JP2017012184A - 多能性細胞の処理 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】多能性細胞を培養する過程と、多能性細胞をGSK−3Bの酵素活性阻害剤で処理する過程とを含み、GSK−3Bの酵素活性阻害剤が、3−[1−(2−ヒドロキシエチル)−1H−インドール−3−イル]−4−(1−ピリジン−3−イル−1H−インドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオンである、多能性細胞を増殖及び分化するための方法。
【選択図】なし
Description
を達成するのに十分な時間、暴露することを含む。
a.多能性細胞を培養する過程と、
b.多能性細胞をGSK−3Bの酵素活性阻害剤で処理する過程と、を含む。
幹細胞は、単一の細胞レベルにて自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉(内胚葉、中胚葉及び外胚葉)から様々な細胞系統の機能的細胞に分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
、以下のマーカーの少なくとも1つを発現している細胞を指す:PDX−1、HNF−1β、PTF−1α、HNF−6、又はHB9。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞を含む。
c.多能性細胞を培養する過程と、
d.多能性細胞をGSK−3Bの酵素活性阻害剤で処理する過程。
一実施形態において、GSK−3Bの酵素活性阻害剤は式(I)の化合物:
R1はフェニル、置換フェニルであり、フェニル置換基はC1〜5アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル及びニトリル、又はピリミジニルからなる群から選択され;
R2はフェニル、置換フェニル(ここでフェニル置換基はC1〜5アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、及びニトリル、からなる群から選択される)、又は任意にC1〜4アルキルで置換されていてもよいピリミジニルであり、及びR1及びR2の少なくとも一方はピリミジニルである、
R3は水素、2−(トリメチルシリル)エトキシメチル、C1〜5アルキルカルボニル、アリールオキシカルボニル、アリールC1〜5アルキルオキシカルボニル、アリールC1〜5アルキル、置換アリールC1〜5アルキル(ここで1つ以上のアリール置換基は、独立して、C1〜5アルキル、C1〜5アルコキシ、ハロゲン、アミノ、C1〜5アルキルアミノ、及びジC1〜5アルキルアミノからなる群から選択される)、フタルイミドC1〜5アルキル、アミノC1〜5アルキル、ジアミノC1〜5アルキル、スクシンイミドC1〜5アルキル、C1〜5
アルキルカルボニル、アリールカルボニル、C1〜5アルキルカルボニルC1〜5アルキル及びアリールオキシカルボニルC1〜5アルキルであり;
R4は、−(A)−(CH2)q−Xであり;
Aは、ビニレン、エチニレン又は
R5は、水素、C1〜5アルキル、フェニル、及びフェニルC1〜5アルキルからなる群から選択され;
qは0〜9であり;
Xは、水素、ヒドロキシ、ビニル、置換ビニル(ここで1つ以上のビニル置換基はそれぞれ、フッ素、臭素、塩素、及びヨウ素からなる群から選択される)、エチニル、置換エチニル(ここでエチニル置換基は、フッ素、臭素塩素、及びヨウ素からなる群から選択される)、C1〜5アルキル、置換されたC1〜5アルキル(ここで1つ以上のアルキル置換基はそれぞれ、C1〜5アルコキシ、トリハロアルキル、フタルイミド、及びアミノからなる群から選択される)、C3〜7シクロアルキル、C1〜5アルコキシ、置換されたC1〜5アルコキシ(ここでアルキル置換基は、フタルイミド及びアミノらなる群から選択される)、フタルイミドオキシ、フェノキシ、置換フェノキシ(ここで1つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、C1〜5アルキル、ハロゲン、及びC1〜5アルコキシからなる群から選択される)、フェニル、置換フェニル(ここで1つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、C1〜5アルキル、ハロゲン、及びC1〜5アルコキシからなる群から選択される)、アリールC1〜5アルキル、置換アリールC1〜5アルキル(ここで1つ以上のアリール置換基はそれぞれ、C1〜5アルキル、ハロゲン、及びC1〜5アルコキシからなる群から選択される)、アリールオキシC1〜5アルキルアミノ、C1〜5アルキルアミノ、ジC1〜5アルキルアミノ、ニトリル、オキシム、ベンジルオキシイミノ(benxyloxyimino)、C1〜5アルキルオキシイミノ、フタルイミド、スクシンイミド、C1〜5アルキルカルボニルオキシ、フェニルカルボニルオキシ、置換フェニルカルボニルオキシ(ここで1つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、C1〜5アルキル、ハロゲン、及びC1〜5アルコキシからなる群から選択される)、フェニルC1〜5アルキルカルボニルオキシ(ここで1つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、C1〜5アルキル、ハロゲン、及びC1〜5アルコキシからなる群から選択される)、アミノカルボニルオキシ、C1〜5アルキルアミノカルボニルオキシ、ジC1〜5アルキルアミノカルボニルオキシ、C1〜5アルキルカルボニルオキシ、置換されたC1〜5アルキルカルボニルオキシ(ここで1つ以上のアルキル置換基はそれぞれ、メチル、エチル、イソプロピル、及びヘキシルからなる群から選択される)、フェノキシカルボニルオキシ、置換フェノキシカルボニルオキシ(ここで1つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、C1〜5アルキル、C1〜5アルコキシ、及びハロゲンからなる群から選択される)、C1〜5アルキルチオ、置換されたC1〜5アルキルチオ(ここでアルキル置換基は、ヒドロキシ及びフタルイミドからなる群から選択される)、C1〜5アルキルスルホニル、フェニルスルホニル、置換フェニルスルホニル(ここで1つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、臭素、フッ素、塩素、C1〜5アルコキシ、及びトリフルオロメチルからなる群から選択される);但し、Aが
Rは、Ra、−C1〜8アルキル−Ra、−C2〜8アルケニル−Ra、−C2〜8アルキニル−Ra、及びシアノからなる群から選択され;
Raは、シクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリールからなる群から選択され;
R1は、水素、−C1〜8アルキル−R5、−C2〜8アルケニル−R5、−C2〜8アルキニル−R5、−C(O)−(C1〜8)アルキル−R9、−C(O)−アリール−R8、−C(O)−O−(C1〜8)アルキル−R9、−C(O)−O−アリール−R8、−C(O)−NH(C1〜8アルキル−R9)、−C(O)−NH(アリール−R8)、−C(O)−N(C1〜8アルキル−R9)2、−SO2−(C1〜8)アルキル−R9、−SO2−アリール−R8、−シクロアルキル−R6、−複素環−R6、−アリール−R6、及び−ヘテロアリール−R6からなる群から選択され;ここで、複素環及びヘテロアリールは、複素環又はヘテロアリール環の炭素原子を通して1の位置のアザインドール窒素原子と結合しており;
R5は、水素、−O−(C1〜8)アルキル、−O−(C1〜8)アルキル−OH、−O−(C1〜8)アルキル−O−(C1〜8)アルキル、−O−(C1〜8)アルキル−NH2、−O−(C1〜8)アルキル−NH(C1〜8アルキル)、−O−(C1〜8)アルキル−N(C1〜8アルキル)2、−O−(C1〜8)アルキル−S−(C1〜8)アルキル、−O−(C1〜8)アルキル−SO2−(C1〜8)アルキル、−O−(C1〜8)アルキル−SO2−NH2、−O−(C1〜8)アルキル−SO2−NH(C1〜8アルキル)、−O−(C1〜8)アルキル−SO2−N(C1〜8アルキル)2、−O−C(O)H、−O−C(O)−(C1〜8)ア
ルキル、−O−C(O)−NH2、−O−C(O)−NH(C1〜8アルキル)、−O−C(O)−N(C1〜8アルキル)2、−O−(C1〜8)アルキル−C(O)H、−O−(C1〜8)アルキル−C(O)−(C1〜8)アルキル、−O−(C1〜8)アルキル−CO2H、−O−(C1〜8)アルキル−C(O)−O−(C1〜8)アルキル、−O−(C1〜8)アルキル−C(O)−NH2、−O−(C1〜8)アルキル−C(O)−NH(C1〜8アルキル)、−O−(C1〜8)アルキル−C(O)−N(C1〜8アルキル)2、−C(O)H、−C(O)−(C1〜8)アルキル、−CO2H、−C(O)−O−(C1〜8)アルキル、−C(O)−NH2、−C(NH)−NH2、−C(O)−NH(C1〜8アルキル)、−C(O)−N(C1〜8アルキル)2、−SH、−S−(C1〜8)アルキル、−S−(C1〜8)アルキル−S−(C1〜8)アルキル、−S−(C1〜8)アルキル−O−(C1〜8)アルキル、−S−(C1〜8)アルキル−O−(C1〜8)アルキル−OH、−S−(C1〜8)アルキル−O−(C1〜8)アルキル−NH2、−S−(C1〜8)アルキル−O−(C1〜8)アルキル−NH(C1〜8アルキル)、−S−(C1〜8)アルキル−O−(C1〜8)アルキル−N(C1〜8アルキル)2、−S−(C1〜8)アルキル−NH(C1〜8アルキル)、−SO2−(C1〜8)アルキル、−SO2−NH2、−SO2−NH(C1〜8アルキル)、−SO2−N(C1〜8アルキル)2、−N−R7、シアノ,(ハロ)1〜3、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−シクロアルキル−R6、−複素環−R6、−アリール−R6、及び−ヘテロアリール−R6からなる群から独立して選択される1〜2個の置換基であり;
R6は、水素、−C1〜8アルキル、−C2〜8アルケニル、−C2〜8アルキニル、−C(O)H、−C(O)−(C1〜8)アルキル、−CO2H、−C(O)−O−(C1〜8)アルキル、−C(O)−NH2、−C(NH)−NH2、−C(O)−NH(C1〜8アルキル)、−C(O)−N(C1〜8)アルキル)2、−SO2−(C1〜8)アルキル、−SO2−NH2、−SO2−NH(C1〜8アルキル)、−SO2−N(C1〜8アルキル)2、−(C1〜8)アルキル−N−R7、−(C1〜8)アルキル−(ハロ)1〜3、−(C1〜8)アルキル−OH、−アリール−R8、−(C1〜8)アルキル−アリール−R8、及び−(C1〜8)アルキル−ヘテロアリール−R8からなる群から独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された1〜4個の置換基であり;但し、R6が炭素原子に結合されている場合には、R6は、−C1〜8アルコキシ、−(C1〜8)アルコキシ−(ハロ)1〜3、−SH、−S−(C1〜8)アルキル、−N−R7、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、及び−ヘテロアリール−R8からなる群から更に選択され;
R7は、水素、−C1〜8アルキル、−C2〜8アルケニル、−C2〜8アルキニル、−(C1〜8)アルキル−OH、−(C1〜8)アルキル−O−(C1〜8)アルキル、−(C1〜8)アルキル−NH2、−(C1〜8)アルキル−NH(C1〜8アルキル)、−(C1〜8)アルキル−N(C1〜8アルキル)2、−(C1〜8)アルキル−S−(C1〜8)アルキル、−C(O)H、−C(O)−(C1〜8)アルキル、−C(O)−O−(C1〜8)アルキル、−C(O)−NH2、−C(O)−NH(C1〜8アルキル)、−C(O)−N(C1〜8アルキル)2、−SO2−(C1〜8)アルキル、−SO2−NH2、−SO2−NH(C1〜8アルキル)、−SO2−N(C1〜8アルキル)2、−C(N)−NH2、−シクロアルキル−R8、−(C1〜8)アルキル−複素環−R8、−アリール−R8、−(C1〜8)アルキル−アリール−R8、及び−(C1〜8)アルキル−ヘテロアリール−R8からなる群から独立して選択される2個の置換基であり;
R8は、水素、−C1〜8アルキル、−(C1〜8)アルキル−(ハロ)1〜3及び−(C1〜8)アルキル−OHからなる群から独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された1〜4個の置換基であり;但し、R8が炭素原子に結合されている場合には、R8は、−C1〜8アルコキシ、−NH2、−NH(C1〜8アルキル)、−N(C1〜8アルキル)2、シアノ、ハロ、−(C1〜8)アルコキシ−(ハロ)1〜3、ヒドロキシ、及びニトロからなる群から更に選択され;
R9は、水素、−C1〜8アルコキシ、−NH2、−NH(C1〜8アルキル)、−N(C1〜8アルキル)2、シアノ、(ハロ)1〜3、ヒドロキシ、及びニトロからなる群から独立して選択される1〜2個の置換基であり;
R2は、水素、−C1〜8アルキル−R5、−C2〜8アルケニル−R5、−C2〜8アルキニル−R5、−C(O)H、−C(O)−(C1〜8)アルキル−R9、−C(O)−NH2、−C(O)−NH(C1〜8アルキル−R9)、−C(O)−N(C1〜8アルキル−R9)2、−C(O)−NH(アリール−R8)、−C(O)−シクロアルキル−R8、−C(O)−複素環−R8、−C(O)−アリール−R8、−C(O)−ヘテロアリール−R8、−CO2H、−C(O)−O−(C1〜8)アルキル−R9、−C(O)−O−アリール−R8、−SO2−(C1〜8)アルキル−R9、−SO2−アリール−R8、−シクロアルキル−R6、−アリール−R6及び−(C1〜8)アルキル−N−R7からなる群より独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された1個の置換基であり;但し、R2が炭素原子に結合されている場合には、R2は、−C1〜8アルコキシ−R5、−N−R7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−複素環−R6、及び−ヘテロアリール−R6からなる群から更に選択され;
R3は、水素、−C1〜8アルキル−R10、−C2〜8アルケニル−R10、−C2〜8アルキニル−R10、−C1〜8アルコキシ−R10、−C(O)H、−C(O)−(C1〜8)アルキル−R9、−C(O)−NH2、−C(O)−NH(C1〜8アルキル−R9)、−C(O)−N(C1〜8アルキル−R9)2、−C(O)−シクロアルキル−R8、−C(O)−複素環−R8、−C(O)−アリール−R8、−C(O)−ヘテロアリール−R8、−C(NH)−NH2、−CO2H、−C(O)−O−(C1〜8)アルキル−R9、−C(O)−O−アリール−R8、−SO2−(C1〜8)アルキル−R9、−SO2−アリール−R8、−N−R7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−R8、−複素環−R8、−アリール−R8、及び−ヘテロアリール−R8からなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された1〜3個の置換基であり;
R4は、水素、−C1〜8アルキル−R10、−C2〜8アルケニル−R10、−C2〜8アルキニル−R10、−C1〜8アルコキシ−R10、−C(O)H、−C(O)−(C1〜8)アルキル−R9、−C(O)−NH2、−C(O)−NH(C1〜8アルキル−R9)、−C(O)−N(C1〜8アルキル−R9)2、−C(O)−シクロアルキル−R8、−C(O)−複素環−R8、−C(O)−アリール−R8、−C(O)−ヘテロアリール−R8、−C(NH)−NH2、−CO2H、−C(O)−O−(C1〜8)アルキル−R9、−C(O)−O−アリール−R8、−SH、−S−(C1〜8)アルキル−R10、−SO2−(C1〜8)アルキル−R9、−SO2−アリール−R8、−SO2−NH2、−SO2−NH(C1〜8アルキル−R9)、−SO2−N(C1〜8アルキル−R9)2、−N−R7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−R8、−複素環−R8、−アリール−R8、及び−ヘテロアリール−R8からなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された1〜4個の置換基であり;
R10は、水素、−NH2、−NH(C1〜8アルキル)、−N(C1〜8アルキル)2、シアノ、(ハロ)1〜3、ヒドロキシ、ニトロ、及びオキソからなる群から独立して選択される1〜2個の置換基であり;並びに
Y及びZは、O、S、(H,OH)、及び(H,H)からなる群から独立して選択され;但し、Y及びZの一方がOであり且つ他方がO、S、(H,OH)、及び(H,H)からなる群から選択される];及びそれらの薬学上許容し得る塩である。
ンゾフリル、ベンゾチエニル、ジベンゾフリル、及びジベンゾチエニルからなる群から選択される。
ロ)1〜3、ヒドロキシ、及びニトロからなる群から独立して選択される1〜2個の置換基である。
れる。
ZはOから選択され;あるいは、Zはジヒドロから選択され;ここで、それぞれの水素原子は単結合で結合されている;
R4及びR5は、場合によりオキソで置換されているC1〜8アルキル、C2〜8アルケニル、及びC2〜8アルキニルから独立して選択され;
R2は、−C1〜8アルキル−、−C2〜8アルケニル−、−C2〜8アルキニル−、−O−(C1〜8)アルキル−O−、−O−(C2〜8)アルケニル−O−、−O−(C2〜8)アルキニル−O−、−C(O)−(C1〜8)アルキル−C(O)−(式中、上記のアルキル、アルケニル、及びアルキニル結合基のいずれも、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、−C(O)O−(C1〜8)アルキル、−C1〜8アルキル−C(O)O−(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは、水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選ばれた置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ(C1〜8)アルキル及びオキソからなる群から独立して選ばれた1個〜4個の置換基で場合により置換されている直炭素鎖であり;そして、式中、上記のアルキル、アルケニル、及びアルキニル結合基のいずれも、複素環、アリール、ヘテロアリール、複素環(C1〜8)アルキル、アリール(C1〜8)アルキル、ヘテロアリール(C1〜8)アルキル、スピロシクロアルキル、及びスピロ複素環(式中、上記のシクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリール置換基のいずれも、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは、水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ(C1〜8)アルキルからなる
群から独立して選択された1個〜4個の置換基で場合により置換されており;そして式中、上記の複素環置換基のいずれも場合によりオキソで置換されている)からなる群から独立して選択された1個〜2個の置換基で場合により置換されている)、シクロアルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール(式中、シクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリールは、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは、水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選ばれた置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ(C1〜8)アルキルからなる群から独立して選択された1個〜4個の置換基で場合により置換されており;そして式中、複素環は場合によりオキソで置換されている)、−(O−(CH2)1〜6)0〜5−O−、−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−O−、−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−O−、−(O−(CH2)1〜6)0〜5−NR6−、−O−(CH2)1〜6−NR6−(CH2)1〜6−O−、−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−NR6−、−(O−(CH2)1〜6)0〜5−S−、−O−(CH2)1〜6−S−(CH2)1〜6−O−、−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−S−、−NR6−、−NR6−NR7−、−NR6−(CH2)1〜6−NR7−、−NR6−(CH2)1〜6−NR7−(CH2)1〜6−NR8−、−NR6−C(O)−、−C(O)−NR6−、−C(O)−(CH2)0〜6−NR6−(CH2)0〜6−C(O)−、−NR6−(CH2)0〜6−C(O)−(CH2)1〜6−C(O)−(CH2)0〜6−NR7−、−NR6−C(O)−NR7−、−NR6−C(NR7)−NR8−、−O−(CH2)1〜6−NR6−(CH2)1〜6−S−、−S−(CH2)1〜6−NR6−(CH2)1〜6−O−、−S−(CH2)1〜6−NR6−(CH2)1〜6−S−、−NR6−(CH2)1〜6−S−(CH2)1〜6−NR7−、及び−SO2−(式中、R6、R7、及びR8は、水素、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは、水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ヒドロキシ(C1〜8)アルキル、複素環(C1〜8)アルキル、アリール(C1〜8)アルキル、及びヘテロアリール(C1〜8)アルキル(式中、上記の複素環、アリール、及びヘテロアリール置換基は、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは、水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ(C1〜8)アルキルからなる群から独立して選択された1個〜4個の置換基で場合により置換されており;そして式中、複素環は場合によりオキソで置換されている)からなる群から独立して選択される)からなる群から選択され;但し、A及びEが水素置換された炭素原子から選択された場合には、R2は、−C2〜8アルキニル−、−O−(C1〜8)アルキル−O−、−O−(C2〜8)アルケニル−O−、−O−(C2〜8)アルキニル−O−、−C(O)−(C1〜8)アルキル−C(O)−(式中、上記のアルキル、アルケニル、及びアルキニル結合基のいずれも、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、−C(O)O−(C1〜8)アルキル、−C1〜8アルキル−C(O)O−(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは、水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ(C1〜8)アルキル及びオキソからなる群から独立して選択された1個〜4個の置換基で場合により置換された直炭素鎖であり;そして式中、上記のアルキル、アルケニル、及びアルキニル結合基のいずれも複素環、アリール、ヘテロアリール、複素環(
C1〜8)アルキル、アリール(C1〜8)アルキル、ヘテロアリール(C1〜8)アルキル、スピロシクロアルキル、及びスピロ複素環(式中、上記のシクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリール置換基のいずれも、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ(C1〜8)
アルキルからなる群から独立して選択された1個〜4個の置換基で場合により置換されており;そして式中、上記の複素環置換基のいずれも場合によりオキソで置換されている)からなる群から独立して選択された1個〜2個の置換基で場合により置換されている)、シクロアルキル(式中、シクロアルキルは、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ(C1〜8)アルキルからなる群から独立して選択された1個〜4個の置換基で場合により置換されている)、−(O−(CH2)1〜6)1〜5−O−、−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−O−、−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−O−、−(O−(CH2)1〜6)1〜5−NR6−、−O−(CH2)1〜6−NR6−(CH2)1〜6−O−、−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−NR6−、−(O−(CH2)1〜6)0〜5−S−、−O−(CH2)1〜6−S−(CH2)1〜6−O−、−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−S−、−NR6−NR7−、−NR6−(CH2)1〜6−NR7−、−NR6−(CH2)1〜6−NR7−(CH2)1〜6−NR8−、−NR9−C(O)−、−C(O)−NR9−、−C(O)−(CH2)0〜6−NR6−(CH2)0〜6−C(O)−、−NR6−(CH2)0〜6−C(O)−(CH2)1〜6−C(O)−(CH2)0〜6−NR7−、−NR6−C(O)−NR7−、−NR6−C(NR7)−NR8−、−O−(CH2)1〜6−NR6−(CH2)1〜6−S−、−S−(CH2)1〜6−NR6−(CH2)1〜6−O−、−S−(CH2)1〜6−NR6−(CH2)1〜6−S−及び−NR6−(CH2)1〜6−S−(CH2)1〜6−NR7−(式中、R6、R7、及びR8は、水素、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ヒドロキシ(C1〜8)アルキル、複素環(C1〜8)アルキル、アリール(C1〜8)アルキル、及びヘテロアリール(C1〜8)アルキル(式中、上記の複素環、アリール及びヘテロアリール置換基は、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは水素及び水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ(C1〜8)アルキルからなる群から独立して選択された1個〜4個の置換基で場合により置換されており;そして式中、複素環は場合によりオキソで置換されている)よりなる群より独立して選ばれ;そして式中、R9は、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ヒドロキシ(C1〜8)アルキル、複素環(C1〜8)アルキル、アリール(C1〜8)アルキル及びヘテロアリール(C1〜8)アルキル(式中、上記の複素環、アリール及びヘテロアリール置換基は、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる
群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ(C1〜8)アルキルからなる群から独立して選択された1個〜4個の置換基で場合により置換され;そして式中、複素環は場合によりオキソで置換されている)よりなる群より独立して選ばれる)よりなる群より選ばれ;並びに
R1及びR3は、水素、C1〜8アルキル、C2〜8アルケニル、C2〜8アルキニル(式中、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、C1〜8アルコキシ、アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、(ハロ)1〜3、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ(C1〜8)アルキル及びオキソからなる群から選択された置換基で場合により置換されている)、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルキルカルボニル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、C1〜8アルキルチオ、アリール、ヘテロアリール(式中、アリール及びヘテロアリールはC1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ(C1〜8)アルキルからなる群から選択された置換基で場合により置換されている)、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で場合により置換されている)、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、及びニトロ、からなる群から独立して選択される];及びそれらの薬学上許容し得る塩である。
本発明で使用するのに好適な多能性細胞は、ABCG2、クリプト、FoxD3、Connexin43、Connexin45、Oct4、SOX−2、Nanog、hTERT、UTF−1、ZFP42、SSEA−3、SSEA−4、Tra1−60、及びTra1−81からなる群から選択される多能性マーカーの少なくとも1つを発現する。
ヒト胚幹細胞の特長:ヒト胚幹細胞は、発生段階特異的胚性抗原(SSEA)3及び4の1つ以上、及びTra−1−60及びTra−1−81と呼ばれる抗体を用いて検出可能なマーカーを発現し得る(Thomson et al.、Science 282:1145,1998)。インビトロでのヒト胚幹細胞の分化は、SSEA−4、Tra−1−60、及びTra−1−81の発現(存在する場合)を消失させ、SSEA−1の発現を増大させる。未分化のヒト胚幹細胞は、通常、アルカリホスファターゼ活性を有し、この活性は、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者(Vector Laboratories、Burlingame Calif.)によって述べられるようにVectorRedを基質として現像することによって検出することができる。未分化多能性幹細胞はまた、RT−PCRで検出されるように、一般にOct−4及びTERTも発現する。
22:972〜980、2004)に開示されている。
MEM)、Gibco# 10829−018、Ham’s F12/50% DMEM基本培地、200mM L−グルタミン、Gibco# 15039−027、非必須アミノ酸溶液、Gibco 11140−050、β−メルカプトエタノール、Sigma# M7522、ヒト組み換え塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、Gibco# 13256−029から作製されてもよい。
一実施形態において、多能性マーカーを発現する細胞は、次の過程を含む方法によってヒト胚幹細胞から誘導される:
a.ヒト胚幹細胞を培養する過程、
b.ヒト胚幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる過程、及び
c.細胞を除去し、続いてこの細胞を、細胞を培養する前にタンパク質又は細胞外マトリクスで予め処理されていない組織培養基質上で、低酸素状態下で培養する過程。
a.ヒト胚幹細胞を培養する過程、
b.細胞を除去し、続いてこの細胞を、タンパク質又は細胞外マトリクスで予め処理されていない組織培養基質上で、低酸素状態下で培養する過程。
一実施形態では、細胞は、細胞外マトリクスでコーティングされていない組織培養基質上で、低酸素状態下で、約1〜約20日間培養される。代替的な実施形態では、細胞は、細胞外マトリクスでコーティングされていない組織培養基質上で、低酸素状態下で、約5〜約20日間培養される。代替的な実施形態では、細胞は、細胞外マトリクスでコーティングされていない組織培養基質上で、低酸素状態下で、約15日間培養される。
は細胞外マトリクスで予め処理されていない組織培養基質上で、低酸素状態下で培養される。あるいは、培地は、IGF−1を含有していてもよい。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、当該技術分野の任意の方法によって、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。
分化される。この方法の一例は、D’Amour et al,Nature Biotechnology,24:1392〜1401,(2006)に開示されている。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、当技術分野の任意の方法により、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより決定することができる。多能性幹細胞は、一般にそのようなマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出される。
メトリー分析(FACS)(例えば、Harlow及びLane、Using Antibodies:A Laboratory Manual、ニューヨーク:Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998年)参照)が含まれる。
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内胚葉系統の特徴を示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵臓内胚葉系統の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内胚葉系統に特異的なマーカーは、例えば、Hlxb9、PTF−1a、PDX−1、HNF−6、HNF−1β等の1つ以上の転写因子の発現を含む。
膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内分泌系統の特徴を示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵臓内分泌系統の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内分泌系統に特異的なマーカーは、1つ以上の、例えばNGN−3、NeuroD、Islet−1等の転写因子の発現を含む。
ヒト胚幹細胞の培養
幹細胞は、単一の細胞レベルにて自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉(内胚葉、中胚葉及び外胚葉)から様々な細胞系統の機能的細胞に分化する能力によって、また移植
後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
enzyme(Source)と共にルーチン的に継代させた。ヒト胚幹細胞培養物の一部を低酸素状態下(約3% O2)でインキュベートした。
ヒト胚幹細胞由来の多能性マーカーを発現する細胞の誘導及び培養
ヒト胚幹細胞系H1及びH9由来の種々の継代数(継代30〜54)の細胞を、低酸素状態下(約3% O2)で少なくとも3継代の間培養した。細胞は、8ng/mLのbFGFで補充されたMEF−CM中で培養され、実施例1に従ってMatrigelでコーティングされたプレートに播かれた。
1324−WN−002,RD Systems,MN)及び100ng/mLのアクチビンA(RD Systems,MN)で補充したDMEM/F12培地で2日間処理し、続いて2%のFBS及び100ng/mLのアクチビンA(AA)で補充したDMEM/F12培地で更に3〜4日間処理した。このプロトコルは、胚体内胚葉マーカーの有意な増加をもたらした。
0ng/mLWnt−3Aの中で、低酸素状態(約3% O2)下において37℃で標準組織培養インキュベーター中で培養した。TCPSフラスコは、MATRIGEL又はその他の細胞外マトリクスタンパク質でコーティングされていなかった。培地は毎日交換された。いくつかの培養物において、培地は、10−50ng/mLのIGF−I(インスリン成長因子−I、RD Systems,MNより入手)又は1X ITS(インスリン、トランスフェリン、及びセレン、Invitrogen,CAより入手)で更に補充された。培養条件の一部において、基本培地(DM−F12+2% FBS)は、0.1mMのメルカプトエタノール(Invitrogen,CA)及び非必須アミノ酸(1X,NEAA、Invitrogen,CAより入手)で更に補充された。
多能性マーカーを発現する細胞のヒト胚幹細胞の単個細胞浮遊液からの誘導
ヒト胚幹細胞系H1 P33及びH9 P45からの細胞を、低酸素状態(約3% O2)下で少なくとも3継代の間培養した。細胞は、8ng/mLのbFGFで補充されたMEF−CM中で培養され、実施例1に従ってMATRIGELコーティングされたプレートに播かれた。約60%コンフルエンシーの時点で、培養物はTrypLE(商標)Express溶液(Invitrogen,CA)に5分間暴露された。放出された細胞をDMEM−F12+2% FBS培地で再懸濁し、遠心分離によって回収し、血球計を用いてカウントした。放出された細胞を、組織培養ポリスチレン(TCPS)で処理されたフラスコに、1000〜10,000細胞/cm2で播種し、DM−F12+2% FBS+100ng/mLアクチビンA+20ng/mLWnt−3A+50ng/mLIGF−I+0.1mMメルカプトエタノール(Invitrogen,CA)及び非必須アミノ酸(1X,NEAA、Invitrogen,CAより入手)の中で、低酸素状態(約3%O2)下において37℃で標準組織培養インキュベーター中で培養した。TCPSフラスコは、MATRIGEL又はその他の細胞外マトリクスタンパク質でコーティングされていなかった。培地は毎日交換された。第1継代細胞をP1と呼ぶ。
ヒト胚幹細由来の多能性マーカーを発現する細胞の増殖に有用な種々の培養基
ヒト胚幹細由来の多能性マーカーを発現する細胞は、以下の培地組成物中において少なくとも2〜30継代の培養に成功した。
1.DM−F12+2% FBS+100ng/mL AA+20ng/mL Wnt−3A
2.DM−F12+2% FBS+100ng/mL AA+20ng/mL Wnt−3A+50ng/mL IGF−I
3.DM−F12+2% FBS+100ng/mL AA+20ng/mL Wnt−3A+10ng/mL IGF−I
4.DM−F12+2% FBS+50ng/mL AA+20ng/mL Wnt−3A+50ng/mL IGF−I
5.DM−F12+2% FBS+50ng/mL AA+10ng/mL Wnt−3A+50ng/mL IGF−I
6.DM−F12+2% FBS+50ng/mL AA+20ng/mL Wnt−
3A+10ng/mL IGF−I
7.DM−F12+2% FBS+100ng/mL AA+10ng/mL Wnt−3A+10ng/mL IGF−I
8.HEScGRO合成培地(Chemicon,CA)
GSK−3βの酵素活性阻害剤が多能性マーカーを発現する細胞の生存率に与える影響
多能性マーカーを発現する細胞の誘導及び維持を、実施例2に記載された通りに行った。細胞は、2% FCS(Invitrogen)、100ng/mLアクチビンA、20ng/mLWnt−3a、及び50ng/mLIGF(RD Biosystems)で補充されたDMEM:F12で増殖させた。細胞を、Falconポリスチレンフラスコに密度10,000細胞/cm2で播種し、37℃、5%CO2、低酸素において単層培養で増殖させた。60〜70%コンフルエンスに達した後、PBSで単層を洗い、かつTrypLE(Invitrogen)で3〜5分間でインキュベートして剥離及び単一細胞分散させることによって、細胞を継代させた。
高含量スクリーニングアッセイを用いて測定したGSK−3βの酵素活性阻害剤がヒト胚幹細胞の分化及び増殖に与える影響
ヒト胚幹細胞(H9系)の維持を実施例1に記載の通りに実施した。細胞コロニーを、平均して4日ごとに継代させて未分化多能性状態のまま維持した。継代は、細胞培養物をコラゲナーゼ溶液(1mg/mL;Sigma−Aldrich)に37℃で10〜30分間暴露し、続いてピペットの先端で穏やかに擦り落として細胞塊を回収することによって行われた。塊を重力によって沈降させ、続いて洗浄して残留コラゲナーゼを除去した。細胞塊を、ルーチン維持培養用に1:3の比、又は直接アッセイ用に1:1の比で分割した。用いたヒト胚幹細胞系は継代50未満の継代数に維持され、正常核型の表現型及びマイコプラズマ汚染の欠如に関してルーチン的に評価された。
ls)を室温で5分間添加した。細胞をPBSで一度洗浄し、画像化するために100mL/ウェルPBS中に放置した。
プレートリーダーアッセイを用いて測定されたGSK−3βの酵素活性阻害剤がヒト胚幹細胞の増殖に与える影響
ヒト胚幹細胞(H9又はH1系)の維持を実施例1に記載の通りに実施した。細胞コロニーを、平均して4日ごとに継代させて未分化多能性状態のまま維持した。継代は、細胞培養物をコラゲナーゼ溶液(1mg/mL;Sigma−Aldrich)に37℃で10〜30分間暴露し、続いてピペットの先端で穏やかに擦り落として細胞塊を回収することによって行われた。塊を沈降させ、洗浄して残留コラゲナーゼを除去した。細胞塊を、ルーチン維持培養用に1:3の単層部分比、又は直接アッセイ用に1:1の比で分割した。これら実施例で用いたヒト胚幹細胞系は継代50未満の継代数に維持され、正常核型の表現型、並びにマイコプラズマ汚染の欠如に関してルーチン的に評価された。
た。陰性対照ウェルは、アクチビンA又はWnt3aなしに0.5% FCSを有する基本培地を収容した。スクリーニング化合物は三重に試験された。アッセイ2日目にウェルを吸引し、同一溶液を再度供給した。3日及び4日目に、2%FCSを有するDMEM:F12基本培地に維持された陰性対照ウェルを除いて、全アッセイウェルは吸引されて、2%FCS及び100ng/mLアクチビンAで補充されたDMEM:F12に変更された。
GSK−3β酵素阻害剤がヒト胚幹細胞の分化及び増殖に与える影響:リード化合物の用量漸増
一次スクリーニングで同定されたヒットの活性を確認し、かつ用量漸増によって活性範囲を更に分析することが重要であった。一次スクリーニングヒットの選択的サブセットの新しいサンプルを乾燥粉末として入手し、可溶化して新しいストック試薬を作り、二次確認アッセイで希釈してヒト胚幹細胞への影響を評価した。
CO2に保たれた。
。アッセイ直前に、化合物ストックを0.5% FCS(HyClone)及び100ng/mLアクチビンA(RD Biosystems)で補充されたDMEM:F12基本培地(Invitrogen)で1:1000に希釈して10μM試験化合物を作った。これを更に、同様に0.5% FCS(HyClone)及び100ng/mLアクチビンA(RD Biosystems)で補充されたDMEM:F12基本培地で連続して倍数希釈して各化合物ごとに7点希釈曲線を作った。
Healthcare)を使用して細胞を撮像した。暴露時間は、陽性対照ウェル、及び未処理の陰性対照として二次抗体のみで染色されたウェルを使用して最適化された。処理及び染色手順の間のあらゆる細胞消失を補償するために、1ウェル当たり15の領域を得た。各ウェルごとの全細胞の数及び全Sox−17強度の測定値を、IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)ソフトウェアを使用して得た。グレイスケール・レベル(基準線範囲100〜300)及び核サイズに基づいて、細胞核のセグメンテーションを決定した。各複製セットごとの平均値及び標準偏差が計算された。全Sox17タンパク質発現量は、細胞×細胞の面積の全蛍光量として定義される全強度又は積分強度として報告された。300〜3000のグレイスケール範囲、及び0.4以上の形状因子の判定基準に基づいて背景を消去した。全強度データは、各ウェルごとの全強度をWnt3a/アクチビンA陽性対照の平均全強度で割って正規化された。各複製セットごとの平均値及び標準偏差に関する正規化データが計算された。
この二次アッセイにおける用量漸増によって活性が確認され、かつ作用強度が測定され
た8つのGSK−3B酵素阻害剤に関する結果が示されている。示したデータは、細胞の数及びSox17に与える化合物の影響を示しており、それぞれのデータ点は二重セットからの平均であり、同一領域及びウェルからパラメータごとに見つけ出された。この実施例において、Sox17の発現は胚体内胚葉分化を示している。H1ヒト胚幹細胞系を用いた細胞の数及びSox17強度に関する結果はそれぞれ表VIII及び表Iに示されている。H9ヒト胚幹細胞系に関する結果は表X及び表XIに示されている。陽性対照値は、細胞の数及びSox17強度に関して1.000に正規化された。陰性対照値は、両方の細胞株で、細胞の数は0.388未満、及びSox17強度は0.065未満であった。両方のヒト胚幹細胞系を比較し、かつ各化合物の用量漸増を含むこれらのデータの図式表現が、図1〜図8に示されている。細胞の数はパネルAに示され、Sox17強度はパネルBに示される。これらのデータは、各化合物がhES細胞の増殖及び胚体内胚葉の分化を促進することができ、かつ活性の最適範囲を同定することができることを確認している。
GSK−3β酵素阻害剤が胚体内胚葉に関連した追加のマーカーの発現に与える影響
リード化合物は、転写因子Sox17に加えて、胚体内胚葉分化を示す他のマーカーもまた誘導することができることを証明することが重要であった。ヒットの選択サブセットを、CXCR4、表面受容体タンパク質、及び胚体内胚葉の分化にも関連する転写因子であるHNF−3βの発現を促進する能力に関して試験した。
xpress溶液(Invitrogen,CA)で5分間インキュベートすることにより培養プレートから収集された。細胞をMEF調整培地で再懸濁し、2つの等しいサンプルに分割した。サンプルの1セットを様々な蛍光標識抗体で更に染色し、フローサイトメトリー(FACS)分析を施した。サンプルの第2の並列セットに定量PCRを施した。
図9は、様々なGSK3阻害剤で処理した後にCXCR4表面受容体を発現する陽性細
胞の割合のFACS分析を示す。未処理の細胞集団(陰性対照)又はアクチビンA及びWnt3で処理されている細胞(陽性対照)に対する、各化合物の1μM〜5μMの範囲の2種類の濃度が示されている。図10のパネルa、b、及びcは、やはり胚体内胚葉のマーカーであると考慮されるCXCR4、Sox17、及びHNF3βに関するリアルタイムPCRデータを示している。FACS及びリアルタイムPCR分析は共に、未処理の対照細胞と比べて、分化した細胞ではこれらマーカーのそれぞれの有意な増加が見られるを明示している。一部の例では、これらの胚体内胚葉マーカーの発現レベルは陽性対照と等しく、分化のこの段階においてGSK3阻害剤がWnt3aに取って代わることができることを実証している。
GSK−3β酵素阻害剤が膵臓内胚葉の形成に与える影響
胚体内胚葉の誘導の間にGSK3β阻害剤で処理することが、例えば、膵臓内胚葉などの他の細胞型のその後の分化を阻害しないこと証明することが重要であった。ヒットの選択サブセットを、膵臓内胚葉に関連する鍵となる転写因子であるPDX1及びHNF6の発現を促進する能力に関して試験した。
内胚葉へ分化させるために、0.5% FCSを有するDMEM:F12培地と、100ng/mLアクチビンAを有しWnt3aを有さない異なる濃度の阻害化合物とを含有する試験量(24ウェルプレートに関してはウェル当たり0.5mL、96ウェルプレートに関してはウェル当たり100μL)を加え戻した。陽性対照ウェルは、0.5% FCSと100ng/mLアクチビンAと20ng/mL Wnt3a(RD Biosystems)とを有するが試験化合物がない状態の同じ基本培地を収容した。陰性対照ウェルは、0.5% FCSを有するが、アクチビンA、Wnt3a、又は試験化合物のない状態の同じ基本培地を収容した。アッセイ2日目にアッセイウェルを吸引し、同一濃度の試験化合物又は対照溶液を再度供給した。3日及び4日目に、全アッセイウェルは吸引され、試験化合物又はWnt3aの両方がない状態で2% FCS及び100ng/mLアクチビンAで補充されたDMEM:F12が供給された。平行陰性対照ウェルは、3日及び4日目は2% FCSを有するDMEM:F12に維持された。胚体内胚葉へ分化させるために、細胞を3日間処理し、2% FCSと、0.25μM KAADシクロパミン(EMD Biosciences)と、20ng/mL FGF7(RD Biosystems)とを含有するDMEM:F12基本培地を毎日供給した。次に、細胞を更に4日間処理し、1% B27(Invitrogen)と、0.25μM KAADシクロパミンと、2μMレチノイン酸(RA;Sigma−Aldrich)と、20ng/mL FGF7とを含有するDMEM:F12を毎日供給した。平行陰性対照ウェルは、2% FCS(段階2)又は1% B27(段階3)を含有するがあらゆるその他の添加剤を含有しないDMEM:F12基本培地にずっと維持された。
Biosystems)とを含有するが試験化合物が存在しない状態の(血清を有する又は有さない)基本培地を収容した。陰性対照ウェルは、アクチビンA、Wnt3a、又は試験化合物のない状態で血清を有する又は有さない同じ基本培地を収容した。アッセイ2日目にアッセイウェルを吸引し、同一濃度の試験化合物又は対照溶液を再度供給した。3日目に、全アッセイウェルは吸引され、試験化合物又はWnt3aの両方がない状態で2%FCS及び100ng/mLアクチビンAで補充されたRPMI−1640が供給された。平行陰性対照ウェルは、3日目は2%FCSを含有するRPMI−1640基本培地に維持された。細胞を4日間処理し、2%FCSと0.25mM KAADシクロパミン(EMD Biosciences)と、50ng/mL FGF10(RD Biosystems)とを含有するRPMI−1640基本培地を毎日供給することによって、細胞を膵臓内胚葉に分化させた。続いて、細胞を3日間処理し、1% B27(Invitrogen)と0.25mM KAADシクロパミンと2mMレチノイン酸(RA;Sigma−Aldrich)と50ng/mL FGF10とを含有するRPMI−1640を毎日供給した。平行陰性対照ウェルは、2% FCS(段階2)又は1% B27(段階3)を含有するがあらゆるその他の添加剤を含有しないRPMI−1640基本培地にずっと維持された。
時間細胞に添加した。Alexa Fluor488共役二次抗体(ニワトリ抗ヤギIgG;Molecular Probes)をPBSで1:200に希釈し、細胞をPBSで3回洗浄した後各ウェルに添加した。細胞核を対比染色するために、2μg/mL Hoechst 33342(Invitrogen)を室温で10分間添加した。細胞をPBSで一度洗浄し、画像化するために100μL/ウェルPBS中に放置した。
Healthcare)を使用して細胞を撮像した。暴露時間は、陽性対照ウェル、及び二次抗体のみで染色されたウェルを用いて最適化された。処理及び染色手順の間のあらゆる細胞消失を補償するために、1ウェル当たり15の領域を得た。各ウェルごとの全細胞の数及び全Pdx1強度の測定値を、IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)ソフトウェアを使用して得た。グレイスケール・レベル(基準線範囲100〜300)及び核サイズに基づいて、細胞核のセグメンテーションを決定した。各複製データセットに関して平均値及び標準偏差を計算した。全Pdx1タンパク質発現量は、細胞×細胞の面積の全蛍光量として定義される全強度又は積分強度として報告された。300〜3000のグレイスケール範囲の判定基準に基づいて背景を消去した。全強度データは、各ウェルごとの全強度をWnt3a/アクチビンA陽性対照の平均全強度で割って正規化された。各複製セットごとの平均値及び標準偏差に関する正規化データが計算された。
8つのGSK−3β酵素阻害剤に関する結果が示されている。高含量分析で得た図1に示されるデータは、H1hES細胞系の細胞の数(パネルA)及びPdx1強度(パネルB)に与える影響を示しており、それぞれのデータ点は二重サンプルセットからの平均であり、同一領域及びウェルからパラメータごとに見つけ出された。リアルタイムPCRで得た図12に示されるデータは、これら小分子阻害剤が2つの転写因子であるPdx1及びHNF6の誘導発現に与える影響を示している。これらの実施例において、Pdx1及びHNF6の発現は膵臓内胚葉分化を示している。これらのアッセイのGSK3β阻害化合物は、細胞系列へのコミットメントの早期段階中にWnt3aの代替となることができ、結果生じる細胞は、分化の続いて起こる後期段階中に膵臓内胚葉を形成する能力を維持する。
GSK−3β酵素阻害剤が膵臓内分泌細胞の形成に与える影響
胚体内胚葉の誘導の間にGSK3β阻害剤で処理することが、例えば、膵臓内分泌細胞又はインスリン産生細胞などの他の細胞型のその後の分化を阻害しないこと証明することが重要であった。ヒットの選択したサブセットを、膵臓ホルモンの発現を促進する能力に関して試験した。
理し、1% B27、50ng/mL Exendin4と、50ng/mL IGF(RD Biosystems)と、50ng/mL HGF(RD Biosystems)とを含有するDMEM:F12基本培地を毎日供給した。平行陰性対照ウェルは、1%B27を含有するがあらゆるその他の添加剤を含有しないDMEM:F12基本培地にずっと維持された。
Healthcare)を使用して細胞を撮像した。暴露時間は、陽性対照ウェル、及び二次抗体のみで染色されたウェルを用いて最適化された。処理及び染色手順の間のあらゆる細胞消失を補償するために、1ウェル当たり15の領域を得た。各ウェルごとの全細胞の数及び全インスリン強度の測定値を、IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)ソフトウェアを使用して得た。グレイスケール・レベル(基準線範囲100〜300)及び核サイズに基づいて、細胞核のセグメンテーションを決定した。各複製セットごとの平均値及び標準偏差が計算された。全インスリンタンパク質発現量は、細胞×細胞の面積の全蛍光量として定義される全強度又は積分強度として報告された。300〜3000のグレイスケール範囲の判定基準に基づいて背景を消去した。全強度データは、各ウェルごとの全強度をWnt3a/アクチビンA陽性対照の平均全強度で割って正規化された。各三重セットごとの平均値及び標準偏差に関する正規化データが計算された。
、ピペッティング誤差に関して補正した。プライマー及びFAM−ラベルTAQMAN(登録商標)プローブを、濃度200nMにて使用した。各標的遺伝子に関する発現レベルを、以前にABIにより開発されたヒトグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)内在性対照を使用して正規化した。プライマー及びプローブの組合せを次に示す:PDX1(Hs00236830_m1)、インスリン(Hs00355773)、及びGAPDH(4310884E)。
8つのGSK−3B酵素阻害剤に関する結果が示されている。高含量分析で得た図13に示されるデータは、H1hES細胞系の細胞の数(パネルA)及びインスリン強度(パネルB)に与える化合物の影響を示しており、それぞれのデータ点は三重セットからの平均であり、同一領域及びウェルからパラメータごとに見つけ出された。リアルタイムPCRで得た図14に示されるデータは、Pdx1及びインスリンに対する化合物の影響を示している。これらの実施例において、Pdx1及びインスリンの発現は膵臓内胚葉分化及びホルモン陽性細胞の生成を示している。これらのアッセイの選択GSK3β阻害化合物は、インスリン免疫染色及びリアルタイムPCRの両方から明らかなように、細胞系列へのコミットメントの早期段階中にWnt3aの代替となることができ、分化の続いて起こる後期段階中に膵臓β細胞の形成を誘導しかつ維持することができる。
膵臓内分泌細胞の形成に与えるGSK−3β酵素阻害剤の相加効果
細胞運命決定の複数段階の間に添加される場合は、GSK3β阻害剤で処理することにより膵臓β細胞の分化を改善することができることを証明することが重要であった。ヒットの選択サブセットを、膵臓ホルモン陽性細胞に関連するインスリンの発現を促進するために逐次定期的な添加によって試験した。
容した。アッセイ2日目にアッセイウェルを吸引し、同一濃度の試験化合物又は対照溶液を再度供給した。3日、4日及び5日目に、全アッセイウェルは吸引され、試験化合物又はWnt3aの両方がない状態で2% FCS及び100ng/mLアクチビンAで補充されたDMEM:F12が供給された。平行陰性対照ウェルは、3日、4日及び5日目は2%FCSを有するDMEM:F12に維持された。胚体内胚葉へ分化させるために、細胞を3日間処理し、2% FCSと、0.25μM KAADシクロパミン(EMD Biosciences)と、20ng/mL FGF7(RD Biosystems)とを含有するDMEM:F12基本培地を毎日供給した。続いて細胞を4日間処理し、1% B27(Invitrogen)と、0.25μM KAADシクロパミンと、2μMレチノイン酸(RA;Sigma−Aldrich)と、20ng/mL FGF7とを含有するDMEM:F12を毎日供給した。平行陰性対照ウェルは、2% FCS又は1%B27を含有するがあらゆるその他の添加剤を含有しないDMEM:F12基本培地にずっと維持された。膵臓内胚葉の形成後、細胞を更に6日間継続して処理し、1% B27と、1μM DAPT(γセクレターゼ阻害剤:EMD Biosciences)と、50ng/mL Exendin 4(Sigma−Aldrich)と、1μM TGFbeta R1阻害剤II(ALK5阻害剤:EMD Biosciences)とを含有するDMEM:F12基本培地を隔日で供給した。この6日間の間、GSK3β阻害剤を、分化の開始時の前回の処理と同じ濃度を用いてそれぞれにウェルに加え戻した。次に、細胞を別の3日間連続して処理し、1% B27、50ng/mL Exendin 4と、50ng/mL IGF(RD Biosystems)と、50ng/mL HGF(RD Biosystems)と、1μM TGFβ R1阻害剤II(ALK5阻害剤;EMD Biosciences)とを含有するDMEM:F12基本培地を隔日で供給した。この3日間の間、GSK3β阻害剤を、分化の開始時の前回の処理と同じ濃度を用いてそれぞれにウェルに加え戻した。陽性対照ウェルの平行セットを20ng/mL Wnt3aの存在下又は非存在下で処理した。平行陰性対照ウェルは、1%B27を含有するがあらゆるその他の添加剤を含有しないDMEM:F12基本培地にずっと維持された。
Healthcare)を使用して細胞を撮像した。暴露時間は、陽性対照ウェル、及び二次抗体のみで染色されたウェルを用いて最適化された。処理及び染色手順の間のあらゆる細胞消失を補償するために、1ウェル当たり15の領域を得た。各ウェルごとの全細胞の数及び全インスリン強度の測定値を、IN Cell Developer Too
lbox 1.7(GE Healthcare)ソフトウェアを使用して得た。グレイスケール・レベル(基準線範囲100〜300)及び核サイズに基づいて、細胞核のセグメンテーションを決定した。各複製データセットに関して平均値及び標準偏差を計算した。全インスリンタンパク質発現量は、細胞×細胞の面積の全蛍光量として定義される全強度又は積分強度として報告された。300〜3000のグレイスケール範囲の判定基準に基づいて背景を消去した。全強度データは、各ウェルごとの全強度をWnt3a/アクチビンA陽性対照の平均全強度で割って正規化された。各三重セットごとの平均値及び標準偏差に関する正規化データが計算された。
8つのGSK−3B酵素阻害剤に関する結果が示されている。高含量分析で得た図15に示されるデータは、H1hES細胞系の細胞の数(パネルA)及びインスリン強度(パネルB)に与える化合物の影響を示しており、それぞれのデータ点は三重セットからの平均であり、同一領域及びウェルからパラメータごとに見つけ出された。この実施例では、インスリンの発現はホルモン陽性膵臓細胞への分化を示している。これらのアッセイの選択GSK3B阻害化合物は、細胞系列へのコミットメントの早期段階中にWnt3aの代替となることができ、後期段階で添加される場合、陽性対照サンプルに比べて高度のインスリン発現を促進すると思われる。
多能性細胞を増殖及び分化するための方法であって、
a.前記多能性細胞を培養する過程と、
b.前記多能性細胞をGSK−3Bの酵素活性阻害剤で処理する過程と、を含む方法。
前記多能性細胞が胚幹細胞である、1.に記載の方法。
前記多能性細胞が、胚幹細胞由来の多能性マーカーを発現する細胞である、1.に記載の方法。
前記多能性マーカーを発現する細胞が、ABCG2、クリプト、FoxD3、Connexin43、Connexin45、Oct4、SOX−2、Nanog、hTERT、UTF−1、ZFP42、SSEA−3、SSEA−4、Tra1−60、及びTra1−81からなる群から選択される多能性マーカーのうちの少なくとも1つを発現する、3.に記載の方法。
前記多能性細胞が胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化される、1.に記載の方法。
前記多能性細胞が前記GSK−3Bの酵素活性阻害剤で約1〜約72時間処理される、1.に記載の方法。
前記多能性細胞が前記GSK−3Bの酵素活性阻害剤で約12〜約48時間処理される、1.に記載の方法。
前記多能性細胞が前記GSK−3Bの酵素活性阻害剤で約48時間処理される、1.に記載の方法。
前記GSK−3Bの酵素活性阻害剤が濃度約100nM〜約100μMで用いられる、1.に記載の方法。
前記GSK−3Bの酵素活性阻害剤が濃度約1μM〜約10μMで用いられる、1.に記載の方法。
前記GSK−3Bの酵素活性阻害剤が濃度約10μMで用いられる、1.に記載の方法。
R1が、フェニル、置換フェニル(ここで該フェニル置換基はC1〜5アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル及びニトリルからなる群から選択される)、又はピリミジニルである、12.に記載の方法。
R2がフェニル、置換フェニル(ここで該フェニル置換基はC1〜5アルキル、ハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル及びニトリルからなる群から選択される)、又は任意にC1〜4アルキルで置換されていてもよいピリミジニルであり、及びR1及びR2の少なくとも一方はピリミジニルである、12.に記載の方法。
R3は水素、2−(トリメチルシリル)エトキシメチル、C1〜5アルキルカルボニル、アリールオキシカルボニル、アリールC1〜5アルキルオキシカルボニル、アリールC1〜5アルキル、置換アリールC1〜5アルキル(ここで該1つ以上のアリール置換基は、独立して、C1〜5アルキル、C1〜5アルコキシ、ハロゲン、アミノ、C1〜5アルキルアミノ、及びジC1〜5アルキルアミノからなる群から選択される)、フタルイミドC1〜5アルキル、アミノC1〜5アルキル、ジアミノC1〜5アルキル、スクシンイミドC1〜5アルキル、C1〜5アルキルカルボニル、アリールカルボニル、C1〜5アルキルカルボニルC1〜5アルキル及びアリールオキシカルボニルC1〜5アルキルアルキルである、12.に記載の方法。
R4が−(A)−(CH2)q−Xである、12.に記載の方法。
R5が、水素、C1〜5アルキル、フェニル及びフェニルC1〜5アルキルからなる群から選択される、17.に記載の方法。
qが0〜9である、16.に記載の方法。
Xが、水素、ヒドロキシ、ビニル、置換ビニル(ここで該1つ以上のビニル置換基はそれぞれ、フッ素、臭素、塩素、及びヨウ素から選択される)、エチニル、置換エチニル(ここで該エチニル置換基は、フッ素、臭素塩素、及びヨウ素からなる群から選択される)、C1〜5アルキル、置換されたC1〜5アルキル(ここで該1つ以上のアルキル置換基はそれぞれ、C1〜5アルコキシ、トリハロアルキル、フタルイミド、及びアミノからなる群から選択される)、C3〜7シクロアルキル、C1〜5アルコキシ、置換されたC1〜5アルコキシ(ここで該アルキル置換基は、フタルイミド及びアミノからなる群から選択される)、フタルイミドオキシ、フェノキシ、置換フェノキシ(ここで該1つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、C1〜5アルキル、ハロゲン、及びC1〜5アルコキシからなる群から選択される)、フェニル、置換フェニル(ここで該1つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、C1〜5アルキル、ハロゲン、及びC1〜5アルコキシからなる群から選択される)、アリールC1〜5アルキル、置換アリールC1〜5アルキル(ここで該1つ以上のアリール置換基はそれぞれ、C1〜5アルキル、ハロゲン、及びC1〜5アルコキシからなる群から選択される)、アリールオキシC1〜5アルキルアミノ、C1〜5アルキルアミノ、ジC1〜5アルキルアミノ、ニトリル、オキシム、ベンジルオキシイミノ(Benxyloxyimino)、C1〜5アルキルオキシイミノ、フタルイミド、スクシンイミド、C1〜5アルキルカルボニルオキシ、フェニルカルボニルオキシ、置換フェニルカルボニルオキシ(ここで該1つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、C1〜5アルキル、ハロゲン、及びC1〜5アルコキシからなる群から選択される)、フェニルC1〜5アルキルカルボニルオキシ(ここで該1つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、C1〜5アルキル、ハロゲン、及びC1〜5アルコキシからなる群から選択される)、アミノカルボニルオキシ、C1〜5アルキルアミノカルボニルオキシ、ジC1〜5アルキ
ルアミノカルボニルオキシ、C1〜5アルキルカルボニルオキシ、置換されたC1〜5アルキルカルボニルオキシ(ここで該1つ以上のアルキル置換基はそれぞれ、メチル、エチル、イソプロピル、及びヘキシルからなる群から選択される)、フェノキシカルボニルオキシ、置換フェノキシカルボニルオキシ(ここで該1つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、C1〜5アルキル、C1〜5アルコキシ、及びハロゲンからなる群から選択される)、C1〜5アルキルチオ、置換されたC1〜5アルキルチオ(ここで該アルキル置換基は、ヒドロキシ及びフタルイミドからなる群から選択される)、C1〜5アルキルスルホニル、フェニルスルホニル、置換フェニルスルホニル(ここで該1つ以上のフェニル置換基はそれぞれ、臭素、フッ素、塩素、C1〜5アルコキシ、及びトリフルオロメチルからなる群から選択される);但し、Aが
R1が置換フェニルであり、R2がピリミジン−3−イルである、12.に記載の方法。
R1が4−フルオロフェニルである、12.に記載の方法。
R3が、水素、アリールC1〜5アルキル、又は置換アリールC1〜5アルキルである、12.に記載の方法。
R3が水素又はフェニルC1〜5アルキルである、12.に記載の方法。
Aがエチニレンであり、qが0〜5である、16.に記載の方法。
Xが、スクシンイミド、ヒドロキシ、メチル、フェニル、C1〜5アルキルスルホニル、C3〜6シクロアルキル、C1〜5アルキルカルボニルオキシ、C1〜5アルコキシ、フェニルカルボニルオキシ、C1〜5アルキルアミノ、ジC1〜5アルキルアミノ又はニトリルである、16.に記載の方法。
前記式1の化合物が、4−(4−フルオロフェニル)−2−(4−ヒドロキシブチン−1−イル)−1−(3−フェニルプロピル)−5−(4−ピリジル)イミダゾールである、12.に記載の方法。
Rが、Ra、−C1〜8アルキル−Ra、−C2〜8アルケニル−Ra、−C2〜8アルキニル−Ra及びシアノからなる群から選択される、28.に記載の方法。
Raが、シクロアルキル、複素環、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択される、29.に記載の方法。
R1が、水素、−C1〜8アルキル−R5、−C2〜8アルケニル−R5、−C2〜8アルキニル−R5、−C(O)−(C1〜8)アルキル−R9、−C(O)−アリール−R8、−C(O)−O−(C1〜8)アルキル−R9、−C(O)−O−アリール−R8、−C(O)−NH(C1〜8アルキル−R9)、−C(O)−NH(アリール−R8)、−C(O)−N(C1〜8アルキル−R9)2、−SO2−(C1〜8)アルキル−R9、−SO2−アリール−R8、−シクロアルキル−R6、−複素環−R6、−アリール−R6及び−ヘテロアリール−R6からなる群から選択され;ここで、複素環及びヘテロアリールは、複素環又はヘテロアリール環の炭素原子を通して1の位置のアザインドール窒素原子と結合する、28.に記載の方法。
R5が、水素、−O−(C1〜8)アルキル、−O−(C1〜8)アルキル−OH、−O−(C1〜8)アルキル−O−(C1〜8)アルキル、−O−(C1〜8)アルキル−NH2、−O−(C1〜8)アルキル−NH(C1〜8アルキル)、−O−(C1〜8)アルキル−N(C1〜8アルキル)2、−O−(C1〜8)アルキル−S−(C1〜8)アルキル、−O−(C1〜8)アルキル−SO2−(C1〜8)アルキル、−O−(C1〜8)アルキル−SO2−NH2、−O−(C1〜8)アルキル−SO2−NH(C1〜8アルキル)、−O−(C1〜8)アルキル−SO2−N(C1〜8アルキル)2、−O−C(O)H、−O−C(O)−(C1〜8)アルキル、−O−C(O)−NH2、−O−C(O)−NH(C1〜8アルキル)、−O−C(O)−N(C1〜8アルキル)2、−O−(C1〜8)アルキル−C(O)H、−O−(C1〜8)アルキル−C(O)−(C1〜8)アルキル、−O−(C1〜8)アルキル−CO2H、−O−(C1〜8)アルキル−C(O)−O−(C1〜8)アルキル、−O−(C1〜8)アルキル−C(O)−NH2、−O−(C1〜8)アルキル−C(O)−NH(C1〜8アルキル)、−O−(C1〜8)アルキル−C(O)−N(C1〜8アルキル)2、−C(O)H、−C(O)−(C1〜8)アルキル、−CO2H、−C(O)−O−(C1〜8)アルキル、−C(O)−NH2、−C(NH)−NH2、−C(O)−NH(C1〜8アルキル)、−C(
O)−N(C1〜8アルキル)2、−SH、−S−(C1〜8)アルキル、−S−(C1〜8)アルキル−S−(C1〜8)アルキル、−S−(C1〜8)アルキル−O−(C1〜8)アルキル、−S−(C1〜8)アルキル−O−(C1〜8)アルキル−OH、−S−(C1〜8)アルキル−O−(C1〜8)アルキル−NH2、−S−(C1〜8)アルキル−O−(C1〜8)アルキル−NH(C1〜8アルキル)、−S−(C1〜8)アルキル−O−(C1〜8)アルキル−N(C1〜8アルキル)2、−S−(C1〜8)アルキル−NH(C1〜8アルキル)、−SO2−(C1〜8)アルキル、−SO2−NH2、−SO2−NH(C1〜8アルキル)、−SO2−N(C1〜8アルキル)2、−N−R7、シアノ,(ハロ)1〜3、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−シクロアルキル−R6、−複素環−R6、−アリール−R6及び−ヘテロアリール−R6からなる群から独立して選択される1〜2個の置換基である、31.に記載の方法。
R6が、水素、−C1〜8アルキル、−C2〜8アルケニル、−C2〜8アルキニル、−C(O)H、−C(O)−(C1〜8)アルキル、−CO2H、−C(O)−O−(C1〜8)アルキル、−C(O)−NH2、−C(NH)−NH2、−C(O)−NH(C1〜8アルキル)、−C(O)−N(C1〜8)アルキル)2、−SO2−(C1〜8)アルキル、−SO2−NH2、−SO2−NH(C1〜8アルキル)、−SO2−N(C1〜8アルキル)2、−(C1〜8)アルキル−N−R7、−(C1〜8)アルキル−(ハロ)1〜3、−(C1〜8)アルキル−OH、−アリール−R8、−(C1〜8)アルキル−アリール−R8及び−(C1〜8)アルキル−ヘテロアリール−R8からなる群から独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された1〜4個の置換基である;但し、R6が炭素原子に結合されている場合には、R6は、−C1〜8アルコキシ、−(C1〜8)アルコキシ−(ハロ)1〜3、−SH、−S−(C1〜8)アルキル、−N−R7、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ及び−ヘテロアリール−R8からなる群から更に選択される、31.に記載の方法。
R7が、水素、−C1〜8アルキル、−C2〜8アルケニル、−C2〜8アルキニル、−(C1〜8)アルキル−OH、−(C1〜8)アルキル−O−(C1〜8)アルキル、−(C1〜8)アルキル−NH2、−(C1〜8)アルキル−NH(C1〜8アルキル)、−(C1〜8)アルキル−N(C1〜8アルキル)2、−(C1〜8)アルキル−S−(C1〜8)アルキル、−C(O)H、−C(O)−(C1〜8)アルキル、−C(O)−O−(C1〜8)アルキル、−C(O)−NH2、−C(O)−NH(C1〜8アルキル)、−C(O)−N(C1〜8アルキル)2、−SO2−(C1〜8)アルキル、−SO2−NH2、−SO2−NH(C1〜8アルキル)、−SO2−N(C1〜8アルキル)2、−C(N)−NH2、−シクロアルキル−R8、−(C1〜8)アルキル−複素環−R8、−アリール−R8、−(C1〜8)アルキル−アリール−R8及び−(C1〜8)アルキル−ヘテロアリール−R8からなる群から独立して選択される2個の置換基である、33.に記載の方法。
R8が、水素、−C1〜8アルキル、−(C1〜8)アルキル−(ハロ)1〜3及び−(C1〜8)アルキル−OHからなる群から独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された1〜4個の置換基である;但し、R8が炭素原子に結合されている場合には、R8は、−C1〜8アルコキシ、−NH2、−NH(C1〜8アルキル)、−N(C1〜8アルキル)2、シアノ、ハロ、−(C1〜8)アルコキシ−(ハロ)1〜3、ヒドロキシ及びニトロからなる群から更に選択される、31.に記載の方法。
R9が、水素、−C1〜8アルコキシ、−NH2、−NH(C1〜8アルキル)、−N(C1〜8アルキル)2、シアノ、(ハロ)1〜3、ヒドロキシ及びニトロからなる群から独立して
選択される1〜2個の置換基である、31.に記載の方法。
R2が、水素、−C1〜8アルキル−R5、−C2〜8アルケニル−R5、−C2〜8アルキニル−R5、−C(O)H、−C(O)−(C1〜8)アルキル−R9、−C(O)−NH2、−C(O)−NH(C1〜8アルキル−R9)、−C(O)−N(C1〜8アルキル−R9)2、−C(O)−NH(アリール−R8)、−C(O)−シクロアルキル−R8、−C(O)−複素環−R8、−C(O)−アリール−R8、−C(O)−ヘテロアリール−R8、−CO2H、−C(O)−O−(C1〜8)アルキル−R9、−C(O)−O−アリール−R8、−SO2−(C1〜8)アルキル−R9、−SO2−アリール−R8、−シクロアルキル−R6、−アリール−R6及び−(C1〜8)アルキル−N−R7からなる群より独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された1個の置換基である;但し、R2が炭素原子に結合されている場合には、R2は、−C1〜8アルコキシ−R5、−N−R7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−複素環−R6及び−ヘテロアリール−R6からなる群から更に選択される、28.に記載の方法。
R3が、水素、−C1〜8アルキル−R10、−C2〜8アルケニル−R10、−C2〜8アルキニル−R10、−C1〜8アルコキシ−R10、−C(O)H、−C(O)−(C1〜8)アルキル−R9、−C(O)−NH2、−C(O)−NH(C1〜8アルキル−R9)、−C(O)−N(C1〜8アルキル−R9)2、−C(O)−シクロアルキル−R8、−C(O)−複素環−R8、−C(O)−アリール−R8、−C(O)−ヘテロアリール−R8、−C(NH)−NH2、−CO2H、−C(O)−O−(C1〜8)アルキル−R9、−C(O)−O−アリール−R8、−SO2−(C1〜8)アルキル−R9、−SO2−アリール−R8、−N−R7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−R8、−複素環−R8、−アリール−R8及び−ヘテロアリール−R8からなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された1〜3個の置換基である、28.に記載の方法。
R10が、水素、−NH2、−NH(C1〜8アルキル)、−N(C1〜8アルキル)2、シアノ,(ハロ)1〜3、ヒドロキシ、ニトロ及びオキソからなる群から独立して選択される1〜2個の置換基である、38.に記載の方法。
R4が、水素、−C1〜8アルキル−R10、−C2〜8アルケニル−R10、−C2〜8アルキニル−R10、−C1〜8アルコキシ−R10、−C(O)H、−C(O)−(C1〜8)アルキル−R9、−C(O)−NH2、−C(O)−NH(C1〜8アルキル−R9)、−C(O)−N(C1〜8アルキル−R9)2、−C(O)−シクロアルキル−R8、−C(O)−複素環−R8、−C(O)−アリール−R8、−C(O)−ヘテロアリール−R8、−C(NH)−NH2、−CO2H、−C(O)−O−(C1〜8)アルキル−R9、−C(O)−O−アリール−R8、−SH、−S−(C1〜8)アルキル−R10、−SO2−(C1〜8)アルキル−R9、−SO2−アリール−R8、−SO2−NH2、−SO2−NH(C1〜8アルキル−R9)、−SO2−N(C1〜8アルキル−R9)2、−N−R7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−R8、−複素環−R8、−アリール−R8及び−ヘテロアリール−R8からなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された1〜4個の置換基である、28.に記載の方法。
R10が、水素、−NH2、−NH(C1〜8アルキル)、−N(C1〜8アルキル)2、シアノ,(ハロ)1〜3、ヒドロキシ、ニトロ及びオキソからなる群から独立して選択される1
〜2個の置換基である、40.に記載の方法。
Y及びZが、O、S、(H,OH)、及び(H,H)からなる群から独立して選択される;但し、Y及びZの一方がOであり且つ他方がO、S、(H,OH)、及び(H,H)からなる群から選択される;及びそれらの薬学上許容し得る塩である、28.に記載の方法。
Rが、Ra、−C1〜4アルキル−Ra、−C2〜4アルケニル−Ra、−C2〜4アルキニル−Ra及びシアノからなる群から選択される、28.に記載の方法。
Raが、複素環、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択される、29.に記載の方法。
Raが、ジヒドロ−ピラニル、フェニル、ナフチル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、アザインドリル、インダゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ジベンゾフリル及びジベンゾチエニルからなる群から選択される、29.に記載の方法。
R1が、水素、−C1〜4アルキル−R5、−C2〜4アルケニル−R5、−C2〜4アルキニル−R5、−C(O)−(C1〜4)アルキル−R9、−C(O)−アリール−R8、−C(O)−O−(C1〜4)アルキル−R9、−C(O)−O−アリール−R8、−C(O)−NH(C1〜4アルキル−R9)、−C(O)−NH(アリール−R8)、−C(O)−N(C1〜4アルキル−R9)2、−SO2−(C1〜4)アルキル−R9、−SO2−アリール−R8、−シクロアルキル−R6、−複素環−R6、−アリール−R6及び−ヘテロアリール−R6からなる群から選択され;ここで、複素環及びヘテロアリールは、複素環又はヘテロアリール環の炭素原子を通して1の位置のアザインドール窒素原子と結合している、28.に記載の方法。
R1が、水素、−C1〜4アルキル−R5、−アリール−R6及び−ヘテロアリール−R6からなる群から選択され;ここで、ヘテロアリールは、ヘテロアリール環の炭素原子を通して1の位置のアザインドール窒素原子に結合されている、28.に記載の方法。
R1が、水素、−C1〜4アルキル−R5及び−ナフチル−R6からなる群から選択される、28.に記載の方法。
R5が、水素、−O−(C1〜4)アルキル、−O−(C1〜4)アルキル−OH、−O−(C1〜4)アルキル−O−(C1〜4)アルキル、−O−(C1〜4)アルキル−NH2、−O−(C1〜4)アルキル−NH(C1〜4アルキル)、−O−(C1〜4)アルキル−N(C1〜4アルキル)2、−O−(C1〜4)アルキル−S−(C1〜4)アルキル、−O−(C1〜4)アルキル−SO2−(C1〜4)アルキル、−O−(C1〜4)アルキル−SO2−NH2、−O−(C1〜4)アルキル−SO2−NH(C1〜4アルキル)、−O−(C1〜4)アルキル−SO2−N(C1〜4アルキル)2、−O−C(O)H、−O−C(O)−(C1〜4)ア
ルキル、−O−C(O)−NH2、−O−C(O)−NH(C1〜4アルキル)、−O−C(O)−N(C1〜4アルキル)2、−O−(C1〜4)アルキル−C(O)H、−O−(C1〜4)アルキル−C(O)−(C1〜4)アルキル、−O−(C1〜4)アルキル−CO2H、−O−(C1〜4)アルキル−C(O)−O−(C1〜4)アルキル、−O−(C1〜4)アルキル−C(O)−NH2、−O−(C1〜4)アルキル−C(O)−NH(C1〜4アルキル)、−O−(C1〜4)アルキル−C(O)−N(C1〜4アルキル)2、−C(O)H、−C(O)−(C1〜4)アルキル、−CO2H、−C(O)−O−(C1〜4)アルキル、−C(O)−NH2、−C(NH)−NH2、−C(O)−NH(C1〜4アルキル)、−C(O)−N(C1〜4アルキル)2、−SH、−S−(C1〜4)アルキル、−S−(C1〜4)アルキル−S−(C1〜4)アルキル、−S−(C1〜4)アルキル−O−(C1〜4)アルキル、−S−(C1〜4)アルキル−O−(C1〜4)アルキル−OH、−S−(C1〜4)アルキル−O−(C1〜4)アルキル−NH2、−S−(C1〜4)アルキル−O−(C1〜4)アルキル−NH(C1〜4アルキル)、−S−(C1〜4)アルキル−O−(C1〜4)アルキル−N(C1〜4アルキル)2、−S−(C1〜4)アルキル−NH(C1〜4アルキル)、−SO2−(C1〜4)アルキル、−SO2−NH2、−SO2−NH(C1〜4アルキル)、−SO2−N(C1〜4アルキル)2、−N−R7、シアノ,(ハロ)1〜3、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−シクロアルキル−R6、−複素環−R6、−アリール−R6及び−ヘテロアリール−R6からなる群から独立して選択される1〜2個の置換基である、31.に記載の方法。
R5が、水素、−O−(C1〜4)アルキル、−N−R7、ヒドロキシ及び−ヘテロアリール−R6からなる群から独立して選択される1〜2個の置換基である、31.に記載の方
法。
R5が、水素、−O−(C1〜4)アルキル、−N−R7、ヒドロキシ、−イミダゾリル−R6、−トリアゾリル−R6及び−テトラゾリル−R6からなる群から独立して選択される1〜2個の置換基である、31.に記載の方法。
R6が、水素、−C1〜4アルキル、−C2〜4アルケニル、−C2〜4アルキニル、−C(O)H、−C(O)−(C1〜4)アルキル、−CO2H、−C(O)−O−(C1〜4)アルキル、−C(O)−NH2、−C(NH)−NH2、−C(O)−NH(C1〜4アルキル)、−C(O)−N(C1〜4)アルキル)2、−SO2−(C1〜4)アルキル、−SO2−NH2、−SO2−NH(C1〜4アルキル)、−SO2−N(C1〜4アルキル)2、−(C1〜4)アルキル−N−R7、−(C1〜4)アルキル−(ハロ)1〜3、−(C1〜4)アルキル−OH、−アリール−R8、−(C1〜4)アルキル−アリール−R8及び−(C1〜4)アルキル−ヘテロアリール−R8からなる群から独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された1〜4個の置換基である;但し、R6が炭素原子に結合されている場合には、R6は、−C1〜4アルコキシ、−(C1〜4)アルコキシ−(ハロ)1〜3、−SH、−S−(C1〜4)アルキル、−N−R7、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ及び−ヘテロアリール−R8からなる群から更に選択される、31.に記載の方法。
R6が水素である、31.に記載の方法。
R7が、水素、−C1〜4アルキル、−C2〜4アルケニル、−C2〜4アルキニル、−(C1〜4)アルキル−OH、−(C1〜4)アルキル−O−(C1〜4)アルキル、−(C1〜4)
アルキル−NH2、−(C1〜4)アルキル−NH(C1〜4アルキル)、−(C1〜4)アルキル−N(C1〜4アルキル)2、−(C1〜4)アルキル−S−(C1〜4)アルキル、−C(O)H、−C(O)−(C1〜4)アルキル、−C(O)−O−(C1〜4)アルキル、−C(O)−NH2、−C(O)−NH(C1〜4アルキル)、−C(O)−N(C1〜4アルキル)2、−SO2−(C1〜4)アルキル、−SO2−NH2、−SO2−NH(C1〜4アルキル)、−SO2−N(C1〜4アルキル)2、−C(N)−NH2、−シクロアルキル−R8、−(C1〜4)アルキル−複素環−R8、−アリール−R8、−(C1〜4)アルキル−アリール−R8及び−(C1〜4)アルキル−ヘテロアリール−R8からなる群から独立して選択される2個の置換基である、33.に記載の方法。
R7が、水素、−C1〜4アルキル、−C(O)H、−C(O)−(C1〜4)アルキル、−C(O)−O−(C1〜4)アルキル、−SO2−NH2、−SO2−NH(C1〜4アルキル)及び−SO2−N(C1〜4アルキル)2からなる群から独立して選択される2個の置換基である、33.に記載の方法。
R8が、水素、−C1〜4アルキル、−(C1〜4)アルキル−(ハロ)1〜3及び−(C1〜4)アルキル−OHからなる群から独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された1〜4個の置換基である;但し、R8が炭素原子に結合されている場合には、R8は、−C1〜4アルコキシ、−NH2、−NH(C1〜4アルキル)、−N(C1〜4アルキル)2、シアノ、ハロ、−(C1〜4)アルコキシ−(ハロ)1〜3、ヒドロキシ及びニトロからなる群から更に選択される、31.に記載の方法。
R8が水素である、31.に記載の方法。
R9が、水素、−C1〜4アルコキシ、−NH2、−NH(C1〜4アルキル)、−N(C1〜4アルキル)2、シアノ,(ハロ)1〜3、ヒドロキシ及びニトロからなる群から独立して選択される1〜2個の置換基である、31.に記載の方法。
R9が水素である、31.に記載の方法。
R2が、水素、−C1〜4アルキル−R5、−C2〜4アルケニル−R5、−C2〜4アルキニル−R5、−C(O)H、−C(O)−(C1〜4)アルキル−R9、−C(O)−NH2、−C(O)−NH(C1〜4アルキル−R9)、−C(O)−N(C1〜4アルキル−R9)2、−C(O)−NH(アリール−R8)、−C(O)−シクロアルキル−R8、−C(O)−複素環−R8、−C(O)−アリール−R8、−C(O)−ヘテロアリール−R8、−CO2H、−C(O)−O−(C1〜4)アルキル−R9、−C(O)−O−アリール−R8、−SO2−(C1〜4)アルキル−R9、−SO2−アリール−R8、−シクロアルキル−R6、−アリール−R6及び−(C1〜4)アルキル−N−R7からなる群より独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された1個の置換基である;但し、R2が炭素原子に結合されている場合には、R2は、−C1〜4アルコキシ−R5、−N−R7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−複素環−R6及び−ヘテロアリール−R6からなる群から更に選択される、28.に記載の方法。
R2が、水素、−C1〜4アルキル−R5、−C2〜4アルケニル−R5、−C2〜4アルキニル−R5、−CO2H、−C(O)−O−(C1〜4)アルキル−R9、−シクロアルキル−R6、−アリール−R6及び−(C1〜4)アルキル−N−R7からなる群より独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された1個の置換基である;但し、R2が窒素原子に結合されている場合には、クオーターニウム塩(quaterniumsalt)は形成されず;そして但し、R2が炭素原子に結合されている場合には、R2は、−C1〜4アルコキシ−R5、−N−R7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、オキソ、−複素環−R6及び−ヘテロアリール−R6からなる群から更に選択される、28.に記載の方法。
R2が、水素、−C1〜4アルキル−R5及び−アリール−R6からなる群より独立して選択される、炭素原子又は窒素原子に結合された1個の置換基である;但し、R2が窒素原子に結合されている場合には、クオーターニウム塩(quaterniumsalt)は形成されず;そして但し、R2が炭素原子に結合されている場合には、R2は、−N−R7、ハロゲン、ヒドロキシ及び−ヘテロアリール−R6からなる群から更に選択される、28.に記載の方法。
R3が、水素、−C1〜4アルキル−R10、−C2〜4アルケニル−R10、−C2〜4アルキニル−R10、−C1〜4アルコキシ−R10、−C(O)H、−C(O)−(C1〜4)アルキル−R9、−C(O)−NH2、−C(O)−NH(C1〜4アルキル−R9)、−C(O)−N(C1〜4アルキル−R9)2、−C(O)−シクロアルキル−R8、−C(O)−複素環−R8、−C(O)−アリール−R8、−C(O)−ヘテロアリール−R8、−C(NH)−NH2、−CO2H、−C(O)−O−(C1〜4)アルキル−R9、−C(O)−O−アリール−R8、−SO2−(C1〜8)アルキル−R9、−SO2−アリール−R8、−N−R7、−(C1〜4)アルキル−N−R7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−R8、−複素環−R8、−アリール−R8及び−ヘテロアリール−R8からなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された1〜3個の置換基である、28.に記載の方法。
R3が、水素、−C1〜4アルキル−R10、−C2〜4アルケニル−R10、−C2〜4アルキニル−R10、−C1〜4アルコキシ−R10、−C(O)H、−CO2H、−NH2、−NH(C1〜4アルキル)、−N(C1〜4アルキル)2、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ及びニトロからなる群から選択される、炭素原子に結合された1個の置換基である、28.に記載の方法。
R3が、水素、−C1〜4アルキル−R10、−NH2、−NH(C1〜4アルキル)、−N(C1〜4アルキル)2、ハロゲン及びヒドロキシからなる群から選択される、炭素原子に結合された1個の置換基である、28.に記載の方法。
R4が、水素、−C1〜4アルキル−R10、−C2〜4アルケニル−R10、−C2〜4アルキニル−R10、−C1〜4アルコキシ−R10、−C(O)H、−C(O)−(C1〜4)アルキル−R9、−C(O)−NH2、−C(O)−NH(C1〜4アルキル−R9)、−C(O)−N(C1〜4アルキル−R9)2、−C(O)−シクロアルキル−R8、−C(O)−複素環−R8、−C(O)−アリール−R8、−C(O)−ヘテロアリール−R8、−C(NH)−NH2、−CO2H、−C(O)−O−(C1〜4)アルキル−R9、−C(O)−O−アリール−R8、−SH、−S−(C1〜4)アルキル−R10、−SO2−(C1〜4)アルキ
ル−R9、−SO2−アリール−R8、−SO2−NH2、−SO2−NH(C1〜4アルキル−R9)、−SO2−N(C1〜4アルキル−R9)2、−N−R7、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル−R8、−複素環−R8、−アリール−R8及び−ヘテロアリール−R8からなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された1〜4個の置換基である、28.に記載の方法。
R4が、水素、−C1〜4アルキル−R10、−C2〜4アルケニル−R10、−C2〜4アルキニル−R10、−C1〜4アルコキシ−R10、−C(O)H、−CO2H、−NH2、−NH(C1〜4アルキル)、−N(C1〜4アルキル)2、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、−シクロアルキル、−複素環、−アリール及び−ヘテロアリールからなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された1〜4個の置換基である、28.に記載の方法。
R4が、水素、C1〜4アルキル−R10、C1〜4アルコキシ−R10、−NH2、−NH(C1〜4アルキル)、−N(C1〜4アルキル)2、ハロゲン及びヒドロキシからなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された1〜4個の置換基である、28.に記載の方法。
R4が、水素、C1〜4アルキル−R10、C1〜4アルコキシ−R10、−NH2、−NH(C1〜4アルキル)、−N(C1〜4アルキル)2、塩素、フッ素及びヒドロキシからなる群より独立して選択される、炭素原子に結合された1〜4個の置換基である、28.に記載の方法。
R10が、水素、−NH2、−NH(C1〜4アルキル)、−N(C1〜4アルキル)2、シアノ,(ハロ)1〜3、ヒドロキシ、ニトロ及びオキソからなる群から独立して選択される1〜2個の置換基でありる、38.及び41.に記載の方法。
R10が、水素及び(ハロ)1〜3からなる群から独立して選択される1〜2個の置換基である、38.及び41.に記載の方法。
R10水素及び(フルオロ)3からなる群から独立して選択される1〜2個の置換基である、38.及び41.に記載の方法。
Y及びZが、O、S、(H,OH)、及び(H,H)からなる群から独立して選択される;但し、Y及びZの一方がOであり且つ他方がO、S、(H,OH)、及び(H,H)からなる群から選択される、28.に記載の方法。
Y及びZが、O及び(H,H)からなる群から独立して選択される;但し、Y及びZの一方がOであり且つ他方がO及び(H,H)からなる群から選択される、28.に記載の方法。
Y及びZが独立してOから選択される、28.に記載の方法。
前記式IIの化合物が、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−3−イル]−4−[2−(トリフルオロメチル)フェニル]−1H−ピロール−2,5−ジオンである、28.に記載の方法。
前記式IIの化合物が、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−3−イル]−4−(1−メチル−1H−ピラゾール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオンである、28.に記載の方法。
前記式IIの化合物が、3−[1−(3−ヒドロキシ−プロピル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−3−イル]−4−ピラジン−2−イル−ピロール−2,5−ジオンである、28.に記載の方法。
前記式IIの化合物が、3−(2,4−ジメトキシ−ピリミジン−5−イル)−4−[1−(3−ヒドロキシ−プロピル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−3−イル]−ピロール−2,5−ジオンである、28.に記載の方法。
前記式IIの化合物が、4−{3−[4−(2,4−ジメトキシ−ピリミジン−5−イル)−2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−3−イル]−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル}−ブチロニトリルである、28.に記載の方法。
前記式IIの化合物が、4−{3−[4−(1−メチル−1H−ピラゾール−3−イル)−2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−3−イル]−ピロロ[2,3−b]ピリジン−1−イル}−ブチロニトリルである、28.に記載の方法。
前記式IIの化合物が、3−(2,4−ジメトキシ−ピリミジン−5−イル)−4−(1−フェネチル−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−3−イル)−ピロール−2,5−ジオンである、28.に記載の方法。
A及びEが、水素置換された炭素原子及び窒素原子からなる群から独立して選択され;ここで、
ZがOから選択され;あるいは、Zがジヒドロから選択され;ここで、それぞれの水素原子が単結合で結合されている、83.に記載の方法。
R4及びR5が、場合によりオキソで置換されているC1〜8アルキル、C2〜8アルケニル、及びC2〜8アルキニルから独立して選択される、83.に記載の方法。
R2が、−C1〜8アルキル−、−C2〜8アルケニル−、−C2〜8アルキニル−、−O−(C1〜8)アルキル−O−、−O−(C2〜8)アルケニル−O−、−O−(C2〜8)アルキニル−O−、−C(O)−(C1〜8)アルキル−C(O)−(式中、該アルキル、アルケニル、及びアルキニル結合基のいずれも、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、−C(O)O−(C1〜8)アルキル、−C1〜8アルキル−C(O)O−(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは、水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選ばれた置換基で置換されている)、ハロゲン,(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ(C1〜8)アルキル及びオキソからなる群から独立して選ばれた1個〜4個の置換基で場合により置換されている直炭素鎖であり;そして、式中、該アルキル、アルケニル、及びアルキニル結合基のいずれも、複素環、アリール、ヘテロアリール、複素環(C1〜8)アルキル、アリール(C1〜8)アルキル、ヘテロアリール(C1〜8)アルキル、スピロシクロアルキル、及
びスピロ複素環(式中、該シクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリール置換基のいずれも、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル,カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは、水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ハロゲン,(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル,(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ(C1〜8)アルキルからなる群から独立して選択された1個〜4個の置換基で場合により置換されており;そして式中、上記の複素環置換基のいずれも場合によりオキソで置換されている)からなる群から独立して選択された1個〜2個の置換基で場合により置換されている)、シクロアルキル、複素環、アリール、ヘテロアリール(式中、シクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリールは、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは、水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選ばれた置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル,(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ(C1〜8)アルキルからなる群から独立して選択された1個〜4個の置換基で場合により置換されており;そして式中、複素環は場合によりオキソで置換されている)、−(O−(CH2)1〜6)0〜5−O−、−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−O−、−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−O−、−(O−(CH2)1〜6)0〜5−NR6−、−O−(CH2)1〜6−NR6−(CH2)1〜6−O−、−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−NR6−、−(O−(CH2)1〜6)0〜5−S−、−O−(CH2)1〜6−S−(CH2)1〜6−O−、−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−S−、−NR6−、−NR6−NR7−、−NR6−(CH2)1〜6−NR7−、−NR6−(CH2)1〜6−NR7−(CH2)1〜6−NR8−、−NR6−C(O)−、−C(O)−NR6−、−C(O)−(CH2)0〜6−NR6−(CH2)0〜6−C(O)−、−NR6−(CH2)0〜6−C(O)−(CH2)1〜6−C(O)−(CH2)0〜6−NR7−、−NR6−C(O)−NR7−、−NR6−C(NR7)−NR8−、−O−(CH2)1〜6−NR6−(CH2)1〜6−S−、−S−(CH2)1〜6−NR6−(CH2)1〜6−O−、−S−(CH2)1〜6−NR6−(CH2)1〜6−S−、−NR6−(CH2)1〜6−S−(CH2)1〜6−NR7−、及び−SO2−(式中、R6、R7、及びR8は、水素、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは、水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ヒドロキシ(C1〜8)アルキル、複素環(C1〜8)アルキル、アリール(C1〜8)アルキル、及びヘテロアリール(C1〜8)アルキル(式中、該複素環、アリール、及びヘテロアリール置換基は、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは、水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル,(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ(C1〜8)アルキルからなる群から独立して選択された1個〜4個の置換基で場合により置換されており;そして式中、複素環は場合によりオキソで置換されている)からなる群から独立して選択される)からなる群から選択され;但し、A及びEが水素置換された炭素原子から選択された場合には、R2は、−C2〜8アルキニル−、−O−(C1〜8)アルキル−O−、−O−(C2〜8)アルケニル−O−、−O−(C2〜8)アルキニル−O−、−C(O)−(C1〜8)アルキル−C(O)−(式中、該アルキル、アルケニル、及びアルキニル結合基のいずれも、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、−C(O)O−(C1〜8)アルキル、−C1〜8アルキル−C(O)O−(C1〜8)アルキル、ア
ミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは、水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル,(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ(C1〜8)アルキル及びオキソからなる群から独立して選択された1個〜4個の置換基で場合により置換された直炭素鎖であり;そして式中、該アルキル、アルケニル、及びアルキニル結合基のいずれも複素環、アリール、ヘテロアリール、複素環(C1〜8)アルキル、アリール(C1〜8)アルキル、ヘテロアリール(C1〜8)アルキル、スピロシクロアルキル、及びスピロ複素環(式中、該シクロアルキル、複素環、アリール、及びヘテロアリール置換基のいずれも、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アル
コキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ(C1〜8)アルキルからなる群から独立して選択された1個〜4個の置換基で場合により置換されており;そして式中、該複素環置換基のいずれも場合によりオキソで置換されている)からなる群から独立して選択された1個〜2個の置換基で場合により置換されている)、シクロアルキル(式中、シクロアルキルは、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ(C1〜8)アルキルからなる群から独立して選択された1個〜4個の置換基で場合により置換されている)、−(O−(CH2)1〜6)1〜5−O−、−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−O−、−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−O−、−(O−(CH2)1〜6)1〜5−NR6−、−O−(CH2)1〜6−NR6−(CH2)1〜6−O−、−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−NR6−、−(O−(CH2)1〜6)0〜5−S−、−O−(CH2)1〜6−S−(CH2)1〜6−O−、−O−(CH2)1〜6−O−(CH2)1〜6−S−、−NR6−NR7−、−NR6−(CH2)1〜6−NR7−、−NR6−(CH2)1〜6−NR7−(CH2)1〜6−NR8−、−NR9−C(O)−、−C(O)−NR9−、−C(O)−(CH2)0〜6−NR6−(CH2)0〜6−C(O)−、−NR6−(CH2)0〜6−C(O)−(CH2)1〜6−C(O)−(CH2)0〜6−NR7−、−NR6−C(O)−NR7−、−NR6−C(NR7)−NR8−、−O−(CH2)1〜6−NR6−(CH2)1〜6−S−、−S−(CH2)1〜6−NR6−(CH2)1〜6−O−、−S−(CH2)1〜6−NR6−(CH2)1〜6−S−及び−NR6−(CH2)1〜6−S−(CH2)1〜6−NR7−(式中、R6、R7、及びR8は、水素、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ヒドロキシ(C1〜8)アルキル、複素環(C1〜8)アルキル、アリール(C1〜8)アルキル、及びヘテロアリール(C1〜8)アルキル(式中、該複素環、アリール及びヘテロアリール置換基は、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは水素及び水素及びC1〜4アルキル)、ハロゲン,(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル,(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ(C1〜8)アルキルからなる群から独立して選択された1個〜4個の置換基で場合により置換されており;そして式中、複素環は場合によりオキソで置換されている)よりなる群より独立して選ばれ;そして式中、R9は、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ヒドロキシ(C1〜8)アルキル、複素環(C1〜8)アルキル、アリール(C1〜8)アルキル及びヘテロアリール(C1〜8)アルキル(式中、該複素環、アリール及びヘテロアリール置換基は、C1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル,(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ及びヒドロキシ(C1〜8)アルキルからなる群から独立して選択された1個〜4個の置換基で場合により置換され;そして式中、複素環は場合によりオキソで置換されている)よりなる群より独立して選ばれる)よりなる群より選ばれる、83.に記載の方法。
R1及びR3が、水素、C1〜8アルキル、C2〜8アルケニル、C2〜8アルキニル(式中、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、C1〜8アルコキシ、アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、(ハロ)1〜3、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ(C1〜8)アルキル及びオキソからなる群から選択された置換基で場合により置換されている)、C1〜8アルコキシ、C1〜8アルキルカルボニル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、C1〜8アルキルチオ、アリール、ヘテロアリール(式中、アリール及びヘテロアリールはC1〜8アルキル、C1〜8アルコキシ、アルコキシ(C1〜8)アルキル、カルボキシル、カルボキシル(C1〜8)アルキル、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、アミノ(C1〜8)アルキル(式中、アミノは水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で置換されている)、ハロゲン、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルキル、(ハロ)1〜3(C1〜8)アルコキシ、ヒドロキシ、及びヒドロキシ(C1〜8)アルキルからなる群から選択された置換基で場合により置換されている)、アミノ(水素及びC1〜4アルキルからなる群から独立して選択された置換基で場合により置換されている)、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、及びニトロ;及びそれらの薬学上許容し得る塩からなる群から独立して選択される、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、6,7,9,10,12,13,15,16−オクタヒドロ−23H−5,26:17,22−ジメテノ−5H−ジピリド[2,3−k:3’,2’−q]ピロロ[3,4−n][1,4,7,10,19]トリオキサジアザシクロヘンイコシン−23,25(24H)−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、10,11,13,14,16,17,19,20,22,23−デカヒドロ−9,4:24,29−ジメテノ−1H−ジピリド[2,3−n:3’,2’−t]ピロロ[3,4−q][1,4,7,10,13,22]テトラオキサジアザシクロテトラコシン−1,3(2H)−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、10,11,13,14,16,17,19,20,22,23,25,26−ドデカヒドロ−9,4:27,32−ジメテノ−1H−ジピリド
[2,3−q:3’,2’−w]ピロロ[3,4−t][1,4,7,10,13,16,25]ペンタオキサジアザシクロヘプタコシン−1,3(2H)−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、6,7,9,10,12,13−ヘキサヒドロ−20H−5,23:14,19−ジメテノ−5H−ジベンゾ[h,n]ピロロ[3,4−k][1,4,7,16]ジオキサジアザシクロオクタデシン−20,22(21H)−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、6,7,9,10,12,13,15,16−オクタヒドロ−23H−5,26:17,22−ジメテノ−5H−ジベンゾ[k,q]ピロロ[3,4−n][1,4,7,10,19]トリオキサジアザシクロヘンエイコシン−23,25(24H)−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、10,11,13,14,16,17,19,20,22,23−デカヒドロ−9,4:24,29−ジメテノ−1H−ジベンゾ[n,t]ピロロ[3,4−q][1,4,7,10,13,22]テトラオキサジアザシクロテトラコシン−1,3(2H)−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が化合物1aである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3−[1−[3−[(2−ヒドロキシエチル)メチルアミノ]プロピル]−1H−インダゾール−3−イル]−4−[1−(3−ピリジニル)−1H−インドール−3−イル]−1H−ピロール−2,5−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3,5−ジクロロ−N−[3−クロロ−4−[(3,4,12,12a−テトラヒドロ−1H−[1,4]チアジノ[3,4−c][1,4]ベンゾジアゼピン−11(6H)−イル)カルボニル]フェニル]−ベンズアミドである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3−[1−(2−ヒドロキシ−エチル)−1H−インドール−3−イル]−4−(1−ピリジン−3−イル−1H−インドール−3−イル)−ピロール−2,5−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3−(2−メトキシ−フェニル)−4−(1−ピリジン−3−イル−1H−インドール−3−イル)−ピロール−2,5−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、6−[[2−[[4−(2,4−ジクロロフェニル)−5−(4−メチル−1H−イミダゾール−2−イル)−2−ピリミジニル]アミノ]エチ
ル]アミノ]−3−ピリジンカルボニトリルである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3−(5−クロロ−1−メチル−1H−インドール−3−イル)−4−[1−(3−イミダゾール−1−イル−プロピル)−1H−インダゾール−3−イル]−ピロール−2,5−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3−(5−クロロ−1−メチル−1H−インドール−3−イル)−4−[1−(3−[1,2,3]トリアゾール−1−イル−プロピル)−1H−インダゾール−3−イル]−ピロール−2,5−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3−[1−(3−ヒドロキシ−プロピル)−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−3−イル]−4−(1−メチル−1H−ピラゾール−3−イル)−ピロール−2,5−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が化合物10aである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3−[1−(3−ヒドロキシ−3−メチル−ブチル)−1H−インダゾール−3−イル]−4−(1−ピリジン−3−イル−1H−インドール−3−イル)−ピロール−2,5−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3−[1−(2−ヒドロキシ−エチル)−1H−インダゾール−3−イル]−4−(1−ピリミジン−5−イル−1H−インドール−3−イル)−ピロール−2,5−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3−[1−(2−ヒドロキシ−エチル)−1H−インドール−3−イル]−4−(1−ピリミジン−5−イル−1H−インドール−3−イル)−ピロール−2,5−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、(11Z)−8,9,10,13,14,15−ヘキサヒドロ−2,6:17,21−ジ(メテノ)ピロロ[3,4−h][1,15,7]ジオキサザシクロトリコシン−22,24(1H,23H)−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3−(5−クロロ−1−ピリジン−3−イル−1H−インドール−3−イル)−4−[1−(3−ヒドロキシ−プロピル)−1H−インダゾール−3−イル]−ピロール−2,5−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3−(2−メトキシ−フェニル)−4−[1−(3−メトキシ−プロピル)−1H−ピロロ[3,2−c]ピリジン−3−イル]−ピロール−2,5−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3−[1−(3−ヒドロキシ−プロピル)−1H−インダゾール−3−イル]−4−[1−(テトラヒドロ−ピラン−4−イル)−1H−インドール−3−イル]−ピロール−2,5−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、2−{3−[4−(5−クロロ−1−メチル−1H−インドール−3−イル)−2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−3−イル]−インダゾール−1−イル}−N−(2−ヒドロキシ−エチル)−アセトアミドである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、4−(3−クロロ−フェニル)−6−(3−ジメチルアミノ−プロピル)−5,6−ジヒドロ−4H−2,4,6−トリアザ−シクロペンタ[c]フッ素−1,3−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、14−エチル−6,7,9,10,13,14,15,16−オクタヒドロ−12H,23H−5,26:17,22−ジメテノジベンゾ[k,q]ピロロ[3,4−n][1,4,7,10,19]ジオキサトリアザシクロヘンエイコシン−23,25(24H)−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、14−ベンジル−6,7,9,10,13,14,15,16−オクタヒドロ−12H,23H−5,26:17,22−ジ(メテノ)ジベンゾ[k,q]ピロロ[3,4−n][1,4,7,10,19]ジオキサトリアザシクロヘンイコシン−23,25(24H)−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3−(1−{2−[2−(2−ヒドロキシ−エトキシ)−エトキシ]−エチル}−1H−インドール−3−イル)−4−[1−(2−ヒドロキシ−エチル)−1H−インドール−3−イル]−ピロール−2,5−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、6,7,8,9,10,11,12,13−オクタヒドロ−8,11−ジメチル−5,23:14,19−ジメテノ−20H−ジベンゾ[k,q]ピロロ[3,4−n][1,4,7,10]テトラアザシクロオクタデシン−20,22(21H)−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、7,8,9,10,12,13,16,17,18,19−デカヒドロ−8,17−ジメチル−15H,26H−5,29:20,25−ジメテノ−6H−ジベンゾ[k,q]ピロロ[3,4−n][1,4,7,10,19,22]ジオキサテトラアザシクロテトラコシン−26,28(27H)−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、14−(2−フリルメチル)−6,7,9,10,13
,14,15,16−オクタヒドロ−12H,23H−5,26:17,22−ジ(メテノ)ジベンゾ[k,q]ピロロ[3,4−n][1,4,7,10,19]ジオキサトリアザシクロヘンイコシン−23,25(24H)−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、14−(2−チエニルメチル)−6,7,9,10,13,14,15,16−オクタヒドロ−12H,23H−5,26:17,22−ジ(メテノ)ジベンゾ[k,q]ピロロ[3,4−n][1,4,7,10,19]ジオキサトリアザシクロヘンイコシン−23,25(24H)−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、14−(1−ナフチルメチル)−6,7,9,10,13,14,15,16−オクタヒドロ−12H,23H−5,26:17,22−ジ(メテノ)ジベンゾ[k,q]ピロロ[3,4−n][1,4,7,10,19]ジオキサトリアザシクロヘンイコシン−23,25(24H)−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、14−(ピリジン−4−イルメチル)−6,7,9,10,13,14,15,16−オクタヒドロ−12H,23H−5,26:17,22−ジ(メテノ)ジベンゾ[k,q]ピロロ[3,4−n][1,4,7,10,19]ジオキサトリアザシクロヘンイコシン−23,25(24H)−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3−[1−(2−{2−[2−(1,2,3,4−テトラヒドロ−ナフタレン−1−イルアミノ)−エトキシ]−エトキシ}−エチル)−1H−インドール−3−イル]−4−{1−[2−(1,2,3,4−テトラヒドロ−ナフタレン−1−イルアミノ)−エチル]−1H−インドール−3−イル}−ピロール−2,5−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3−[1−(3−ジメチルアミノ−フェニル)−1H−インドール−3−イル]−4−[1−(2−ヒドロキシ−エチル)−1H−インダゾール−3−イル]−ピロール−2,5−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、3−[5−クロロ−1−(6−ジメチルアミノ−ピリジン−3−イル)−1H−インドール−3−イル]−4−[1−(2−ヒドロキシ−エチル)−1H−インダゾール−3−イル]−ピロール−2,5−ジオンである、83.に記載の方法。
前記式(III)の化合物が、5−(5−クロロ−3−{4−[1−(2−ヒドロキシ−エチル)−1H−インダゾール−3−イル]−2,5−ジオキソ−2,5−ジヒドロ−1H−ピロール−3−イル}−インドール−1−イル)−ニコチン酸メチルエステルである、83.に記載の方法。
Claims (11)
- 多能性細胞を増殖及び分化するための方法であって、
a.前記多能性細胞を培養する過程と、
b.前記多能性細胞をGSK−3Bの酵素活性阻害剤で処理する過程とを含み、
ここで、前記GSK−3Bの酵素活性阻害剤が、3−[1−(2−ヒドロキシエチル)−1H−インドール−3−イル]−4−(1−ピリジン−3−イル−1H−インドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオンである、
上記方法。 - 前記多能性細胞が胚幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性細胞が、胚幹細胞由来の多能性マーカーを発現する細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性マーカーを発現する細胞が、ABCG2、クリプト、FoxD3、Connexin43、Connexin45、Oct4、SOX−2、Nanog、hTERT、UTF−1、ZFP42、SSEA−3、SSEA−4、Tra1−60、及びTra1−81からなる群から選択される多能性マーカーのうちの少なくとも1つを発現する、請求項3に記載の方法。
- 前記多能性細胞が胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化される、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性細胞が前記GSK−3Bの酵素活性阻害剤で1〜72時間処理される、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性細胞が前記GSK−3Bの酵素活性阻害剤で12〜48時間処理される、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性細胞が前記GSK−3Bの酵素活性阻害剤で48時間処理される、請求項1に記載の方法。
- 前記GSK−3Bの酵素活性阻害剤が濃度100nM〜100μMで用いられる、請求項1に記載の方法。
- 前記GSK−3Bの酵素活性阻害剤が濃度1μM〜10μMで用いられる、請求項1に記載の方法。
- 前記GSK−3Bの酵素活性阻害剤が濃度10μMで用いられる、請求項1に記載の方法。
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