MX2010011738A - Tratamiento de celulas pluripotentes. - Google Patents

Tratamiento de celulas pluripotentes.

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Abstract

La presente invención está dirigida a métodos para tratar células pluripotenciales por medio de los cuales las células pluripotenciales se pueden expandir eficazmente en cultivo y se pueden diferenciar mediante su tratamiento con un inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B.

Description

TRATAMIENTO DE CÉLULAS PLURIPOTENTES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a métodos para tratar células pluripotenciales por medio de los cuales las células pluripotenciales se pueden expandir eficazmente en cultivo y se pueden diferenciar mediante su tratamiento con un inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los avances en la terapia de reemplazo de células para diabetes mellitus tipo I y la disminución de islotes de Langerhans transplantables han centrado el interés en desarrollar fuentes de células productoras de insulina, o células ß, adecuados para injertos. Un enfoque es la generación de células ß funcionales a partir de células pluripotentes, tales como, por ejemplo, células madre embrionarias.
En el desarrollo embrional de los vertebrados, una célula pluripotente da origen a un grupo de células que comprenden tres capas de gérmenes (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un proceso conocido como gastrulación. Los tejidos tales como, por ejemplo, tiroides, timo, páncreas, intestino e hígado, se desarrollarán a partir del endodermo, a través de una etapa intermedia. La etapa intermedia en este proceso es la formación de endodermo definitivo. Las células del endodermo definitivo expresan un número de marcadores, tales como, HNF-3 beta, GATA-4, Mixl1 , CXCR4 y SOX-17.
La formación del páncreas se origina a partir de la diferenciación de endodermo definitivo en endodermo pancreático. Las células del endodermo pancreático expresan el gen homeobox pancreático-duodenal, PDX-1. En ausencia de PDX-1 , el páncreas falla en desarrollar la formación futura de las yemas ventral y dorsal. Así, la expresión de PDX-1 marca una etapa crítica en la organogénesis pancreática. El páncreas maduro contiene, entre otros tipos de células, tejido exocrino y tejido endocrino. Los tejidos endocrino y exocrino se originan a partir de la diferenciación de endodermo pancreático.
La generación de una cantidad suficiente de material celular para el transplante necesita una fuente de material celular que pueda expandirse eficientemente en el cultivo, y diferenciarse eficientemente en el tejido de interés, por ejemplo, células ß funcionales.
Los métodos actuales para cultivar células madre embrionarias humanas son complejos; éstos requieren el uso de factores exógenos, o medios definidos químicamente para que las células proliferen sin perder su pluripotencia. Además, la diferenciación de las células madre embrionarias a menudo resulta en un decrecimiento en la células que se expanden en el cultivo.
En un ejemplo, Cheon y otros (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, 19 de octubre de 2005) describe un sistema de cultivo libre de células alimentadoras y libre de suero, en el cual las células madre embrionarias se mantienen en un medio no condicionado de reemplazo de suero (RS) suplementado con diferentes factores de crecimiento capaces de activar la autorrenovación de las células madre embrionarias.
En otro ejemplo, el documento de los Estados Unidos 20050233446 describe un medio definido útil para cultivar células madre, incluso células madre primordiales de primate indiferenciadas. En solución, el medio es sustancialmente ¡sotónico en comparación con las células madre que se cultivan. En un cultivo dado, el medio particular comprende un medio base y una cantidad de cada uno de bFGF, insulina y ácido ascórbico necesario para soportar el crecimiento indiferenciado de células madre primordiales.
En otro ejemplo, la patente WO2005086845 describe un método para el mantenimiento de una célula madre indiferenciada, tal método comprende exponer una célula madre a un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento transformador beta (TGFb), un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento del fibroblasto (FGF), o nicotinamida (NIC) en una cantidad suficiente para mantener la célula en estado indiferenciado por una cantidad de tiempo suficiente para lograr el resultado deseado.
Los inhibidores del glucógeno de la sintasa quinasa-3 (GSK-3) se conocen que estimulan la proliferación y expansión de células madre adultas. En un ejemplo, Tateishi y otros. (Biochemical and Biophysical Research Communications (2007) 352: 635) muestran que la inhibición del GSK-3 mejora el crecimiento y supervivencia de las células madre cardíacas humanas (hCSCs) recuperadas del corazón humano adulto o neonatal y que tiene características mesenquimales.
Por ejemplo, Rulifson y otros (PNAS 144, 6247-6252, (2007)) declaran "La señalización de Wnt estimula la proliferación de células ß del islote".
En otro ejemplo, WO2007016485 reporta que la adición de inhibidores GSK-3 al cultivo de células madre no embrionarias, que incluyen células progenitoras adultas multipotentes, conduce al mantenimiento de un fenotipo pluripotente durante la expansión y resulta en una respuesta a la diferenciación más robusta.
En otro ejemplo, US2006030042 usa un método de inhibir GSK-3, ya sea por adición de Wnt o un inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3 de molécula pequeña, para mantener las células madre embrionarias sin el uso de una capa celular alimentadora.
En otro ejemplo, WO2006026473 reporta la adición de un inhibidor GSK-3B, para estabilizar las células pluripotentes a través de la activación transcriptional de c-myc y la estabilización de la protelna c-myc.
En otro ejemplo, WO2006100490 reporta el uso de un medio de cultivo de células madres que contiene un inhibidor de GSK-3 y un agonista gp130 para mantener una población autorrenovable de células madre pluripotentes, que incluyen células madre embrionarias de ratón o humanas.
En otro ejemplo, Sato y otros. (Nature Medicine (2004) 10:55-63) muestran que la inhibición de GSK-3 con un compuesto farmacológicamente específico puede mantener el fenotipo indiferenciado de células madre embrionarias y mantienen la expresión de los factores de transcripción específicos del estado pluripotente tales como Oct-3/4, Rex- , y Nanog.
En otro ejemplo, Maurer y otros (Journal of Proteome Research (2007) 6:1198-1208) muestran que las células madre neuronales adultas tratadas con el inhibidor de GSK-3 muestran una diferenciación neuronal mejorada, específicamente al estimular la transcripción de genes objetivo ß-catenina y disminuir la apoptosis.
En otro ejemplo, Gregory y otros (Annals of the New York Academy of Sciences (2005) 1049:97-106) reportan que los inhibidores de GSK-3B mejoran la osteogénesis in vitro.
En otro ejemplo, Feng y otros (Biochemical and Biophysical Research Communcations (2004) 324: 1333-1339) muestran que diferenciación hematopoyética de las células madre embrionarias está asociada con la regulación descendente de la ruta de Wnt/ ß-catenina, donde Wnt es un inhibidor natural de GSK3.
Por consiguiente, aún persiste una importante necesidad de desarrollar métodos para tratar las células madre pluripotentes de manera que puedan expandirse para abordar las necesidades clínicas actuales y al mismo tiempo retengan el potencial para diferenciarse en células pancreáticas endocrinas, células que expresan las hormonas pancreáticas o células secretoras de las hormonas pancreáticas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para expandir y diferenciar células pluripotentes al tratar las células pluripotentes con un inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3B.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para expandir y diferenciar células pluripotenciales; el método comprende las siguientes etapas: a. cultivar células pluripotenciales, y b. tratar las células pluripotenciales con un inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B.
En una modalidad, las células pluripotenciales se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.
Las células pluripotentes pueden ser células madre embrionarias humanas, o pueden ser células que expresan marcadores de pluripotencia derivadas de células madre embrionarias humanas, de acuerdo con los métodos descritos en 60/913475.
En una modalidad, el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B es un compuesto de la Fórmula (I): Fórmula (I) En una modalidad, el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B es un compuesto de la Fórmula (II): Fórmula (II) En una modalidad, el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B es un compuesto de la Fórmula (III): BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A-1B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones del compuesto JNJ 17189731 en el número de células, determinado por el número de núcleos observados (figura 1A) y la expresión de Sox-17, determinada por la intensidad de la tinción por inmunofluoresencia (figura 1 B). Los resultados se obtuvieron de células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas (franjas blancas) o de células de la línea H9 de células madre embrionarias humanas (franjas negras) con el uso del IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
Las Figuras 2A-2B muestra el efecto de un intervalo de concentraciones del compuesto JNJ 17163796 en el número de células, determinado por el número de núcleos observados (figura 2A) y la expresión de Sox-17, determinada por la intensidad de la tinción por inmunofluoresencia (figura 2B). Los resultados se obtuvieron de células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas (franjas blancas) o de células de la línea H9 de células madre embrionarias humanas (franjas negras) con el uso del IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
Las Figuras 3A-3B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones del compuesto JNJ 17223375 en el número de células, determinado por el número de núcleos observados (figura 3A) y la expresión de Sox-17, determinada por la intensidad de la tinción por inmunofluoresencia (figura 3B). Los resultados se obtuvieron de células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas (franjas blancas) o de células de la línea H9 de células madre embrionarias humanas (franjas negras) con el uso del IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
Las Figuras 4A-4B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones del compuesto JNJ 18157698 en el número de células, determinado por el número de núcleos observados (figura 4A) y la expresión de Sox-17, determinada por la intensidad de la tinción por inmunofluoresencia (figura 4B). Los resultados se obtuvieron de células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas (franjas blancas) o de células de la línea H9 de células madre embrionarias humanas (franjas negras) con el uso del IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
Las Figuras 5A-5B muestra el efecto de un intervalo de concentraciones del compuesto JNJ 26158015 en el número de células, determinado por el número de núcleos observados (figura 5A) y la expresión de Sox-17, determinada por la intensidad de la tinción por inmunofluoresencia (figura 5B). Los resultados se obtuvieron de células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas (franjas blancas) o de células de la línea H9 de células madre embrionarias humanas (franjas negras) con el uso del IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
Las Figuras 6A-6B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones del compuesto JNJ 26483197 en el número de células, determinado por el número de núcleos observados (figura 6A) y la expresión de Sox-17, determinada por la intensidad de la tinción por inmunofluoresencia (figura 6B). Los resultados se obtuvieron de células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas (franjas blancas) o de células de la línea H9 de células madre embrionarias humanas (franjas negras) con el uso del IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
Las Figuras 7A-7B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones del compuesto JNJ 26483249 en el número de células, determinado por el número de núcleos observados (figura 7A) y la expresión de Sox-17, determinada por la intensidad de la tinción por inmunofluoresencia (figura 7B). Los resultados se obtuvieron de células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas (franjas blancas) o de células de la línea H9 de células madre embrionarias humanas (franjas negras) con el uso del IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
Las Figuras 8A-8B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones del compuesto JNJ 10220067 en el número de células, determinado por el número de núcleos observados (figura 8A) y la expresión de Sox-17, determinada por la intensidad de la tinción por inmunofluoresencia (figura 8B). Los resultados se obtuvieron de células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas (franjas blancas) o de células de la línea H9 de células madre embrionarias humanas (franjas negras) con el uso del IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
La Figura 9 muestra la expresión de CXCR4 en la superficie de las células, determinada por el teñido de inmunofluoresencia y análisis simétrico de flujo, en células tratadas con los compuestos mostrados, de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 8.
Las Figuras 10A-10C muestran la expresión de CXCR4 (figura 10A), HNF-3 beta (figura 10B), y Sox-17 (figura 10C), determinada por PCR en tiempo real, en células tratadas con los compuestos mostrados, de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 8.
Las Figuras 11A-11B muestra el efecto sobre el número de células que tiene un intervalo de concentraciones de los compuestos que se muestran, tal como lo determina la cantidad de núcleos observados (figura 11A) y la expresión de Pdx-1 , tal como lo determina la intensidad de la tinción inmunofluorescente (figura 11B), con el uso del IN Cell Analyzer 100O (GE Healthcare). Las células se trataron de conformidad con los métodos descritos en el Ejemplo 9.
La Figura 12 muestra el efecto de un intervalo de concentraciones de los compuestos mostrados en la expresión de Pdx-1 (barras blancas) y HNF-6 (barras negras), determinada por PCR en tiempo real. Las células se trataron de conformidad con los métodos descritos en el Ejemplo 9.
Las Figuras 13A-13B muestran el efecto sobre el número de células que tiene un intervalo de concentraciones de los compuestos que se muestran, tal como lo determina la cantidad de núcleos observados (figura 13A) y la expresión de insulina, tal como lo determina la intensidad de la tinción inmunofluorescente (figura 13B), con el uso del IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Las células se trataron de conformidad con los métodos descritos en el Ejemplo 10.
La Figura 14 muestra el efecto de un intervalo de concentraciones de los compuestos mostrados en la expresión de Pdx-1 (barras blancas) y la insulina (barras negras), determinada por PCR en tiempo real. Las células se trataron de conformidad con los métodos descritos en el Ejemplo 10.
Las Figuras 15A-15B muestran el efecto sobre el número de células que tiene un intervalo de concentraciones de los compuestos que se muestran, tal como lo determina la cantidad de núcleos observados (figura 15A) y la expresión de insulina, tal como lo determina la intensidad de la tinción inmunofluorescente (figura 15B), con el uso del IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Las células se trataron de conformidad con los métodos descritos en el Ejemplo 11.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para una mayor claridad de la descripción, y no a modo de limitación, la Descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran determinadas características, modalidades o aplicaciones de la presente invención.
Definiciones Las células madre son células indiferenciadas definidas por su capacidad a nivel de células únicas de a uto rre novarse y diferenciarse para producir células progenitoras, que incluyen progenitoras que se autorrenuevan, progenitoras que no se renuevan y células diferenciadas de forma terminal. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de varios linajes celulares a partir de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como para dar lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante y contribuir sustancialmente a la mayoría, si no a todos, los tejidos después de la inyección dentro de los blastocistos.
Las células madre se clasifican por su potencial de desarrollo como: (1) totipotentes, lo que significa que son capaces de dar lugar a todos los tipos de células embrionarias y extraembrionarias; (2) pluripotentes, lo que significa que son capaces de dar lugar a todos los tipos de células embrionarias; (3) multipotentes, lo que significa que son capaces de dar lugar a un subconjunto de linajes celulares, pero todo dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico particular (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC) pueden producir una progenie que incluyen HSC (autorenovables), progenitores oligopotentes restringidos a células de la sangre y todos los tipos de células y elementos (por ejemplo, plaquetas) que son 4 componentes normales de la sangre), (4) oligopotentes, lo que significa que son capaces de dar lugar a un subconjunto más restringido de los linajes celulares que las células madre multipotentes; y (5) unipotentes, lo que significa que son capaces de dar origen a un linaje de células individuales (por ejemplo, las células madre espermatogénicas).
Diferenciación es un proceso mediante el cual una célula no especializada ("no comprometida") o menos especializada, adquiere las características de una célula especializada, tal como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula inducida a la diferenciación o diferenciada es una que toma una posición más especializada ("comprometida") dentro del linaje de una célula. El término "comprometido", cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha seguido la vía de la diferenciación hasta un punto donde, bajo circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo de célula específico o subconjunto de tipos de células o revertir a un tipo de célula menos diferenciada. La desdiferenciación se refiere al proceso mediante el cual una célula revierte a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Como se utiliza en la presente, el linaje de una célula define la herencia de una célula, es decir, de qué células proviene y qué células puede originar. El linaje de una célula posiciona a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico para el linaje se refiere a una característica específicamente asociada con el fenotipo de las células de un linaje de interés y se puede usar para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida para linaje de interés.
"Linaje de células ß" se refiere a las células con expresión positiva de genes para el factor de transcripción PDX-1 y al menos uno de los siguientes factores de transcripción: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1 , NeuroD, Isl-1 , HNF-3 beta, MAFA, Pax4 y Pax6. Las células que expresan marcadores característicos del linaje de células ß incluyen las células ß.
"Células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo" como se usa en la presente, se refiere a las células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: SOX-17, GATA-4, HNF-3 beta, GSC, Cer1 , Nodal, FGF8, Brachyury, proteína homeobox tipo Mix, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99, o OTX2. Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo incluyen las células precursoras de la línea primitiva, las células de la línea primitiva, las células del mesendodermo y las células del endodermo definitivo.
"Células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático" como se usa en la presente, se refiere a las células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX-1 , HNF-1 beta, PTF-1 alfa, HNF-6, o HB9. Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático incluyen las células endodermo pancreático.
"Células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático" como se usa en la presente, se refiere a las células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: NGN-3, NeuroD, lslet- , PDX- , NKX6.1 , Pax-4, Ngn-3, o PTF-1 alfa. Las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático incluyen células endocrinas pancreáticas, células que expresan la hormona pancreática y células secretoras de hormona pancreática y células del linaje de células ß.
"Endodermo definitivo", como se utiliza en la presente, se refiere a células que tienen características de células que se originan del epiblasto durante la gastrulación y que forman el tracto gastrointestinal y sus derivados. Las células del endodermo definitivo expresan los siguientes marcadores: HNF-3 beta, GATA-4, SOX-17, Cerberus, OTX2, goosecoide, C-Kit, CD99, y Mixl .
"Endodermo extraembrionario" como se usa en la presente, se refiere a una población de células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: SOX-7, AFP, y SPARC.
"Marcadores" como se usa en la presente, son moléculas de ácidos nucleicos o polipéptidos que se expresan diferencialmente en una célula de interés.' En este contexto, expresión diferencial significa un nivel aumentado para un marcador positivo y un nivel disminuido para un marcador negativo. El nivel detectable del marcador de ácido nucleico o polipéptido es suficientemente más alto o más bajo en las células de interés en comparación con otras células, de modo que la célula de interés pueda identificarse y distinguirse de otras células por medio del uso de cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica.
"Célula mesendodérmica" como se usa en la presente, se refiere a una célula que expresa al menos uno de los siguientes marcadores: CD48, eomesodermina (EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 beta, GSC, FGF17, GATA-6.
"Célula endocrina pancreática" o "célula que expresa la hormona pancreática" como se usa en la presente, se refiere a una célula capaz de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático.
"Célula secretora de hormona pancreática" como se usa en la presente, se refiere a una célula capaz de secretar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático.
"Célula de la línea pre-primitiva" como se usa en la presente, se refiere a una célula que expresa al menos uno de los siguientes marcadores: Nodal, o FGF8.
"Célula de la línea primitiva" como se usa en la presente, se refiere a una célula que expresa al menos uno de los siguientes marcadores: Brachyury, proteína homeobox tipo Mix, o FGF4.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para la expansión y diferenciación de células pluripotentes que comprende tratar las células pluripotentes con un inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3B.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para expandir y diferenciar células pluripotenciales; el método comprende las siguientes etapas: c. cultivar células pluripotenciales, y d. tratar las células pluripotenciales con un inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B.
En una modalidad, las células pluripotenciales se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.
Los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se seleccionan del grupo que consiste de SOX17, GATA4, Hnf-3 beta, GSC, Cer1 , Nodal, FGF8, Brachyury, proteína homeobox tipo Mix, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, y OTX2. En la presente invención se contempla una célula, derivada de una célula pluripotente, que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula precursora de la línea primitiva. En un aspecto alternativo, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula mesendodérmica. En un aspecto alternativo, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula del endodermo definitivo.
Las células pluripotentes se pueden tratar con el inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3B por aproximadamente una hasta aproximadamente 72 horas. Alternativamente, las células pluripotentes se pueden tratar con el inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3B por aproximadamente 12 hasta aproximadamente 48 horas. Alternativamente, las células pluripotentes se pueden tratar con el inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3B por aproximadamente 48 horas.
En una modalidad, el inhibidor de la actividad enzimática de GSK- 3B se usa a una concentración de aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 100 µ?. Alternativamente, el inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3B se usa a una concentración de aproximadamente 1 µ? hasta aproximadamente 10 µ?. Alternativamente, el inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3B se usa a una concentración de aproximadamente 10 µ?. Compuestos adecuados para el uso en los métodos de la presente invención En una modalidad, el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B es un compuesto de la Fórmula (I): Fórmula (I) en donde: F es fenilo, fenilo sustituido en donde los sustituyentes de fenilo se seleccionan del grupo que consiste de alquilo de Ci-5) halógeno, nitro, trifluorometilo y nitrito, o pirimidinilo; R2 es fenilo, fenilo sustituido en donde los sustituyentes de fenilo se seleccionan del grupo que consiste de alquilo de C-i-5, halógeno, nitro, trifluorometilo y nitrilo, o pirimidinilo el cual es opcionalmente alquilo de C1-4 sustituido, y al menos uno de Ri y R2 es pirimidinilo; R3 es hidrógeno, 2-(trimetilsilil)etoximetilo, alcoxicarbonilo de Ci-5l ariloxicarbonilo, arilo de Ci-salquiloxicarbonilo, arilo de d-salquilo, arilo de Ci.salquilo sustituido en donde el único o más sustituyentes arilo se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo de C1-5, áícoxi de Ci-5> halógeno, amino, alquilamino de C1.5, y dialquilamino de Ci-5, ftalimido de Ci.5alqu¡lo, amino de d-5alquilo, diamino de Ci-5alquilo, succinimido de d-salquilo, alquilcarbonilo de Ci-s, arilcarbonilo, alquilcarbonilo de d-salquilo de Ci.s y ariloxicarbonilo de C1-5alquilo; R4 es -(A)-(CH2)q-X; A es vinileno, etinileno o Rs se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de Ci-5, fenilo y fenilo de C-i-5alquilo; q es 0-9; X se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, hidroxi, vinilo, vinilo sustituido en donde uno o más sustituyentes de vinilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de flúor, bromo, cloro y yodo, etinilo, etinilo sustituido en donde los sustituyentes de etinilo se seleccionan del grupo que consiste de flúor, bromo cloro y yodo, alquilo de Ci-5, alquilo de d-5 sustituido en donde el único o más sustituyentes de alquilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de alcoxi de C i-5, trihaloalquilo, ftalimido y amino, cicloalquilo de C3-7| alcoxi de C1-5, alcoxi de C-i-5 sustituido en donde los sustituyentes de alquilo se seleccionan del grupo que consiste de ftalimido y amino, ftalimidooxi, fenoxi, fenoxi sustituido en donde el único o más sustituyentes de fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de alquilo de Ci-5| halógeno y alcoxi de C-i-5, fenilo, fenilo sustituido en donde el único o más sustituyentes de se seleccionan cada uno del grupo que consiste de alquilo de C-i-5, halógeno y alcoxi de Ci-5, arilo de Ci-5 alquilo, arilo de Ci-salquilo sustituido en donde el único o más sustituyentes de arilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de alquilo de Ci-5, halógeno y alcoxi de C-i-5, ariloxi de C-i-5 alquilamino, alquilamino de Ci-5) dialquilamino de Ci-5, nitrilo, oxima, benxiloxiimino, alquiloxiimino de Ci-5, ftalimido, succinimido, alquilcarboniloxi de Ci-5, fenilcarboniloxi, fenilcarboniloxi sustituido en donde el único o más sustituyentes de fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de alquilo de Ci-5, halógeno y alcoxi de Ci.5) fenilo de 5alquilcarboniloxi en donde el único o más sustituyentes de fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de Ci-5alquilo, halógeno y alcoxi de Ci-5, aminocarboniloxi, alquilaminocarboniloxi de C-i-5) dialquilaminocarboniloxi de C1.5, alcoxicarboniloxi de C1.5, alcoxicarboniloxi de Ci-5 sustituido en donde el único o más sustituyentes de alquilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de metilo, etilo, isopropilo y hexilo, fenoxicarboniloxi, fenoxicarboniloxi sustituido en donde el único o más sustituyentes de fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de alquilo de Ci-5, alcoxi de C-i-5 y halógeno, alquiltio de Ci.5l alquiltio de Ci-5 sustituido en donde los sustituyentes de alquilo se seleccionan del grupo que consiste de hidroxi y ftalimido, alquilsulfonilo de C-i-5, fenilsulfonilo, fenilsulfonilo sustituido en donde el único o más sustituyentes de fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de bromo, flúor, cloruro, alcoxi de Ci-5 y trifluorometilo; siempre y cuando A sea q sea 0 y X sea H, entonces R3 no puede ser 2-(trimetilsilil)etoximetilo; y sales farmacéuticamente aceptables de éstos.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de la Fórmula (I) en donde Ri es fenilo sustituido y R2 es pirimidin-3-ilo.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de la Fórmula (I) en donde Ri es 4-fluorofenilo.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de la Fórmula (I) en donde R3 es hidrógeno, arilo de C1-5alquilo, o arilo de Ci-5alquilo.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de la Fórmula (I) en donde R3 es hidrógeno o fenilo de d-5alquilo.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de la Fórmula (I) en donde A es etinileno y q es 0-5.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de la Fórmula (I) en donde X es succinimido, hidroxi, metilo, fenilo, alquilsulfonilo de Ci-5, cicloalquilo de C3-6, alquilcarboniloxi de C1-5, alcoxi de Ci-5, fenilcarboniloxi, alquilamino de Ci-5, dialquilamino de C1.5 o nitrito.
Los compuestos de la Fórmula (I) se describen en la patente de los Estados Unidos número 6,214,830, nombrada comúnmente, cuya completa descripción se incorpora en la presente como referencia.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de la Fórmula (I) en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste de: Compuesto Nombre 1 5(4)-(4-fluorofenil)-4(5)-(4-p¡ridil)im¡dazol, 2 4-(4-fluorofenil)-1-(3-fenilprop¡l)-5-(4-p¡ridil)im¡dazol, 3 5-(4-fluorofen¡l)-4-(3-fenilprop¡l)-5-(4-p¡rid¡l)imidazol, 4 4-(4-fluorofen¡l)-2-yodo-1-(3-fen¡lprop¡l)-5-(4-pirid¡l)¡midazol, 5 4-(4-fluorofen¡l)-2-(4-h¡drox¡but¡n-1-¡l)-1-(3-fenilprop¡l)-5-(4-pir¡d¡lo)¡midazol, 6 4-(4-fluorofen¡l)-5-(4-p¡r¡dil)-1-[2-(trimetils¡l¡l)etox¡metil]-¡midazol, 7 5-(4-fiuorofenil)^-(4-pir¡d¡l)-1-[2-(lr¡metilsilil)etox¡metil]-¡midazol, 8 5-(4-fluorofenil)-2-yodo^-(4-p¡ridil)-1-[2-(trimetilsil¡l)etoximetil]-¡midazol, 9 5-(4-fluorofenilH-(4-p¡r¡dil)-2-(trimetilsilil)et¡n¡l-1-[2-(tr¡met¡lsilil)etoximet¡l]-¡m 10 2-(2-clorov¡n¡l)-5-(4-fluorofenil)-4-(4-p¡ridil)-im¡dazol, 11 5-(4-fluorofen¡IH-(4-pir¡dil)-1-[2-(tr¡met¡lsil¡l)etox¡met¡l]-imidazol-2-carboxaldehído, 12 2-[2,2-dibromoetileno-1-il]-5-(4-fluorofenil)-4-(4^iridil)-1^2-(trimetilsilil)etoximetil]- im¡dazol-2-carboxaldehído, 13 5(4)-(4-fluorofenil)-2-(3-hidrox¡-3-fen¡l-propin-1-il)-4(5)-(4-pir¡dil)im¡dazol, 14 5-(4-fluorofen¡IH-(4-p¡rid¡l)-1-[2-(trimet¡ls¡l¡l)etoximetil]-2-ox¡rriino¡m¡dazol, 15 5-(4-fluorofenil)-4-(4-pirid¡l)-2-im¡dazol oxima, 16 2-(5-cloropentin-1-il)-4-(4-fluorofenil)-1-(3-fen¡lpropil)-5-(4-p¡r¡d¡l)¡m¡dazol, 17 4-(4-fluorofenil)-2-(4-N-fenilcarbamoiloxibutin-1-¡l)1-(3-fen¡lprop¡l)-5-(4^¡r¡d¡l)imidazol, 17 2-(4-clorobutin-1-¡l)-4-(4-fluorofenil)-1-(3-fen¡lpropil)-5-(4-p¡rid¡l)¡midazol, y 18 2-(4-d¡met¡lam¡nobutin-1-¡l)-4-(4-fluorofenil)-1-(3-fenilpropil)-5-(4-p¡r¡dil)¡midazol.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de la Fórmula donde el compuesto es el Compuesto 5 de la fórmula: Compuesto 5.
En una modalidad, el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B es un compuesto de la Fórmula (II): en donde: R se selecciona del grupo que consiste de Ra, -Ci-8alquilo -Ra, -C2-8alquenilo-Ra, -C2-8alquinilo-Ra y ciano; Ra se selecciona del grupo que consiste de cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo; R1 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, -d-salquilo-R5, -C2. 8alquenilo-R5, -C2-ealquinilo-R5, -C(O)- (Ci-8)alquilo-R9, -C(0)-arilo-R8, -C(0)-0-(C1-8)alquilo-R9, -C(0)-0-arilo-R8, -C(0)-NH(C1-8alquilo-R9), -C(0)-NH(arilo-R8), -C(0)-N(C1-8alquilo-R9)2, -S02-(C -8)alquilo-R9, -S02-arilo-R8, -cicloalquilo-R6, -heterociclilo-R6, -arilo-R6 y -heteroarilo-R6; en donde el heterociclilo y heteroarilo se unen al átomo de nitrógeno del azaindol en una posición a través de un átomo de carbono del anillo de heterociclilo o heteroarilo; R5 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -0-(C-i-8)alquilo, -0-(C1-8)alquilo-OH, -0-(C-i-8)alquilo-O-(C1-8)alquilo, -0-(C1-8)alquilo-NH2, -0-(Ci-8)alquilo-NH(C1-8alqu¡lo), -0-(d. 8)alquilo-N(Ci-8alquilo)2, -0-(C1-8)alquilo-S-(Ci-8)alquilo, -0-(d-e)alqu¡lo-S02-(d-8)alquilo, -0-(C1-8)alquilo-S02-NH2, -0-(C1-8)alquilo-S02-NH(d-8alquilo), -0-(Ci. 8)alquilo-S02-N(C^alquilo)2, -0-C(0)H, -0-C(0)-(d_8)alqu¡lo, -0-C(0)-NH2, -O-C(0)-NH(C1-8alquilo), -0-C(0)-N(C1-8alquilo)2, -0-(Ci-8)alquilo-C(0)H, -0-(d-8)alquilo-C(0)-(C1-8)alquilo, -O-(C1-8)alquilo-C02H, -O-íd^alquilo-C^-O-íCL 8)alquilo, -0-(Ci-8)alquilo-C(0)-NH2, -0-(C1-8)alquilo-C(0)-NH(C1-8alquilo), -O-(C1-8)alquilo-C(0)-N(C1-8alquilo)2, -C(0)H, -C(0)-(d.8)alquilo, -C02H, -C(0)-0-(C1-8)alquilo, -C(0)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(0)-NH(C1-8alquilo), -C(0)-N(d. 8alquilo)2, -SH, -S-(Ci-8)alquilo, -S-(C1-8)alquilo-S-(Ci-8)alqu¡lo, -S-(Ci-8)alquilo-0- (Ci-8)alquilo, -S-ÍCi-eJalquilo-O-ÍCi-^alquNo-OH, -S-(Ci-8)alquilo-0-(C1-8)alquilo-NH2, -S-íd^alquilo-O-íCi-sJalquilo-NHÍd-aalquilo), -S-(C1-8)alquilo-0-(Ci. 8)alquilo-N(Ci.8alquilo)2l -S-(Ci-8)alquilo-NH(Ci-8alquilo), -S02-(Ci-8)alquilo, -S02-NH2, -S02-NH(C -8alquilo), -S02-N(C1-8alquilo)2, -N-R7, ciano, (halo)1-3, hidroxi, nitro, oxo, -cicloalquilo-R6, -heterociclilo-R6, -arilo-R6 y -heteroarilo-R6; R6 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono o nitrógeno independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de -C-i-8, alquenilo de -C2-8, alquinilo de -C2-8, -C(0)H, -C(0)-(Ci. 8)alquilo, -C02H, -C(0)-0-(C1-8)alquilo, -C(0)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(0)-NH(Ci. salquilo), -CíOJ-Níd-sJalqui^, -S02-(C1-8)alquilo, -S02-NH2, -S02-NH(Ci-salquilo), -S02-N(C1-8alquilo)2, -(Ci-8)alquilo-N-R7, -(C1-8)alquilo-(halo)i-3, -(Ci. 8)alquilo-OH, -arilo-R8, -(Ci-8)alquilo-arilo-R8 y -(C1-8)alquilb-heteroarilo-R8; siempre que, cuando R6 está unido a un átomo de carbono, R6 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste de alcoxi de -Ci-8, -(d-sjalcoxi-íhalo)^, -SH, -S-(Ci-8)alquilo, -N-R7, ciano, halo, hidroxi, nitro, oxo y -heteroarilo-R8; R7 es 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de -C1-8l alquenilo de -C2-8, alquinilo de -C2-8, -(C1-8)alquilo-OH, -(Ci-8)alquilo-NH2, -(Ci.8)alquilo-NH(Ci-8alquilo), -(Ci-8)alquilo-N(Ci-8alquilo)2, -(Ci-8)alquilo-S-(C1-8)alquilo, -C(0)H, -C(0)-(C1-8)alquilo, -C(0)-0-(C1-8)alquilo, -C(0)-NH2) -C(0)-NH(Ci. ealquilo), -C(0)-N(C -8alquilo)2, -S02-(Ci-8)alquilo, -S02-NH2, -S02-NH(Ci. ealquilo), -S02-N(C1-8alquilo)2, -C(N)-NH2, -cicloalquilo-R8, -(C1-8)alquilo-heterociclilo-R8, -arilo-R8, -(C1-8)alquilo-arilo-R8 y -(Ci-8)alquilo-heteroarilo-R8; R es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono o nitrógeno independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de -Ci-8, -(Ci-8)alquilo-(halo)i-3 y -(C1-8)alquilo-OH; siempre que, cuando R8 está unido a un átomo de carbono, R8 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste de alcoxi de -Ci-8, -NH2, -NH(Ci. 8alquilo), -N(Ci-8alquilo)2, ciano, halo, -(Ci-8)alcoxi-(halo)i-3, hidroxi y nitro; R9 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alcoxi de -Ci-8, -NH2, -NH(Ci-8alquilo), -N(Ci-8alquilo)2) ciano, (halo)i-3, hidroxi y nitro; R2 es un sustituyente unido a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, - C-i-ealquilo-R5, -C2-8alquenilo-R5, -C2-8alqu¡nilo-R5, -C(0)H, -C(0)-(C^)alquilo-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C1-8alquilo-R9), -C(O)-N(Ci.aalquilo-R9)2, -C(0)-NH(arilo-R8), -C(0)-c¡cloalquilo-R8, -C(0)-heterocicl¡lo-R8, -C(0)-arilo-R8, -C(0)-heteroarilo-R8, -C02H, -C(0)-0-(Ci-8)alquilo-R9, -C(O)-O-arilo-R8, -S02-arilo-R8, -cicloalquilo-R6, -arilo-R6 y -(d. 8)alquilo-N-R7; siempre que, cuando R2 está unido a un átomo de carbono, R2 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste de -Ci-aalcoxi-R5, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, oxo, -heterociclilo-R6 y -heteroariío-R6; í R3 es 1 a 3 sustituyentes unidos al átomo de carbono independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -Ci-8alquilo-R10, -C2- 8alquenilo-R10, -C2-8alquinilo-R10, -C1-8alcoxi-R10, -C(0)H, -C(0)-(C1-8)alquilo-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C1-8alquilo-R9), -C(0)-N(C1-8alquilo-R9)2, -C(O)-cicloalquilo-R8, -C(0)-heterociclilo-R8, -C(0)-arilo-R8, -C(0)-heteroarilo-R8, - C(NH)-NH2, -C02H, -C(0)-0-(C1-8)alquilo-R9, -C(0)-0-arilo-R8, -S02-(C1- 8)alquilo-R9, -S02-arilo-R8, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquilo-R8, -heterociclilo-R8, -arilo-R8 y -heteroarilo-R8; R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos al átomo de carbono independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -C-i-8alquilo-R10, -C2- 8alquenilo-R10, -C2-8alquinilo-R10, -C1-8alcoxi-R10, -C(0)H, -C(0)-(C -8)alquilo-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C1-8alquilo-R9), -C(0)-N(Ci-8alquilo-R9)2, -C(O)-cicloalquilo-R8, -C(0)-heterociclilo-R8, -C(0)-arilo-R8, -C(0)-heteroarilo-R8, -C(NH)-NH2, -C02H, -C(0)-0-(Ci-8)alquilo-R9, -C(0)-0-arilo-R8, -SH, -S-(Ci. 8)alquilo-R10, -S02-(Ci-8)alquilo-R9, -S02-arilo-R8, -SO2-NH2l -S02-NH(Ci. 8alquilo-R9), -S02-N(Ci-8alquilo-R9)2> -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquilo-R8, -heterociclilo-R8, -arilo-R8 y -heteroarilo-R8; R10 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -NH2, -NH(Ci-8alquilo), -N(C -8alquilo)2, ciano, (halo)i-3, hidroxi, nitro y oxo; y, Y y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste de O, S, (?,??) y (H,H); siempre y cuando uno de Y y Z es O y el otro es seleccionado del grupo que consiste de O, S, (?,??) y (H,H); y sales farmacéuticamente aceptables de éstos.
Las modalidades de la presente invención incluyen los compuestos de la Fórmula (II) en donde, R se selecciona del grupo que consiste de Ra, -C^alquilo-Ra, -C2- alquenilo-Ra, -C2.4alquinilo-Ra y ciano.
Las modalidades de la presente invención incluyen los compuestos de la Fórmula (II) en donde, Ra se selecciona del grupo que consiste de heterociclilo, arilo y heteroarilo.
En una modalidad, Ra se selecciona del grupo que consiste de dihidro-piranilo, fenilo, naftilo, tienilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, piridinilo, azaindolilo, indazolilo, benzofurilo, benzotienilo, dibenzofurilo y dibenzotienilo.
Las modalidades de la presente invención incluyen los compuestos de la Fórmula (II) en donde, R se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, -Ci-4alquilo-R5, -C2-4alquenilo-R5, -C2-4alquinilo-R5, -C(0)-(C1-4)alquilo-R9, -C(0)-arilo-R8, -C(0)-0-(C1-4)alquilo-R9, -C(0)-0-arilo-R8, -C(0)-NH(C1-4alquilo-R9), -C(0)-NH(arilo-R8), -C(0)-N(C1-4alquilo-R9)2, -S02-(Ci-4)alquilo-R9, -S02-arilo-R8, -cicloalquilo-R6, -heterociclilo-R6, -arilo-R6 y -heteroarilo-R6; en donde el heterociclilo y heteroarilo se unen al átomo de nitrógeno del azaindol en una posición a través de un átomo de carbono del anillo de heterociclilo o heteroarilo.
En una modalidad, R1 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, -C1-4alquilo-R5, -arilo-R6 y -heteroarilo-R6; en donde el heteroarilo se une al átomo de nitrógeno del azaindol en una posición a través de un átomo de carbono del anillo de heteroarilo.
En una modalidad, R se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, -Ci-4alquilo-R5 y -naftilo-R6.
Las modalidades de la presente invención incluyen los compuestos de la Fórmula (II) en donde, R5 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -0-(Ci^t)alquilo, -0-(Ci_ 4)alquilo-OH, -0-(Ci-4)alquilo-NH2, -0-(Ci-4)alquilo-S-(CM)alquilo, -0-(Ci^)alquilo-S02-(C1-4)alqu¡lo, -0-(C1-4)alqu¡lo-S02-NH2, -0-(d^)alquilo-S02-NH(C^alquilo), -0-(C )alquilo-S02-N(C1-4alquilo)2, -0-C(0)H, -0-C(O)-(d. 4)alquilo, -0-C(0)-NH2, -0-C(O)-NH(C1-4alqu¡lo), -O-C(0)-N(C1-4alqu¡lo)2, -0-(Ci. 4)alquilo-C(0)H, -O-íd^alquilo-CÍOHd^alquilo, -0-(Ci-4)alquilo-C02H, -0-(d. 4)alquilo-C(0)-0-(d-4)alquilo, -0-(C1_ )alquilo-C(0)-NH2> -0-(C1- )alquilo-C(0)-NH(CMalquilo), -O-íC^íalquilo-CíOJ-NíC^alquiloJz, -C(0)H, -C(0)-(C1-4)alqu¡lo, S02-NH2, -S02-NH(CMalquilo), -N-R7, ciano, (halo)1-3, hidroxi, nitro, oxo, -cicloalquilo-R6, -heterociclilo-R6, -arilo-R6 y -heteroarilo-R6.
En una modalidad, R5 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -O- -N-R7, hidroxi y -heteroarilo-R6.
En una modalidad, R5 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -O-(C1-4)alquilo, -N-R7, hidroxi, -imidazolilo-R6, -triazolilo-R6 y -tetrazolilo-R6 Las modalidades de la presente invención incluyen los compuestos de la Fórmula (II) en donde, R6 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono o nitrógeno independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de -CM, alquenilo de -C2-4, alquinilo de -C2-4, -C(0)H, -C(O)-(C1-4)alquilo, -C02H, -C(0)-0-(C1-4)alquilo, -C(0)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(O)-NH(Ci. 4alquilo), -C(0)-N(Ci-4)alquilo)2, -S02-(Ci-4)alquilo, -S02-NH2) -SO2-NH(Ci-4alquilo), -(d. 4)alquilo-OH, -arilo-R8, -(Ci^alquilo-arilo-R8 y -(Ci. )alquilo-heteroarilo-R8; siempre que, cuando R6 está unido a un átomo de carbono, R6 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste de alcoxi de -Ci^, -(Ci-4)alcoxi-(halo)i-3, -SH, -N-R7, ciano, halo, hidroxi, nitro, oxo y -heteroarilo-R8.
En una modalidad, R6 es hidrógeno.
Las modalidades de la presente invención incluyen los compuestos de la Fórmula (II) en donde, R7 es 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de -Ci-4, alquenilo de -C2- , alquinilo de -C2-4, -(Ci^)alquilo-OH , -(C-i. 4)alquilo-0-(Ci-4)alquilo, -(Ci-4)alquilo-NH(C - alquilo), - -(C1- )alquilo-S-(Ci- )alquilo, -C(0)H, -C(0)-(Ci. 4)alquilo, -C(0)-0-(C1-4)alquilo, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C1-4alquilo), -C(O)-N(C1-4alquilo)2, -S02-(C1-4)alquilo, -S02-NH2, -SOrNHÍd^alquilo), -S02-N(C1-4alquilo)2, -C(N)-NH2, -cicloalquilo-R8, -(C1-4)alqu¡lo-heterociclilo-R8, -arilo-R8, -(d.4)alqu¡lo-arilo-R8 y -(C1- )alquilo-heteroarilo-R8.
En una modalidad R7 es 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de -Ci-4, -C(0)H, -C(0)-(d.4)alquilo, -C(0)-0-(C1-4)alquilo, -S02-NH2> -S02-NH(C1-4alquilo) y - S02-N(C1- alquilo)2.
Las modalidades de la presente invención incluyen los compuestos de la Fórmula (II) en donde, R8 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono o nitrógeno independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de siempre que, cuando R8 está unido a un átomo de carbono, R8 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste de alcoxi de -C-M, -NH2, -NH(Ci-4alquilo), -N(Ci_4alquilo)2, ciano, halo, -(Ci-4)alcoxi-(halo)i-3, hidroxi y nitro.
En una modalidad, R8 es hidrógeno.
Las modalidades de la presente invención incluyen los compuestos de la Fórmula (II) en donde, R9 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alcoxi de -C-1.4, -NH2, -NH(Ci-4alquilo), -N(Ci-4alquilo)2, ciano, (halo)i.3, hidroxi y nitro.
En una modalidad, R9 es hidrógeno.
Las modalidades de la presente invención incluyen los compuestos de la Fórmula (II) en donde, R2 es un sustituyente unido a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, -C2-4alquenilo-R5, -C2-4alquinilo-R5, -C(0)H, -C(O)-(Ci-4)alquilo-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C1-4alquilo-R9), -C(O)-N(C1-4alquilo-R9)2, -C(0)-NH(arilo-R8). -C(0)-cicloalquilo-R8, -C(0)-heterocicl¡lo-R8, -C(O)-arilo-R8, -C(0)-heteroarilo-R8, -C02H, -C(0)-0-(C -4)alquilo-R9, -C(0)-0-arilo-R8, -S02-(C1-4)alquilo-R9, -S02-arilo-R8, -cicloalquilo-R6, -arilo-R6 y -(d. )alquilo-N-R7; siempre que, cuando R2 está unido a un átomo de carbono, R2 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste de -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, oxo, -heterociclilo-R6 y -heteroarilo-R6.
En una modalidad, R2 es un sustituyente unido a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, -Ci. 4alquilo-R5, -C2-4alquenilo-R5, -C2-4alquinilo-R5, -C02H, -C(0)-0-(C1-4)alquilo-R9, -cicloalquilo-R6, -arilo-R6 y -(C1-4)alquilo-N-R7; siempre que, cuando R2 está unido a un átomo de nitrógeno, no se forma una sal cuaternaria; y, siempre que, cuando R2 está unido a un átomo de carbono, R2 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste de -Ci-4alcoxi-R5, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, oxo, -heterociclilo-R6 y -heteroarilo-R6.
En una modalidad, R2 es un sustituyente unido a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, -Ci. 4alquilo-R5 y -arilo-R6; siempre que, cuando R2 está unido a un átomo de nitrógeno, no se forma una sal cuaternaria; y, siempre que, cuando R2 está unido a un átomo de carbono, R2 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste de -N-R7, halógeno, hidroxi y -heteroarilo-R6.
Las modalidades de la presente invención incluyen los compuestos de la Fórmula (II) en donde, R3 es 1 a 3 sustituyentes unidos a un átomo de carbono independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -C^alquilo-R10, -C2-4alquenilo-R10, -C2- alquinilo-R10, -C^alcoxi-R10, -C(0)H, -C(0)-(C^)alquilo-R9, -C(0)-NH2) -C(0)-NH(C1-4alquilo-R9), -C(0)-N(d. 4alquilo-R9)2, -C(0)-cicloalquilo-R8, -C(0)-heterociclilo-R8, -C(0)-arilo-R8, -C(O)-heteroarilo-R8, -C(NH)-NH2, -C02H, -C(0)-0-(C1-4)alquilo-R9, -C(0)-0-arilo-R8, - S02-(Ci.8)alqu¡lc~R9, -S02-arilo-R8, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquilo-R8, -heterociclilo-R8, -arilo-R8 y -heteroarilo-R8.
En una modalidad, R3 es un sustituyente unido a un átomo de carbono seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, -C2-4alquenilo-R10, -C2-4alquinilo-R10, -C1-4alcoxi-R10, -C(0)H, -C02H, -NH2, -NH(Ci-4alquilo), -N(Ci-4alquilo)2, ciano, halógeno, hidroxi y nitro.
En una modalidad, R3 es un sustituyente unido a un átomo de carbono seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, -Ci-4alquilo-R10, - H2, -NH(Ci-4alquilo), -N(Ci-4alquilo)2, halógeno e hidroxi.
Las modalidades de la presente invención incluyen los compuestos de la Fórmula (II) en donde, R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, R 0, -C(0)H, -C(0)-(C1-4)alquilo-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C^alquilo-R9), -C(O)- -C(0)-cicloalquilo-R8, -C(0)-heterociclilo-R8, -C(0)-arilo-R8, -C(0)-heteroarilo-R8, -C(NH)-NH2, -C02H, -C(0)-0-(C )alqu¡lo-R9, -C(0)-0-arilo-R8, -SH, -S-(C1-4)alquilo-R10, -SO2-arilo-R8, -S02-NH2, -S02-NH(C^alquilo-R9), -S02-N(C1-4alquilo-R9)2l -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquilo-R8, -heterociclilo-R8, -arilo-R8 y -heteroarilo-R8.
En una modalidad, R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -C-ualquilo-R10, -C2-4alquenilo-R10, -C2-4alquinilo-R10, -Ci- alcoxi-R10, -C(0)H, -C02H, -NH2> -NH(C -4alquilo), -N(Ci-4alquilo)2, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquilo, -heterociclilo, -arilo y -heteroarilo.
En una modalidad, R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, C1-4alquilo-R10, C1-4alcoxi-R10, -NH2, -NH(C1-4alquilo), -N(Ci. 4alquilo)2, halógeno e hidroxi.
En una modalidad, R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -NH2, -NH(Ci- alquilo), -N(Ci. 4alquilo)2, cloro, flúor e hidroxi.
Las modalidades de la presente invención incluyen los compuestos de la Fórmula (II) en donde, R10 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -NH2, -NH(Ci-4alquilo), -N(Ci-4alquilo)2, ciano, (halo)i.3, hidroxi, nitro y oxo.
En una modalidad, R 0 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno y (halo) -3.
En una modalidad, R10 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno y (fluoro)3.
Las modalidades de la presente invención incluyen los compuestos de la Fórmula (II) en donde, Y y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste de O, S, (?,??) y (H,H); siempre y cuando uno de Y y Z es O y el otro es seleccionado del grupo que consiste de O, S, (H,OH) y (H,H).
En una modalidad, Y y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste de O y (H,H); siempre y cuando uno de Y y Z es O, y el otro es seleccionado del grupo que consiste de O y (H,H).
En una modalidad, Y y Z se seleccionan independientemente de O.
Los compuestos de la Fórmula (II) se describen en la patente de los Estados Unidos número 7,125,878, nombrada comúnmente, cuya completa descripción se incorpora en la presente como referencia.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de la Fórmula (II) en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste de: Compuesto Nombre 3-(2-clorofen¡l)-4-[1-(3-hidroxipropil)-1 H^¡rrolo ^^ 3-(2<forofen¡IH-[1-[3-(d¡met¡lamino)propilH diona, 3-[1-(3-h¡droxiprop¡l)-1 H-p¡rrolo[2,3-b]p¡r¡d¡n-3-¡l]-4-(1-naftalen¡l)-1 - -p¡rrol-2,5-d¡ona, 3-[1-[3-(d¡met¡lam¡no)prop¡l]-1 H^iiTolo[2,3-¿]p¡rid¡n-3-¡l]-^(1-naftalen¡l)-1 - -p¡rrol-2,5- diona, 3-(5-clorobenzo[b]t¡en-3-il)-4-[1 -(3-hidroxipropil)-1 H-p¡rrolol2,3-b]p¡r¡dina-3-il]-1 H- p¡rrol-2,5-d¡ona, 3-[1-(3-h¡drox¡prop¡l)-1 H^¡ olo[2,3-b]p¡ri^ 3-(1 -et¡l-1 H^¡rrolo[2,3-b]pir¡din-3-¡l)-4-[1-(3-h¡drox¡prop¡l)-1 H-pirrolo[2,3-i)]pir¡d¡ri-3- ¡l]-1H-pirrol-2,5-d¡ona, 8 3-[1-(3-h¡droxiprop¡l)-1 H-pirrolo[2,3-b]p¡r¡d¡n-3-¡l]-4-(2-metox¡fen¡l)-1 H-p¡rrol-2,5-d¡ona, 9 3-[1-(3-h¡droxipropil)-1 H^irrolo[2,3-b]p¡ridin-3-il]-4-(3-metox¡fen¡l)-1H^irrol-2,5-d¡on 10 3-(2-cloro-4-fluorofen¡l)-4-[1 -(3-h¡drox¡prop¡l)-1 H^irrolo[2,3-b]p¡r¡dina-3-¡l]-1 -/-p¡rrol- 2,5-diona, 11 3-[1-(3-h¡droxipropil)-1 H^irrolo[2,3-b]piridin-3-¡l]-4-[2-(trifluorometil)fen¡l]-1 H-p¡rrol- 2,5-diona, 12 3-[1-(3-hidroxipropil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il]-4-(2-piridinil)-1H-pirrol-2,5-diona, 13 3-[3-cloro-5-(trifluoromet¡l)-2^iridinilH-[1-^ ¡I]- 1 H-p¡rrol-2 ,5-diona , 14 3-[1-(3-h¡drox¡prop¡l)-1H^irrolo[2,3-b]pir¡d¡n-3-¡l]-4-(2-t¡enil)-1 H-p¡rrol-2,5-diona, 15 3-(2,5-d¡cloro-3 ienil)-4-[1-(3-hidrox¡propil)-1 H-p¡rrolo[2,3-b]p¡rid¡na-3-¡l]-1 H-pirrol- 2,5-diona, 16 3-[1-(3-hidrox¡prop¡l)-1 H^irazol-3-¡l]-4-[1-(3-N^ 1H-p¡rrol-2,5-d¡ona, 3-[1-(3-hidrox¡prop¡l)-1H-p¡rrolo[2,3-b]p¡r¡din-3-il]-4-(1 H-¡m¡dazol-2-¡l)-1H-pirrol-2,5- diona, 18 3-[1-(3-h¡drox¡propil)-1H-¡m¡dazol-4-iH-[1-(3-h¡drox¡prop¡l)-1H-pirrolo[2,3-í)]p¡r¡d¡n-3-¡l]- 1H-pirrol-2,5-d¡ona, 19 3-[1-(2-hidroxietil)-1 H-im¡dazol-4-il]-4-[1 -(3-hidrox¡prop¡l)-1 H-p¡rrolo[2,3-i)]pind¡n-3-¡l]- 1H-p¡rrol-2,5-d¡ona, 20 3-[1-[3-(d¡met¡lam¡no)prop¡l]-1H-¡ndazol-3-¡l]-4-[1-(2-naftalen¡l)-1 H-p¡rrolo[2,3-b]p¡rid¡n-3- il]-1 H-p¡rrol-2,5-d¡ona, 21 3-[1-(3-hidrox¡propil)-1 H-¡ndazol-3-il]-4-[1 -(2-naftalen¡l)-1 H-p¡rrolo[2,3- )]p¡r¡d¡n-3-il]- 1H-pirrol-2,5-d¡ona, 22 3-[(E)-2-(4-fluorofen¡l)etenilH-[1 -(3- idroxipropil)-1 H-pirrolo[2,3-b]pirid¡n-3-¡l]-1 H- pirrol-2,5-diona, 23 3-(3,4-dihidro-2H-p¡ran-6-il)-4-[1 -(3-hidrox¡propil)-1 H-p¡rrolo[2,3-b]pir¡dina-3-¡l]-1 H-pirrol- 2,5-diona, 24 4-[1-(3-h¡droxipropil)-1 H-p¡rrolot2,3-/)]piridin-3-¡l]-[3,3'-bi-1 H-p¡rrol]-2,5-d¡ona, 25 3-(2-benzofuran¡IH-[1-(3-hidroxiprop^ 26 S-ll-ÍS-hidroxipropi -IH-pirrolop.S-blpiridin-S-ilH-í'l-metil-I H-pirazol-S-i -I H-pirrol- 2,5-diona, 27 2,5-d¡hidro-4-[1 -(3-hidroxiprop¡l)-1 H-p¡rrolo[2,3-b]p¡rid¡n-3-¡l]-2,5-dioxo-1 H-pirrol-3- carbonitrilo, 28 3-d¡benzo[b,d]t¡en-4-¡l-4-[1-(3-hidroxiprop¡l)-1 H^¡rrolo[2,3-b]pir¡d¡na-3-il]-1 /-/-p¡rrol- 2,5-diona, 29 3-(4-dibenzofuran¡l)-4-[1-(3-h¡droxiprop¡l)-1H^irrolo[2,3-b]p¡ridin-3-¡l]-1H-p¡rrol-2,5-d¡ona, 30 3-(2-hidroxifenilH-[1-(3-metoxipropil)-1H^ 31 3-(3,4-dimetox¡fen¡l)-4-[1-(3-metox¡propil)-1 -/-p¡rrolo[2,3-b]pirid¡na-3-¡l]-1 H-p¡rrol-2,5-diona, 32 3-(3Ad¡hidroxifenil)^[1-(3-h¡droxiprop¡l)-1H^¡rrolo[2 ft]p¡rid¡na-3-¡ -1W^irrol-2 d¡ona, 33 3-(2-metoxifenil)-4-[1-(2-naftalen¡l)-1 H^¡rrolo[2,3-b]p¡r¡d¡n-3-¡l]-1H^irrol-2,5-diona^ 34 2-met¡lprop¡l éster del ácido [3-[3-[2,5-dihidro-4-(2-metox¡fenil)-2,5-d¡oxo-1 H-p¡rrol-3-¡l]- 1 H-pirrolo[2,3-i)]piridin-1-il]propil]-carbamico, 35 3-[1 -(3-aminopropil)-1 H-pirrolo[2,3-b]p¡ridin-3-il]-4-(2-metox¡fen¡l)-1 H-pirrol-2,5-d¡ona, 36 W-[3-[3-[2,5-d¡h¡dro-4-(2-metoxifen¡l)-2,5-d¡oxo-1 H-p¡rrol-3-il]-1 H-p¡rrolo[2,3-b]p¡ridin- 1-¡l]prop¡l]-acetamida, 37 V-[3-[3-[2,5-d¡h¡dro-4-(2-metox¡fenil)-2,5-dioxo-1 H^irrol-3-il]-1H^irrolo[2,3-b]p¡ridin- 1 -¡l]propil]-sulfam¡da, 38 3-(2-metox¡fenil)-4-[1 -[3-(1 H-tetrazol-1-¡l)prop¡l]-1 H-p¡rrolo[2,3-b]p¡r¡d¡na-3-il]-1 H- p¡rrol-2,5-d¡ona, 39 3-(2-metox¡fen¡l)-^-[1-[3-(2H-tetrazol-2-il)prop¡l]-1 H-p¡rrolo[2,3-/3]p¡r¡dina-3-¡l]-1 H- p¡rrol-2,5-diona, 40 3-[1-(3-hidrox¡-propil)-1 H-p¡rrolo[2,3-b]p¡rid¡n-3-¡l]-4-p¡raz¡n-2-¡l-pirrol-2,5-d¡ona, 41 3-(2,4-d¡metoxi^¡r¡mid¡n-5-¡l)-4-[1-(3-hidrox¡-prop¡l)-1 H-pirrolo[2,3-b]pir¡d¡n-3-¡l]^¡rrol- 2,5-diona, 42 4-{3-[4-(2,4-d¡metox¡^¡r¡midin-5-il)-2,5-dioxo-2,5-d¡h¡dro-1 H-pirrol-3-¡l]-pirrolo[2,3- b]pir¡d¡n-1 -il}-butironitrilo, 43 4-{3-[4-(1-met¡l-1 H-pirazol-3-¡l)-2,5-dioxo-2,5-d¡hidro-1 H-pirrol-3-¡l]-p¡rrolo[2,3-b]p¡r¡d¡n- 1-il}-but¡ron¡trilo, y 44 3-(2,4-dimetoxi^irim¡din-5-¡l)-4-(1-fenetil-1 H-p¡rrolo[2,3-b]p¡r¡d¡na-3-il)-p¡rrol-2,5-diona.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de la Fórmula (II) en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste de: En una modalidad, el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B es un compuesto de la Fórmula (III): H Fórmula (III) en donde A y E se seleccionan independientemente del grupo que consiste de un átomo de carbono sustituido con hidrógeno y un átomo de nitrógeno; en donde es independientemente seleccionado del grupo que consiste de 1H-indol, 1 H-pirrolo[2,3-/9]piridina, 1H-pirazolo[3,4-jb]pir¡dina y 1H-indazol; Z se selecciona de O; Alternativamente, Z se selecciona de dihidro; en donde cada átomo de hidrógeno está unido por un enlace simple; R4 y se seleccionan independientemente de alquilo de C1-8, alquenilo de C2-8 y alquinilo de C2-8 opcionalmente sustituido con oxo; F¾ se selecciona del grupo que consiste de alquilo de -Ci-8, alquenilo de -C2-81 alquinilo de -C2-8, -0-(Ci^)alquilo-0-, -O-(C2-8)alquenilo-0-, -0-(C2-a)alqu¡nilo-0-, -C(0)-(Ci-8)alquilo-C(0)- (en donde cualquiera de los grupos de enlace de alquilo, alquenilo y alquinilo antes mencionados son cadenas de carbono rectas opcionalmente sustituidas con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de C-i-8, alcoxi de C-i-e, Ci. 8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxilo(Ci-8)alquilo, -C(0)0-(Ci-8)alqu¡lo, -Ci. 8alquilo-C(0)0-(Ci.8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C- ), amino(Ci.e)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C1-4), halógeno, (halo)1-3(Ci-8)alcoxi, hidroxi, hidroxi(Ci. 8)alquilo y oxo; y, en donde cualquiera de los grupos de enlace de alquilo, alquenilo y alquinilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con uno a dos sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de heterociclilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo(C -8)alquilo, arilo(C1-8)alquilo, heteroariloíC-i-eJalquilo, espirocicloalquilo y espiroheterociclilo (en donde cualquiera de los sustituyentes de cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de C-i-e, alcoxi de C-i-8, C -8alcoxi(Ci.8)alquilo, carboxilo, carboxiloíC^alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C1-4), amino(Ci-8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyante independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de Ci-4), halógeno, (halo)i-3(Ci-8)alquilo, (halo)-i. 3(Ci-8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(Ci.8)alquilo; y, en donde cualquiera de los sustituyentes de heterociclilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con oxo)), cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo (en donde cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo son opcionalmente sustituidos con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de d-a, alcoxi de Ci-a, carboxilo, carboxiloíC-i. 8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C^), amino(Ci-8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y 8)alquilo, y, en donde heterociclilo es opcionalmente sustituido con oxo), -(0-(CH2)i-6)o-5-0-, -0-(CH2)i_6- (CH^^-NRg-ÍCH^^-O-, -0-(CH2)^-0-(CH2)^-NR6-, -(O-(CH2)1-6)o.5-S-, -0-(CH^-e-S-ÍCH^^-O-, -0-(CH2)1-6-0-(CH2)1-6-S-, -NR6-, -NRs-NRy-, -NR6-(CH2)1- 6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-, -NR6-C(0)-, -C(0)-NR6-, -C(0)-(CH2)o-6-NR6-(CH2)o-6-C(0)-, -NR6-(CH2)M-C(0)-(CH2)^-C(0)-(CH2)o-6-NR7-, -NR6-C(0)-NR7-, -NR6-C(NR7)-NR8-, O-, -S-íCH^^-NRe-ÍCH^^-S-, -NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)i-6-NR7-y -S02- (en donde R6, R7 y Re se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de C-i-a, Ci^alcoxi(Ci.8)alquilo, carboxilo(Ci ^alquilo, aminoíC 8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyante independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C-u), hidroxi(Ci. 8)alquilo, heterociclilo(Ci.8)alquilo, arilo(Ci-e)alquilo y heteroarilo(Ci.8)alquilo (en donde los sustituyentes de heterociclilo, arilo y heteroarilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de C1-8, alcoxi de Ci-8, Ci_8alcoxi(Ci..8)alquilo, carboxilo, carboxilo(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C1- ), amino(Ci-8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C1-4), halógeno, (halo)i-3(Ci-8)alquilo, (halo)-i. hidroxi e hidroxi(Ci-8)alquilo; y, en donde el heterociclilo es opcionalmente sustituido con oxo)); siempre y cuando, A y E se seleccionen de un átomo de carbono sustituido con hidrógeno, entonces R2 se selecciona del grupo que consiste de alquinilo de -C2-8l -0-(Ci-8)alquilo-, -O-(C2-8)alquenilo-0-, -0-(C2.8)alquin¡lo-0-, -C(O)-(Ci-8)alquilo-C(0)- (en dónde cualquiera de los grupos de enlace de alquilo, alquenilo y alquinilo antes mencionados son cadenas de carbono rectas opcionalmente sustituidas con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de C1-8, alcoxi de Ci-s, Ci-8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxilo(Ci-8)alquilo, -C(0)O-(Ci. s)alquilo, -Ci^alquilo-C(0)0-(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C1-4), am¡no(C-i-8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C -4), halógeno, (haloJ-i-síC-i-eJalquilo, (halo)i-3(Ci-8)alcox¡, hidroxi, hidroxi(Ci. e)alquil y oxo; y, en donde cualquiera de los grupos de enlace de alquilo, alquenilo y alquinilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con uno a dos sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de heterociclilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo(Ci^)alquilo, arilo(Ci-8)alquilo, espirocicloalquilo y espiroheterociclilo (en donde cualquiera de los sustituyentes de cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de Ci-e, alcoxi de C -8, carboxilo, carboxilo(Ci_8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C- ), amino(C1-8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C- ), halógeno, (haloJi-aiCi-eJalquilo, (halo)i. - 3(Ci-8)alcox¡, hidroxi e hidroxi(Ci-8)alquilo; y, en donde cualquiera de los sustituyentes de heterociclilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con oxo)), cicloalquilo (en donde cicloalquilo es opcionalmente sustituido con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de d-s, alcoxi de C-i-a, carboxilo, carboxiloíC!. 8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de Cw), amino(Ci.8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C-u), halógeno, (halo)i.3(Ci. 8)alquilo, hidroxi e hidroxi(Ci-8)alquilo), -(0-(CH2)i-6)i-5-0-, -O-(CH^-O-ÍCH^-O-, -0-(CH2)1-6-0-(CH2)^-0-(CH2)i^-0-, -(0-(CH2)1-6)1-5-NR6-, -0-(CH2)1-6-NR6-(CH2)i.6-0-, -0-(CH2)^-0-(CH2)^-NR6-, -(O-(CH2)^)0-5-S-, -O- -0-(CH2)i-6-0-(CH2)i-6-S-, -NR6-NR7-, -NR6-(CH2)i-6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)i^-NR8-, -NR9-C(0)-, -C(0)-NR9-, -C(0)-(CH2)o-6-NR6-(CH2)o-6-C(0)-, -NR6-(CH2)M-C(0)-(CH2)I^-C(0)-(CH2 NR7-, -NR6-C(0)-NR7-, -NR6-C(NR7)-NR8-, -0-(CH2)i-6-NR6-(CH2)i-6-S-, -S- (en donde R6, R7 y Re se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de C1.8, carboxilo(Ci-8)alquilo, amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C- ), h¡droxi(Ci.8)alquilo, heterociclilo(Ci-8)alquilo, arilo(Ci-8)alquilo y heteroarilo(Ci-8)alquilo (en donde los sustituyentes de heterociclilo, arilo y heteroarilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de Ci.8) alcoxi de C1-8, Ci. salcox^C^alquilo, carboxilo, carboxilo(Ci.8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C1-4), amino(Ci-8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C1-4), halógeno, (halo^d^alquilo, (halo)1-3(C1-8)alcoxi, hidroxi e h¡droxi(Ci-e)alquilo; y, en donde heterociclilo es opcionalmente sustituido con oxo); y, en donde R9 se selecciona del grupo que consiste de alquilo de C-|.8, C -8alcoxi(C1-8)alquilo, carboxilo(Ci-8)alquilo, (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C- ), hidrox^C^alquilo, heterociclilo(Ci. 8)alquilo, y heteroarilo(Ci-8)alquilo (en donde los sustituyentes de heterociclilo, arilo y heteroarilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de d-e, alcoxi de C-i-e, Ci^alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxilo(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C-u), amino(Ci. 8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C1.4), halógeno, (halo)i-3(Ci.8)alquilo, hidroxi e h¡droxi(Ci-8)alquilo; y, en donde heterociclilo es opcionalmente sustituido con oxo)); y, R1 y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de Ci-8, alquenilo de C2-8, alquinilo de C2-8 (en donde alquilo, alquenilo y alquinilo son opcionalmente sustituidos con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste de alcoxi de Ci-8, alcoxi(Ci. 8)alquilo, carboxilo, carboxilo(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C- ), amino(Ci-8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de Ci-4), (halo)1-3, (halo)i-3(Ci-8)alquilo, (halo)i.3(Ci-8)alcoxi, hidroxi, hidroxi(Ci-8)alquil y oxo), alcoxi de Ci-8, alcoxicarbonilo de Ci-8, (halo)i.3(Ci.8)alcox¡, alquiltio de C1-8, arilo, heteroarilo (en donde arilo y heteroarilo son opcionalmente sustituidos con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste de alquilo de Ci-8, alcoxi de Ci-8) alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxilo(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de Ci.4) , amino(Ci-8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de Ci-4), halógeno, 8)alquilo, (halo)i-3(Ci-8)alcoxi, hidroxi e hidrox^C^alquilo), amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de Ci^), ciano, halógeno, hidroxi y nitro; y sales farmacéuticamente aceptables de éstos.
En una modalidad, un compuesto de la Fórmula (III) es un compuesto seleccionado del grupo que consiste de: Fórmula (Illa) Fórmula (lllb) Fórmula (lllg) Fórmula (lllh) Fórmula (lili) Fórmula (lllk) Fórmula (lili) Fórmula (lllm) Fórmula (llln) en donde todas las otras variables son tal como se describió anteriormente; y sales farmacéuticamente aceptables de éstos.
En una modalidad, un compuesto de la Fórmula (III) es un compuesto seleccionado del grupo que consiste de: Fórmula (Illa) Fórmula (lllb) Fórmula (lili) Fórmula (lllj) en donde todas las otras variables son tal como se describió anteriormente; y sales farmacéuticamente aceptables de éstos.
Los compuestos de la Fórmula (III) se describen en la patente de los Estados Unidos número 6,828,327, nombrada comúnmente, cuya completa descripción se incorpora en la presente como referencia.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de la Fórmula (III) en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste de: Compuesto Nombre 6,7,9,10,12,13,15,16-octahidro-23H-5,26:17,22-d¡meteno-5H-d¡pirido[2,3-íc:3,,2'- q]pirrolo[3,4-n][1 l4,7,10,19]trioxadiazac¡clohen¡cosino-23,25(24H)-diona, ^.^ .^.M^e^ ^G^O^^S-deca idro-g^ ^-dimeteno-I H-dipiridop^-n:^^'- f]pirrolo[3,4-c/][1 , 4,7,10,13,22]tetraoxadiazac¡clotetracosino-1 ,3(2W)-d¡ona, 10,11 ,13 4,16,17,19,20,22l23,25,26 iodecahidro-9,4:27,32-d¡meteno-1 H-d¡pir¡do[2,3-q:3',2'-w]p¡rrolo[3,4-fl[1 , 4,7,10, 13, 16,25]pentaoxad¡azacicloheptacosina-1 ,3(2H)-d¡ona, 6,7,9,10,12, 13-hexah¡dro-20H-5,23:14, 19-d¡meteno-5H-dibenzo[ft,n]piiTolo[3,4-/(][1 ,4,7,16]d¡oxadiazac¡clooctadec¡no-20,22(21H)-d¡ona, 6,7,9,10,12,13,15,16-octah¡dro-23H-5,26:17,22-dimeteno-5H-dibenzo[/(,q]p¡rrolo[3,4-n][1.4,7,10,19]tr¡oxadiazac¡clohene¡cosino-23,25(24H)-d¡ona, 10,11 ,13,14,16,17,19,20,22,23-decahidro-9,4:24,29-d¡meteno-1 H-dibenzo[n,qpirrolo[3,4-q][1 ,4,7,10,13,22]tetraoxadiazac¡clotetracos¡no-1 ,3(2H)-diona, 10,11 , 13,14,16,17, 19,20,22,23,25,26-dodecah¡dro-9,4:27,32-dimeteno-1 H-d¡benzo[q,vv|p¡rrolo[3,4-f][1 ,4,7, 10, 13, 16,25]pentaoxadiazacicloheptacosina-1 ,3(2H)-d¡ona, 12-hidro-6H, 19H-5,22:13,18:7,11-tr¡metenopirido[2,3-;]pirrolo[3,4-m][1 ,9]benzod¡azac¡clo eptadecino-19,21 (20 -/)-diona, 12-hidro-6H, 19W-5.22: 13, 18-d¡meteno-7,11 -nitrilop¡r¡do[2,3-y]pirrolo[3,4-m][1 ,9]benzodiazacicloheptadecino-19,21 (20H)-d¡ona, 6,7,9,10,12,13-hexah¡dro-20H-5,23:14,19-d¡meteno-5H-pir¡do[2,3-k]pirrolo[3,4-n][4,7,1 ,10]benzodioxad¡azac¡clooctadec¡no-20,22(21 H)-d¡ona, 6,7,9,10,12,13,15,16-octahidro-23H-5,26:17,22-d¡meteno-5H-pir¡dot2,3-n]p¡rrolo[3,4-q][4,7,10,1 ,13]benzotrioxadiazac¡cloheneicos¡no-23,25(24H)-d¡ona, 11 -etil-6,7, 10, 11 , 12, 13, 15, 16-octahidro-23H-5,26: 17,22-d¡meteno-5H, 9H-d¡benzo[/c,q]pirrolo[3,4-n][1 ,7,4,10,19]d¡oxatriazacicloheneicos¡no-23,25(24H)-diona, 6,7,10,11 ,12,13,15,16-octahidro-11 -metil-23H-5,26:17,22-dimeteno-5H, 9H-dibenzo[/ ,q]p¡rrolo[3,4-n][1 ,7,4,10,19]dioxatr¡azacicloheneicos¡no-23,25(24/-/)-diona, 6,7,10,11 ,12,13l15,16-octah¡dro-11-(1-met¡let¡l)-23H-5,26:17,22-d¡meteno-5H, 9H-dibenzo[/ ,q]p¡rrolo[3,4-n][1 ,7,4,10,19]dioxatr¡azac¡cloheneicos¡no-23,25(24H)-d¡ona, 7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16-decahidro-8,11 ,14-trimet¡l-6H, 23H-5,26:17,22-d¡metenod¡benzo[n,^irrolo[3,4-q][1 ,4,7,10,13]pentaazacicloheneicos¡no-23,25(24H)-d¡ona, 6,7,10,11 ,12,13,15,16-octah¡dro-11-met¡l-23H-5,26-meteno-17,22-nitr¡lo-5H, 9H-d¡benzo[k,q]pirrolo[3,4-n][1 ,7,4,10,19]d¡oxatriazaciclohene¡cos¡no-23,25(24H)-diona, 11 -etil-6,7, 10,11 ,12,13,15,16-octahidro-23H-5,26-meteno-17,22-nitr¡lo-5H, 9H-d¡benzo[/ ,q]pirrolo[3,4-n][1 ,7,4,10,19]d¡oxatr¡azaciclohene¡cos¡no-23,25(24H)-diona, 11 -etil-6,7, 10,11 ,12,13,15,16-octah¡dro-23H-5,26: 17,22-d¡meteno-5H, 9H-d¡pirido[2,3-^:3',2'-q]p¡rrolo[3,4-n][1 ,7,4,10,19]dioxatr¡azacicloheneicosino-23,25(24H)-diona, 6,7,9,10,12,13l15,16-octah¡dro-23H-5,26:1 ,22-d¡meteno-5H-dip¡rido[2,3-/(:3·,2,-q]p¡rrolo[3,4-n][1 ,7,4, 10, 19]dioxatiadiazac¡cloheneicosino-23,25(24H)-diona , 7,8,9,10,11 , 12,13,14,15,16-decah¡dro-(6H, 23H-5,26:17,22-d¡metenod¡pirido[2,3-n:3,,2,- lp¡rrolo[3,4-g][1 l7l13]triazaciclohene¡cos¡no-23,25(24H)-d¡ona, 11-et¡l-7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16-decahidro-6H, 23H-5,26:17,22-d¡metenodip¡rido[2,3-n:3',2'-flpirrolo[3,4-q][1 J,13]triazac¡clohene¡cosino-23,25(24H)-d¡ona, 6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15-decah¡dro-22H-5,25:16,21-d¡meteno-5H-d¡p¡r¡do[2,3-m:3',2,-s]p¡rrolo[3,4-p][1 ,6,12]triazac¡cloe¡cosina-22,24(23H)-diona, 10-etil-6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15-decah¡dro-22H-5,25:16,21-d¡meteno-5H-dipirido[2,3-m:3',2'-s]pirrolo[3,4-p][1 ,6,12]triazacicloe¡cosina-22,24(23H)-d¡ona, 7,8,9, 15,16,17,18-heptahidro-6H, 25H-5.28: 19,24-d¡meteno-10, 14-nitr¡lod¡pirido[2,3-í):3',2'- j]pirrolo[3,4-e][1 ,10]diazac¡clotr¡cos¡na-25,27(26H)-diona, 7,8,9,10,11 , 13,14, 15,16-nonah¡dro-6H, 23H-5,26:17,22-dimetenodip¡r¡do[2,3-b:3',2'- /7]pirrolo[3,4-e][1 ,10]d¡azac¡cloheneicosino-12,23,25(24H)-triona, 26 7,8,9,11 ,12,13,14-heptahidro-6H, 21 H-5,2 :15,20-d¡metenodip¡rido[2,3-í):3',2,- /?Íp¡rrolo[3,4-e][1 ,10]d¡a2ac¡clononadecino-10,21 ,23(22H)-tr¡ona, 27 6,7,8,9,10, 11 , 12, 13,14, 15-decah¡dro-7, 14-d¡h¡drox¡-(7R, 14R)-22H-5,25: 16,21 -dimeteno- 5H-dipirido[2,3-b:3\2'- i]pirrolo[3,4-e][1 ,10]diazacicloeicxisina-22,24(23H)-diona, 28 6,7,9,10,12,13-hexahidro-20H-5,23:14,19-dimeteno-5H-dipirido[2,3-/?:3,,2'- n]pirrolo[3,4-lf][1 ,4,7,16]dioxadiazaciclooctadecino-20,22(21H)-diona, 29 6,7,10,11 ,12,13, 15,16-odahidro-11 -(2-metox¡etil)-23H-5,26-meteno-17,22-n¡trilo-5H, 9H- dibenzo[k,q]piirolo[3,4-n][1 ,7,4,10,19]dioxatriazac¡clo ene¡cx)s¡no-23,25(24H)-d¡ona, 30 6,7, 10, 11 , 12, 13, 15,16-octahidro-11 -(2-h¡droxietil)-23H-5,26: 17,22-dimeteno-5H, 9H- d¡benzo[/<,q]pirrolo[3,4-n][1 , 7,4,10,19]dioxatriazac¡cloheneicosino-23,25(24H)-diona, y 31 6,7,9,10,12,13,14,15,16,17-decah¡dro-14-metil-24H-5,27:18,23-d¡meteno-5H- d¡benzo[/,/]pirrolo[3,4-o][1 , 4,7,11 ,20]d¡oxatriazac¡clodocos¡no-24,26(25H)-diona.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de la Fórmula (III) en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste de: Compuesto Otros ejemplos de la invención incluyen un compuesto seleccionado del grupo que consiste de: Compuesto Nombre 1a Para proporcionar 2a 3-[1-[3-[(2-h¡drox¡et¡l)metilamino]prop¡l]-1 H-indazol-3-¡l]-4-[1-(3-p¡rid¡n¡l)-1 H-¡ndol-3- ¡l]-1 H-pirrol-2,5-diona, 5 3a 3,5-dicloro-N-[3-cloro-4-[(3,4,12,12a-tetra ¡dro-1H-[1 ,4]tiazino[3,4- c][1 ,4]benzod¡azep¡n-11 (6H)-¡l)carbon¡l]fen¡l]-benzamida, 4a 3-[1-(2-hidrox¡-etil)-1 H-¡ndol-3-¡l]-4-(1-pirid¡n-3-¡l-1 H-indol-3-¡l)-pirrol-2,5-diona, 5a 3-(2-metox¡-fenil)-4-(1-p¡rid¡n-3-il-1 H-¡ndol-3-¡l)-pirrol-2,5-diona, 6a 6-[[2-[[4-(2,4-d¡clorofen¡l)-5-(4-metil-1 H-im¡dazol-2-¡l)-2^ir¡m¡din¡l]am¡no]el¡l]amino]-3- piridinacarbonitrilo, 7a 3-(5-cloro-1-metiH H-¡ndol-3-¡l)-4-[1-(3-¡midazol-1-il-prop¡l)-1 H-indazol-3-¡l]-p¡rrol-2,5-d¡ona, 8a 3-(5-cloro-1-met¡l-1 H-indol-3-il)-4-[1-(3-[1 ,2,3]triazol-1-il-propil)-1H-indazol-3-il]- p¡rrol-2,5-diona, -| Q 9a 3-[1-(3-h¡drox¡-prop¡l)-1 H-pirrolo[2,3-b]p¡rid¡n-3-il]-4-(1-metil-1 H-p¡razol-3-¡l)-p¡rrol-2,5- diona, 10a Para proporcionar 11 a 3-[1-(3-hidroxi-3-metil-butil)-1 H-indazol-3-¡IH-(1-P¡rid»n-3-¡l-1 H-indol-3-il)-p¡rrol-2,5-diona, 12a 3-[1 -(2-hidroxi-etil)-1 H-¡ndazol-3-il]-4-(1 -pir¡m¡d¡n-5-il-1 H-indol-3-il)-pirrol-2,5-diona, 13a 3-[1-(2-h¡drox¡-etil)-1 H-indol-3-¡IH-(1-piri^ 14a (11Z)-8,9,10,13,14,15-hexahidro-2,6:17,21 -di(meteno)pirrolo[3,4- h][1 ,15,7]d¡oxazaciclotricosina-22,24(1 H, 23H)-diona, 15a 3-(5-cloro-1-piridin-3-il-1 H-indol-3-il)-4-[1-(3-hidroxi-prop¡l)-1 H-indazol-3-¡l)-pirrol-2,5-diona, . c 16a 3-(2-metoxi-fenil)-4-[1-(3-metoxi-propil)-1 H-pirrolo[3,2 ]piridin-3-il]^irrol-2,5-^ 1 0 17a 3-[1-(3-h¡droxi-propil)-1 H-indazol-3-il]-4-[1-(tetrahidro-piran-4-il)-1 H-¡ndol-3-il]-pirrol- 2,5-diona, 18a 2-{3-[4-(5-cloro-1-metil-1 H-indol-3-il)-2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-3Ml]-indazol-1- il}-N-(2-hidroxi-etil)-acetamida, 19a 4-(3-cloro-fenil)-6-(3-dimetilamino-propil)-5,6-dihidro-4H-2,4,6-triaza- ciclopenta[c]flúor- ,3-diona, 20a 14-etil-6,7,9,10,13,14,15,16-octahidro-12H, 23H-5,26:17,22- d¡metenodibenzo[k,q]pirrolo[3,4-n][1 ,4,7, 10, 19]dioxatriazacicloheneicosino- 23,25(24H)-diona, 21a 14-benzil-6,7,9,10,13,14,15,16-octahidro-12H, 23H-5,26:17,22- 20 di(meteno)dibenzo[k,q]pirrolo[3,4-n][1 ,4,7,10,19]dioxatriazaciclohenicosino- 23,25(24H)-diona, 22a 3-(1-{2-[2-(2-h¡drox¡-etox¡)-etox¡]-etil}-im pirrol-2,5-diona, 23a 6,7,8,9,10,11 , 12,13-octahidro-8,1 1-dimetil-5,23:14,19-dimeteno-20H- dibenzo[k,q]pirrolo[3,4-n][1 ,4,7,10]tetraazaciclooctadecino-20,22(21 H)-diona, 7,8,9,10,12,13,16,17,18,19-deca idrch8,17-dimetiM^ dibenzo[k,oJp¡rrolo[3,4-n][1 ,4J,10 9,22]dioxatetraa2addotetra8sincH26l28(27H) J¡ona, 14-(2-furilmet¡l)-6,7,9, 10,13, 14, 15, 16-octah¡dro-12H, 23H-5.26: 17,22- d¡(meteno)dibenzo[k,q]p¡rrolo[3,4-n][1 ,4,7,10,19]dioxatriazaciclohenicos¡no- 23,25(24H)-diona, 14-(2-tienilmetil)-6,7,9,10,13,14,15,16-octah¡dro-12H, 23H-5,26:17,22- d¡(meteno)dibenzo[k,q]p¡rrolo[3,4-n][1 ,4,7, 10,19]d¡oxatriazac¡clohenicosino- 23,25(24H)-d¡ona, 14-(1-naftilmetil)-6,7,9,10,13,14,15,16-octahidro-12H, 23H-5,26:17,22- d¡(meteno)d¡benzo[k,q]p¡rrolo[3,4-n][1 ,4,7, 10,19]d¡oxatr¡azadclohenicosino- 23,25(24H)-d¡ona, 14-(p¡ridin-4-¡lmet¡l)-6,7,9,10,13,14,15,16-octah¡dro-12H, 23H-5,26:17,22- di(meteno)dibenzo[k,q]p¡rrolo[3,4-n][1 ,4,7, 10,19]d¡oxatriazac¡dohen¡cosino- 23,25(24H)-d¡ona, 3-[1-(2-{2-[2-(1,2,3,4 etrahidro-naftalen-1-ilam¡no)-etoxiJ-etox¡}-etil)-1 H-indol-3-i [2-(1 ,2,3,4-tetrah¡dro-naftalen-1-ilamino)-et¡l]-1 H-¡ndol-3-¡l}-pirrol-2,5-diona, 3-[1-(3-dimetilamino-fenil)-1 H-indol-3-^ 3-[5-cloro-1-(6-dimetilamino-piridin-3-il)-1H-indol-3-il]-4-[1-(2-hidroxi-etil)-1 H- ¡ndazol-3-il]-pirrol-2,5-diona, y metil éster del ácido 5-(5-cloro-3-{4-[1-(2-hidroxi-etil)-1 H-indazol-3-il]-2,5-dioxo-2,5- d¡hidro-1 H-pirrol-3-il}-indol-1-il)-n¡cotinico.
Otros ejemplos de la invención incluyen un compuesto seleccionado del grupo que consiste de: Compuesto 1 a Compuesto 1a Compuesto 3a 54 Compuesto 13a Compuesto 14a Compuesto 15a Compuesto 25a Compuesto 26a Compuesto 27a Compuesto 28a Compuesto 29a Compuesto 30a Compuesto 31a Compuesto 32a Células adecuadas para el tratamiento de acuerdo con los métodos de la presente invención Las células pluripotentes, adecuadas para el uso en la presente invención, expresan al menos uno de los siguientes marcadores de pluripotencia seleccionados del grupo que consiste de: ABCG2, cripto, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60 y Tra1-81.
En una modalidad, las células pluripotentes son células madre embrionarias. En una modalidad alternativa, las células pluripotentes son células que expresan marcadores de pluripotencia derivadas de células madre embrionarias. En una modalidad, las células madre embrionarias son humanas.
Aislamiento, expansión y cultivo de células madre embrionarias humanas Caracterización de células madre embrionarias humanas: Las células madre embrionarias humanas pueden expresar uno o más antígenos embrionarios específicos de etapa (SSEA) 3 y 4, y los marcadores detectables por medio del uso de los anticuerpos designados Tra-1-60 y Tra-1 -81 (Thomson y otros, Science 282:1 145, 1998). La diferenciación de las células madre embrionarias humanas ¡n vitro resulta en la pérdida de la expresión de SSEA-4, Tra- 1-60, y la expresión de Tra- -8 (si está presente) y una expresión incrementada de SSEA-1. Las células madre embrionarias humanas indiferenciadas típicamente tienen actividad fosfatasa alcalina, la cual se puede detectar al fijar las células con 4 % de paraformaldehído, y después desarrollándolas con Vector Red como un sustrato, como se describe por el fabricante (Vector Laboratories, Burlingame Calif.) Las células madre pluripotentes no diferenciadas también expresan típicamente Oct-4 y TERT, según se detectó por RT-PCR.
Otro fenotipo deseable de células madre embrionarias humanas propagadas es un potencial para diferenciar en células de las tres capas germinales: tejidos del endodermo, mesodermo y ectodermo. La pluripotencia de las células madre embrionarias humanas se puede confirmar, por ejemplo, por la inyección de células en ratones SCID, al fijar los teratomas que se forman por medio del uso de 4 % de paraformaldehído, y después examinándolos histológicamente para la evidencia de los tipos de células provenientes de las tres capas germinales. Alternativamente, la pluripotencia se puede determinar por la creación de cuerpos embrioides y el análisis los cuerpos embrioides para la presencia de marcadores asociados con las tres capas germinales.
Las lineas de células madre embrionarias humanas propagadas se pueden cariotipar usando una técnica estándar de bandas G y se pueden comparar con los cariotipos publicados de las especies de primates correspondientes. Es deseable la obtención de células que tengan un "cariotipo normal", lo cual significa que las células son euploides, en donde todos los cromosomas humanos están presentes y no notablemente alterados.
Fuentes de las células madre embrionarias humanas: Los tipos de células madre embrionarias humanas que se pueden usar incluyen las líneas establecidas de células embrionarias humanas derivadas del tejido formado después de la gestación, que incluye tejido pre-embrionario (tal como, por ejemplo, un blastocito), tejido embrionario, o tejido fetal tomado en cualquier momento durante la gestación, típicamente pero no necesariamente antes de aproximadamente 10-12 semanas de gestación. Ejemplos no limitantes son las líneas de células madre embrionarias humanas establecidas o células de germen embrionario humano, tales como, por ejemplo, las líneas de células madre embrionarias humanas H1 , H7 y H9 (WiCell). También se contempla el uso de las composiciones de esta descripción durante el establecimiento inicial o la estabilización de estas células, en cuyo caso la fuente primaria de las células serían las células pluripotentes primarias tomadas directamente a partir de los tejidos fuente. También adecuadas son las células tomadas de una población de células madre pluripotentes ya cultivada, en ausencia de células alimentadoras.
También son adecuadas las líneas de células madre embrionarias humanas mutantes, tales como, por ejemplo, BG01v (BresaGen, Atenas, GA).
En una modalidad, las células madre embrionarias humanas se preparan como se describen en Thomson y otros (patente de los Estados Unidos, núm. 5,843,780; Science 282:1 145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 92:7844, 1995).
Cultivo de la células madre embrionarias humanas: En una modalidad, las células madre embrionarias humanas se cultivan en un sistema de cultivo que está esencialmente libre de células alimentadoras, pero sin embargo soporta la proliferación de las células madre embrionarias humanas, sin sufrir diferenciación sustancial. El crecimiento de las células madre embrionarias humanas en cultivos libres de células alimentadoras sin diferenciación se sustenta por el uso de un medio condicionado mediante el cultivo previo con otro tipo de células. Alternativamente, el crecimiento de las células madre embrionarias humanas en un cultivo libre de células alimentadoras sin diferenciación se sustenta por el uso de un medio químicamente definido.
En una modalidad alternativa, las células madre embrionarias humanas son inicialmente cultivadas en una capa de células alimentadoras que soportan las células madre embrionarias humanas de varias formas. Las células embrionarias humanas se transfieren después al sistema de cultivo que está esencialmente libre de células alimentadoras, pero sin embargo soporta la proliferación de células madre embrionarias humanas sin experimentar una diferenciación sustancial.
Los ejemplos de medios acondicionados adecuados para el uso en la presente invención se describen en US200200721 17, US6642048, WO2005014799, y Xu y otros (Stem Cells 22: 972-980, 2004).
Un ejemplo de un medio químicamente definido adecuado para el uso en la presente invención se puede encontrar en US20070010011.
Los medios de cultivo adecuados pueden elaborarse a partir de los siguientes componentes, tales como, por ejemplo, medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), Gibco núm. 1 1965-092; medio Eagle modificado de Dulbecco Knockout (KO DMEM), Gibco núm. 10829-018; F12/50 % medio basal DMEM de Ham; 200 mM L-glutamina, Gibco núm. 15039-027; solución de aminoácido no esencial, Gibco 1 1 140-050; ß-mercaptoetanol, Sigma núm. M7522; factor de crecimiento del fibroblasto básico recombinante humano (bFGF), Gibco núm. 13256-029.
En una modalidad, las células madre embrionarias humanas se colocan en placas sobre un sustrato de cultivo adecuado que se trata antes del tratamiento de acuerdo con los métodos de la presente invención. En una modalidad, el tratamiento es un componente de la matriz extracelular, tal como, por ejemplo, los derivados provenientes de la membrana basal o aquellos que pueden formar parte de los acoplamientos receptor-ligando de las moléculas de adhesión. En una modalidad, el sustrato de cultivo adecuado es MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® es una preparación soluble de células tumorales de Engelbreth-Holm-Swarm que forman un gel a temperatura ambiente para formar una membrana de base reconstituida.
Otros componente de la matriz extracelular y mezclas de componentes son adecuados como alternativa. Éste puede incluir laminina, fibronectina, proteoglicano, entactina, sulfato de heparano y similares, solos o en combinaciones diversas.
Las células madre embrionarias humanas se colocan en placas sobre el sustrato en una distribución adecuada y en presencia de un medio que promueve la supervivencia, propagación y retención de las células con las características deseables. Todas estas características se benefician de la atención prestada en la distribución de sembrado y se puede determinar rápidamente mediante alguien con conocimiento en la materia.
Aislamiento, expansión y cultivo de las células que expresan marcadores de pluripotencia que se derivan de las células madre embrionarias humanas En una modalidad, las células que expresan marcadores pluripotenciales se derivan de células madre embrionarias humanas mediante un método que comprende las siguientes etapas: a. Cultivar las células madre embrionarias humanas, b. diferenciar las células madre embrionarias humanas en - células que expresan marcadores característicos de las células del endodermo definitivo y c. eliminar las células y, posteriormente, cultivar bajo condiciones hipóxicas, sobre un sustrato de cultivo de tejidos que no se trató previamente con una proteína o una matriz extracelular antes de cultivar las células.
En una modalidad, las células que expresan marcadores pluripotenciales se derivan de células madre embrionarias humanas mediante un método que comprende las siguientes etapas: a. Cultivar células madre embrionarias humanas y b. eliminar las células y, después, cultivarlas bajo condiciones hipóxicas, sobre un sustrato de cultivo de tejidos que no se trató previamente con una proteína o una matriz extracelular. Cultivo de las células bajo condiciones hipóxicas sobre un sustrato de cultivo de tejido que no es pre-tratado con una proteína o una matriz extracelular En una modalidad, las células se cultivan bajo condiciones hipóxicas, sobre un sustrato de cultivo de tejido que no es cubierto con una matriz extracelular por aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 días. En una modalidad alternativa, las células se cultivan bajo condiciones hipóxicas, sobre un sustrato de cultivo de tejido que no es cubierto con una matriz extracelular por aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 días. En una modalidad alternativa, las células se cultivan bajo condiciones hipóxicas, sobre un sustrato de cultivo de tejido que no es cubierto con una matriz extracelular por aproximadamente 15 días.
En una modalidad, la condición hipóxica es aproximadamente 1 % O2 hasta aproximadamente 20 % O2. En una modalidad alternativa, la condición hipóxica es aproximadamente 2 % O2 hasta aproximadamente 10 % 02. En una modalidad alternativa, la condición hipóxica es aproximadamente 3 % O2.
Las células se pueden cultivar, bajo condiciones hipóxicas, sobre un sustrato de cultivo de tejido que no es pre-tratado con una proteína o una matriz extracelular, en un medio que contiene suero, activina A, y un ligando Wnt. Alternativamente, el medio puede también contener IGF-1.
El medio de cultivo puede tener una concentración de suero en el intervalo de aproximadamente 2 % hasta aproximadamente 5 %. En una modalidad alternativa, la concentración de suero puede ser de aproximadamente 2 %.
La activina A se puede usar en una concentración de aproximadamente 1 pg/ml hasta aproximadamente 100 pg/ml. En una modalidad alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 1 pg/ml. En una modalidad alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 100 ng/ml. En una modalidad alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml. En otra modalidad alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 100 ng/ml.
El ligando Wnt se puede seleccionar del grupo que consiste de Wnt-1 , Wnt-3a, Wnt-5a y Wnt-7a. En una modalidad, el ligando Wnt es Wnt-1. En una modalidad alternativa, el ligando Wnt es Wnt-3a.
El ligando Wnt se puede usar a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml hasta aproximadamente 1000 ng/ml. En una modalidad alternativa, el ligando Wnt se puede usar a una concentración de aproximadamente 10 ng/ml hasta aproximadamente 100 ng/ml. En una modalidad, una concentración del ligando Wnt es aproximadamente 20 ng/ml.
IGF-1 se puede usar a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml hasta aproximadamente 100 ng/ml. En una modalidad alternativa, el IGF-1 se puede usar a una concentración de aproximadamente 10 ng/ml hasta aproximadamente 100 ng/ml. En una modalidad, la concentración de IGF-1 es aproximadamente 50 ng/ml.
Las células que expresan marcadores de pluripotencia derivadas de los métodos de la presente invención son capaces de la expansión en un cultivo bajo condiciones hipóxicas, sobre un sustrato de cultivo de tejido que no es pre-tratado con una proteína o una matriz extracelular.
Las células que expresan marcadores de pluripotencia derivadas de los métodos de la presente invención expresan al menos uno de los siguientes marcadores de pluripotencia seleccionados del grupo que consiste de: ABCG2, cripto, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60 y Tra1-81.
Diferenciación adicional de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático por cualquier método en la materia.
Por ejemplo, las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se pueden diferenciar en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y otros, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).
Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático, por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo con un factor de crecimiento de fibroblastos y KAAD-ciclopamina, después la eliminación del medio que contiene el factor de crecimiento de fibroblastos y la KAAD-ciclopamina y el cultivo posterior de las células en un medio que contiene ácido retinoico, un factor de crecimiento de fibroblastos y la KAAD-ciclopamina. Un ejemplo de este método se describe en D' Amour y otros, Nature Biotechnology, 24: 1392-1401 , (2006).
Los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se seleccionan del grupo que consiste de Pdx1 , HNF-1 beta, PTF1a, HNF-6, HB9.y PROX1. Para el uso de la invención, es adecuada una célula que expresa al menos uno de los marcadores características del linaje del endodermo pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático es una célula del endodermo pancreático.
Diferenciación adicional decélulas que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático por cualquier método en la materia.
Por ejemplo, las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se pueden diferenciar en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y otros, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).
Los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se seleccionan del grupo que consiste de NGN-3, NeuroD, lslet-1 , Pdx-1. NKX6.1 , Pax-4, NGN-3, y PTF-1 alfa. En una modalidad, una célula endocrina pancreática es capaz de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático. Para el uso de la invención es adecuada una célula que expresa al menos uno de los marcadores características del linaje endocrino pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático es una célula endocrina pancreática. La célula endocrina pancreática puede ser una célula que expresa la hormona pancreática. Alternativamente, la célula endocrina pancreática puede ser una célula que secreta hormona pancreática.
En un aspecto de la presente invención, la célula endocrina pancreática es una célula que expresa los marcadores característicos del ß linaje de la célula. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß expresa Pdx1 y al menos uno de los factores de transcripción siguientes: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1 , NeuroD, lsl-1 , HNF-3 beta, MAFA, Pax4 y Pax6. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje de la célula ß es una célula ß. La detección de las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo La formación de las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se puede determinar evaluando la presencia de los marcadores antes y después de seguir un protocolo específico. Las células madre pluripotentes generalmente no expresan tales marcadores. Por lo tanto, la diferenciación de las células pluripotentes se detecta cuando las células comienzan a expresarlos.
La eficiencia de la diferenciación se puede determinar exponiendo una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico expreso mediante células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.
Los métodos para evaluar la expresión de los marcadores de ácido proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estándares en la materia. Estos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa. (RT-PCR), membranas de Northern, hibridación in situ (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros, eds. suplemento 2001 )) e inmunoensayos, tales como análisis inmunohistoquímico de material seccionado, Western blot y para los marcadores accesibles en células intactas, análisis de citometría de flujo (FACS) (véase, por ejemplo, Harlow and Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Algunos ejemplos de anticuerpos útiles para detectar ciertos marcadores proteicos se enumeran en la Tabla IA. Debería considerarse que los anticuerpos alternativos dirigidos a los mismos marcadores que son reconocidos por los anticuerpos enumerados en la Tabla IA están disponibles, o se pueden desarrollar fácilmente. Tales anticuerpos alternativos además se pueden emplear para evaluar la expresión de los marcadores en las células aisladas de acuerdo con la presente invención.
Por ejemplo, las características de las células madre pluripotentes son famosas para aquellos con experiencia en la materia, y las características adicionales de las células madre pluripotentes continúan para ser identificadas. Los marcadores de las células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, la expresión de uno o más de los siguientes: ABCG2, cripto, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.
Después de tratar las células madre pluripotentes con los métodos de la presente invención, las células diferenciadas se pueden purificar mediante la exposición de una población de células tratadas en un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico, tal como CXCR4, expresado por células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.
Detección de células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático Los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático son famosos para aquellos con experiencia en la materia, y los marcadores característicos adicionales del linaje del endodermo pancreático continúan para ser identificadas. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que las células tratadas de acuerdo con la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje del endodermo pancreático. Los marcadores específicos del linaje del endodermo pancreático incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción tales como, por ejemplo, Hlxb9, PTF-1a, PDX-1 , HNF-6, HNF-1 beta.
La eficiencia de la diferenciación se puede determinar exponiendo una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico expresado por las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático.
Los métodos para evaluar la expresión de los marcadores de ácido proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estándares en la materia. Estos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa. (RT-PCR), membranas de Northern, hibridación in situ (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros, eds. suplemento 2001)) e inmunoensayos, tales como análisis inmunohistoquímico de material seccionado, Western blot y para los marcadores accesibles en células intactas, análisis de citometría de flujo (FACS) (véase, por ejemplo, Harlow and Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Algunos ejemplos de anticuerpos útiles para detectar ciertos marcadores proteicos se enumeran en la Tabla IA. Debería considerarse que los anticuerpos alternativos dirigidos a los mismos marcadores que son reconocidos por los anticuerpos enumerados en la Tabla IA están disponibles, o se pueden desarrollar fácilmente. Tales anticuerpos alternativos además se pueden emplear para evaluar la expresión de los marcadores en las células aisladas de acuerdo con la presente invención. Detección de células que expresan los marcadores característicos del linaje pancreático endocrino Los marcadores característicos del linaje pancreático endocrino son famosos para aquellos con experiencia en la materia, y los marcadores adicionales característicos del linaje pancreático endocrino continúan siendo identificados. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que las células tratadas de acuerdo con la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje pancreático endocrino. Los marcadores específicos del linaje pancreático endocrino incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción tales como, por ejemplo, NGN-3, NeuroD, lslet-1.
Los marcadores característicos de las células del ß linaje de células son famosos para aquellos con experiencia en la materia, y los marcadores adicionales característicos del ß linaje de células continúan siendo identificados. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que las células tratadas de acuerdo con la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje de células ß. Las características específicas del linaje de células ß incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción tales como, por ejemplo, Pdx1 (gen homebbox 1 pancreático y duodenal), Nkx2.2, Nkx6.1 , Isl1 , Pax6, Pax4, NeuroD, Hnflb, Hnf-6, Hnf-3beta, y MafA, entre otros. Estos factores de transcripción se establecen bien en la materia para la identificación de las células endocrinas. Ver, por ejemplo, Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002)).
La eficiencia de la diferenciación se puede determinar mediante la exposición de una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente a un marcador proteico expresado por células que expresan los marcadores característicos del linaje pancreático endocrino. Alternativamente, la eficiencia de la diferenciación se puede determinar mediante la exposición de una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente a un marcador proteico expresado por células que expresan los marcadores característicos del linaje ß de las células.
Los métodos para evaluar la expresión de los marcadores de ácido proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estándares en la materia. Estos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa de transchptasa inversa cuantitativa. (RT-PCR), membranas de Northern, hibridación in situ (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros, eds. suplemento 2001)) e inmunoensayos, tales como análisis inmunohistoquímico de material seccionado, Western blot y para los marcadores accesibles en células intactas, análisis de citometría de flujo (FACS) (véase, por ejemplo, Harlow and Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Algunos ejemplos de anticuerpos útiles para detectar ciertos marcadores proteicos se enumeran en la Tabla IA. Debería considerarse que los anticuerpos alternativos dirigidos a los mismos marcadores que son reconocidos por los anticuerpos enumerados en la Tabla IA están disponibles, o se pueden desarrollar fácilmente. Tales anticuerpos alternativos además se pueden emplear para evaluar la expresión de los marcadores en las células aisladas de acuerdo con la presente invención.
La presente invención se ilustra, pero no se limitada por los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1 Cultivo de células madre embrionarias humanas Las células madre son células indiferenciadas definidas por su capacidad a nivel de células únicas de autorrenovarse y diferenciarse para producir células progenitoras, que incluyen progenitoras que se autorrenuevan, progenitoras que no se renuevan y células diferenciadas de forma terminal. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de varios linajes celulares a partir de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como para dar lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante y contribuir sustancialmente a la mayoría, si no a todos, los tejidos después de la inyección dentro de los blastocistos.
Las líneas de células madre embrionarias humanas H1 , H7 y H9 se obtuvieron de WiCell Research Institute, Inc., (Madison, Wl) y se cultivaron de acuerdo con las instrucciones provistas por el instituto fuente. Brevemente, las células se cultivaron en células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) en medios celulares ES formados por DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO) complementado con 20 % suero de reemplazo, aminoácidos no esenciales MEM 100 nM MEM, 0.5 mM beta-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina con factor de crecimiento fibroblástico básico humano 4 ng/ml (bFGF) (todo de Invitrogen/GIBCO). Las células MEF derivadas de embriones de ratones E13 a 13.5, se compraron de Charles River. Las células MEF se expandieron en un medio DMEM complementado con 10 % FBS (Hyclone), 2 mM de glutamina y 100 mM MEM de aminoácidos no esenciales. Los cultivos subconfluentes celulares MEF se trataron con 10 mg/ml de mitomicina C (Sigma, St. Louis, MO) durante 3 horas para detener la división celular, luego se tripsinizaron y colocaron en placas de cultivo a 2x10 /cm2 en platos recubiertos de gelatina bovina al 0.1 %. Las células MEF del pase dos al cuatro se usaron como capas alimentadoras. Las células madre embrionarias humanas colocadas en placas de cultivo sobre capas alimentadoras de células MEF a 37 °C en una atmósfera del 5 % C02/ dentro de un incubador de cultivo de tejidos humidificado. Cuando fueron confluentes (aproximadamente de 5 a 7 días después de colocarlas en placas de cultivo), las células madre embrionarias humanas se trataron con colagenasa tipo IV 1 mg/ml (Invitrogen/GIBCO) durante 5 a 10 minutos y luego se raspó suavemente la superficie usando una pipeta de 5 mi. Las células se separaron a 900 rpm durante 5 minutos, y el sedimento se resuspendió y colocó nuevamente en placas de cultivo en relación 1 :3 a 1 :4 de células en medios de cultivo fresco.
En paralelo, las células madre embrionarias humanas H1 , H7, y H9 se sembraron también en placas recubiertas con una dilución 1:30 de MATRIGEL™ reducido en factor de crecimiento (BD Biosciences) y cultivadas en medio acondicionado MEM suplementado con 8 ng/ml bFGF. Las células cultivadas en MATRIGEL™ se pasaron de forma rutinaria con colagenasa IV (Invitrogen/GIBCO), dispasa (BD Biosciences) o enzima liberasa (Fuente). Algunos de los cultivos de células madre embrionarias humanas se incubaron bajo condiciones hipóxicas (aproximadamente 3 % O2).
Ejemplo 2 Derivación y Cultivo de las células que expresan marcadores de pluripotencia que se derivan de las células madre embrionarias humanas Las células de varios pases de la línea de células madre embrionarias humanas H1 y H9 (Pases 30-54) se cultivaron bajo condiciones hipóxicas (aproximadamente 3 % O2) por al menos tres pases. Las células se cultivaron en MEF-CM suplementado con 8 ng/ml de bFGF y se colocaron en placas recubiertas de MATRIGEL de conformidad con el Ejemplo 1.
Las células se trataron después con medio DMEM/F12 suplementado con 0.5 % FBS, 20 ng/ml WNT-3a (catálogo núm. 1324-WN-002, R&D Systems, MN), y 100 ng/ml Activina-A (R&D Systems, MN) por dos días, seguido por el tratamiento con medio DMEM/F12 suplementado con 2 % FBS y 100 ng/ml Activina-A (AA) por unos 3 a 4 días adicionales. Este protocolo resultó en una regulación ascendente significativa de los marcadores del endodermo definitivo.
Las células se trataron entonces con solución TrypLE™ Express (Invitrogen, CA) por 5 min. Las células liberadas se resuspendieron en medio DMEM-F12 + 2 % de SFB, se recuperaron mediante centrifugación y se recontaron con el uso de un hemocitómetro. Las células liberadas se sembraron a 1000-10000 células/cm2 en matraces tratados con poliestireno para cultivo de tejidos (TCPS) y se cultivaron en DMEM-F12 + 2 % FBS + 100 ng/ml activina-A + 20 ng/ml WNT-3A bajo condiciones hipóxicas (aproximadamente 3 % O2) a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos estándar. Los matraces de TCPS no se recubrieron con MATRIGEL u otras proteínas de matriz extracelular. Los medios se cambiaron diariamente. En algunos cultivos, el medio se suplementó, además, con 10-50 ng/ml de IGF-I (factor de crecimiento insulínico-l de R&D Systems, MN) o 1X ITS (Insulina, transferrina, y selenio de Invitrogen, Ca). En algunas de las condiciones de cultivo, el medio basal (DM-F12 + 2 % FBS) se suplementó, además, con 0.1 mM mercaptoetanol (Invitrogen, CA) y aminoácidos no esenciales (1X, NEAA de Invitrogen, CA).
Después de 5 a15 días de cultivo, distintas colonias de células aparecieron rodeadas de un gran número de células alargadas que parecían estar en senescencia. A aproximadamente 50 a 60 % de confluencia, los cultivos se pasaron por exposición a la solución TrypLE™ Express por 5 min. a temperatura ambiente. Las células liberadas se resuspendieron en medio DMEM-F12 + 2 % FBS, se recuperaron por centrifugación, y se sembraron a 10000 células/cm2 en matraces tratados con poliestireno para cultivo de tejidos (TCPS) en DMEM-F12 + 2 %FBS + 100 ng/ml activina-A + 20 ng/ml WNT-3A +/- 50 ng/ml de IGF-I. Este medio será denominado en lo adelante como "medio de crecimiento".
Ejemplo 3 Derivación de las células que expresan marcadores de pluripotencia a partir de una suspensión de célula simple de células madre embrionarias humanas Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 P33 y H9 P45 se cultivaron bajo condiciones hipóxicas (aproximadamente 3 % O2) por al menos tres pases. Las células se cultivaron en MEF-CM suplementado con 8 ng/ml de bFGF y se colocaron en placas recubiertas de MATRIGEL de conformidad con el Ejemplo 1. A aproximadamente 60 % de confluencia, los cultivos se expusieron a una solución TrypLE™ Express (Invitrogen, CA) por 5 min. Las células liberadas se resuspendieron en medio DMEM-F12 + 2 % de SFB, se recuperaron mediante centrifugación y se recontaron con el uso de un hemocitómetro. Las células liberadas se sembraron de 1000 a 10000 células/cm2 en matraces tratados con poliestireno para cultivo de tejidos (TCPS) y cultivadas en DM-F12 + 2 % FBS + 100 ng/ml activina-A + 20 ng/ml WNT-3A + 50 ng/ml de IGF-I + 0.1 mM mercaptoetanol (Invitrogen, CA) y aminoácidos no esenciales (1X, ????? de Invitrogen, CA) bajo condiciones hipóxicas (aproximadamente 3 % O2) a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos estándar Los matraces de TCPS no se recubrieron con MATRIGEL u otras proteínas de matriz extracelular. Los medios se cambiaron diariamente. Las primeras células de paso se denominan P1.
Ejemplo 4 Varios medio de crecimiento útiles para la expansión de las células que expresan marcadores de pluripotencia derivadas de células madre embrionarias humanas Las células que expresan marcadores de pluripotencia derivadas de células madre embrionarias humanas se cultivaron con éxito en las siguientes composiciones de medios por al menos 2-30 pases: 1. DM-F12 + 2 % FBS + 100 ng/ml AA + 20 ng/ml WNT-3A 2. DM-F 2 + 2 % SFB + 100 ng/ml AA + 20 ng/ml WNT-3A + 50 ng/ml IGF-I 3. DM-F12 + 2 % FBS + 100 ng/ml AA + 20 ng/ml WNT-3A + 10 ng/ml IGF-I 4. DM-F12 + 2 % FBS + 50 ng/ml AA + 20 ng/ml WNT-3A + 50 ng/ml IGF-I 5. DM-F12 + 2 % FBS + 50 ng/ml AA + 10 ng/ml WNT-3A + 50 ng/ml IGF-I 6. DM-F12 + 2 % FBS + 50 ng/ml AA + 20 ng/ml WNT-3A + 10 ng/ml IGF-I 7. DM-F12 + 2 % FBS + 100 ng/ml AA + 10 ng/ml WNT-3A + 10 ng/ml IGF-I 8. Medio HEScGRO definido (Chemicon, CA) El componente basal del medio antes mencionado se puede reemplazar con un medio similar tal como, RPMI, DMEM, CRml, Knockout™ DMEM, y F12.
Ejemplo 5 Efectos de los inhibidores de la actividad enzimática de GSK-33 en la viabilidad de las células que expresan marcadores de pluripotencia La derivación y mantenimiento de las células que expresan marcadores de pluripotencia se realizó como se describió en el Ejemplo 2. Las células se cultivaron en DMEM:F12 suplementado con 2 % FCS (Invitrogen), 100 ng/ml de Activina A, 20 ng/ml de Wnt-3a, y 50 ng/ml de IGF(R&D Biosystems). Las células se sembraron a una densidad de 10000 células/cm2 en matraces de' poliestireno Falcon y se cultivaron en un cultivo monocapa a 37 °C, 5 % CO2, bajo oxígeno. Después de alcanzar un 60-70 % de confluencia, las células se pasaron con lavado de la monocapa con PBS e incubación con TrypLE (Invitrogen) por 3-5 minutos para permitir el desprendimiento y la dispersión de células simples.
El tamizaje se realizó con el uso de compuestos de prueba de una genoteca registrada de pequeñas moléculas seleccionadas por su capacidad de inhibir la actividad de la enzima GSK-3B. Los compuestos de esta genoteca estuvieron disponibles como estirpes de 1 nriM, en un formato de placas de 96 pocilios en 50 mM de HEPES, 30 % de DMSO. Para el ensayo, las células que expresan marcadores de pluripotencia se lavaron, se contaron, se colocaron en placas en un medio de cultivo normal, a una densidad de siembra de 20000 células por pocilio en placas de 96 pocilios, con pocilios oscuros y fondo claro (Costar). Esta densidad de siembra se determinó previamente para producir la formación óptima de la monocapa en el cultivo durante la noche Al siguiente día, el medio de cultivo se eliminó, las monocapas de células se enjuagaron tres veces con PBS, y los compuestos de prueba se añadieron a los pocilios en alícuotas de 80 µ?, cada una diluida en el medio de ensayo a una concentración final del ensayo de 10 µ?. En el día 2 del ensayo, el medio se eliminó de cada pocilio y se reemplazó con una alícuota fresca de los compuestos de prueba diluidos en el medio de ensayo. El medio de ensayo en los días 1 y 2 del cultivo consistió de DMEM:F12 suplementado con 0.5 % FCS y 100 ng/ml Activina A. En los días 3 y 4 del cultivo, el medio se eliminó de cada pocilio y se reemplazó con DMEM:F12 suplementado con 2 % FCS y 100 ng/ml de Activina A (no hay compuesto de prueba). En el día 4 del ensayo, 15 mi de MTS (Promega) se añadieron a cada pocilio y las placas se incubaron a 37 X por 1.5 a 4 horas antes de leer la densidad óptica a 490 nm en un instrumento SpectraMax (Molecular Devices). Las medidas estadísticas consistente del promedio, la desviación estándar, y el coeficiente de variación se calcularon para cada conjunto duplicado. La toxicidad se calculó para cada pocilio de prueba en relación con el control positivo (pocilios tratados con Activina A y Wnt3a los días 1 y 2 del cultivo).
La Tabla II es una compilación de todos los resultados del tamizaje. Las células que expresan marcadores de pluripotencia se colocaron en placas inicialmente como una monocapa confluente en este ensayo; por lo tanto, los resultados son representativos de una medida de toxicidad durante el periodo de cultivo de cuatro días. Los resultados se expresaron como un porcentaje de la viabilidad del control, y demuestran la toxicidad variable para algunos compuestos a la concentración de tamizaje de 10 µ? usada. Una proporción de los compuestos tienen una toxicidad mínima o no medible en este ensayo de base celular.
Un panel pequeño de compuestos selectos se probó nuevamente en un intervalo de valoración de dosis estrecho, nuevamente mediante el uso de células que expresan marcadores de pluripotencia en un ensayo similar al descrito anteriormente. La Tabla III es un resumen de estos resultados, que demuestran efectos variables de la valoración de la dosis para un intervalo de compuestos tóxicos y no tóxicos.
Ejemplo 6 Efectos de los inhibidores de la actividad enzimática de GSK-3B en la diferenciación y proliferación de las células madre embrionarias humanas determinadas por medio del uso de un ensayo de tamizaje de alto contenido El mantenimiento de las células madre embrionarias humanas (línea H9) se realizó como se describió en el Ejemplo 1. Las colonias de células se mantuvieron en un estado pluripotente, indiferenciado con un promedio de pases cada cuatro días El pase se realizó con la exposición de cultivos celulares a una solución de colagenasa (1 mg/ml; Sigma-Aldrich) por 10 a 30 minutos a 37 °C seguida del raspado suave con la punta de una pipeta para recuperar los agregados celulares. Se esperó a que los agregados se sedimentaran por gravedad y después se lavaron para remover la colagenasa residual. Los agregados celulares se dividieron en una relación de 1 :3 para el mantenimiento rutinario del cultivo o una relación 1 :1 para el ensayo inmediato. Las líneas de células madre embrionarias humanas usadas se mantuvieron con número de pases menores que 50 pases y se evaluaron rutinariamente para el fenotipo cariotípico normal y ausencia de contaminación con micoplasma.
Los agregados celulares que se usaron en el ensayo se resuspendieron uniformemente en un medio de cultivo normal y se colocaron en placas de 96 pocilios recubiertas con MATRIGEL Packard VIEWPLATES (PerkinElmer) en volúmenes de 100 µ? /pocilio El medio condicionado MEF suplementado con 8 ng/ml de bFGF se utilizó para la siembra inicial y la recuperación. El suministro diario se realizó mediante aspiración del medio de cultivo usado para cada pocilio y el reemplazo con el mismo volumen de medio fresco. Las placas se mantuvieron a 37 °C, 5 % CO2 en una caja humidificada durante todo el tiempo del ensayo.
El tamizaje se realizó con el uso de compuestos de prueba de una genoteca registrada de pequeñas moléculas seleccionadas por su capacidad de inhibir la actividad de la enzima GSK-3B. Los compuestos de esta genoteca estuvieron disponibles como estirpes de 1 mM, en un formato de placas de 96 pocilios en 50 mM de HEPES, 30 % de DMSO. Los compuestos de tamizaje se probaron en conjuntos triplicados o duplicados. Los ensayos de tamizaje primario se iniciaron con la aspiración del medio de cultivo para cada pocilio seguida por tres lavados en PBS para eliminar los factores de crecimiento y el suero residual. Se añadieron volúmenes de prueba de 80 a 100 pl por pocilio que contenían medio base DMEM:F12 (Invitrogen) suplementado con 0.5 % FCS (HyClone) y 100 ng/ml activina A (R&D Biosystems) más 10 µ? del compuesto de prueba. Los pocilios de control positivo contenían el mismo medio base, con la sustitución de 10-20 ng/ml Wnt3a (R&D Biosystems) por el compuesto de prueba. Los pocilios de control negativo contenían medio base con 0.5 % FCS y activina A sola (AA solamente) o alternativamente, 0.5 % FCS sin activina A o Wnt3a (sin tratamiento). Los pocilios se aspiraron y se alimentaron nuevamente con soluciones idénticas el día 2 del ensayo. En los días 3 y 4, todos los pocilios de ensayo se aspiraron y se convirtieron con DMEM:F12 suplementado con 2 % FCS y 100 ng/ml de activina A (sin el compuesto de prueba ni Wnt3a); Los pocilios de control negativo en paralelo se mantuvieron en medio base DMEM:F12 con 2 % FCS y activina A (AA solamente) o alternativamente, 2 % FCS sin activina A (sin tratamiento).
Al final del cultivo, las células en placas de 96 pocilios se fijaron con 4 % paraformaldehído a temperatura ambiente por 20 minutos, se lavaron tres veces con PBS, y después se permeabilizaron con 0.5 % Tritón X-100 por 20 minutos a temperatura ambiente. Alternativamente, las células se fijaron con 70 % etanol frío en hielo toda la noche a -20 °C, lavadas tres veces con PBS, y después se permeabilizaron con Tritón X-100 por 5 minutos a 4 °C. Después de fijadas y permeabilizarlas, las células se lavaron nuevamente tres veces con PBS y se bloquearon después con 4 % de suero de gallina (Invitrogen) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios (cabra anti-Sox17 humano y cabra anti-HNF-3beta humano; R&D Systems) se diluyeron 1 :100 en 4 % suero de gallina y se añadieron a las células por una hora a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario combinado Alexa Fluor 488 (IgG anti-cabra de pollo; sondas moleculares) se diluyó a 1 :200 en PBS y se agregó después de lavar las células tres veces con PBS. Para el teñido secundario de los núcleos, se añadieron 5 mM Draq5 (Alexis Biochemicals) por cinco minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez con PBS y se dejaron en 100 ml/pocillo de PBS para la obtención de imágenes.
Se obtuvieron imágenes de las células con un IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) con el uso de dicroico 51008bs para células teñidas con Draq5 y Alexa Fluor 488. Los tiempos de exposición se optimizaron por medio del uso de pocilios de control positivo y con solamente pocilios secundarios para los controles negativos no tratados. Se obtuvieron doce campos por pocilio para compensar cualquier pérdida de células durante los procedimientos de teñido y tratamiento. El número de células totales y la intensidad celular total para Sox-17 y HNF-3beta se midieron por medio del uso del programa IN Cell Developer Toolbox 1.6 (GE Healthcare). La segmentación de los núcleos se determinó en base a los niveles en la escala de grises (valores iniciales en el intervalo de 100-300) y el tamaño nuclear. Los promedios y desviaciones estándares se calcularon para las réplicas. La expresión total de la proteina se reportó como la intensidad total o intensidad integrada, que se define como la fluorescencia total de la célula por el área de la célula. El fondo se eliminó en base a los criterios de aceptación de los intervalos en la escala de grises entre 300 y 3000 y de los factores de forma mayores o iguales que 0.4. Los datos de intensidad total se normalizaron dividiendo las intensidades totales de cada pocilio dentro de la intensidad total promedio para el control positivo Wnt3a/Activina A. Los datos normalizados se calcularon para los promedios y las desviaciones estándares para cada grupo de réplicas.
La Tabla IV es un resumen representativo de todos los resultados del tamizaje. La Tabla V es una lista de los aciertos de este tamizaje. Los aciertos fuertes se definen como mayores o iguales que 120 % de los valores de control; Los aciertos moderados se definen por estar en el intervalo de 60-120 % de los valores de control. Un número significativo de compuestos indujeron una respuesta proliferativa en este ensayo. En paralelo, un número significativo de compuesto indujeron la diferenciación en este ensayo, según se midió por la expresión de la proteina de los factores de transcripción Sox17 y Hnf-3b.
Ejemplo 7 Efectos de los inhibidores de la actividad enzimática de GSK-3 ß en la proliferación de células madre embrionarias humanas determinados por medio del uso de un ensayo Píate Reader El mantenimiento de las células madre embrionarias humanas (líneas H9 o H1) se realizó como se describió en el Ejemplo 1. Las colonias de células se mantuvieron en un estado pluripotente, indiferenciado con un promedio de pases cada cuatro días El paso se realizó con la exposición de cultivos celulares a una solución de colagenasa (1 mg/ml; Sigma-Aldrich) por 10 a 30 minutos a 37 °C seguida del raspado suave con la punta de una pipeta para recuperar los agregados celulares. Los agregados se dejaron sedimentar y se lavaron para eliminar la colagenasa residual. Los agregados celulares se dividieron en una relación de 1:3 área de la monocapa para el cultivo de rutina o una relación 1 :1 para el ensayo inmediato. Las líneas de células madre embrionarias humanas usadas para estos ejemplos se mantuvieron con números de pases menores que 50 y se evaluaron rutinariamente para fenotipo cariotípico normal así como la ausencia de contaminación por micoplasma.
Los agregados celulares que se usaron en el ensayo se resuspendieron uniformemente en medio de cultivo normal y se colocaron en placas de 96 pocilios recubiertas con MATRIGEL Packard VIEWPLATES (PerkinElmer) en volúmenes de 100 µ?/pocillo. El medio condicionado MEF suplementado con 8 ng/ml de bFGF se utilizó para la siembra inicial y la recuperación. El suministro diario se realizó mediante aspiración del medio de cultivo usado para cada pocilio y el reemplazo con el mismo volumen de medio fresco. Las placas se mantuvieron a 37 °C en una caja humidificada, 5 % CO2 durante todo el tiempo del ensayo.
Los ensayos de tamizaje primario se iniciaron con la aspiración del medio de cultivo para cada pocilio seguida por tres lavados en PBS para eliminar los factores de crecimiento y el suero residual. Los volúmenes de prueba de 80-100 µ? por pocilio se añadieron otra vez, y contenían medio base DMEM.F12 (Invitrogen) suplementado con 0.5 % FCS (HyClone) y 100 ng/ml activina A (R&D Biosystems) y 10 µ? del compuesto de prueba. Los pocilios de control positivo contenían el mismo medio con la sustitución de 10-20 ng/ml Wnt3a (R&D Biosystems). Los pocilios de control negativo contenían medio base con 0.5 % FCS sin activina A o Wnt3a. Los compuestos de tamizaje se probaron en triplicado. Los pocilios se aspiraron y se alimentaron nuevamente con soluciones idénticas el día 2 del ensayo. Los días 3 y 4, todos los pocilios de ensayo se aspiraron y convirtieron a DMEM.F12 suplementado con 2 % FCS y 100 ng/ml activina A con la excepción de los pocilios de control negativo que se mantuvieron en medio base DMEM:F12 con 2 % FCS.
El día 4 del ensayo, se añadieron a cada pocilio 15-20 µ? de MTS (Promega) y las placas se incubaron a 37 °C por 1.5 a 4 horas. Las lecturas densitométricas a OD490 se determinaron por medio del uso de un lector de placas con espectrofotómetro de Molecular Devices. Las lecturas promedio para los conjuntos de réplica se calcularon conjuntamente con la desviación estándar y el coeficiente de variación. Los pocilios experimentales se compararon con el control positivo Activina A/Wnt3a para calcular un valor control en por ciento como una medida de la proliferación.
La Tabla VI es un resumen representativo de todos los resultados del tamizaje. La Tabla VII es una lista de los aciertos de este tamizaje. Los aciertos fuertes se definen como mayores o iguales que 120 % de los valores de control; Los aciertos moderados se definen por estar en el intervalo de 60-120 % de los valores de control. Un número significativo de compuesto indujeron una respuesta proliferativa en este ensayo.
Ejemplo 8 Efectos de inhibidores de la enzima GSK-3B sobre la diferenciación v proliferación de células madre embrionarias humanas: Valoración de la dosis de los compuestos guía Fue importante confirmar la actividad de los aciertos identificados a partir del tamizaje primario y el análisis posterior del intervalo de actividad por valoración de la dosis. Nuevas muestras de un conjunto selectivo de los aciertos del tamizaje primario se obtuvieron como polvos secos, se solubilizaron para preparar reactivos madre frescos, y se diluyeron en ensayos de confirmación secundarios para evaluar los efectos en las células madre embrionarias humanas.
El cultivo de des células madre embrionarias humanas (H1 y H9) se realizó como se describió en el Ejemplo 1. Las colonias de células se mantuvieron en un estado indiferenciado, pluripotente en plástico de poliestireno recubierto con Matrigel™ (Invitrogen), por medio del uso de una dilución 1 :30 de Matrigel™ en DMEM:F12 para recubrir la superficie. Las células se dividieron por pases enzimáticos cada cuatro días como promedio. El pase se realizó con la exposición de las monocapas de células a una solución de colagenasa (1 mg/ml; Sigma-Aldrich) por 10 a 60 minutos a 37 °C seguida del raspado suave con la punta de una pipeta para recuperar los agregados celulares. Los agregados se dejaron sedimentar por gravedad y después se lavaron para eliminar la colagenasa residual. Los agregados celulares se dividieron en una relación de 1 :3 para el mantenimiento rutinario del cultivo o una relación 1 : 1 para el ensayo posterior. Las líneas de células madre embrionarias humanas se mantuvieron con menos de 50 pases y se evaluaron rutinariamente para el fenotipo cariotípico normal y ausencia de contaminación con micoplasma.
Preparación de células para ensayo: Los agregados celulares de las líneas H1 o H9 de células madre embrionarias humanas usadas en el ensayo se resuspendieron uniformemente en el medio de cultivo y se colocaron en placas de 96 pocilios recubiertas con Matrigel™ Packard VIEWPLATES (PerkinElmer) en volúmenes de 100 µ?/pocillo. El medio condicionado MEF suplementado con 8 ng/ml de bFGF se utilizó para la siembra inicial y la expansión. El suministro diario se realizó mediante aspiración del medio de cultivo usado para cada pocilio y el reemplazo con el mismo volumen de medio fresco. Se permitió que los cultivos se expandieran por uno a tres días después de colocarlos en las placas antes del ensayo inicial. Las placas se mantuvieron a 37 °C, 5 % C02 en una caja humidificada durante todo el tiempo del ensayo.
Preparación de compuestos y medio de ensayo: Un subconjunto de aciertos resultante . del tamizaje primario se usó para los estudios de seguimiento y los ensayos secundarios posteriores. Veinte compuestos disponibles como polvos secos se solubilizaron como 10 mM de soluciones madre en DMSO y se almacenaron deshidratados a -20 °C hasta su uso. Inmediatamente antes del ensayo, las reservas del compuesto se diluyeron 1 :1000 para preparar 10 µ? del compuesto de prueba en medio base DMEM:F12 (Invitrogen) suplementado con 0.5 % FCS (HyClone) y 100 ng/ml Activina A (R&D Biosystems). Esto se diluyó después dos veces en serie para obtener una curva de dilución de siete puntos para cada compuesto, también en medio base DMEM:F12 con 0.5 % FCS y 100 ng/ml Activina A.
Ensayo de tamizaje secundario: El ensayo se inició al aspirar el medio de cultivo de las monocapas de células en cada pocilio seguido por tres lavados en PBS para eliminar los factores de crecimiento y suero residuales. Los volúmenes de prueba de 100 µ? por pocilio se añadieron otra vez y contenían el medio con 0.5 % FCS y diferentes cpncentraciones de los compuestos inhibidores con 100 ng/ml Activina A, sin Wnt3a. Los pocilios de control positivo contenían el mismo medio base con 0.5 % FCS y con 20 ng/ml Wnt3a (R&D Biosystems) en ausencia del compuesto de prueba. Los pocilios de control negativo contenían el mismo medio base con 0.5 % de FCS, sin Activina A, Wnt3a ni compuesto de prueba. Los pocilios de ensayo se aspiraron y se alimentaron nuevamente con concentraciones idénticas del compuesto de prueba o con soluciones de control el día 2 del ensayo. En los días 3 y 4 todos los pocilios para ensayo se aspiraron y se alimentaron con DMEM:F12 suplementado con 2 % de FCS y 100 ng/ml de Activina A sin compuesto de prueba ni Wnt3a. Los pocilios de control negativo en paralelo se mantuvieron los días 3 y 4 en medio base DMEM:F12 con 2 % de FCS.
Evaluación del ensayo: Al final del cultivo, las células en placas de 96 pocilios se lavaron dos veces con PBS después se arreglaron con 4 % de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 20 minutos, se lavaron tres veces más con PBS y después se permeabilizaron con 0.5 % de Tritón X-100 durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de fijarlas y permeabilizarlas, las células se lavaron nuevamente tres veces con PBS y se bloquearon después con 4 % de suero de gallina (Invitrogen) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios (cabra anti-Sox17 humano; R&D Systems) se diluyeron 1 :100 en 4 % suero de gallina y se añadieron a las células por una hora a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario combinado Alexa Fluor 488 (IgG anti-cabra de pollo; sondas moleculares) se diluyó a 1 :200 en PBS y se agregó a cada pocilio después de lavar las células tres veces con PBS. A los núcleos marcados por contracoloración, se les agregó 2 pg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen) durante diez minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez con PBS y se dejaron en 100 µ?/pocillo de PBS para la obtención de imágenes.
Se obtuvieron imágenes de las células con un IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) con el uso de dicroico 51008 bs para células teñidas con Hoechst 33342 y Alexa Fluor 488. Los tiempos de exposición se optimizaron por medio del uso de pocilios de control positivo y pocilios teñidos con el anticuerpo secundario solo como un control negativo no tratado. Las imágenes desde 15 campos por pocilio se obtuvieron para compensar cualquier pérdida celular durante el tratamiento y los procedimientos de tinción. Las mediciones para la cantidad total de células y la intensidad total de Sox-17 se obtuvieron para cada pocilio con el uso del programa IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). La segmentación de los núcleos se determinó en base a los niveles en la escala de grises (valores iniciales en el intervalo de 100-300) y el tamaño nuclear. Los promedios y las desviaciones estándar se calcularon para cada grupo de datos de réplicas. La expresión total de la proteína Sox17 se reportó como la intensidad total o intensidad integrada, que se define como la fluorescencia total de la célula por el área de la célula. El fondo se eliminó en base a los criterios de aceptación de los intervalos en la escala de grises entre 300 y 3000 y de los factores de forma mayores o iguales que 0.4. Los datos de intensidad total se normalizaron dividiendo las intensidades totales de cada pocilio dentro de la intensidad total promedio para el control positivo Wnt3a/Activina A. Los datos normalizados se calcularon para los promedios y las desviaciones estándar para cada grupo de réplicas.
Resultados Los resultados se mostraron para ocho inhibidores de la enzima GSK-3B donde se confirmó la actividad y se determinó la potencia por valoración en este ensayo secundario. Los datos presentados muestran los efectos del compuesto en el número de células y la intensidad de Sox17 donde los puntos de los datos respectivos se promediaron de un conjunto duplicado y se extrajeron para cada parámetro de pocilios y campos idénticos. En este ejemplo, la expresión de Sox17 es indicativa de la diferenciación del endodermo definitivo. Los resultados para el número de células y la intensidad de Sox17, respectivamente, por medio del uso de la línea de células madre embrionarias humana H1 se muestran en las Tablas VIII y IX. Los resultados para la línea de células madre embrionarias humana H9 se muestran en las Tablas X y XI. Los valores de control positivo se normalizaron a 1000 para el número de células y la intensidad de Sox17. Los valores de control negativo fueron menores que 0.388 para el número de células y menores que 0.065 para la intensidad de Sox17 con ambas líneas celulares. Una representación gráfica de estos datos, que compara ambas líneas de células madre embrionarias humanas y que incluye una valoración de la dosis de cada compuesto, se proporciona en las Figuras 1A a 8B. El número de células se presenta en las figuras 1A-8A; La intensidad de Sox 17 se muestra en las figuras 1 B-8B. Estos datos confirman que cada compuesto puede estimular la proliferación de células hES y la diferenciación del endodermo definitivo e identificar un intervalo de actividad.
Ejemplo 9 Efectos de los inhibidores de la enzima GSK-33 en la expresión de marcadores adicionales asociados con el endodermo definitivo Fue importante demostrar que los compuestos guia también pueden inducir otros marcadores indicativos de diferenciación del endodermo definitivo, además del factor de transcripción Sox17. Un subconjunto selecto de aciertos se trató para su capacidad para estimular la expresión de CXCR4, una proteína receptora de superficie, y HNF-3 beta, un factor de transcripción también asociado con la diferenciación del endodermo definitivo.
Preparación de células para ensayo: Los agregados celulares de la línea de células madre embrionarias humanas H1 usados en el ensayo se resuspendieron uniformemente en el medio de cultivo y se colocaron en placas de 96 pocilios recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1 :30) (Corning) en volúmenes de 2 ml/pocillo. El medio condicionado MEF suplementado con 8 ng/ml de bFGF se utilizó para la siembra inicial y la expansión. El suministro, diario se realizó mediante aspiración del medio de cultivo usado para cada pocilio y el reemplazo con el mismo volumen de medio fresco. Se permitió que los cultivos se expandieran por uno a tres días después de colocarlos en las placas antes del ensayo inicial. Las placas se mantuvieron a 37 °C, con 5 % de C02 a lo largo del ensayo.
Preparación de los compuestos y el medio de ensayo: Un subconjunto de siete aciertos resultantes del tamizaje primario se usó para el estudio de seguimiento y los ensayos secundarios posteriores. Los compuestos puros se solubilizaron como estirpes de 10 mM en DMSO y se almacenaron desecados a -20 °C hasta usarlos. Inmediatamente antes del ensayo, las soluciones madre del compuesto se diluyeron hasta una concentración final en el intervalo entre 1 µ? y 5 µ? en medio base DMEM:F12 (Invitrogen) suplementado con 0.5 % FCS (HyClone) y 100 ng/ml Activina A (R&D Biosystems).
Ensayo: El ensayo se inició al aspirar el medio de cultivo de las monocapas de células en cada pocilio seguido por tres lavados en PBS para eliminar los factores de crecimiento y suero residuales. Los volúmenes de prueba de 2 mi por pocilio se añadieron otra vez y contenían el medio con 0.5 % FCS y diferentes concentraciones de los compuestos inhibidores con 100 ng/ml Activina A, sin Wnt3a. Los pocilios de control positivo contenían el mismo medio base y 0.5 % de FCS con 100 ng/ml de Activina A y 20 ng/ml de Wnt3a (R&D Biosystems) sin compuesto de prueba. Los pocilios de control negativo contenían el medio base con 0.5 % de FCS, sin Activina A, Wnt3a ni compuesto de prueba. Los pocilios de ensayo se aspiraron y se alimentaron nuevamente con concentraciones idénticas del compuesto de prueba o con soluciones de control el día 2 del ensayo. En los días 3 y 4 todos los pocilios para ensayo se aspiraron y se alimentaron con DMEM:F12 suplementado con 2 % de FCS y 100 ng/ml de Activina A sin compuesto de prueba ni Wnt3a. Los pocilios de control negativo en paralelo se mantuvieron los días 3 y 4 en medio base DMEM:F12 con 2 % de FCS.
Evaluación del ensayo: Al final del cultivo, las monocapas de células se lavaron con PBS y se cosecharon de las placas de cultivo mediante la incubación por 5 minutos con solución TrypLE™ Express (Invitrogen, CA). Las células se resuspendieron en un medio acondicionado MEF y se dividieron en dos muestras iguales. Un conjunto de muestras se tiñó adicionalmente con varios anticuerpos fluorescentes marcados y sometido a análisis por citometría de flujo (FACS). Un segundo conjunto en paralelo de muestras se sometió a PCR cuantitativa.
Las células para el análisis FACS se lavaron en PBS y se bloquearon por 15 minutos a 4 °C en 0. 125 % gammaglobulina humana (Sigma cat. núm. G-4386) diluida en amortiguador de tinción PBS y BD FACS. Las alícuotas de las células (aproximadamente 105 célula cada una) se tiñeron por 30 minutos a 4 °C con los anticuerpos directamente conjugados para una etiqueta fluorescente y con especificidad para CD9 PE (BD núm. 555372), CD99 PE (cat. núm. MHCD9904), o CXCR-4 APC (R&D Systems cat. núm. FAB173A). Después de una serie de lavados en amortiguador de tinción BD FACS, las células se tiñeron con 7-AAD (BD núm. 559925) para evaluar la viabilidad y se analizaron en un instrumento BD FACS Array (BD Biosciences), y se recogieron al menos 10000 eventos. Los anticuerpos de control del isotipo de IgGik de ratón para PE y APC se usaron recaudar el porcentaje de células positivas.
Las células para PCR cuantitativo se procesaron para la extracción de ARN, purificación y síntesis de ADNc. Las muestras de ARN se purificaron al unirlas a una membrana de gel de sílice (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA) en presencia de un regulador rico en sales que contiene etanol seguido del lavado para eliminar los contaminantes El ARN se purificó, además, por medio del uso de un kit libre de ADN TURBO (Ambion, Inc), y el ARN de alta calidad se eluyó en agua La producción y pureza se evaluaron mediante las lecturas A260 y A280 en un espectrofotómetro. Las copias de cDNA se elaboraron de RNA purificado con el uso de un kit de archivo de cDNA de alta capacidad de Applied Bíosystems, Inc. (ABI, CA).
A menos que se indicara de otra manera, todos los reactivos para la amplificación y cuantificación de PCR en tiempo real se obtuvieron de ABI. Las reacciones de PCR en tiempo real se llevaron a cabo con el uso del sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7900. Se usó TAQMAN UNIVERSAL PCR MASTER MIX (ABI, CA) con 20 ng de ARN transcrito inverso en un volumen total de reacción de 20 µ?. Cada muestra de cDNA se corrió por duplicado para corregir errores de pipeteado. Los cebadores y las sondas TAQMAN etiquetadas con FAM se usaron a concentraciones de 200 nm. El nivel de expresión para cada gen objetivo se normalizó con un control endógeno humano de gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa (GAPDH) previamente desarrollado por ABI. Los grupos de cebadores y sondas se enumeran de la siguiente manera: CXCR4 (Hs00237052), GAPDH (4310884E), HNF3b (Hs00232764), SOX17 (parte de la sonda núm. 450025, partes sentido e inversa núm. 4304971).
Después de una incubación inicial a 50 °C por 2 min seguido por 95 °C por 10 min, las muestras se ciclaron 40 veces en dos etapas, una etapa de desnaturalización a 95 °C por 15 seg. seguido por una etapa hibridación/extensión a 60 °C por 1 min. El análisis de los datos se llevó a cabo por medio del uso del programa Sistema de Detección de Secuencias GENEAMP 7000. Para cada grupo de iniciadores/sondas se determinó un valor CT como el número de ciclo en el que la intensidad de la fluorescencia alcanzó un valor específico en el medio de la región exponencial de amplificación. Los niveles de expresión génica relativa se calcularon usando el método comparativo Ct. En resumen, para cada muestra de cDNA, el valor CT del control endógeno se sustrajo del CT del gen de interés para dar el valor delta Ct (ACt). La cantidad normalizada del objetivo se calculó como 2-ACt, asumiendo que la amplificación tiene una eficacia del 100 %. Los datos finales se expresaron en relación a una muestra de calibración.
Resultados La Figura 9 exhibe el análisis FACS del porcentaje de células positivas que expresan el receptor superficial CXCR4 después del tratamiento con varios inhibidores de GSK3. Dos concentraciones de cada compuesto, que se encuentran en el intervalo entre 1 µ? y 5 µ?, se muestran en relación con una población de células no tratadas (control negativo) o células tratadas con Activina A y Wnt3 (control positivo). Las Figuras 10A-10C muestran datos de PCR en tiempo real para CXCR4, Sox17, y HNF3beta, que también se consideran como marcadores del endodermo definitivo. Ambos análisis, FACS y PCR en tiempo real, demuestran un crecimiento significativo en cada uno de estos marcadores observados en células diferenciadas en relación con células control no tratadas. Los niveles de expresión de estos marcadores del endodermo definitivo fueron equivalentes en algunos casos al control positivo, lo que demuestra que un inhibidor de GSK3 puede sustituirse por Wnt3a en esta etapa de la diferenciación.
Ejemplo 10 Efectos de los inhibidores de la enzima GSK-33 en la formación del endodermo pancreático Fue importante demostrar que el tratamiento con los inhibidores de GSK3P durante la inducción del endodermo definitivo no previno la diferenciación posterior de los tipos de células, tales como endodermo pancreático, por ejemplo. Un subconjunto selecto de aciertos se trató para su capacidad para estimular la expresión de PDX1 y HNF6, factores de transcripción claves asociados con el endodermo pancreático.
El mantenimiento de las células madre embrionarias humanas (lineas H9 y H1) se realizó como se describió en el Ejemplo 1. Las colonias de células se mantuvieron en un estado pluripotente, indiferenciado con un promedio de pases cada cuatro días. El paso se realizó con la exposición de cultivos celulares a una solución de colagenasa (1 mg/ml; Sigma-Aldrich) por 10 a 30 minutos a 37 °C seguida del raspado suave con la punta de una pipeta para recuperar los agregados celulares. Se esperó a que los agregados se sedimentaran por gravedad y después se lavaron para remover la colagenasa residual. Los agregados celulares se dividieron en una relación de 1 :3 para el mantenimiento rutinario del cultivo o una relación 1 :1 para el ensayo posterior. Las líneas de células madre embrionarias humanas que se usáronse mantuvieron con menos de 50 pases y se evaluaron rutinariamente para el fenotipo cariotípico normal y ausencia de contaminación con micoplasma.
Preparación de las células del ensayo: Los agregados celulares de la línea de células madre embrionarias humanas H1 usadas en el ensayo se resuspendieron uniformemente en el medio de cultivo y se colocaron en placas en placas de 24 pocilios recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1 :30) (pocilios negros; Arctic White) en volúmenes de 1 ml/pocillo. El medio condicionado MEF suplementado con 8 ng/ml de bFGF se utilizó para la siembra inicial y la expansión. En un segundo experimento, los aglomerados de células hES de la línea H9 se colocaron en placas de 96 pocilios en capas alimentadoras embrionarias de ratón (MEF), previamente ¡nactivadas por el tratamiento con mitomicina C (Sigma Chemical Co). El medio de cultivo para las células hES en las monocapas MEF consistió de DMEM:F12 con 20 % de suero sustituto Knockout (Invitrogen) suplementado con aminoácidos esenciales mínimos (Invitrogen), L-glutamina, y 2-mercaptoetanol. El suministro diario se realizó mediante aspiración del medio de cultivo usado para cada pocilio y el reemplazo con el mismo volumen de medio fresco. Se permitió que los cultivos se expandieran por uno a tres días después de colocarlos en las placas antes del ensayo inicial. Las placas se mantuvieron a 37 °C, con 5 % de CO2 a lo largo del ensayo.
Preparación de los compuestos y el medio de ensayo: Un subconjunto de ocho aciertos resultantes del tamizaje primario se usó para el estudio de seguimiento y los ensayos secundarios posteriores. Los compuestos puros se solubilizaron como estirpes de 10 mM en DMSO y se almacenaron desecados a -20 °C hasta usarlos. Inmediatamente antes del ensayo, las soluciones madre de los compuestos se diluyeron hasta una concentración final en el intervalo entre 1 µ? y 5 µ? en medio base con aditivos.
Ensayo: En este ensayo, los inhibidores GSK3 se incluyeron solamente los días 1 y 2 de la etapa de diferenciación del endodermo definitivo, con la sustitución por Wnt3a. Los cultivos de células madre embrionarias en MATRIGEL™ se iniciaron como se describió en los Ejemplos 8 y 9 anteriores por la aspiración del medio de cultivo de las monocapas de células en cada pocilio, seguido por tres lavados en PBS para eliminar los factores de crecimiento y el suero. Para la diferenciación a endodermo definitivo, volúmenes de prueba (0.5 mi por pocilio para placas de 24 pocilios, 100 µ? por pocilio para placas de 96 pocilios) se añadieron y contenían medio DMEM:F12 con 0.5 % FCS) y diferentes concentraciones de los compuestos inhibidores con 100 ng/ml Activina A, sin Wnt3a. Los pocilios de control positivo contenían el mismo medio base con 0.5 % FCS y con 100 ng/ml Activina A y 20 ng/ml Wnt3a (R&D Biosystems) en ausencia del compuesto de prueba. Los pocilios de control negativo contenían el mismo medio base con 0.5 % de FCS, sin Activina A, Wnt3a ni compuesto de prueba. Los pocilios de ensayo se aspiraron y se alimentaron nuevamente con concentraciones idénticas del compuesto de prueba o con soluciones de control el día 2 del ensayo. En los días 3 y 4 todos los pocilios para ensayo se aspiraron y se alimentaron con DMEM:F12 suplementado con 2 % de FCS y 100 ng/ml de Activina A sin compuesto de prueba ni Wnt3a. Los pocilios de control negativo en paralelo se mantuvieron los días 3 y 4 en medio base DMEM:F12 con 2 % de FCS. Para la diferenciación para el endodermo pancreático, las células se trataron durante tres días, con el suministro diario del medio base DMEM:F12 que contiene 2 % de FCS con 0.25 µ? KAAD de ciclopamina (EMD Biosciences) y 20 ng/ml de FGF7 (R&D Biosystems). Posteriormente, las células se trataron por cuatro días adicionales, suministrando diariamente DMEM:F12 que contenía 1 % B27 (Invitrogen), 0.25 µ? KAAD ciclopamina, 2 µ? ácido retinoico (RA; Sigma-Aldrich) y 20 ng/ml de FGF7. Los pocilios de control negativo paralelos se mantuvieron todo el tiempo en medio base DMEM:F12 con 2 % FCS (etapa 2) o 1 % B27 (etapa 3) y sin ningún otro aditivo.
Cultivos paralelos de células embrionarias humanas H9 crecieron en capas alimentadoras MEF, y se diferenciaron a endodermo pancreático. La diferenciación del endodermo definitivo se alcanzó por medio del cultivo de las células en un medio consistente de RPMI-1640 (Invitrogen) que no contenía suero el día 1 y 0.2 % FCS los días 2 y 3 junto con concentraciones diferentes de los compuestos inhibidores y 100 ng/ml Activina A. Los pocilios de control positivo contenían el mismo medio base (con o sin suero) con 100 ng/ml Activina A y 20 ng/ml Wnt3a (R&D Biosystems) en ausencia del compuesto de prueba. Los pocilios de control negativo contenían el mismo medio base con o sin suero, en ausencia de Activina A, Wnt3a, o compuesto de prueba. Los pocilios de ensayo se aspiraron y se alimentaron nuevamente con concentraciones idénticas del compuesto de prueba o con soluciones de control el día 2 del ensayo. El día 3, todos los pocilios de ensayo se aspiraron y se alimentaron con RPMI-1640 suplementado con 2 % FCS y 100 ng/ml Activina A en ausencia del compuesto de prueba y Wnt3a. Los pocilios de control negativo en paralelo se mantuvieron el día 3 en medio base RPMI-1640 con 2 % FCS. Las células se diferenciaron en endodermo pancreático mediante el tratamiento de las células por cuatro días con alimentación diaria con medio base RPMI-1640 que contenía 2 % FCS con 0.25 mM KAAD ciclopamina (EMD Biosciences) y 50 ng/ml FGF10 (R&D Biosystems). Posteriormente, las células se trataron por tres días de duración, con alimentación diaria con RPMI-1640 que contenía 1 % B27 (Invitrogen), 0.25 mM KAAD ciclopamina, 2 mM ácido retinoico (RA; Sigma-Aldrich) y 50 ng/ml FGF10. Los pocilios de control negativo en paralelo se mantuvieron todo el tiempo en medio base RPMI-1640 con 2 % FCS (etapa 2) o 1 % B27 (etapa 3) y sin ningún otro aditivo.
Evaluación del ensayo: Al final de la diferenciación, las células se examinaron como se describió en el Ejemplo 9 para la expresión del gen por PCR en tiempo real. Para un alto contenido de tinción de fluorescencia, las células en placas de 96 pocilios se lavaron dos veces con PBS después se arreglaron con 4 % de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 20 minutos, se lavaron tres veces más con PBS y después se permeabilizaron con 0.5 % de Tritón X-100 durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de arreglarlas y permeabilizarlas, las células se lavaron nuevamente tres veces con PBS y se bloquearon con 4 % de suero de gallina (Invitrogen) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo primario (cabra anti-Pdxl humano; Santa Cruz) se diluyó 1 :100 en 4 % suero de gallina y se añadieron a las células por dos horas a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario combinado Alexa Fluor 488 (IgG anti-cabra de pollo; sondas moleculares) se diluyó a 1 :200 en PBS y se agregó a cada pocilio después de lavar las células tres veces con PBS. A los núcleos marcados por contracoloración, se les agregó 2 pg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen) durante diez minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez con PBS y se dejaron en 100 µ?/pocillo de PBS para la obtención de imágenes.
Se obtuvieron imágenes de las células con un IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) con el uso de dicroico 51008bs para células teñidas con Hoechst 33342 y Alexa Fluor 488. Los tiempos de exposición se optimizaron con el uso de pocilios de control positivo y pocilios teñidos con el anticuerpo secundario únicamente. Las imágenes desde 15 campos por pocilio se obtuvieron para compensar cualquier pérdida celular durante el tratamiento y los procedimientos de tinción. Las mediciones para la cantidad total de células y la intensidad total de Pdx1 se obtuvieron para cada pocilio con el uso del programa IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). La segmentación de los núcleos se determinó en base a los niveles en la escala de grises (valores iniciales en el intervalo de 100-300) y el tamaño nuclear. Los promedios y las desviaciones estándar se calcularon para cada grupo de datos de réplicas. La expresión total de la proteína Pdx1 se reportó como la intensidad total o intensidad integrada, que se define como la fluorescencia total de la célula por el área de la célula. El fondo se eliminó en base a los criterios de aceptación de intervalos en la escala de grises entre 300 y 3000. Los datos de intensidad total se normalizaron dividiendo las intensidades totales de cada pocilio dentro de la intensidad total promedio para el control positivo Wnt3a/Activina A. Los datos normalizados se calcularon para los promedios y las desviaciones estándar para cada grupo de réplicas.
Las células para PCR cuantitativo se desintegraron en regulador RLT (Qiagen) y después se procesaron para la extracción de RNA, purificación y síntesis de cDNA. Las muestras de RNA se purificaron al unirlas a una membrana de gel de sílice (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA) en presencia de un regulador rico en sales que contiene etanol seguido del lavado para eliminar los contaminantes El ARN se purificó, además, por medio del uso de un kit libre de ADN TURBO (Ambion, Inc), y después el ARN de alta calidad se eluyó en agua. La producción y pureza se evaluaron mediante las lecturas A260 y A280 en un espectrofotómetro. Las copias de cDNA se elaboraron de RNA purificado con el uso de un kit de archivo de cDNA de alta capacidad de Applied Biosystems, Inc. (ABI, CA).
A menos que se indicara de otra manera, todos los reactivos para la amplificación y cuantificación de PCR en tiempo real se obtuvieron de ABI. Las reacciones de PCR en tiempo real se llevaron a cabo con el uso del sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7900. TAQMAN UNIVERSAL PCR MASTER MIX se uso con 20 ng de ARN transcrito inverso en un volumen de reacción total de 20 µ?. Cada muestra de cDNA se corrió por duplicado para corregir errores de pipeteado. Los cebadores y las sondas TAQMAN etiquetadas con FAM se usaron a concentraciones de 200 nM. El nivel de expresión para cada gen objetivo se normalizó con un control endógeno humano de gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa (GAPDH) previamente desarrollado por ABI. Los grupos de cebadores y sondas se enumeran de la siguiente manera: PDX1 (Hs00236830_m1), GAPDH (4310884E), y HNF6 (Hs00413554_m1).
Después de una incubación inicial a 50 °C durante 2 min seguida de 95 °C durante 10 min, las muestras se ciclaron 40 veces en dos etapas: un paso de desnaturalización a 95 °C durante 15 s seguido de un paso de alineación/extensión a 60 °C durante 1 min. El análisis de datos se llevó a cabo usando el programa del Sistema de detección de secuencia GENEAMPÓ7000. Para cada grupo de iniciadores/sondas se determinó un valor CT como el número de ciclo en el que la intensidad de la fluorescencia alcanzó un valor específico en el medio de la región exponencial de amplificación. Los niveles de expresión génica relativa se calcularon usando el método comparativo Ct. En resumen, para cada muestra de cDNA, el valor CT del control endógeno se sustrajo del CT del gen de interés para dar el valor delta Ct (ACt). La cantidad normalizada del objetivo se calculó como 2-ACt, asumiendo que la amplificación tiene una eficacia del 100 %. Los datos finales se expresaron en relación a una muestra de calibración.
Resultados Los resultados se muestran para ocho inhibidores de la enzima GSK-3 . Los datos presentados en las Figuras 11A-11B a partir del análisis de contenido alto mostraron efectos en el número de células (figura 11 A) y la intensidad de Pdx1 (figura 11B) para la línea de célula H1 hES, donde los puntos de datos respectivos se promediaron a partir de un conjunto de muestras por duplicado y se extrajeron para cada parámetro de pocilios y campos idénticos. Los datos presentados en la Figura 12 a partir de PCR en tiempo real mostraron efectos de estos inhibidores de molécula pequeña en la expresión inducida de dos factores de transcripción, Pdx1 y HNF6. En estos ejemplos, la expresión de Pdx1 y HNF6 es indicativa de la diferenciación del endodermo pancreático Los compuestos inhibidores de GSK3P en estos ensayos pueden sustituirse por Wnt3a durante las etapas tempranas del compromiso del linaje de las células; las células resultantes mantienen una capacidad para formar el endodermo pancreático durante las etapas secuenciales posteriores de diferenciación.
Ejemplo 11 Efectos de los inhibidores de la enzima GSK-33 en la formación de las células endocrinas pancreáticas Fue importante demostrar que el tratamiento con los inhibidores de GSK3 durante la inducción del endodermo definitivo no previno la diferenciación posterior de otros tipos de células, tales como las células endocrinas pancreáticas, o las células productoras de insulina, por ejemplo. Un subconjunto selecto de aciertos se trató para su capacidad para estimular la expresión de las hormonas pancreáticas.
Preparación de células para ensayo: Las células del endodermo pancreático que se obtuvieron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 10 (cultivadas en placas de 96 pocilios y placas de 24 pocilios) se sometieron posteriormente a agentes que provocan que las células se diferencien en células que expresan la hormona pancreática.
Los ensayos para cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en MATRIGEL™ se iniciaron como se describió en los Ejemplos 8 - 10 anteriormente por la aspiración del medio de cultivo de las monocapas de células en cada pocilio, seguido por tres lavados en PBS para eliminar los factores de crecimiento y el suero. Para la diferenciación a endodermo definitivo, volúmenes de prueba (0.5 mi por pocilio para placas de 24 pocilios, 100 µ? por pocilio para placas de 96 pocilios) se añadieron y contenían medio con 0.5 % FCS y diferentes concentraciones de los compuestos inhibidores con 100 ng/ml Activina A, sin Wnt3a. Los pocilios de control positivo contenían el mismo medio base y 0.5 % de FCS con 100 ng/ml de Activina A y 20 ng/ml de Wnt3a (R&D Biosystems) sin compuesto de prueba. Los pocilios de control negativo contenían el mismo medio base con 0.5 % de FCS, sin Activina A, Wnt3a ni compuesto de prueba. Los pocilios de ensayo se aspiraron y se alimentaron nuevamente con concentraciones idénticas del compuesto de prueba o con soluciones de control el día 2 del ensayo. En los días 3, 4 y 5 todos los pocilios para ensayo se aspiraron y se alimentaron con DMEM:F12 suplementado con 2 % de FCS y 100 ng/ml de Activina A sin compuesto de prueba ni Wnt3a. Los pocilios de control negativo en paralelo se mantuvieron los días 3, 4 y 5 en medio base DMEM:F12 con 2 % de FCS. Para la diferenciación para el endodermo pancreático, las células se trataron durante tres días, con el suministro diario del medio base DMEM:F12 que contiene 2 % de FCS con 0.25 µ? KAAD de ciclopamina (EMD Biosciences) y 20 ng/ml de FGF7 (R&D Biosystems). Posteriormente, las células se trataron durante cuatro días, suministrando diariamente DMEM:F12 que contiene 1 % de B27 (Invitrogen), 0.25 µ? de KAAD ciclopamina, 2 µ? de ácido retinoico (RA; Sigma-Aldrich) y 20 ng/ml de FGF7. Los pocilios de control negativo en paralelo durante las etapas 2 y 3 se mantuvieron todo el tiempo en medio base DMEM:F12 con 2 % FCS o 1 % B27 y sin ningún otro aditivo. Después de la formación del endodermo pancreático, las células se trataron, además, por seis días de duración, con alimentación diaria con medio base DMEM:F12 que contenía 1 % B27 con 1 µ? DAPT (inhibidor de gamma secretasa: EMD Biosciences) y 50 ng/ml Exendin 4 (Sigma-Aldrich). Las células se trataron después por otros tres días de duración, con alimentación diaria con medio base DMEM.F12 que contenía 1 % B27, 50 ng/ml Exendin 4, 50 ng/ml IGF (R&D Biosystems) y 50 ng/ml HGF (R&D Biosystems). Los pocilios de control negativo en paralelo se mantuvieron todo el tiempo en medio base DMEM:F12 con 1 % de B27 y sin ningún otro aditivo.
Evaluación del ensayo: Al final del cultivo, las células se trataron como en los Ejemplos 8 y 9 anteriormente para la evaluación por análisis de contenido alto o PCR en tiempo real.
Para un alto contenido de tinción de fluorescencia, las células en placas de 96 pocilios se lavaron dos veces con PBS después se arreglaron con 4 % de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 20 minutos, se lavaron tres veces más con PBS y después se permeabilizaron con 0.5 % de Tritón X-100 durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de fijarlas y permeabilizarlas, las células se lavaron nuevamente tres veces con PBS y se bloquearon con 4 % de suero de gallina (Invitrogen) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo primario (conejillo de indias anti-insulina de cerdo, con reactividad cruzada con la insulina humana; DakoCytomation) se diluyó .500 en 4 % de suero de cabra y se agregó a las células durante una hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces con PBS y después se tiñeron con el anticuerpo secundario combinado Alexa Fluor 488 (IgG anti-conejillo de indias de cabra; sondas moleculares) diluido 1 :100 en 4 % de suero de cabra. A los núcleos marcados por contracoloración, se les agregó 2 gg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen) durante diez minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez con PBS y se dejaron en 100 µ?/pocillo de PBS para la obtención de imágenes.
Se obtuvieron imágenes de las células con un IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) con el uso de dicroico 51008bs para células teñidas con Hoechst 33342 y Alexa Fluor 488. Los tiempos de exposición se optimizaron con el uso de pocilios de control positivo y pocilios teñidos con el anticuerpo secundario únicamente. Las imágenes desde 15 campos por pocilio se obtuvieron para compensar cualquier pérdida celular durante el tratamiento y los procedimientos de tinción. Las mediciones para la cantidad total de células y la intensidad total de insulina se obtuvieron para cada pocilio con el uso del software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). La segmentación de los núcleos se determinó en base a los niveles en la escala de grises (valores iniciales en el intervalo de 100-300) y el tamaño nuclear. Los promedios y las desviaciones estándar se calcularon para cada grupo de datos de réplicas. La expresión total de la proteína insulina se reportó como la intensidad total o intensidad integrada, que se define como la fluorescencia total de la célula por el área de la célula. El fondo se eliminó en base a los criterios de aceptación de intervalos en la escala de grises entre 300 y 3000. Los datos de intensidad total se normalizaron dividiendo las intensidades totales de cada pocilio dentro de la intensidad total promedio para el control positivo Wnt3a/Activina A. Los datos normalizados se calcularon para promedios y desviaciones estándar para cada grupo triplicado.
Las células para PCR cuantitativo se desintegraron en regulador RLT (Qiagen) y después se procesaron para la extracción de RNA, purificación y síntesis de cDNA. Las muestras de RNA se purificaron al unirlas a una membrana de gel de sílice (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA) en presencia de un regulador rico en sales que contiene etanol seguido del lavado para eliminar los contaminantes El ARN se purificó, además, por medio del uso de un kit libre de ADN TURBO (Ambion, INC), y el ARN de alta calidad se eluyó en agua La producción y pureza se evaluaron mediante las lecturas A260 y A280 en un espectrofotómetro. Las copias de cDNA se elaboraron de RNA purificado con el uso de un kit de archivo de cDNA de alta capacidad de Applied Biosystems, Iric. (ABI, CA).
A menos que se indicara de otra manera, todos los reactivos para la amplificación y cuantificación de PCR en tiempo real se obtuvieron de ABI. Las reacciones de PCR de tiempo real se elaboraron con el Sistema de detección de secuencia ABI PRISM® 7900. TAQMAN® UNIVERSAL PCR MASTER MIX® (ABI, CA) se usó con 20 ng de reverso transcripción de ARN en un volumen de reacción total de 20 µ?. Cada muestra de cDNA se corrió por duplicado para corregir errores de pipeteado. Se usaron cebadores y sondas TAQMAN etiquetadas FAM® en concentraciones de 200 nM. El nivel de expresión para cada gen objetivo se normalizó con un control endógeno humano de gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa (GAPDH) previamente desarrollado por ABI. Los grupos de cebadores y sondas se enumeran de la siguiente manera: PDX1 (Hs00236830_m1), Insulina (Hs00355773), y GAPDH (4310884E).
Después de una incubación inicial a 50 °C durante 2 min seguida de 95 °C durante 10 min, las muestras se ciclaron 40 veces en dos etapas: un paso de desnaturalización a 95 °C durante 15 s seguido de un paso de alineación/extensión a 60 °C durante 1 min. El análisis de datos se llevó a cabo usando el programa del Sistema de detección de secuencia GENEAMP® 7000. Para cada equipo de cebador/sonda, se determinó un valor como el número de ciclo al que la intensidad de fluorescencia alcanzó un valor específico en medio de la región exponencial de amplificación. Los niveles de expresión relativa del gen se calcularon con el método Ct comparativo. Brevemente, para cada muestra de ANDc, el valor del control endógeno Ct se sustrajo del gen de interés Ct para dar el valor Ct (ACt). Se calculó la cantidad normalizada de destino como 2"?a, asumiendo la amplificación a 100 % de eficacia. Los datos finales se expresaron en relación a una muestra de calibración.
Resultados Los resultados se muestran para ocho inhibidores de la enzima GSK-3B. Los datos presentados en las Figuras 13A-13B a partir del análisis de contenido alto mostraron efectos en el número de células (figura 13A) y la intensidad de insulina (figura 13B) para la línea de células H1 hES donde los puntos de datos respectivos se promediaron a partir de un conjunto por triplicado y se extrajeron para cada parámetro de pocilios y campos idénticos. Los datos presentados en la Figura 14 a partir de la PCR en tiempo real mostraron efectos del compuesto para Pdx1 e insulina. En estos ejemplos, la expresión de Pdx1 e insulina es indicativa de la diferenciación del endodermo pancreático y la generación de células hormonales positivas. Los compuestos inhibidores de GSK3P selectivos en estos ensayos se pueden sustituir por Wnt3a durante las etapas tempranas del compromiso del linaje de células y puede inducir y mantener la formación de células beta durante las etapas de diferenciación secuenciales posteriores, como es evidente a partir de la inmunotinción con insulina y la PCR en tiempo real.
Ejemplo 12 Efectos aditivos de los inhibidores de la enzima GSK-33 en la formación de las células endocrinas pancreáticas Fue importante demostrar que el tratamiento con los inhibidores de GSK3P puede mejorar la diferenciación de las células beta pancreáticas si se añaden durante fases múltiples del compromiso de destino de las células. Un subconjunto selecto de aciertos se trató por adición cronometrada secuencial para mejorar la expresión de insulina asociada con las células positivas a las hormonas pancreáticas.
Preparación de las células para el ensayo: Preparación de las células para el ensayo: Las células del endodermo pancreático que se obtuvieron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 10 y 11 (cultivadas en placas de 96 pocilios) se sometieron posteriormente a agentes que provocan que las células se diferencien en células que expresan la hormona pancreática.
Los ensayos para cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en MATRIGEL™ se iniciaron como se describió en los Ejemplos 8 - 10 anteriormente por la aspiración del medio de cultivo de las monocapas de células en cada pocilio, seguido por tres lavados en PBS para eliminar los factores de crecimiento y el suero. Para la diferenciación a endodermo definitivo, volúmenes de prueba (100 µ? por pocilio para las placas de 96 pocilios) se añadieron y contenían medio con 0.5 % FCS y diferentes concentraciones de los compuestos inhibidores con 100 ng/ml Activina A, sin Wnt3a. Los pocilios de control positivo contenían el mismo medio base y 0.5 % de FCS con 100 ng/ml de Activina A y 20 ng/ml de Wnt3a (R&D Biosystems) sin compuesto de prueba. Los pocilios de control negativo contenían el mismo medio base con 0.5 % de FCS, sin Activina A, Wnt3a ni compuesto de prueba. Los pocilios de ensayo se aspiraron y se alimentaron nuevamente con concentraciones idénticas del compuesto de prueba o con soluciones de control el día 2 del ensayo. En los días 3, 4 y 5 todos los pocilios para ensayo se aspiraron y se alimentaron con DMEM:F12 suplementado con 2 % de FCS y 100 ng/ml de Activina A sin compuesto de prueba ni Wnt3a. Los pocilios de control negativo en paralelo se mantuvieron los días 3, 4 y 5 en medio base DMEM:F12 con 2 % de FCS. Para la diferenciación para el endodermo pancreático, las células se trataron durante tres días, con el suministro diario del medio base DME :F12 que contiene 2 % de FCS con 0.25 µ? KAAD de ciclopamina (EMD Biosciences) y 20 ng/ml de FGF7 (R&D Biosystems). Posteriormente, las células se trataron durante cuatro días, suministrando diariamente DMEM:F12 que contiene 1 % de B27 (Invitrogen), 0.25 µ? de KAAD ciclopamina, 2 µ? de ácido retinoico (RA; Sigma-Aldrich) y 20 ng/ml de FGF7. Los pocilios de control negativo en paralelo se mantuvieron todo el tiempo en medio base DMEM:F12 con 2 % FCS o 1 % B27 y sin ningún otro aditivo. Después de la formación del endodermo pancreático, las células se trataron, además, por seis días de duración, con alimentación en días alternos con medio base DMEM:F12 que contenía 1 % B27 con 1 µ? DAPT (inhibidor de gamma secretasa: EMD Biosciences) y 50 ng/ml Exendin 4 (Sigma-Aldrich) y 1 µ? de inhibidor II TGFbeta R1 (inhibidor ALK5; EMD Biosciences). Durante este período de seis días, los inhibidores de GSK3P se añadieron otra vez a los pocilios respectivos, por medio del uso de la misma concentración como en el tratamiento previo al inicio de la diferenciación. Las células se trataron después por otros tres días de duración con alimentación en días alternos con medio base DMEM:F12 que contenía 1 % B27, 50 ng/ml Exendin 4, 50 ng/ml IGF (R&D Biosystems) y 50 ng/ml HGF (R&D Biosystems), y 1 µ? de inhibidor II TGFbeta R1 (inhibidor ALK5; EMD Biosciences). Durante este período de tres días, los inhibidores de GSK3P se añadieron otra vez a los pocilios respectivos, por medio del uso de la misma concentración como en el tratamiento previo al inicio de la diferenciación. Los conjuntos de pocilios de control positivo en paralelo se trataron en presencia o ausencia de 20 ng/ml Wnt3a. Los pocilios de control negativo en paralelo se mantuvieron todo el tiempo en medio base DMEM:F12 con 1 % de B27 y sin ningún otro aditivo.
Evaluación del ensayo: Al final del cultivo, las células se trataron como en el Ejemplo 11 anterior para la evaluación por análisis de contenido alto.
Para un alto contenido de tinción de fluorescencia, las células en placas de 96 pocilios se lavaron dos veces con PBS después se arreglaron con 4 % de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 20 minutos, se lavaron tres veces más con PBS y después se permeabilizaron con 0.5 % de Tritón X-100 durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de fijarlas y permeabilizarias, las células se lavaron nuevamente tres veces con PBS y se bloquearon con 4 % de suero de gallina (Invitrogen) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo primario (conejillo de indias anti-insulina de cerdo, con reactividad cruzada con la insulina humana; DakoCytomation) se diluyó 1 :500 en 4 % de suero de cabra y se agregó a las células durante una hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces con PBS y después se tiñeron con el anticuerpo secundario combinado Alexa Fluor 488 (IgG anti-conejillo de indias de cabra; sondas moleculares) diluido 1:100 en 4 % de suero de cabra. A los núcleos marcados por contracoloración, se les agregó 2 pg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen) durante diez minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez con PBS y se dejaron en 100 µ?/pocillo de PBS para la obtención de imágenes.
Se obtuvieron imágenes de las células con un IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) con el uso de dicroico 51008bs para células teñidas con Hoechst 33342 y Alexa Fluor 488. Los tiempos de exposición se optimizaron con el uso de pocilios de control positivo y pocilios teñidos con el anticuerpo secundario únicamente. Las imágenes desde 15 campos por pocilio se obtuvieron para compensar cualquier pérdida celular durante el tratamiento y los procedimientos de tinción. Las mediciones para la cantidad total de células y la intensidad total de insulina se obtuvieron para cada pocilio con el uso del software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). La segmentación de los núcleos se determinó en base a los niveles en la escala de grises (valores iniciales en el intervalo de 100-300) y el tamaño nuclear. Los promedios y las desviaciones estándar se calcularon para cada grupo de datos de réplicas. La expresión total de la proteína insulina se reportó como la intensidad total o intensidad integrada, que se define como la fluorescencia total de la célula por el área de la célula. El fondo se eliminó en base a los criterios de aceptación de intervalos en la escala de grises entre 300 y 3000. Los datos de intensidad total se normalizaron dividiendo las intensidades totales de cada pocilio dentro de la intensidad total promedio para el control positivo Wnt3a/Activina A. Los datos normalizados se calcularon para promedios y desviaciones estándar para cada grupo triplicado.
Resultados Los resultados se muestran para ocho inhibidores de la enzima GSK-3B. Los datos presentados en las Figuras 15A-15B a partir del análisis de contenido alto mostraron efectos en el número de células (figura 15A) y la intensidad de insulina (figura 15B) para la línea de células H1 hES donde los puntos de datos respectivos se promediaron a partir de un conjunto por triplicado y se extrajeron para cada parámetro de pocilios y campos idénticos. En este ejemplo, la expresión de insulina es indicativa de la diferenciación a células pancreáticas positivas hormonales. Los compuestos inhibidores de GSK3P selectivos en estos ensayos pueden sustituirse por Wnt3a durante las etapas tempranas del compromiso del linaje de células y, cuando se añaden en etapas posteriores de la diferenciación, parecen promover una expresión de insulina mejorada en relación con una muestra de control positiva.
Las publicaciones citadas en este documento se incorporan como referencias en su totalidad. Aunque los diferentes aspectos de la invención se ilustraron anteriormente con referencia a los ejemplos y modalidades preferidas, se apreciará que el alcance de la invención no se define por la descripción anterior sino por las siguientes reivindicaciones redactadas apropiadamente bajo los principios de la ley de patentes.
Tabla IA: Lista de anticuerpos primarios usados para FACS y análisis de inmunotinción.
Tabla Ib: Lista de anticuerpos secundarios conjugados usados para FACS y para análisis de inmunotinción.
Anticuerpo secundario conjugado Suministrador Dilución IgG de cabra anti-ratón conjugado con APC Jackson ImmunoResearch (PA) 1 200 IgG de cabra anti-ratón conjugado con PE Jackson ImmunoResearch (PA) 1 200 Burro anti-conejo conjugado con PE o con APC Jackson ImmunoResearch (PA) 1 200 Burro anti-cabra conjugado con PE o APC Jackson ImmunoResearch (PA) 1 200 IgM de cabra anti-ratón con PE SouthernBiotech (AL) 1 200 Ig de cabra anti-rata con PE SouthemBiotech (AL) 1 :200 lgG3 de cabra anti-ratón con PE SouthemBiotech (AL) 1 :200 Tabla II: Efectos de los inhibidores de la actividad de la enzima GSK-3B sobre la viabilidad de las células que expresan marcadores pluripotenciales.
Datos crudos Promedio S.D. % de CV % de control (duplicado) JNJ5226780 0.785 0.790 0.788 0.00382 0.48 94.0 JNJ10179026 0.148 0.152 0.150 0.00247 1.65 4.8 JNJ17154215 0.427 0.462 0.444 0.02496 5.62 46.0 JNJ17205955 0.643 0.638 0.641 0.00368 0.57 73.5 JNJ180125 0.762 0.762 0.762 0.00007 0.01 90.4 JNJ18157646 0.850 0.824 0.837 0.01824 2.18 101.0 JNJ 19370026 0.911 0.884 0.898 0.01881 2.10 109.5 JNJ19567340 0.723 0.743 0.733 0.01421 1.94 86.4 JNJ7830433 0.161 0.169 0.165 0.00559 3.39 6.9 JNJ10179130 0.767 0.789 0.778 0.01556 2.00 92.6 JNJ17154215 0.512 0.555 0.533 0.03048 5.72 58.4 JNJ 17205955 0.282 0.293 0.288 0.00792 2.75 24.1 JNJ18014061 0.764 0.723 0.743 0.02892 3.89 87.9 JNJ18157698 0.853 0.858 0.855 0.00382 0.45 103.5 JNJ 19376240 0.832 0.837 0.834 0.00361 0.43 100.6 JNJ 19567405 0.726 0.725 0.725 0.00042 0.06 85.3 JNJ8706646 0.132 0.137 0.134 0.00368 2.74 2.6 JNJ 10182562 0.797 0.793 0.795 0.00346 0.44 95.1 JNJ17 57659 0.776 0.787 0.782 0.00792 1.01 93.2 JNJ17205994 0.164 0.148 0.156 0.01131 7.24 5.6 JNJ18014074 0.475 0.383 0.429 0.06548 15.26 43.8 JNJ18157698 0.823 0.774 0.798 0.03444 4.31 95.6 JNJ19386042 0.781 0.729 0.755 0.03649 4.83 89.5 JNJ19573541 0.143 0.149 0.146 0.00396 2.72 4.2 JNJ8710481 0.716 0.716 0.716 0.00014 0.02 84.1 JNJ10182562 0.804 0.802 0.803 0.00148 0.18 96.2 JNJ17163042 0.900 0.877 0.888 0.01626 1.83 108.2 JNJ 17226703 0.824 0.799 0.812 0.01725 2.13 97.4 JNJ18018338 0.744 0.819 0.781 0.05261 6.73 93.2 JNJ18157711 0.952 0.966 0.959 0.00933 0.97 118.1 JNJ19410833 0.952 0.919 0.935 0.02277 2.43 114.8 JNJ 19574867 0.776 0.777 0.777 0.00042 0.05 92.5 JNJ8710481 0.691 0.617 0.654 0.05254 8.03 75.4 JNJ10184655 0.162 0.134 0.148 0.02022 13.66 4.5 JNJ10166565 0.791 0.608 0.700 0.12947 18.50 81.8 JNJ17982133 0.153 0.129 0.141 0.01676 11.87 3.5 JNJ18018351 0.731 0.585 0.658 0.10317 15.68 75.9 DMSO 0.789 0.700 0.744 0.06279 8.44 88.0 JNJ19410859 0.909 0.675 0.792 0.16546 20.88 94.7 JNJ19574880 0.164 0.151 0.157 0.00926 5.89 5.8 JNJ10148307 0.706 0.672 0.689 0.02404 3.49 83.9 JNJ10222784 0.641 0.601 0.621 0.02878 4.63 73.7 JNJ171 4664 0.882 0.748 0.815 0.09504 11.66 102.5 JNJ17989049 0.822 0.802 0.812 0.01400 1.72 102.1 JNJ18047991 0.777 0.764 0.771 0.00919 1.19 95.9 DMSO 0.798 0.771 0.785 0.01916 2.44 98.0 JNJ19410872 0.791 0.789 0.790 0.00134 0.17 98.7 JNJ20948798 0.628 0.640 0.634 0.00806 1.27 75.6 JNJ10164830 0.149 0.135 0.142 0.00969 6.81 2.7 JNJ10222927 0.803 0.782 0.792 0.01492 1.88 99.1 JNJ 17187027 0.125 0.129 0.127 0.00318 2.51 0.4 JNJ17994873 0.315 0.542 0.428 0.15995 37.34 45.2 JNJ 18055726 0.820 0.748 0.784 0.05091 . 6.49 97.9 JNJ18157711 0.154 0.165 0.160 0.00806 5.05 5.3 JNJ19558929 0.737 0.730 0.734 0.00481 0.66 90.4 JNJ21192730 0.659 0.647 0.653 0.00813 1.25 78.5 JNJ 10164895 0.165 0.154 0.159 0.00785 4.93 5.2 JNJ10231273 0.637 0.554 0.595 0.05876 9.87 69.9 JNJ17187053 0.684 0.588 0.636 0.06809 10.71 76.0 JNJ17994899 0.750 0.624 0.687 0.08945 13.02 83.5 JNJ18077800 0.678 0.618 0.648 0.04285 6.61 77.8 JNJ 19363357 0.777 0.667 0.722 0.07757 10.74 88.7 DMSO 0.799 0.649 0.724 0.10564 14.59 89.0 JNJ21194667 0.648 0.625 0.636 0.01662 2.61 76.0 JNJ10172058 0.601 0.620 0.611 0.01308 2.14 72.2 JNJ 10259847 0.695 0.702 0.698 0.00552 0.79 85.2 JNJ 17193774 0.568 0.709 0.639 0.09956 15.59 76.4 JNJ 17994912 0.623 0.765 0.694 0.10041 14.46 84.6 JNJ18157074 0.758 0.762 0.760 0.00297 0.39 94.3 JNJ 19369233 0.487 0.434 0.461 0.03769 8.18 49.9 JNJ19567314 0.690 0.686 0.688 0.00262 0.38 83.7 JNJ21196227 0.535 0.550 0.543 0.01089 2.01 62.1 JNJ10178727 0.743 0.638 0.691 0.07446 10.78 84.1 JNJ 10259847 0.694 0.603 0.649 0.06449 9.94 77.8 JNJ 17200976 0.160 0.186 0.173 0.01824 10.56 7.2 JNJ17994925 0.662 0.566 0.614 0.06788 11.05 72.7 JNJ18157087 0.600 0.514 0.557 0.06102 10.96 64.2 JNJ19369246 0.685 0.524 0.605 0.11427 18.90 71.3 JNJ 19567327 0.731 0.525 0.628 0.14552 23.18 74.7 JNJ24843611 0.715 0.596 0.655 0.08436 12.87 78.8 JNJ24843611 0.592 0.572 0.582 0.01393 2.39 70.0 JNJ25758785 0.614 0.611 0.613 0.00177 0.29 74.6 JNJ26064571 0.766 0.849 0.807 0.05869 7.27 104.3 JNJ26130403 0.830 0.813 0.822 0.01195 1.45 106.5 JNJ26170794 0.727 0.730 0.728 0.00198 0.27 92.2 JNJ26241774 0.713 0.836 0.774 0.08733 11.28 99.3 JNJ26367991 0.726 0.719 0.722 0.00523 0.72 91.3 JNJ26483310 0.646 0.681 0.663 0.02510 3.78 82.4 JNJ24326185 0.651 0.649 0.650 0.00120 0.19 80.3 JNJ25758850 0.642 0.622 0.632 0.01407 2.23 77.5 JNJ26067626 0.843 0.672 0.758 0.12099 15.97 96.7 JNJ26134771 0.734 0.815 0.774 0.05728 7.40 99.3 JNJ26170820 0.823 0.743 0.783 0.05699 7.28 100.6 JNJ26241917 0.871 0.874 0.872 0.00219 0.25 114.2 JNJ26714220 0.652 0.642 0.647 0.00721 1.12 79.8 JNJ26483223 0.617 0.633 0.625 0.01174 1.88 76.5 JNJ24843572 0.657 0.655 0.656 0.00134 0.20 81.2 JNJ25758863 0.684 0.809 0.746 0.08803 11.80 95.0 JNJ26067652 0.901 0.735 0.818 0.11731 14.34 106.0 JNJ26150202 0.791 0.768 0.779 0.01591 2.04 100.1 JNJ26170833 0.948 0.764 0.856 0.12982 15.17 111.7 JNJ26243204 0.821 0.608 0.714 0.15033 21.05 90.1 JNJ26399906 0.745 0.685 0.715 0.04243 5.94 90.2 JNJ26 83236 0.624 0.618 0.621 0.00417 0.67 76.0 JNJ24843585 0.652 0.624 0.638 0.01916 3.00 78.5 JNJ25873419 0.773 0.662 0.718 0.07792 10.86 90.6 JNJ26069901 0.856 0.834 0.845 0.01570 1.86 110.1 JNJ26153647 0.828 0.800 0.814 0.02008 2.47 105.4 JNJ26177086 0.821 0.841 0.831 0.01421 1.71 108.0 JNJ26247143 0.816 0.787 0.802 0.02072 2.58 103.5 JNJ26399906 0.744 0.737 0.741 0.00453 0.61 94.1 JNJ26483249 0.699 0.679 0.689 0.01464 2.12 86.3 JNJ25753520 0.186 0.208 0.197 0.01541 7.83 11.3 JNJ25887537 0.665 0.699 0.682 0.02432 3.57 85.2 JNJ26077883 0.810 0.683 0.746 0.09030 12.10 95.0 JNJ26158015 0.141 0.162 0.151 0.01506 9.95 4.3 DMSO 0.784 0.605 0.695 0.12671 18.25 87.1 JNJ26248729 0.726 0.590 0.658 0.09624 14.63 81.5 JNJ26399945 0.635 0.620 0.628 0.01068 1.70 76.9 JNJ26483249 0.697 0.695 0.696 0.00113 0.16 87.3 JNJ25753403 0.154 0.153 0.154 0.00042 0.28 4.5 JNJ25900641 0.616 0.645 0.630 0.02072 3.29 82.1 JNJ22791671 0.909 0.830 0.869 0.05614 6.46 121.0 JNJ26158054 0.150 0.150 0.150 0.00028 0.19 3.9 JNJ26177762 0.981 1.056 1.018 0.05303 5.21 145.3 JNJ26261105 0.166 0.189 0.177 0.01626 9.19 8.3 JNJ26399971 0.718 0.451 0.584 0.18887 32.34 74.6 JNJ26483262 0.652 0.647 0.649 0.00389 0.60 85.2 JNJ25757173. 0.503 0.529 0.516 0.01860 3.61 63.5 JNJ25900654 0.603 0.609 0.606 0.00424 0.70 78.1 JNJ26116922 0.856 0.793 0.824 0.04419 5.36 113.7 JNJ26893438 0.883 0.848 0.866 0.02503 2.89 120.5 JNJ26184457 0.779 0.784 0.781 0.00368 0.47 106.7 JNJ26361712 0.892 0.914 0.903 0.01591 1.76 126.6 JNJ26399984 0.544 0.537 0.540 0.00460 0.85 67.5 JNJ26511901 0.532 0.682 0.607 0.10543 17.37 78.3 JNJ25757173 0.665 0.645 0.655 0.01400 2.14 86.1 JNJ25900706 0.676 0.677 0.677 0.00035 0.05 89.7 JNJ26120601 0.935 0.807 0.871 0.09115 10.47 121.3 JNJ26158093 0.916 0.859 0.887 0.03981 4.49 124.0 JNJ26219050 0.907 0.891 0.899 0.01124 1.25 125.9 JNJ26361725 0.909 0.896 0.902 0.00919 1.02 126.4 JNJ26399997 0.682 0.797 0.740 0.08118 10.98 99.9 JNJ26511927 0.679 0.644 0.661 0.02510 3.80 87.2 JNJ25757238 0.300 0.223 0.261 0.05452 20.88 22.0 JNJ26047723 0.183 0.175 0.179 0.00573 3.20 8.6 JNJ26120614 0.741 0.728 0.734 0.00884 1.20 99.1 JNJ26158106 0.935 0.906 0.921 0.02051 2.23 129.4 JNJ26219063 0.131 0.128 0.129 0.00212 1.64 0.5 JNJ26366730 0.138 0.137 0.138 0.00092 0.67 1.9 JNJ26400049 0.241 0.227 0.234 0.01032 4.41 17.6 JNJ26941226 0.604 0.639 0.622 0.02475 3.98 80.7 JNJ25758707 0.247 0.182 0.215 0.04617 21.52 14.4 JNJ26054912 0.659 0.634 0.647 0.01718 2.66 84.8 JNJ26128726 0.758 0.575 0.667 0.12961 19.44 88.1 JNJ26161343 0.166 0.170 0.168 0.00276 1.64 6.9 JNJ26220454 0.651 0.559 0.605 0.06541 10.81 78.0 JNJ26367991 0.803 0.694 0.748 0.07693 10.28 101.3 JNJ26483197 0.823 0.634 0.728 0.13378 18.37 98.1 JNJ26511953 0.624 0.618 0.621 0.00431 0.69 80.6 RWJ351001 0.639 0.603 0.621 0.02553 4.11 73.6 RWJ382867 0.143 0.149 0.146 0.00403 2.76 2.9 RWJ682205 0.817 0.818 0.818 0.00071 0.09 102.8 RWJ665862 0.742 0.752 0.747 0.00679 0.91 92.2 RWJ670804 0.856 0.905 0.881 0.03479 3.95 112.1 RWJ673829 0.650 0.576 0.613 0.05268 8.59 72.4 RWJ675260 0.768 0.724 0.746 0.03097 4.15 92.2 RWJ675946 0.556 0.549 0.553 0.00537 0.97 63.4 RWJ351958 0.227 0.242 0.235 0.01103 4.70 16.1 RWJ395477 0.634 0.663 0.649 0.02044 3.15 77.7 RWJ447228 0.141 0.128 0.135 0.00919 6.83 1.3 RWJ666167 0.847 0.832 0.840 0.01110 1.32 106.0 RWJ670908 0.803 0.845 0.824 0.02998 3.64 103.7 RWJ673830 0.860 0.860 0.860 0.00035 0.04 109.1 RWJ675261 0.528 0.497 0.513 0.02227 4.34 57.5 RWJ675948 0.683 0.688 0.686 0.00332 0.48 83.1 RWJ447228 0.611 0.628 0.620 0.01202 1.94 73.3 RWJ 14342 0.719 0.749 0.734 0.02143 2.92 90.3 RWJ553709 0.916 0.838 0.877 0.05487 6.26 111.6 RWJ666168 0.771 0.740 0.755 0.02178 2.88 93.5 RWJ670984 0.820 0.852 0.836 0.02305 2.76 105.5 RWJ674239 0.971 0.913 0.942 0.04137 4.39 121.2 RWJ675430 0.839 0.743 0.791 0.06746 8.53 98.8 RWJ676061 0.562 0.527 0.544 0.02440 4.48 62.2 RWJ352190 0.678 0.661 0.670 0.01195 1.78 80.8 RWJ414984 0.722 0.713 0.717 0.00658 0.92 87.9 RWJ659780 0.802 0.801 0.802 0.00106 0.13 100.4 RWJ666205 0.854 0.857 0.855 0.00205 0.24 108.4 RWJ671232 0.767 0.798 0.782 0.02157 2.76 97.5 RWJ674240 0.789 0.776 0.782 0.00870 1.11 97.5 RWJ675266 0.720 0.709 0.714 0.00764 1.07 87.4 RWJ676085 0.641 0.618 0.630 0.01619 2.57 74.9 RWJ352244 0.603 0.584 0.593 0.01372 2.31 69.4 RWJ425264 0.135 0.158 0.146 0.01633 11.18 3.0 RWJ662440 0.792 0.572 0.682 0.15563 22.83 82.6 RWJ666213 0.752 0.593 0.673 0.11292 16.79 81.2 RWJ672667 0.805 0.598 0.702 0.14644 20.87 85.5 RWJ674241 0 599 0.504 0.552 0.06682 12.11 63.2 RWJ675366 0.714 0.593 0.654 0.08549 13.08 78.4 RWJ676137 0.699 0.698 0.698 0.00099 0.14 85.0 RWJ352628 0.690 0.674 0.682 0.01131 1.66 83.3 RWJ425268 0.616 0.634 0.625 0.01301 2.08 74.8 RWJ663860 0.809 0.817 0.813 0.00552 0.68 103.0 RWJ667045 0.128 0.133 0.131 0.00361 2.76 0.7 RWJ672932 0.821 0.811 0.816 0.00721 0.88 103.4 RWJ674320 0.456 0.474 0.465 0.01223 2.63 50.8 RWJ675369 0.762 0.766 0.764 0.00304 0.40 95.7 RWJ676139 0.680 0.663 0.671 0.01195 1.78 81.8 RWJ353258 0.615 0.635 0.625 0.01400 2.24 74.8 RWJ355923 0.681 0.698 0.689 0.01266 1.84 84.5 RWJ664545 0.830 0.807 0.818 0.01584 1.94 103.8 RWJ667046 0.869 0.849 0.859 0.01442 1.68 109.9 RWJ672934 0.821 0.841 0.831 0.01428 1.72 105.7 RWJ674817 0.819 0.840 0.830 0.01485 1.79 105.5 RWJ675430 0.795 0.793 0.794 0.00078 0.10 100.1 RWJ676431 0.640 0.636 0.638 0.00283 0.44 76.7 RWJ355131 0.610 0.628 0.619 0.01266 2.05 73.9 RWJ425271 0.143 0.144 0.144 0.00035 0.25 2.6 RWJ353709 0.804 0.903 0.853 0.07000 8.20 109.0 RWJ667069 0.918 0.854 0.886 0.04483 5.06 113.9 RWJ673313 0.105 1.080 0.593 0.68971 116.37 70.0 RWJ674855 0.877 0.860 0.868 0.01209 1.39 111.3 RWJ675578 0.808 0.695 0.751 0.07941 10.57 93.8 RWJ676432 0.720 0.697 0.709 0.01648 2.33 87.3 RWJ355923 0.636 0.621 0.629 0.01054 1.68 75.4 RWJ425348 0.640 0.634 0.637 0.00474 0.74 76.6 RWJ665436 0.833 0.833 0.833 0.00000 0.00 106.0 RWJ669182 0.887 0.846 0.866 0.02934 3.39 111.0 RWJ673515 0.845 0.877 0.861 0.02326 2.70 110.2 RWJ674855 0.794 0.784 0.789 0.00686 0.87 99.4 RWJ675605 0.770 0.786 0.778 0.01138 1.46 97.8 RWJ67657 0.629 0.659 0.644 0.02128 3.30 77.7 RWJ356205 0.584 0.558 0.571 0.01817 3.18 66.8 RWJ445224 0.707 0.679 0.693 0.01987 2.87 85.0 RWJ665588 0.727 0.578 0.652 0.10536 16.15 78.9 RWJ669327 0.742 0.629 0.685 0.07969 1 .63 83.8 DMSO 0.653 0.507 0.580 0.10310 17.78 68.0 RWJ675104 0.722 0.568 0.645 0.10904 16.90 77.9 RWJ675881 0.643 0.581 0.612 0.04384 7.16 72.9 RWJ676639 0.608 0.590 0.599 0.01245 2.08 70.9 JNJ26511966 0.597 0.610 0.603 0.00926 1.54 71.2 JNJ26511979 0.687 0.668 0.677 0.01336 1.97 82.4 JNJ26512005 0.840 0.832 0.836 0.00594 0.71 106.1 JNJ26533065 0.831 0.822 0.826 0.00587 0.71 104.7 JNJ26533091 0.863 0.856 0.860 0.00509 0.59 109.7 JNJ26533104 0.886 0.802 0.844 0.05954 7.05 107.3 JNJ26533156 0.753 0.687 0.720 0.04660 6.47 88.8 JNJ26714181 0.455 0.463 0.459 0.00587 1.28 49.6 JNJ26714194 0.668 0.678 0.673 0.00764 1.13 81.7 JNJ26714207 0.181 0.171 0.176 0.00658 3.74 7.2 JNJ26714220 0.832 0.842 0.837 0.00658 0.79 106.3 JNJ26875563 0.795 0.802 0.798 0.00445 0.56 100.5 JNJ22791671 0.157 0.140 0.148 0.01202 8.11 3.0 JNJ26893438 0.153 0.153 0.153 0.00035 0.23 3.7 JNJ26941226 0.168 0.154 0.161 0.00969 6.02 4.9 JNJ28572128 0.670 0.641 0.655 0.02079 3.17 79.1 RWJ67694 0.706 0.679 0.693 0.01888 2.73 84.7 RWJ676940 0.788 0.666 0.727 0.08627 11.86 89.8 RWJ677545 0.879 0.785 0.832 0.06640 7.98 105.6 RWJ678986 0.168 0.176 0.172 0.00537 3.13 6.6 RWJ680665 0.946 0.848 0.897 0.06972 7.77 115.3 RWJ680667 0.187 0.202 0.194 0.01089 5.61 9.9 RWJ680668 0.906 0.688 0.797 0.15394 19.31 100.3 RWJ680669 0.715 0.674 0.694 0.02850 4.10 84.9 RWJ680858 0.695 0.700 0.697 0.00339 0.49 85.3 RWJ680858 0.665 0.631 0.648 0.02369 3.66 78.0 RWJ680879 0.590 0.613 0.601 0.01655 2.75 71.0 RWJ680885 0.681 0.687 0.684 0.00382 0.56 83.3 RWJ680991 0.829 0.821 0.825 0.00530 0.64 104.5 RWJ680992 0.822 0.790 0.806 0.02270 2.82 101.6 RWJ680993 0.671 0.684 0.677 0.00912 1.35 82.3 RWJ681140 0.686 0.668 0.677 0.01266 1.87 82.3 RWJ681142 0.212 0.197 0.204 0.01047 5.12 11.5 RWJ681146 0.666 0.666 0.666 0.00007 0.01 80.7 RWJ681945 0.736 0.656 0.696 0.05643 8.11 85.1 RWJ68198 0.726 0.610 0.668 0.08217 12.30 81.0 JNJ28850601 0.303 0.310 0.306 0.00488 1.59 26.7 DMSO 0.786 0.659 0.722 0.09001 12.46 89.1 DMSO 0.673 0.649 0.661 0.01676 2.53 79.9 DMSO 0.701 0.686 0.693 0.01011 1.46 84.8 Tabla III: Efectos de los inhibidores de la actividad de la enzima GSK-3B sobre la viabilidad de las células que expresan marcadores pluripotenciales.
Conc. comp. Datos crudos Promedio S.D. % de CV % de control (uM) (duplicado) medio EXPRES 01 Sin tratamiento únicamente AA AA + Wnt3a JNJ 19370026 5 0.4434 0.3878 0.4156 0.0393 9.5 40.1 JNJ 19370026 2.5 0.7734 0.8038 0.7886 0.0215 2.7 92.0 JNJ26483197 10 0.2993 0.3026 0.3010 0.0023 0.8 24.1 JNJ26483197 5 0.7023 0.6299 0.6661 0.0512 7.7 75.0 JNJ26483197 2.5 0.7835 0.8043 0.7939 0.0147 1.9 92.8 RWJ675605 10 0.7205 0.7369 0.7287 0.0116 1.6 83.7 RWJ675605 5 0.7769 0.8272 0.8021 0.0356 4.4 93.9 RWJ675605 2.5 0.8214 0.8640 0.8427 0.0301 3.6 99.6 RWJ675430 10 0.6275 0.5980 0.6128 0.0209 3.4 67.5 RWJ675430 5 0.7159 0.7222 0.7191 0.0045 0.6 82.3 RWJ675430 2.5 0.9245 0.9403 0.9324 0.0112 1.2 112.1 RWJ675948 10 0.7220 0.6670 0.6945 0.0389 5.6 78.9 RWJ675948 5 0.7526 0.7486 0.7506 0.0028 0.4 86.7 RWJ675948 2.5 0.7557 0.7390 0.7474 0.0118 1.6 86.3 JNJ26483249 10 0.8214 0.8636 0.8425 0.0298 3.5 99.5 JNJ26483249 5 0.7996 0.7873 0.7935 0.0087 1.1 92.7 JNJ26483249 2.5 0.8669 0.8195 0.8432 0.0335 4.0 99.6 RWJ67657 10 0.6195 0.5908 0.6052 0.0203 3.4 66.5 RWJ67657 5 0.8047 0.8319 0.8183 0.0192 2.4 96.2 RWJ67657 2.5 0.8041 0.7900 0.7971 0.0100 1.3 93.2 RWJ676639 10 0.1261 0.1520 0.1391 0.0183 13.2 1.5 RWJ676639 5 0.1303 0.1263 0.1283 0.0028 2.2 0.0 RWJ676639 2.5 0.4482 0.4051 0.4267 0.0305 7.1 41.6 Tabla IV: Efectos de los inhibidores de la actividad de la enzima GSK-3B sobre la diferenciación y proliferación de células madre embrionarias humanas.
Tabla V: Efectos de los inhibidores de la actividad de la enzima GSK-3B sobre la diferenciación v proliferación de células madre embrionarias humanas.
UNJ10172058 0.8926 U J10222784 0.6476 IRWJ4 5224 0.8514 RWJ674239 0.6282 Icomp. de 0.8162 UNJ8706646 0.6161 referencia UNJ8710481 0.8161 RWJ675948 0.5887 UNJ26533156 0.7992 ÜNJ10178727 0.5686 ÍRWJ352190 0.7864 RWJ553709 0.7842 IRWJ665436 0.7277 RWJ675948 0.6342 RWJ353258 0.6211 UNJ10178727 0.6025 Tabla VI: Efectos de los inhibidores de la actividad de la enzima GSK-3B sobre la proliferación de células madre embrionarias humanas.
Número JNJ Datos crudos Promedio S. D. % de CV % de control medio condicionado 1 1348 1.0099 1 1092 1.0846 0 0660 6.1 116.5 Sin tratamiento 0 9344 0.5977 0 8454 0.7925 0 1745 22.0 85.2 AA/DMSO 0 3878 0.2434 0 2252 0.2855 0 0891 31.2 30.7 AA/Wnt3a/DMSO 0 6098 1.0804 0 7635 0.8179 0 2403 25.8 100.0 RWJ351001 0 3418 0.4276 0 5751 0.4482 0 1180 26.3 48.2 RWJ351958 0 1362 0.1531 0 1532 0.1475 0 0098 6.6 15.8 RWJ352190 1 3764 1.2753 1 3208 1.3242 0 0506 3.8 142.3 RWJ352244 0 6923 0.5994 0 6134 0.6350 0 0501 7.9 68.2 RWJ352628 1 7896 1.4721 2 1908 1.8175 0 3602 19.8 195.3 RWJ353258 1 7591 1.6274 1 6518 1.6794 0 0701 4.2 180.4 RWJ355131 0 3702 0.3193 0 3368 0.3421 0 0259 7.6 36.8 RWJ355923 0 5876 0.6384 0 9154 0.7138 0 1764 24.7 76.7 RWJ356205 0 3074 0.2328 0 2920 0.2774 0 0394 14.2 29.8 RWJ382867 0 1311 0.1245 0 1288 0.1281 0 0034 2.6 13.8 RWJ395477 0 1270 0.2778 0 1916 0.1988 0 0757 38.1 21.4 RWJ41 342 0 2166 0.3062 0 2915 0.2714 0 0481 17.7 29.2 RWJ414984 0 4362 0.3728 0 2481 0.3524 0 0957 27.2 37.9 RWJ425264 0.1560 0.1481 0.1359 0.1467 0.0101 6.9 15.8 RWJ425268 0.2932 0.3883 0.6258 0.4358 0.1713 39.3 46.8 RWJ425271 0.1362 0.1479 0.1298 0.1380 0.0092 6.7 14.8 RWJ425348 0.2198 0.2159 0.2300 0.2219 0.0073 3.3 23.8 RWJ445224 0.7624 0.2705 0.2478 0.4269 0.2908 68.1 45.9 RWJ447228 0.1239 0.1233 0.1269 0.1247 0.0019 1.5 13.4 RWJ553709 0.1277 0.1254 0.6980 0.3170 0.3299 104.1 34.1 RWJ659780 0.2665 0.3215 0.2605 0.2828 0.0336 11.9 30.4 RWJ662440 0.2395 0.3235 0.1333 0.2321 0.0953 41.1 24.9 RWJ663860 0.2646 0.1873 0.1293 0.1937 0.0679 35.0 20.8 RWJ664545 0.3590 0.2790 0.1515 0.2632 0.1047 39.8 28.3 RWJ665436 0.4690 0.5805 0.3349 0.4615 0.1230 26.6 49.6 Número JNJ Datos crudos Promedio S.D. % de CV % de control medio condicionado 1.1525 1.1269 1.1140 1.1311 0.0196 1.7 71.0 Sin tratamiento 1.2057 1.2358 1.3132 1.2516 0.0555 4.4 78.6 AA/DMSO 0.2622 0.2073 0.2830 0.2508 0.0391 15.6 15.8 AA/Wnt3a/DMSO 1.3943 1.7976 1.8000 1.5922 0.2136 13.4 100.0 R J665588 0.1930 0.2223 0.2167 0.2107 0.0156 7.4 13.2 RWJ665862 0.1757 0.1813 0.1835 0.1802 0.0040 2.2 11.3 RWJ666167 0.1473 0.1880 0.1732 0.1695 0.0206 12.2 10.6 RWJ666168 0.1330 0.1362 0.1867 0.1520 0.0301 19.8 9.5 RWJ666205 0.8191 0.5493 0.6526 0.6737 0.1361 20.2 42.3 RWJ666213 0.4008 0.2779 0.3869 0.3552 0.0673 18.9 22.3 RWJ667045 0.1220 0.1248 0.1251 0.1240 0.0017 1.4 7.8 RWJ667046 0.2883 0.3308 0.5503 0.3898 0.1406 36.1 24.5 RWJ667069 0.2835 0.4024 0.5698 • 0.4186 0.1438 34.4 26.3 RWJ669182 0.3704 0.6073 0.5280 0.5019 0.1206 24.0 31.5 RWJ669327 0.2266 0.1815 0.2289 0.2123 0.0267 12.6 13.3 RWJ670804 1.0820 1.1862 1.1076 1.1253 0.0543 4.8 70.7 RWJ670908 0.3590 0.5457 0.6123 0.5057 0.1313 26.0 31.8 RWJ670984 0.2198 0.3564 0.3202 0.2988 0.0708 23.7 18.8 RWJ671232 0.2928 0.2920 0.3659 0.3169 0.0424 13.4 19.9 RWJ672667 0.3349 0.3013 0.3507 0.3290 0.0252 7.7 20.7 RWJ672932 0.1852 0.1924 0.2349 0.2042 0.0269 13.2 12.8 RWJ672934 0.2170 0.3003 0.1877 0.2350 0.0584 24.9 14.8 RWJ673313 0.3094 0.2515 0.1881 0.2497 0.0607 24.3 15.7 RWJ673515 1.8452 1.7710 1.5591 1.7251 0.1485 8.6 108.3 RWJ673829 0.7305 0.7067 0.6250 0.6874 0.0553 8.0 43.2 RWJ673830 0.2113 0.1800 0.1547 0.1820 0.0284 15.6 11.4 RWJ674239 1.5225 1.5912 0.1081 1.0739 0.8371 78.0 67.4 RWJ674240 0.4006 1.2807 0.1162 0.5992 0.6071 101.3 37.6 RWJ674241 0.1972 0.1839 0.1162 0.1658 0.0434 26.2 10.4 RWJ674320 0.1351 0.1318 0.1169 0.1279 0.0097 7.6 8.0 Número JNJ Datos crudos Promedio S.D. % de CV % de control medio condicionado 1.0568 1.0604 1.0586 0.0025 0.2 71.9 Sin tratamiento 1.1544 0.9576 1.0560 0.1392 13.2 71.7 AA únicamente + DMSO 0.6329 0.8434 0.7382 0.1488 20.2 47.1 AA + Wnt3a + DMSO 1.2704 1.8669 1.4229 0.2960 20.8 100.0 RWJ674817 0.5617 0.2098 0.3858 0.2488 64.5 19.9 RWJ674855 0.6850 0.5853 0.6352 0.0705 11.1 39.2 RWJ674855 0.7496 0.9187 0.8342 0.1196 14.3 54.5 RWJ675104 0.2320 0.2124 0.2222 0.0139 6.2 7.3 RWJ675260 0.8079 1.4391 1.1235 0.4463 39.7 76.9 RWJ675261 0.8310 0.7318 0.7814 0.0701 9.0 50.5 RWJ675266 1.0646 1.1384 1.1015 0.0522 4.7 75.2 RWJ675366 0.6344 1.0400 0.8372 0.2868 34.3 54.8 sin células 0.1335 0.2070 0.1703 0.0520 30.5 3.3 RWJ675369 0.8643 0.4060 0.6352 0.3241 51.0 39.2 RWJ675430 1.7922 1.8533 1.8228 0.0432 2.4 130.9 RWJ675578 0.1914 0.2371 0.2143 0.0323 15.1 6.7 RWJ675605 1.8401 1.7563 1.7982 0.0593 3.3 129.0 RWJ675881 1.0301 1.0356 1.0329 0.0039 0.4 69.9 RWJ675946 0.1306 0.1338 0.1322 0.0023 1.7 0.3 RWJ675948 1.7143 1.6506 1.6825 0.0450 2.7 120.0 RWJ676061 0.4170 0.4956 0.4563 0.0556 12.2 25.4 RWJ676085 0.1772 0.2348 0.2060 0.0407 19.8 6.0 RWJ676137 1.0231 .2392 1.1312 0.1528 13.5 77.5 RWJ676139 1.9718 2.0997 2.0358 0.0904 4.4 147.3 RWJ676431 1.5168 1.6872 1.6020 0.1205 7.5 113.8 RWJ676432 1.6935 1.9710 1.8323 0.1962 10.7 131.6 RWJ67657 1.2655 1.1829 1.2242 0.0584 4.8 84.7 RWJ676639 1.3481 1.3168 1.3325 0.0221 1.7 93.0 JNJ26511966 0.6444 0.7239 0.6842 0.0562 8.2 43.0 JNJ26511979 0.2046 0.3076 0.2561 0.0728 28.4 9.9 JNJ26512005 1.3627 1.0693 1.2160 0.2075 17.1 84.0 JNJ26533065 0.8722 0.9660 0.9191 0.0663 7.2 61.1 JNJ26533091 1.0332 0.4554 0.7443 0.4086 54.9 47.6 JNJ26533104 0.8775 0.7347 0.8061 0.1010 12.5 52.4 JNJ26533156 1.7865 1.2008 1.4937 0.4142 27.7 105.5 JNJ26714181 0.2396 0.1584 0.1990 0.0574 28.9 5.5 JNJ26714194 0.8122 1.0827 0.9475 0.1913 20.2 63.3 JNJ2671 207 0.1342 0.1363 0.1353 0.0015 1.1 0.6 JNJ26714220 1.0462 0.5838 0.8150 0.3270 40.1 53.1 JNJ26875563 0.4586 0.2903 0.3745 0.1190 31.8 19.0 JNJ22791671 0.1277 0.1402 0.1340 0.0088 6.6 . 0.5 JNJ26893438 0.1258 0.1324 0.1291 0.0047 3.6 0.1 JNJ26941226 0.1219 0.1216 0.1218 0.0002 0.2 -0.5 JNJ28572128 0.4223 0.4721 0.4472 0.0352 7.9 24.7 JNJ28850601 0.1514 0.1396 0.1455 0.0083 5.7 1.4 Número JNJ Datos crudos Promedio S.D. % de CV % de control medio condicionado 0.7423 0.7081 0.7252 0.0242 3.3 87.7 Sin tratamiento 0.4936 0.5689 0.5313 0.0532 10.0 59.8 AA únicamente + DMSO 0.1433 0.1939 0.1686 0.0358 21.2 7.6 AA + Wnt3a + DMSO 0.6808 0.9406 0.8107 0.1837 22.7 100.0 JNJ17994873 0.2447 0.1331 0.1889 0.0789 41.8 10.6 JNJ17994899 0.1537 0.1302 0.1420 0.0166 11.7 3.8 sin células 0.1163 0.1147 0.1155 0.0011 1.0 0.0 JNJ1 994912 0.2994 0.2592 0.2793 0.0284 10.2 23.6 JNJ17994925 0.1353 0.2121 0.1 37 0.0543 31.3 8.4 JNJ180125 0.1267 0.1419 0.1343 0.0107 8.0 2.7 JNJ18014061 0.1376 0.1676 0.1526 0.0212 13.9 5.3 JNJ18014074 0.1134 0.1103 0.1119 0.0022 2.0 -0.5 JNJ18018338 0.1318 0.1478 0.1398 0.01 13 8.1 3.5 JNJ18018351 0.2569 0.2124 0.2347 0.0315 13.4 17.1 JNJ18047991 0.2674 0.2636 0.2655 0.0027 1.0 21.6 JNJ18055726 0.4357 0.3467 0.3912 0.0629 16.1 39.7 JNJ18077800 0.1265 0.1588 0.1427 0.0228 16.0 3.9 JNJ18157074 0.1662 0.2521 0.2092 0.0607 29.0 13.5 JNJ18157087 0.1596 0.1566 0.1581 0.0021 1.3 6.1 JNJ18157646 0.2725 0.1636 0.2181 0.0770 35.3 14.8 JNJ18157711 1.2256 1.0636 1.1446 0. 146 10.0 148.0 JNJ18157711 0.1134 0.1070 0.1102 0.0045 4.1 -0.8 JNJ19363357 0.1469 0.1495 0.1482 0.0018 1.2 4.7 JNJ19369233 0.1169 0.1122 0.1146 0.0033 2.9 -0.1 JNJ19369246 0.1595 0.1422 0.1509 0.0122 8.1 5.1 JNJ19370026 1.0484 1.0749 1.0617 0.0187 1.8 136.1 JNJ19376240 0.3012 0.2347 0.2680 0.0470 17.5 21.9 JNJ19386042 0.1267 0.1510 0.1389 0.0172 12.4 3.4 JNJ19410833 1.1902 1.1487 1.1695 0.0293 2.5 151.6 JNJ19410859 0.6400 0.7076 0.6738 0.0478 7.1 80.3 JNJ19410872 0.1701 0.1752 0.1727 0.0036 2.1 8.2 JNJ19558929 0.3435 0.3488 0.3462 0.0037 1.1 33.2 JNJ19567314 0.4032 0.3548 0.3790 0.0342 9.0 37.9 JNJ19567327 0.1602 0.1502 0.1552 0.0071 4.6 5.7 JNJ19567340 0.1604 0.2079 0.1842 0.0336 18.2 9.9 JNJ 9567405 0.1646 0.1592 0.1619 0.0038 2.4 6.7 JNJ19573541 0.1779 0.2273 0.2026 0.0349 17.2 12.5 JNJ19574867 0.1225 0.1443 0.1334 0.0154 11.6 2.6 JNJ19574880 0.1300 0.1291 0.1296 0.0006 0.5 2.0 JNJ20948798 0.1263 0.1336 0.1300 0.0052 4.0 2.1 JNJ21192730 0.2778 0.1326 0.2052 0.1027 50.0 12.9 JNJ21194667 0.2569 0.1219 0.1894 0.0955 50.4 10.6 JNJ21196227 0.1640 0.1158 0.1399 0.0341 24.4 3.5 JNJ24843611 1.1486 0.8970 1.0228 0.1779 17.4 130.5 JNJ24843611 0.1358 0.1201 0.1280 0.0111 8.7 1.8 JNJ24326185 0.1257 0.1257 0.1257 0.0000 0.0 1.5 JNJ24843572 0.4676 0.4803 0.4740 0.0090 1.9 51.6 Número JNJ Datos crudos Promedio S.D. % de CV % de control medio condicionado 0.6935 0.7803 0.7369 0.0614 8.3 104.8 Sin tratamiento 0.4735 0.6069 0.5402 0.0943 17.5 71.5 AA únicamente + DMSO 0.1428 0.1656 0.1542 0.0161 10.5 6.3 AA + Wnt3a + DMSO 0.5702 0.8468 0.7085 0.1956 27.6 100.0 JNJ24843585 0.1599 0.2380 0.1990 0.0552 27.8 13.8 JNJ25753520 0.1287 0.1244 0.1266 0.0030 2.4 1.6 sin células 0.1241 0.1100 0.1171 0.0100 8.5 0.0 JNJ25753403 0.1235 0.1152 0.1194 0.0059 4.9 0.4 JNJ25757173 0.1199 0.1278 0.1239 0.0056 4.5 1.1 JNJ25757173 0.1174 0.1162 0. 16T ?.???T 0.7 -0.1 JNJ25757238 1.1100 0.9464 1.0282 0.1157 11.3 154.1 JNJ25758707 0.1247 0.1115 0.1181 0.0093 7.9 0.2 JNJ25758785 0.2640 0.1688 0.2164 0.0673 31.1 16.8 JNJ25758850 0.2313 0.1307 0.1810 0.0711 39.3 10.8 JNJ25758863 0.8639 0.9218 0.8929 0.0409 4.6 131 .2 JNJ25873419 0.2540 0.2320 0.2430 0.0156 6.4 21.3 JNJ25887537 0. 809 0.3077 0.2443 0.0897 36.7 21.5 JNJ25900641 0.1892 0.1872 0.1882 0.0014 0.8 12.0 JNJ25900654 0.1967 0.2492 0.2230 0.0371 16.7 17.9 JNJ25900706 0.3346 0.1619 0.2483 0.1221 49.2 22.2 JNJ26047723 0.1106 0.1138 0.1122 0.0023 2.0 -0.8 JNJ 26054912 0.1224 0.1445 0.1335 0.0156 1 1.7 2.8 JNJ26064571 0.1312 0.1270 0.1291 0.0030 2.3 2.0 JNJ26067626 0.1653 0.21 14 0.1884 0.0326 17.3 12.0 JNJ26067652 0.1732 0.1467 0.1600 0.0187 1 1.7 7.2 JNJ26069901 0.1618 0.2754 0.2186 0.0803 36.7 17.2 JNJ26077883 1.0006 0.9631 0.9819 0.0265 2.7 146.2 JNJ26116922 0.6472 0.4319 0.5396 0.1522 28.2 71.4 JNJ26120601 0.1539 0.1469 0.1504 0.0049 3.3 5.6 JNJ26120614 0.1127 0.1309 0.1218 0.0129 10.6 0.8 JNJ26128726 0.6887 0.5860 0.6374 0.0726 1 1.4 88.0 JNJ26130403 0.1141 0.1094 0.11 18 0.0033 3.0 -0.9 JNJ26134771 0.2774 0.1690 0.2232 0.0767 34.3 17.9 JNJ26150202 0.9482 1.1150 1.0316 0.1179 11.4 154.6 JNJ26153647 0.7687 0.6804 0.7246 0.0624 8.6 102.7 JNJ26158015 0.7125 0.3347 0.5236 0.2671 51.0 68.7 JNJ26158054 0.1446 0.1221 0.1334 0.0159 1 1.9 2.7 JNJ26158093 1.0968 1.3108 1.2038 0.1513 12.6 183.8 JNJ26158106 0.3167 0.3415 0.3291 0.0175 5.3 35.8 JNJ26161343 0.1261 0.1144 0.1203 0.0083 6.9 0.5 JNJ26170794 0.2223 0.2930 0.2577 0.0500 19.4 23.8 JNJ26170820 0.1265 0.1236 0.1251 0.0021 1.6 1.3 JNJ26170833 1.1940 0.9431 1.0686 0.1774 16.6 160.9 JNJ26177086 1.0689 0.6879 0.8784 0.2694 30.7 128.7 JNJ26177762 1.0444 0.7603 0.9024 0.2009 22.3 132.8 JNJ26184457 0.1443 0.1209 0.1326 0.0165 12.5 2.6 JNJ26219050 0.1152 0.1309 0.1231 0.0111 9.0 1.0 Número JNJ Datos crudos Promedio s.o. % de CV % de control medio condicionado 0.7590 0.7451 | 0.7521 0.0098 1.3 98.0 Sin tratamiento 0.5687 0.4490 AA únicamente + DMSO 0.1988 0.1522 AA + Wnt3a + DMSO 0.6837 0.8460 JNJ26219063 0.1911 0.1101 JNJ26220454 0.2772 0.1151 sin células 0.1278 0.1084 JNJ26241774 0.1443 0.2120 JNJ26241917 0.4413 0.2238 JNJ26243204 0.1098 0.1085 JNJ26247143 0.1389 0.2147 JNJ26248729 0.1852 0.1342 JNJ26261105 0.1114 0.1295 JNJ26361712 0.5375 0.6158 JNJ26361725 0.1259 0.1441 JNJ26366730 0.1206 0.1312 JNJ26367991 0.2269 0.2857 JNJ26367991 0.1140 0.1079 JNJ26399906 0.9589 0.8868 JNJ26399906 1.0442 0.9622 JNJ26399945 0.1961 0.1735 JNJ26399971 0.5732 0.5216 JNJ26399984 0.1273 0.1217 JNJ26399997 0.5932 0.6671 JNJ26400049 0.1444 0.1368 JNJ26483197 1.0786 1.0891 JNJ26483310 0.5418 0.2338 JNJ26483223 0.1268 0.2052 JNJ26483236 0.1169 0.1184 JNJ26483249 0.8618 1.0400 JNJ26483249 0.8430 1.0187 JNJ26483262 0.3659 0.3168 JNJ26511901 0.9184 0.8116 JNJ26511927 0.2384 0.3156 JNJ26511953 0.2297 0.1469 RWJ67694 0.1955 0.1256 RWJ676940 0.1658 0.1704 RWJ677545 0.1399 0.1303 RWJ678986 0.1234 0.1236 0.1235 0.0001 0.1 0.8 RWJ680665 0.1397 0.2147 0.1772 0.0530 29.9 9.1 RWJ680667 0.1218 0.1310 0.1264 0.0065 5.1 1.3 RWJ680668 0.1456 0.1981 0.1719 0.0371 21.6 8.3 RWJ680669 0.5412 0.1898 0.3655 0.2485 68.0 38.2 RWJ680858 0.1996 0.1245 0.1621 0.0531 32.8 6.8 RWJ680858 0.1418 0.2014 0.1716 0.0421 24.6 8.3 RWJ680879 0.1106 0.1197 0.1152 0.0064 5.6 -0.5 RWJ680885 0.1159 0.1272 0.1216 0.0080 6.6 0.5 Número JNJ Datos crudos Promedio S.D. % de CV % de control medio condicionado 0.8077 0.7210 0.7644 0.0613 8.0 74.7 sin tratamiento + D SO 0.4638 0.4073 0.4356 0.0400 9.2 36.7 AA/Wnt3a 0.8466 0.9935 0.9830 0.2592 26.4 100.0 JNJ10222784 0.8095 0.9055 0.8575 0.0679 7.9 85.5 JNJ10222927 0.3519 0.4708 0.4114 0.0841 20.4 33.9 JNJ10231273 0.1609 0.1275 0.1442 0.0236 16.4 3.1 JNJ10259847 0.5020 0.2733 0.3877 0.1617 41.7 31.2 JNJ10259847 0.3413 0.4146 0.3780 0.0518 13.7 30.1 JNJ17154215 0.1176 0.1174 0.1175 0.0001 0.1 0.0 JNJ17154215 0.1148 0.1410 0.1279 0.0185 14.5 1.2 JNJ1 157659 0.2394 0.2450 0.2422 0.0040 1.6 14.4 JNJ17163042 0.3672 0.3098 0.3385 0.0406 12.0 25.5 JNJ10166565 0.2722 0.1593 0.2158 0.0798 37.0 11.3 JNJ17174664 0.5079 0.4349 0.4714 0.0516 11.0 40.9 JNJ17187027 0.1076 0.1168 0.1122 0.0065 5.8 -0.6 JNJ17187053 0.2569 0.2151 0.2360 0.0296 12.5 13.7 JNJ17193774 0.2846 0.4376 0.3611 0.1082 30.0 28: 1 JNJ17200976 0.1168 0.1136 0.1152 0.0023 2.0 -0.3 JNJ17205955 0.1168 0.1152 0.1160 0.0011 1.0 -0.2 JNJ17205955 0.1137 0.1195 0.1166 0.0041 3.5 -0.1 JNJ17205994 0.1154 0.1152 0.1153 0.0001 0.1 -0.3 JNJ17226703 0.2188 0.2353 0.2271 0.0117 5.1 12.6 JNJ17982133 0.4588 0.2521 0.3555 0.1462 41.1 27.5 JNJ17989049 0.3081 0.1961 0.2521 0.0792 31.4 15.5 Número JNJ Datos crudos Promedio S.D % de CV % de control medio condicionado 0.7914 1.1189 0.9552 0.2316 24.2 93.3 Sin tratamiento 0.4215 0.5259 0.4737 0.0738 15.6 39.8 sin células 0.1152 0.1160 0.1156 0.0006 0.5 0.0 AA/Wnt3a 0.7168 0.8836 1.0151 0.2016 19.9 100.0 WJ680991 0.2882 0.2308 0.2844 0.0499 17.6 18.8 RWJ680992 0.3049 0.2845 0.3127 0.0282 9.0 21.9 RWJ680993 0.5403 0.2570 0.3855 0.1332 34.6 30.0 RWJ681140 0.7323 0.3034 0.4388 0.2041 46.5 35.9 RWJ681142 0.1185 0.1216 0.1199 0.0018 1.5 0.5 RWJ681146 0.2496 0.2683 0.2302 0.0376 16.3 12.7 RWJ681945 0.1548 0.1356 0.1513 0.0134 8.8 4.0 RWJ68198 0.1555 0.1450 0.1581 0.0161 10.2 4.7 RWJ682205 0.2347 0.1920 0.3785 0.2589 68.4 29.2 RWJ447228 0.1842 0.2093 0.3793 0.2585 68.2 29.3 RWJ675430 0.7223 0.8707 0.4291 0.2452 57.2 34.8 RWJ355923 0.6268 0.3192 0.3354 0.1667 49.7 24.4 Tabla Vil: Efectos de los inhibidores de la actividad de la enzima GSK-3B sobre la proliferación de células madre embrionarias humanas.
Lista de Aciertos Fuertes Lista de Aciertos moderados >=120 % control 60-120 % control Número JNJ % del valor de control Número JNJ % del valor de control RWJ352628 195.3 JNJ26511901 115.5 JNJ26158093 183.8 RWJ676431 113.8 RWJ353258 180.4 RWJ673515 108.3 JNJ26170833 160.9 JNJ26533156 105.5 JNJ26150202 154.6 JNJ26153647 102.7 JNJ25757238 154.1 RWJ676639 93.0 JNJ19410833 151.6 JNJ26128726 88.0 JNJ26483197 149.3 JNJ10222784 85.5 JNJ18157711 148.0 RWJ67657 84.7 RWJ676139 147.3 JNJ26512005 84.0 JNJ26077883 146.2 JNJ19410859 80.3 RWJ352190 142.3 JNJ26399997 79.2 JNJ26399906 136.8 RWJ676137 77.5 JNJ19370026 136.1 RWJ675260 76.9 JNJ26177762 132.8 RWJ355923 76.7 RWJ676432 131.6 RWJ675266 75.2 JNJ2S758863 131.2 JNJ26116922 71.4 RWJ675430 130.9 JNJ26361712 70.9 JNJ24843611 130.5 RWJ670804 70.7 RWJ675605 129.0 RWJ675881 69.9 JNJ26483249 128.8 JNJ26158015 68.7 JNJ26177086 128.7 RWJ352244 68.2 JNJ26483249 125.7 RWJ674239 67.4 JNJ26399906 124.4 JNJ26399971 66.4 RWJ675948 120.0 JNJ26714194 63.3 JNJ26533065 61.1 Tabla VIII: Efectos DEPENDIENTES de la dosis de los inhibidores de actividad enzimática de GSK-3B en la proliferación de CÉLULAS de la LÍNEA de células madre embrionarias humana H1.
Concentración JNJ10220067 JNJ17163796 JNJ17189731 JNJ17223375 JNJ18 57698 [Um] Número SD Número SD Número SD Número SD Número SD de de de de de célula célula célula célula célula 10 1.006 0.051 0.039 0.049 0.193 0.147 1.280 0.014 1.049 0.062 5 1.058 I 0.047 1.164 ! 0.018 0.889 I 0.035 1.348 j 0.007 1.104 0.014 2.5 1.031 i 0.054 1.022 I 0.023 0.896 { 0.035 1.318 | 0.028 0.932 0.087 1.25 0.899 I 0.040 1.121 j 0.023 1.120 j 0.072 1.159 I 0.041 1.006 0.023 0.625 0.742 I 0.095 1.092 i 0.044 1.107 I 0.093 1.029 j 0.018 0.832 0.026 0.313 0.754 | 0.010 0.931 | 0.056 1.132 I 0.018 1.018 I 0.044 0.742 0.127 0.156 0.822 | 0.074 0.804 I 0.002 1.082 0.041 0.776 ! 0.054 0.712 0.020 Concentración JNJ26158015 JNJ26483197 JNJ26483249 JNJ17225871 JNJ17228458 [Um] Número SD Número SD Número SD Número SD Número SD de de de de de célula célula célula célula célula 10 0.001 I 0.001 0.096 | 0.103 0.058 I 0.074 0.290 i 0.307 0.000 0.000 5 0.034 I 0.035 0.262 | 0.268 0.173 j 0.207 0.458 j 0.263 0.089 10.067 2.5 0.566 I 0.461 0.592 | 0.019 0.428 I 0.326 0.640 | 0.104 0.438 10.050 1.25 0.897 I 0.103 1.124 | 0.101 0.850 j 0.238 0.739 | 0.129 0.636 10.016 0.625 0.921 I 0.122 1.106 I 0.056 0.910 I 0.061 0.805 | 0.036 0.736 j 0.025 0.313 1.028 I 0.069 0.888 ! 0.213 0.868 i 0.131 0.785 i 0.094 0.791 10.038 0.156 1.027 I 0.067 0.890 ! 0.079 0.742 I 0.051 0.774 ! 0.027 0.832 10.005 Concentración JNJ19370026 JNJ26150202 JNJ26170833 JNJ26177086 JNJ26177762 [Um] Número SD Número SD Número SD Número SD Número SD de de de de de célula célula célula célula célula 10 0.000 i 0.000 0.496 ! 0.690 0.129 0.170 0.412 i 0.081 0.996 10.246 5 0.024 ! 0.034 0.768 i 0.490 0.530 i 0.080 1.128 I 0.026 0.908 10.179 2.5 1.097 | 0.294 1.001 I 0.129 1.174 I 0.016 1.031 I 0.217 1.005 10.086 1.25 1.446 I 0.076 1.158 i 0.043 1.113 I 0.057 0.914 I 0.100 1.200 ! 0.085 0.625 1.296 ! 0.183 0.699 j 0.248 1.188 I 0.041 0.801 j 0.136 1.111 10.300 0.313 1.034 I 0.197 0.617 I 0.232 1.158 ; 0.102 0.785 i 0.121 0.959 10.094 0.156 0.826 ; 0.030 0.812 I 0.120 0.974 I 0.065 0.659 ! 0.068 0.912 10.059 Concentración JNJ26512005 JNJ26533065 JNJ26533156 JNJ26714194 JNJ3026582 [Um] Número SD Número SD Número SD Número SD Númer SD de de de de o de célula célula célula célula célula 10 0.000 i 0.000 0.021 I 0.027 0.002 I 0.002 0.052 0.067 0.053 0.024 5 0.000 i 0.000 0.339 I 0.254 1.011 I 0.499 1.161 I 0.134 0.905 ! 0.036 2.5 0.192 i 0.233 1.350 j 0.170 1.724 | 0.042 1.293 I 0.020 1.019 I 0.015 1.25 0.552 I 0.458 1.277 | 0.101 1.652 | 0.032 1.213 I 0.087 1.163 10.062 0.625 0.895 j 0.054 0.713 I 0.151 1.357 I 0.023 1.025 I 0.045 1.231 I 0.152 0.313 0.734 ! 0.075 0.665 ! 0.207 1.213 I 0.177 1.241 I 0.031 1.216 10.007 0.156 0.594 i 0.078 0.469 I 0.465 1.206 ! 0.142 1.041 | 0.007 1.103 I 0.065 Tabla IX: Efectos DEPENDIENTES de la dosis de los inhibidores de actividad enzimática de GSK-3B en la diferenciación de CÉLULAS de la LÍNEA de células madre embrionarias humana H1 Tabla X: Efectos DEPENDIENTES de la dosis de los inhibidores de actividad enzimática de GSK-3B en la proliferación de CÉLULAS de la LÍNEA de células madre embrionarias humana H9 Concentración JNJ10220067 JNJ17163796 JNJ171B9731 JNJ17223375 JNJ18157698 0.313 0.250 0.090 0.072 0.025 0.772 0.050 0.100 j 0.156 0.095 0.020 0.057 0.044 0.336 0.056 0.072 0.015 0.276 0.043 i Concentración JNJ26512005 JNJ26533065 JNJ26533156 JNJ267U194 JNJ3026582 [Um] Número de SD Número de SD Número de SD Número de SD Número de SD célula célula célula célula célula 10 0.007 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.044 0.038 0.004 0.001 I 5 0.002 0.001 0.127 0.069 0.415 0.023 0.382 0.110 0.017 0.003 2.5 0.001 0.001 0.151 0.059 0.425 0.082 0.345 0.001 0.033 0.037 1.25 0.090 0.097 0.108 0.051 0.325 0.042 0.284 0.076 0.044 0.028 0.625 0.248 0.058 0.230 0.168 0.314 0.062 0.266 0.021 0.100 0.099 0.313 0.264 0.048 0.086 0.033 0.267 0.098 0.347 0.084 0.057 0.032 0.156 0.133 0.069 0.063 0.004 0.218 0.012 0.192 0.014 0.070 0.048 Tabla XI: Efectos DEPENDIENTES de la dosis de los inhibidores de actividad enzimática de GSK-3B en la diferenciación de CÉLULAS de la LÍNEA de células madre embrionarias humana H9.
I Concentración JNJ10220067 JNJ17163796 JNJ171B9731 JNJ17223375 JNJ18157698 [Um] Intensidad SD Intensidad de SD Intensidad de SD Intensidad SD Intensidad de SD de Sox17 Sox17 Sox17 de Sox 7 Sox17 0.157 0.051 0.003 0.132 0.003 0.678 0.093 0.116 0.047 0.095 0.025 I 0.313 0.052 0.008 0.311 0.005 0.951 0.010 0.155 0.071 0.110 0.030 0.625 0.103 0.058 0.453 0.076 1.160 0.013 0.277 0.061 0.154 0.013 1.25 0.312 0.255 1.012 0.051 1.042 0.134 0.459 0.066 0.317 0.062 2.5 0.100 0.062 0.986 0.269 0.869 0. 58 0.726 0.079 0.297 0.235 j 5 0.105 I 0.089 0.480 0.423 0.432 0.111 1.114 0.066 0.353 ; 0.080 10 0.121 | 0.141 0.002 0.002 0.022 i 0.005 0.140 0.110 0.694 ! 0.123 \ Concentración JNJ26158015 JNJ26483197 JNJ26483249 JNJ17225871 JNJ17228458 [uM] Intensidad SD Intensidad de i SD Intensidad de I SD Intensidad SD Intensidad de SD de Sox17 Sox17 Sox17 de Sox17 Sox17 0.157 0.364 I 0.044 0.149 0.058 0.125 0.051 0.132 0.063 0.039 j 0.010 0.313 0.577 I 0.062 0.398 0.166 0.129 0.018 0.146 0.005 0.070 0.027 0.625 0.985 j 0.072 0.678 I 0.197 0.212 I 0.134 0.196 0.084 0.137 I 0.049 I 1.25 0.943 ; 0.419 1.110 0.042 0.202 i 0.103 0.129 0.029 0.075 | 0.017 j 2.5 0.559 0.238 0.857 0.012 0.209 j 0.045 0.177 0.030 0.053 I 0.005 5 0.019 0.019 0.194 ! 0.007 0.154 j 0.023 0.174 0.070 0.038 j 0.001 I 10 0.001 0.001 0.129 0.037 0.129 0.067 0.200 0.022 0.000 j 0.000 í Concentración JNJ19370026 JNJ26150202 JNJ26170B33 JNJ26177086 JNJ26177762 [uM] Intensidad SO Intensidad de i SD Intensidad de SD intensidad SD Intensidad de SD de Sox17 Sox17 Sox1 de Sox17 Sox17 0.157 0.074 0.024 0.040 0.030 0.291 0.086 0.054 0.014 0.186 0.040 I 0.313 0.170 0.046 0.051 i 0.016 0.746 0.088 0.080 0.006 0.342 I 0.068 ! 0.625 0.246 0.036 0.150 0.095 0.941 0.111 0.268 0.050 0.563 I 0.019 1.25 0.981 0.075 0.155 0.010 1.119 0.045 0.332 0.006 0.936 0.186 2.5 0.914 0.038 0.408 0.279 1.305 0.066 0.432 0.154 1.146 0.137 I 5 0.001 0.001 0.251 I 0.092 1.185 0.012 0.543 0.004 1.127 0.121 I 10 0.000 0.000 0.262 ! 0.068 0.000 0.000 0.822 0.024 0.759 0.328 i Concentración JNJ265 2005 JNJ26533065 JNJ26533156 JNJ267U194 JNJ3026582 [u ] Intensidad SD Intensidad de i SD Intensidad de SD Intensidad SD Intensidad de SD de Sox17 Sox17 Sox17 de Sox17 Sox17 0.157 0.085 0.041 0.049 0.011 0.173 0.009 0.146 0.041 0.059 0.051 0.313 0.240 0.030 0.068 0.010 0.203 0.061 0.282 0.135 0.054 0.040 ! 0.625 0.165 ! 0.043 0.222 ! 0.201 0.220 i 0.070 0.202 0.013 0.073 ! 0.066 I 1.25 0.114 I 0.134 0.076 i 0.034 0.202 I 0.002 0.165 0.030 0.053 i 0.035 I 2.5 0.001 ! 0.001 0.120 i 0.066 0.299 j 0.019 0.205 0.002 0.042 ! 0.049 ! 5 0.001 | 0.001 0.087 I 0.036 0.300 ! 0.095 0.234 0.078 0.016 I 0.001 I 10 0.009 I 0.003 0.000 I 0.000 0.000 I 0.000 0.042 0.028 0.004 I 0.003

Claims (126)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1. Un método para expandir y diferenciar células pluripotentes, el método comprende las etapas de: a. cultivar células pluripotenciales, y b. tratar las células pluripotenciales con un inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las células madre pluripotentes son células madre embrionarias.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las células pluripotentes son células que expresan marcadores de pluripotencia derivadas de las células madre embrionarias.
4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque las células que expresan marcadores de-pluripotencia expresan al menos uno de los siguientes marcadores de pluripotencia seleccionado del grupo que consiste de: ABCG2, cripto, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60 y Tra1-81.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las células pluripotentes se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las células pluripotentes se tratan con el inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3B por aproximadamente una hasta aproximadamente 72 horas.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las células pluripotentes se tratan con el inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3B por aproximadamente 12 hasta aproximadamente 48 horas.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las células pluripotentes se tratan con el inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3B por aproximadamente 48 horas.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3B se usa a una concentración de aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 100 µ?.
10. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3B se usa a una concentración de aproximadamente 1 µ? hasta aproximadamente 10 µ?.
11. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3B se usa a una concentración de aproximadamente 0 µ?.
12. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3B es un compuesto de la Fórmula (I): Fórmula (I)
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque Ri es fenilo, fenilo sustituido en donde los sustituyentes de fenilo se seleccionan del grupo que consiste de alquilo de Ci-5, halógeno, nitro, trifluorometilo y nitrilo, o pirimidinilo.
14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque F½ es fenilo, fenilo sustituido, en donde los sustituyentes de fenilo se seleccionan del grupo que consiste de alquilo de Ci-5, halógeno, nitro, trifluorometilo y nitrilo, o pirimidinilo el cual es opcionalmente alquilo de C- sustituido, y al menos uno de Ri y R2 es pirimidinilo.
15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque R3 es hidrógeno, 2-(trimetilsilil)etoximetilo, alcoxicarbonilo de Ci-5, ariloxicarbonilo, arilo de Ci-5alquiloxicarbonilo, arilo de Ci-5alquilo, arilo de Ci-salquilo sustituido en donde el único o más sustituyentes arilo se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo de C -5, alcoxi de Ci-5, halógeno, amino, alquilamino de C-|.5, y dialquilamino de Ci_ 5l ftalimido de Ci-salquilo, amino de Ci.5alquilo, diamino de Ci.5alquilo, succinimido de Ci-5alquilo, alquilcarbonilo de Ci-5, arilcarbonilo, alquilcarbonilo de Ci-salquilo de Ci-5 y ariloxicarbonilo de C1-5 alquilo.
16. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque R4 es -(A)-(CH2)q-X.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque A es vinileno, etinileno o
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque R5 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de Ci-5, fenilo y fenilalquilo de C-i-5.
19. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque q es 0-9.
20. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque X se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, hidroxi, vinilo, vinilo sustituido en donde uno o más sustituyentes de vinilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de flúor, bromo, cloro y yodo, etinilo, etinilo sustituido en donde los sustituyentes de etinilo se seleccionan del grupo que consiste de flúor, bromo cloro y yodo, alquilo de C1-5, alquilo de Ci-5 sustituido en donde el único o más sustituyentes de alquilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de alcoxi de C 1-5, trihaloalquilo, ftalimido y amino, cicloalquilo de C3-7, alcoxi de C -5, alcoxi de d-5 sustituido en donde los sustituyentes de alquilo se seleccionan del grupo que consiste de ftalimido y amino, ftalimidooxi, fenoxi, fenoxi sustituido en donde el único o más sustituyentes de fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de alquilo de C-i-5, halógeno y alcoxi de Ci-5, fenilo, fenilo sustituido en donde el único o más sustituyentes de fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de alquilo de C -5, halógeno y alcoxi de Ci-5, arilalquilo de C-i-5, arilalquilo de C-i-5 sustituido en donde el único o más sustituyentes arilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de alquilo de C1.5, halógeno y alcoxi de Ci-5) ariloxialquilamino de Ci-5, alquilamino de C-i-5, dialquilamino de d-5, nitrilo, oxima, benxiloxiimino, alquiloxiimino de Ci-5, ftalimido, succinimido, alquilcarboniloxi de Ci-5, fenilcarboniloxi, fenilcarboniloxi sustituido en donde el único o más sustituyentes de fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de alquilo de Ci-5, halógeno y alcoxi de Ci-5, fenilalquilcarboniloxi de Ci-5 en donde el único o más sustituyentes de fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de alquilo de Ci-5, halógeno y alcoxi de Ci-5, aminocarboniloxi, alquilaminocarboniloxi de Ci-5, dialquilaminocarboniloxi de C1-5, alcoxicarboniloxi de Ci-5, alcoxicarboniloxi de Ci-5 sustituido en donde el único o más sustituyentes de alquilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de metilo, etilo, isopropilo y hexilo, fenoxicarboniloxi, fenoxicarboniloxi sustituido en donde el único o más sustituyentes de fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de alquilo de Ci-5, alcoxi de Ci-5 y halógeno, alquiltio de Ci-5, alquiltio de Ci-5 sustituido en donde los sustituyentes alquilo se seleccionan del grupo que consiste de hidroxi y ftalimido, alquilsulfonilo de Ci-5, fenilsulfonilo, fenilsulfonilo sustituido en donde el único o más sustituyentes de fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste de bromo, flúor, cloruro, alcoxi de C1-5 y trifluorometilo; siempre y cuando A es q es 0 y X es H, entonces R3 no puede ser 2-(trimetilsilil)etoximetilo; y sales farmacéuticamente aceptables de éstos.
21. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque R1 es fenilo sustituido y R2 es pirimidin-3-ilo.
22. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque R1 es 4-fluorofenilo.
23. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque R3 es hidrógeno, arilalquilo de C -5, o arilalquilo de C-i-5 sustituido.
24. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque R3 es hidrógeno o fenilalquilo de C -5.
25. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque A es etinileno y q es 0-5.
26. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque X es succinimido, hidroxi, metilo, fenilo, alquilsulfonilo de Ci-5, cicloalquilo de C3-6, alquilcarboniloxi de C-i-5, alcoxi de. Ci-5, fenilcarboniloxi, alquilamino de Ci-5, dialquilamino de C1-5 o nitrilo.
27. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula I es 4-(4-fluorofenil)-2-(4-hidroxibut¡n-1-il)-1-(3-fenilpropil)-5-(4-piridil)imidazol.
28. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3B es un compuesto de la Fórmula (II): Fórmula (II)
29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R se selecciona del grupo que consiste de Ra, -C -8alquilo-Ra, -C2-8alquenilo-Ra, -C2-8alqu¡nilo-Ra y ciano.
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque Ra se selecciona del grupo que consiste de cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo.
31. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R1 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, -Ci.8alqu¡lo-R5, -C2-8alquenilo-R5, -C2-ealquinilo-R5, -C(0)-(Ci. 8)alquilo-R9, -C(0)-arilo-R8, -C(0)-0-(Ci-8)alquilo-R9, -C(0)-0-arilo-R8, -C(O)-NH(C1-8alquilo-R9), -C(0)-NH(arilo-R8), -C(0)-N(Ci-8alquilo-R9)2, -S02-(C1- 8)alquilo-R9, -S02-arilo-R8, -cicloalquilo-R6, -heterociclilo-R6, -arilo-R6 y -heteroarilo-R6; en donde el heterociclilo y heteroarilo se unen al átomo de nitrógeno del azaindol en una posición a través de un átomo de carbono del anillo de heterociclilo o heteroarilo.
32. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque R5 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -0-(Ci-8)alquilo, -0-(d-8)alquilo-OH, -0-(C1-8)alqu¡lo-0-(Ci.8)alqu¡lo, -0-(C1-8)alquilo-NH2, -0-(Ci-8)alquilo-NH(Ci-8alquilo), -0-(Ci-8)alquilo-N(C1-8alquil)2, -O-(d-eJalquilo-SOríCi-eJalquilo, -O-(d.8)alquilo-S02-NH2, -0-(C1-8)alquilo-S02-NH(C1-8alquilo), -0-(C1-8)alquilo-S02-N(C^alquilo)2, -0-C(0)H, -O-CÍOMd. 8)alquilo, -0-C(O)-NH2, -0-C(O)-NH(C1-8alquilo), -0-C(0)-N(C1-8alquilo)2, -0-(d. 8)alquilo-C(0)H, -O-id-eJalquilo-CtOMCi-^alquilo, -0-(C1-e)alquilo-C02H, -0-(d. 8)alquilo-C(0)-0-(Ci^)alquilo, -0-(C1-8)alquilo-C(0)-NH2, -0-(C1-8)alquilo-C(0)-NH(C1-8alquilo), -0-(C1-8)alquilo-C(0)-N(C1-8alquilo)2, -C(0)H, -CíOMCi-f alquilo, -C02H, -C(0)-0-(C1-8)alquilo, -C(0)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(0)-NH(C1-8alquilo), -C(0)-N(C1-8alquilo)2, -SH, -S-(d-8)alquilo, -S-(Ci-8)alquilo-S-(Ci-8)alquilo, -S-(Ci. s)alquilo-0-(C -8)alqu¡lo, -S-íC^alquilo-O-ÍC^alquilo-OH, -S-(d^)alqu¡lo-0-(d. 8)alquilo-NH2, -S-íd-eJalquilo-O-ÍCi^alquilo-NHÍC^alquilo), -S-(C1-8)alquilo-0- -S02-(Ci.8)alquilo, -S02-NH2> -S02-NH(C -8alquilo), -S02-N(Ci-8alquilo)2) -N-R7, ciano, (halo)i-3, hidroxi, nitro, oxo, -cicloalquilo-R6, -heterociclilo-R6, -arilo-R6 y -heteroarilo-R6.
33. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque R6 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono o nitrógeno independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de -d-s, alquenilo de -C2-8, alquinilo de -C2-8, -C(0)H, -C(0)-(C1-8)alqu¡lo, -C02H, -C(0)-0-(C1-8)alquilo, -C(0)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(0)-NH(Ci.8alquilo), -C(0)-N(Ci-8)alquilo)2, -S02-(Ci-8)alquilo, -S02-NH2, -S02-NH(Ci-8alquilo), -S02-N(Ci-8alquilo)2, -(C1-8)alquilo-N-R7, -(C -8)alquilo-(halo)i-3) -(C -8)alquilo-OH, -arilo-R8, -(Ci-8)alquilo-arilo-R8 y -(C1-8)alquilo-heteroarilo-R8; siempre que, cuando R6 está unido a un átomo de carbono, R6 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste de alcoxi de -d-ß, -(C1-8)alcoxi-(halo)1-3, -SH, -S-(Ci-8)alquilo, -N-R7, ciano, halo, hidroxi, nitro, oxo y -heteroarilo-R8.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque R7 es 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de -Ci-8l alquenilo de -C2-8, alquinilo de -C2-8, -(d^alquilo-OH, -(Ci-8)alquilo-0-(Ci. 8)alquilo, -(C -8)alquilo-NH2, -(C1-8)alquilo-NH(Ci.8alquilo), -(C1-8)alquilo-N(Ci. 8alquilo)2, -(d.8)alqu¡lo-S-(Ci-8)alqu¡lo, -C(0)H, -C(0)-(C1-8)alquilo, -C(0)-0-(C1-8)alquilo, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C1-8alquilo), -C(0)-N(d.8alquilo)2, -S02- (C1-8)alquilo, -S02-NH2, -S02-NH(C1-8alqu¡lo), -S02-N(C -8alquilo)2, -C(N)- NH2> -cicloalquilo-R8, -(C-|.8)alquilo-heterociclilo-R8, -arilo-R8, -(Ci-8)alquilo-arilo-R8 y -(Ci-8)alquilo-heteroarilo-R8.
35. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque R8 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono o nitrógeno independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de -Ci-8, -(Ci-8)alquilo-(halo)i-3 y -(Ci-8)alquilo-OH; siempre i que, cuando R8 está unido a un átomo de carbono, R8 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste de alcoxi de -d-a, -NH2l -NHÍCi-ealquilo), -N(Ci-8alquilo)2, ciano, halo, hidroxi y nitro.
36. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque R9 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alcoxi de -C -8, -NH2, - NH(Ci-8alquilo), -N(Ci-8alquilo)2, ciano, (halo)i-3, hidroxi y nitro.
37. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R2 es un sustituyente unido a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, -Ci. 8alquilo-R5, -C2-8alquenilo-R5, -C2.8alquinilo-R5, -C(0)H, -C(0)-(C1-8)alquilo- R9, -C(0)-NH2> -C(0)-NH(C1-8alquilo-R9), -C(0)-N(C1-8alquilo-R9)2, -C(O)- NH(arilo-R8), -C(0)-cicloalqu¡lo-R9, -C(0)-heterociclilo-R8, -C(0)-arilo-R8, - C(O)-heteroarilo-R8, -C02H, -C(0)-O-(C1-8)alquilo-R9, -C(0)-O-arilo-R8, -S02- (d-eJalquilo-R9, -S02-arilo-R8, -cicloalquilo-R6, -arilo-R6 y -(d^alquilo-N-R7; siempre que, cuando R2 está unido a un átomo de carbono, R2 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste de -Ci-8alcoxi-R5, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, oxo, -heterociclilo-R6 y -heteroarilo-R6.
38. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R3 es 1 a 3 sustituyentes unidos a un átomo de carbono independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -Ci-ealquilo-R10, -C2-8alquenilo-R10, -C2.8alqu¡n¡lo-R10, -C-|.8alcox¡-R10, -C(0)H, -C(0)-(C1-8)alquilo-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(Ci-8alquilo-R9), -C(0)-N(C1-8alquilo-R9)2, -C(0)-cicloalquilo-R8, -C(0)-heteroc¡clilo-R8, -C(O)-arilo-R8, -C(0)-heteroarilo-R8, -C(NH)-NH2, -C02H, -C(0)-0-(C1-8)alquilo-R9, -C(0)-0-arilo-R8, -S02-(Ci-8)alquilo-R9, -S02-arilo-R8, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquilo-R8, -heterociclilo-R8, -arilo-R8 y -heteroarilo-R8.
39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque R 0 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, -NH2, -NH(d. salquilo), -NÍC salquil)^ ciano, (halo)i-3, hidroxi, nitro y oxo.
40. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -C1-8alquilo-R10, -C2-8alquenilo-R10, -C2-8alquinilo-R10, -C1-8alcoxi-R10, -C(O)H, -C(0)-(Ci-8)alquilo-R9, -C(0)-NH2, -C^-NHÍCLaalquilo-R9), -C(O)-N(C -8alquilo-R9)2, -C(0)-cicloalquilo-R8, -C(0)-heterociclilo-R8, -C(0)-arilo-R8, -C(0)-heteroar¡lo-R8, -C(NH)-NH2, -C02H, -C(0)-0-(C1-8)alquilo-R9, -C(O)-0-arilo-R8, -SH, -S-(C1-8)alquilo-R10, -S02-(Ci-8)alqu¡lo-R9, -S02-arilo-R8, -S02- NH2, -S02-NH(Ci.8alquilo-R9), -S02-N(Ci-8alquilo-R9)2, -N-R7, ciano, halógeno, hídroxi, nitro, -cicloalquilo-R8, -heterociclilo-R8, -arilo-R8 y -heteroarilo-R8.
41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque R10 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, -NH2, -NH(C-|. ealquilo), -N(Ci-8alquil)2, ciano, (halo)i-3, hidroxi, nitro y oxo.
42. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque Y y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste de O, S, (?,??) y (H,H); siempre y cuando uno de Y y Z es O y el otro es seleccionado del grupo que consiste de O, S, (H.OH) y (H,H); y sales farmacéuticamente aceptables de éstos.
43. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R se selecciona del grupo que consiste de Ra, -Ci-4alquilo-Ra, -C2-4alquenilo-Ra, -C2-4alquinilo-Ra y ciano.
44. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque Ra se selecciona del grupo que consiste de heterociclilo, arilo y heteroarilo.
45. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque Ra se selecciona del grupo que consiste de dihidro-piranilo, fenilo, naftilo, tienilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, piridinilo, azaindolilo, indazolilo, benzofurilo, benzotienilo, dibenzofurilo y dibenzotienilo.
46. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R1 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, -d^alquilo-R5, -C^alquenilo-R5, -C2-4alquinilo-R5, -C(0)-(Ci. 4)alquilo-R9, -C(0)-arilo-R8, -C(0)-0-(C1-4)alquilo-R9, -C(0)-0-arilo-R8, -C(O)-NH(Ci.4alquilo-R9), -C(0)-NH(arilo-R8), -C(0)-N(C1-4alquilo-R9)2, -S02-(d. 4)alquilo-R9, -SO2-arilo-R8, -cicloalquilo-R6, -heterociclilo-R6, -arilo-R6 y -heteroarilo-R6¡ en donde el heterociclilo y heteroarilo se unen al átomo de nitrógeno del azaindol en una posición a través de un átomo de carbono del anillo de heterociclilo o heteroarilo.
47. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, -C-i^alquilo-R5, -arilo-R6 y -heteroarilo-R6; en donde el heteroarilo se une al átomo de nitrógeno del azaindol en una posición a través de un átomo de carbono del anillo de heteroarilo.
48. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R1 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, -Ci-4alquilo-R5 y -naftilo-R6.
49. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque R5 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -0-(Ci.4)alquilo, -0-(d-4)alquilo-OH, -0-(C )alquilo-0-(C -4)alquilo, -0-(C1-4)alqu¡lo-NH2, -0-(CM)alquilo-NH(C1-4alquilo), - -0-(C -4)alqu¡lo-S02-NH2) -0-(C -4)alquilo-S02-NH(C -4alquilo), -0-(C1-4)alquilo-S02-N(C1-4alquilo)2, -0-C(0)H, -0-C(O)-(d. 4)alquilo, -0-C(0)-NH2, -0-C(0)-NH(C -4alquilo), -0-C(0)-N(C1-4alquilo)2, -0-(d. 4)alqu¡lo-C(0)H, -0-(C1-4)alquilo-C(0)-(C1-4)alquilo, -0-(C1- )alqu¡lo-C02H, -0-(d. 4)alquilo-C(0)-0-(C1^)alquilo, -0-(C1^,)alquilo-C(0)-NH2, -0-(C^)alquilo-C(O)-NH(C^alquilo), -0-(C^)alquilo-C(0)-N(CMalquilo)2, -C(0)H, -C(0)-(d.4)alquilo, -C02H, -C(O)-0-(CM)alquilo, -C(0)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(0)-NH(C1-4alquilo), -C(O)-N(d.4alquilo)2) -SH, -S-(C^)alquilo, -S-íd^alquilo-S-íd^alquilo, -S-(d. 4)alquilo-0-(CM)alquilo, 4)alquilo-NH2, -S-ÍCi^alquilo-O-íd^alquilo-NHÍd.-íalquilo), -S-(d-4)alquilo-0- S02-NH2, -S02-NH(C - alquilo), -S02-N(C1-4alquilo)2, -N-R7, ciano, (halo)1-3, hidroxi, nitro, oxo, -cicloalquilo-R6, -heterociclilo-R6, -arilo-R6 y -heteroarilo-R6.
50. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque R5 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -0-(C1-4)alquilo, -N-R7, hidroxi y -heteroarilo-R6.
51. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque R5 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -O-íd-^alquilo, -N-R7, hidroxi, -imidazolilo-R6, -triazolilo-R6 y -tetrazolilo-R6.
52. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque R6 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono o nitrógeno independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de -C1-4, alquenilo de -C2-4, alquinilo de -C2-4, -C(0)H, - C(0)-(C )alqu¡lo, -C02H, -C(0)-0-(C )alqu¡lo, -C(0)-NH2) -C(NH)-NH2) -C(0)-NH(C1-4alqu¡lo), -C(0)-N(C1-4)alquilo)2, -S02-NH2l -S02-NH(C -4alquilo), -S02-N(Ci- alquilo)2l -(C -4)alqu¡lo-N-R7, -(C^alquilo-íhalo)^, -(C -4)alquilo-OH, -ar¡lo-R8, y -(C -4)alquilo-heteroarilo-R8; siempre que, cuando R6 está unido a un átomo de carbono, R6 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste de alcoxi de -C1-4, -SH, -S-(Ci-4)alquilo, -N-R7, ciano, halo, hidroxi, nitro, oxo y -heteroarilo-R8.
53. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque R6 es hidrógeno.
54. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque R7 es 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de -Ci-4, alquenilo de -C2-4, alquinilo de -C2-4, -(C -4)alquilo-OH, -(C-i-4)alquilo-0-(Ci. 4)alquilo, -(Ci-4)alquilo-NH2, -(Ci-4)alquilo-NH(C -4alquilo), -(Ci-4)alquilo-N(Ci. 4alquilo)2, -(Ci-4)alquilo-S-(C -4)alquilo, -C(0)H, -C(0)-(C1-4)alquilo, -C(0)-0-(C1-4)alquilo, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(Ci-4alquilo), -C(0)-N(C1-4alquilo)2l -S02-(C -4)alquilo, -S02-NH2l -SOz-NI-KC^alquilo), -S02-N(C1-4alquilo)2l -C(N)-NH2l -cicloalquilo-R8, -(Ci-4)alquilo-heterociclilo-R8, -arilo-R8, -(Ci- )alquilo-arilo-R8 y -(Ci- )alquilo-heteroarilo-R8.
55. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque R7 es 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de -Ci- , -C(0)H, -C(0)-(Ci-4)alquilo, -S02-NH2, -S02-NH(C1-4alquilo) y - S02-N(Ci-4alquilo)2.
56. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque R8 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono o nitrógeno independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de -Cu, -(Ci-4)alquilo-(halo)i-3 y -(C^)alquilo-OH; siempre que, cuando R8 está unido a un átomo de carbono, R8 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste de alcoxi de -d-4, -NH2, -N(Ci. alquilo)2, ciano, halo, -(Ci-4)alcoxi-(halo)i-3, hidroxi y nitro.
57. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque R8 es hidrógeno.
58. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque R9 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, alcoxi de -Ci-4, -NH2, -NH(Ci-4alquilo), -N(Ci-4alqu¡lo)2, ciano, (halo) -3) hidroxi y nitro.
59. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque R9 es hidrógeno.
60. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque, R2 es un sustituyente unido a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, -C-i. 4alquilo-R5, -C2-4alquenilo-R5, -C2-4alquinilo-R5, -C(0)H, -C(0)-(Ci-4)alqu¡lo-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C1-4alquilo-R9), -C(0)-N(C1-4alquilo-R9)2) -C(O)-NH(arilo-R8), -C(0)-cicloalquilo-R8. -C(0)-heterociclilo-R8, -C(0)-arilo-R8, -C(0)-heteroarilo-R8, -C02H, -C(0)-0-(C1-4)alquilo-R9, -C(0)-0-arilo-R8, -S02- (Ci-4)alqu¡lo-R9, -SO2-arilo-R8, -cicloalquilo-R6, -arilo-R6 y -(Ci-4)alquilo-N-R7; siempre que, cuando R2 está unido a un átomo de carbono, R2 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste de -C-i-4alcoxi-R5, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, oxo, -heterociclilo-R6 y -heteroarilo-R6.
61. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R2 es un sustituyente unido a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, -C-i. 4alquilo-R5, -C2-4alquenilo-R5, -C2-4alquinilo-R5, -C02H, -C(0)-0-(Ci-4)alquilo-R9, -cicloalquilo-R6, -arilo-R6 y -(Ci-4)alquilo-N-R7; siempre que, cuando R2 está unido a un átomo de nitrógeno, no se forma una sal cuaternaria; y, siempre que, cuando R2 está unido a un átomo de carbono, R2 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste de -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, oxo, -heterociclilo-R6 y -heteroarilo-R6.
62. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R2 es un sustituyente unido a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, -Cv 4alquilo-R5 y -arilo-R6; siempre que, cuando R2 está unido a un átomo de nitrógeno, no se forma una sal cuaternaria; y, siempre que, cuando R2 está unido a un átomo de carbono, R2 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste de -N-R7, halógeno, hidroxi y -heteroarilo-R6.
63. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque, R3 es 1 a 3 sustituyentes unidos a un átomo de carbono independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -C-ualquilo-R10, -C2-4alquen¡lo-R10, -C2-4alquinilo-R10, -C^alcoxi-R 0, -C(0)H, -C(0)-(C1-4)alquilo-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C^alquilo-R9), -C(0)-N(d. 4alquilo-R9)2l -C(0)-cicloalqu¡lo-R8, -C(0)-heterociclilo-R8, -C(0)-arilo-R8, -C(O)-heteroarilo-R8, -C(NH)-NH2, -C02H, -C(0)-0-(C1_4)alquilo-R9, -C(0)-0-arilo-R8, -S02-(C1-8)alquilo-R9, -S02-arilo-R8, -N-R7, -(C1-4)alquilo-N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquilo-R8, -heterociclilo-R8, -arilo-R8 y -heteroarilo-R8.
64. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R3 es un sustituyente unido a un átomo de carbono seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, -Ci.4alquilo-R10, -C2-4alquenilo-R10, -C2-4alquinilo-R10, -C1-4alcoxi-R10, -C(O)H, -C02H, -NH2, -NH(Ci-4alquilo), -N(Ci-4alquilo)2, ciano, halógeno, hidroxi y nitro.
65. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R3 es un sustituyente unido a un átomo de carbono seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, -NH2, -NH(Ci-4alquilo), -N(Ci.4alquilo)2, halógeno e hidroxi.
66. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -C1-4alquilo-R10, -C2- alquenilo-R10, -C2-4alquinilo-R10, -C1-4alcoxi-R10, -C(0)H, -C(0)-(C1-4)alqu¡lo-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C1-4alquilo-R9), -C(O)-N(Ci_4alquilo-R9)2, -C(0)-cicloalqu¡lo-R8, -C(0)-heteroc¡clilo-R8, -C(0)-arilo-R8, -C(0)-heteroarilo-R8, -C(NH)-NH2, -C02H, -C(0)-0-(C1-4)alquilo-R9, -C(0)-0-arilo-R8, -SH, -S-(C )alquilo-R10, -S02-(C1-4)alquilo-R9, -S02-arilo-R8, -S02- NH2) -S02-NH(CMalquilo-R9), -S02-N(C1-4alquilo-R9)2, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquilo-R8, -heterociclilo-R8, -arilo-R8 y-heteroarilo-R8.
67. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -C2-4alquenilo-R10, -C2-4alquinilo-R10, -C-|. alcox¡-R10, -C(0)H, -C02H, -NH2, -NH(Ci-4alquilo), -N(Ci-4alquilo)2, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquilo, -heterociclilo, -arilo y -heteroarilo.
68. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, Ci-4alquilo-R10, C1-4alcoxi-R10, -NH2, -NHÍC^alquilo), -N(Ci-4alquilo)2, halógeno e hidroxi.
69. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, C -4alquilo-R10, -NH2, -NH(C1-4alquilo), -N(Ci-4alquilo)2, cloro, flúor e hidroxi.
70. El método de conformidad con las reivindicaciones 38 y 41 , caracterizado además porque R10 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno, -NH2, -NH(C1-4alquilo), -N(C1- alquilo)2, ciano, (halo)i-3, hidroxi, nitro y oxo.
71. El método de conformidad con las reivindicaciones 38 y 41 , caracterizado además porque R10 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno y (halo)i.3.
72. El método de conformidad con las reivindicaciones 38 y 41 , caracterizado además porque R10 es 1 a 2 sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidrógeno y (fluoro)3.
73. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque Y y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste de O, S, (?,??) y (H,H); siempre y cuando uno de Y y Z es O y el otro se selecciona del grupo que consiste de O, S, (?,??) y (H,H).
74. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque Y y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste de O y (H,H); siempre y cuando uno de Y y Z es O, y el otro es seleccionado del grupo que consiste de O y (H,H).
75. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque Y y Z se seleccionan independientemente de O.
76. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula II es 3-[1-(3-hidroxipropil)-1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il]-4-[2-(trifluorometil)fenil]-1H-pirrol^ 2,5-diona.
77. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula II es 3-[1-(3-hidroxipropil)-1 H-pirrolo[2,3-£»]piridin-3-il]-4-(1 -metil-1 H-pirazol-3-il)-1 H-pirrol-2,5-diona.
78. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula II es 3-[1 -(3-hidroxi-propil)-1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il]-4-p¡razin-2-il-pirrol-2,5-diona.
79. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula II es 3-(2,4-dimetoxi-pirimidin-5-il)-4-[1-(3-hidroxr-propil)-1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il]-pirrol-2,5-diona.
80. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula II es 4-{3-[4-(2,4-dimetoxi-pirimidin-5-il)-2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-3-il]-pirrolo[2,3-b]piridin-1-il}-butironitrilo.
81. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula II es 4-{3-[4-(1-metil- H-p¡razol-3-il)-2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-3-il]-pirrolo[2,3-b]piridin-1-il}-butironitrilo.
82. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula II es 3-(2,4-dimetoxi-pirimidin-5-il)-4-(1-fenetil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-il)-pirrol-2,5-diona.
83. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el inhibidor de la actividad enzimática de GSK-3B es un compuesto de la Fórmula (III): H Fórmula (III)
84. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque A y E se seleccionan independientemente del grupo que consiste de un átomo de carbono sustituido con hidrógeno y un átomo de nitrógeno; en donde es independientemente seleccionado del grupo que consiste de H-indol, 1H-pirrolo[2,3-£»]piridina, 1 -/-pirazolo[3,4-/?]piridina y 1/- -indazol.
85. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque Z se selecciona de O; alternativamente, Z se selecciona de dihidro; en donde cada átomo de hidrógeno está unido por un enlace simple.
86. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque R4 y R5 se seleccionan independientemente de alquilo de C-t-e, alquenilo de C2-8 y alquinilo de C2-8 opcionalmente sustituido con oxo.
87. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque R2 se selecciona del grupo que consiste de alquilo de -Ci-8, alquenilo de -C2-8, alquinilo de -C2-8, -0-(Ci-8)alquilo-0-, -0-(C2-8)alquenilo-0-, -0-(C2-8)alquinilo-0-, -C(0)-(C -8)alquilo-C(0)- (en donde cualquiera de los grupos de enlace de alquilo, alquenilo y alquinilo antes mencionados son cadenas de carbono rectas opcionalmente sustituidas con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de C-?-ß, alcoxi de C1-8, Ci-8alcoxi(C1-8)alquilo, carboxilo, carboxilo(Ci-8)alquilo, -C(0)0-(Ci-8)alquilo, -Ci-8alquilo-C(0)0-(C -8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C- ), am¡no(Ci-8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de .4), halógeno, (halo)1-3(Ci-8)alquilo, (halo)1-3(Ci-8)alcoxi, hidroxi, hidroxi(Ci-8)alquilo y oxo; y, en donde cualquiera de los grupos de enlace de alquilo, alquenilo y alquinilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con uno a dos sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de heterociclilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo(Ci.8)alquil, arilo(Ci.8alquilo, heteroarilo(Ci-8)alquilo, espirocicloalquilo y espiroheterociclilo (en donde cualquiera de los sustituyentes de cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de Ci.e, alcoxi de C-i-a, Ci-8alcoxi(Ci.8)alquilo, carboxilo, carboxilo(Ci. 8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C-M), amino alquilo de (C-i-8) (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C- ), halógeno, (halo)i-3(Ci-8)alquilo, (halo)i-3(Ci-8)alcoxi, hidroxi e hidroxi alquilo de (Ci-8); y, en donde cualquiera de los sustituyentes de heterociclilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con oxo)), cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo (en donde cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo son opcionalmente sustituidos con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de Ci-8, alcoxi de C-?-ß, Ci.8alcoxi alquilo de (Ci-8), carboxilo, carboxilo(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C- ), amino(Ci-8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C1-4), halógeno, (halo)1-3(Ci. 8)alcoxi, hidroxi e hidroxi alquilo de (Ci-8); y, en donde heterociclilo es opcionalmente sustituido con oxo), -(0-(CH2)i-6)o-5-0-, -0-(CH2)i-6-0-(CH2)i.6-O-, -0-(CH2)1-6-0-(CH2)1-6-0-(CH2)i-6-0-, -(O-(CH2)1-6)0-5-NR6-, -0-(CH2)1-6- NR6-(CH2)1-6-0-, -0-(CH2) 6-0-(CH2)1-6-NR6-, -(O-ÍCH^o-s-S-, -0-(CH2)1-6-S-(CH2)i-6-0-, -0-(CH2)1-6-0-(CH2)i-6-S-, -NR6-, -NR6-NR7-, -NR6-(CH2)i.6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)i-6-NR8-, -NR6-C(0)-, -C(0)-NR6-, -C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-, -NRe-íCH^o-e-CÍOJ-ÍCH^^-CÍOí-ÍCHz NRr-, -NR6-C(0)-NR7-, -NR6-C(NR7)-NR8-, -O-iCHz e-NRe-iCH^-S-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-0-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-, -NR6-(CH2)1,6-S-(CH2)1-6-NR7- y -S02-(en donde R6, R7 y Re se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de C-i.8, carboxilo(Ci. 8)alquilo, amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C- ), hidroxi (Ci-8)alquilo, heterociclilo(C1-8) alquilo, arilo(Ci-8)alquilo y heteroarilo (Ci-8)alquilo (en donde los sustituyentes de heterociclilo, arilo y heteroarilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de C-i-8l alcoxi de C1-8- C1-8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxilo(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C1-4), amino(Ci-8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de CM), halógeno, (halo)i-3(Ci-8)alquilo, (halo)1-3(Ci. 8)alcox¡, hidroxi e hidroxi(Ci-8)alquilo; y, en donde heterociclilo es opcionalmente sustituido con oxo)); siempre y cuando, A y E se seleccionen de un átomo de carbono sustituido con hidrógeno, entonces R2 se selecciona del grupo que consiste de alquinilo de -C2-8, -0-(Ci.e)alquilo-, -0-(C2-8)alquenilo-0-, -0-(C2-8)alquin¡lo-0-, -C(0)-(Ci-8)alqu¡lo-C(0)- (en donde cualquiera de los grupos de enlace de alquilo, alquenilo y alquinilo antes mencionados son cadenas de carbono rectas opcionalmente sustituidas con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de C1-8, alcoxi de Ci-8, carboxilo, carboxilo(C -8)alquilo, -C(0)0-(Ci-8)alquilo, -C1-8alquilo-C(0)0-(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyeme independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de Ci-4), amino alquilo de (Ci-8) (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C1- ), halógeno, (halo)i-3(Ci-8)alquilo, (halo)1-3(Ci-8)alcoxi, hidroxi, hidroxi(Ci-8)alquil y oxo; y, en donde cualquiera de los grupos de enlace de alquilo, alquenilo y alquinilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con uno a dos sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de heterociclilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo(Ci-8)alquilo, arilo(C-i-8)alquilo, heteroarilo(Ci-8)alquilo, espirocicloalquilo y espiroheterociclilo (en donde cualquiera de los sustituyentes de cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de Ci-8, alcoxi de Ci-8, C1-8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxiloíCi. 8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C^), amino(Ci. 8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C^), halógeno, (halo^íC^alquilo, (halo)i.3(Ci-8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(Ci-8)alquilo; y, en donde cualquiera de los sustituyentes de heterociclilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con oxo)), cicloalquilo (en donde cicloalquilo es opcionalmente sustituido con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de Ci-a, alcoxi de C-i-8, C-i-8alcox¡(Ci-8)alqu¡lo, carboxilo, carboxilo(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C-i^), amino(Ci.8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C- ), halógeno, (halo)i-3(C1- 6)alquilo, (halo)1-3(C -8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(C -8)alquilo), -(0-(CH2)i-6)i-5-0-, -0-(CH2)i-6-0-(CH2)i.6-0-, -0-(CH2)1-6-0-(CH2)i-6-0-(CH2)1-6-O-, -(0-(CH2)i-e)i. 5-NR6-, -0-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-0-, -0-(CH2)1-6-0-(CH2)1-6-NR6-, -(0-(CH2)i. 6)o-5-S-, -0-(CH2)1-6-0-(CH2)1-6-S-, -NR6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-, -NR9-C(0)-, -C(0)-NR9-, -CiOJ-iCH^o-e- Re-iCH^o-e-CiO)-, -NR6-(CH2)o-6-C(O)-(CH2)i.6-C(0)-(CH2)o-6-NR7-, -NR6-C(0)-NR7-, -NR6-C(NR7)-NR8-, -O-iCHz e-NRHCH^e-S-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-0-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S- y -NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)i- 6-NR7- (en donde R8, R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de Ci-8, Ci-8alcox¡(Ci-8)alquilo, carboxilo(Ci. s)alquilo, amino(C1-8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C1-4), hidroxi(Ci-e)alquilo, heterociclilo(Ci-8)alquilo, arilo(Ci-8)alquil y heteroarilo(Ci-8)alquilo (en donde los sustituyentes de heterociclilo, arilo y heteroarilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de C-i-e, alcoxi de Ci-e, Ci.8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxilo(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C- ), amino(Ci-8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C ), halógeno, (halo)i-3(Ci_ 8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(Ci-8)alquilo; y, en donde heterociclilo es opcionalmente sustituido con oxo); y, caracterizado además porque R9 se selecciona del grupo que consiste de alquilo de Ci-ß, Ci.8alcox¡(Ci.8)alqu¡lo, carboxilo(Ci-8)alquilo, amino(Ci-8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de 01-4), hidroxi(Ci-8)alquilo, heterociclilo(Ci-8)alqu¡lo, arilo(Ci.8)alquilo y heteroarilo(Ci-8)alquilo (en donde los sustituyentes de heterociclilo, arilo y heteroarilo antes mencionados son opcionalmente sustituidos con uno a cuatro sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de alquilo de Ci-8, alcoxi de C1-8, Ci,8alcox¡(C1-8)alquilo, carboxilo, carboxilo(C-|.8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C ), am¡nó(Ci-8)alqu¡lo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de CM), halógeno, (halo)i-3(Ci.8)alquilo, (halo)i.3(Ci. 8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(Ci-8)alquilo; y, en donde heterociclilo es opcionalmente sustituido con oxo)).
88. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque Ri y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo de C1-3, alquenilo de C2-8, alquinilo de C2-8 (en donde alquilo, alquenilo y alquinilo son opcionalmente sustituidos con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste de alcoxi de Ci-ß, alcoxi(Ci. 8)alquilo, carboxilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C- ), amino(Ci-8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C- ), (halo)i-3, 8)alquil y oxo), alcoxi de Ci-8, alcoxicarbonilo de C1-8, alquiltio de C1-8, arilo, heteroarilo (en donde arilo y heteroarilo son opcionalmente sustituidos con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste de alquilo de Ci-a, alcoxi de d-e, alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxiloíC-i-sJalquilo, amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C1-4), amino(Ci-8)alquilo (en donde amino es sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de C -4), halógeno, (halo)-i. 3(Ci-e)alcox¡, hidroxi e h¡drox¡(Ci-8)alquilo), amino (sustituido con un sustituyente independientemente seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de Ci-4), ciano, halógeno, hidroxi y nitro; y sales farmacéuticamente aceptables de éstos.
89. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 6,7,9, 10, 12, 13, 15, 16-octahidro-23H-5,26: 17,22-dimeteno-5H-dipirido[2,3-k:3\2'-q]pirrolo[3,4-n][1 ,4,7,10,19]trioxadiazaciclohenicosino-23,25(24H)-diona.
90. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 10,1 ,13,14,16,17,19,20,22,23-decahidro-9,4:24,29-dimeteno-1H-dip¡rido[2,3-n:3\2'-t]pirrolo[3,4-q][1 ,4,7,10,13,22]tetraoxadiazaciclotetracosino-1,3(2H)-diona.
91. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 10,11 , 13,14, 16,17,19,20,22,23,25,26-dodecahidro-9,4:27,32-dimeteno-1 H-dipirido^.S-qiS'^'-wJpirrolo ^-t][1 ,4,7,10,13,16,25]pentaoxadiazacicloheptacosina-1,3(2H)-diona.
92. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es ey.g.lO.^.IS-hexahidro^OH-S^SiH.ig-dimeteno-SH-dibenzoth.nJpirrolo ^-k][1 ,4,7,16]dioxadiazaciclooctadecino-20,22(21H)-diona.
93. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 6,7,9,10,12,13,15,16-octah¡dro-23H-5,26:17,22-dimeteno-5H-dibenzo[k,q]p¡rrolo[3,4-n][1 ,4,7, 10, 19]trioxadiazaciclohene¡cos¡no-23,25(24H)-diona.
94. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 10,11 ,13I14,16)17,19)20,22,23-decahidro-9,4:24I29-d¡meteno-1 H-dibenzo[n,t]pirrolo[3,4-q][1 ,4,7,10,13,22]tetraoxadiazaciclotetracosino- 1 ,3(2H)-diona.
95. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es el Compuesto 1a.
96. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-[3-[(2-hidroxietil)metilamino]propil]-1 H-indazol-3-il]-4-[1 -(3-p¡ridinil)-1 H-indol-3-il]-1 H-pirrol-2,5-d¡ona.
97. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3,5-dicloro-N-[3-cloro^-[(3,4 2 2a-tetrahidro-1H-[1 ,4]tiaz¡no[3l4-c][1 l4]benzod¡azepin- 11 (6H)-il)carbonil]fenil]-benzamida.
98. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-(2-hidrox¡-etil)-1 H-indol-3-il]-4-(1 -pirid¡n-3-il-1 H-indol-3-i!)-pirrol-2,5-diona.
99. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-(2-metoxi-fenil)-4-(1-piridin-3-¡l-1 H-indol-3-il)-pirrol-2,5-d¡ona.
100. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 6-[[2-[[4-(2,4-diclorofenil)-5-(4-metil-1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]amino]-3-piridinacarbonitrilo.
101. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-(5-cloro-1-metil-1 H-indol-3-il)-4-[1-(3-imidazol-1 -il-propil)-1 H-indazol-3-il]-pirrol-2,5-diona.
102. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-(5-cloro-1-metil-1 H-indo!-3-íl)-4-[1-(3-[1 ,2,3]triazol-1-il-propil)-1 H-¡ndazol-3-il]-pirrol-2,5-diona.
103. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-(3-hidroxi-propil)-1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il]-4-(1 -metil-1 H-pirazol-3-il)-pirrol-2,5-diona.
104. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es el Compuesto 0a.
105. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-(3- idrox¡- 3-metil-butil)-1 H-indazol-3-il]-4-(1 -pirid¡n-3-¡l-1 H-indol-3-¡l)-p¡rrol-2,5-diona.
106. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-(2- hidroxi-etil)-1H-¡ndazol-3-il]-4-(1-pirimidin-5-il-1 H-indol-3-il)-pirrol-2,5-diona.
107. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-(2-hidroxi-etil)-1 H-indol-3-il]-4-(1 -pir¡midin-5-il-1 H-indol-3-il)-pirrol-2,5-diona.
108. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es (11Z)-8,9,10, 3,14, 15-hexahidro-2,6:17,21-di(meteno)pirrolo[3,4-h][1 ,15,7]dioxazaciclotr¡cosina-22,24(1 H, 23H)-diona.
109. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-(5-cloro-1-piridin-3-il-1 H-indol-3-il)-4-[1-(3-hidroxi-propil)-1 H-indazol-3-il]-pirrol-2,5-diona.
110. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-(2-metox¡-fenil)-4-[1-(3-metoxi-propil)-1H-pirrolo[3,2-c]piridin-3-il]-pirrol-2,5-diona.
111. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-(3-hidroxi-propil)-1H-indazol-3-il]-4-[1-(tetrah¡dro-p¡^
112. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 2-{3-[4-(5-cloro-1 -metil-1 H-indol-3-il)-2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-3-il]-indazol-1 -il}-N-(2-hidroxi-etil)-acetamida.
113. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 4-(3-cloro- fenil)-6-(3-dimetilamino-propi^ 1 ,3-diona.
114. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 14-etil-6,7,9,10,13,14,15,16-octahidro-12H, 23H-5,26:17,22-dimetenodibenzo[k,q]pirrolo[3,4-n][1 ,4,7, 10,19]dioxatriazacicloheneicosino-23,25(24H)-diona.
115. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 14-benzil-6,7,9,10,13,14,15,16-octahidro-12H, 23H-5,26:17,22-di(meteno)dibenzo[k,q]pirrolo[3,4-n][1 ,4,7,10,19]dioxatriazaciclohenicos¡no-23,25(24H)-diona.
116. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-(1 -{2-[2-(2-hidroxi-etoxi)-etoxi]-etil}-1H-indol-3-il)-4-[1-(2-hidroxi-etil)-1 H-indol-3-il]- pirrol-2,5-diona.
117. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 6,7,8,9, 10, 11 , 12, 13-octahidro-8, 11 -dimetil-5,23: 14, 19-dimeteno-20H- dibenzo[k,q]pirrolo[3,4-n][1 ,4,7,10]tetraazaciclooctadecino-20,22(21 H)-diona.
118. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 7,8,9,10,12,13, 16,17, 18, 19-decahidro-8,17-d¡metil-15H, 26H-5,29:20,25- dimeteno-6H-dibenzo[k,q]pirrolo[3,4-n][1 ,4,7,10,19,22]dioxatetraazaciclotetracosino-26,28(27H)-diona.
119. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 14-(2-furilmeti -ej.G.IO.ia.M.IS.ie-octahidro-^H, 23H-5,26:17,22-di(meteno)dibenzo[k,q]pirrolo[3,4-n][1 ,4,7, 10,19]dioxatriazaciclohenicosino-23,25(24H)-diona.
120. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 14-(2-tienilmeti -ej.g.lO.IS.M.IS.ie-octahidro-^H, 23H-5,26:17,22-di(meteno)dibenzo[k,q]pirrolo[3,4-n][1 ,4,7,10,19]dioxatriazaciclohenicosino-23,25(24H)-diona.
121. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 14-(1-naftilmeti -ej^.lO.IS. .IS.ie-octahidro-^H, 23H-5,26:17,22-di(meteno)dibenzo[k,q]pirrolo[3,4-n][1 ,4,7,10, 9]dioxatriazaciclohenicosino-23,25(24H)-diona.
122. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 14-(pir¡din-4-ilmetil)-6,7,9(10,13,14,15I16-octahidro-12H, 23H-5.26: 17,22-di(meteno)dibenzo[k,q]pirrolo[3,4-n][1 ,4,7, 10,19]dioxatriazaciclohenicosino-23,25(24H)-diona.
123. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1 -(2-{2- [2-(1,2,3,4-tetrahidro-naftalen-1-ilam [2-(1,2,3,4-tetrah¡dro-naftalen-1-ilam^
124. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-(3-dimetilamino-fenil)-1 H-indol-3-il]-4-[1 -(2-hidroxi-etil)-1 H-indazol-3-il]-pirrol-2,5-diona.
125. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[5-cloro-1-(6-dimetilamino-piridin-3-il)-1 H-indol-3-il]-4-[1-(2-hidroxi-etil)-1 H-indazo^ il]-pirrol-2,5-diona.
126. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es metil éster del ácido 5-(5-cloro-3-{4-[1-(2-hidroxi-etil)-1 H-indazol-3-¡l]-2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-3-il}-indol-1-il)-nicotínico.
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