleccionado mixto. Los datos son la media de tres experimentos por triplicado.
Tabla 2. Concentración (uM) de isoflavonas-agliconas y equol sintetizados sobre diversos tipo de leche de soya durante 96 h de fermentación.
Tabla 2. (continuación) Leche de Daidzeina Genisteina Gliciteina Equol soya Tiempo (tú Tiempo (h) Tiempo (h) Tiempo (h.) 0 24 48 72 96 0 24 48 72 96 0 24 4ß 72 96 0 24 48 72 9 Harina de soya comercial Orits de soya - 4,7* 17,71 25,6* 28,3* 7,0* 16,3* 26,5* 30.3* 32.9* 3,2* 9.8* 10,9* 11.6* 11,64 - 0,4* 3,5* 5,5* 0,3C 0,5f 1.3f 1.01 0,3c 0,8e 2.1g 3.2g 1.7f 0,3a 0,2f 0.7ß 0,6c 0,3d 0,4a 0,2a 0,3a Harina de soya 2,7* 3,5* 3,9* 3,9* 3,9* - - - 6.7* io,2± 12,0* 12,7* 13,7* - - -grasas comp. 0,6b 0,5b 0,2a 0,5a 0,8a O. e 0,6g 0,5f 0,4d 0,9e Harina de soya 5,1± 11.0* 18,54 19,7* 20.1* 4,4* 6,3* 7.4± 7.8* 4.6* 9,54 13.0* 14.1* 14,8* • - - -baja en grasas 0,9d 0.4Q 1,00 1.6 1.2f 0.3a 0.4a 0.6a 0,4a 0.2c 0.4f 0.9g 0,6e 0.5f Con la excepción de la leche de soya obtenida de la harina de soya de grasas completas, la concentración de agliconas aumentó durante la incubación para todos los tipos de leche de soya. Después de 96 h de incubación, la concentración más alta de daidzeina se ha observado en OFS leche de soya (57.0 ± 4.0 µ , correspondiente a 1, 45 mg/100 mi) , seguido por Prolia 68 238 (50.7 ± 2.1 µ? ) y Prolia 68.237 (46.4 ± 1.7 µ?) . Mayor concentración de genisteina último también estaba en anteriormente que tres tipos de leche de soya (140.3 + 9.4 - 3.9 mg/100 mi, 102.9 ± 6.4 y 94.0 ± 5.3 µ?, por OFS, Prolia 68238 y 68237, respectivamente) . En comparación con otras agliconas, la concentración gliciteina fue menor en todos los tipos de leche de soya. La más alta concentración de gliciteina estaba en Prolia 68237 y 68238, y OFS tipos de leche de soya (23.9 ± 2.4, 22.5 ± 1.3 y 20.4 ± 1.0 µ? - 0.58 mg/100 mi, respectivamente). En el caso de la leche de soya producida a partir de harina de soya biológica (OFS) la tasa de conversión de isoflavonas conjugadas a agliconas correspondiente fue de 0.72, 0.85 y 0.98, para daidzina a daidzeina, genisteina genistina y glicitina para gliciteina. Aunque la concentración de agliconas aumentó durante la incubación, después de 24 h la tasa de hidrólisis de las tres isoflavonas conjugados estuvieron en el rango 1.0 - 0.95.
Antes de la incubación, la presencia de Equol no se ha detectado en ningún tipo de leche de soya (Tabla 2) . Diversos tipos de leche de soya fueron incapaces de sintetizar Equol durante el proceso de fermentación. Después de 96 h de incubación, la concentración más alta de Equol se ha determinado en tipos de leche de soya Prolia 68238 y 68237 (20. ± 1.1 y 18.5 ± 0.9 µ? respectivamente) y sobre todo en leche de soya OFS (37.3 + 1.5 µ?. correspondiente a 0.9 mg/100 mi). Debido a la síntesis simultánea de la daidzeína, no fue posible determinar la tasa de conversión del mismo a Equol. Varios estudios han examinado el uso de bacterias potencialmente probióticas, aislado a partir de material fecal humano, con el fin de enriquecer la leche de soya con isoflavonas-agliconas (Chun et al., 2007. Conversión de glucósido de isoflavona a agliconas de leche de soya por fermentación con bacterias de ácido láctico. J. Food Sci. 72:39-44; Donkor y Shah 2008. Producción de ß-glucosidasa y la hidrólisis de los fitoestrógenos de isoflavonas por leche de soya de Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis y Lactobacillus casei en J. Food Sci. 73:15-20; Pham y Shah 2007. Biotransformación de los glucósidos de isoflavona por Bifidobacterium animalis en leche de soya suplementada con leche en polvo descremada J. Food Sci. 72:316-324; Tsangalis et al., 2002; Tsangalis et al., 2004; Wei et al., 2007. Uso de Lactobacillus y Bifidobacterium para los productos algycones isoflavonas en la leche de soya fermentada. Int. J. Food Microbiol . 117:120-124). Los microorganismos utilizados han sido exclusivamente bifidobacterias o varias bacterias del ácido láctico que pertenecen a especies diferentes. La presente invención se ha seleccionado cuatro nuevos biotipos que corresponden a L. plantarum DPPMA24W y DPPMASL33, L. Fermentum DPPMA114 y L. rhamnosus DPPMAAZl, nunca usado anteriormente para la síntesis de isoflavonas-agliconas y Equol. Sólo un número limitado de estudios ha considerado también la síntesis de Equol durante la fermentación de la leche de soya. Equol se ha sintetizado en la leche de soya fermentada con bifidobacterias (Tsangalis et al., 2002. Transformación enzimática de los fitoestrógenos de isoflavona en la leche de soya por ß-glucosidasa producir bifidobacterias . Food Res. Int. Sci. 67:3104-3113). Después de 24 h de fermentación, la más alta concentración de Equol (0.521 mg/100 mi) fue sintetizado por Bifidobacterium animalis, en comparación con la producción de 0.338 y 0.433 mg/100 mi obtuvieron usando Bifidobacterium pseudolongum biotipos y Bifidobacterium longum. La leche de soya fermentada OFS con el iniciador mixto seleccionado de acuerdo con este estudio contenían una concentración más alta de Equol, a saber, 37.3 µ? correspondiente a 0.9 mg/100 mi.
En base a los resultados previamente reportados, la leche de soya producido a partir de harina de soya biológica (OFS) se ha considerado el mejor sustrato para la síntesis de isoflavonas-agliconas y Equol. Sobre la base de nuestro conocimiento, ningún estudio anterior consideró .el uso de la leche de soya obtenida de la harina de soya cultivados biológicamente para la síntesis de isoflavonas-agliconas y Equol.
Por lo tanto, la concentración de la lunasina utilizando el método de HPLC (Wang et al. 2008. Análisis de los péptidos de proteina de soya derivados y el efecto de cultivo, las condiciones ambientales y ha sido determinado el procesamiento de la concentración de la lunasina en la soya y productos de soya. J. AOAC Intern. 91:936-944) . Antes de la incubación, la concentración de lunasina fue de aproximadamente 3.2 mg/100 mi (Figura 3) . Durante la fermentación, el iniciador mixto seleccionado a favor de un incremento constante de la lunasina que, al final de 96 h de incubación, fue de 8.4 mg/100 mi. En la base de nuestro conocimiento, ningún estudio previo consideró la síntesis concomitante de isoflavonas-agliconas, Equol y lunasina en la misma preparación que consiste en leche de soya fermentada con bacterias de ácido láctico. Los efectos fisiológicos de este péptido bioactivo (lunasina) están ampliamente documentados en la literatura (Jeong et. al., 2003. Caracterización de la lunasina aislado de soya. ,J. Agüe Food Chem. 51: 7.901-7.906; Jeong et al 2007. La prevención del cáncer péptido de trigo de lunasina inhibe la acetilación de las histonas del núcleo. Cáncer Lett. 255:42-48) .
Con base en los resultados previos, la leche de soya fermentada OFS se usa para los análisis de protección cutánea y sobre las células intestinales humanas. (3) Análisis sobre epidermis reconstituida y medición TEER (resistencia eléctrica transepitelial) La leche de soya OFS obtenida de la harina de soya biológica y fermentada con iniciador mixto seleccionado se han utilizado a una concentración final de 10 Equol µ? para el tratamiento de la epidermis reconstituida humana de acuerdo con el modelo SkinEthic ®. Este modelo ha sido experimentado y aceptado ampliamente por la comunidad científica (Di Cagno et al., 2009. Síntesis de ?-amino butírico (GABA) por Lactobacillus plantarum DSMZ19463: Uva funcional debe ser para bebidas y dermatológica. Appl . Microbiol. Biotechnol. DOI: 10 : 1007 /S00253-009-23704) . Después del tratamiento durante 24 h, se ha llevado a cabo la medición de TEER. Este tipo de análisis, ampliamente aceptado por la comunidad científica internacional, evalúa la capacidad de corrosión de tejido tomando como referencia la integridad de la capa de córnea y la función de barrera. En particular, por medio de esta detección es posible obtener información sobre la presencia de una estructura compacta laminar a nivel de la capa córnea, de uniones integrales estrechas y espesor epidérmico. Estos factores en su conjunto definen una función de barrera eficiente. La Figura 4 muestra como en la presencia de leche de soya fermentada OFS un aumento notable (P <0.05) del valor de TEER está presente, demostrando, una acción protectora de la molécula a nivel cutáneo. El mismo resultado se ha obtenido con una mezcla de síntesis química de Equol y lunasina.
De acuerdo con los conocimientos actuales este es el primer ejemplo de aplicación de la preparación a base de leche de soya que contiene isoflavonas-agliconas, Equol y lunasina que demuestran una estimulación de las funciones de barrera cutánea. (4) Análisis en células Caco-2/TC7 Con el fin de probar las propiedades inmunomoduladoras de las isoflavonas-agliconas contenidas en la leche de soya producida a partir de harina de soya biológica (OFS) , en primer lugar se ha evaluado la citotoxicidad contra células Caco-2/TC7 por compuestos químicos estándar (Equol, daidzeina, genisteína y gliciteina) a concentraciones de 5 - 100 µ? usando captación de análisis rojo neutro (NR) . La genisteína, gliciteina y Equol han mostrado un comportamiento similar al de metanol y D SO (control negativo) y no afectó significativamente la proliferación celular. Después de 72 h de tratamiento, la daidzeina notablemente inhibió (P <0.03) la proliferación celular a una concentración superior a 100 µ?. ; Preliminarmente, las células Caco-2/TC7 han sido tratadas durante 24 h en una concentración de 10 µ? con la leche de soya fermentada OFS y se diluyó a una concentración final de 10 Equol µ? o no fermentado con leche de soya. Estos compuestos o preparaciones no mostraron inducción de la liberación de NO, que muestra un comportamiento similar al control negativo, es decir, metanol y DMSO (Figura 5) . Sucesivamente, las células Caco-2/TC7 han sido estimuladas con INF-?? (1000 U/ml) e LPS (100 ng/ml) durante 24 h. Este tratamiento aumentó significativamente (P <0.05) la liberación de NO, simulando el estado inflamatorio de células Caco-2/TC7, preventivamente tratadas con el control negativo, daidzeina o leche de soya sin fermentar OFS. Por el contrario, los tratamientos con Equol o leche fermentada de soya OFS se inhibieron de una manera marcada (P <0.002 y P <0.007, respectivamente) , la liberación de NO. Una inhibición considerable (P <0.05) de la liberación de NO también se ha observado con el uso de tratamientos con genisteina y gliciteina. Puesto que preliminarmente se ha demostrado que la concentración de (10 µ?) de isoflavonas-agliconas utilizadas en el análisis no es tóxico, la muerte de células Caco-2 TC7 seguramente no ha interferido con la liberación de NO.
Bajo las condiciones de cultivo de este estudio, las células se desarrollan Caco-2/TC7 características morfológicas y funcionales de los enterocitos, incluyendo uniones intercelulares, la integridad de los mismos que se mide por determinación TEER. Preliminarmente, TEER se ha determinado en presencia de compuestos químicos estándar (10-100 µ?) , leche de soya fermentada OFS y se diluyó a una concentración de 10 µ Equol, o leche de soya no fermentada OFS. Con la excepción del compuesto químico Equol a una concentración de 100 µ? (1000 U/ml) no se han observado efectos sobre la TEER durante 72 h de incubación. El tratamiento de células con Caco-2/TC7 INF-? (1000 U/ml) favoreció una disminución notable (P <0.003) de valor TEER (Figura 6) . Cuando Caco-2/TC7 células estimuladas con INF-? han sido tratados también con leche de soya fermentada OFS el efecto negativo de INF-? es notablemente atenuado (P <0.007). Un efecto despreciable se ha observado en la presencia de leche de soya no fermentada OFS. La genisteina, gliciteina y sobre todo Equol han mostrado una tendencia similar a la leche de soya fermentada OFS. La Daidzeina no ha interferido con el efecto negativo causado por INF-?.
La interleucina-8 (IL-8) es un miembro de la familia de las quimioquinas CXC y juega un papel fundamental en la activación de células de neutrófilas, iniciando asi la respuesta inflamatoria. Cuando las células Caco-2 TC7 se someten a un tratamiento con interleucina 1ß-(2 ng/ml) se ha observado un incremento significativo (P <0.001) de la síntesis de IL-8 (Figura 7). Cuando las células Caco-2/TC7, estimuladas con interleucina-?ß, se han sometido también a un tratamiento con Equol y daidzeina, se ha observado una disminución significativa (P <0.005) de la síntesis de IL-8. La inhibición más alta de la síntesis de IL-8 (P <0.001) ha sido observadao por tratamiento con leche de soya fermentada OFS. Por el contrario, los tratamientos con genisteina, gliciteina o leche de soya fermentada OFS no dieron como resultado una disminución (P <0.10) de la síntesis de IL-8.
Los resultados reportados muestran claramente que el efecto anti-inflamatorio y estimulante para las funciones de barrera de células intestinales humanas por la leche de soya fermentada OFS es principalmente el resultado de la presencia de Equol y algunos agliconas isoflavonas. Un efecto aditivo por lunasina es posible. (5) Desarrollo de un protocolo biotecnologico para la síntesis de daidzeína, genisteína, gliciteína, Equol y lunasina y uso de los mismos en el campo dermatológico Como se ha señalado en otra parte del texto, se ha desarrollado un procedimiento biotecnologico para la síntesis de isoflavonas-agliconas (daidzeína, genisteína y la gliciteína) , Equol y lunasina y uso de los mismos en el campo dermatológico. Dicho proceso consiste en: a) el cultivo de L plantarum DPPMA24W y DPPMASL33, L. fermentum DPP A114 y L. rhamnosus DPP AAZ1 en cultivo puro en medio de cultivo MRS; b) recolección, lavado e inoculo de las suspensiones de células en diversos tipos de leche de soya, preferiblemente, la leche de soya estéril preparada a partir de harina de soya cultivada de acuerdo con métodos biológicos y agronómicos de laboratorio descortezados; c) la fermentación de la leche de soya por iniciador mixto seleccionado de 48 -96 h, preferiblemente 96 horas a 30 -37 °C, preferiblemente 30°C; d) separación de las células por centrifugación. De acuerdo con una variante del procedimiento de la preparación también puede contener células de bacterias del ácido láctico; e) la deshidratación de la preparación por secado o liofilización proceso; f) preparación de una composición mediante la adición de excipientes adecuados, para obtener formas adecuadas para uso por via oral o tópica dependiendo de los casos.
Ejemplo 6: Evaluación in vitro de la biomasa que contiene lunasina vs biomasa sin lunasina en la estimulación del crecimiento del pelo.
Estudio in vitro de la biomasa que contiene lunasina (BL) en comparación con sin lunasina (B) como promotor del crecimiento del pelo.
Material y métodos Las células de la papila Derma (DPC) han sido cultivadas en medio (medio de Eagle modificado con Dulbecco, DMEM) que contenía 2 mM de L-glutamina, lx de solución antimicótica y antibiótico (lOOOu g/ml sulfato de estreptomicina, 1000 unidades/ml de penicilina G y 2.5 g/ml de anfotericina B) y 10% de suero fetal bovino. En la confluencia las células han sido cultivadas durante 24 horas en DMEM sin suero y después se trató con diversas concentraciones de biomasa que contienen o no lunasina .
La proliferación celular se ha determinado por el método MTT (Mosmann, 1983) . DPC han sido sembradas en una placa de 96 pozos (104 células/pozo) y se incubaron durante 24 horas añadiendo las sustancias a ensayar. La absorbancia se ha medido a 570 nm con un lector de ELISA.
Además se ha llevado a cabo el análisis Western blot en Bcl2. Las proteínas se han extraído por medio de solución reguladora que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7.4, EDTA 2 mM, 100 mM leuptina g/ml y 100 NaCl. 50 ug de proteínas se han cargado y se separaron por SDS-PAGE. Los anticuerpos monoclonales contra Bcl-2, Bax y actina se han diluido 1: 500, el complejo antígeno-anticuerpo se ha detectado usando el sistema ECL y el resultado analizado mediante densitometría imagen (Bio-Rad GS-700) .
Resultados y discusión En el rango de concentraciones analzadas de biomasa de lunasina (0.01-0.5 µ?) que contiene induce de aumento de la proliferación in vitro de acuerdo con DPC manera dependiente de la dosis (p <0.05) (Figura 1). ' El efecto de la biomasa que contiene lunasina, diferente a la biomasa sin lunasina, induce un aumento de la expresión de proteína Bcl-2 y una disminución de la expresión de la proteína Bax (Figura 2) .
Estos datos sugieren que la biomasa que contiene lunasina estimula el crecimiento del cabello a través de efecto proliferativo y anti-apoptóticos de los mismos en DPC, podría, por lo tanto, prolongar la fase anágena.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. - Proceso para la preparación de una mezcla fermentada a base de soya, que comprende isoflavonas-agliconas, Equol y lunasina por fermentación de soya usando una mezcla de las siguientes cuatro bacterias del ácido láctico: Lactobacillus plantarum DSM 23755, Lactobacillus plantarum DS 23756, Lactobacillus fermentum DSM 23757 y Lactobacillus- rhamnosus DSM 23758.
2. - El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende o que consiste de los siguientes pasos: a) propagación de cultivo de los cuatro Lactobacillus plantarum DSM 23755, Lactobacillus plantarum DSM 23756, Lactobacillus fermentum DSM 23757 y Lactobacillus rhamnosus DSM 23758 bacterias de ácido láctico; b) inocular sustratos a base de soya con una suspensión acuosa de dichas bacterias de ácido láctico; c) incubar a 30 - 37°C, preferiblemente 30°C, durante 48 a 96 h, preferiblemente 96 h.
3. - El proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde los sustratos se inocularon con una suspensión acuosa de las bacterias de ácido láctico en una cantidad de' 1 a 4% del volumen total del sustrato, dicha suspensión acuosa que tiene una densidad celular de aproximadamente 9,0 log ufc/ml dé cada cepa.
4. - El proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde los sustratos a base de soya se seleccionan, del grupo que consiste en harina de soya, harina de soya preferiblemente biológica, la leche de soya.
5. - El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa d) de la centrifugación del caldo de cultivo con el fin de eliminar las células de bacterias del ácido láctico.
6. - El proceso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la centrifugación del caldo de cultivo se lleva a cabo a 10,000 xg durante 15 min a 4°C.
7. - el proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además la etapa e) de la deshidratación del sobrenadante obtenido en la etapa d) o de cultivo obtenido en la etapa c) mediante secado o liofilización.
8. - La mezcla fermentada a base de soya, que comprende isoflavonas-agliconas, Equol y lunasina, que pueden obtenerse mediante el procedimiento tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 7.
9. - La composición farmacéutica o cosmética que comprende o que consiste en la mezcla de acuerdo con la reivindicación 8 junto con uno o más excipientes farmacéuticos o cosméticamente aceptable y/o adyuvantes.
10. - La mezcla de acuerdo con la reivindicación 8, como tal o en combinación con uno o más excipientes y/o adyuvantes, para su uso como alimento integrador.
11. - La mezcla de acuerdo con la reivindicación 8 o la composición de acuerdo con la reivindicación 9, para uso en el tratamiento de trastornos o enfermedades de la piel o la pared intestinal .
12. - La mezcla de acuerdo con la reivindicación 8 o la composición de acuerdo con la reivindicación 9, para uso cosmético .
13. - La preparación de la mezcla para uso de acuerdo con la reivindicación 12, para el tratamiento de pérdida de cabello.
14. - La mezcla de acuerdo con la reivindicación 8 o la composición de acuerdo con la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento de la alopecia o defluvio telógeno.
15. - La preparación de la mezcla de los cuatro siguientes bacterias de ácido láctico Lactobacillus plantarum DSM 23755, Lactobacillus plantarum DSM 23756, Lactobacillus fermentum DSM 23757 y Lactobacillus rhamnosus DSM 23758.
16. - Bacteria del ácido láctico Lactobacillus plantarum DSM 23755.
17. - Bacteria de ácido láctico Lactobacillus plantarum DSM 23756.
18. - Bacteria del ácido láctico Lactobacillus fermentum
19. - Bacteria de ácido láctico Lactobacillus rhamnosus RESUMEN La presente invención se refiere a una mezcla que comprende isoflavonas-agliconas, tales como diadzeina, genisteina y gliciteina, además de Equol y lunasina, dicha mezcla estando asada en soya fermentada usando bacterias de ácido láctico aisladas de las matrices alimenticias y usando dicha mezcla para la protección de la piel y similar y de células intestinales humanas con referencia particular a la prevención del estado inflamatorio y protección de funciones de barrera y tratamiento de pérdida de cabello.
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