MX2014015419A - Tratamiento de celulas pluripotentes. - Google Patents

Tratamiento de celulas pluripotentes.

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Abstract

La presente invención está dirigida a métodos para tratar células pluripotentes, mediante los cuales las células pluripotentes pueden expandirse eficientemente en cultivo y diferenciarse mediante el tratamiento de las células pluripotentes con un inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B.

Description

TRATAMIENTO DE CÉLULAS PLURIPOTENTES REFERENCIA CRUZADA La presente solicitud reclama la prioridad de la Solicitud de Patente Provicional No. de Serie 61/741,776, presentada el 14 de junio de 2012, que se incorpora aquí en su totalidad como referencia para todo propósito.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a metodos para tratar células pluripotentes, en donde las células pluripotentes pueden expandirse de manera eficiente en cultivo y diferenciarse al tratar las células pluripotentes con un inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los avances en la terapia de reemplazo celular para la diabetes mellitus Tipo I y la escasez de islotes de Langerhans para transplantes, han concentrado el interés en el desarrollo de fuentes de células productoras de insulina, o células b, adecuadas para la funcionalidad del injerto. Un enfoque es la generación de celulas b funcionales a partir de células pluripotentes, tales como, por ejemplo, células madres embrionarias.
En el desarrollo embrionario de los vertebrados, una célula pluripotente da origen a un grupo de células que comprenden tres capas de germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un proceso conocido como gastrulación. Los tejidos tales como, por ejemplo, tiroides, timo, páncreas, intestino e hígado, se desarrollarán a partir del endodermo, a través de una etapa intermedia. La etapa intermedia en este proceso es la formación de endodermo definitivo. Las células del endodermo definitivo expresan varios marcadores, tales como, HNF-3 beta, GATA-4, MixM, CXCR4 y SOX-17.
La formación del páncreas se origina a partir de la diferenciación del endodermo definitivo en endodermo pancreático. Las células del endodermo pancreático expresan el gen de la homeosecuencia pancreático-duodenal, PDX-1. En ausencia de PDX-1, el páncreas no se desarrolla más allá de la formación de las yemas ventral y dorsal. Por lo tanto, la expresión de PDX-1 marca una etapa crítica en la organogénesis pancreática. El páncreas maduro contiene, entre otros tipos de células, tejido exocrino y tejido endocrino. Los tejidos endocrino y exocrino se originan a partir de la diferenciación de endodermo pancreático.
La generación de una cantidad suficiente de material celular para el trasplante requiere una fuente del material celular que pueda expandirse de manera eficiente en cultivo, y diferenciarse de manera eficiente en el tejido de interés, por ejemplo, células b funcionales.
Los metodos actuales para cultivar células madre embrionarias humanas son complejos; requieren el uso de factores exógenos, o medios definidos químicamente para que las células proliferen sin perder su pluripotencia. Además la diferenciación de células madre embrionarias resulta, frecuentemente, en una disminución en las células a expandirse en el cultivo.
En un ejemplo, Cheon y otros (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, 19 de octubre de 2005) describen un sistema de cultivo libre de células alimentadoras y libre de suero, en el cual las células madre embrionarias se mantienen en un medio no condicionado de reemplazo de suero (RS) complementado con distintos factores de crecimiento capaces de activar la autorrenovación de las células madre embrionarias.
En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 20050233446 describe un medio definido útil para cultivar células madre, incluso células madre primordiales de primate indiferenciadas. En solución, el medio es sustancialmente isotónico en comparación con las células madre que se cultivan. En un cultivo dado, el medio particular comprende un medio base y una cantidad de cada uno de bFGF, insulina y ácido ascórbico necesarios para soportar el crecimiento indiferenciado de células madre primordiales.
En otro ejemplo, la patente núm. W02005086845 describe un método para el mantenimiento de una célula madre indiferenciada, dicho método comprende la exposición de una célula madre a un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento transformante beta (TGF ), a un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento fibroblástico (FGF), o nicotinamida (NIC) en una cantidad suficiente para mantener la célula en un estado indiferenciado durante un período de tiempo suficiente para lograr un resultado deseado.
Los inhibidores de la glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3) son conocidos por promover la proliferación y la expansión de células madres adultas. En un ejemplo, Tateishi y otros (Biochemical and Biophysical Research Communications (2007) 352: 635) muestran que la inhibición de GSK-3 mejora el crecimiento y la supervivencia de células madres cardiacas humanas (hCSC) recuperadas de corazón humano neonatal o adulto y que tienen características mesenquimales.
Por ejemplo, Rulifson y otros (PNAS 144, 6247-6252, (2007)) establecen que “la señal Wnt estimula la proliferación de células b de los islotes.” En otro ejemplo, la patente núm. W02007016485 informa que la adición de inhibidores de GSK-3 al cultivo de células madres no embrionarias, que incluyen células progenitoras adultas multipotentes, conduce al mantenimiento de un fenotipo pluripotente durante la expansión y resulta en una respuesta de diferenciación más robusta.
En otro ejemplo, la patente núm. US2006030042 usa un método de inhibición de GSK-3, ya sea mediante la adición de Wnt o una molécula pequeña inhibidora de la actividad de la enzima GSK-3, para mantener las células madres embrionarias sin el uso de una capa de células alimentadora.
En otro ejemplo, la patente núm. W02006026473 informa la adición de un inhibidor de GSK-3B, para estabilizar celulas pluripotentes a través de la activación transcripcional de c-myc y la estabilización de la proteína c-myc.
En otro ejemplo, la patente núm. W02006100490 informa el uso de un medio de cultivo de células madres que contiene un inhibidor de GSK-3 y un agonista gp130 para mantener una población de auto-renovación de células madres pluripotentes, que incluyen células madres embrionarias humanas o de ratón.
En otro ejemplo, Sato y otros (Nature Medicine (2004) 10:55-63) muestran que la inhibición de GSK-3 con un compuesto farmacológico específico puede mantener el fenotipo indiferenciado de células madres embrionarias y sostener la expresión de factores de transcripción específicos del estado pluripotente tales como Oct-3/4, Rex-1, y Nanog.
En otro ejemplo, Maurer y otros (Journal of Proteome Research (2007) 6:1198-1208) muestran que las células madres neuronales adultas, tratadas con Un inhibidor de GSK -3 muestran mayor diferenciación neuronal, específicamente al promover la transcripción de genes objetivo de b-catenina y disminuir la apoptosis.
En otro ejemplo, Gregory y otros (Annals of the New York Academy of Sciences (2005) 1049:97-106) informan que inhibidores de GSK-3B mejoran la osteogénesis vitro.
En otro ejemplo, Feng y otros (Biochemical and Biophysical Research Communcations (2004) 324:1333-1339) muestran que la diferenciación hematopoyética a partir de células madres embrionarias se asocia con la regulación negativa de la vía Wnt/p-catenina, en donde Wnt es un inhibidor natural de GSK3.
Por lo tanto, aún persiste una necesidad importante de desarrollar métodos para tratar células madres pluripotentes de manera que puedan expandirse para abordar las necesidades clínicas actuales, y al mismo tiempo retengan el potencial para diferenciarse en células endocrinas pancreáticas, células que expresan hormonas pancreáticas o células secretoras de hormonas pancreáticas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para expandir y diferenciar células pluripotentes al tratar las células pluripotentes con un inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para expandir y diferenciar células pluripotentes; el método comprende las etapas de: a. cultivar células pluripotentes, y b. tratar las células pluripotentes con un inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B.
En una modalidad, las células pluripotentes se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo.
Las células pluripotentes pueden ser células madre embrionarias humanas, o pueden ser células que expresan marcadores de pluripotencia, derivadas de células madre embrionarias humanas, de acuerdo con los métodos descritos en la patente núm. 60/913475.
En una modalidad, el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B es un compuesto de la Fórmula (I): Fórmula (I) En una modalidad, el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B es un compuesto de la Fórmula (II): Fórmula (II) En una modalidad, el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B es un compuesto de la Fórmula (III): Fórmula (III) BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A y 1B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones del compuesto núm. 221 sobre el número de células, determinado por el número de núcleos observados (Figura 1A) y la expresión de Sox-17, determinada por la intensidad de la tinción de inmunofluorescencia (Figura 1B). Los resultados se obtuvieron a partir de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (barras blancas), o de células de la línea de células madre embrionarias humanas H9 (barras negras), mediante el uso del analizador de células IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
Las Figuras 2A y 2B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones del compuesto núm. 206 sobre el número de células, determinado por el número de núcleos observados (Figura 2A) y la expresión de Sox-17, determinada por la intensidad de la tinción de inmunofluorescencia (Figura 2B). Los resultados se obtuvieron a partir de celulas de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (barras blancas), o de células de la línea de células madre embrionarias humanas H9 (barras negras), mediante el uso del Analizador de células IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
Las Figuras 3A y 3B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones del compuesto núm. 223 sobre el número de células, determinado por el número de núcleos observados (Figura 3A) y la expresión de Sox-17, determinada por la intensidad de la tinción de inmunofluorescencia (Figura 3B). Los resultados se obtuvieron a partir de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (barras blancas), o de células de la línea de células madre embrionarias humanas H9 (barras negras), mediante el uso del Analizador de células IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
Las Figuras 4A y 4B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones del compuesto núm. 47 sobre el número de células, determinado por el número de núcleos observados (Figura 4A) y la expresión de Sox-17, determinada por la intensidad de la tinción de inmunofluorescencia (Figura 4B). Los resultados se obtuvieron a partir de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (barras blancas), o de células de la línea de células madre embrionarias humanas H9 (barras negras), mediante el uso del Analizador de células IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
Las Figuras 5A y 5B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones del compuesto núm. 103 sobre el número de celulas, determinado por el número de núcleos observados (Figura 5A) y la expresión de Sox-17, determinada por la intensidad de la tinción de inmunofluorescencia (Figura 5B). Los resultados se obtuvieron a partir de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (barras blancas), o de células de la línea de células madre embrionarias humanas H9 (barras negras), mediante el uso del Analizador de células IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
Las Figuras 6A y 6B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones del compuesto núm. 133 sobre el número de células, determinado por el número de núcleos observados (Figura 6A) y la expresión de Sox-17, determinada por la intensidad de la tinción de inmunofluorescencia (Figura 6B). Los resultados se obtuvieron a partir de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (barras blancas), o de células de la línea de células madre embrionarias humanas H9 (barras negras), mediante el uso del Analizador de células IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
Las Figuras 7A y 7B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones del compuesto núm. 136 sobre el número de células, determinado por el número de núcleos observados (Figura 7A) y la expresión de Sox-17, determinada por la intensidad de la tinción inmunofluorescente (Figura 7B). Los resultados se obtuvieron a partir de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (barras blancas), o de células de la línea de celulas madre embrionarias humanas H9 (barras negras), mediante el uso del Analizador de células IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
Las Figuras 8A y 8B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones del compuesto núm. 198 sobre el número de células, determinado por el número de núcleos observados (Figura 8A) y la expresión de Sox-17, determinada por la intensidad de la tinción de inmunofluorescencia (Figura 8B). Los resultados se obtuvieron a partir de células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (barras blancas), o de células de la línea de células madre embrionarias humanas H9 (barras negras), mediante el uso del Analizador de células IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare).
La Figura 9 muestra la expresión de CXCR4 en la superficie de células, determinada por tinción de inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo, en células tratadas con los compuestos mostrados, de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 8.
Las Figuras 10A a 10C muestran la expresión de CXCR4 (Figura 10A), HNF-3 beta (Figura 10B), y Sox-17 (Figura 10C), determinadas mediante PCR en tiempo real, en células tratadas con los compuestos mostrados, de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 8.
Las Figuras 11A y 11B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones de los compuestos mostrados sobre el número de células, determinado por el número de núcleos observados (Figura 11 A) y la expresión de Pdx-1, determinada por la intensidad de la tinción de inmunofluorescencia (Figura 11 B), mediante el uso del analizador de células IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Las celulas se trataron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 9.
La Figura 12 muestra el efecto de un intervalo de concentraciones de los compuestos mostrados sobre la expresión de Pdx-1 (barras blancas) y HNF-6 (barras negras), determinada por PCR en tiempo real. Las células se trataron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 9.
Las Figuras 13A y 13B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones de los compuestos mostrados sobre el número de células, determinado por el número de núcleos observados (Figura 13A) y la expresión de Insulina, determinada por la intensidad de la tinción de inmunofluorescencia (Figura 13B), mediante el uso del analizador de células IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Las células se trataron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 10.
La Figura 14 muestra el efecto de un intervalo de concentraciones de los compuestos mostrados sobre la expresión de Pdx-1 (barras blancas) e insulina (barras negras), determinadas mediante PCR en tiempo real. Las células se trataron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 10.
Las Figuras 15A y 15B muestran el efecto de un intervalo de concentraciones de los compuestos mostrados sobre el número de células, determinado por el número de núcleos observados (Figura 15A) y la expresión de insulina, determinada por la intensidad de la tinción de inmunofluorescencia (Figura 15B), mediante el uso del analizador de células IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Las celulas se trataron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 11.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para mayor claridad de la descripción, y no en forma limitante, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas características, modalidades o aplicaciones de la presente invención.
Definiciones Las células madre son células indiferenciadas definidas por su capacidad a nivel de células únicas de autorrenovarse y diferenciarse para producir células progenitores, que incluyen progenitores que se autorrenuevan, progenitores que no se renuevan y células diferenciadas de forma terminal. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de varios linajes celulares a partir de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como para dar lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante y contribuir sustancialmente a la mayoría, si no a todos, los tejidos después de la inyección dentro de los blastocistos.
Las células madre se clasifican según su potencial de desarrollo como: (1) totipotentes, que significa que pueden producir todos los tipos celulares embrionarios y extraembrionarios; (2) pluripotentes, que significa que pueden producir todos los tipos celulares embrionarios; (3) multipotentes, que significa que pueden producir un subconjunto de linajes celulares, pero todos dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico particular (por ejemplo, las células madres hematopoyéticas (HSC) pueden producir una progenie que incluye HSC (autorrenovación), progenitores oligopotentes restringidos a células sanguíneas y todos los tipos y elementos celulares (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre); (4) oligopotentes, que significa que pueden producir un subconjunto más restringido de linajes celulares que las células madres multipotentes; y (5) unipotente, que significa ser capaz de originar un único linaje celular (por ejemplo, células madres espermatogénicas).
La diferenciación es un proceso mediante el cual una célula no especializada (“no comprometida”) o menos especializada, adquiere las características de una célula especializada, tal como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula inducida a la diferenciación o diferenciada es una que toma una posición más especializada (“comprometida”) dentro del linaje de una célula. El término “comprometido”, cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha seguido la vía de la diferenciación hasta un punto en donde, bajo circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo de célula específico o subconjunto de tipos de células o revertir a un tipo de célula menos diferenciada. La desdiferenciación se refiere al proceso mediante el cual una célula revierte a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Como se usa en la presente descripción, el linaje de una célula define la herencia de una célula, es decir, de qué células proviene y qué células puede originar. El linaje de una célula posiciona a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico para el linaje se refiere a una característica específicamente asociada con el fenotipo de las células de un linaje de interés y se puede usar para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida para linaje de interés.
El “linaje de células b” se refiere a células con expresión génica positiva para el factor de transcripción PDX-1 y al menos uno de los siguientes factores de transcripción: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, lsl-1, HNF-3 beta, MAFA, Pax4, y Pax6. Las células que expresan marcadores característicos del linaje de célulasó incluyen células b.
“Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo” como se usa en la presente descripción, se refieren a células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: SOX-17, GATA-4, HNF-3 beta, GSC, Cer1, Nodal, FGF8, brachyura, proteína de homeosecuencia tipo Mix, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99, u OTX2. Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo incluyen células precursoras de la línea primitiva, células de la línea primitiva, células mesendodérmicas y células del endodermo definitivo.
“Células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático”, como se usa en la presente descripción, se refieren a células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX-1 , HNF-1 beta, PTF-1 alfa, FINF-6, o FIB9. Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático incluyen las células del endodermo pancreático.
“Las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático”, como se usa en la presente descripción, se refiere a las células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: NGN-3, NeuroD, lslet-1, PDX-1 , NKX6.1, Pax-4, Ngn-3, o PTF-1 alfa. Las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático incluyen las células endocrinas pancreáticas, las células que expresan hormonas pancreáticas, y las células secretoras de hormonas pancreáticas y las células del linaje de las células b.
“Endodermo definitivo”, como se usa en la presente descripción, se refiere a células que tienen características de células que se originan del epiblasto durante la gastrulación y que forman el tracto gastrointestinal y sus derivados. Las células del endodermo definitivo expresan los siguientes marcadores: HNF-3 beta, GATA-4, SOX-17, Cerberus, OTX2, goosecoide, C-Kit, CD99, y Mixll .
“Endodermo extraembrionario”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una población de células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: SOX-7, AFP, y SPARC.
“Marcadores”, como se usa en la presente descripción, son moléculas de ácidos nucleicos o polipéptidos que se expresan diferencialmente en una célula de interés. En este contexto, expresión diferencial significa un nivel aumentado para un marcador positivo y un nivel disminuido para un marcador negativo. El nivel detectadle del marcador de ácido nucleico o polipéptido es suficientemente más alto o más bajo en las células de interés en comparación con otras células, de manera que la célula de interés pueda identificarse y distinguirse de otras células por medio del uso de cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la téenica.
“Célula mesendodérmica”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula que expresa al menos uno de los siguientes marcadores: CD48, eomesodermina (EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 beta, GSC, FGF17, GATA-6.
“La célula endocrina pancreática”, o “la célula que expresa una hormona pancreática”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula capaz de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina, y polipéptido pancreático.
“Célula que secreta hormonas pancreáticas”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula con la capacidad de secretar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina, y polipéptido pancreático.
“Célula de la línea pre-primitiva”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula que expresa por lo menos uno de los siguientes marcadores: Nodal, o FGF8.
“Celulas de la línea primitiva”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula que expresa por lo menos uno de los siguientes marcadores: braquiura, proteina de homeosecuencia tipo mezcla o FGF4.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para la expansión y diferenciación de células pluripotentes que comprende tratar a las células pluripotentes con un inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para expandir y diferenciar células pluripotentes; el método comprende las etapas de: c. cultivar células pluripotentes, y d. tratar las células pluripotentes con un inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B.
En una modalidad, las células pluripotentes se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.
Los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se seleccionan del grupo que consiste en SOX17, GATA4, FINF-3beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, proteínas de la caja homeótica tipo Mix, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 y OTX2. En la presente invención se contempla una célula, derivada de una célula pluripotente que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula precursora de la línea primitiva. En un aspecto alternativo, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula mesendodérmica. En un aspecto alternativo, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula del endodermo definitivo.
Las células pluripotentes pueden tratarse con el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B durante aproximadamente una a aproximadamente 72 horas. Alternativamente, las células pluripotentes pueden tratarse con el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B durante aproximadamente 12 a aproximadamente 48 horas. Alternativamente, las células pluripotentes pueden tratarse con el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B durante aproximadamente 48 horas.
En una modalidad, el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B se usa a una concentración de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 100 mM. Alternativamente, el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B se usa a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 pM. Alternativamente, el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B se usa a una concentración de aproximadamente 10 pM. Compuestos adecuados para su uso en los métodos de la presente invención En una modalidad, el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B es un compuesto de la Fórmula (I): Fórmula (I) en donde: R-i es fenilo, fenilo sustituido en donde los sustituyentes del fenilo se seleccionan del grupo que consiste en alquilo de Ci-5, halógeno, nitro, trifluorometilo y nitrilo, o pirimidinilo; R2 es fenilo, fenilo sustituido en donde los sustituyentes del fenilo se seleccionan del grupo que consiste en alquilo de Ci-5, halógeno, nitro, trifluorometilo y nitrilo, o pirimidinilo que se sustituye opcionalmente con alquilo de Ci-4, y al menos uno de R-i y R2 es pirimidinilo; R3 es hidrógeno, 2- (trimetilsilil) etoximetilo, alcoxicarbonilo de C-i. 5, ariloxicarbonilo, alquiloxicarbonil arilo de C-i-s, alquil arilo de Ci-5, alquil arilo sustituido de Ci-5, en donde el uno o más sustituyentes de arilo se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo de C-i-s, alcoxi de Ci_5, halógeno, amino, alquilamino de Ci-5, y dialquilamino de C-i-s, alquil ftalimido de C.-i-s, alquil amino de Ci-5, alquil diamino de Ci-5, alquil succinimido de C1-5, alquilcarbonilo de C1-5, arilcarbonilo, alquilo de C-i. 5alquilcarbonilo de Ci-s y alquil ariloxicarbonilo de Ci-5; R4 es -(A)-(CH2)q-X; A es vinileno, etinileno o R5 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de C-i-5, fenilo y alquil fenilo de Ci-5, q es 0-9; X se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxi, vinilo, vinilo sustituido en donde uno o más sustituyentes de vinilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en flúor, bromo, cloro y yodo, etinilo, etinilo sustituido en donde los sustituyentes de etinilo se seleccionan del grupo que consiste en flúor, bromo cloro y yodo, alquilo de C1-5, alquilo sustituido de Ci. 5, en donde el uno o más sustituyentes de alquilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en alcoxi de Ci-5, trihaloalquilo, ftalimido y amino, cicloalquilo de C3-7, alcoxi de Ci-5, alcoxi sustituido de Ci-5, en donde los sustituyentes del alquilo se seleccionan del grupo que consiste en ftalimido y amino, ftalimidooxi, fenoxi, fenoxi sustituido, en donde el uno o más sustituyentes del fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en alquilo de C1-5, halógeno y alcoxi de Ci-5, fenilo, fenilo sustituido en donde el uno o más sustituyentes del fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en alquilo de C-|. 5, halógeno y alcoxi de C1 5, alquil arilo de C-i.5, alquil arilo sustituido de Ci-5, en donde el uno o más sustituyentes del arilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en alquilo de C-i. 5, halógeno y alcoxi de C1-5, alquilamino ariloxi de C1.5, alquilamino de Ci-5, dialquilamino de Ci-5, nitrilo, oxima, benxiloxiimino, alquiloxiimino de Ci-5, ftalimido, succinimido, alquilcarboniloxi de Ci-5, fenilcarboniloxi, fenilcarboniloxi sustituido, en donde el uno o más sustituyentes del fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en alquilo de Ci-5, halógeno y alcoxi de C-i-5, fenil alquilcarboniloxi de Ci-5l en donde el uno o más sustituyentes del fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en alquilo de Ci-5, halógeno y alcoxi de Ci-5, aminocarboniloxi, alquilaminocarboniloxi de C-i-5, dialquilaminocarboniloxi de Ci-5, alcoxicarboniloxi de C-i-5, alcoxicarboniloxi sustituido de Ci-5, en donde el uno o más sustituyentes del alquilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en metilo, etilo, isopropilo y hexilo, fenoxicarboniloxi, fenoxicarboniloxi sustituido, en donde el uno o más sustituyentes del fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en alquilo de Ci-5, alcoxi de C1-5 y halógeno, alquiltio de Ci-5, alquiltio sustituido de Ci-5, en donde los sustituyentes del alquilo se seleccionan del grupo que consiste en hidroxi y ftalimido, alquilsulfonilo de C1-5, fenilsulfonilo, fenilsulfonilo sustituido, en donde el uno o más sustituyentes del fenílo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en bromo, flúor, cloruro, alcoxi de Ci. 5 y trifluorometilo; con la condición de que si A es q es 0 y X es H, entonces R3 no debe ser 2-(trimetilsilil)etoximetilo; y sales farmacéuticamente aceptables de estos.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de Fórmula (I), en donde Ri es fenilo sustituido y R2 es pirimidin-3-il.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de Fórmula (I), en donde Ri es 4-fluorofenilo.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de Fórmula (I), en donde R3 es hidrógeno, alquil arilo de Ci-5, o alquil arilo sustituido de Ci-s.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de Fórmula (I), en donde R3 es hidrógeno o fenilalquilo de Ci_5.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de Fórmula (I), en donde A es etinileno y q es 0-5.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de Fórmula (I) en donde X es succinimido, hidroxi, metilo, fenilo, alquilsulfonilo de Ci-5, cicloalquilo de C3-6, alquilcarboniloxi de C1-5, alcoxi de C1-5, fenilcarboniloxi, alquilamino de C1-5, dialquilamino de C-i-5 o nitrilo.
Los compuestos de Fórmula (I) se describen en la patente de los Estados Unidos cedida en forma mancomunada núm. 6,214,830, cuya descripción completa se incorpora en la presente descripción como referencia.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de Fórmula (I), en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en los compuestos enumerados en la Tabla A, más abajo: Tabla A Compuestos de Fórmula (I) TABLA A (CONTINUACIÓN) Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de Fórmula (I) en donde el compuesto es el Compuesto A-5 de la fórmula: Compuesto A-5 En una modalidad, el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B es un compuesto de la Fórmula (II): Fórmula (II) en donde: R se selecciona del grupo que consiste en Ra, -Ci.8alquil-Ra, - C2-8alquenilo-Ra -C2-8alquinilo-Ra y ciano; Ra se selecciona del grupo que consiste en cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo; R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-8alquil· R5, -C2-8alquenil-R5, -C2-sa Iq u i n i I- R5 , -C(O)-(Ci-8)alquil-R9, -C(O)- aril-R8, -C(O)-O-(C1-8)alquil-R9, -C(0)-0-aril-R8, -C(0)- (C^ 8alquil-R9), -C(0)-NH(aril-R8), -C(0)-N(Ci.8alquil-R9)2, -S02·^!- 8)alquil-R9, -S02-aril-R8, cicloalquil-R6, -heterociclil-R6, -aril-R6 y heteroaril-R6; en donde el heterociclilo y el heteroarilo están unidos al átomo de nitrógeno del azaindol en la posición uno a través de un átomo de carbono de anillo heterociclilo o heteroarilo; R5 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -0-(Ci-8)alquilo, -0-(Ci. s)alquil-OH, -0-(Ci-8)alquil-0-(Ci-8)alquilo, -0-(C1-8)alquil-NH2, - 0-(C -8)alquil-NH(Ci-8alquilo), -0-(Ci-8)alquil-N(Ci-8alquilo)2, -O- (C1-8)alquil-S-(Ci-8)alquilo, -CKC-i-^alquil-SO^C-i-sJalquilo, -O- (Ci-8)alquil-S02-NH2, -0-(C1-8)alquil-S02-NH(Ci.8alquilo), -0-(Ci. 8)alquil-S02-N(Ci-8alquilo)2, -0-C(0)H, -0-C(0)-(C1-8)alquilo, -O- C(0)-NH2, -0-C(0)-NH(C1-8alquilo), -0-C(0)-N(C1-8alquilo)2, -O- (Ci-8)alquil-C(0)H, -0-(Ci-8)alquil-C(0)-(Ci.8)alquilo, -0-(Ci. 8)alquil-CO2H, -0-(Ci-8)alqu¡l-C(0)-0-(C -8)alquilo, -0-(Ci. 8)alqu¡l-C(O)-NH2, -O-(C1-8)alqu¡l-C(O)-NH(C1-8alquilo), -O- ^. 8)alquil-C(0)-N(C1-8alquilo)2, -C(0)H, -C(0)-(C1-8)alquilo, -CO2H, -C(0)-0-(C1-8)alquilo, -C(0)-NH2, -C(NH)-NH2, -O ^-NH^. 8alquilo), -C(0)-N(Ci.8alqu¡lo)2, -SH, -S-(Ci-8)alquilo, -S-(C-|. 8)alquil-S-(C1-8)alquilo, -S-(C1-8)alquil-0-(Ci.8)alquilo, -S-(Ci. 8)alquil-0-(Ci-8)alquil-0H, -S-(Ci-8)alquil-0-(C1-8)alquil-NH2 -S-(Ci_8)alquil-0-(C1_e)alquil-NH(C(-8alquilo), -S- sialquil-O-iCi. 8)alquil-N(Ci-8alquilo)2, -S-(Ci-8)alquil-NH(Ci-8alquilo), -S02-(C·!. 8)alquilo, -S02-NH2, -S02-NH(Ci-8alquilo), -S02-N(Ci-8alquilo)2, -N-R7, ciano, (halo)i-3, hidroxi, nitro, oxo, -cicloalquil-R6, -heterociclil-R6, -aril-R6 y -heteroaril-R6; R6 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-8alquilo, -C2-8alquenilo, -C2-8alquinilo, -C(0)H, -C(O)-(C1-8)alquilo, -C02H, -C(0)-0-(C1-8)alquilo, -C(0)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(0)-NH(C1-8alquilo), -C(0)-N(C1-8)alquilo)2, -S02-(C-i-8)alquilo, -S02-NH2, -S02-NH(Ci-8alquilo), -S02-N(Ci-8alquilo)2, -(C1-8)alquilo-N-R7, -(C1-8)alquil-(halo)i-3, -(Ci-8)alquil-OH, aril-R8, -(C1-8)alquil-aril-R8 y -(Ci-8)alquil-heteroaril-R8; con la condición de que, cuando R6 se une a un átomo de carbono, R6 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste en -C1-8alcoxi, -(Ci-8)alcoxi-(halo)i-3, -SH, -S-(C1-8)alquilo, -N-R7, ciano, halo, hidroxi, nitro, oxo y -heteroaril-R8; R7 es 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -C-i-salquilo, -C2-8alquenilo, -C2- 8alquinilo, -(Ci-8)alquil-OH, -(Ci-8)alquil-O-(C1-8)alquilo, -(Ci-8)alquil-NH2, -(C1-8)alquil-NH(C -8alquilo), -(C1-8)alquil-N(Ci-8alquilo)2, -(Ci. 8)alquil-S-(C1-8)alquilo, -C(O)H, -C(O)-(C1-8)alquilo, 8)alquilo, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C1-8alquilo), -C(0)-N(Ci-8alquilo)2, -S02-(Ci-8)alquilo, -S02-NH2, -S02-NH(Ci-8alquilo), -S02-N(Ci. 8alquilo)2, -C(N)-NH2, -cicloalquil-R8, -(C-i-8)alquil-heterociclil-R8, -aril-R8, -(C1-8)alquil-aril-R8 y -(Ci-8)alquil-heteroaril-R8; R8 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -C-i-8alquilo, -(Ci-8)alqu¡l-(halo)i_3 y -(C-i. s)alquil-OH; con la condición de que, cuando R8 se une a un átomo de carbono, R8 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste en -C1-8alcoxi, -NH2, -NH(Ci-8alquilo), -N(C-|. 8alquilo)2, ciano, halo, -(Ci-8)alcoxi-(halo)i-3, hidroxi y nitro; R9 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -C-i-8alcox¡, -NH2, -NH(Ci. 8alquilo), -N(Ci-8alquilo)2, ciano, (halo)i-3, hidroxi y nitro; R2 es un sustituyente unido a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, -C1-8alquil-R5, -C2-8alquenil-R5, -C2-8alquinil-R5, -C(0)H, -C(0)-(Ci-8)alquil-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(Ci-8alquil-R9), -C(0)-N(Ci-8alquil-R9)2, - C(O)-NH(aril-R8), -C(O)-cicloalquil-R8, -C(0)-heteroc¡clil-R8, -C(0)-aril-R8, -C(0)-heteroaril-R8, -CO2H, -C(0)-O-(C1-8)alquil-R9, -C(0)-0-aril-R8, -S02-(Ci-8)alquil-R9, -S02-aril-R8, -cicloalquil-R6, -aril-R6 y -(C1-8)alquil-N-R7; con la condición de que, cuando R2 se une a un átomo de carbono, R2 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste en -Ci-8alcoxi-R5, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, oxo, -heterociclil-R6 y -heteroaril-R6; R3 es 1 a 3 sustituyentes unidos a un átomo de carbono seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-8alquil-R10, -C2-8alquenil-R10, -C2-8alquinil-R10, - C1-8alcoxi-R10, -C(0)H, -C(0)-(Ci-8)alquil-R9, -C(0)-NH2, -C(O)-NH(Ci-8alquil-R9), -C(0)-N(C1-8alquil-R9)2, -C(0)-cicloalquil-R8, -C(0)-heterociclil-R8, -C(0)-aril-R8, -C(0)-heteroaril-R8, -C(NH)-NH2, -C02H, -C(0)-0-(C1-8)alquil-R9, -C(0)-0-aril-R8, -S02-(C^ 8)alquil-R9, -S02-aril-R8, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquil-R8, -heterociclil-R8, -aril-R8 y -heteroaril-R8; R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -C1-8alquil-R10, -C2-8alquenil-R10, -C2-8alquinil-R10, -C-i. ealcoxi-R10, -C(0)H, -C(0)-(C1-8)alquil- salquil-R9), -C(0)-N(C1-8alquil-R9)2, -C(0)-cicloalquil-R8, -C(O)-heterociclil-R8, -C(0)-aril-R8, -C(0)-heteroaril-R8, -C(NH)-NH2, -C02H, -C(0)-0-(C1-8)alquil-R9, -C(0)-0-aril-R8, -SH, -S-(C1-8)alquil- R10, -S02-(C1-8)alquil-R9, -S02-aril-R8, -S02-NH2, -S02-NH(Ci. Salquil-R9), -S02-N(Ci-8alquil-R9)2, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquil-R8, -heterociclil-R8, -aril-R8 y -heteroaril-R8; R10 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -NH2, -NH(Ci-8alquilo), - N(Ci-8alquilo)2, ciano, (halo)i-3, hidroxi, nitro y oxo; y, Y y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste en O, S, (H,OH) y (H,H); con la condición de que uno de Y y Z sea O y el otro se seleccione del grupo que consiste en O, S, (H,OH) y (H,H); y sales farmaceuticamente aceptables de estos.
Modalidades de la presente invención incluyen compuestos de Fórmula (II), en donde R se selecciona del grupo que consiste en Ra, -C-i. 4alquil-Ra, -C2-4alquenil-Ra, -C2.4alquinil-Ra y ciano.
Modalidades de la presente invención incluyen compuestos de Fórmula (II), en donde Ra se selecciona del grupo que consiste en heterociclilo, arilo y heteroarilo.
En una modalidad, Ra se selecciona del grupo que consiste en dihidro-piranilo, fenilo, naftilo, tienilq, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, piridinilo, azaindolilo, indazolilo, benzofurilo, benzotienilo, dibenzofurilo y dibenzotienilo.
Modalidades de la presente invención incluyen compuestos de Fórmula (II), en donde R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-4alquil-R5, -C2-4alquenil-R5, -C2-4alquinil-R5, -C(O)-(Ci- )alquil-R9, -C(O)-aril-R8, -C(0)-O-(C1-4)alquil-R9, -C(0)-0-aril-R8, -C(0)-NH(C1-4alqu¡l-R9), -C(O)- NH(aril-R8), -C(O)-N(Ci-4alquil-R9)2, -S02-(C1-4)alquil-R9, -S02-aril-R8, -dcloalquil-R6, -heterocielil-R6, -aril-R6 y -heteroaril-R6; en donde el heterociclilo y heteroarilo se unen al átomo de nitrógeno del azaindol en la posición uno a traves de un átomo de carbono del anillo heterociclilo o heteroarilo.
En una modalidad, R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -C1-4alquil-R5, -aril-R6 y -heteroaril-R6; en donde el heteroarilo se une al átomo de nitrógeno del azaindol en la posición uno a través de un átomo de carbono del anillo heteroarilo.
En una modalidad, R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-4alquil-R5 y -naftil-R6.
Modalidades de la presente invención incluyen compuestos de Fórmula (II), en donde R5 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -O-(Ci-4)alquilo, -0-(Ci-4)alquil-OH, -0-(Ci_4)alqu¡l-0-(Ci-4)alquilo, -0-(C-i-4)alquil-NH2, -0-(Ci_ 4)alquil-NH(Ci- alquilo), -0-(C - )alqu¡l-N(Ci- alquilo)2, -0-(C1- )alquil-S-(C·!. 4)alquilo, -0-(Ci-4)alquil-S02-(C-i- )alquilo, -0-(Ci-4)alquil-S02-NH2, -0-(Ci. 4)alquil- alquil-S02-N(C-i- alquilo)2, -0-C(O)H, -0-C(0)-(C1-4)alquilo, -0-C(0)-NH2, -0-C(0)-NH(Ci-4alquilo), -0-C(0)-N(Ci. 4alquilo)2, -0-(Ci-4)alquil-C(0)H, -0-(Ci-4)alquil-C(0)-(Ci-4)alquilo, -O-ÍC!. 4)alquil-CO2H, -0-(C1-4)alquil-C(0)-0-(C1-4)alquilo, -0-(Ci-4)alquil-C(0)-NH2, -0-(Ci- )alquil-C(0)-NH(C1-4alquilo), -0-(Ci-4)alquil-C(0)-N(Ci-4alquilo)2, C(0)H, -C(0)-(Ci-4)alquilo, -C02H, -C(0)-0-(C1-4)alquilo, -C(0)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(0)-NH(C1-4alquilo), -C(0)-N(C1-4alquilo)2, -SH, -S-(C1-4)alquilo, -S- (Ci-4)alquil-S-(C1-4)alquilo, -S-(Ci-4)alqu¡l-O-(Ci-4)alqu¡lo, -S-(Ci-4)alquil-0-(Ci. 4)alqu¡l-OH, -S-(Ci-4)alqu¡l-0-(Ci-4)alquil-NH2, -S-(C1- )alqu¡l-0-(C1- )alqüil-NH(Ci-4alquilo), -S-(Ci- )aiquil-0-(C1-4)alquil-N(C1-4alquNo)2, -S-(C -4)alquil-NH(C1- alquilo), -S02-(C1-4)alquilo, -S02-NH2, -S02-NH(Ci-4alquilo), -S02-N(Ci-4alquilo)2, -N-R7, ciano, (halo)1-3, hidroxi, nitro, oxo, -cicloalquil-R6, -heterociclil-R6, -aril-R6 y -heteroaril-R6.
En una modalidad, R5 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -0-(Ci-4)alquilo, -N-R7, hidroxi y -heteroaril-R6.
En una modalidad, R5 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -0-(Ci-4)alquilo, -N-R7, hidroxi, -imidazolil-R6, -triazolil-R6 y -tetrazolil-R6.
Modalidades de la presente invención incluyen compuestos de Fórmula (II), en donde R6 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-4alquilo, -C2-4alquenilo, -C2-4alquinilo, -C(O)H, -C(O)-(C-M)alquilo, -CO2H, -C(0)-0-(C1-4)alquilo, -C(0)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(0)-NH(C1-4alquilo), -C^-N Ci-^alquilo^, -S02-(C1-4)alquilo, -S02-NH2, -S02-NH(Ci-4alquilo), -S02-N(Ci- alquilo)2, -(Ci- )alquil-N-R7, -(C1- )alquil-(halo)i-3, -(Ci-4)alquil-OH, -aril-R8, -(C-i-^alquil-aril-R8 y -(Ci- )alquil-heteroaril-R8; con la condición de que, cuando R6 se une a un átomo de carbono, R6 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste en -Ci-4alcox¡, -(Ci-4)alcoxi-(halo)i-3, -SH, -S-(Ci- )alquilo, -NR7, ciano, halo, hidroxi, nitro, oxo y-heteroaril-R8.
En una modalidad, R6 es hidrógeno.
Modalidades de la presente invención incluyen compuestos de Fórmula (II), en donde R7 es 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci^alquilo, -C2-4alquenilo, -C2-4alquinilo, -(Ci_4)alquil-OH, -(Ci^alquil-O-iC-Mjalquilo, -(Ci-4)alquil-NH2, -(C1-4)alquil-NH(Ci. 4alquilo), -(C1-4)alquil-N(Ci-4alquilo)2, -(C1-4)alquil-S-(C1-4)alqu¡lo, -C(O)FI, -C(O)-(Ci-4)alquilo, -C(O)-O-(Ci-4)alquilo, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(Ci-4alquilo), -C(O)-N(C1- alquilo)2, -S02-(Ci- )alquilo, -S02-NH2, -SC^-NF^C- alquilo), -S02-N(Ci. alquilo)2, -C(N)-NH2, -cicloalquil-R8, -(Ci-4)alquil-heterociclil-R8, -aril-R8, -(Ci. 4)alquil-aril-R8 y -(C1-4)alquil-heteroaril-R8.
En una modalidad R7 es 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci- alquilo, -C(0)H, -C(0)-(C1-4)alquilo, -C(0)-0-(Ci-4)alquilo, -S02-NH2, 4alquilo) y -S02-N(Ci-4alquilo)2.
Modalidades de la presente invención incluyen compuestos de Fórmula (II), en donde R8 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci- alqu¡lo, -(Ci-4)alquil-(halo)i-3 y -(Ci-4)alquil-OH; con la condición de que, cuando R8 se une a un átomo de carbono, R8 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste en -C1- alcoxi, -NH2, -NH(C1-4alquilo), -N(Ci-4alquilo)2, ciano, halo, -(Ci^alcoxi-íhalo)·^, hidroxi y nitro.
En una modalidad, R8 es hidrógeno.
Modalidades de la presente Invención incluyen compuestos de Fórmula (II), en donde R9 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-4alcoxi, -NH2, -NH(Ci-4alquilo), -N(Ci_4alquilo)2, ciano, (halo)i-3, hidroxi y nitro.
En una modalidad, R9 es hidrógeno.
Modalidades de la presente invención incluyen compuestos de Fórmula (II), en donde R2 es un sustituyente unido a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-4alqu¡l-R5, -C2-4alquenil-R5, -C2-4alquinil-R5, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)alquil-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C1-4alquil-R9), -C(0)-N(Ci-4alquil-R9)2, -C(0)-NH(aril-R8), -C(O)-cicloalquil-R8, -C(0)-heterociclil-R8, -C(0)-aril-R8, -C(0)-heteroaril-R8, -CO2H, -C(0)-O-(C1-4)alquil-R9, -C(0)-0-aril-R8, -S02-(C1-4)alquil-R9, -S02-aril-R8, -cicloalquil-R6, -aril-R6 y -(Ci-4)alquil-N-R7; con la condición de que, cuando R2 se une a un átomo de carbono, R2 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste en -C-i-4alcoxi-R5, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, oxo, -heterociclil-R6 y heteroaril-R6.
En una modalidad, R2 es un sustituyente unido a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, -C-i. 4alquil-R5, -C2-4alquenil-R5, -C2.4alquinil-R5, -C02FI, -C(0)-0-(C1-4)alquil-R9, -cicloalquil-R6, -aril-R6 y -(C-i-4)alquil-N-R7; con la condición de que, cuando R2 se une a un átomo de nitrógeno, no se forme una sal cuaternaria; y, con la condición de que, cuando R2 se une a un átomo de carbono, R2 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste en -Ci-4alcoxi-R5, -N-R7, daño, halógeno, hidroxi, nitro, oxo, -heterocielil-R6 y -heteroaril-R6.
En una modalidad, R2 es un sustituyente unido a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci. 4alquil-R5 y -aril-R6; con la condición de que, cuando R2 se une a un átomo de nitrógeno, no se forme una sal cuaternaria; y, con la condición de que cuando R2 se une a un átomo de carbono, R2 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste en -N-R7, halógeno, hidroxi y -heteroaril-R6.
Modalidades de la presente invención incluyen compuestos de Fórmula (II), en donde R3 es 1 a 3 sustituyentes unidos a un átomo de carbono seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -C- alquil-R10, -C2-4alquenil-R10, -C2-4alquinil-R10, -Ci-4alcoxi-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)alquil-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C1-4alquil-R9), -C(0)-N(Ci. alquil-R9)2, -C(0)-cicloalquil-R8, -C(0)-heterociclil-R8, -C(0)-aril-R8, -C(O)-heteroaril-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(0)-O-(C1-4)alquil-R9, -C(0)-0-aril-R8, -S02-(Ci-8)alquil-R9, -S02-aril-R8, -N-R7, -(Ci- )alquil-N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquil-R8, -heterociclil-R8, -aril-R8 y -heteroaril-R8.
En una modalidad, R3 es un sustituyente unido a un átomo de carbono seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, -C-Malquil-R10, -C2-4alquenil-R10, -C2-4alquinil-R10, -Ci-4alcoxi-R10, -C(0)H, -C02H, -NH2, -NH(Ci-4alquiló), -N(C - alquilo)2, ciano, halógeno, hidroxi y nitro.
En una modalidad, R3 es un sustituyente unido a un átomo de carbono seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-4alquil-R10, -NH2, -NH(C1-4alquilo), -N(C1-4alquilo)2, halógeno e hidroxi.
Modalidades de la presente invención incluyen compuestos de Fórmula (II), en donde R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-4alquil-R10, -C2-4alquenil-R10, -C2- alquinil-R10, -Ci-4alcoxi-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)alquil-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C1-4alquil-R9), -C(0)-N(Ci. 4alquil-R9)2, -C(0)-cicloalquil-R8, -C(0)-heterociclil-R8, -C(0)-aril-R8, -C(O)-heteroaril-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(0)-O-(C1-4)alquil-R9, -C(0)-0-aril-R8, -SH, -S-(Ci-4)alquil-R10, -S02-(C1-4)alquil-R9, -S02-aril-R8, -S02-NH2, -S02-NH(Ci-4alquil-R9), -S02-N(Ci- alquil-R9)2, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquil-R8, -heterociclil-R8, -aril-R8 y -heteroaril-R8.
En una modalidad, R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-4alquil-R10, -C2-4alquenil-R10, -C2-4alquinil-R10, -Ci-4alcoxi-R10, -C(0)H, -C02H, -NH2, -NH(Ci-4alquilo), -N(Ci- alquilo)2, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquilo, -heterociclilo, -arilo y -heteroarilo.
En una modalidad, R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, C1- alquil-R10, C1- alcoxi-R10, -NH2, -NH(C1-4alquilo), -N(C·,-4alquilo)2, halógeno e hidroxi.
En una modalidad, R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, Ci-4alquil-R10, Ci-4alcoxi-R10, -NH2, -NH(C1-4alquilo), -N(Ci. 4alquilo)2, cloro, flúor e hidroxi.
Modalidades de la presente invención incluyen compuestos de Fórmula (II), en donde R10 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -NH2, -NH(Ci. 4alquilo), -N(Ci- alquilo)2, ciano, (halo)i-3, hidroxi, nitro y oxo.
En una modalidad, R10 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y (halo)i-3.
En una modalidad, R10 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y (flúor)3.
Modalidades de la presente invención incluyen compuestos de Fórmula (II), en donde Y y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste en O, S, (H,OH) y (H, H); con la condición de que uno de Y y Z es O y el otro se selecciona del grupo que consiste en O, S, (H,OH) y (H,H).
En una modalidad, Y y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste en O y (H,H); con la condición de que uno de Y y Z es O, y el otro se selecciona del grupo que consiste en O y (H,H).
En una modalidad, Y y Z se seleccionan independientemente de O.
Compuestos de Fórmula (II) se describen en la patente de los Estados Unidos cedida en forma mancomunada núm. 7,125,878, cuya descripción completa se incorpora en la presente como referencia.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de Fórmula (II), en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en los compuestos enumerados en la Tabla B, más abajo: Tabla B Tabla B (Continuación) Un ejemplo de la Invención incluye un compuesto de Fórmula (II) en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en: Compuesto B-11 Compuesto B-26 Compuesto B-40 Compuesto B-41 Compuesto B-42 Compuesto B-43 Compuesto B-44 En una modalidad, el inhibidor de la actividad de la enzima GSK- 3B es un compuesto de la Fórmula (III): Formula (III) caracterizado porque A y E se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un átomo de carbono sustituido con hidrógeno y un átomo de nitrógeno; en donde se selecciona independientemente del grupo que consiste en 1H- indol, 1/-/-pirrol[2,3-ó]piridina, 1/-/-pirazol[3,4-í)]piridina y 1H-indazol; Z se selecciona de O; alternativamente, Z se selecciona de dihidro; en donde cada átomo de hidrógeno está unido por un simple enlace; R4 y R5 se seleccionan independientemente de C^salquilo, C2- 8alquenilo y C2-8alquinilo opcionalmente sustituido con oxo; R2 se selecciona del grupo que consiste en -C-i-8alquil-, -C2- 8alquenil-, -C2-8alquinil-, -O-(C-i-8)alquil-0-, -0-(C2-8)alquenil-0-, -0-(C2-8)alquinil-0-, -C(O)-(Ci-8)alquil-C(O)- (en donde cualquiera de los grupos de unión alquilo, alquenilo y alquinilo anteriores son cadenas de carbono lineales opcionalmente sustituidas con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en C1-8alquilo, Ci-8alcoxi, C-i-salcox Ci. 8)alquilo, carboxilo, carboxil(Ci-8)alquilo, -C(0)0-(Ci-8)alquilo, -C-\. 8alquil-C(0)0-(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci_4alquilo), amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C-i-4alquilo), halógeno, (halo)i-3(Ci-8)alquilo, (halo)i-3(Ci-8)alcox¡, hidroxi, hidroxi(Ci-8)alquilo y oxo; y, en donde cualquiera de los grupos de unión alquilo, alquenilo y alquinilo anteriores se sustituyen opcionalmente con uno a dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en heterocielilo, arilo, heteroarilo, heterociclil(C1-8)alquilo, aril(Ci. 8)alquilo, heteroaril(Ci-8)alquilo, espirocicloalquilo y espiroheterociclilo (en donde cualquiera de los sustituyentes cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo anteriores se sustituyen opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en C-,. 8alquilo, C1-8alcoxi, Ci-8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxil(Ci. s)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C-i. 4alquilo), amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alquilo), halógeno, (halo)i-3(Ci. e)alquilo, (halo)i-3(C-i-8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(C1-8)alquilo¡ y, en donde cualquiera de los sustituyentes heterocielilo anteriores se sustituyen opcionalmente con oxo)), cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo (en donde cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo se sustituyen opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en C1-8alquilo, Ci-8alcox¡, Ci-8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxil(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci_4alquilo), amino(Ci-8alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C-i. alquilo), halógeno, (halo)i.3(C1-8)alquilo, (halo)1-3(C1-8)alcox¡, hidroxi e hidroxi(C1-8)alquilo; y, en donde el heterociclilo se sustituye opcionalmente con oxo), -(0-(CH2)1-6)o-5-O-, -0-(CH2)i-6-0-(CH2)I-6-0-, -0-(CH2)1-6-0-(CH2)1-6-0-(CH2)1-6-0-, -(0-(CH2)I. 6)O-5-NR6-, -O-(CH2)I-6-NR6-(CH2)1-6-0-, -0-(CH2)I-6-0-(CH2)I-6-NR6-, -(0-(CH2)1-6)O-5-S-, -0-(CH2)I-6-S-(CH2)1-6-0-, -0-(CH2)1-6-0-(CH2)1-6-S-, -NR6-, -NR6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NR7-(CH2)1-6-NR8-, -NR6-C(O)-, -C(O)-NR6-, -C(0)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-, -NR6-(CH2)O-6-C(0)-(CH2)1-6-C(0)- (CH2)O-6-NR7-, -NR6-C(0)-NR7-, -NR6-C(NR7)-NRS-, -0-(CH2)I-6-NR6-(CH2)1-6-S-, -S-(CH2)I-6-NR6-(CH2)1-6-0-, -S-(CH2)1-6-NR6- (CH2)1-6-S-, -NR6-(CH2)1-6-S-(CH2) -6-NR7- y -S02- (en donde R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, C-i-8alquilo, Ci-aalcox C^alquilo, carboxil(Ci.8)alquilo, amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alquilo), hidroxi(Ci_ 8)alquilo, heterocielil(Ci-8)alquilo, aril(C1-8)alquilo y heteroaril(Ci. 8)alquilo (en donde los sustituyentes heterociclilo, arilo y heteroarilo anteriores se sustituyen opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en Ci-8alquilo, Ci-8alcoxi, Ci-8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxil(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C- alquilo), amino(C1-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C-i. 4alquilo), halógeno, (halo)1-3(Ci-8)alquilo, (halo)i-3(C1-8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(C1-8)alqu¡lo; y, en donde el heterocielilo se sustituye opcionalmente con oxo))¡ con la condición de que, si A y E se seleccionan de un átomo de carbono sustituido con hidrógeno, entonces R2 se selecciona del grupo que consiste en -C2-8alquinil-, -O-(C1-8)alquil-0-, -0-(C2-8)alquenil-0-, -0-(C2- e)alquinil-0-, -C(O)-(Ci-8)alquil-C(O)- (en donde cualquiera de los grupos de unión alquilo, alquenilo y alquinilo anteriores son cadenas de carbono lineales sustituidas opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en Ci-8alquilo, Ci-8alcoxi, Ci-8alcoxi(Ci_ 8)alquilo, carboxilo, carboxil(Ci-8)alquilo, -C(0)0-(C1-8)alquilo, -C-i. 8alquil-C(0)0-(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alquilo), amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C-i. 4alquilo), halógeno, (halo)i-3(Ci-8)alquilo, (halo)-i-3(Ci-8)alcox¡, hidroxi, hidroxi(Ci-8)alquilo y oxo; y, en donde cualquiera de los grupos de unión alquilo, alquenilo y alquinilo anteriores se sustituyen opcionalmente con uno a dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en heterociclilo, arilo, heteroarilo, heterociclil(Ci-8)alquilo, aril^. 8)alquilo, heteroar¡l(Ci-8)alquilo, espirocicloalquilo y espiroheterociclilo (en donde cualquiera de los sustituyeles cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo anteriores se sustituyen opcionalmente con uno a cuatro sustituyeles seleccionados independientemente del grupo que consiste en C-i. 8alquilo, C1-8alcoxi, Ci-8alcoxi(C -8)alquilo, carboxilo, carboxi C!. 8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C-i. 4alquilo), amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alquilo), halógeno, (halo)i-3(C·)-8)alquilo, (halo)1-3(Ci-8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(Ci-8)alquilo; y, en donde cualquiera de los sustituyentes heterociclilo anteriores se sustituyen opcionalmente con oxo)), cicloalquilo (en donde el cicloalquilo se sustituye opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en C -8alqu¡lo, C-i-8alcox¡, Ci-8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxil(C-i-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alquilo), amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C-i. alquilo), halógeno, (halo)1-3(C1-8)alquilo, (halo)1-3(C -8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(Ci-8)alquilo), -(0-(CH2)I-6)I-5-O-, -0-(CH2)I-6-0-(CH2)i-6-0-, -0-(CH2)I-6-0-(CH2)I-6-0-(CH2)I-6-0- -(0-(CH2)I-6)I-5-NR6-, -0-(CH2h-Q- e-(CH2h6-0-, -0-(CH2)1-6-0-(CH2)1-6-NR6-, -(0-(CH2)1-6)O-5-S-, -0-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-0-, -0-(CH2)I-6-0-(CH2)1-6-S-, -NR6-NR7-, -NR6-(CH2)1-6-NRr -NR6-(CH2)1-6-NR7- (CH2)i-6-NR8- -NR9-C(O)-, -C(O)-NR9-, -C(0)-(CH2)O-6-NR6- (CH2)O-6-C(0)-, -NR6-(CH2)O-6-C(0)-(CH2)1-6-C(0)-(CH2)O-6-NR7-, -NR6-C(0)-NR7-, -NR6-C(NR7)-NR8-, -0-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-0-, -S-(CH2)I-6-NR6-(CH2)I-6-S- y -NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)I-6-NR7- (en donde R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, C-i. 8alquilo, Ci-8alcoxi(C1-8)alquilo, carboxil(Ci-8)alquilo, amino(Ci. 8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alquilo), hidroxi(C -8)alquilo, heterocielil(Ci. 8)alquilo, aril(Ci-8)alquilo y heteroaril(C1-8)alquilo (en donde los sustituyentes heterociclilo, arilo y heteroarilo anteriores se sustituyen opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en C-i. 8alquilo, Ci-8alcox¡, Ci-8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxil(C-|. 8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C-|. 4alquilo), amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci.4alquilo), halógeno, (halo)i-3(Ci. s)alquilo, (halo)i-3(C1-8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(C1-8)alquilo; y, en donde el heterocielilo se sustituye opcionalmente con oxo); y, en donde Rg se selecciona del grupo que consiste en C1-8alquilo, C-i. 8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxil(Ci-8)alquilo, amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C-i. 4alquilo), hidroxi(C1-8)alquilo, heterociclil(C1-8)alquilo, aril(Ci. 8)alquilo y heteroaril(Ci-8)alquilo (en donde los sustituyentes heterociclilo, arilo y heteroarilo anteriores se sustituyen opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en Ci-8alquilo, C-u 8alcoxi, Ci-8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxil(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C-i_ alquilo), am¡no(C-i-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alquilo), halógeno, (halo)i-3(Ci. 8)alquilo, (halo)i-3(Ci-8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(C1-8)alquilo; y, en donde el heterociclilo se sustituye opcionalmente con oxo)); y, Ri y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, Ci-8alquilo, C2-8alquenilo, C2-8alquinilo (en donde el alquilo, alquenllo y alquinilo se sustituyen opclonalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en C1-8alcoxi, alcoxi(C1-8)alquilo, carboxilo, carboxil(Ci. 8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci. 4alquilo), amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alquilo), (halo)i-3, (halo)i-3(Ci. 8)alquilo, (halo)1-3(Ci-8)alcoxi, hidroxi, hidroxi(Ci-8)alquilo y oxo), Ci-8alcoxi, Ci-8alcoxicarbonilo, (halo)i-3(Ci-8)alcoxi, Ci-8alquiltio, arilo, heteroarilo (en donde el arilo y el heteroarilo se sustituyen opcionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en C1-8alquilo, Ci-8alcoxi, alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxil(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C1-4alquilo), amino(C1-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C-i. 4alquilo), halógeno, (halo)1-3(C1-8)alquilo, (halo)i-3(Ci-8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(Ci-8)alquilo), amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C-i-4alquilo), ciano, halógeno, hidroxi y nitro; y sales farmaceuticamente aceptables de estos.
En una modalidad, un compuesto de Fórmula (III) es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: Fórmula (lile) Fórmula (llld) Fórmula (lile) Fórmula (lllf) Formula (lili) Fórmula (lili) Fórmula (lllm) Fórmula (llln) en donde todas las demás variables son como se definen anteriormente; y, sales farmacéuticamente aceptables de estos.
En una modalidad, un compuesto de Fórmula (III) es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: Formula (lllf) Formula (lili) Fórmula (lllj) en donde todas las demás variables son como se definen anteriormente; y, sales farmacéuticamente aceptables de estos.
Compuestos de Fórmula (III) se describen en la patente de los Estados Unidos cedida en forma mancomunada núm. 6,828,327, cuya descripción completa se incorpora en la presente como referencia.
Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de Fórmula (III) en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en los compuestos enumerados en la Tabla C, más abajo: Tabla C Compuestos de Fórmula (III) TABLA C - (CONTINUACION) TABLA C - (CONTINUACION) Un ejemplo de la invención incluye un compuesto de Fórmula (III) en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en: .
Compuesto C-1 Compuesto C-2 Compuesto C-5 Compuesto C-6 Otros ejemplos de la invención incluyen un compuesto seleccionado del grupo que consiste en los compuestos enumerados en la Tabla D, más abajo: Tabla D Compuestos adicionales TABLA D (CONTINUACION) TABLA D (CONTINUACIÓN) Otros ejemplos de la invención incluyen un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: .
Compuesto D-1a Compuesto D-2a Compuesto D-3a .
Compuesto D-4a Compuesto D-5a Compuesto D-6a - Compuesto D-7a Compuesto D-8a Compuesto D-9a Compuesto D-1 Oa Compuesto D-11a Compuesto D-12a Compuesto D-13a Compuesto D-14a Compuesto D-15a Compuesto D-16a Compuesto D-17a Compuesto D-18a .
Compuesto D-19a Compuesto D-20a Compuesto D-21a .
Compuesto D-22a Compuesto D-23a Compuesto D-24a Compuesto D-25a Compuesto D-26a Compuesto D-27a .
Compuesto D-28a Compuesto D-29a Compuesto D-30a - Compuesto D-31a Compuesto D-32a Celulas adecuadas para el tratamiento de acuerdo con los métodos de la presente invención Las células pluripotentes, adecuadas para su uso en la presente invención expresan al menos uno de los siguientes marcadores de pluripotencia seleccionados del grupo que consiste en: ABCG2, cripto, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, y Tra1-81.
En una modalidad las células pluripotentes son células madre embrionarias. En una modalidad alternativa, las células pluripotentes son células que expresan marcadores de pluripotencia, derivadas de células madre embrionarias. En una modalidad, las células madre embrionarias son humanas. Aislamiento, expansión v cultivo de células madre embrionarias humanas Caracterización de células madre embrionarias humanas : Las células madre embrionarias humanas pueden expresar uno o más de los antígenos embrionarios 3 y 4 específicos de etapa (SSEA), y marcadores detectables mediante el uso de anticuerpos designados Tra-1-60 y Tra-1-81 (Thomson y otros, Science 282:1145, 1998). La diferenciación in vitro de células madre embrionarias humanas resulta en la pérdida de la expresión de SSEA-4, Tra- 1-60, y Tra-1-81 (si están presentes) y la expresión incrementada de SSEA-1. Las células madre embrionarias humanas no diferenciadas tienen, típicamente, actividad fosfatase alcalina, la cual puede detectarse al fijar las células con paraformaldehído al 4 %, y después desarrollarlas con Vector Red como sustrato, tal como lo describe el fabricante (Vector Laboratories, Burlingame Calif.) Las celulas madre pluripotentes no diferenciadas también expresan típicamente Oct-4 y TERT, según se detectó por RT-PCR.
Otro fenotipo deseable de células madre embrionarias humanas propagadas es un potencial para diferenciarse en células de las tres capas germinales: tejidos de endodermo, mesodermo y ectodermo. La pluripotencia de las células madre embrionarias humanas puede confirmarse, por ejemplo, al inyectar células en ratones SCID, fijar los teratomas que se forman mediante el uso de paraformaldehído al 4 %, y después examinarlos histológicamente en busca de evidencia de los tipos de células provenientes de las tres capas germinales. Alternativamente, la pluripotencia se puede determinar por la creación de cuerpos embrioides y el análisis los cuerpos embrioides para la presencia de marcadores asociados con las tres capas germinales.
Las líneas de células madre embrionarias humanas propagadas pueden cariotiparse mediante el uso de una téenica estándar de bandas G y la comparación con los cariotipos publicados de las especies de primates correspondientes. Es deseable la obtención de células que tengan un “cariotipo normal”, lo que significa que las células son euploides, en donde todos los cromosomas humanos están presentes y no alterados notablemente.
Fuentes de células madre embrionarias humanas: Los tipos de células madre embrionarias humanas que pueden usarse incluyen las líneas establecidas de células embrionarias humanas derivadas del tejido formado después de la gestación, que incluye tejido preembrionario (tal como, por ejemplo, un blastocisto), tejido embrionario, o tejido fetal tomado en cualquier momento durante la gestación, típicamente, pero no necesariamente antes de aproximadamente 10-12 semanas de gestación. Ejemplos no limitantes son las líneas de células madre embrionarias humanas establecidas o células de germen embrionario humano, tales como, por ejemplo, las líneas de células madre embrionarias humanas H1, H7 y H9 (WiCell). Además, se contempla el uso de las composiciones de esta descripción durante el establecimiento inicial o la estabilización de estas células, en cuyo caso la fuente primaria de las células serían las células pluripotentes primarias tomadas directamente a partir de los tejidos fuente. Además, son adecuadas las células tomadas de una población de células madre pluripotentes ya cultivadas, en ausencia de células del alimentador. Además, son adecuadas las líneas de células madre embrionarias humanas mutantes, tales como, por ejemplo, BG01v (BresaGen, Atens, GA).
En una modalidad las células madre embrionarias humanas se preparan como lo describen Thomson y otros (patente de Estados Unidos núm. 5,843,780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff. , 1998; Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).
Cultivo de células madre embrionarias humanas: En una modalidad, las células madre embrionarias humanas se cultivan en un sistema de cultivo que está esencialmente libre de células alimentadoras pero, sin embargo, soporta la proliferación de células madre embrionarias humanas, sin sufrir diferenciación sustancial. El crecimiento de células madre embrionarias humanas en un cultivo libre de alimentador, sin diferenciación, se soporta con el uso de un medio condicionado mediante el cultivo previo de otro tipo de célula. Alternativamente, el crecimiento de células madre embrionarias humanas en un cultivo libre de alimentador, sin diferenciación, se soporta mediante el uso de un medio definido químicamente.
En una modalidad alternativa, las células madre embrionarias humanas se cultivan inicialmente en capa de células alimentadoras que soportan las células madre embrionarias humanas de varias maneras. Las células embrionarias humanas se transfieren después a un sistema de cultivo que está esencialmente libre de células alimentadoras pero, sin embargo, soporta la proliferación de células madre embrionarias humanas, sin sufrir diferenciación sustancial.
Ejemplos de medios condicionados adecuados para su uso en la presente invención se describen en las patentes núm. US20020072117, US6642048, W02005014799, y Xu y otros (Stem Cells 22: 72-980, 2004).
Un ejemplo de un medio químicamente definido adecuado para su uso en la presente invención puede encontrarse en la patente núm. US20070010011.
Un medio de cultivo adecuado se puede hacer a partir de los siguientes componentes, tales como, por ejemplo, medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), Gibco núm. 11965-092; medio Eagle modificado de Dulbecco Knockout (KO DMEM), Gibco núm. 10829-018; medio F12 de Ham/medio basal DMEM al 50 %; 200 mM L-glutamina, Gibco núm. 15039-027; solución de aminoácidos no esenciales, Gibco 11140-050; b- mercaptoetanol, Sigma núm. M7522; factor de crecimiento de fibroblasto básico humano recombinante (bFGF), Gibco núm. 13256-029. Én una modalidad, las células madre embrionarias humanas se siembran sobre un sustrato de cultivo adecuado que se trata antes del tratamiento de acuerdo con los métodos de la presente invención. En una modalidad, el tratamiento es un componente de la matriz extracelular, tal como, por ejemplo, los derivados de membrana basal o los que pueden formar parte de los acoplamientos receptor-ligando de las moléculas de adhesión. En una modalidad, el sustrato de cultivo adecuado es MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® es una preparación soluble de células tumorales de Engelbret-Holm-Swarm que forman un gel a temperatura ambiente para formar una membrana de base reconstituida.
Otros componentes de la matriz extracelular y mezclas de componentes son adecuados como alternativa. Estos puede incluir laminina, fibronectina, proteoglicano, entactina, sulfato de heparano, y similares, solos o en combinaciones diversas.
Las células madre embrionarias humanas se siembran sobre el sustrato en una distribución adecuada y en presencia de un medio que promueva la supervivencia y propagación celular así como la retención de las características deseables. Todas estas características se benefician de la atención prestada en la distribución de sembrado y se puede determinar rápidamente mediante alguien con conocimiento en la materia.
Aislamiento, expansión v cultivo de celulas que expresan marcadores de pluripotencia, que se derivan de células madre embrionarias humanas En una modalidad, las células que expresan marcadores de pluripotencia se derivan de células madre embrionarias humanas mediante un método que comprende las etapas de: a. cultivar células madre embrionarias humanas, b. diferenciar las células madre embrionarias humanas en células que expresan marcadores característicos de las células del endodermo definitivo, y c. extraer las células, y posteriormente cultivarlas en condiciones de hipoxia, sobre un sustrato de cultivo de tejidos que no está pre-tratado con una proteína o una matriz extracelular antes de cultivar las células.
En una modalidad, las células que expresan marcadores de pluripotencia se derivan de células madre embrionarias humanas mediante un método que comprende las etapas de: a. cultivar células madre embrionarias humanas, y b. extraer las células, y posteriormente cultivarlas en condiciones de hipoxia, sobre un sustrato de cultivo de tejidos que no está pre-tratado con una proteína o una matriz extracelular.
Cultivo de celulas bajo condiciones hipóxicas sobre un sustrato de cultivo de tejidos que no está tratado previamente con una proteina o una matriz extracelular En una modalidad, las células se cultivan bajo condiciones hipóxicas, sobre un sustrato de cultivo de tejidos que no está recubierto con una matriz extracelular, durante aproximadamente 1 a aproximadamente 20 días. En una modalidad alternativa, las células se cultivan bajo condiciones hipóxicas, sobre un sustrato de cultivo de tejidos que no está recubierto con una matriz extracelular, durante aproximadamente 5 a aproximadamente 20 días. En una modalidad alternativa, las células se cultivan bajo condiciones hipóxicas, sobre un sustrato de cultivo de tejidos que no está recubierto con una matriz extracelular, durante aproximadamente 15 días.
En una modalidad, la condición hipóxica es de aproximadamente 1 % de O2 a aproximadamente 20 % de 02. En una modalidad alternativa, la condición hipóxica es de aproximadamente 2 % de 02 a aproximadamente 10 % de 02. En una modalidad alternativa, la condición hipóxica es de aproximadamente 3 % de 02.
Las células pueden cultivarse, bajo condiciones hipóxicas sobre un sustrato de cultivo de tejidos que no se trata previamente con una proteína o una matriz extracelular, en medio que contiene suero, activina A, y un ligando Wnt. Alternativamente, el medio puede contener, además, IGF-1.
El medio de cultivo puede tener una concentración de suero en el intervalo de aproximadamente 2 % a aproximadamente 5 %. En una modalidad alternativa, la concentración de suero puede ser de aproximadamente 2 %.
La activina A podría usarse a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 pg/ml. En una modalidad alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 1 pg/ml. En una modalidad alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 100 ng/ml. En una modalidad alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml. En otra modalidad alternativa, la concentración puede ser de aproximadamente 100 ng/ml.
El ligando Wnt se puede seleccionar del grupo que consiste en Wnt-1 , Wnt-3a, Wnt-5a y Wnt-7a. En una modalidad el ligando Wnt es Wnt-1. En una modalidad alterna, el ligando Wnt es Wnt-3a.
El ligando Wnt puede estar en una concentración de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 1000 ng/ml. En una modalidad alterna, el ligando Wnt podría usarse a una concentración de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml. En una modalidad la concentración del ligando Wnt es aproximadamente 20 ng/ml.
El IGF-1 puede usarse a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml. En una modalidad alternativa, el IGF-1 puede usarse a una concentración de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml. En una modalidad, la concentración de IGF-1 es de aproximadamente 50 ng/ml.
Las células que expresan marcadores de pluripotencia, derivadas por los métodos de la presente invención son capaces de expandirse en cultivo bajo condiciones hipóxicas, sobre un sustrato de cultivo de tejidos que no está tratado previamente con una proteína o una matriz extracelular.
Las células que expresan marcadores de pluripotencia, derivadas por los métodos de la presente invención expresan al menos uno de los siguientes marcadores de pluripotencia seleccionados del grupo que consiste en: ABCG2, cripto, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, y Tra1-81. Diferenciación adicional de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático mediante cualquier método conocido en la materia.
Por ejemplo, las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se pueden diferenciar en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático de acuerdo con los métodos descritos en D’Amour y otros, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático, al tratar las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo con un factor de crecimiento de fibroblastos y KAAD-ciclopamina, eliminar después el medio que contiene el factor de crecimiento de fibroblastos y la KAAD-ciclopamina y, posteriormente, cultivar las células en un medio que contiene ácido retinoico, un factor de crecimiento de fibroblastos y la KAAD-ciclopamina. Un ejemplo de este método se describe en D’ Amour y otros, Nature Biotechnology, 24: 1392-1401 , (2006).
Los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se seleccionan del grupo que consiste en Pdx1 , HNF-1beta, PTF1a, HNF-6, HB9 y PROX1. Para el uso en la presente invención es apropiada una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático es una célula del endodermo pancreático. Diferenciación adicional de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático mediante cualquier método conocido en la materia.
Por ejemplo, las celulas que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se pueden diferenciar en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático de acuerdo con los métodos descritos en D’Amour y otros , Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se seleccionan del grupo consistente de NGN-3, NeuroD, lslet-1, Pdx-1. NKX6.1, Pax-4, NGN-3, y PTF-1 alfa. En una modalidad una célula endocrina pancreática tiene la capacidad de expresar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático. Para el uso de la invención es adecuada una célula que expresa al menos uno de los marcadores características del linaje endocrino pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático es una célula endocrina pancreática. La célula endocrina pancreática puede ser una célula que expresa la hormona pancreática. Alternativamente, la célula endocrina pancreática puede ser una célula que secreta hormona pancreática.
En un aspecto de la presente invención la célula endocrina pancreática es una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células b. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células b expresa PDX1 y por lo menos uno de los factores de transcripción siguientes: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, isl-1, HNF-3 beta, MAFA, Pax4, y Pax6. En un aspecto de la presente invención una celula que expresa marcadores característicos del linaje de células b es una célula b.
La detección de las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo La formación de las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se puede determinar evaluando la presencia de los marcadores antes y después de seguir un protocolo específico. Las células madre pluripotentes generalmente no expresan tales marcadores. Por lo tanto, la diferenciación de las células pluripotentes se detecta cuando las células comienzan a expresarlos.
La eficiencia de la diferenciación se puede determinar exponiendo una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico expreso mediante células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.
Los métodos para evaluar la expresión de los marcadores de ácido proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estándares en la materia. Estos incluyen reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR), membrana de Nortern, hibridación in situ (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros, eds. 2001 supplement)) e inmunoensayos, tales como análisis inmunohistoquímico de material seccionado, Transferencia (de tipo) Western y para marcadores que son accesibles en células intactas, análisis de citometría de flujo (FACS) (ver, por ejemplo, Harlow and Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Coid Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
En la Tabla IA y la Tabla IB se enumeran ejemplos de anticuerpos útiles para detectar ciertos marcadores de proteínas. Debe señalarse que anticuerpos alternativos dirigidos a los mismos marcadores que son reconocidos por los anticuerpos enumerados en la Tabla IA y la Tabla IB están disponibles, o pueden desarrollarse fácilmente. Tales anticuerpos alternativos además se pueden emplear para evaluar la expresión de los marcadores en las células aisladas de acuerdo con la presente invención.
Por ejemplo, las características de las células madre pluripotentes son famosas para aquellos con experiencia en la materia, y las características adicionales de las células madre pluripotentes continúan para ser identificadas. Los marcadores de células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, la expresión de uno o más de los siguientes: ABCG2, cripto, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.
Después de tratar las células madre pluripotentes con los métodos de la presente invención, las células diferenciadas se pueden purificar mediante la exposición de una población de células tratadas en un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico, tal como CXCR4, expresado por células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.
Detección de celulas que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático Los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático son famosos para aquellos con experiencia en la materia, y los marcadores característicos adicionales del linaje del endodermo pancreático continúan para ser identificadas. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que las células tratadas de acuerdo con la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje del endodermo pancreático. Los marcadores específicos del linaje del endodermo pancreático incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción tales como, por ejemplo, Hlxb9, PTF-1a, PDX-1, HNF-6, HNF-1beta.
La eficiencia de la diferenciación se puede determinar exponiendo una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico expresado por las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático.
Los métodos para evaluar la expresión de los marcadores de ácido proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estándares en la materia. Estos incluyen reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR), membrana de Nortern, hibridación in situ (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros , eds. 2001 supplement)) e inmunoensayos, tales como análisis inmunohistoquímico de material seccionado, Transferencia (de tipo) Western y para marcadores que son accesibles en células intactas, análisis de citometría de flujo (FACS) (ver, por ejemplo, Harlow and Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Coid Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
En la Tabla IA y la Tabla IB se enumeran ejemplos de anticuerpos útiles para detectar ciertos marcadores de proteínas. Debe señalarse que anticuerpos alternativos dirigidos a los mismos marcadores que son reconocidos por los anticuerpos enumerados en la Tabla IA y la Tabla IB están disponibles, o pueden desarrollarse fácilmente. Tales anticuerpos alternativos además se pueden emplear para evaluar la expresión de los marcadores en las células aisladas de acuerdo con la presente invención. Detección de células que expresan los marcadores característicos del linaje pancreático endocrino Los marcadores característicos del linaje pancreático endocrino son famosos para aquellos con experiencia en la materia, y los marcadores adicionales característicos del linaje pancreático endocrino continúan siendo identificados. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que las células tratadas de acuerdo con la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje pancreático endocrino. Los marcadores específicos del linaje pancreático endocrino incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción tales como, por ejemplo, NGN-3, NeuroD, lslet-1.
Los marcadores característicos de las células del b linaje de células son famosos para aquellos con experiencia en la materia, y los marcadores adicionales característicos del b linaje de células continúan siendo identificados. Estos marcadores pueden usarse para confirmar que las células tratadas de acuerdo con la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje de células b. Las características específicas del linaje de células b incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción tales como, por ejemplo, Pdx1 (gen de homeosecuencia pancreática y duodenal-1), Nkx2.2, Nkx6.1 , Isl1 , Pax6, Pax4, NeuroD, Hnflb, Hnf-6, Hnf-3beta, y MafA, entre otros. Estos factores de transcripción se establecen bien en la materia para la identificación de las células endocrinas. Ver, por ejemplo, Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002)).
La eficiencia de la diferenciación se puede determinar mediante la exposición de una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente a un marcador proteico expresado por células que expresan los marcadores característicos del linaje pancreático endocrino. Alternativamente, la eficiencia de la diferenciación se puede determinar mediante la exposición de una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente a un marcador proteico expresado por células que expresan los marcadores característicos del linaje b de las células.
Los métodos para evaluar la expresión de los marcadores de ácido proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estándares en la materia. Estos incluyen reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR), membrana de Nortern, hibridación in situ (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros, eds. 2001 supplement)) e inmunoensayos, tales como análisis inmunohistoquímico de material seccionado, Transferencia (de tipo) Western y para marcadores que son accesibles en células intactas, análisis de citometría de flujo (FACS) (ver, por ejemplo, Harlow and Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Coid Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
En la Tabla IA y la Tabla IB se enumeran ejemplos de anticuerpos útiles para detectar ciertos marcadores de proteínas. Debe señalarse que anticuerpos alternativos dirigidos a los mismos marcadores que son reconocidos por los anticuerpos enumerados en la Tabla IA y la Tabla IB están disponibles, o pueden desarrollarse fácilmente. Tales anticuerpos alternativos además se pueden emplear para evaluar la expresión de los marcadores en las células aisladas de acuerdo con la presente invención.
La presente invención se ilustra, pero no se limitada por los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1 Cultivo de células madre embrionarias humanas Las células madre son células indiferenciadas definidas por su capacidad a nivel de células únicas de autorrenovarse y diferenciarse para producir células progenitoras, que incluyen progenitoras que se autorrenuevan, progenitoras que no se renuevan y células diferenciadas de forma terminal. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de varios linajes celulares a partir de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como para dar lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante y contribuir sustancialmente a la mayoría, si no a todos, los tejidos después de la inyección dentro de los blastocistos.
Las líneas de células madre embrionarias humanas H1 , H7 y H9 se obtuvieron de WiCell Research Institute, Inc., (Madison, Wl) y se cultivaron de acuerdo con las instrucciones provistas por el instituto fuente. Brevemente, las células se cultivaron en células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) en medios celulares ES formados por DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO) complementado con 20 % suero de reemplazo, aminoácidos no esenciales MEM 100 nM MEM, 0.5 mM beta-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina con factor de crecimiento fibroblástico básico humano 4 ng/ml (bFGF) (todo de Invitrogen/GIBCO). Las células MEF derivadas de embriones de ratones E13 a 13.5, se compraron de Charles River. Las células MEF se expandieron en un medio DMEM complementado con 10 % FBS (Hyclone), 2 mM de glutamina y 100 mM MEM de aminoácidos no esenciales. Se trataron los cultivos de células subconfluentes con 10 mg/ml de mitomicina C (Sigma, St. Louis, MO) por 3 h para dificultar la división celular, después, se tripsinizaron y fijaron con placas a 2x104/cm2 en 0.1 % platos recubiertos con gelatina bovina. Las células MEF del pase dos al cuatro se usaron como capas alimentadoras. Las células madre embrionarias humanas colocadas en placas de cultivo sobre capas alimentadoras de células MEF a 37 °C en una atmósfera del 5 % CO2 / dentro de un incubador de cultivo de tejidos humidificado. Cuando fueron confluentes (aproximadamente de 5 a 7 días después de colocarlas en placas de cultivo), las células madre embrionarias humanas se trataron con colagenasa tipo IV 1 mg/ml (Invitrogen/GIBCO) durante 5 a 10 minutos y luego se raspó suavemente la superficie mediante el uso de una pipeta de 5 mi. Las células se separaron a 900 rpm durante 5 minutos, y el sedimento se resuspendió y colocó nuevamente en placas de cultivo en relación 1 :3 a 1 :4 de células en medios de cultivo fresco.
En paralelo, se sembraron, además, células madre embrionarias humanas H1 , H7, y H9 en placas recubiertas con una dilución de 1:30 de MATRIGEL™ con reducción del factor de crecimiento (BD Biosciences) y se cultivaron en medios condicionados con MEF complementados con 8 ng/ml de bFGF. A las células cultivadas en MATRIGEL™ se les realizaron los pases de manera rutinaria con enzima colagenasa IV (Invitrogen/GIBCO), Dispasa (BD Biosciences) o Liberasa (Fuente). Algunos de los cultivos de células madre embrionarias humanas se incubaron en condiciones de hipoxia (aproximadamente 3 % de O2).
Ejemplo 2 Derivación v cultivo de células que expresan marcadores de pluripotencia, derivadas de células madre embrionarias humanas Las células a partir de varios pases de las líneas de células madre embrionarias humanas H1 y H9 (Pases 30-54) se cultivaron en condiciones hipóxicas (aproximadamente 3 % de 02) durante al menos tres pases. Las células se cultivaron en MEF-CM complementado con 8 ng/ml de bFGF y se sembraron en placas recubiertas con MATRIGEL de acuerdo con el Ejemplo 1.
Despues las células se trataron con medio DMEM/F12 complementado con 0.5 % FBS, 20 ng/ml de WNT-3a (núm. de catálogo 1324-WN-002, R&D Systems, MN), y 100 ng/ml de Activina-A (R&D Systems, MN) durante dos días seguido por el tratamiento con medios DMEM/F12 complementado con 2 % FBS y 100 ng/ml de Activina-A (AA) durante 3 a 4 días adicionales. Este protocolo resultó en una regulación positiva significativa de los marcadores del endodermo definitivo.
Las células se trataron, después, con solución TrypLE™ Express (Invitrogen, CA) durante 5 minutos. Las células liberadas se resuspendieron en medio DMEM-F12 + 2 % FBS, se recuperaron mediante centrifugación, y se contaron con el uso de un hemocitómetro. Las células liberadas se sembraron a 1000-10,000 células/cm2 en matraces tratados con poliestireno para cultivo tisular (TCPS) y se cultivaron en DMEM-F12 + 2 % FBS + 100 ng/ml de activina-A + 20 ng/ml de WNT-3A en condiciones de hipoxia (aproximadamente 3 % de 02) a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos estándar. Los matraces TCPS no se recubrieron con MATRIGEL u otras proteínas de la matriz extracelular. El medio se cambió diariamente. En algunos cultivos, los medios se complementaron, además, con 10-50 ng/ml de IGF-I (factor de crecimiento similar a la insulina-l de R&D Systems, MN) o 1X ITS (insulina, transferrina y selenio de Invitrogen, CA). En algunas de las condiciones de cultivo los medios básales (DM-F12 + 2 % FBS) se complementaron además con 0.1 mM de mercaptoetanol (Invitrogen, CA) y aminoácidos no esenciales (1X, NEAA de Invitrogen, CA).
Después de 5 a 15 días de cultivo, aparecieron distintas colonias de células rodeadas de un gran número de células alargadas que parecían estar en senescencia. A aproximadamente 50 a 60 % de confluencia, se realizó el pase de los cultivos mediante exposición a solución TrypLE™ Express durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las células liberadas se resuspendieron en medio DMEM-F12 + 2 % FBS, se recuperaron mediante centrifugación, y se sembraron a 10,000 células/cm2 en matraces tratados con poliestireno para cultivo tisular (TCPS) en DMEM-F12 + 2 % FBS + 100 ng/ml de activina-A + 20 ng/ml de WNT-3A +/-50 ng/ml de IGF-I. Estos medios se denominarán en adelante como “medios de cultivo”.
Ejemplo 3A Derivación de células que expresan marcadores de pluripotencia a partir de una suspensión de células individuales de células madre embrionarias humanas Las células a partir de las líneas de células madre embrionarias humanas H1 P33 y H9 P45 se cultivaron bajo condiciones hipóxicas (aproximadamente 3 % de 02) durante al menos tres pases. Las células se cultivaron en MEF-CM complementado con 8 ng/ml de bFGF y se sembraron en placas recubiertas con MATRIGEL de acuerdo con el Ejemplo 1. A aproximadamente 60 % de confluencia, los cultivos se expusieron a solución TrypLE™ Express (Invitrogen, CA) durante 5 minutos. Las células liberadas se resuspendieron en medio DMEM-F12 + 2 % FBS, se recuperaron mediante centrifugación, y se contaron con el uso de un hemocitómetro. Las células liberadas se sembraron a 1000 a 10,000 células/cm2 en matraces tratados con poliestireno para cultivo tisular (TCPS) y se cultivaron en DM-F12 + 2 % FBS + 100 ng/ml de activina-A + 20 ng/ml WNT-3A + 50 ng/ml de IGF-I + 0.1 mM de mercaptoetanol (Invitrogen, CA) y aminoácidos no esenciales (1X, NEAA de Invitrogen, CA) bajo condiciones de hipoxia (aproximadamente 3 % de 02) a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos estándar. Los matraces TCPS no se recubrieron con MATRIGEL u otras proteínas de la matriz extracelular. El medio se cambió diariamente. Las células del primer pase se denominan P1.
Ejemplo 3B Varios medios de cultivo útiles para la expansión de células que expresan marcadores de pluripotencia, derivadas de células madre embrionarias humanas Las células que expresan marcadores de pluripotencia, derivadas de células madre embrionarias humanas se han cultivado con éxito en las siguientes composiciones de medios durante al menos 2-30 pases: 1. DM-F12 + 2 % FBS + 100 ng/ml de AA + 20 ng/ml de WNT-3A 2. DM-F12 + 2 % FBS + 100 ng/ml de AA + 20 ng/ml de WNT- 3A + 50 ng/ml de IGF-I 3. DM-F12 + 2 % FBS + 100 ng/ml de AA + 20 ng/ml de WNT- 3A + 10 ng/ml de IGF-I 4. DM-F12 + 2 % FBS + 50 ng/ml de AA + 20 ng/ml de WNT- 3A + 50 ng/ml de IGF-I 5. DM-F12 + 2 % FBS + 50 ng/ml de AA + 10 ng/ml de WNT- 3A + 50 ng/ml de IGF-I 6. DM-F12 + 2 % FBS + 50 ng/ml de AA + 20 ng/ml de WNT- 3A + 10 ng/ml de IGF-I 7. DM-F12 + 2 % FBS + 100 ng/ml de AA + 10 ng/ml de WNT- 3A + 10 ng/ml de IGF-I 8. Medios definidos FlEScGRO (Chemicon, CA) El componente basal de los medios mencionados anteriormente puede sustituirse con medios similares tales como, RPMI, DMEM, CRML, Knockout™DMEM y F12.
Ejemplo 4 Efectos de inhibidores de la actividad de la enzima GSK-36 sobre la viabilidad de celulas que expresan marcadores de pluripotencia La derivación y mantenimiento de células que expresan marcadores de pluripotencia se realizaron como se ha descrito en el Ejemplo 2. Las células se cultivaron en DMEM:F12 complementado con 2 % de FCS (Invitrogen), 100 ng/ml de Activina A, 20 ng/ml de Wnt-3a, y 50 ng/ml de IGF(R&D Biosystems). Las células se sembraron a una densidad de 10,000 células/cm2 en matraces de poliestireno Falcon y se cultivaron en cultivo en monocapa a 37 °C, 5 % de CO2, oxígeno bajo. Después de alcanzar 60-70 % de confluencia, se realizó el pase de las células al lavar la monocapa con PBS e incubar con TrypLE (Invitrogen) durante 3-5 minutos para permitir la separación y la dispersión de celulas individuales.
El análisis se llevó a cabo mediante el uso de compuestos de prueba de una biblioteca patentada de moléculas pequeñas seleccionadas por su capacidad de inhibir la actividad de la enzima GSK-3B. Los compuestos de esta biblioteca se prepararon como soluciones estándar de 1 mM, en un formato de placa de 96 pocilios en 50 mM de HEPES, 30 % de DMSO. Para el ensayo, las células que expresan marcadores de pluripotencia se lavaron, se contaron, y se sembraron en medio de cultivo normal a una densidad de siembra de 20,000 células por pocilio en placas de 96 pocilios oscuros, de fondo transparente (Costar). Esta densidad de siembra se determinó previamente para producir la formación óptima de una monocapa en un cultivo durante la noche. Al día siguiente, se retiró el medio de cultivo, las monocapas de células se lavaron tres veces con PBS, y los compuestos de prueba se añadieron a los pocilios en alícuotas de 80 mI, cada uno diluido en el medio de ensayo a una concentración final de ensayo de 10 mM. En el día 2 del ensayo, se retiró el medio de cada pocilio y se reemplazó con una alícuota fresca de los compuestos de prueba diluidos en medio de ensayo. El medio de ensayo en los días 1 y 2 de cultivo consistió en DMEM:F12 complementado con 0.5 % de FCS y 100 ng/ml de activina A. En los días 3 y 4 de cultivo, se retiró el medio de cada pocilio y se reemplazó con DMEM:F12 complementado con 2 % de FCS y 100 ng/ml de Activina A (sin compuesto de prueba). El día 4 del ensayo, se añadieron 15 ml de MTS (Promega) a cada pocilio y las placas se incubaron a 37 °C durante 1.5 a 4 horas antes de leer la densidad óptica a 490 nm en un instrumento SpectraMax (Molecular Devices). Las medidas estadísticas que consisten de media, desviación estándar y coeficiente de variación se calcularon para cada conjunto duplicado. La toxicidad se calculó para cada pocilio de prueba con relación a un control positivo (pocilios tratados con Activina A y Wnt3a en los días 1 y 2 del cultivo).
La Tabla II es una recopilación de todos los resultados del análisis. Las células que expresan marcadores de pluripotencia se sembraron inicialmente como una monocapa confluente en este ensayo; por lo tanto, los resultados son representativos de una medida de toxicidad durante el periodo de cultivo de cuatro días. Los resultados se expresan como porcentaje de viabilidad del control, y demuestran una toxicidad variable para algunos compuestos a la concentración de análisis usada de 10 mM. Una mayor proporción de los compuestos tienen una toxicidad medible mínima o nula en este ensayo basado en células.
Un pequeño panel de compuestos seleccionados se probaron en repetición en un intervalo estrecho de valoración de la dosis, de nuevo mediante el uso de células que expresan marcadores de pluripotencia en un ensayo similar al descrito anteriormente. La Tabla III es un resumen de estos resultados, que demuestran efectos variables de titulación de la dosis para un intervalo de compuestos tóxicos y no tóxicos.
Ejemplo 5 Efectos de inhibidores de la actividad de la enzima GSK-3B sobre la diferenciación y la proliferación de celulas madre embrionarias humanas determinadas mediante el uso de un ensayo de análisis de alto contenido El mantenimiento de las células madre embrionarias humanas (línea H9) se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1. Las colonias de células se mantuvieron en un estado indiferenciado, pluripotente con los pases en un promedio de cada cuatro días. El pase se llevó a cabo al exponer los cultivos celulares a una solución de colagenasa (1 mg/ml; Sigma-Aldrich.) durante 10 a 30 minutos a 37 °C seguido por raspado suave con una punta de pipeta para recuperar las agrupaciones de células. Las agrupaciones se dejaron sedimentar por gravedad, seguido de lavado para eliminar la colagenasa residual. Las agrupaciones de células se dividieron en una relación 1:3 para el cultivo de mantenimiento de rutina o en una relación 1:1 para el ensayo inmediato. Las líneas de células madre embrionarias humanas usadas se mantuvieron en números de pases menores del pase 50 y rutinariamente se evaluó el fenotipo cariotípico normal y la ausencia de contaminación por micoplasma.
Las agrupaciones de células usadas en el ensayo resuspendieron uniformemente en un medio de cultivo normal y se sembraron en placas VIEWPLATES Packard de 96 pocilios recubiertos con Matrigel (PerkinElmer) en volúmenes de 100 mI/pocillo. Se usó el medio condicionado MEF complementado con 8 ng/ml de bFGF para la siembra inicial y la recuperación. La alimentación diaria se llevó a cabo al aspirar el medio gastado del cultivo de cada pocilio y reemplazarlo con un volumen igual de medio nuevo. Las placas se mantuvieron a 37 °C, 5 % de CO2 en una cámara humidificada durante todo el tiempo del ensayo.
El análisis se llevó a cabo mediante el uso de compuestos de prueba de una biblioteca patentada de moléculas pequeñas seleccionadas por su capacidad para inhibir la actividad de la enzima GSK-3B. Los compuestos de esta biblioteca se prepararon como soluciones estándar de 1 mM, en un formato de placa de 96 pocilios en 50 mM de HEPES, 30 % DMSO. Los compuestos de análisis se probaron en conjuntos triplicados o duplicados. Los ensayos de análisis primario se iniciaron al aspirar medio de cultivo de cada pocilio seguido de tres lavados en PBS para eliminar factores de crecimiento y suero residuales. Los volúmenes de prueba de 80 a 100 pl por pocilio se añadieron de nuevo los cuales contenían medio base DMEM:F12 (Invitrogen) complementado con 0.5 % FCS (HyClone) y 100 ng/ml de activina A (R&D Biosystems) más 10 mM del compuesto de prueba. Los pocilios del control positivo contenían el mismo medio base, sustituyendo 0-20 ng/ml de Wnt3a (R&D Biosystems) por el compuesto de prueba. Los pocilios del control negativo contenían medio base con 0.5 % FCS y solo activina A (AA solamente) o alternativamente, 0.5 % FCS sin activina A o Wnt3a (sin tratamiento). Los pocilios se aspiraron y se alimentaron dé nuevo con soluciones idénticas en el día 2 del ensayo. En los días 3 y 4, todos los pocilios de ensayo se aspiraron y se llevaron a DMEM:F12 complementado con 2 % FCS y 100 ng/ml de activina A (sin compuesto de prueba o Wnt3a); los pocilios controles negativos en paralelo se mantuvieron en medio base DMEM:F12 con 2 % FCS y activina A (AA solamente) o alternativamente, 2 % FCS sin activina A (sin tratamiento).
Al final del cultivo, las células en las placas de 96 pocilios se fijaron con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante 20 minutos, se lavaron tres veces con PBS, y después se permeabilizaron con Tritón X-100 a 0.5 % durante 20 minutos a temperatura ambiente. Alternativamente, las células se fijaron con etanol al 70 % en hielo frío durante la noche a -20 °C, se lavaron tres veces con PBS, y después se permeabilizaron con Tritón X-100 durante 5 minutos a 4 °C. Después de la fijación y la permeabilización, las células se lavaron de nuevo tres veces con PBS y después se bloquearon con suero de pollo 4 % (Invitrogen) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios (anticuerpo de cabra anti-Sox17 humana y anticuerpo de cabra anti-FINF-3beta humana; R&D Systems) se diluyeron 1 :100 en suero de pollo 4 % y se añadieron a las células durante una hora a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 488 (anticuerpo de pollo anti-IgG de cabra; Molecular Probes) se diluyó 1 :200 en PBS y se añadió después de lavar las células tres veces con PBS. Para la tinción de contraste de los núcleos, se añadió Draq5 5 mM (Alexis Biochemicals) durante cinco minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez con PBS y se dejaron en 100 mi de PBS/pocillo para obtener las imágenes.
La obtención de las imágenes de las celulas se realizó mediante un analizador IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) mediante el uso de 51008bs dicroico para células teñidas con Draq5 y Alexa Fluor 488. Los tiempos de exposición se optimizaron mediante el uso de pocilios controles positivos y pocilios sólo con el secundario para los controles negativos no tratados. Se obtuvieron doce campos por pocilio para compensar cualquier pérdida de células durante los procedimientos de tratamiento y de tinción. El número total de células y la intensidad total de las células para Sox-17 y HNF-3beta se midieron mediante el uso del programa informático IN Cell Developer Toolbox 1.6 (GE Healthcare). La segmentación de los núcleos se determinó en base a los niveles de la escala de grises (intervalo de la línea base 100-300) y el tamaño nuclear. Los promedios y las desviaciones estándar se calcularon para las réplicas. La expresión total de las proteínas se informó como la intensidad total o intensidad integrada, definida como la fluorescencia total de la célula multiplicada por el área de la célula. El fondo se eliminó en base a criterios de aceptación de intervalos de la escala de grises entre 300 a 3000 y factores de forma mayores que o iguales a 0.4. Los datos de intensidad total se normalizaron al dividir las intensidades totales de cada pocilio entre la intensidad total promedio para el control positivo Wnt3a/Activina A. Los datos normalizados se calcularon para los promedios y la desviación estándar para cada conjunto de réplica.
La Tabla IV es un resumen representativo de todos los resultados de análisis. La Tabla V es una lista de éxitos de este análisis. Los éxitos fuertes se definen como mayores que o iguales a 120 % de los valores del control; los exitos moderados se definen como los que están dentro del intervalo de 60-120 % de los valores del control. Un número significativo de compuestos induce una respuesta proliferativa en este ensayo. En paralelo, un número significativo de compuestos induce diferenciación en este ensayo, tal como se mide por la expresión de proteínas de los factores de transcripción Sox17 y HNF-3b.
Ejemplo 6 Efectos de inhibidores de la actividad de la enzima GSK-3B sobre la proliferación de células madre embrionarias humanas determinada mediante el uso de un ensayo de lectura de placa El mantenimiento de células madre embrionarias humanas (líneas H9 o H1) se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1. Las colonias de células se mantuvieron en un estado indiferenciado, pluripotente con los pases en un promedio de cada cuatro días. El pase se llevó a cabo al exponer los cultivos celulares a una solución de colagenasa (1 mg/ml; Sigma-Aldrich) durante 10 a 30 minutos a 37 °C seguido por raspado suave con una punta de pipeta para recuperar las agrupaciones de células. Las agrupaciones se dejaron sedimentar y se lavaron para eliminar la colagenasa residual. Las agrupaciones de células se dividieron en una relación de 1 :3 del área de la monocapa para el cultivo de rutina o una relación de 1 :1 para el ensayo inmediato. Las líneas de células madre embrionarias humanas usadas para estos ejemplos se mantuvieron con números de pases de menos de 50 y de manera rutinaria se evaluaron para el fenotipo cariotípico normal así como la ausencia de contaminación por micoplasma.
Las agrupaciones de células usadas en el ensayo se resuspendieron uniformemente en un medio de cultivo normal y se sembraron en placas VIEWPLATES Packard de 96 pocilios recubiertos con Matrigel (PerkinElmer) en volúmenes de 100 mI/pocillo. Se usó el medio condicionado MEF complementado con 8 ng/ml de bFGF para la siembra inicial y la recuperación. La alimentación diaria se llevó a cabo al aspirar el medio gastado del cultivo de cada pocilio y reemplazándolo con un volumen igual de medio nuevo. Las placas se mantuvieron a 37 °C en una cámara humidificada, 5 % de CO2 durante todo el ensayo.
Los ensayos de análisis primario se iniciaron al aspirar medio de cultivo de cada pocilio seguido de tres lavados en PBS para eliminar factores de crecimiento y suero residuales. Los volúmenes de prueba de 80-100 ml por pocilio se añadieron de nuevo, los cuales contenían medio base DMEM:F12 (Invitrogen) complementado con 0.5 % FCS (HyClone) y 100 ng/ml de activina A (R&D Biosystems) y 10 mM del compuesto de prueba. Los pocilios del control positivo contenían el mismo medio al sustituir 10-20 ng/ml de Wnt3a (R&D Biosystems). Los pocilios del control negativo contenían medio base con 0.5 % FCS sin activina A o Wnt3a. Los compuestos del análisis se analizaron por triplicado. Los pocilios se aspiraron y se alimentaron de nuevo con soluciones idénticas en el día 2 del ensayo. En los días 3 y 4, todos los pocilios de ensayo se aspiraron y se convirtieron en DMEM:F12 complementado con de FCS al 2 % y 100 ng/ml de activina A con la excepción de los pocilios controles negativos que se mantuvieron en medio base DMEM:F12 con FCS al 2 % En el día 4 de ensayo, se añadieron 15-20 ml de MIS (Promega) a cada pocilio y las placas se incubaron a 37 °C durante 1.5 a 4 horas. Las lecturas densitométricas en OD490 se determinaron mediante el uso de un lector de placas espectrofotómetro Molecular Devices. Se calcularon los promedios de lecturas para conjuntos de réplicas junto con la desviación estándar y el coeficiente de variación. Los pocilios experimentales se compararon con el control positivo de Activina A/Wnt3a para calcular un porcentaje del valor control como medida de proliferación.
La Tabla VI es un resumen representativo de todos los resultados del análisis. La Tabla Vil es una lista de éxitos de este análisis. Los éxitos fuertes se definen como mayores que o iguales a 120 % de los valores del control; los éxitos moderados se definen como los que están dentro del intervalo de 60-120 % de los valores del control. Un número significativo de compuestos induce una respuesta proliferativa en este ensayo.
Ejemplo 7 Efectos de inhibidores de la enzima GSK-335 sobre la diferenciación y la proliferación de células madre embrionarias humanas: Valoración de la dosis de compuestos principales Fue importante confirmar la actividad de los éxitos identificados a partir del análisis primario y además analizar el intervalo de actividad mediante valoración de la dosis. Muestras nuevas de un subconjunto seleccionado de éxitos del análisis primario se obtuvieron como polvos secos, se solubilizaron para obtener reactivos de reserva frescos, y se diluyeron en ensayos de confirmación secundarios para evaluar los efectos sobre las células madre embrionarias humanas.
El cultivo de dos células madre embrionarias humanas (H1 y H9) se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1. Las colonias de células se mantuvieron en un estado pluripotente indiferenciado, en plástico de poliestireno recubierto con Matrigel™ (Invitrogen), mediante el uso de una dilución 1:30 de Matrigel™ en DMEM:F12 para recubrir la superficie. Las células se dividieron mediante pase enzimático cada cuatro días como promedio. El pase se llevó a cabo al exponer las monocapas de células a una solución de colagenasa (1 mg/ml; Sigma-Aldrich) durante 10 a 60 minutos a 37 °C seguido por raspado suave con una punta de pipeta para recuperar los agregados de células. Los agregados se dejaron sedimentar por gravedad, después se lavaron para eliminar la colagenasa residual. Los agregados de células se dividieron en una relación 1 :3 para el cultivo de mantenimiento o en una relación 1 :1 para el ensayo posterior. Las líneas de células madre embrionarias humanas se mantuvieron en menos del pase 50 y rutinariamente se evaluó su fenotipo cariotípico normal y la ausencia de contaminación por micoplasma.
Preparación de células para ensayo : Los agregados celulares de las líneas de células madre embrionarias humanas H1 o H9 usadas en el ensayo se resuspendieron de manera uniforme en medio de cultivo y se sembraron sobre placas VIEWPLATES Packard de 96 pocilios recubiertos con Matrigel™ (PerkinElmer) en volúmenes de 100 mI/pocillo. Se usó medio condicionado MEF complementado con 8 ng/ml de bFGF para la siembra inicial y la expansión. La alimentación diaria se llevó a cabo al aspirar el medio gastado del cultivo de cada pocilio y reemplazándolo con un volumen igual de medio nuevo. A los cultivos se les permitió expandirse de uno a tres días después de la siembra antes de iniciar el ensayo. Las placas se mantuvieron a 37 °C, 5 % de CO2 en una cámara humidificada durante la duración del ensayo.
Preparación de compuestos y medio de ensayo: Un subconjunto de éxitos resultantes del análisis primario se usó para el estudio de seguimiento y los ensayos secundarios posteriores. Veinte compuestos disponibles en forma de polvos secos se disolvieron en soluciones de reserva de 10 mM en DMSO y se almacenaron desecadas a -20 °C hasta su uso. Inmediatamente antes del ensayo, los compuestos de reserva se diluyeron 1:1000 para producir 10 pM del compuesto de prueba en medio base DMEM:F12 (Invitrogen) complementado con FCS 0.5 % (HyClone) y 100 ng/ml de Activina A (R&D Biosystems). Este se diluyó además dos veces en serie para producir una curva de dilución de siete puntos para cada compuesto, tambien en medio base DMEM:F12 con FCS 0.5 % y 100 ng/ml de Activina A.
Ensayo de análisis secundario: El ensayo se inició al aspirar el medio de cultivo de las monocapas de células en cada pocilio seguido de tres lavados en PBS para eliminar factores de crecimiento y suero residuales. Los volúmenes de prueba de 100 ml por pocilio se añadieron de nuevo, los cuales contenían medio con FCS 0.5 % y diferentes concentraciones de compuestos inhibidores con 100 ng/ml de Activina A, sin Wnt3a. Los pocilios controles positivos contenían el mismo medio base con FCS 0.5 % y con 20 ng/ml de Wnt3a (R&D Biosystems) en ausencia del compuesto de prueba. Los pocilios controles negativos contenían el mismo medio base con FCS 0.5 % en ausencia de Activina A, Wnt3a, o el compuesto de prueba. Los pocilios de ensayo se aspiraron y se alimentaron de nuevo con concentraciones idénticas del compuesto de prueba o soluciones controles en el día 2 del ensayo. En los días 3 y 4, todos los pocilios del ensayo se aspiraron y se alimentaron con DMEM:F12 complementado con FCS 2 % y 100 ng/ml de Activina A en ausencia tanto del compuesto de prueba como de Wnt3a. Los pocilios controles negativos en paralelo se mantuvieron en los días 3 y 4 en medio base DMEM:F12 con FCS 2 %.
Evaluación del ensayo. Al final del cultivo, las células en las placas de 96 pocilios se lavaron dos veces con PBS y, después, se fijaron con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante 20 minutos, se lavaron tres veces más con PBS, y después se permeabilizaron con Tritón X-1000 al 0.5 % durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación y la permeabilización, las células se lavaron de nuevo tres veces con PBS y después se bloquearon con suero de pollo al 4 % (Invitrogen) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios (anticuerpo de cabra anti-Sox17 humana; R&D Systems) se diluyeron 1:100 en suero de pollo al 4 % y se añadieron a las células durante una hora a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 488 (anticuerpo de pollo anti-lgG de cabra; Molecular Probes) se diluyó 1:200 en PBS y se añadió a cada pocilio después de lavar las células tres veces con PBS. Para la tinción de contraste de los núcleos, se añadieron 2 mg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen) durante diez minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez con PBS y se dejaron en 100 mI/pocillo de PBS para obtener las imágenes.
La obtención de las imágenes de las células se realizó mediante un analizador IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) con el uso de 51008bs dicroico para células teñidas con Hoechst 33342 y Alexa Fluor 488.
Los tiempos de exposición se optimizaron con el uso de los pocilios controles positivos y los pocilios teñidos solamente con el anticuerpo secundario como control negativo no tratado. Se obtuvieron imágenes de 15 campos por pocilio para compensar cualquier pérdida de células durante los procedimientos de tratamiento y tinción. Las mediciones del número total de células y la intensidad total de Sox-17 para cada pocilio se obtuvieron mediante el uso del programa informático IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healtcare). La segmentación de los núcleos se determinó en base a los niveles de la escala de grises (intervalo de la línea base 100-300) y al tamaño nuclear. Los promedios y desviaciones estándar se calcularon para cada conjunto de duplicados de datos. La expresión total de la proteína Sox17 se informó como la intensidad total o intensidad integrada, definida como la fluorescencia total de la célula multiplicada por el área de la célula. El fondo se eliminó en base a criterios de aceptación de intervalos de la escala de grises entre 300 a 3000 y factores de forma mayores que o iguales a 0.4. Los datos de intensidad total se normalizaron al dividir las intensidades totales de cada pocilio entre la intensidad total promedio para el control positivo Wnt3a/Activina A. Los datos normalizados se calcularon para el promedio y la desviación estándar para cada conjunto duplicado. Resultados Se muestran los resultados para ocho inhibidores de la enzima GSK-3B donde se confirmó la actividad, y se determinó la potencia mediante valoración en este ensayo secundario. Los datos presentados muestran los efectos de los compuestos sobre el número de células y la intensidad de Sox17, en donde los puntos de los datos respectivos se promediaron a partir de un conjunto duplicado y se extrajeron para cada parámetro a partir de campos y pocilios idénticos. En este ejemplo, la expresión de Sox17 es indicativa de la diferenciación en endodermo definitivo. Los resultados para el número de células y la intensidad de Sox17, respectivamente, mediante el uso de la línea de células madre embrionarias humanas H1 se muestran en las Tablas VIII y IX. Los resultados para la línea de células madre embrionarias humanas H9 se muestran en las Tablas X y XI. Los valores del control positivo se normalizaron a 1.000 para el número de celulas y para la intensidad de Sox17. Los valores del control negativo fueron menores que 0.388 para el número de células y menores que 0.065 para la intensidad de Sox17 con ambas líneas celulares. Una representación gráfica de estos datos, que compara las dos líneas de células madre embrionarias humanas, y que incluye una valoración de la dosis de cada compuesto, se proporciona en las Figuras 1A a la 8B. El número de células se presenta en el panel A; La intensidad de Sox 17 se muestra en el panel B. Estos datos confirman que cada compuesto puede promover la proliferación de células hES y la diferenciación en endodermo definitivo, e identificar un intervalo óptimo de actividad.
Ejemplo 8 Efectos de inhibidores de la enzima GSK-33 sobre la expresión de marcadores adicionales asociados con el endodermo definitivo Fue importante demostrar que los compuestos principales podían inducir además otros marcadores indicativos de la diferenciación del endodermo definitivo, en adición al factor de transcripción Sox17. Un subconjunto seleccionado de éxitos se probó para determinar su capacidad para promover la expresión de CXCR4, una proteína receptor de superficie, y HNF-3 beta, un factor de transcripción asociado además a la diferenciación en endodermo definitivo.
Preparación de células para ensayo: Los agregados celulares de la línea de células madre embrionarias humanas H1 usados en el ensayo se resuspendieron de manera uniforme en medio de cultivo y se sembraron en placas de 6 pocilios (Corning) recubiertas con MATRIGEL™ (dilución de 1:30) en volúmenes de 2 ml/pocillo. Se usó medio condicionado MEF complementado con 8 ng/ml de bFGF para la siembra inicial y la expansión. La alimentación diaria se llevó a cabo al aspirar el medio gastado del cultivo de cada pocilio y reemplazándolo con un volumen igual de medio nuevo. A los cultivos se les permitió expandirse de uno a tres días después de la siembra antes de iniciar el ensayo. Las placas se mantuvieron a 37 °C, 5 % de CO2 durante todo el ensayo.
Preparación de los compuestos y el medio de ensayo: Un subconjunto de siete éxitos resultantes del análisis primario se usó para el estudio de seguimiento y los ensayos secundarios posteriores. Los compuestos puros se disolvieron en soluciones de reserva de 10 mM en DMSO y se almacenaron desecadas a -20 °C hasta su uso. Inmediatamente antes del ensayo, las reservas de compuestos se diluyeron a una concentración final que está en el intervalo entre 1 mM y 5 mM en medio báse DMEM:F12 (Invitrogen) complementado con FCS 0.5 % (Hyclone) y 100 ng/ml de Activina A (R&D Biosystems).
Ensayo: El ensayo se inició al aspirar el medio de cultivo de las monocapas de células en cada pocilio seguido de tres lavados en PBS para eliminar factores de crecimiento y suero residuales. Los volúmenes de prueba de 2 mi por pocilio se añadieron de nuevo, los cuales contenían medio con FCS 0.5 % y diferentes concentraciones de compuestos inhibidores con 100 ng/ml de Activina A, sin Wnt3a. Los pocilios controles positivos contenían el mismo medio base y FCS 0.5 % con 100 ng/ml de Activina A y 20 ng/ml de Wnt3a (R&D Biosystems) en ausencia del compuesto de prueba. Los pocilios controles negativos contenían medio base con FCS 0.5 %, en ausencia de Activina A, Wnt3a, o el compuesto de prueba. Los pocilios de ensayo se aspiraron y se alimentaron de nuevo con concentraciones idénticas del compuesto de prueba o soluciones controles en el día 2 del ensayo. En los días 3 y 4, todos los pocilios del ensayo se aspiraron y se alimentaron con DMEM:F12 complementado con FCS 2 % y 100 ng/ml de Activina A en ausencia tanto del compuesto de prueba como de Wnt3a. Los pocilios controles negativos en paralelo se mantuvieron en los días 3 y 4 en medio base DMEM:F12 con FCS 2 %.
Evaluación del ensayo. Al final del cultivo, las monocapas de células se lavaron con PBS y se cosecharon de las placas de cultivo al incubar 5 minutos con solución TrypLE™ Express (Invitrogen, CA). Las células se resuspendieron en medio MEF condicionado y se dividieron en dos muestras iguales. Un conjunto de muestras se tiñeron, además, con diversos anticuerpos marcados con fluorescencia y se sometieron a análisis por citometría de flujo (FACS). Un segundo conjunto paralelo de muestras se sometió a PCR cuantitativa.
Las células para el análisis de FACS se lavaron en PBS y se bloquearon durante 15 minutos a 4 °C en 0. 125 % gamma-globulina humana (Sigma cat. núm. G-4386) diluida en PBS y amortiguador de tinción BD FACS.
Se tiñeron alícuotas de células (aproximadamente 105 células cada una) durante 30 minutos a 4 °C con anticuerpos conjugados directamente a una etiqueta fluorescente y con especificidad para CD9 PE (BD núm. 555372), CD99 PE (Caltag núm. MHCD9904), o CXCR-4 APC (R&D Systems cat. núm. FAB173A). Tras una serie de lavados en amortiguador de tinción BD FACS, las células se tiñeron con 7-AAD (BD núm. 559925) para evaluar la viabilidad y se analizaron en un instrumento BD FACS Array (BD Biosciences), que colecta al menos 10,000 eventos. Se usaron anticuerpos control de isotipo IgG-ik de ratón tanto para PE como para APC para obtener el porcentaje de células positivas.
Las células para la PCR cuantitativa se procesaron para extracción de ARN, purificación, y síntesis de ADNc. Las muestras de ARN se purificaron mediante la unión a una membrana de gel de sílice (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA) en presencia de un amortiguador de alto contenido en sal que contiene etanol, seguido de lavado para eliminar los contaminantes. El ARN se purificó más aún con el uso de un kit TURBO libre de ADN (Ambion, Inc.), y el ARN de alta calidad se eluyó en agua. El rendimiento y la pureza se estimaron mediante lecturas de A260 y A280 en un espectrofotómetro. Se produjeron copias de ADNc a partir del ARN purificado mediante el uso de un kit de archivo de ADNc de alta capacidad de Applied Biosystems, Inc. (ABI, CA).
A menos que se indique de cualquier otra manera, todos los reactivos para la amplificación y cuantificación de la PCR en tiempo real se compraron de ABI. Las reacciones de PCR en tiempo real se llevaron a cabo mediante el uso del sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7900. Se usó la mezcla TAQMAN UNIVERSAL PCR MASTER MIX (ABI, CA) con 20 ng del ARN transcrito inverso en un volumen total de reacción de 20 mI. Cada muestra de ADNc se corrió por duplicado para corregir errores de pipeteado. Los iniciadores y las sondas TAQMAN marcadas con FAM se usaron en concentraciones de 200 nM. El nivel de expresión para cada gen objetivo se normalizó mediante el uso de un control de gliceraldehído-3-fosfáto deshidrogenasa (GAPDH) endógena humana, desarrollado previamente por ABI. Los conjuntos de iniciadores y sondas se enumeran de la siguiente manera: CXCR4 (Hs00237052), GAPDH (4310884E), HNF3b (Hs00232764), SOX17 (parte de la sonda núm.450025, parte directa y reversa núm.4304971).
Despues de una incubación inicial a 50 °C durante 2 min seguido por 95 °C durante 10 min, las muestras se sometieron a un ciclo 40 veces en dos etapas: una etapa de desnaturalización a 95 °C durante 15 s, seguida por una etapa de hibridación/extensión a 60 °C durante 1 min. El análisis de datos se llevó a cabo mediante el uso del programa informático sistema de detección de secuencias GENEAMP 7000. Para cada grupo de iniciadores/sondas se determinó un valor CT como el número de ciclo en el que la intensidad de la fluorescencia alcanzó un valor específico en el medio de la región exponencial de amplificación. Los niveles de expresión génica relativa se calcularon mediante el uso del método comparativo de Ct. En resumen, para cada muestra de ADNc, el valor CT del control endógeno se sustrajo del CT del gen de interés para dar el valor delta Ct (ACt). La cantidad normalizada del destino se calculó como 2-ACt, al suponer que la amplificación tiene una eficacia del 100 %. Los datos finales se expresaron en relación a una muestra de calibración. Resultados La Figura 9 muestra el análisis por FACS del porcentaje de células positivas que expresan el receptor de superficie CXCR4 después del tratamiento con varios inhibidores de GSK3. Dos concentraciones de cada compuesto, que están en el intervalo entre 1 mM y 5 mM, se muestran con relación a una población de células no tratadas (control negativo) o células tratadas con Activina A y Wnt3 (control positivo). Los paneles a, b, y c de las Figuras 10A a 10C muestran los datos de la PCR en tiempo real para CXCR4, Sox17, y HNF3beta, que también se consideran como marcadores del endodermo definitivo. Ambos análisis de FACS y de PCR en tiempo real demostraron un aumento significativo en cada uno de estos marcadores observados en células diferenciadas con relación a las células control no tratadas. Los niveles de expresión de estos marcadores del endodermo definitivo eran equivalentes en algunos casos al control positivo, lo que demuestra que un inhibidor de GSK3 puede sustituir a Wnt3a en esta etapa de diferenciación.
Ejemplo 9 Efectos de inhibidores de la enzima GSK-3B sobre la formación de endodermo pancreático Era importante demostrar que el tratamiento con inhibidores de GSK3P durante la inducción de endodermo definitivo no impidió la posterior diferenciación de otros tipos de celulas, tales como endodermo pancreático, por ejemplo. Un subconjunto seleccionado de éxitos se ensayó para determinar su capacidad para promover la expresión de PDX1 y HNF6, factores de transcripción asociados con el endodermo pancreático.
El mantenimiento de células madre embrionarias humanas (líneas H9 o H1) se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1. Las colonias de células se mantuvieron en un estado indiferenciado, pluripotente con los pases en un promedio de cada cuatro días. El pase se llevó a cabo al exponer los cultivos celulares a una solución de colagenasa (1 mg/ml; Sigma-Aldrich) durante 10 a 30 minutos a 37 °C, seguido por raspado suave con una punta de pipeta para recuperar los agregados de células. Los agregados se dejaron sedimentar por gravedad, seguido de lavado para eliminar la colagenasa residual. Los agregados celulares se dividieron en una relación 1:3 para el cultivo de mantenimiento de rutina o en una relación 1 :1 para el ensayo posterior. Las líneas de células madre embrionarias humanas usadas se mantuvieron en menos del pase 50 y rutinariamente se evaluó su fenotipo cariotípico normal y la ausencia de contaminación por micoplasma.
Preparación de las celulas de ensayo: Los agregados celulares de la línea de células madre embrionarias humanas H1 usados en el ensayo se resuspendieron de manera uniforme en medio de cultivo y se sembraron en placas de 24 pocilios (pocilios oscuros; Arctic White) recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:30) en volúmenes de 1 ml/pocillo. Se usó medio condicionado MEF complementado con 8 ng/ml de bFGF para la siembra inicial y la expansión. En un segundo experimento, los agregados de células hES de la línea H9 se sembraron en placas de 96 pocilios sobre capas de alimentador embrionario de ratón (MEF), previamente inactivadas mediante tratamiento con mitomicina C (Sigma Chemical Co). El medio de cultivo para las células hES sobre monocapas de MEF consistió en DMEM:F12 con sustituto de suero desactivado al 20 % (Invitrogen) complementado con aminoácidos esenciales mínimos (Invitrogen), L-glutamina, y 2-mercaptoetanol. La alimentación diaria se llevó a cabo al aspirar el medio gastado del cultivo de cada pocilio y reemplazarlo con un volumen igual de medio nuevo. A los cultivos se les permitió expandirse de uno a tres días después de la siembra antes de iniciar el ensayo. Las placas se mantuvieron a 37 °C, 5 % de CO2 durante todo el ensayo.
Preparación de los compuestos y el medio de ensayo: Un subconjunto de ocho éxitos resultantes del análisis primario se usó para el estudio de seguimiento y los ensayos secundarios posteriores. Los compuestos puros se disolvieron en soluciones de reserva de 10 mM en DMSO y se almacenaron desecadas a -20 °C hasta el uso. Inmediatamente antes del ensayo, las reservas de los compuestos se diluyeron a una concentración final en el intervalo entre 1 mM y 5 mM en medio base con aditivos.
Ensayo. En este ensayo, los inhibidores de GSK3 se incluyeron solo en los días 1 y 2 de la etapa de diferenciación del endodermo definitivo, al sustituir por Wnt3a. Los cultivos de células madre embrionarias en MATRIGEL™ se iniciaron como se describe en los Ejemplos 7 y 8 anteriores, al aspirar el medio de cultivo de las monocapas de células en cada pocilio seguido de tres lavados en PBS para eliminar factores de crecimiento y suero residuales. Para la diferenciación a endodermo definitivo, se añadieron volúmenes de prueba (0.5 mi por pocilio para placas de 24 pocilios, 100 ml por pocilio para placas de 96 pocilios) que contenían medio DMEM:F12 con FCS 0.5 % y diferentes concentraciones de compuestos inhibidores con 100 ng/ml de Activina A, sin Wnt3a. Los pocilios controles positivos contenían el mismo medio base con FCS 0.5 % y con 100 ng/ml de Activina A y 20 ng/ml de Wnt3a (R&D Biosystems) en ausencia del compuesto de prueba. Los pocilios controles negativos contenían el mismo medio base con FCS 0.5 %, en ausencia de Activina A, Wnt3a, o el compuesto de prueba. Los pocilios de ensayo se aspiraron y se alimentaron de nuevo con concentraciones idénticas del compuesto de prueba o soluciones controles en el día 2 del ensayo. En los días 3 y 4, todos los pocilios del ensayo se aspiraron y se alimentaron con DMEM.F12 complementado con FCS 2 % y 100 ng/ml de Activina A en ausencia tanto del compuesto de prueba como de Wnt3a. Los pocilios controles negativos en paralelo se mantuvieron en los días 3 y 4 en medio base DMEM:F12 con FCS 2 %. Para la diferenciación a endodermo pancreático, las celulas se trataron durante tres días, con alimentación diaria con medio base DMEM:F12 que contenía FCS 2 % con 0.25 pM de KAAD ciclopamina (EMD Bíosciences) y 20 ng/ml de FGF7 (R&D Biosystems). Las células se trataron durante un período adicional de cuatro días, con alimentación diaria con DMEM:F12 que contenía B27 1 % (Invítrogen), 0.25 mM de KAAD ciclopamina, 2 pM de ácido retinoico (RA; Sigma-Aldrich) y 20 ng/ml de FGF7. Los pocilios controles negativos en paralelo se mantuvieron todo el tiempo en medio base DMEM:F12 con FCS 2 % (etapa 2) o B27 1 % (etapa 3) y sin ningún otro aditivo.
Los cultivos paralelos de células embrionarias humanas H9 crecieron en capas alimentadoras MEF, y se diferenciaron a endodermo pancreático. La diferenciación a endodermo definitivo se logró al cultivar las células en un medio que consistió en RPMI-1640 (Invítrogen) que no contenía suero en el día 1 y FCS 0.2 % en los días 2 y 3 junto con diferentes concentraciones de compuestos inhibidores y 100 ng/ml de Activina A. Los pocilios controles positivos contenían el mismo medio base (con o sin suero) con 100 ng/ml de Activina A y 20 ng/ml de Wnt3a (R&D Biosystems) en ausencia del compuesto de prueba. Los pocilios controles negativos contenían el mismo medio base con o sin suero, en ausencia de Activina A, Wnt3a, o del compuesto de prueba. Los pocilios de ensayo se aspiraron y se alimentaron de nuevo con concentraciones idénticas del compuesto de prueba o soluciones controles en el día 2 del ensayo. En el día 3, todos los pocilios de ensayo se aspiraron y se alimentaron con medio RPMI-1640 complementado con FCS 2 % y 100 ng/ml de activina A en ausencia tanto del compuesto de prueba como de Wnt3a. Los pocilios controles negativos en paralelo se mantuvieron el día 3 en medio base RPMI-1640 con FCS 2 %. Las células se diferenciaron a endodermo pancreático al tratar las células durante cuatro días, con alimentación diaria con medio base RPMI-1640 que contenía FCS 2 % con 0.25 mM de KAAD ciclopamina (EMD Biosciences) y 50 ng/ml de FGF10 (R&D Biosystems). Posteriormente, las células se trataron durante tres días, con alimentación diaria con RPMI-1640 que contenía B27 1 % (Invitrogen), 0.25 mM de KAAD ciclopamina, 2 mM de ácido retinoico (RA; Sigma-Aldrich) y 50 ng/ml de FGF10. Los pocilios controles negativos en paralelo se mantuvieron todo el tiempo en medio base RPMI-1640 con FCS 2 % (etapa 2) o B27 1 % (etapa 3) y sin ningún otro aditivo.
Evaluación del ensayo. Al final de la diferenciación, las células se examinaron como se describe en el Ejemplo 8 para la expresión génica mediante PCR en tiempo real. Para una tinción de fluorescencia de alto contenido, las células en las placas de 96 pocilios se lavaron dos veces con PBS después se fijaron con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente. durante 20 minutos, se lavaron tres veces más con PBS, y después se permeabilizaron con Tritón X-100 0.5 % durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación y la permeabilización, las células se lavaron de nuevo tres veces con PBS y se bloquearon con suero de pollo 4 % (Invitrogen) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo primario (anticuerpo de cabra anti-Pdx1 humano; Santa Cruz) se diluyó 1:100 en suero de pollo 4 % y se añadió a las células durante dos horas a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 488 (anticuerpo de pollo anti-lgG de cabra; Molecular Probes) se diluyó 1:200 en PBS y se añadió a cada pocilio después. de lavar las células tres veces con PBS. Para la tinción de contraste de los núcleos, se añadieron 2 mg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen) durante diez minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez con PBS y se dejaron en 100 mI/pocillo de PBS para obtener las imágenes.
La obtención de las imágenes de las células se realizó mediante un analizador IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) con la usación de 51008bs dicroico para células teñidas con Hoechst 33342 y Alexa Fluor 488.
Los tiempos de exposición se optimizaron mediante el uso de pocilios controles positivos y pocilios teñidos solamente con el anticuerpo secundario. Se obtuvieron imágenes de 15 campos por pocilio para compensar cualquier pérdida de células durante los procedimientos de tratamiento y tinción. Las mediciones del número total de células y la intensidad total de Pdx1 se obtuvieron para cada pocilio mediante el uso del programa informático IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healtcare). La segmentación de los núcleos se determinó en base a los niveles de la escala de grises (intervalo de la línea base 100-300) y al tamaño nuclear. Los promedios y desviaciones estándar se calcularon para cada conjunto de duplicados de datos. La expresión total de la proteína Pdx1 se informó como intensidad total o intensidad integrada, definida como la fluorescencia total de la célula multiplicada por el área de la célula. El fondo se eliminó en base a criterios de aceptación de intervalos de la escala de grises entre 300 a 3000. Los datos de intensidad total se normalizaron al dividir las intensidades totales de cada pocilio entre la intensidad total promedio para el control positivo Wnt3a/Activina A. Los datos normalizados se calcularon para el promedio y la desviación estándar para cada conjunto duplicado.
Las células para PCR cuantitativa se lisaron en amortiguador RLT (Qiagen) y después se procesaron para la extracción del ARN, purificación, y síntesis de ADNc. Las muestras de ARN se purificaron mediante la unión a una membrana de gel de sílice (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA) en presencia de un amortiguador de alto contenido en sal que contiene etanol, seguido de lavado para eliminar los contaminantes. El ARN se purificó aún más con un kit TURBO libre de ADN (Ambion, Inc.), y después el ARN de alta calidad se eluyó en agua. El rendimiento y la pureza se evaluaron mediante lecturas de A260 y A280 en un espectrofotómetro. Se produjeron copias de ADNc a partir del ARN purificado mediante el uso de un kit de archivo de ADNc de alta capacidad de Applied Biosystems, Inc. (ABI, CA).
A menos que se indique de cualquier otra manera, todos los reactivos para la amplificación y cuantificación de PCR en tiempo real se compraron de ABI. Las reacciones de PCR en tiempo real se llevaron a cabo mediante el uso del sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7900. Se usó la mezcla TAQMAN UNIVERSAL PCR MASTER MIX con 20 ng de ARN transcrito inverso en un volumen total de reacción de 20 pl. Cada muestra de ADNc se corrió por duplicado para corregir errores de pipeteado. Los iniciadores y las sondas TAQMAN marcadas con FAM se usaron en concentraciones de 200 nM. El nivel de expresión para cada gen objetivo se normalizó mediante el uso de un control de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) endógena humana desarrollado previamente por ABI. Los conjuntos de iniciadores y sondas se enumeran de la siguiente manera: PDX1 (Hs00236830_m1), GAPDH (4310884E), y HNF6 (Hs00413554_m1).
Despues de una incubación inicial a 50 °C durante 2 min seguido por 95 °C durante 10 min, las muestras se sometieron a un ciclo de 40 veces en dos etapas: una etapa de desnaturalización a 95 °C durante 15 s, seguida por una etapa de hibridación/extensión a 60 °C durante 1 min. El análisis de datos se llevó a cabo mediante el uso del programa informático sistema de detección de secuencias GENEAMPÓ7000. Para cada grupo de iniciadores/sondas se determinó un valor CT como el número de ciclo en el que la intensidad de la fluorescencia alcanzó un valor específico en el medio de la región exponencial de amplificación. Los niveles de expresión génica relativa se calcularon mediante el uso del método comparativo Ct. En resumen, para cada muestra de ADNc, el valor CT del control endógeno se sustrajo del CT del gen de interés para dar el valor delta Ct (ACt). La cantidad normalizada del destino se calculó como 2-ACt, asumiendo que la amplificación tiene una eficacia del 100 %. Los datos finales se expresaron en relación a una muestra de calibración. Resultados Los resultados se muestran para ocho inhibidores de la enzima GSK-3 . Los datos presentados en las Figuras 11A y 11B a partir de análisis de alto contenido muestran los efectos sobre el número de células (panel A) y la intensidad de Pdx1 (panel B) para la línea de celulas H1 hES, en donde los puntos de los datos respectivos se promediaron a partir de un conjunto de muestras por duplicado y se extrajeron para cada parámetro a partir de campos y pocilios idénticos. Los datos presentados en la Figura 12 a partir de la PCR en tiempo real muestran efectos de estas pequeñas moléculas inhibidoras sobre la expresión inducida de dos factores de transcripción, Pdx1 y HNF6. En estos ejemplos, la expresión de Pdx1 y HNF6 son indicativos de la diferenciación en endodermo pancreático. Los compuestos inhibidores de GSK3 en estos ensayos pueden sustituirse por Wnt3a durante las primeras etapas de compromiso del linaje celular; lo que resulta en que las células mantengan una capacidad para formar endodermo pancreático durante etapas secuenciales posteriores de diferenciación.
Ejemplo 10 Efectos de inhibidores de la enzima GSK-3B sobre la formación de células endocrinas pancreáticas Fue importante demostrar que el tratamiento con inhibidores de GSK3 durante la inducción de endodermo definitivo no impidió la posterior diferenciación de otros tipos de células, tales como células endocrinas pancreáticas, o células productoras de insulina, por ejemplo. Para un subconjunto de éxitos seleccionados se probó su capacidad para promover la expresión de hormonas pancreáticas.
Preparación de ¡as celulas para el ensayo: Las células de endodermo pancreático obtenidas de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 9 (cultivadas en placas de 96 pocilios y placas de 24 pocilios) se sometieron posteriormente a agentes que provocan que las células se diferencien a células que expresan hormonas pancreáticas.
El ensayo para cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en Matrigel™ se inició como se describe en los Ejemplos 7-9 anteriores, al aspirar el medio de cultivo de las monocapas de células en cada pocilio, seguido de tres lavados en PBS para eliminar factores de crecimiento y suero residuales. Para la diferenciación a endodermo definitivo, se añadieron volúmenes de prueba (0.5 mi por pocilio para placas de 24 pocilios, 100 ml por pocilio para placas de 96 pocilios) que contenían medio con FCS 0.5 % y diferentes concentraciones de compuestos inhibidores con 100 ng/ml de Activina A, sin Wnt3a. Los pocilios controles positivos contenían el mismo medio base y FCS 0.5 % con 100 ng/ml de Activina A y 20 ng/ml de Wnt3a (R&D Biosystems) en ausencia del compuesto de prueba. Los pocilios controles negativos contenían el mismo medio base con FCS 0.5 %, en ausencia de Activina A, Wnt3a, o el compuesto de prueba. Los pocilios de ensayo se aspiraron y se alimentaron de nuevo con concentraciones idénticas del compuesto de prueba o soluciones controles en el día 2 del ensayo. En los días 3, 4, y 5, todos los pocilios del ensayo se aspiraron y se alimentaron con DMEM:F12 complementado con FCS 2 % y 100 ng/ml de Activina A en ausencia tanto del compuesto de prueba como de Wnt3a. Los pocilios controles negativos se mantuvieron en paralelo los días 3, 4, y 5 en medio base DMEM:F12 con FCS 2 %. Para la diferenciación a endodermo pancreático, las celulas se trataron durante tres días, con alimentación diaria con medio base DMEM:F12 que contenía FCS 2 % con 0.25 pM de KAAD ciclopamina (EMD Biosciences) y 20 ng/ml de FGF7 (R&D Biosystems). Las células se trataron posteriormente durante cuatro días, con alimentación diaria con DMEM:F12 que contenía B27 1 % (Invitrogen), 0.25 mM de KAAD ciclopamina, 2 pM de ácido retinoico (RA; Sigma-Aldrich100 ng/ml) y 20 ng/ml de FGF7. Los pocilios controles negativos en paralelo durante las etapas 2 y 3 se mantuvieron todo el tiempo en medio base DMEM:F12 con FCS 2 % o B27 1 % y sin ningún otro aditivo. Después de la formación de endodermo pancreático, las células se trataron adicionalmente durante seis días, con alimentación diaria con medio base DMEM:F12 que contenía B27 1 % con 1 pM de DAPT (inhibidor de gamma secretasa: EMD Biosciences) y 50 ng/ml de Exendina 4 (Sigma-Aldrich). Las células se trataron después durante otro tiempo de tres días, con alimentación diaria con medio base DMEM:F12 que contenía B27 1 %, 50 ng/ml de Exendina 4, 50 ng/ml de IGF (R&D Biosystems) y 50 ng/ml de HGF (R&D Biosystems). Los pocilios controles negativos se mantuvieron en paralelo durante todo el tiempo en medio base DMEM:F12 con B27 1 % y sin ningún otro aditivo.
Evaluación del ensayo. Al final del cultivo, las células se trataron como en los Ejemplos 7 y 8 anteriores para su evaluación mediante análisis de alto contenido o PCR en tiempo real.
Para la tinción de fluorescencia de alto contenido, las células en placas de 96 pocilios se lavaron dos veces con PBS, después se fijaron con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante 20 minutos, se lavaron tres veces más con PBS, y después se permeabilizaron con Tritón X-100 0.5 % durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación y la permeabilización, las células se lavaron de nuevo tres veces con PBS y se bloquearon con suero de pollo 4 % (Invitrogen) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo primario (anticuerpo de conejillo de indias anti-insulina porcina, con reactividad cruzada con la insulina humana; DakoCytomation) se diluyó 1 :500 en suero de cabra 4 % y se añadió a las células durante una hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces con PBS y después se tiñeron con el anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 488 (anticuerpo de cabra anti-lgG de conejillo de Indias; Molecular Probes) diluido 1 :100 en suero de cabra 4 %. Para la tinción de contraste de los núcleos, se añadieron 2 mg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen) durante diez minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez con PBS y se dejaron en 100 mI/pocillo de PBS para obtener las imágenes.
La obtención de las imágenes de las células se realizó mediante un analizador IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) con la usación de 51008bs dicroico para células teñidas con Hoechst 33342 y Alexa Fluor 488.
Los tiempos de exposición se optimizaron mediante el uso de pocilios controles positivos y pocilios teñidos solamente con el anticuerpo secundario. Se obtuvieron imágenes de 15 campos por pocilio para compensar cualquier pérdida de células durante los procedimientos de tratamiento y tinción. Las mediciones del número total de células y la intensidad total de insulina se obtuvieron para cada pocilio mediante el uso del programa informático IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healtcare). La segmentación de los núcleos se determinó en base a los niveles de la escala de grises (intervalo de la línea base 100-300) y al tamaño nuclear. Los promedios y desviaciones estándar se calcularon para cada conjunto de duplicados de datos. La expresión total de la proteína insulina se informó como la intensidad total o intensidad integrada, definida como la fluorescencia total de la célula multiplicada por el área de la célula. El fondo se eliminó en base a criterios de aceptación de intervalos de la escala de grises entre 300 a 3000. Los datos de intensidad total se normalizaron al dividir las intensidades totales de cada pocilio entre la intensidad total promedio para el control positivo Wnt3a/Activina A. Para los datos normalizados se calculó el promedio y la desviación estándar para cada conjunto triplicado.
Las células para PCR cuantitativa se lisaron en amortiguador RLT (Qiagen) y después se procesaron para la extracción del ARN, purificación, y síntesis de ADNc. Las muestras de ARN se purificaron mediante la unión a una membrana de gel de sílice (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA) en presencia de un amortiguador de alto contenido en sal que contiene etanol, seguido de lavado para eliminar los contaminantes. El ARN se purificó más aún con el uso de un kit TURBO libre de ADN (Ambion, INC), y el ARN de alta calidad se eluyó en agua. El rendimiento y la pureza se estimaron mediante lecturas de A260 y A280 en un espectrofotómetro. Se produjeron copias de ADNc a partir del ARN purificado mediante el uso de un kit de archivo de ADNc de alta capacidad de Applied Biosystems, Inc. (ABI, CA).
A menos que se indique de cualquier otra manera, todos los reactivos para la amplificación y cuantificación de la PCR en tiempo real se compraron de ABI. Las reacciones de PCR en tiempo real se llevaron a cabo mediante el uso del sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7900. Se usó TAQMAN® UNIVERSAL PCR MASTER MIX® (ABI, CA) con 20 ng de ARN transcrito inverso en un volumen total de reacción de 20 pl. Cada muestra de ADNc se corrió por duplicado para corregir errores de pipeteado. Los iniciadores y las sondas TAQMAN® marcadas con FAM se usaron en concentraciones de 200 nM. El nivel de expresión para cada gen objetivo se normalizó mediante el uso de un control de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) endógena humana, desarrollado previamente por ABI. Los conjuntos de iniciadores y sondas se enumeran de la siguiente manera: PDX1 (Hs00236830_m1), insulina (Hs00355773), y GAPDH (4310884E).
Despues de una incubación inicial a 50 °C durante 2 min seguida por 95 °C durante 10 min, las muestras se sometieron a un ciclo de 40 veces en dos etapas: una etapa de desnaturalización a 95 °C durante 15 s seguida por una etapa de hibridación/extensión a 60 °C durante 1 min. El análisis de datos se llevó a cabo mediante el uso del programa informático sistema de detección de secuencias GENEAMP®7000. Para cada equipo de cebador/sonda, se determinó un valor Ct como el número de ciclo al que la intensidad de fluorescencia alcanzó un valor específico en medio de la región exponencial de amplificación. Los niveles de expresión relativa del gen se calcularon con el método Ct comparativo. En resumen, para cada muestra de ADNc, el valor del control endógeno Ct se sustrajo del gen de interés Ct para dar el valor delta Ct (ACt. La cantidad normalizada del destino se calculó como 2 ACt, con la suposición de que la amplificación tiene una eficacia del 100 %. Los datos finales se expresaron en relación a una muestra de calibración. Resultados Los resultados se muestran para ocho inhibidores de la enzima GSK-3B. Los datos presentados en las Figuras 13A y 13B a partir del análisis de alto contenido muestran los efectos de compuestos sobre el número de células (panel A) y la intensidad de insulina (panel B) para la línea celular H1 hES, en donde los puntos respectivos de los datos se promediaron a partir de un conjunto triplicado y se extrajeron para cada parámetro a partir de campos y pocilios idénticos. Los datos presentados en la Figura 14 de la PCR en tiempo real muestran los efectos de compuestos para Pdx1 e insulina. En estos ejemplos, la expresión de Pdx1 e insulina son indicativos de la diferenciación a endodermo pancreático y de la generación de células positivas hormonales. Los compuestos inhibidores selectivos de QbK3b en estos ensayos pueden sustituirse por Wnt3a durante las primeras etapas de compromiso de linaje celular y pueden inducir y mantener la formación de células beta pancreáticas durante etapas secuenciales posteriores de diferenciación, como se evidencia tanto por la inmunotinción de insulina, como por PCR en tiempo real.
Ejemplo 11 Efectos aditivos de inhibidores de la enzima GSK-36 sobre la formación de celulas endocrinas pancreáticas Fue importante demostrar que el tratamiento con inhibidores de GSK3 podría mejorar la diferenciación de células beta pancreáticas si se añaden durante múltiples fases del compromiso de destino celular. Un subconjunto seleccionado de éxitos se probó mediante la adición cronometrada secuencial para mejorar la expresión de insulina asociada a células positivas hormonales pancreáticas.
Preparación de las células para el ensayo: preparación de las células para el ensayo: Las células de endodermo pancreático obtenidas de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 9 y 10 (cultivadas en placas de 96 pocilios) se sometieron posteriormente a agentes que provocan que las células se diferencien a células que expresan hormonas pancreáticas.
El ensayo para cultivos de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en Matrigel™ se inició como se describe en los Ejemplos 7-9 anteriores, al aspirar el medio de cultivo de las monocapas de células en cada pocilio, seguido de tres lavados en PBS para eliminar factores de crecimiento y suero residuales. Para la diferenciación a endodermo definitivo, se añadieron volúmenes de prueba (100 ml por pocilio para placas de 96 pocilios) que contenían medio con FCS 0.5 % y diferentes concentraciones de compuestos inhibidores con 100 ng/ml de Activina A, sin Wnt3a. Los pocilios controles positivos contenían el mismo medio base y FCS 0.5 % con 100 ng/ml de Activina A y 20 ng/ml de Wnt3a (R&D Biosystems) en ausencia del compuesto de prueba. Los pocilios controles negativos contenían el mismo medio base con FCS 0.5 %, en ausencia de Activina A, Wnt3a, o el compuesto de prueba. Los pocilios de ensayo se aspiraron y se alimentaron de nuevo con concentraciones idénticas del compuesto de prueba o soluciones controles en el día 2 del ensayo. En los días 3, 4, y 5, todos los pocilios del ensayo se aspiraron y se alimentaron con DMEM:F12 complementado con FCS 2 % y 100 ng/ml de Activina A en ausencia tanto del compuesto de prueba como de Wnt3a. Los pocilios controles negativos se mantuvieron en paralelo los días 3, 4, y 5 en medio base DMEM:F12 con FCS 2 %. Para la diferenciación a endodermo pancreático, las células se trataron durante tres días, con alimentación diaria con medio base DMEM:F12 que contenía FCS 2 % con 0.25 mM de KAAD ciclopamína (EMD Biosciences) y 20 ng/ml de FGF7 (R&D Biosystems). Las células se trataron posteriormente durante cuatro días, con alimentación diaria con DMEM:F12 que contenía B27 1 % (Invítrogen), 0.25 mM de KAAD ciclopamína, 2 pM de ácido retinoico (RA; Sigma-Aldrich) y 20 ng/ml de FGF7. Los pocilios controles negativos en paralelo se mantuvieron todo el tiempo en medio base DMEM:F12 con FCS 2 % o B27 1 % y sin ningún otro aditivo. Después de la formación de endodermo pancreático, las células se trataron adicionalmente durante seis días, con alimentación en días alternos con medio base DMEM:F12 que contenía B27 1 % con 1 mM de DAPT (inhibidor de gamma secretasa: EMD Biosciences) y 50 ng/ml de Exendina 4 (Sigma-Aidrich) y 1 mM del inhibidor II de TGFbeta R1 (inhibidor de ALK5; MD Biosciences). Durante este período de seis dias, se añadieron inhibidores de GSK3p de nuevo a los pocilios respectivos, con el uso de la misma concentración que en el tratamiento previo en la iniciación de la diferenciación. Después las células se trataron otros tres días de duración, con alimentación en días alternos con medio base DMEM:F12 que contenía B27 1 %, 50 ng/ml de Exendina 4, 50 ng/ml de IGF (R&D Biosystems) y 50 ng/ml de FIGF (R&D Biosystems), y 1 mM de inhibidor II TGFbeta R1 (inhibidor de ALK5; MD Biosciences). Durante este período de tres días, los inhibidores de la GSK3 se añadieron de nuevo a los pocilios respectivos, mediante el uso de la misma concentración que el tratamiento previo en la iniciación de la diferenciación. Conjuntos paralelos de pocilios controles positivos se trataron en presencia o ausencia de 20 ng/ml de Wnt3a. Los pocilios controles negativos en paralelo se mantuvieron durante todo el tiempo en medio base DMEM:F12 con B27 1 % y sin ningún otro aditivo.
Evaluación del ensayo. Al final del cultivo, las células se trataron como en el Ejemplo 10 anterior para su evaluación por el análisis de alto contenido.
Para la tinción de fluorescencia de alto contenido, las células en placas de 96 pocilios se lavaron dos veces con PBS, después se fijaron con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante 20 minutos, se lavaron tres veces más con PBS, y después se permeabilizaron con Tritón X-100 0.5 % durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación y la permeabilización, las células se lavaron de nuevo tres veces con PBS y se bloquearon con suero de pollo 4 % (Invitrogen) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo primario (anticuerpo de conejillo de indias anti-insulina porcina, con reactividad cruzada con la insulina humana; DakoCytomation) se diluyó 1 :500 en suero de cabra 4 % y se añadió a las células durante una hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces con PBS y, después, se tiñeron con el anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 488 (anticuerpo de cabra anti-lgG de conejillo de Indias; Molecular Probes) diluido 1:100 en suero de cabra 4 %. Para la tinción de contraste de los núcleos, se añadieron 2 mg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen) durante diez minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez con PBS y se dejaron en 100 mI/pocillo de PBS para obtener las imágenes.
La obtención de las imágenes de las células se realizó mediante un analizador IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) con la usación de 51008bs dicroico para células teñidas con Hoechst 33342 y Alexa Fluor 488. Los tiempos de exposición se optimizaron mediante el uso de pocilios controles positivos y pocilios teñidos solamente con el anticuerpo secundario. Se obtuvieron imágenes de 15 campos por pocilio para compensar cualquier pérdida de células durante los procedimientos de tratamiento y tinción. Las mediciones del número total de células y la intensidad total de insulina se obtuvieron para cada pocilio mediante el uso del programa informático IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healtcare). La segmentación de los núcleos se determinó en base a los niveles de la escala de grises (intervalo de la línea base 100-300) y al tamaño nuclear. Los promedios y desviaciones estándar se calcularon para cada conjunto de duplicados de datos. La expresión total de la proteína insulina se informó como la intensidad total o intensidad integrada, definida como la fluorescencia total de la celula multiplicada por el área de la célula. El fondo se eliminó en base a criterios de aceptación de intervalos de la escala de grises entre 300 a 3000. Los datos de intensidad total se normalizaron al dividir las intensidades totales de cada pocilio entre la intensidad total promedio para el control positivo Wnt3a/Activina A. Para los datos normalizados se calculó el promedio y la desviación estándar para cada conjunto triplicado.
Resultados Los resultados se muestran para ocho inhibidores de la enzima GSK-3B. Los datos presentados en las Figuras 15A y 15B a partir del análisis de alto contenido muestran los efectos de compuestos sobre el número de células (panel A) y la intensidad de insulina (panel B) para la linea celular H1 hES donde los puntos respectivos de los datos se promediaron a partir de un conjunto triplicado y se extrajeron para cada parámetro a partir de campos y pocilios idénticos. En este ejemplo, la expresión de insulina es indicativa de la diferenciación a células pancreáticas positivas hormonales. Los compuestos inhibidores selectivos de GSK3P en estos ensayos pueden sustituir a Wnt3a durante las primeras etapas de compromiso del linaje celular y, cuando se añaden en etapas posteriores de la diferenciación, parecen promover una mayor expresión de insulina con relación a una muestra control positiva.
Las publicaciones citadas en este documento se incorporan como referencias en su totalidad. Aunque los diferentes aspectos de la invención se ilustraron anteriormente con referencia a los ejemplos y las realizaciones preferidas, se apreciará que el alcance de la invención no se define por la descripción anterior, sino por las siguientes reivindicaciones redactadas bajo los principios de la lcy de patentes.
TABLA IA: LISTA DE ANTICUERPOS PRIMARIOS USADOS PARA LA CLASIFICACION CELULAR ACTIVADA POR FLUORESCENCIA (FACS, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS) Y PARA LOS ANÁLISIS DE INMUNOTINCIÓN.
TABLA IB: LISTA DE ANTICUERPOS SECUNDARIOS CONJUGADOS USADOS PARA FACS Y PARA ANÁLISIS DE INMUNOTINCIÓN.
TABLA II: EFECTOS DE INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA GSK-3B SOBRE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS QUE EXPRESAN MARCADORES DE PLURIPOTENCIA.
TABLA II: CONTINUACIÓN TABLA II: CONTINUACION TABLA II: CONTINUACIÓN TABLA II: CONTINUACIÓN TABLA II: CONTINUACIÓN TABLA II: CONTINUACIÓN TABLA II: CONTINUACIÓN TABLA II: CONTINUACIÓN TABLA 111: EFECTOS DE INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA GSK-3B SOBRE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS QUE EXPRESAN MARCADORES DE PLURIPOTENCIA.
TABLA III (CONTINUACION) TABLA III (CONTINUACIÓN) TABLA IV: EFECTOS DE INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA GSK-3B SOBRE LA DIFERENCIACIÓN Y PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS.
TABLA IV. CONTINUACIÓN TABLA IV. CONTINUACIÓN TABLA IV. CONTINUACIÓN TABLA IV. CONTINUACIÓN TABLA IV. CONTINUACIÓN TABLA IV. CONTINUACIÓN TABLA V: EFECTOS DE INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA GSK-3B SOBRE LA DIFERENCIACIÓN Y PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS.
TABLA V. CONTINUACIÓN TABLA VI: EFECTOS DE INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA GSK-3B SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS. i .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . TABLA VI: CONTINUACIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i . . . .
I .
TABLA VI: CONTINUACIÓN TABLA VI: CONTINUACIÓN TABELA VI: CONTINUAQÁO TABLA VI: CONTINUACIÓN TABLA VI: CONTINUACIÓN TABLA Vil: EFECTOS DE INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA GSK-3B SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS.
. I TABLA IX: EFECTOS DEPENDIENTES DE LA DOSIS DE INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA GSK-3B SOBRE LA DIFERENCIACIÓN DE LA LÍNEA DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS H1.
TABLA X: EFECTOS DEPENDIENTES DE LA DOSIS DE INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA GSK-3B SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS DE LA LÍNEA DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS H9.
TABLA XI: EFECTOS DEPENDIENTES DE LA DOSIS DE INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA GSK-3B SOBRE LA DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS DE LA LÍNEA DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS H9.
TABLAXII.RELACIÓNENTRELOSCOMPUESTOSENLASTABLASYLOSCOMPUESTOS 5 10 15 20 TABLA XII (CONTINUACIÓN) TABLA XII (CONTINUACIÓN) TABLA XIII. FÓRMULAS QUÍMICAS DE OTROS COMPUESTOS PROBADOS

Claims (126)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1. Un metodo para expandir y diferenciar células pluripotentes; caracterizado porque comprende las etapas de: a. cultivar células pluripotentes, y b. tratar las células pluripotentes con un inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las células pluripotentes son células madre embrionarias.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las células pluripotentes son células que expresan marcadores de pluripotencia derivadas de células madre embrionarias.
4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque las células que expresan marcadores de pluripotencia expresan al menos uno de los siguientes marcadores de pluripotencia seleccionados del grupo que consiste en: ABCG2, cripto, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, y Tra1-81.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las células pluripotentes se diferencian en celulas que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las células pluripotentes se tratan con el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B durante aproximadamente una a aproximadamente 72 horas.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las células pluripotentes se tratan con el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B durante aproximadamente 12 a aproximadamente 48 horas.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las células pluripotentes se tratan con el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B durante aproximadamente 48 horas.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B se usa a una concentración de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 100 mM.
10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el Inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B se usa a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 pM.
11. El metodo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B se usa a una concentración de aproximadamente 10 mM.
12. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el inhibidor de la actividad de la enzima GSK- 3B es un compuesto de la Fórmula (I): Fórmula (I)
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque R-i es fenilo, fenilo sustituido en donde los sustituyentes del fenilo se seleccionan del grupo que consiste en C-i-salquilo, halógeno, nitro, trifluorometilo y nitrilo, o pirimidinilo.
14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque R2 es fenilo, fenilo sustituido en donde los sustituyentes del fenilo se seleccionan del grupo que consiste en Ci-5alquilo, halógeno, nitro, trifluorometilo y nitrilo, o pirimidinilo que está sustituido opcionalmente con Ci-4alqu¡lo, y al menos uno de Ri y R2 es pirimidinilo.
15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque R3 es hidrógeno, 2-(trimetilsilil)etoximetilo, Ci_ 5alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo, arilCi-salquiloxicarbonilo, arilCi-5alquilo, arilC-t. 5alquilo sustituido en donde el uno o más sustituyeles del arilo se seleccionan independientemente del grupo que consiste en Ci-5alquilo, C-i-salcoxi, halógeno, amino, Ci-5alquilamino, y d¡Ci-5alqu¡lam¡no, ftalimidoC1-5alquilo, aminoCi-5alquilo, diaminoC-i-salquilo, succinimidoCi-salquilo, Ci_5alquilcarbonilo, arilcarbonilo, Ci-5alquilcarbonilCi.5alquilo y ariloxicarbonilC1-5alquilo.
16. El metodo de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque R4 es -(A)-(CH2)q-X.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque A es vinileno, etinileno o „OR5 ALA
18. El método de conformidad con la reivindicación 17 caracterizado además porque R5 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, C1-5alquilo, fenilo y fenilC-i-salquilo.
19. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque q es 0-9.
20. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque X se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxi, vinilo, vinilo sustituido en donde uno o más sustituyentes del I vinilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en flúor, bromo, cloro y yodo, etinilo, etinilo sustituido, en donde los sustituyentes del etinilo se seleccionan del grupo que consiste en flúor, bromo, cloro y yodo, C1-5alquilo, Ci_ 5alquilo sustituido en donde el uno o más sustituyentes del alquilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en Ci-5alcoxi, trihaloalquilo, ftalimido y amino, C3-7cicloalquilo, C-i_5alcoxi, C1-5alcoxi sustituido en donde los sustituyentes del alquilo se seleccionan del grupo que consiste en ftalimido y amino, ftalimidooxi, fenoxi, fenoxi sustituido en donde el uno o más sustituyentes del fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en Ci-5alquilo, halógeno y Ci-5alcox¡, fenilo, fenilo sustituido en donde el uno o más sustituyentes del fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en Ci-salquilo, halógeno y C1-5alcoxi, arilC1-5alquilo, arilC1-5alquilo sustituido en donde el uno o más sustituyentes del arilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en C-i-salquilo, halógeno y C-i-salcoxi, ariloxiCi-salquilamino, Ci_ 5alquilamino, diC-i-salquilamino, nitrilo, oxima, benxiloxiimino, Ci-salquiloxiimino, ftalimido, succinimido, C-i-salquilcarboniloxi, fenilcarboniloxi, fenilcarboniloxi sustituido en donde el uno o más sustituyentes del fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en C1-5alqu¡lo, halógeno y Ci-5alcoxi, femlC-i. 5alquilcarboniloxi en donde el uno o más sustituyentes del fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en C-i-salquilo, halógeno y C-|. 5alcoxi, aminocarboniloxi, C-i-salquilaminocarboniloxi, diCi_ 5alquilaminocarboniloxi, Ci-5alcoxicarbonilox¡, C1-5alcoxicarboniloxi sustituido en donde el uno o más sustituyentes del alquilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en metilo, etilo, isopropilo y hexilo, fenoxicarboniloxi, fenoxicarboniloxi sustituido en donde el uno o más sustituyentes del fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en Ci-5alquilo, C1-5alcoxi y halógeno, Ci-5alquiltio, Ci-5alquiltio sustituido en donde los sustituyentes del alquilo se seleccionan del grupo que consiste en hidroxi y ftalimido, 0^ 5alquilsulfonilo, fenilsulfonilo, fenilsulfonilo sustituido en donde uno o más sustituyentes del fenilo se seleccionan cada uno del grupo que consiste en bromo, flúor, cloruro, Ci-5alcoxi y trifluorometilo; con la condición de que si A es /OR5 N Wx q es 0 y X es H, entonces R3 no debe ser 2-(trimetilsilil)etoximetilo; y sales farmacéuticamente aceptables de estos.
21. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque Ri es fenilo sustituido y R2 es pirimidin-3-ilo.
22. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque R1 es 4-fluorofenilo.
23. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque R3 es hidrógeno, arilCi-5alquilo, o ahlC-i. 5alquilo sustituido.
24. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque R3 es hidrógeno o fenilCi-5alquilo.
25. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque A es etinileno y q es 0-5.
26. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque X es succinimido, hidroxi, metilo, fenilo, C-i. 5alquilsulfonilo, C3-6cicloalquilo, Ci-5alquilcarboniloxi, Ci-5alcoxi, fenilcarboniloxi, Ci-5alquilamino, diCi-5alquilamino o nitrilo.
27. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula I es 4-(4-fluorofenil)-2-(4-hidroxibutin-1-il)-1-(3-fenilpropil)-5-(4-piridil)imidazol.
28. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B es un compuesto de la Fórmula (II): Fórmula (II)
29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R se selecciona del grupo que consiste en Ra, -C-i.salquil-Ra, -C2-8alquenil-Ra, -C2-8alquin¡l-Ra y ciano.
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque Ra se selecciona del grupo que consiste en cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo.
31. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -C1-Salquil-R5, -C2-8alquenil-R5, -C2-8alquinil-R5, -C(O)-(Ci-8)alqu¡l-R9, -C(O)-aril- -aril-R8, -C(0)-NH(C1-8alquil-R9), -C(0)-NH(aril-R8), -C(0)-N(C1-8alquil-R9)2, -S02-(C1-8)alquil-R9, -S02-aril-R8, -cicloalquil-R6, -heterociclil-R6, -aril-R6 y -heteroaril-R6; en donde el heterociclilo y el heteroarilo se unen al átomo de nitrógeno del azaindol en la posición uno a través de un átomo de carbono del anillo heterociclilo o heteroarilo.
32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque R5 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -0-(Ci-8)alquilo, -O-(C1-8)alquil-OH, -0-(Ci-8)alquil-0-(C-i-8)alquilo, -0-(C-i-8)alquil-NH2, -0-(Ci-8)alqu¡l-NH(Ci-8alquilo), -0-(Ci-8)alquil-N(Ci-8alquilo)2, -0-(Ci-8)alquil-S-(Ci-8)alquilo, -O-(Ci-8)alquil-S02-(Ci-8)alquilo, -0-(Ci-8)alquil-S02-NH2, -0-(C1-8)alquil-S02- NH(C1-8alquilo), -0-(C1-8)alquil-S02-N(C1-8alqu¡lo)2, -0-C(0)H, -0-C(0)-(Ci. a)alquilo, -0-C(0)-NH2, -0-C(0)-NH(C1-8alquilo), -0-C(0)-N(C1-8alquilo)2, -O-(C1-8)alquil-C(0)H, -0-(C1-8)alquil-C(0)-(C1-8)alquilo, -0-(Ci-8)alquil-CO2H, -O- (C1-8)alquil-C(0)-0-(Ci-8)alquilo, -0-(Ci-8)alquil-C(0)-NH2, -0-(C-i-8)alquil-C(0)-NH(C1-8alquilo), -0-(C1-8)alquil-C(0)-N(Ci-8alquilo)2, -C(0)H, -C(0)-(C1- 8)alquilo, -C02H, -C(0)-0-(C1-8)alquilo, -C(0)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(0)-NH(Ci- aalquilo), -C(O)-N(Ci-8alquilo)2, -SH, -S-(Ci-8)alquilo, -S-(Ci-8)alquil-S-(Ci-8)alquilo, -S-(Ci-8)alqu¡l-O-(Ci-8)alqu¡lo, -S-(Ci-8)alquil-0-(Ci-8)alquil-0H, -S-(Ci. 8)alqu¡l-0-(Ci-8)alquil-NH2 -S-(C1-8)alqu¡l-0-(C1-8)alquil-NH(Ci-8alquilo), -S·^. 8)alquil-0-(C1-8)alquil-N(C1-8alquilo)2, -S-(C1-8)alquil-NH(C -8alquilo), -S02-(C-|. 8)alquilo, -S02-NH2, -S02-NH(Ci-8alquilo), -S02-N(Ci-8alquilo)2, -N-R7, ciano, (halo)i-3 hidroxi, nitro, oxo, -cicloalquil-R6, -heterociclil-R6, -aril-R6 y -heteroaril-R6.
33. El metodo de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque R6 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -C1-8alquilo, -C2-8alquenilo, -C2-8alquinilo, -C(O)H, -C(0)-(C1-8)alquilo, -CO2H, -C(0)-0-(C1-8)alquilo, -C(0)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(0)-NH(Ci-8alqu¡lo), -C(0)-N(Ci-8)alquilo)2, -S02-(C1-8)alquilo, -S02-NH2, -S02-NH(C1-8alquilo), -S02-N(Ci-8alquilo)2, -(Ci-8)alquil-N-R7, -(Ci-8)alquil-(halo)i-3, -(Ci-8)alquil-OH, -aril-R8, -(C -8)alquil-aril-R8 y -(Ci-8)alquil-heteroaril-R8; con la condición de que, cuando R6 se une a un átomo de carbono, R6 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste en -Ci-8alcoxi, -(Ci_ 8)alcoxi-(halo)i-3, -SH, -S-(C1-8)alquilo, -N-R7, ciano, halo, hidroxi, nitro, oxo y -heteroaril-R8.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque R7 es 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-8alquilo, -C2- 8alquenilo, -C2-8alquinilo, -(C1-8)alquil-OH, -(C1-8)alquil-0-(C1-8)alquilo, -(C1-8)alquil- NH2I -(Ci-8)alquil-NH(Ci-8alquilo), -(C1-8)alquM-N(C1-8alquilo)2 -(C -8)alquil-S-(C·]. s)alquilo, -C(O)H, -C(O)-(Ci-8)alquilo, -C(O)-O-(C1-8)alquilo, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C1-8alquilo), -C(0)-N(C1-8alqu¡lo)2, -S02-(C1-8)alqu¡lo, -S02-NH2, -S02-NH(Ci-salquiio), -S02-N(C1-8alquilo)2, -C(N)-NH2, -cicloalquil-R8, -(Ci-8)alquil-heterociclil-R8, -aril-R8, -(Ci-8)alqu¡l-ar¡l-R8 y -(C1-8)alquN-heteroaril-R8.
35. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque R8 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-8alquilo, -(Ci-8)alquil-(halo)i-3 y -(C-i-8)alquil-OH; con la condición de que, cuando R8 se une a un átomo de carbono, R8 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste en -Ci-8alcoxi, -NH2, -NH(Ci-8alquilo), -N(Ci-8alquilo)2, ciano, halo, -(Ci-8)alcoxi-(halo)i-3, hidroxi y nitro.
36. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque R9 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -C-t-8alcox¡, -NH2, -NH(Ci-8alquilo), -N(C-i-8alquilo)2, ciano, (halo)i-3, hidroxi y nitro.
37. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R2 es un sustituyente unido a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, -C-i. 8alquil-R5, -C2-8alquenil-R5, -C2-8alquinil-R5, -C(0)H, -C(0)-(C1-8)alquil-R9, -C(O)-NH2, -C(0)-NH(C1-8alquil-R9), -C(0)-N(C1-8alquil-R9)2, -C(0)-NH(aril-R8), -C(O)-cicloalquil-R8, -C(0)-heterociclil-R8, -C(0)-aril-R8, -C(0)-heteroaril-R8, -CO2H, - C(O)-O-(C1-8)alquil-R9 -C(O)-0-aril-R8, -S02-(C1-8)alquil-R9, -S02-aril-R8, -cicloalquil-R6, -aril-R6 y -(Ci-8)alqu¡l-N-R7; con la condición de que, cuando R2 se une a un átomo de carbono, R2 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste en -Ci-8alcoxi-R5, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, oxo, -heterociclil-R6 y heteroaril-R6.
38. El metodo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R3 es 1 a 3 sustituyentes unidos a un átomo de carbono seleccionado Independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci.8alquil-R10, -C2-8alquenil-R10, -C2-8alquinil-R10, -C-i-8alcoxi-R10, -C(0)H, -C(0)-(C1-8)alquil-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(Ci-8alquil-R9), -C(O)- N(Ci-8alquil-R9)2, -C(0)-cicloalqu¡l-R8, -C(0)-heterociclil-R8, -C(0)-aril-R8, -C(0)-heteroaril-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(0)-0-(Ci-8)alquil-R9, -C(0)-0-aril-R8, -S02-(Ci-8)alquil-R9, -S02-aril-R8, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquil-R8, -heterociclil-R8, -aril-R8 y -heteroaril-R8.
39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque R10 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -NH2, -NH(C-|. 8alquilo), -N(Ci-8alquilo)2, ciano, (halo)i-3, hidroxi, nitro y oxo.
40. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-8alquil-R10, -C2-8alquenil-R10, -C2-8alquinil-R10, -C1-8alcoxi-R10, -C(0)H, -C(0)-(C1-8)alquil-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C1-8alquil-R9), -C(0)-N(C1- 8alqu¡l-R9)2, -C(O)-cicloalqu¡l-R8, -C(O)-heterociclil-R8, -C(0)-aril-R8, -C(0)-heteroaril-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(0)-O-(C1-8)alquil-R9, -C(0)-0-aril-R8, -SH, -S-(Ci-8)alquil-R10, -S02-(C1-8)alquil-R9, -S02-anl-R8, -S02-NH2, -S02-NH(Ci-8alquil-R9), -S02-N(Ci-8alqu¡l-R9)2, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquil-R8, -heterodclil-R8, -aril-R8 y -heteroaril-R8
41. El metodo de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque R10 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -NH2, -NH(C-. salquilo), -N(Ci-8alquilo)2, ciano, (halo)i-3, hidroxi, nitro y oxo.
42. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque Y y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste en O, S, (H,OH) y (H,H); con la condición de que uno de Y y Z es O y el otro se selecciona del grupo que consiste en O, S, (H,OH) y (H,H); y sales farmacéuticamente aceptables de estos.
43. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R se selecciona del grupo que consiste en Ra, -Ci_ 4alquil-Ra, -C2-4alquenil-Ra, -C2-4alquinil-Ra y ciano.
44. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque Ra se selecciona del grupo que consiste en heterociclilo, arilo y heteroarilo.
45. El método de conformidad con la reivindicación 29, Ra se selecciona del grupo que consiste en dihidro-piranilo, fenilo, naftilo, tienilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, piridinilo, azaindolilo, indazolilo, benzofurilo, benzotienilo, dibenzofurilo y dibenzotienilo.
46. El metodo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-4alquil-R5, -C2.4alquenil-R5, -C2-4alquinil-R5, -C(O)-(C-i-4)alquil-R9, -C(O)-aril-R8, -C(0)-O-(C1-4)alquil-R9, -C(0)-0-aril-R8, -C(0)-NH(C1-4alqu¡l-R9), -C(0)-NH(aril- , - )alquil-R9, -S02-aril-R8, -cicloalquil-R6, -heterociclil-R6, -aril-R6 y -heteroaril-R6; en donde el heterociclilo y el heteroarilo se unen al átomo de nitrógeno en el azaindol en la posición uno a través de un átomo de carbono del anillo heterociclilo o heteroarilo.
47. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-4alquil-R5, -aril-R6 y heteroarilo-R6; en donde el heteroarilo se une al átomo de nitrógeno del azaindol en la posición uno a través de un átomo de carbono del anillo heteroarilo.
48. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-4alquil-R5 y naftil-R6.
49. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque R5 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -0-(C )alquilo, -O-(Ci-4)alquil-OH, -O- alquil-NH2, -0-(C1-4)alquil-NH(C1-4alquilo), -0-(C1-4)alquil-N(C1-4alquilo)2, -0-(C1-4)alquil-S-(C1-4)alquilo, -O- (C1-4)alquil-S02-(Ci-4)alquilo -O-(Ci-4)alquil-S02-NH2, -0-(C1-4)alquil-S02- NH(Ci-4alquilo), -0-(Ci-4)alquil-S02-N(C1-4alquilo)2, -0-C(O)H, -O-CÍOMC·,. 4)alquilo, -0-C(O)-NH2, -0-C(0)-NH(C1-4alquilo), -0-C(0)-N(C1-4alquilo)2, -O-(C1-4)alquil-C(0)H, -0-(C1-4)alquil-C(0)-(Ci-4)alquilo, -0-(Ci-4)alquil-CO2H, -O-(C1-4)alquil-C(0)-0-(C1-4)alquilo, -0-(C1-4)alquil-C(0)-NH2, -0-(C1-4)alquil-C(0)- NH(C1-4alquilo), -0-(C1-4)alquil-C(0)-N(C1-4alquilo)2, -C(0)H, -CfOMCi. 4)alquilo, -C02H, -C(0)-0-(C1-4)alqu¡lo, -C(0)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(0)-NH(Ci. 4alquilo), -C(0)-N(Ci-4alquilo)2 -SH, -S-(Ci-4)alquilo, -S-(Ci-4)alquil-S-(Ci. 4)alquilo, -S-(C1-4)alquil-0-(C1-4)alquilo, -S-(Ci-4)alquil-0-(C1-4)alquil-0H, -S-(Ci-4)alquil-0-(C -4)alquil-NH2 -S-(C1-4)alquil-0-(C1-4)alquil-NH(C1-4alquilo), -S-(Ci-4)alquil-0-(Ci-4)alquil-N(Ci-4alquilo)2, -S-(Ci-4)alquil-NH(Ci-4alquilo), -S02-(C1-4)alqu¡lo, -S02-NH2, -S02-NH(C1-4alquilo), -S02-N(Ci-4alquilo)2, -N-R7, ciano, (halo)i-3, hidroxi, nitro, oxo, -cicloalquil-R6, -heterociclil-R6, -aril-R6 y -heteroaril-R6.
50. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque R5 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -0-(C1-4)alquilo, -N-R7, hldroxi y -heteroaril-R6.
51. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque R5 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -0-(Ci-4)alquilo, -N-R7, hidroxi, -imidazolil-R6, -triazolil-R6 y -tetrazolil-R6.
52. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque R6 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci.4alquilo, -C2-4alquenilo, -C2_4alquinilo, -C(O)H, -C(O)-(Ci-4)alquilo, -CO2H, -C(0)-O-(C1-4)alquilo, -C(0)-NH2, -C(NH)-NH2, -C(0)-NH(C1-4alquilo), -C(0)-N(Ci-4)alquilo)2, -S02-(Ci-4)alqu¡lo, -S02-NH2, -S02-NH(Ci-4alquilo), -S02-N(Ci-4alquilo)2 -(Ci-4)alquil-N-R7, -(Ci-4)alquil-(halo)1-3, -(C1-4)alquil-OH, -aril-R8, -(C1-4)alquil-aril-R8 y -(C1-4)alquil-heteroaril-R8; con la condición de que, cuando R6 se une a un átomo de carbono, R6 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste en -Ci-4alcoxi, -(C-i-4)alcoxi-(halo)i-3, -SH, -S-(Ci-4)alquilo, -N-R7, ciano, halo, hidroxi, nitro, oxo y-heteroaril-R8.
53. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque R6 es hidrógeno.
54. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque R7 es 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-4alquilo, -C2- 4alquenilo, -C2-4alquinilo, -(C1-4)alquil-OH, -(C1-4)alquil-0-(Ci-4)alquilo, -(Ci-4)alquil-NH2, -(C1-4)alquil-NH(Ci^alquilo), -(Ci^)alquil-N(C1-4alquilo)2, -(Ci-4)alquil-S-(C·]. 4)alquilo, -C(0)H, -C(0)-(CM)alquilo, -C^-CHCi^alquilo, -C(0)-NH2, -C(O)-NH(Ci-4alquilo), -C(0)-N(C1-4alquilo)2l -S02-(Ci-4)alquilo, -S02-NH2, -S02-NH(Ci-4alquilo), -S02-N(Ci-4alquilo)2, -C(N)-NH2, -cicloalquil-R8, -(Ci-4)alquil-heterociclil-R8, -aril-R8, -(Ci-4)alquil-aril-R8 y -(Ci-4)alquil-heteroaril-R8.
55. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque R7 es 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci- alquilo, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)alquilo, -C(0)-O-(C1 4)alquilo, -S02-NH2, -SO^NHÍC!. 4alquilo) y -S02-N(Ci-4alquilo)2.
56. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque R8 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-4alquilo, -(C1-4)alquil-(halo)1-3 y -(Ci-4)alquil-OH; con la condición de que, cuando R8 se une a un átomo de carbono, R8 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste en -Ci-4alcox¡, -NH2, -NH(Ci- alquilo), -N(C1-4alquilo)2, ciano, halo, -(C-i-^alcoxKhalo)-!^, hidroxi y nitro.
57. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque R8 es hidrógeno.
58. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque R9 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci^alcoxi, -NH2, -NH(C1- alquilo), -N(Ci-4alquilo)2, ciano, (halo)i-3, hidroxi y nitro.
59. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque R9 es hidrógeno.
60. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R2 es un sustituyente unido a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci_ - )alquil-R9, -C(O)-NH2 -C(0)-NH(Ci-4alquil-R9), -C(0)-N(C1-4alquil-R9)2, -C(0)-NH(aril-R8), -C(O)-cicloalquil-R8, -C(0)-heterociclil-R8, -C(0)-aril-R8, -C(0)-heteroaril-R8, -CO2H, -C(0)-O-(C1-4)alquil-R9, -C(0)-0-aril-R8, -S02-(C1-4)alquil-R9, -S02-aril-R8, -cicloalquil-R6, -aril-R6 y -(C1-4)alquil-N-R7; con la condición de que, cuando R2 se une a un átomo de carbono, R2 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste en -C1- alcoxi-R5, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, oxo, -heterociclil-R6 y -heteroaril-R6.
61. El metodo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R2 es un sustituyente unido a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, -C-i. alquil-R5, -C2-4alquenil-R5, -C2-4alquinil-R5, -C02H, -C(0)-0-(Ci-4)alquil-R9, -cicloalquil-R6, -aril-R6 y -(C-i-4)alquil-N-R7; con la condición de que, cuando R2 se une a un átomo de nitrógeno, no se forma una sal cuaternaria; y, con la condición de que, cuando R2 se une a un átomo de carbono, R2 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste en -Ci- alcoxi-R5, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, oxo, -heterociclil-R6 y -heteroaril-R6.
62. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R2 es un sustituyente unido a un átomo de carbono o nitrógeno seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, -C^ 4alquil-R5 y -aril-R6; con la condición de que, cuando R2 se une a un átomo de nitrógeno, no se forma una sal cuaternaria; y, con la condición de que cuando R2 se une a un átomo de carbono, R2 se selecciona adicionalmente del grupo que consiste en -N-R7, halógeno, hidroxi y -heteroaril-R6.
63. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R3 es 1 a 3 sustituyentes unidos a un átomo de carbono seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci-4alquil-R10, -C2-4alquenil-R10, -C2-4alquinil-R10, -Ci-4alcoxi-R10, -C(O)H, -C(O)-(C1-4)alquil-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(Ci-4alqui!-R9), -C(O)-N(Ci-4alquil-R9)2, -C(0)-cicloalquil-R8, -C(0)-heterociclil-R8, -C(0)-aril-R8, -C(0)-heteroaril-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(0)-O-(Ci-4)alquil-R9, -C(0)-0-aril-R8, -S02-(Ci 8)alquil-R9, -S02-aril-R8, -N-R7, -(Ci-4)alquil-N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquil-R8, -heterociclil-R8, -aril-R8 y -heteroaril-R8.
64. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R3 es un sustituyente unido a un átomo de carbono seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci^alquil-R10, -C2- 4alquenil-R10, -C2-4alquinil-R10, -C^alcoxi-R10, -C(0)H, -C02H, -NH2, -NH(Ci. 4alquilo), -N(C1-4alquilo)2, ciano, halógeno, hidroxi y nitro.
65. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R3 es un sustituyente unido a un átomo de carbono seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, -Ci^alquil-R10, -NH2, -NH(C-i_4alquilo), -N(C -4alquilo)2, halógeno e hidroxi.
66. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, - - -C(O)H, -C(O)-(C1-4)alquil-R9, -C(0)-NH2, -C(0)-NH(C1-4alquil-R9), -C(O)-N(Ci- alquil-R9)2, -C(0)-cicloalquil-R8, -C(0)-heterociclil-R8, -C(0)-aril-R8, -C(0)-heteroaril-R8, -C(NH)-NH2, -CO2H, -C(0)-O-(C1-4)alquil-R9, -C(0)-0-aril-R8, -SH, -S-(C1-4)alquil-R10, -S02-(Ci-4)alquil-R9, .-S02-aril-R8, -S02-NH2, -S02-NH(Ci-4alquil-R9), -S02-N(Ci-4alquil-R9)2, -N-R7, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquil-R8, -heterociclil-R8, -aril-R8 y -heteroaril-R8.
67. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -C1- alquil-R10, -C2-4alquenil-R10, -C2-4alquinil-R10, -Ci- alcoxi-R10, -C(0)H, -C02H, -NH2I -NH(C1- alquilo), -N(C1-4alquilo)2, ciano, halógeno, hidroxi, nitro, -cicloalquilo, -heterociclilo, -arilo y -heteroarilo.
68. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, C1-4alquil-R10, C1-4alcoxi-R10, -NH2, -NH(Ci-4alquilo), -N(Ci_ 4alquilo)2, halógeno e hidroxi.
69. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque R4 es 1 a 4 sustituyentes unidos a un átomo de carbono seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, C-ualquil-R10, Ci-4 alcoxi-R10, -NH2, -NH(Ci-4alquilo), -N(Ci-4alquilo)2, cloro, flúor e hidroxi.
70. El metodo de conformidad con las reivindicaciones 38 y 41 , caracterizado además porque R10 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, -NH2, -NH(C-|. 4alquilo), -N(C1-4alquilo)2, ciano, (halo) -3, hidroxi, nitro y oxo.
71. El método de conformidad con las reivindicaciones 38 y 41 , caracterizado además porque R10 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y (halo) -3.
72. El método de conformidad con las reivindicaciones 38 y 41 , caracterizado además porque R10 es 1 a 2 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y (flúor)3.
73. El método de la reivindicación 28, caracterizado además porque Y y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste en O, S, (H,OH) y (H,H); con la condición de que uno de Y y Z es O y el otro se selecciona del grupo que consiste en O, S, (H,OH) y (H,H).
74. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque Y y Z se seleccionan independientemente del grupo que consiste en O y (H,H); con la condición de que uno de Y y Z es O, y el otro se selecciona del grupo que consiste en O y (H,H).
75. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque Y y Z se seleccionan independientemente de O.
76. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula II es 3-[1-(3-hidroxipropil)-1/-/-pirrol[2,3-j ]piridin-3-il]-4-[2-(trifluorometil)fenil]-1/-/-pirrol-2,5-diona.
77. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula II es 3-[1-(3-hidroxipropil)-1 H-p¡rrol[2,3-b]p¡rid¡n-3-il]-4-(1 -metll-1 /-/-pirazol-3-il)-1 H-pirrol-2,5-diona.
78. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula II es 3-[1-(3-hidroxi-propil)-1 H-p¡rrol[2,3-b]piridin-3-il]-4-pirazin-2-il-pirrol-2,5-diona.
79. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula II es 3-(2,4-dimetoxi-pirimidin-5-il)-4-[1-(3-hidroxi-propil)-1 H-pirrol[2,3-b]piridin-3-il]-pirrol-2,5-diona.
80. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula II es 4-{3-[4-(2,4-dimetoxi-pirimidin-5-il)-2,5-dioxo-2,5-dih¡dro-1 H-pirrol-3-il]-pirrol[2,3-b]piridin-1-il}-butironitrilo.
81. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula II es 4-{3-[4-(1-metil-1 H-pirazol-3-il)-2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-3-il]-p¡rrol[2,3-b]pir¡din-1-¡l}-butironitrilo.
82. El método de conformidad con la reivindicación 28 caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula II es 3-(2,4-dimetoxi-pir¡midin-5-il)-4-(1-fenetil-1H-p¡rrol[2,3-b]piridin-3-il)-pirrol-2,5-diona.
83. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el inhibidor de la actividad de la enzima GSK-3B es un compuesto de la Fórmula (III): Fórmula (III)
84. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque A y E se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un átomo de carbono sustituido con hidrógeno y un átomo de nitrógeno; en donde se selecciona independientemente del grupo que consiste en 1/-/-indol, 1H-pirrol[2,3-¿>]piridina, 1/-/-pirazol[3,4-¿>]piridina y 1H-indazol.
85. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque Z se selecciona de O; alternativamente, Z se selecciona de dihidro; en donde cada átomo de hidrógeno está unido por un enlace simple.
86. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque R4 y R5 se seleccionan independientemente de Ci-8alquilo, C2-8alquenilo y C2-8alquinilo opcionalmente sustituidos con oxo.
87. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque R2 se selecciona del grupo que consiste en -C-i-8alquil-, -C2-8alquenil-, -C2-8alquinil-, -O-(C1-8)alquil-0-, -0-(C2-8)alquenil-0-, -0-(C2-8)alquinil-0-, -C(O)-(Ci-8)alqu¡l-C(O)- (caracterizado además porque cualquiera de los grupos de unión alquilo, alquenilo y alquinilo anteriores son cadenas de carbono lineales opcionalmente sustituidas con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en Ci-8alquilo, C1-8alcoxi, Ci-8alcoxi(C1-8)alquilo, carboxilo, carboxil(Ci-8)alquilo, -C(0)0-(Ci.8)alquilo, -Ci.8alquil-C(0)0-(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alquilo), aminoíC-i-sJalquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alquilo), halógeno, (halo)i-3(Ci-8)alquilo, (halo)1-3(C1-8)alcoxi, hidroxi, hidroxi(Ci-8)alquilo y oxo; y, en donde cualquiera de los grupos de unión alquilo, alquenilo y alquinilo anteriores se sustituyen opcionalmente con uno a dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en heterocielilo, arilo, heteroarilo, heterocicli Ci-sJalquilo, aril(Ci-8)alquilo, heteroaril(Ci-8)alquilo, espirocicloalquilo y espiroheterociclilo (en donde cualquiera de los sustituyentes cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo anteriores se sustituyen opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en C1-8alquilo, C-i. 8alcoxi, C-i-8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxil(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alqu¡lo), amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci^alquilo), halógeno, (halo)i-3(Ci-8)alqu¡lo, (halo)1-3(C1-8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(C1-8)alquilo; y, en donde cualquiera de los sustituyentes heterociclilo anteriores se sustituyen opcionalmente con oxo)), cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo (en donde cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo se sustituyen opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en Ci-8alqu¡lo, C1-8alcox¡, C1-8alcoxi(C -8)alquilo, carboxilo, carboxil(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C1-4alquilo), amino(Ci-8alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C1-4alquilo), halógeno, (halo)i-3(C-i. 8)alquilo, (halo)i-3(C1-8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(Ci-8)alquilo; y, en donde el heterocielilo se sustituye opcionalmente con oxo), -(0-(CH2)I-6)O-5-O-, -O-(CH2)I-6-0-(CH2)I-6-0-, -0-(CH2)1-6-0-(CH2)I-6-0-(CH2)1-6-0-, -(0-(CH2)I-6)O-5-NR6-, -0-(CH2)1-6-NR6-(CH2)I-6-0-, -0-(CH2)1-6-0-(CH2)1-6-NR6-, -(0-(CH2)I. 6)O-5-S-, -0-(CH2)1-6-S-(CH2)1-6-0-, -0-(CH2)1-6-0-(CH2)1-6-S-, -NR6-, -NR6-NR , -NR6-(CH2)I-6-NR7-, -NR6-(CH2)I-6-NR7-(CH2)I-6-NR8-, -NR6-C(O)-, -C(O)-NR6-, -C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)0-6-C(O)-, -NR6-(CH2)O-6-C(0)-(CH2)1-6-C(0)-(CH2)O-6-NR7-, -NR6-C(0)-NR7-, -NR6-C(NR7)-NR8-, -0-(CH2)1-6-NR6-(CH2)I-6-S-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-0-, -S-(CH2)1-6-NR6-(CH2)1-6-S-, -NR6-(CH2)1-6-S-(CH2)I.6-NR7- y -S02- (en donde R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, C1-8alquilo, C-i. 8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxil(C1-8)alquilo, amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alquilo), h¡droxi(Ci-8)alquilo, heterociclil(Ci-8)alquilo, aril(C-i-8)alquilo y heteroaril(Ci-8)alquilo (en donde los sustituyentes heterociclilo, arilo y heteroarilo anteriores se sustituyen opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en Ci-8alquilo, Ci-8alcox¡, Ci-8alcox¡(C-i-8)alquilo, carboxilo, carboxil(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C1-4alquilo), amino(C-i-8)alqu¡lo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci^alquilo), halógeno, (halo)1-3(Ci-8)alquilo, (halo)1-3(C1-8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(Ci-8)alquilo; y, en donde el heterociclilo se sustituye opcionalmente con oxo)); con la condición de que, si A y E se seleccionan de un átomo de carbono sustituido con hidrógeno, entonces R2 se selecciona del grupo que consiste en -C2-8alquinilo-, -O-(C1-8)alquil-0-, -0-(C2-8)alquenil-0-, -0-(C2-8)alquinil-0-, -C(O)-(Ci-8)alquil-C(O)- (en donde cualquiera de los grupos de unión alquilo, alquenilo y alquinilo anteriores son cadenas de carbono lineales sustituidas opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en Ci-8alquilo, C-i. 8alcoxi, Ci-8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxil(Ci-8)alquilo, -C(0)0-(C-|. s)alquilo, -Ci-8alquil-C(0)0-(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alquilo), amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alquilo), halógeno, (halo)1-3(C -8)alquilo, (halo)i. 3(C .8)alcoxi, hidroxi, hidroxi(Ci-8)alquilo y oxo; y, en donde cualquiera de los grupos de unión alquilo, alquenilo y alquinilo anteriores se sustituyen opcionalmente con uno a dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en heterocielilo, arilo, heteroarilo, heterociclil(Ci-8)alquilo, aril(Ci-8)alquilo, heteroaril(Ci-8)alquilo, espirocicloalquilo y espiroheterociclilo (en donde cualquiera de los sustituyentes cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo anteriores se sustituyen opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en C -8alquilo, C1-8alcoxi, C·). 8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxil(C -8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C1- alquilo), amino(C1-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C -4alquilo), halógeno, (halo)i-3(C1-8)alquilo, (halo)1-3(Ci-8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(Ci-8)alquilo; y, en donde cualquiera de los sustituyeles heterocielilo anteriores se sustituyen opcionalmente con oxo)), cicloalquilo (en donde el cicloalquilo se sustituye opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en C -8alquilo, C1-8alcox¡, C1-8alcoxi(C1-8)alquilo, carboxilo, carboxil(C1-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alquilo), amino(C-i-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci^alquilo), halógeno, (halo)i-3(C1-8)alquilo, (halo)i-3(Ci-8)alcox¡, hidroxi e hidroxi(Ci-8)alquilo), -(0-(CH2)I-6)I-5-O-, -0-(CH2)I-6-0-(CH2)I-6-0-, -0-(CH2)l-6-0-(CH2)l-6-0-(CH2)l-6-0-, -(0-(CH2)I-6)I-5-NR6-, -O- (CH2)1-6-NR6-(CH2)I-6-0-, -0-(CH2)I-6-0-(CH2)1-6-NR6-, -(0-(CH2)i-e)o-5-S-, -O-(CH2)1 -6-S-(CH2)I.6-0-, -0-(CH2)I-6-0-(CH2)I-6-S-, -NR6-NR7-, -NR6-(CH2)I-6-NR7-, -NR6-(CH2)I-6-NR7-(CH2)I-6-NR8-, -NRg-C(O)-, -C(O)-NR9-, -C(O)-(CH2)0-6-NR6-(CH2)O-6-C(O)-, -NR6-(CH2)O-6-C(0)-(CH2)I-6-C(0)-(CH2)O-6-NR7-, -NR6-C(0)-NR7-, -NR6-C(NR7)-NR8-, -0-(CH2)I-6-NR6-(CH2)I-6-S-, -S-(CH2)I-6- NR6-(CH2)I-6-0-, -S-(CH2)I-6-NR6-(CH2)I-6-S- y -NR6-(CH2)I-6-S-(CH2)I-6-NR7-(en donde R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, C1-8alquilo, Ci.aalcoxi(C1-8)alquilo, carboxi C!. 8)alquilo, amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo consistente en hidrógeno y Ci-4alqu¡lo), hidroxi(C -8)alquiio, heterocielil(Ci.8)alquilo, aril(Ci. 8)alquilo y heteroaril(Ci-8)alquilo (en donde los sustituyentes heterociclilo, arilo y heteroarilo anteriores se sustituyen opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en C1-8alquilo, Ci-8alcoxi, Ci-8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxil(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alquilo), amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci- alquilo), halógeno, (halo)i.3(Ci. 8)alquilo, (halo)i-3(Ci-8)alcox¡, hidroxi e hidroxi(Ci.8)alqu¡lo; y, en donde el heterociclilo se sustituye opcionalmente con oxo); y, en donde Rg se selecciona del grupo que consiste en Ci-8alquilo, Ci-8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxil(Ci-8)alquilo, amino(Ci-8)alqu¡lo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C1-4alquilo), hidroxi(C1-8)alquilo, heterociclil(C1-8)alquilo, aril(Ci-8)alquilo y heteroaril(Ci-8)alqullo (en donde los sustituyentes heterociclilo, arilo y heteroarilo anteriores se sustituyen opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en Ci-8alquilo, C-i-8alcox¡, Ci-8alcoxi(Ci-8)alquilo, carboxilo, carboxil(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C-i- alquilo), amino(C1-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C1-4alquilo), halógeno, (halo^C-i. 8)alquilo, (halo)-i-3(Ci-8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(C1-8)alquilo; y, en donde el heterocielilo se sustituye opcionalmente con oxo)).
88. El metodo de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque Ri y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, C1-8alquilo, C2-8alquenilo, C2-8alquinilo (en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo se sustituyen opcionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en Ci-8alcox¡, alcoxi(C1-8)alquilo, carboxilo, carboxil(Ci-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C-i. 4alquilo), amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C-i. 4alquilo), (halo)1-3, (halo)i-3(Ci-8)alquilo, (halo)i-3(Ci.8)alcoxi, hidroxi, h¡droxi(C-|. 8)alquilo y oxo), C-i-8alcoxi, Ci-8alcoxicarbonilo, (halo)i-3(Ci-8)alcoxi, Ci-8alquiltio, arilo, heteroarilo (en donde el arilo y heteroarilo se sustituyen opcionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en Ci-8alquilo, C1-8alcoxi, alcoxi(C1-8)alquilo, carboxilo, carboxil(C1-8)alquilo, amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y Ci-4alquilo), amino(Ci-8)alquilo (en donde el amino se sustituye con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C1-4alquilo), halógeno, (halo)1-3(Ci-8)alquilo, (halo)i. 3(Ci-8)alcoxi, hidroxi e hidroxi(C1_8)alquilo), amino (sustituido con un sustituyente seleccionado independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y C1-4alquilo), ciano, halógeno, hidroxi y nitro; y sales farmaceuticamente aceptables de estos.
89. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 6,7,9,10,12,13,15,16-octahidro-23H-5,26:17,22-dimeteno-5H-dipirido[2,3-k:3',2'-q]pirrol[3,4-n][1,4,7,10,19]trioxadiazacicloheneicosino-23,25(24H)-diona.
90. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 10,11 ,13,14, 16,17, 19, 20,22, 23-decahidro-9, 4:24, 29-dimeteno-1H-dip¡rido[2,3-n:3',2'-t]pirrol[3,4-q][1 ,4,7,10,13,22]tetraoxadiazaciclotetracosino-1,3(2H)-diona.
91. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 10,11,13,14,16,17,19,20,22,23,25,26-dodecahidro-9,4:27,32-dimeteno-1H-dip¡rido[2,3-q:3',2'-w]pirrolo[3,4-t][1 ,4,7,10,13,16,25]pentaoxadiazacicloheptacosino-1 ,3(2H)-diona.
92. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 6,7,9,10,12,13-hexahidro-20H-5,23:14,19-dimeteno-5H-dibenzo[h,n]pirrol[3,4-k][1,4,7,16]dioxadiazaciclooctadecino-20,22(21 H)-diona.
93. El metodo de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 6,7,9,10,12,13,15,16-octahidro-23H-5,26:17,22-dimeteno-5H-dibenzo[k,q]pirrol[3,4-n][1,4,7,10,19]thoxadiazacicloheneicosino-23,25(24FI)-diona.
94. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 10,11 ,13,14,16,17,19, 20,22, 23-decahidro-9, 4:24, 29-dimeteno-1 H-dibenzo[n,t]pirrol[3,4-q][1,4,7,10,13,22]tetraoxadiazaciclotetracosino-1,3(2H)-diona.
95. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es el Compuesto 1a.
96. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-[3-[(2-hidroxietil)metilamino]propil]-1 H-indazol-3-il]-4-[1 -(3-piridinil)-1 H-indol-3-il]- I H-pirrol-2,5-diona.
97. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3,5-dicloro-N-[3-cloro-4-[(3,4,12,12a-tetrahidro-1 I-[1,4]tiazino[3,4-c][1,4]benzodiazepin- I I (6FI)-il)carbonil]fenil]-benzam¡da.
98. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-(2-hidroxi-etil)-1 H-indol-3-il]-4-(1-piridin-3-il-1 H-indol-3-il) pirrol-2,5-diona.
99. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-(2-metoxi-fenil)-4-(1-piridin-3-il-1 H-indol-3-¡l)-pirrol-2,5-diona.
100. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 6-[[2-[[4-(2l4-diclorofenil)-5-(4-metil-1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]amino]-3-piridinacarbonitrilo.
101. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-(5-cloro-1 -metil-1 H-indol-3-il)-4-[1 -(3-imidazol-1 -il-propil)-1 H-indazol-3-il]-pirrol-2,5-diona.
102. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-(5-cloro-1 -metil-1 H-indol-3-il)-4-[1 -(3-[1 ,2,3]triazol-1 -il-propil)-1 H-indazol-3-il]-pirrol-2,5-diona.
103. El método de conformidad con conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-(3-hidroxi-propil)-1 H-pirrol[2,3-b]piridin-3-il]-4-(1 -metil-1 H-pirazol-3-il)-plrrol-2,5-diona.
104. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es el Compuesto 10a.
105. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-(3-hidroxi-3-metil-butil)-1 H-indazol-3-il]-4-(1 -piridin-3-il-1 H-indol-3-il)-pirrol-2,5-diona.
106. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-(2-hidroxi-etil)-1 H-indazol-3-il]-4-(1 -pir¡mid¡n-5-¡l-1 H-indol-3-il)-pirrol-2,5-diona.
107. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-(2-hidroxi-etil)-1 H-indol-3-il]-4-(1-pirimidin-5-il-1H-indol-3-il)-pirrol-2,5-diona.
108. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es (11Z)- 8,9,10,13,14,15-hexahidro-2,6:17,21-di(meteno)pirrol[3,4-h][1 ,15,7]dioxazaciclotricosino-22,24(1 FI,23H)-diona.
109. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-(5-cloro-1-piridin-3-il-1 H-indol-3-il)-4-[1-(3-hidroxi-propil)-1 H-indazol-3-il]-pirrol-2,5-diona.
110. El metodo de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-(2-metoxi-fenil)-4-[1-(3-metoxi-propil)-1 H-pirrol[3,2-c]piridin-3-il]-pirrol-2,5-diona.
111. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-(3-hidroxi-propil)-1 H-indazol-3-il]-4-[1 -(tetrahidro-piran-4-il)-1 H-indol-3-il]-pirrol-2,5-diona.
112. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 2-{3-[4-(5-cloro-1-metil-1 H-indol-3-il)-2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-3-il]-indaz:ol-1 -il}-N-(2-hidroxi-etil)-acetamida.
113. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 4-(3-cloro-fenil)-6-(3-dimetilamino-prop¡l)-5,6-dihidro-4H-2,4,6-triaza-ciclopenta[c]flúor-1,3-diona.
114. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 14-etil- 6.7.9.10.13.14.15.16-octahidro-12H,23H-5,26:17,22-dimetenodibenzo[k,q]pirrol[3,4-n][1, 4,7, 10,19]dioxatriazacicloheneicosino-23,25(24H)-diona.
115. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 14-benzil- 6.7.9.10.13.14.15.16-octahidro-12H ,23H-5,26: 17,22- di(meteno)dibenzo[k,q]pirrol[3,4-n][1 ,4,7,10,19]d¡oxatriazacicloheneicosino-23,25(24H)-d¡ona.
116. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-(1-{2-[2-(2-hidroxi-etoxi)-etoxi]-etil}-1 H-indol-3-il)-4-[1 -(2-hidroxi-etil)-1 H-indol-3-il]-pirrol-2,5-diona.
117. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 6,7,8,9,10,11 ,12,13-octahidro-8,11 -dimetil-5, 23: 14,19-dimeteno-20H-dibenzo[k,q]pirrol[3,4-n][1 ,4,7, 10]tetraazaciclooctadecino-20, 22(21 H)-diona.
118. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 7,8,9,10,12,13,16,17,18,19-decahidro-8,17-dimetil-15H,26H-5,29:20,25-dimeteno-6H-dibenzo[k,q]pirrol[3,4-n][1 ,4,7, 10,19,22]dioxatetraazaciclotetracosino-26,28(27H)-diona.
119. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 14-(2-furilmetil)-6,7,9,10,13,14,15,16-octahidro-12H,23H-5,26:17,22-di(meteno)dibenzo[k,q]pirrol[3,4-n][1 ,4,7,10,19]dioxatriazacicloheneicosino-23,25(24H)-diona.
120. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 14-(2-tienilmetil)-6,7,9, 10,13,14,15,16-octahidro-12H ,23H-5,26: 17,22- di(meteno)dibenzo[k,q]pinOl[3,4-n][1,4,7,10,19]dioxatriazacicloheneicosino- 23,25(24H)-diona.
121. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 14-(1-naftilmetil)-6,7,9, 10,13, 14, 15,16-octahidro-12H,23H-5,26: 17,22-di(meteno)dibenzo[k,q]pirrol[3,4-n][1 ,4,7,10,19]dioxatriazacicloheneicosino-23,25(24H)-diona.
122. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 14-(piridin-4-ilmetil)-6,7,9, 10,13,14,15,16-octahidro-12H,23H-5,26: 17,22-d¡(meteno)dibenzo[k,q]pirrol[3,4-n][1 ,4,7,10,19]dioxatriazacicloheneicosino- 23,25(24H)-diona.
123. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-(2-{2-[2-(1,2,3,4-tetrah¡dro-naftalen-1-ilamino)-etoxi]-etoxi}-etil)-1 H-indol-3-il]-4-{1-[2-(1,2,3,4-tetrahidro-naftalen-1-ilamino)-etil]-1 H-indol-3-il}-pirrol-2,5-diona.
124. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[1-(3-dimetilamino-fenil)-1 H-indol-3-il]-4-[1 -(2-hidroxi-etil)-1 H-indazol-3-il]-pirrol-2,5-diona.
125. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es 3-[5-cloro- 1 -(6-dimetilamino-pir¡din-3-il)-1 H-indol-3-il]-4-[1 -(2-hidroxi-et¡I)-1 H-indazol-3-¡l]-pirrol-2,5-d¡ona.
126. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto de la Fórmula (III) es éster metílico del ácido 5-(5-cloro-3-{4-[1-(2-hidroxi-etil)-1H-indazol-3-il]-2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-3-il}-indol-1 -il)-nicotinico.
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