JP5951604B2 - イソフラボン−アグリコン、エクオール及びルナシルを含む醗酵大豆ベース混合物、食品、医薬品及び化粧品分野におけるその調製方法及び使用 - Google Patents

イソフラボン−アグリコン、エクオール及びルナシルを含む醗酵大豆ベース混合物、食品、医薬品及び化粧品分野におけるその調製方法及び使用 Download PDF

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Description

本発明はイソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシルを含む醗酵大豆ベース混合物、食品、医薬品及び化粧品分野におけるその調製方法及び使用に関する。特に、本発明は、エクオール及びルナシンに加えてダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテインのようなイソフラボン−アグリコンを含む混合物に関し、該混合物は食品マトリクスから単離された乳酸菌を用いて醗酵された大豆に基づいており、皮膚及び付属器の保護、及びヒト腸細胞の保護のための該混合物の使用は特に炎症状態の防止及びバリア機能の保護及び抜け毛治療に関連している。
イソフラボンは様々な植物、特に大豆(soya、ソーヤ)において天然に存在するジフェノール化合物である(Tsangalis et al.,2002.β−グルコシダーゼ産生ビフィズス菌による豆乳のイソフラボンフィトエストロゲンの酵素的変換(Enzymatic transformation of isoflavone phytoestrogens in soymilk by β−glucosidase producing bifidobacteria.)Food Res.Int.Sci.67:3104−3113)。 イソフラボン由来の大豆及び大豆ベースの食品産物は4つのクラスの化合物に属する:アグリコン、マロニル−、アセチル−、及びβ−グルコシド共役体(Tsangalis et al.,2002.β−グルコシダーゼ産生ビフィズス菌による豆乳のイソフラボンフィトエストロゲンの酵素的変換(Enzymatic transformation of isoflavone phytoestrogens in soymilk by β−glucosidase producing bifidobacteria.)Food Res.Int.Sci.67:3104−3113).90%超の大豆イソフラボン合計濃度はβ−グルコシド誘導体として存在する。顕著な疎水性特性及び高分子量のために、β−グルコシド誘導体はヒトには吸収されない。
そのため、生物利用可能性を有し、それ故に代謝可能にするために、該化合物はアグリコンへと加水分解しなければならない。ダイゼインダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテインのようなアグリコンへの加水分解は、腸内及びバクテリアのβ−グルコシダーゼの活性の結果として腸内通過の間に生じる。遊離の形態では、このようなアグリコンはエストロゲンに構造的に類似しており、ヒト体内でエストラジオール機能を真似ている(Setchell及びCassidi,1999.食物イソフラボン:ヒト健康への生物学的効果と関連性(Dietary isoflavones:biological effects and relevance to human health.)J.Nutr.131:758 − 767))。一般に、イソフラボン−アグリコンの消費はホルモン病態のリスクの低減(Kruzer 2000.大豆イソフラボンのホルモン効果:閉経前及び閉経後の女性における研究(Hormon effects of soy isoflavones:studies in premenopausal and postmenopausal women.)J.Nutr.130:660−661)、及び骨粗鬆症の低出現率、心血管病態及び癌による閉経と致死性(Nagata et al.1998.血清総コレステロール濃度の減少は日本人男女における大豆製品の高摂取に関連している(Decreased serum total cholesterol concentration is associated with high intake of soy products in Japanase men and women.)J.Nutr.128:209−213)に関連している。
エクオールはイソフラボンクラスに属する非ステロイド性のエストロゲン化合物である。ヒトのエクオールの主要源は大豆誘導体であり、ダイゼイン及びアグリコンダイゼイン、その直接の前駆体のための最も豊富に存在する蓄積(most abundant reserve)になっている(Axelson et al.,1984.大豆、ヒト及び動物における非ステロイド性エストロゲンエクオールの食物源(Soya a dietary source of the non−steroidal oestrogen equol in man and animals.)J.Endocrinol.102:49−56)。他のイソフラボン−アグリコンとは異なり、エクオールは複素環内の二重結合の欠損の結果としてのコアキラル核を有する唯一のものである(Setchell et al.,2002.代謝物エクオールの臨床的重要性、大豆及びそのイソフラボンの有効性への糸口(The clinical importance of the metabolite equol a clue to the effectiveness of soy and its isoflavones.)Am.Soc.Nutr.Sci.125:3577−3583)。一般にエクオールは結腸壁を介して容易に吸収され、代謝的に不活性である(Setchell et al.,2002.代謝物エクオールの臨床的重要性、大豆及びそのイソフラボンの有効性への糸口(The clinical importance of the metabolite equol a clue to the effectiveness of soy and its isoflavones.)Am.Soc.Nutr.Sci.125:3577−3583)。そのダイゼイン前駆体に比較して、エクオールは興味深い一連の特性:高いエストロゲン活性(Muthyala et al.,2004.エクオール、大豆イソフラボンからの天然エストロゲン代謝物:R−及びS−エクオールの好適な調製及び分解、並びにエストロゲン受容体α及びβを介するそれらの異なる結合及び生物学的活性(Equol,a natural estrogenic metabolita from soy isoflavones:convenient preparation and resolution of R− and S−equols and their differing binding and biological activity through estrogen receptors alpha and beta.)Bioorg.Med.Chem.12:1559−1567)、抗酸化活性(Mitchell et al.,1998.化学的及び生物学的モデルシステムにおけるフィトエストロゲンの抗酸化効果(Antioxidant efficacy of phytoestrogens in chemical and biological model systems.)Arch.Biochem.Biophys.360:142−148)、及び抗アンドロゲン活性(Lund et al.,2004.エクオールは前立腺成長及びホルモンフィードバックを阻害する新規の抗アンドロゲンである(Equol is a novel anti−androgen that inhibits prostate growth and hormone feedback.)Bio.Reprod.70:1188−1195)を示す。
ヒトにおける大豆イソフラボン代謝は広く記載されている (Axelson et al.,1984.大豆、ヒト及び動物における非ステロイド性エストロゲンエクオールの食物源(Soya a dietary source of the non−steroidal oestrogen equol in man and animals.)、J.Endocrinol.102:49−56;Bannwart et al.,1984.o−デスメチルアンゴレンシンの同定、ダイゼイン及びマタイレシノールの代謝物、ヒト尿における動物リグナンエンテロラクトンの一つの可能性の高い植物前駆体(Identification of o−desmethylangolensin,a metabolita of daidzein and of matairesinol,one likely plant precursor of the animal lignan enterolactone in human urine.)Finn.Chem.Lett.5:120−125)。腸の通過の間にグルコシドイソフラボンをアグリコンに、アグリコンをエクオールに代謝する能力は、わずか西洋諸国人口の30−50%に過ぎない(Frankefeld,et al.2005.1〜3歳離れて測定された個人のダイゼイン−代謝表現型の高い一致(High concordance of daidzein−metabilizing phenotypes in individuals measured 1 to 3 years apart.)Brit.J.Nutr.94:873−876))。大豆由来のイソフラボンの生物利用性を増大させるために二つの主要な戦略を採ることができる:インシチュでそのような化合物を合成するのにふさわしい生存可能で生きているバクテリアの摂取による腸内細菌叢の消費又は調整前のアグリコン及びエクオール富化(Tsangalis et al.,2004.大豆胚芽を用いたイソフラボンアグリコン富化豆乳、大豆タンパク質単離物、及びビフィズス菌の開発(Development of an isoflavone aglycone−enriched soymilk using soy germ,soy protein isolate and bifidobacteria.)Food Res.Intern.37:301−312))。様々な研究(Chun et al.,2007.乳酸菌での醗酵による豆乳におけるイソフラボングルコシドのアグリコンへの転換(Conversion of isoflavone glucoside to aglycones in soymilk by fermentation with lactic acid bacteria.)J.Food Sci.72:39−44;Donkor and Shah 2008.豆乳におけるラクトバチルス・アシドフィルス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、及びラクトバチルス・カゼイによるβ−グルコシダーゼの産生とイソフラボンフィトエストロゲンの加水分解(Production of β−glucosidase and hydrolysis of isoflavone phytoestrogens by Lactobacillus acidophilus,Bifidobacterium lactis and Lactobacillus casei in soymilk.)J.Food Sci.73:15−20;Pham and Shah 2007.脱脂粉乳で補充された豆乳におけるビフィドバクテリウム・アニマリスによるイソフラボングルコシドの生物変換(Biotransformation of isoflavone glycosides by Bifidobacterium animalis in soymilk supplemented with skim milk powder.)J.Food Sci.72:316−324;Tsangalis et al.,2002;Tsangalis et al.,2004;Wei et al.,2007.醗酵豆乳におけるイソフラボンアグリコンを製造するためにラクトバチルス及びビフィドバクテリウムを使用すること(Using Lactobacillus and Bifidobacterium to product the isoflavone algycones in fermented soymilk.)(Int.J.Food Microbiol.117:120−124)は、豆乳の醗酵の間、グルコシドイソフラボンのアグリコン及び/又はエクオールへの変換のためのビフィズス菌及び乳酸菌の使用を考察してきた。
しかし、これらの研究においていくつかの制限が明らかとなった。(i)極めて数の限られたバクテリアバイオタイプ/種しか考察されてきていない。(ii)醗酵過程に使われるバクテリアはもっぱらヒトの糞便材料に由来している。(iii)極めて限られた数の発酵用基質しか考察されておらず、そのうちのいずれも有機農業豆粉の使用に関連してはいなかった。(iv)調製物はイソフラボン/アグリコン又はエクオールにのみ基づいており、エクオール製造の場合は最大濃度は0.521mg/100mlである(Tsangalis et al.,2002.β−グルコシダーゼ産生ビフィズス菌による豆乳におけるイソフラボンフィトエストロゲンの酵素的変換(Enzymatic transformation of isoflavone phytoestrogens in soymilk by β−glucosidase producing bifidobacteria.)Food Res.Int.Sci.67:3104−3113);(v)調製物の生物学的効率、特に皮膚の保護については試験研究がされていない;及び(vi)イソフラボンアグリコン、エクオール、及びルナシンを含む配合調製物については研究がなされていない。
ルナシンは大豆で初めて同定された生物活性ペプチド(43個のアミノ酸残基、分子量約5400Da)であり(Galvez et al.,2001.脱アセチル化ヒストンに結合し、アセチル化を阻害する大豆ペプチド(ルナシン)の化学予防特性(Chemopreventive property of a soybean peptide (Lunasin)that binds to deacetylated histones and inhibits acetylation.)Cancer Res.61:7473−7478)、引き続いてオオムギ(Jeong et al.2002.オオムギルナシンはras誘発コロニー形成を抑制し、哺乳類細胞におけるコアヒストンアセチル化を阻害する(Barley lunasin suppresses ras−induced colony formation and inhibits core histone acetylation in mammalian cells.)J.Agric.Food Chem.50:5903−5908)、小麦(Jeong et al.2007.小麦由来の癌予防性ペプチドルナシンはコアヒストンアセチル化を阻害する(The cancer preventive peptide lunasin from wheat inhibits core histone acetylation.)Cancer Lett.255:42−48)、アマランス(Silva−Sanchez et al.,2008.アマランス(Amaranthus hypochondriacus)種子における生物活性ペプチド(Bioactive peptides in amaranth (Amaranthus hypochondriacus)seed.J.Agric.Food Chem.56:1233−1240)においても見出された生物活性ペプチドである。
大豆におけるルナシンの濃度は栽培品種、培養土壌内微気象雰囲気、及び穀物が収穫後に受けてきた技術的過程によって変わり得る。ルナシンはLoda栽培品種において非常に高濃度(約11mg/g)で見出され、他の大豆変種では(例えばImari)ではルナシン含量は5〜6mg/gを超えない(Wang et al.2008.大豆タンパク質由来ペプチドの分析、栽培品種、環境条件、及び大豆及び大豆製品におけるルナシン濃度の処理の効果(Analysis of soybean protein derived peptides and the effect of cultivar,environmental conditions,and processing of lunasin concentration in soybean and soy products.)J.AOAC Intern.91:936−944)。ルナシンはポリペプチド鎖のC末端に9個のアスパルギン酸残基を含む。この組成はアセチル化が低減したクロマチン領域への親和性の上昇に有利に働き、この領域にはペプチドが結合し、そのためにアセチル化−脱アセチル化の動力学を阻害し、それ故、腫瘍発生において腫瘍抑制剤として作用する。ルナシンがras遺伝子により誘発された細胞増殖の阻害により、及びH3ヒストンのアセチル化阻害により、腫瘍発生現象に対する予防効果を発揮し得ることも報告されている(Jeong et al.,2003.大豆から単離されたルナシンのキャラクタリゼーション(Characterization of lunasin isolated from soybean.)J Agric Food Chem.51:7901−7906)。文献データから、今までのところ、乳酸菌を使った醗酵過程による大豆誘導体のためのルナシン富化を考察した研究はないことが明らかである。
上記の報告された考察に基づき、いくつかの要素は著名な革新的特質を示しているようである:(i)大豆ベースの基質、できれば生物学的起源のものを用いること。(ii)糞便起源ではなく食品マトリックスから単離された乳酸菌を使用すること。(iii)イソフラボン−アグリコン、エクオール及びルナシンのようなより高い数の機能分子を含む製剤の処方に有利に働くように適合したバイオテクノロジーの過程を最適化すること。(iv)インビトロ及びエクスビボアッセイを用いて、皮膚及びヒト腸細胞保護に関し、特に炎症状態の阻害とバリア機能維持に関し、結果的な調製物の効果を実証すること。
本発明の著者らはここに、イソフラボン、アグリコン、エクオール、及びルナシンについて富化した醗酵大豆ベースの混合物を提供するのにふさわしい新しい方法を開発した。本発明による混合物は糞便起源ではない、専ら食品マトリックス由来の乳酸菌の特定の混合物を用いた大豆の醗酵によって得られる。本発明による混合物は、イソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシン、特にルナシンの高い含量により、皮膚及びヒト腸細胞保護のための特別な有効性を、特に炎症状態の防止及びバリア機能維持に関して示した。
本発明の著者らはここに以下の点を考察する:(i)p−ニトロフェニル−β−D−グルコピラノシド(pNPG)についてβ−グルコシダーゼ活性に従い専ら食品マトリックス由来の103種の単離された乳酸菌を選択することにより、4種の乳酸菌、即ちL.plantarum DPPMA24W(2010年7月8日にDSMZに寄託 DSM番号23756)及びDPPMASL33(2010年7月8日にDSMZに寄託 DSM番号23755)、L.fermentum DPPMA114(2010年7月8日にDSMZに寄託 DSM番号23757)、及びL.rhamnosus DPPMAAZ1(2010年7月8日にDSMZに寄託 DSM番号23758)を選択し、大豆粉ベースの基質の醗酵のための混合スターターとして用いることができた。(ii)14種の異なる大豆ベースの基質を用いることにより、混合スターターを用いる醗酵のための有機農業大豆粉に基づいた最適の調製物として選択することができた。(iii)有機農業大豆粉基質の醗酵過程の最適化により、1.45mg/100ml(57.0μM)のダイゼイン、3.9mg/100ml(140.3μM)のゲニステイン、0.58mg/100ml(20.4μM)のグリシテイン、0.9mg/100ml(37.3μM)のエクオール、及び8.4mg/100mlのルナシンを含む製剤の処方が可能になった。(iv)上記の機能的化合物に基づく製剤は皮膚上皮に対して保護効果を示し、炎症状態の阻害及び腸細胞のバリア機能に対して積極的な効果を示す。
本発明はその好ましい態様により、特に添付の図面を参照して、説明的であって制限的でない方法で以下に記載されるであろう。
図1はpNPG合成基質について様々な種に属する103種の乳酸菌バイオタイプのβ−グルコシダーゼ活性を示す。アッセイに使用するすべての乳酸菌は食品マトリックスのみから全く革新的な方法であらかじめ単離しておく。乳酸菌バイオタイプは種への対応を同定するためにコードにより示される。明細書中のプロトコルの記載を参照されたい(実施例1)。データは3つの3回の実験の平均値である。統計的な処理はボックスのプロットにより報告されている。 図2Aは14の異なる粉由来の豆乳の存在下で選択された混合スターターにより実施された乳酸菌プロセスを示す。図2Bは14の異なる粉由来の豆乳の存在下で選択された混合スターターを含む乳酸菌バイオタイプの細胞密度を示す。データは3つの3回の実験の平均値である。統計的な処理はボックスのプロットにより報告されている。 図3は選択された混合スターターを用いた有機農業大豆粉(OFS)由来の豆乳の醗酵中のルナシン(mg/100ml)の合成を示す。データは3つの3回の実験の平均値である。 図4は選択された混合スターターとPBS緩衝液を用いた有機農業醗酵豆乳(OFS)に0及び24時間曝した後の再構成上皮(SkinEthic(登録商標))の経上皮電気抵抗(Transepithelial Electric Resistance (TEER)(オームxcm))を示す。データは3つの3回の実験の平均値である。
図5はCaco−2/TC7細胞からの硝酸放出(μM)(NO)を示す。細胞は標準として使用された化合物(10μM)(エクオール、ダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテイン)と、有機農業大豆粉から得られた豆乳であって、非醗酵の豆乳、又は混合選択スターターで醗酵され10μMのエクオール最終濃度に希釈され、滅菌ろ過された豆乳とで24時間前処理しておいた。続いて細胞をγ−インターフェロン(IFN−γ)(1000U/ml)とリポポリサッカライド(LPS)(100ng/ml)で24時間刺激した。DMSO(1%、v/v)又はメタノール(0.5%、v/v)を含むDMEM培養基を陰性対照として用いた。データは3つの3回の実験の平均値である。星印は陰性対照と比較した有意の差(P<0.01)を示す。 図6は24、48及び72時間のインキュベーション後のCaro−2/TC7細胞の経上皮電気抵抗(TEER)(オームxcm)を示す。インキュベーションは、γ−インターフェロン(IFN−γ)(1000U/ml)の存在下
;IFN−γと有機農業大豆粉から得られ醗酵していない豆乳の存在下

、又は選択された混合スターターで醗酵され10μMのエクオール最終濃度に希釈され滅菌ろ過された豆乳の存在下(−x−)で実施された。DMEM培養基を陰性対照として用いた

。データは3つの3回の実験の平均値である。星印は陰性対照と比較した有意の差(P<0.01)を示す。
図7はCaco−2/TC7細胞からのインターロイキン−8(IL−8)の放出(pg/ml)を示す。細胞はインターロイキン−1β(IL−1β)(2ng/ml)で24時間刺激され、続いて標準として使用された化合物(10μM)(エクオール、ダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテイン)と、有機農業大豆粉から得られた豆乳であって、非醗酵の豆乳、又は選択混合スターターで醗酵され10μMのエクオール最終濃度に希釈され、滅菌ろ過された豆乳とで処理した(24時間)。DMSO(1%、v/v)又はメタノール(0.5%、v/v)を含むDMEM培養基を陰性対照として用いた。データは3つの3回の実験の平均値である。星印は陰性対照と比較した有意の差(P<0.01)を示す。 図8はルナシンを含むバイオマスとルナシンを含まないバイオマスの細胞増殖に対する効果を示す。 図9はルナシンを含むバイオマスとルナシンを含まないバイオマスのBcl−2とBaxのタンパク質発現に対する効果を示す。
本発明による乳酸菌はラクトバチルス種に属し、中部及び南イタリアにおいてパン製造に用いられる天然酵母及びプーリア地方のペコリーノタイプの熟成された「パスタフィラータ」チーズから単離されている。一般にこのような食品マトリックスから単離された乳酸菌は、ヒトや動物の胃腸管にコロニーを形成する微生物とそうかけ離れていない代謝的及び環境的適応特性を示す。L.plantarum DPPMA24W(2010年7月8日にDSMZに寄託 DSM番号23756)及びL.plantarum DPPMASL33(2010年7月8日にDSMZに寄託 DSM番号23755)、L.fermentum DPPMA114(2010年7月8日にDSMZに寄託 DSM番号23757)及びL.rhamnosus DPPMAAZ1(2010年7月8日にDSMZに寄託 DSM番号23758)が選択され使用された。
好ましくは生物学的起源の様々な大豆粉ベースの基質について当該4種の乳酸菌による30〜37℃で48〜96時間の醗酵が関与するバイオテクノロジー的プロトコルを標準化し最適化した。醗酵過程の最後に培養基から遠心分離により、そして上清を乾燥若しくは凍結乾燥による脱水過程に付すことにより細胞を除去することも又は除去しないこともできる。
以下に有機農業大豆ベース製剤の醗酵のためのバイオテクノロジー的プロトコルを記載する。
様々な豆乳製剤の醗酵の結果として、3.9〜57.0μMのダイゼイン、7.8〜140.3μMのゲニステイン、6.7〜20.4μMのグリシテイン、7.6〜37.3μMnエクオール、及び約8.4mg/100mlのルナシンの合成が得られた。上記の報告された濃度の上限は有機農業大豆粉由来の豆乳の醗酵に関するものである。可能な処方の一つに従えば、有機農業大豆由来の醗酵製品の適用により、(i)上皮を保護し、そのバリア機能を増大させ、(ii)γ−インターフェロン(IFN−γ)とリポポリサッカライド(LPS)による誘発の後のCaco−2/TC7細胞の炎症状態を阻害し、(iii)経上皮電気抵抗(TEER)試験により示されるようなバリア機能を刺激し、及び(iv)インターロイキン−(IL−8)の合成を阻害するのに適していることが示された。
微生物学的クロマトグラフィー技術とインビトロ、並びに及びエクスビボの細胞培養物についてのアッセイを用いた補完的分析により示された様に、本発明により食品マトリックスから単離され、従来の研究では使用されなかった乳酸菌種からなる混合スターターによる有機農業豆粉の醗酵により、(i)従来の研究では見られなかったアグリコン、エクオール、及びルナシンの同時合成、及び(ii)炎症状態に対する保護効果を可能にし、上皮とヒト腸細胞のバリア機能を増大する。
それ故、以下の4種の乳酸菌:Lactobacillus plantaru DSM 23755、Lactobacillus plantarum DSM 23756、Lactobacillus fermentum DSM 23757、及びLactobacillus rhamnosus DSM 23758の混合物を用いた大豆醗酵による、イソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシンを含む、醗酵大豆ベース混合物の調製方法は、本発明の特異的な目的である。本発明の方法により得られた混合物は、イソフラボン−アグリコン、ルナシン、及びエクオールが富加された混合物であり、本発明とは異なる乳酸菌を用いた方法により得られた公知の混合物に比較して、これらの化合物をより多い割合で含んでいる。
本発明による方法は、以下の工程を含むか、又はからなる:a)該4種の乳酸菌Lactobacillus plantarum DSM 23755、Lactobacillus plantarum DSM 23756、Lactobacillus fermentum DSM 23757、及びLactobacillus rhamnosus DSM 23758を培養増殖させる工程;
b)該乳酸菌の水性懸濁液で大豆ベース基質をインキュベートする工程;好ましくは、基質は全基質体積の1〜4%の量の乳酸菌の水性懸濁液でインキュベートされ、該水性懸濁液は各バイオタイプについて約log 9.0 cfu/mlの細胞密度を有している;
c)30〜37℃、好ましくは30℃で、48〜96時間、好ましくは96時間インキュベートする工程。
使用に適した大豆ベースの基質は、例えば、大豆粉、好ましくは有機農業大豆粉、豆乳、及び本願に従って報告されている他の商業的処方である。
本発明による方法はさらに、d)乳酸菌から細胞を分離するためにブロス培養物を遠心分離する工程を含む。特に、ブロス培養液の遠心分離は10,000 x gで15分間4℃で行うことができる。
本発明による方法はさらに、e)工程d)で得られた上清を乾燥又は凍結乾燥により脱水する工程を含むことができる。一態様に従えば、処方は工程d)を省いた生存可能で生きている乳酸菌を含むことができる。組成物の調製は、脱水過程の最後に、状況に応じて経口又は局所使用に適した剤形の製剤を得るために、適切な賦形剤を添加した処方を包含することができる。
乳酸菌の除去の工程d)なしで上記のように定義された方法に従って得られ得る醗酵大豆に基づく、イソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシンを含む混合物もまた本発明の目的である。該混合物はそれ故に上記の本発明の乳酸菌を含んでいる。報告されているように、本発明による混合物は、イソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシンを富化した混合物であり、即ち、本発明とは異なる乳酸菌を用いた方法により得られた公知の混合物よりも高い割合でこれらの化合物を含んでいる。
本発明はさらに、上で定義した混合物を、1種以上の薬学的に又は化粧品学的に許容可能な賦形剤及び/又はアジュバントとともに含む、又はからなる医薬又は化粧品組成物に関する。
更なる態様によれば、本発明による混合物は食品インテグレーターとして使用することができる。例えば、混合物は伝統的な食品、例えばパン又はパスタ製品のためにも使用することができる。
さらに、本発明による混合物又は組成物は皮膚又は腸の障害又は疾患の治療に用いることができる。特に、該混合物又は組成物は皮膚バリア機能の変化に対して、例えば感受性皮膚、乾燥皮膚、乾癬、アトピー皮膚炎、脂漏性皮膚炎、ふけ、刺激性皮膚炎、湿疹皮膚炎、接触皮膚炎、潰瘍、にきび、皮膚老化の予防と治療のために用いることができる。さらに、本発明による混合物及び組成物は、腸のバリア機能が変化した場合、例えばセリアック病、食物不寛容、クローン病の治療又は予防に用いることができる。
本発明による混合物又は組成物は化粧品分野で、例えば脱毛の治療に、又は脱毛症又は休止期脱毛の治療のために医療分野で用いることができる。
特に、本発明による混合物又は組成物は局所的に、例えばクリーム、ローション、ペースト、軟膏、ゲル、溶液、エマルジョン、懸濁液、又は全身的に、例えば経口的に、例えばバイアル、チュアブル錠、ピル、サシェット等により投与することができる。
もちろん、乳酸菌の除去工程d)を含む本発明の方法により得られる混合物、又は該混合物を含む医薬若しくは化粧品組成物はまた、上記の報告された適応症に有利に用いることができるが、それは該物が、本発明とは異なる乳酸菌を用いた方法により得られる公知の混合物よりも高い割合でイソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシンを含んでいるためである。
さらに、以下の4種の乳酸菌Lactobacillus plantarum DSM 23755、Lactobacillus plantarum DSM 23756、Lactobacillus fermentum DSM 23757、及びLactobacillus rhamnosus DSM 23758の混合物も本発明の目的である。最後に、Lactobacillus plantarum DSM 23755又はLactobacillus plantarum DSM 23756又はLactobacillus fermentum DSM 23757又はLactobacillus rhamnosus DSM 23758も本発明の目的である。
実施例1:食物マトリックスから単離された乳酸菌の103種のバイオタイプのβ−グルコシダーゼ活性
Lactobacillus alimentarius(10N、2B、5A)、Lactobacillus brevis(5Z、DPPMA869)、Lactobacillus casei(LC10)、Lactobacillus casei subsp.casei(2047、2756、2763、2766)、Lactobacillus casei subsp.pseudoplantarum(2742、2745、2749、2750)、Lactobacillus curvatus(13H5、14H10、1Hd、2042、2081、2768、2770、2771、2775、SAL23、SAL35)、Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus(11842、B15Z)、Lactobacillus fermentum(DPPMA114、D13)、Lactobacillus gasseri(B30W)、Lactobacillus helveticus(15009、B26W、PR4)、Lactobacillus hilgardii(51B)、Lactobacillus paralimentarius(15α、15β、16R、8D、DPPMA238)、Lactobacillus paracasei(12H8、1Hb、B14、B18S、B25、PF6、B61)、Lactobacillus pacarbuckneri(B10、 B48、B48、B5t、BF、BF)、Lactobacillus paraplantarum(4DE、DPPMA667)、Lactobacillus pentosus(8CF、12H5、12H6)、Lactobacillus plantarum(14H4、17N、19A、1A7、2A、30、3DM、4H1、4H10、DB200、DPPMASL33、DPPMA24W)、Lactobacillus rhamnosus(11、19、DPPMAAZ1、DPPMAAZ21)、Lactobacillus sakei (9I、SAL1、SAL18)、Lactobacillus rossiae (10A、15R、3D、5C1、5α、CF51、CI35、CR20、E18)、Lactobacillus sanfranciscensis(16α、A17、BB12、DE9、E19、H10)、Lactococcus lactis subsp.lactis(10γ)、Pediococcus pentosaceus(C16、C25、C305t、C、C、C5t、C29)、及びWeissella cibaria(10XA16、3XA4、5S、5XF12)種に属する乳酸菌の103種のバイオタイプを本研究に用いた。すべてのバイオタイプはthe Collezione di Colture del Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata dell’Universita degli Studi di Bariに属し、あらかじめ食物マトリックス(パン製造及びチーズのための天然酵母)から単離された。乳酸菌のバイオタイプは30又は37℃で24時間MRS培地(Oxoid,Basingstoke,United Kingdom)で30℃で24時間増殖させた。
細胞を24時間培養し、遠心分離(4℃で15分間10,000 x g)で収集し、リン酸緩衝液50mM、pH7で2回洗浄し、水中にlog9.0 cfu/mlの細胞密度で再懸濁させたものを、β−グルコシダーゼ活性アッセイに用いた。β−グルコシダーゼ活性はp−ニトロフェノール−β−グルコピラノシド(pNPG)基質(Sigma Aldrich Chemical Corporate,St.Louis,Missouri,USA)から遊離されたp−ニトロフェノールとして定量された。リン酸緩衝液0.5M、pH7.5中の900μlのpNPG(最終濃度)と100μlの細胞懸濁液をアッセイに用いた。混合物を40℃でインキュベートし、反応を95℃で5分間の熱処理によりブロックした。吸光度を410nmで測定した。β−グルコシダーゼ活性の1単位(U)を、p−ニトロフェノールの1nmol/分がアッセイ条件下で遊離されるのに必要な酵素の量として定義した(De Angelis et al.,2005.Lactobacillus sanfranciscensis CB1由来の細胞内ファミリー3β−グルコシダーゼの精製とキャラクタリゼーション(Purification and characterization of an intracellular family 3 β−glucosidase from Lactobacillus sanfranciscensis CB1.)Ital.J.Food Sci.17:131−142)。
実施例2:豆乳の調製と醗酵
機農業大豆OFS)(ECorNaturaSi,Verona,Italy)、大豆タンパク質単離物(SPI)(Supro Soja 80 Aptonia,Villeneuve d’ Ascq,France)及び様々な市販大豆粉調製物(Cargill Texturizing Solutions Soy Protein,Gent,Belgium)を豆乳の製造に用いた。OFSは洗浄して蒸留水中に一晩静置した。湿潤して膨潤した大豆を手で皮を剥き、温水(約90℃)で1:10の比で希釈し、PBI国際ホモジナイザー(ミラノ、イタリア)で均一化した。均一化は10,000xgで2分間行い、次いで1分休止し、再び14,000xgで2分間行った。懸濁液を遠心分離し(7,000xg、10分、4℃)、豆乳を0.22μm孔径フィルター(Millipore Corporation,Bedford)で滅菌濾過した。pHは6.2であった。SPIを蒸留水(40℃)、0.4:10の比で蒸留し、約55℃で30分間攪拌下(120rpm)で熱処理した。室温で冷却後、pHをNaOH5M(Tsangalis et al.2002)を用いて6.7に調整した。滅菌をオートクレーブ中で121℃で15分間行った。市販の大豆粉調製物を、Chun et al.(Chun et al.,2007.乳酸菌での醗酵による豆乳中イソフラボングルコシドのアグリコンへの変換(Conversion of isoflavone glucoside to aglycones in soymilk by fermentation with lactic acid bacteria)J.Food Sci.72:39−44)に記載の方法により、蒸留水(40℃)で1:10の比で希釈した。pHは約6.3であった。滅菌はオートクレーブ中121℃で15分間行った。
様々な豆乳タイプをβ−グルコシダーゼ活性に基づいて選択した4種の乳酸菌の混合細胞懸濁液で接種した(1〜4%、v/v)。各4種の乳酸菌バイオタイプの初期細胞密度はlog7.0cfu/mlであった。醗酵は30℃で96時間攪拌下(120rpm)で行った。ヒト腸細胞アッセイについては、豆乳を凍結乾燥し、DMEM培養液に再懸濁し、滅菌濾過した。
実施例3:乳酸菌のモニタリング、イソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシンの決定
様々な豆乳タイプの醗酵の間、混合スターターとして使用した乳酸菌(DPPMASL33に対応するLactobacillus plantarum DSM 23755、DPPMA24Wに対応するLactobacillus plantarum DSM 23756、DPPMA114に対応するLactobacillus fermentum DSM 23757、及びDPPMAAZ1に対応するLactobacillus rhamnosus DSM 23758)のモニタリングは、RAPD−PCR法を用いて行った。二つのプライマー(Invitrogen、ミラノ、イタリア)を、任意に選択された配列(P7 5’ AGCAGCGTGG 3’(配列番号:1)及びM13,5’ GAGGGTGGCGGTTCT 3’ (配列番号:2))とともに、プラスミドと染色体バクテリアDNAの様々な領域をランダムに増幅しながら(De Angelis et al.,2001.表現型、遺伝子型及び細胞壁タンパク質分析に基づく雌羊イタリアチーズ由来の非スターター乳酸菌(NSLAB)のキャラクタリゼーション(Characterization of non−starter lactic acid bacteria (NSLAB)from ewes’ Italian cheeses based on phenotypic,genotypic and cell−wall protein analyses.)Appl.Environ.Microbiol.67:2011−2020;Rossetti e Giraffa,2005.M13により生成したRAPD−PCR指紋データベースによる乳製品乳酸菌の迅速な同定(Rapid identification of dairy lactic acid bacteria by M13−generated,RAPD−PCR fingerprint databases.)J.Microbiol.Met.63:135−144)、タイピングに用いた。
醗酵豆乳試料からのイソフラボン−アグリコン及びエクオールの抽出をOtieno and Shah (Otieno and Shah,2007.様々な濃度の外因性の、及びプレバイオティック由来の内因性のβ−グルコシダーゼを用いた豆乳におけるイソフラボンの変換の変化の比較(A comparison of changes in the transformation of isoflavones in soymilk using varying concentrations of exogenous and prebiotic−derived endogenous β−glucosidases.)J.Appl.Microbiol.103:601−612)に記載された方法に従って行った。化合物の決定のためのHPLCクロマトグラフィー分析をMaubach et al.(Maubach et al.,2003.高速液体クロマトグラフィーによるヒト乳房組織及び生物学的流体における大豆由来植物エストロゲンの定量(Quantitation of soy−derived phytoestrogens in human breast tissue and biological fluids by high−performance liquid chromatography.)J.Chromatogr.784:137−144)により記載された方法に従って行った。
醗酵前に又は醗酵の間に有機農業大豆粉由来の豆乳中のルナシンの決定は、C18 Xterra Watersカラムと214nmUV検出器を備えたAKTA Purifier system (GE Healthcare)を用い、5% ACN + 0.05% TFA (溶離液A)及びACN + 0.05% TFA (溶離液B)からなる混合溶媒で溶出するHPLCクロマトグラフィーにより行った(Wang et al.2008.大豆タンパク質由来ペプチドの分析及び栽培品種、環境条件の効果、並びに大豆及び大豆製品中のルナシン濃度の処理(Analysis of soybean protein derived peptides and the effect of cultivar,environmental conditions,and processing of lunasin concentration in soybean and soy products.)J.AOAC Intern.91:936−944)。合成ルナシンを標準として用いた(EZBiolab Inc.,Carmel,IN,USA)。
実施例4:再構成上皮及びTEER測定(経上皮電気抵抗)についての試験
ヒト再構成上皮SkinEthic(登録商標)(再構成ヒト上皮)は、多重層としてヒト上皮の正常ケラチノサイト(角化細胞)からなる。それは、化学的に規定された培地(MCDM153)中、ウシ胎児血清を添加せずに、不活性な多孔性ポリカーボネート支持体上の気液界面で17日間、ヒトケラチノサイトの培養後、完全に分化した上皮である。この成長段階で、形態的な分析により、生存する多層化した上皮と、10を超える数の緻密細胞層からなる角質層が示された。ヒト再構成上皮SkinEthic(登録商標)を先に記載された手順に従って用いた(Di Cagno et al.,2009.ラクトバチルス プランタルム DSMZ19463によるγ−アミノ酪酸(GABA)の合成:機能的ブドウの飲料及び皮膚科学的応用(Synthesis of γ−amino butyric acid (GABA)by Lactobacillus plantarum DSMZ19463:functional grape must beverage and dermatological application.)Appl Biotechnol Microbiol DOI:10.1007/s00253−009−23704)。
Millicell−ERS電圧電流計(Millipore,Billerica,MA)を用いてTEER測定を実行した。測定はオームxcmで表現した。
実施例5:Caco−2/TC7細胞での試験
ヒト起源Caco−2細胞(クローンTC7)を、ウシ胎児血清(10%)を添加し、必須でないアミノ酸(1%)、ゲンタマイシン/ストレプトマイシン(50μg/ml)、グルタミン(2mM)及び4−2−ヒドロキシエチル−1−ピペラジニル−エタンスルホン酸(1%)を添加したダルベッコ(DMEM)培地で培養した(Di Cagno et al.,2010.サワードウのラクトバチルス プランタルムDC400における菌体密度感知機構:他の乳酸菌との共培養下でのプランタリシンA(PlnA)の誘導、並びにPlnAのバクテリア及びCaco−2細胞への効果(Quorum sensing in sourdough Lactobacillus plantarum DC400:induction of plantaricin A (PlnA)under co−cultivation with other lactic acid bacteria and effect of PlnA on bacterial and Caco−2 cells.)Proteomics in press)。細胞生存率はニュートラルレッド色素の取り込みアッセイにより決定した(Balls et al.,1987.毒性学における評価代替方法へのアプローチ(Approaches to validation alternative methods in toxicology.)In:Goldber A.M.(Ed).N.Y.Academic Press pp.45−58)。様々な調製物で24〜72時間の処理の後、細胞をPBS緩衝液で洗浄し、37℃で4時間ニュートラルレッド溶液(33mg/l)とともにインキュベートした。次いで、細胞を再度PBS緩衝液で洗浄し、溶菌溶液(1%酢酸を含む水中50%エタノール)で処理した。プレートの読み取りをNovapath reader (Biorad,Hercules,CA)(Di Cagno et al.,2010)を用いて行った。
Caco−2/TC7細胞からの酸化窒素放出(NO)を酸化生成物、即ち亜硝酸及び硝酸塩を測定することにより決定した。様々な調製物とのインキュベーションの後、細胞培養物の上清を同体積のGriess試薬(0.5M HCl中1%、p/v、スルファニル酸、及び0.1%、p/v、N−1−ナフチルエチレンジアミン塩酸塩)と混合した。室温で30分のインキュベーションの後、540nmでの吸光度を測定し、亜硝酸塩濃度を亜硝酸ナトリウムで作成した標準曲線を参照して決定した。
TEER測定のためCaco−2/TC7細胞を、24セルとポリエチレンフィルター(孔径0.4μm)を有するマイクロプレート容器内に接種した(7.5 x 10細胞/ml)。処理の前に細胞を37℃で21日間インキュベートした。様々な調製物での処理を18、24及び48時間行った。次いで細胞層の積層をTEER測定により決定した。
放出されたインターロイキン−8(IL−8)の測定のため、Caco−2/TC7細胞を予めインターロイキン−1βでインキュベートし(24時間)、次いで様々な調製物でさらに24時間刺激した。前炎症性IL−8の合成をELISAアッセイにより決定した(Bender MedSystems)。定量はキットの指示に従って標準曲線を用いて行った。
結果
(1)β−グルコシダーゼ活性に基づく乳酸菌の選択
予備的に、食物マトリクスから単離された乳酸菌の103種のバイオタイプのβ−グルコシダーゼ活性をpNPG合成基質で試験した。活性は0から202.3Uまで変化した(図1)。L.alimentarius、L.brevis、L.casei、L.delbrueckii subsp.bulgaricus、L.helveticus、L.hilgardiii、L.paralimentarius、L.paraplantarum、L.pentosus、L.sanfranciscensis、Lc.lactis subsp.lactis、L.parabuchneri e W.cibaria種にほぼ属する48種のバイオタイプは、β−グルコシダーゼ活性を示さなかった。活性平均値は3Uであり、25°と75°データパーセンタイルに対応する値は0及び45.5Uであった。乳酸菌の様々な種に対応する25種のバイオタイプは55Uより高いβ−グルコシダーゼ活性を示した。L.plantarum DPPMA24W、L.fermentum DPPMA114、L.rhamnosus DPPMAAZ1、及びL.plantarum DPPMASL33はより高い活性を示した(それぞれ、202.35±7.08、163.15±6.52、146.60±5.84、及び144.34±7.19U)。これらのバイオタイプのβ−グルコシダーゼ活性の値はボックスプロットのエラーバーの外に出ていた。これらの結果に基づいて4種の乳酸菌を選択し、様々な豆乳タイプの醗酵に用いるための混合スターターの配合のために用いた。
(2)豆乳の醗酵と機能性化合物の合成
豆乳の調製に用いる様々な大豆粉タイプの化学組成、タンパク質分散性指数及び粒径を表1に報告する。表1は、DPPMASL33に対応するLactobacillus plantarum DSM 23755、DPPMA24Wに対応するLactobacillus plantarum DSM 23756、DPPMA114に対応するLactobacillus fermentum DSM 23757、及びDPPMAAZ1に対応するLactobacillus rhamnosus DSM 23758を含む選択された混合スターターによる機能性化合物製造に用いる14種の大豆粉の化学組成、タンパク質分散性及び粒径を示す。
14種の豆乳タイプをL.plantarum DPPMA24W、及びDPPMASL33、L.fermentum DPPMA114、及びL.rhamnosus DPPMAAZ1を含む選択された混合スターターを用いて醗酵させた。すべての基質を乳酸化のプロセスに付した(図2A)。96時間の醗酵後、ΔpH値は、Provasoy 68288及び低脂肪大豆粉から得られた豆乳タイプについてそれぞれ、0.59±0.06から1.19±0.09に変化した。ΔpH平均値は0.03であり、25°と75°データパーセンタイル値に対応する範囲は0.79と1.01であった。醗酵の後、すべての豆乳タイプについてのpH値は5.1〜5.3の範囲であった。
乳酸菌はすべての豆乳タイプの醗酵の間増殖した(図2B)。Δlog cfu/ml値は高脂肪から低脂肪大豆粉までの豆乳タイプについてそれぞれ、0.99±0.29から1.61±0.30まで変化した。細胞密度増大の平均値は1.31Δlog cfu/mlで、log8.31cfu/mlの細胞密度絶対値に対応していた。25°と75°パーセンタイルデータ値に対応する範囲は1.21と1.43であった。乳酸菌の増殖は24〜36時間のインキュベーションにより終了した。RAPD−PCRタイピングにより、混合スターターに用いた乳酸菌のすべての4種類のバイオタイプは同様の細胞密度にまで、様々な豆乳タイプ上で増殖した。
様々な豆乳タイプでの共役イソフラボンの初期濃度は、ダイジン(daidzin)、ゲニスチン(genistin)、及びグリシチン(glycitin)についてそれぞれ、142.3±12.5から171.5±10.8mMまで、102.2±8.6から123.0±11.3mMまで、10.5±1.1から18.0±0.9mMまで変化した。これとは対照的に、低濃度(0から7.8±0.5μMまで)のアグリコンが様々な豆乳タイプで観察された(表2)。表2は、選択した混合スターターを用いて14種の様々な粉タイプから得られた豆乳の醗酵の間のイソフラボン−アグリコン(ダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシチン)とエクオールの濃度(μM)を示す。データは3つの三重の実験の平均値である。
表2 96時間の醗酵の間、様々な豆乳タイプについて合成したイソフラボン−アグリコン及びエクオールの濃度(μM)
高脂肪大豆粉から得られた豆乳は例外として、アグリコンの濃度はすべての豆乳タイプのインキュベーションの間増加した。96時間のインキュベーションの後、OFS豆乳(57.0±4,0μM、1.45mg/100mlに対応)において、次いでProlia68238(50.7±2.1μM)及びProlia68237(46.4±1.7μM)により最も高いダイゼインの濃度が観察された。また、ゲニステインの最終的な最高濃度は上記の3つの豆乳タイプ(OFS、Prolia68238及び68237についてそれぞれ、140.3±9.4 − 3.9mg/100ml、102.9±6.4、及び94.0±5.3μM)であった。他のアグリコンに比べて、グリシテイン濃度はすべての豆乳タイプにおいて低かった。Prolia68237及び68238、及びOFS豆乳タイプにおけるグリシテインの最高濃度はそれぞれ、23.9±2.4、22.5±1.3、及び20.4±1.0μM − 0.58mg/100mlであった。有機農業大豆粉(OFS)から製造された豆乳の場合は、共役イソフラボンの対応アグリコンへの変換率は、ダイジン(daidzin)からダイゼイン(daidzein)、ゲニスチン(genistin)からゲニステイン(genistein)、及びグリシチン(glycitin)からグリシテイン(glycitein)までについて、0.72、0.85、及び0.98であった。アグリコンの濃度はインキュベーションの間増大したが、24時間後、すべての3つの共役イソフラボンの加水分解速度は1.0〜0.95の範囲であった。
インキュベーションの前、エクオールの存在は豆乳のどのタイプにも検出されなかった(表2)。様々な豆乳タイプが醗酵過程の間エクオールを合成することができなかった。インキュベーションの96時間後、エクオールの最も高い濃度はProlia 68238及び68237の豆乳タイプで(それぞれ20.0 ± 1.1及び18.5 ± 0.9 μM)、とりわけOFS豆乳で決定された(37.3 ± 1.5 μM、0.9 mg/100 mlに対応)。ダイゼインの同時合成により、そのエクオールに対する変換速度を決定することはできなかった。イソフラボン−アグリコンで豆乳を富化するために、ヒト糞便材料から単離された、プロバイオティックの可能性のあるバクテリアの使用を様々な研究が考察してきた(Chun et al.,2007.乳酸菌での醗酵による豆乳中のイソフラボングルコシドのアグリコンへの変換(Conversion of isoflavone glucoside to aglycones in soymilk by fermentation with lactic acid bacteria.)J.Food Sci.72:39−44;Donkor及びShah 2008.豆乳中のLactobacillus acidophilus、Bifidobacterium lactis及びLactobacillus caseiによるβ−グルコシダーゼの産生及びイソフラボンフィトエストロゲンの加水分解(Production of β−glucosidase and hydrolysis of isoflavone phytoestrogens by Lactobacillus acidophilus,Bifidobacterium lactis and Lactobacillus casei in soymilk.)J.Food Sci.73:15−20;Pham及びShah 2007.脱脂粉乳で補充された豆乳におけるBifidobacterium animalis によるイソフラボングルコシドの生物変換(Biotransformation of isoflavone glycosides by Bifidobacterium animalis in soymilk supplemented with skim milk powder.)J.Food Sci.72:316−324;Tsangalis et al.,2002;Tsangalis et al.,2004;Wei et al.,2007.醗酵豆乳におけるイソフラボンアグリコンを製造するためのラクトバチルス及びビフィドバクテリウムの使用(Using Lactobacillus and Bifidobacterium to product the isoflavone algycones in fermented soymilk.)Int.J.Food Microbiol.117:120−124)。
使用した微生物はもっぱらビフィドバクテリア又は様々な種に属する様々な乳酸菌であった。本発明は、L.plantarum DPPMA24W及びDPPMASL33、L.fermentum DPPMA114、及びL.rhamnosus DPPMAAZ1に対応する4種の新しいバイオタイプを選択するもので、これらは従来イソフラボン−アグリコン及びエクオールの合成には使用されたことがない。豆乳の醗酵の間におけるエクオールの合成を考察した研究も非常に数が限られている。エクオールはビフィドバクテリアで醗酵された豆乳で合成された(Tsangalis et al.,2002.β−グルコシダーゼ産生ビフィドバクテリアによる豆乳中でのイソフラボンフィトエストロゲンの酵素的変換(Enzymatic transformation of isoflavone phytoestrogens in soymilk by β−glucosidase producing bifidobacteria.)Food Res.Int.Sci.67:3104−3113)。醗酵の24時間後、Bifidobacterium pseudolongum及びBifidobacterium longumバイオタイプを用いて得られた0.338及び0.433 mg/100 mlの産生と比較して、エクオールの最も高い濃度(0.521 mg/100 ml)はBifidobacterium animalisにより合成された。この研究に従い選択された混合スターターで醗酵したOFS豆乳はより高い濃度のエクオール、即ち0.9 mg/100 mlに対応する37.3μMを含んでいた。
以前報告された結果に基づけば、有機農業大豆粉(OFS)から生産された豆乳はイソフラボン−アグリコン及びエクオールの合成のための最良の基質と考えられた。我々の知る限りでは、今までにイソフラボン−アグリコン及びエクオールの合成のために有機農業大豆粉から得られた豆乳の使用を考察した研究はなかった。
それ故、HPLC法を用いてルナシンの濃度を定量した(Wang et al.2008.大豆タンパク質由来のペプチドの分析、及び栽培品種、環境条件、及び大豆及び大豆生産物におけるルナシン濃度のプロセッシングの効果(Analysis of soybean protein derived peptides and the effect of cultivar,environmental conditions,and processing of lunasin concentration in soybean and soy products.)J.AOAC Intern.91:936−944)。インキュベーション前、ルナシン濃度は約3.2 mg/100 mlであった(図3)。醗酵の間、選択された混合スターターはルナシンの定常的な増加に有利に働き、インキュベーションの96時間の終わりには約8.4 mg/100 mlであった。我々の知る限り、乳酸菌で醗酵された豆乳からなる同じ調製物でイソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシンの同時合成を考察した研究は今まではなかった。この生物活性ペプチド(ルナシン)の生理学的効果は広く文献に記録されている(Jeong et al.,2003.大豆から単離されたルナシンのキャラクタリゼーション(Characterization of lunasin isolated from soybean.)J Agric Food Chem.51:7901−7906;Jeong et al.2007.小麦由来の癌予防ペプチドルナシンはコアヒストンアセチル化を阻害する。(The cancer preventive peptide lunasin from wheat inhibits core histone acetylation.)Cancer Lett.255:42−48)。これまでの結果に基づいて、醗酵OFS豆乳を皮膚保護のアッセイ及びヒト腸細胞に用いた。
(3)再構成上皮での試験とTEER測定(経上皮電気抵抗)
有機農業大豆粉から得られ選択した混合スターターで醗酵したOFS豆乳をヒト再構成上皮をSkinEthic(登録商標)モデルに従い処理するためにエクオールの最終濃度10μMで使用した。このモデルは科学コミュニティで広く実験され受け入れられている(Di Cagno et al.,2009.Lactobacillus plantarum DSMZ19463によるγ−アミノ酪酸(GABA)の合成:機能的グレープは飲料及び皮膚科学的適用(Synthesis of γ−amino butyric acid (GABA)by Lactobacillus plantarum DSMZ19463):functional grape must beverage and dermatological application.Appl Biotechnol Microbiol DOI:10.1007/s00253−009−23704)。24時間の処理のあと、TEER測定を行った。このタイプの分析は国際的な科学コミュニティで広く受け入れられており、角質層の完全性やバリア機能を参照して組織の腐食能力を評価する。特にこの検出により、角質層レベルでのコンパクトなラメラ状構造の存在、完全緊密接合(integral tight junctions)及び上皮厚さについての情報を得ることができる。これらの要素が全体として効率的なバリア機能を定義する。図4は醗酵OFS豆乳の存在下でTEER値の顕著な増加(P<0.05)を示しており、これは皮膚レベルでの分子の保護作用を実証している。同様の結果が化学的に合成されたエクオールとルナシンの混合物で得られた。
現時点での知識によれば、これはイソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシンを含む豆乳に基づく調製物が皮膚バリア機能の刺激を示す最初の応用例である。
(4)Caco−2/TC7細胞での試験
有機農業大豆粉(OFS)から製造された豆乳に含まれるイソフラボン−アグリコンの免疫調整特性を試験する目的で、ニュートラルレッド(NR)取り込みアッセイを用いた、5〜100μMの濃度での標準化合物(エクオール、ダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテイン)によるCaco−2/TC7細胞に対する細胞毒性をまず評価した。ゲニステイン、グリシテイン、及びエクオールはメタノールとDMSO(陰性対照)に類似した振る舞いを示したが、細胞増殖には有意には影響しなかった。72時間の処理の後、ダイゼインは100μMより高い濃度で細胞増殖を顕著に阻害した(p<0.03)。
予備的に、Caco−2/TC7細胞を24時間、OFS醗酵豆乳で10μMの濃度で処理し、10μMのエクオール最終濃度に希釈し、又は醗酵させていない豆乳で処理した。これらの化合物又は調製物はNO放出の誘発を示さなかったが、これは陰性対照、即ちメタノールとDMSOに類似した振る舞いを示した(図5)。引き続いて、Caco−2/TC7細胞を24時間当たりINF−γ(1000U/ml)及びLPS(100ng/ml)で刺激した。この処理はNO放出を有意に増加させ(P<0.05)、従って陰性対照、ダイゼインで又は醗酵させていないOFS豆乳で予防的に処理したCaco−2/TC7細胞の炎症状態を刺激した。これとは対照的に、エクオール又は醗酵OFS豆乳での処理はNO放出を顕著に阻害した(それぞれP<0.002及びP<0.007)。NO放出のかなりの阻害がゲニステインとグリシテインでの処理でも観察された(P<0.05)。予備的に、試験で用いたイソフラボン−アグリコンの濃度(10μM)が毒性ではないことが示されているので、Caco−2/TC7細胞の死はNO放出と干渉したのではないことは確かである。
この研究の培養条件下では、Caco−2/TC7細胞は緊密な細胞間接合を含む腸細胞の形態学的及び機能的特徴を展開し、その完全性はTEER定量により測定される。予備的に、TEERは標準化合物(10−100μM)、醗酵され、10μMのエクオール濃度に希釈されたOFS豆乳の存在下で定量され、又は醗酵していないOFS豆乳の存在下で定量された。100μM(1000U/ml)の濃度でのエクオール化合物を例外として、72hのインキュベーションの間のTEERへの効果は観察されなかった。Caco−2/TC7細胞のIFN−γ(1000U/ml)での処理はTEER値の顕著な減少(P<0.003)に有利に働いた(図6)。IFN−γで刺激されたCaco−2/TC7細胞が醗酵OFS豆乳でも処理されていると、INF−γの負の効果が顕著に低減した(P<0.007)。醗酵させていない豆乳の存在下では無視できる程度の効果しか観察されなかった。ゲニステイン、グリシテイン、及びとりわけエクオールは醗酵OFS豆乳に類似した傾向を示した。ダイゼインはIFN−γにより引き起こされた負の効果と干渉しなかった。
インターロイキン−8(IL−8)はC−X−Cケモカインファミリーのメンバーであり、好中球細胞の活性化に基本的な役割を果たしており、これにより炎症反応を開始する。Caco−2/TC7細胞をインターロイキン−1β(2ng/ml)での処理にも付すと、IL−8合成の意味の或る増加(P<0.001)が観察された(図7)。インターロイキン−1βで刺激したCaco−2/TC7細胞をエクオールとダイゼインでの処理に付すと、IL−8合成の意味のある増加(P<0.005)が観察された。IL−8合成の最も高い阻害(P<0.001)は醗酵OFS豆乳での処理により観察された。対照的に、ゲニステイン、グリシテイン、又は醗酵OFS豆乳での処理ではIL−8合成の減少は見られなかった(P<0.10)。
報告された結果は、醗酵OFS豆乳によるヒト腸細胞のバリア機能への抗炎症性及び刺激効果が主としてエクオールといくつかのイソフラボン−アグリコンの存在の結果であるということを明確に示している。ルナシンによる追加効果も可能である。
(5)ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、エクオール、及びルナシンの合成のためのバイオテクノロジー的プロトコルの開発と皮膚科学分野でのその使用
本文の他の箇所で先に概略を述べたように、イソフラボン−アグリコン(ダイゼイン、ゲニステイン、及びグリシテイン)、エクオール、及びルナシンの合成のためのバイオテクノロジー的プロトコル、並びに皮膚科学分野でのその使用を開発した。当該方法は以下を含む:
a)MRS培地上での純粋培養におけるL.plantarum DPPMA24W及びDPPMASL33,L.fermentum DPPMA114及びL.rhamnosus DPPMAAZ1の培養;
b)様々な豆乳タイプ、好ましくは農業生物学的方法に従い栽培され、実験室で皮をむいた大豆粉から調製された滅菌豆乳での細胞懸濁液の収集、洗浄及び接種;
c)選択された混合スターターによる48〜96時間、好ましくは96時間、30〜37℃、好ましくは30℃での豆乳の醗酵;
d)遠心分離による細胞の分離。方法変更に従って、その調製物は乳酸菌細胞を含んでいてもよい;
e)乾燥又は凍結乾燥プロセスによる調製物の脱水;
f)場合に応じて経口又は局所投与による使用にふさわしい形態を得るために適切な賦形剤の添加による組成物の調製。
実施例6:ルナシンを含むバイオマスとルナシンを含まないバイオマスの毛髪成長の刺激に対するインビトロ評価
毛髪成長のプロモータとしてルナシンを含むバイオマス(BL)をルナシンを含まないバイオマス(B)と比べたインビトロ研究
材料と方法
皮膚乳頭細胞(DPC)を2mMのL−グルタミン、1xの抗真菌性かつ抗生剤的溶液(1000u g/ml 硫酸ストレプトマイシン、1000 単位/ml ペニシリンG、及び2.5 μg/ml アンフォテリシンB)及び10%ウシ胎仔血清を含む培地(Dulbeccoの変性Eagle培地、DMEM)で培養した。合流して細胞を24時間血清なしでDMEM中で培養し、次いで様々な濃度のルナシンを含むか若しくは含まないバイオマスで処理した。
細胞増殖はMTT法で定量した(Mosmann,1983)。DPCを96穴プレート(10細胞/穴)に蒔種し、アッセイすべき物質を添加しながら24時間インキュベートした。吸光度をELISAリーダーで570nmで測定した。
さらにウェスタンブロットをBc12について実行した。Tris−HCl 50mM、pH 7.4、EDTA 2 mM、リュプチン(leuptin)100μg/ml、及び100 NaCl mMを含む緩衝液を用いてタンパク質を抽出した。
50μgのタンパク質を載せてSDS−PAGEにより分離した。Bcl−2、Bax及びアクチンに対するモノクローナル抗体を1:500に希釈し、抗原−抗体複合体をECLシステムを用いて検出し、結果を画像濃度測定(Bio−Rad GS−700)を用いて分析した。
結果と議論
試験した濃度(0.01〜0.5μM)の範囲内で、ルナシンを含むバイオマスはインビトロでのDPC増殖の増大を用量依存的に誘発する(p<0.05)(図1)。
ルナシンを含むバイオマスの効果は、ルナシンを含まないバイオマスとは異なり、Bcl−2タンパク質発現の増加を誘発し、Baxタンパク質発現の減少を誘発する(図2)。
これらの結果は、ルナシンを含むバイオマスがDPC上でのその増殖及び抗細胞死効果による毛髪成長を刺激することを示唆し、それ故、毛髪の成長期を拡大することができる。

Claims (21)

  1. 以下の4種の乳酸菌:ラクトバチルス プランタルム(Lactobacillus plantarum)DSM 23755、ラクトバチルス プランタルム(Lactobacillus plantarum)DSM 23756、ラクトバチルス ファーメンツム(Lactobacillus fermentum)DSM 23757、及びラクトバチルス ラムノスス(Lactobacillus rhamnosus)DSM 23758の混合物を用いた大豆醗酵によるイソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシンを含む醗酵大豆ベース混合物の調製方法。
  2. 以下の工程:
    a)該4種のラクトバチルス プランタルム(Lactobacillus plantarum)DSM 23755、ラクトバチルス プランタルム(Lactobacillus plantarum)DSM 23756、ラクトバチルス ファーメンツム(Lactobacillus fermentum)DSM 23757、及びラクトバチルス ラムノスス(Lactobacillus rhamnosus)DSM 23758乳酸菌を培養増殖させること、
    b)該乳酸菌の水性懸濁液で大豆ベース基質をインキュベートすること、
    c)30〜37℃、48〜96時間インキュベートすること
    を含む又はからなる、請求項1に記載の方法。
  3. 前記工程c)を30℃で96時間行う、請求項2に記載の方法。
  4. 基質が全基質体積の1〜4%の量の乳酸菌の水性懸濁液で接種され、該水性懸濁液がどの株についても約log 9.0 cfu/mlの細胞密度を有するものである、請求項2又は3に記載の方法。
  5. 大豆ベース基質が、大豆粉、豆乳からなる群から選ばれる、請求項2又は3に記載の方法。
  6. 前記大豆粉が有機農業大豆粉である、請求項5に記載の方法。
  7. 乳酸菌細胞を除去するためにブロス培養の遠心分離の工程d)をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  8. ブロス培養の遠心分離が10,000xgで15分間4℃で行われる、請求項5又は6に記載の方法。
  9. 工程(d)で得られた上清、又は工程(c)で得られた培養物の乾燥又は凍結乾燥による脱水の工程(e)をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
  10. ソフラボン−アグリコン、エクオール、及びルナシン、並びに以下の4種の乳酸菌:ラクトバチルス プランタルム(Lactobacillus plantarum)DSM 23755、ラクトバチルス プランタルム(Lactobacillus plantarum)DSM 23756、ラクトバチルス ファーメンツム(Lactobacillus fermentum)DSM 23757、及びラクトバチルス ラムノスス(Lactobacillus rhamnosus)DSM 23758の混合物を含む、醗酵豆乳ベース混合物。
  11. 請求項10に定義された醗酵豆乳ベース混合物を、一つ以上の薬学的に若しくは化粧品的に許容可能な賦形剤及び/又はアジュバントとともに含む又はからなる医薬又は化粧品組成物。
  12. そのままで、又は一つ以上の賦形剤及び/又はアジュバントと組み合わせて、食物インテグレーターとして使用するための、請求項10に記載の醗酵豆乳ベース混合物。
  13. 皮膚又は腸壁の障害又は疾患の治療に使用するための請求項10に記載の醗酵豆乳ベース混合物又は請求項11に記載の組成物。
  14. 化粧品使用のための請求項10に記載の醗酵豆乳ベース混合物又は請求項11に記載の組成物。
  15. 脱毛の治療のための請求項14に記載の使用のための醗酵豆乳ベース混合物又は組成物
  16. 脱毛症又は休止期脱毛の治療に使用するための請求項10に記載の醗酵豆乳ベース混合物又は請求項11に記載の組成物。
  17. 以下の4種の乳酸菌ラクトバチルス プランタルム(Lactobacillus plantarum)DSM 23755、ラクトバチルス プランタルム(Lactobacillus plantarum)DSM 23756、ラクトバチルス ファーメンツム(Lactobacillus fermentum)DSM 23757、及びラクトバチルス ラムノスス(Lactobacillus rhamnosus)DSM 23758の混合物。
  18. ラクトバチルス プランタルム(Lactobacillus plantarum)DSM 23755乳酸菌。
  19. ラクトバチルス プランタルム(Lactobacillus plantarum)DSM 23756乳酸菌。
  20. ラクトバチルス ファーメンツム(Lactobacillus fermentum)DSM 23757乳酸菌。
  21. ラクトバチルス ラムノスス(Lactobacillus rhamnosus)DSM 23758乳酸菌。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101840376B1 (ko) * 2017-10-20 2018-03-20 (주)코엔바이오 탈모 예방, 발모 촉진 또는 성기능 개선능이 있는 락토바실러스 퍼멘텀 균주 및 이를 포함하는 조성물

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014091988A1 (ja) * 2012-12-11 2014-06-19 キッコーマン株式会社 豆乳発酵エキスおよび胚軸発酵エキス
EP2931270B1 (en) * 2012-12-12 2020-07-22 Herrens Mark ApS Fermented red clover extract and method for producing the same
CN103933548A (zh) * 2014-04-17 2014-07-23 中国药科大学 露那辛多肽在防治白内障药物中的应用
MX2018002278A (es) 2015-08-31 2018-03-23 Chr Hansen As Bacteria de lactobacillus fermentum con actividad antifungica.
KR102394638B1 (ko) * 2015-09-30 2022-05-09 (주)아모레퍼시픽 유산균 유래의 세포외 소낭을 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물
KR102132827B1 (ko) * 2015-10-21 2020-07-22 주식회사 단정바이오 락토바실러스 람노서스 비타피원 균주, 이를 이용한 칡 또는 대두 배아 발효물의 제조방법 및 이를 이용한 칡 또는 대두 배아 발효물
CN105596275B (zh) * 2016-01-06 2018-07-27 名臣健康用品股份有限公司 一种含有双菌发酵豆奶提取物的化妆品基质及应用
JP6956957B2 (ja) * 2016-09-23 2021-11-02 学校法人立命館 脱毛防止剤
JP6626869B2 (ja) * 2016-10-03 2019-12-25 株式会社バイオジェノミクス 善玉菌生産物質の製造方法及び食品
CN106520625B (zh) * 2016-12-05 2019-09-10 厦门和美科盛生物技术有限公司 一种共生乳酸菌发酵液、制备方法及其用途
CN106399208B (zh) * 2016-12-05 2019-09-10 厦门和美科盛生物技术有限公司 一种适合食品加工应用的乳酸菌发酵液、制备方法及用途
CN108338946A (zh) * 2018-03-12 2018-07-31 黑龙江军门现代农业发展有限公司 一种含有丝肽的美容面膜及其制备方法
JP2018186823A (ja) * 2018-07-13 2018-11-29 株式会社ダイセル イソフラバノン類の製造方法
CN109223603B (zh) * 2018-09-21 2021-01-29 黑龙江省中医药科学院 治疗脱发组合物的制备方法
CN109402000A (zh) * 2018-10-31 2019-03-01 南京师范大学 一株产β-葡萄糖苷酶乳酸菌及其筛选方法和富含活性黄酮苷元酸奶的制备方法
KR20240023456A (ko) * 2022-08-11 2024-02-22 코스맥스 주식회사 천연 비타민을 포함하는 복합발효물의 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물
FR3145671A1 (fr) * 2023-02-14 2024-08-16 Roquette Freres Isolat de proteine vegetale ameliore via traitement par biomasse de cellule entiere

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5026553A (en) * 1989-08-07 1991-06-25 Dale E. Swinney Swinney's hair growth formula
KR100454760B1 (ko) * 1997-01-22 2005-01-13 후지 세이유 가부시키가이샤 발효두유(豆乳)제조방법
WO1998042200A1 (fr) * 1997-03-20 1998-10-01 Jean James Garreau Produits alimentaires a base de lait de soja et leur procede de fabrication
CA2294165C (en) * 1997-07-05 2007-11-27 Societe Des Produits Nestle S.A. Frozen dessert
AUPP112497A0 (en) * 1997-12-24 1998-01-22 Novogen Research Pty Ltd Compositions and method for protecting skin from UV induced immunosupression and skin damage
JP4163276B2 (ja) * 1998-02-05 2008-10-08 独立行政法人理化学研究所 機能性組成物
DE69932621D1 (de) * 1998-10-09 2006-09-14 Yakult Honsha Kk Hautpflegezubereitungen zur äusseren anwendung
AUPQ008299A0 (en) * 1999-04-30 1999-05-27 G.J. Consultants Pty Ltd Isoflavone metabolites
FR2831395B1 (fr) * 2001-10-25 2004-06-11 Triballat Laiteries Procede de fabrication de produits fermentes a base de soja, produits fermentes obtenus par ce procede et ferments correspondants
US20060251750A1 (en) * 2002-09-30 2006-11-09 Tabor Aaron T Soy formulations and their use in skin care
CA2553884C (en) * 2004-01-28 2013-06-25 Nestec S.A. Nutritional composition for improving skin condition and preventing skin diseases
ES2351150T3 (es) * 2005-03-01 2011-02-01 Campina Nederland Holding B.V. Bacterias que producen folato de manera natural.
CN1944634A (zh) * 2006-03-08 2007-04-11 沈阳农业大学 水解大豆异黄酮糖苷酶工程菌株、其构建方法及其用途
WO2008003782A1 (en) * 2006-07-07 2008-01-10 Alpro Nv Method for preparing a dairy analogue

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101840376B1 (ko) * 2017-10-20 2018-03-20 (주)코엔바이오 탈모 예방, 발모 촉진 또는 성기능 개선능이 있는 락토바실러스 퍼멘텀 균주 및 이를 포함하는 조성물

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