WO2021006268A1 - ジヒドロインドリジノン誘導体を用いたインスリン産生細胞の作製法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for producing insulin-producing cells from pluripotent stem cells by three-dimensional culture.
- Diabetes is a serious disease that develops against the background of various genetic factors and environmental factors, and as a result of chronic hyperglycemia causing complications such as nephropathy, the QOL of patients is significantly reduced.
- the number of diabetic patients in the world exceeds 400 million, which is regarded as a problem in terms of medical economy.
- Diabetes is broadly classified into type 1 and type 2 diabetes, and in any of the pathological conditions, the loss of pancreatic ⁇ -cells having an insulin secretory function is a major cause.
- Insulin preparations are a common treatment for type 1 diabetes and serious type 2 diabetes with marked loss of pancreatic ⁇ cells, but side effects such as hypoglycemia and frequent self-injection are required. There are many problems such as being said.
- pancreatic islet cells isolated from organ donors In recent years, it has become possible to transplant pancreatic islet cells isolated from organ donors to type 1 diabetic patients, and it is expected as a therapeutic method that can replace insulin treatment and enable complete remission of diabetes.
- pancreatic islet cells isolated from organ donors since it is difficult to disseminate it due to the shortage of islet donors, it is desired to quickly realize a technique for producing a large amount of insulin-producing cells from pluripotent stem cells.
- Patent Document 1 Non-Patent Document 1, 2, 3, 4, 5
- insulin-producing cells can be produced from human iPS cells through a stepwise 5-step differentiation step.
- iPS cells are grown in a maintenance medium, and then in stage 1, they are cultured in a medium containing activin A or the GSK3 ⁇ inhibitor CHIR99201 for several days to induce Sox17-positive embryonic embryonic cells.
- stage 2 germ layer cells in the embryo are treated with FGF10 and the sonic hedgehog inhibitor KAAD-cyclopamine for several days to induce Foxa2-positive primitive intestinal cells.
- stage 3 primordial intestinal cells are treated with a medium containing retinoic acid, KAAD-cyclopamine, the TGF ⁇ receptor kinase inhibitor SB431542 and the BMP signal inhibitor Noggin for several days to induce differentiation into PDX1-positive pancreatic progenitor cells. ..
- pancreatic progenitor cells are stimulated with protein kinase C activator Indractam V, TGF ⁇ receptor kinase inhibitor ALK5 inhibitor II, and Noggin to induce Ngn3-positive pancreatic endocrine progenitor cells.
- insulin-producing cells are obtained by culturing pancreatic endocrine progenitor cells in a medium containing a GLP-1 receptor agonist or nicotine amide for several days.
- the small molecule inhibitor LDN193189 may be used instead of Noggin used in the above-mentioned differentiation culture, and SANT-1 (Non-Patent Documents 2 and 6) and Dorsomorphin may be used instead of KAAD-cyclopamine (Non-Patent Document 5). .. Further, in the final step of differentiation culture, Forskolin or Dexamethasone may be used as a differentiation inducer (Non-Patent Document 5).
- Non-Patent Document 3 the AXL inhibitor R428 promotes the functional maturation of insulin-producing cells
- AKT inhibitor AT7867 is a compound that promotes the proliferation of PDX-1 positive pancreatic progenitor cells.
- An object of the present invention is to provide a means for achieving high efficiency of differentiation of stem cells into insulin-producing cells, which was difficult with conventional techniques.
- the present inventors have found that the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof has a remarkable effect of promoting the induction of differentiation of pluripotent stem cells into insulin-producing cells. , They found that these compounds or salts thereof were useful for the production of insulin-producing cells, and completed the present invention.
- the compound represented by the general formula (I) has a novel structure completely different from that of known differentiation inducers, and is further added to known differentiation-promoting compounds and growth factors in the latter step of the differentiation process. It has the effect of increasing the efficiency of differentiation induction.
- the present invention relates to [1] to [21] described below.
- [1] A method for producing insulin-producing cells by differentiating pluripotent stem cells into insulin-producing cells, wherein the general formula (I)
- each substituent is defined as follows.
- R 1 Hydrogen atom, halogen atom, or C1-C6 alkyl group
- R 2 Hydrogen atom, or C1-C6 alkyl group
- R 3 Substituted with 1 to 4 substituents independently selected from the substituent group ⁇ It may be an aryl group, which is independently selected from the substituent group ⁇ . It is independently selected from a C5-C10 cycloalkoxy group which may be substituted with 1 to 4 substituents, or a substituent group ⁇ .
- the carbamoyl group is substituted with a substituted C1-C6 alkoxy group, a sulfamoyl group substituted with one or two C1-C6 alkyl groups, and 1 to 4 substituents independently selected from the substituent group ⁇ .
- Benoxyl group substituents optionally substituted with ⁇ halogen atom, C1-C6 alkyl group, C1-C6 alkoxy group, halogeno C1-C6 alkyl group, halogeno C1-C6 alkoxy group, and (C1-C6 alkoxy).
- each substituent is defined as follows. - and *: indicates a bond, - is attached to the nitrogen atom of the amide group of the general formula (I), * is attached to R 3 R 4: a hydrogen atom, C1-C6 alkyl group, a halogeno C1-C6 alkyl Group or (C1-C6 alkoxy) carbonyl group R 5 : hydrogen atom, halogen atom, or C1-C6 alkyl group Y: N or CH)]
- a method for producing insulin-producing cells which comprises a step of three-dimensionally culturing cells in a medium containing the compound represented by (1) or a salt thereof.
- R 3 in the compound represented by the general formula (I) is a naphthyl group, a 1,3-benzodioxolyl group, a 2,2-dihalogeno-1,3-benzodioxolyl group, a C5-C10 cycloalkenyl group, It is substituted with a phenyl group which may be substituted with one or two substituents independently selected from the substituent group ⁇ 1 or one or two substituents independently selected from the substituent group ⁇ 1.
- Substituent group ⁇ 1 Halogen atom, cyano group, carboxy group, phenoxy group, benzoyl group, C1-C6 alkyl group, C1-C6 alkoxy group, halogeno C1-C6 alkyl group, halogeno C1-C6 alkoxy group, hydroxy C1-C6 Alkyl group, C1-C6 alkoxy C1-C6 alkoxy group, (C1-C6 alkyl) carbonyl group, (C1-C6 alkoxy) carbonyl group, (C1-C6 alkoxy) carbonyloxy group, phenyl C1-C6 alkoxy group, 5 or 6-membered ring non-aromatic heterocyclyl group, carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C6 alkyl groups, carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C6 alkyl groups C1-C6 alkoxy group, sulfamo
- Phenyl group substituent group ⁇ 1 Halogen atom, C1-C6 alkyl group, C1-C6 alkoxy group, and (C1-C6 alkoxy) carbonyl group [3]
- R 3 in the compound represented by the general formula (I) is a naphthyl group, a 1,3-benzodioxolyl group, a 2,2-dihalogeno-1,3-benzodioxolyl group, a C5-C10 cycloalkenyl group, It is substituted with a phenyl group which may be substituted with one or two substituents independently selected from the substituent group ⁇ 2, or with one or two substituents independently selected from the substituent group ⁇ 2.
- Substituent group ⁇ 2 Halogen atom, cyano group, carboxy group, phenoxy group, benzoyl group, C1-C6 alkyl group, C1-C6 alkoxy group, halogeno C1-C6 alkyl group, halogeno C1-C6 alkoxy group, hydroxy C1-C6 Alkyl group, C1-C6 alkoxy C1-C6 alkoxy group, (C1-C6 alkyl) carbonyl group, (C1-C6 alkoxy) carbonyl group, (C1-C6 alkoxy) carbonyloxy group, phenyl C1-C6 alkoxy group, 5 or 6-membered ring non-aromatic heterocyclyl group, carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C6 alkyl groups, carbamo
- R 3 in the compound represented by the general formula (I) is a naphthyl group, a 1,3-benzodioxolyl group, a 2,2-difluoro-1,3-benzodioxolyl group, a C5-C8 cycloalkene-1.
- Substituent group ⁇ 3 halogen atom, cyano group, carboxy group, phenoxy group, benzoyl group, C1-C4 alkyl group, C1-C4 alkoxy group, halogeno C1-C2 alkyl group, halogeno C1-C2 alkoxy group, hydroxy C1-C4 Alkoxy group, C1-C2 alkoxy C1-C2 alkoxy group, (C1-C4 alkyl) carbonyl group, (C1-C4 alkoxy) carbonyl group, (C1-C4 alkoxy) carbonyloxy group, phenyl C1-C4 alkoxy group, morpholin- 1-yl group A carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C4 alkyl groups C1-C2 substituted with a carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C4 alkyl groups Alkoxy group, sulfamoyl group substituted
- Group ⁇ 3 Fluorine atom, chlorine atom, C1-C4 alkyl group, and C1-C4 alkoxy group
- Substituent group ⁇ 3 Halogen atom, C1-C4 alkyl group, C1-C4 alkoxy group, (C1-C4 alkyl) carbonyl group, And (C1-C4 alkoxy) carbonyl group
- R 1 in the compound represented by the general formula (I) is a hydrogen atom, a chlorine atom, or a methyl group. Law.
- [6] The method for producing an insulin-producing cell according to any one of [1] to [5], wherein R 2 in the compound represented by the general formula (I) is a hydrogen atom or a methyl group.
- a in the compound represented by formula (I) is a group represented by the formula (i)
- R 4 is a hydrogen atom, C1-C6 alkyl group, a halogeno C1-C6 alkyl or (C1-C6,
- R 4 is a hydrogen atom in the compound represented by formula (I), method of producing insulin-producing cells according to [7], which is a methyl group or a trifluoromethyl group.
- a in the compound represented by formula (I) is a group represented by the formula (ii)
- R 5 is characterized in that hydrogen atom, a halogen atom or a C1-C6 alkyl group, [1 ] To [6].
- the method for producing insulin-producing cells according to any one of the following items.
- a in the compound represented by formula (I) is a group represented by the formula (iii), characterized in that R 5 is a hydrogen atom, a fluorine atom or a methyl group, [1] - [ The method for producing insulin-producing cells according to any one of 6].
- [12] The method for producing an insulin-producing cell according to any one of [1] to [6], wherein A in the compound represented by the general formula (I) is a group represented by the formula (iv). .. [13] The method for producing insulin-producing cells according to any one of [1] to [12], wherein n in the compound represented by the general formula (I) is 1.
- R 3 is a 2,2-difluoro-1,3-benzodioxoryl group, 1-tert-butoxycarbonyl-3,6-dihydro-2H-pyridine-4-yl.
- R 3 Independently selected from the group consisting of a group or a group consisting of a fluorine atom, a chlorine atom, a trifluoromethyl group, a tert-butoxy group, a trifluoromethoxy group, a 2,2,2-trifluoroethoxy group, a benzyloxy group, and a phenoxy group.
- R 3 in the compound represented by the general formula (I) is a phenyl group or a fluorine atom, a chlorine atom, a trifluoromethyl group, a tert-butoxy group, a trifluoromethoxy group, a 2,2,2-trifluoroethoxy group and a benzyl. Any one of [1] to [13], which is a phenyl group whose m-position or p-position is substituted with any one substituent selected from the group consisting of an oxy group and a phenoxy group.
- the differentiation process from pluripotent stem cells to insulin-producing cells includes the following steps 1 to 5, and is represented by the general formula (I) in at least one step selected from the group consisting of steps 3, 4, and 5.
- Step 1 From pluripotent stem cells into the embryo body The process of inducing germ layer cells, Step 2: Inducing primitive intestinal cells from germ layer cells in the embryo. Step 3: Inducing pancreatic progenitor cells from primitive intestinal cells, Step 4: Induce pancreatic endocrine progenitor cells from pancreatic progenitor cells, and Step 5: Induce insulin-producing cells from pancreatic endocrine progenitor cells.
- Step 1 From pluripotent stem cells into the embryo body The process of inducing germ layer cells, Step 2: Inducing primitive intestinal cells from germ layer cells in the embryo.
- Step 3 Inducing pancreatic progenitor cells from primitive intestinal cells
- Step 4 Induce pancreatic endocrine progenitor cells from pancreatic progenitor cells
- Step 5 Induce insulin-producing cells from pancreatic endocrine progenitor cells.
- a therapeutic agent for a disease caused by abnormal insulin secretion or deficiency of insulin secretion which comprises insulin-producing cells derived from pluripotent stem cells produced by the method according to any one of [1] to [21].
- the therapeutic agent according to [23], wherein the disease caused by abnormal insulin secretion or insulin secretion deficiency is type 1 diabetes or type 2 diabetes.
- the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof has a remarkable effect in differentiating pluripotent stem cells derived from mammals into insulin-producing cells, as compared with known differentiation-inducing methods. Therefore, the method of the present invention using this compound can efficiently produce insulin-producing cells. Further, since the method of the present invention cultivates cells three-dimensionally, it is possible to cultivate cells in an environment closer to the living body as compared with the two-dimensional culturing method.
- Ff-I01s01 was used and cultured under differentiation protocol # 2.
- K-1 and its derivatives promote the differentiation of human iPS cell-derived ⁇ cells.
- Halogen atom Fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, or iodine atom.
- C1-C6 alkyl group A linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, specifically, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, or an isobutyl group.
- Aryl group A monocyclic or bicyclic aromatic carbocycle having 6 to 10 carbon atoms, which may be condensed with a non-aromatic heterocycle or cycloalkane. Specifically, for example, a phenyl group, a naphthyl group, a tetralinyl group, an indanyl group, a chromanyl group, a 2,3-dihydrobenzofuranyl group, a 1,3-benzodioxolyl group, a 2,3-dihydro-1, 4-Benzodioxynyl group, 1,2,3,4-tetrahydroquinolinyl group, 1,2,3,4-tetrahydroisoquinolinyl group, indolinyl group, or 3,4-dihydro-2H-1 , 4-benzoxazinyl group, etc.
- C5-C10 cycloalkenyl group A hydrocarbon ring having one double bond in a ring having 5 to 10 carbon atoms, which may be crosslinked with an alkylene group.
- cyclo examples thereof include a pentenyl group, a cyclohexenyl group, a cycloheptenyl group, a cyclooctenyl group, a bicyclo [2.2.1] heptenyl group, a bicyclo [2.2.2] octenyl group and the like.
- Heterocyclyl group A group of 4 to 10-membered rings in which the atoms constituting the ring are composed of 1 to 4 heteroatoms independently selected from nitrogen, oxygen and sulfur in addition to carbon, and are aromatic or aromatic. It may be non-aromatic, and in the case of non-aromatic, it may be crosslinked by an alkylene group.
- non-aromatic heterocyclyl groups azetidinyl group, pyrrolidinyl group, piperidinyl group, azepanyl group, diazepanyl group, azocanyl group, piperazinyl group, homopiperazinyl group, morpholinyl group, oxazepanyl group, thiomorpholinyl group, thiazepanyl group, Tetrahydropyranyl group, tetrahydrofuryl group, dioxanyl group, dioxolanyl group, 2-azabicyclo [2.2.1] heptyl group, 2,5-diazabicyclo [2.2.1] heptyl group, 3-azabicyclo [3.2] .1] Octyl group, 8-azabicyclo [3.2.1] octyl group, 9-azabicyclo [3.3.1] nonyl group, 3,9-diazabicyclo [3.3.1] nonyl group
- Aromatic heterocyclyl groups include frill group, pyrrolyl group, thienyl group, oxazolyl group, thiazolyl group, imidazolyl group, pyrazolyl group, oxadiazolyl group, thiadiazolyl group, triazolyl group, tetrazolyl group, pyridyl group, pyrazil group, pyrimidyl group and pyridadinyl group. , Triazinyl group, indrill group, isoindrill group, indazolyl group, prynyl group, quinolyl group, isoquinolyl group, naphthyldinyl group and the like.
- C1-C6 alkoxy group A group in which the C1-C6 alkyl group is bonded to an oxygen atom. Specifically, for example, a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an isopropoxy group, or an n-butoxy group. , Se-butoxy group, isobutoxy group, tert-butoxy group, pentyloxy group, isopentyloxy group, neopentyloxy group, hexyloxy group, isohexyloxy group and the like.
- Halogeno C1-C6 alkyl group A group in which the C1-C6 alkyl group is substituted with 1 to 7 halogen atoms. Specifically, for example, a trifluoromethyl group, a difluoromethyl group, 1,1-. It may be a difluoroethyl group, a 2,2-difluoroethyl group, or a 2,2,2-trifluoroethyl group.
- Halogeno C1-C6 alkoxy group A group in which the C1-C6 alkoxy group is substituted with 1 to 7 of the halogen atoms. Specifically, for example, a fluoromethoxy group, a difluoromethoxy group, or a dichloromethoxy group.
- Dibromomethoxy group Dibromomethoxy group, trifluoromethoxy group, trichloromethoxy group, 2-fluoroethoxy group, 2-bromoethoxy group, 2-chloroethoxy group, 2-iodoethoxy group, 2,2-difluoroethoxy group, 2,2 2-Trifluoroethoxy group, 2,2,2-trichloroethoxy group, pentafluoroethoxy group, 3-fluoropropoxy group, 3-chloropropoxy group, 4-fluorobutoxy group, 5-fluoropentyloxy group, or 6- Fluorohexyloxy group and the like.
- Hydroxy C1-C6 alkyl group A group in which one hydroxy group is substituted on the C1-C6 alkyl group. Specifically, for example, a hydroxymethyl group, a hydroxyethyl group, a hydroxypropyl group, or a hydroxybutyl group. , Hydroxypentyl group, or hydroxyhexyl group.
- C1-C6 Alkoxy C1-C6 Alkoxy Group A group in which the C1-C6 alkoxy group is substituted with the C1-C6 alkoxy group. Specifically, for example, a methoxymethoxy group, a methoxyethoxy group, or a methoxypropoxy group. , Ethoxymethoxy group, ethoxyethoxy group, ethoxypropoxy group, propoxypropoxy group and the like.
- (C1-C6 alkyl) carbonyl group A group in which the C1-C6 alkyl group is bonded to a carbonyl group, specifically, for example, an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, an isobutyryl group, a pivaloyl group, or the like. Can be mentioned.
- (C1-C6 alkoxy) carbonyl group A group in which the C1-C6 alkoxy group is bonded to a carbonyl group. Specifically, for example, a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, an n-propoxycarbonyl group, or an isopropoxy.
- (C1-C6 alkoxy) carbonyloxy group A group in which the C1-C6 alkoxy group is bonded to a carbonyloxy group. Specifically, for example, a methoxycarbonyloxy group, an ethoxycarbonyloxy group, or an n-propoxycarbonyl.
- Oxy group isopropoxycarbonyloxy group, n-butoxycarbonyloxy group, isobutoxycarbonyloxy group, sec-butoxycarbonyloxy group, tert-butoxycarbonyloxy group, n-pentyloxycarbonyloxy group, isopentyloxycarbonyloxy group , Neopentyloxycarbonyloxy group, n-hexyloxycarbonyloxy group, isohexyloxycarbonyloxy group and the like.
- Phenyl C1-C6 alkoxy group A group in which a phenyl group is substituted at an arbitrary position of the C1-C6 alkoxy group. Specifically, for example, a benzyloxy group, a 1-phenylethyloxy group, or a 2-phenyl group. Ethyloxy group, 1-phenylpropyloxy group, 2-phenylpropyloxy group, 3-phenylpropyloxy group and the like can be mentioned.
- Carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C6 alkyl groups A carbamoyl group or a group in which one or two of the C1-C6 alkyl groups are bonded to a carbamoyl group, specifically. Is, for example, a carbamoyl group, a methylcarbamoyl group, a dimethylcarbamoyl group, an ethylcarbamoyl group, a diethylcarbamoyl group, an ethylmethylcarbamoyl group, a propylcarbamoyl group, or a dipropylcarbamoyl group.
- C1-C6 alkoxy group substituted with a carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C6 alkyl groups the C1-C6 alkoxy group substituted with the one or two C1-C6 alkyl groups.
- the carbamoyl group may be substituted, and specifically, for example, carbamoylmethyloxy group, carbamoylethyloxy group, methylcarbamoylmethyloxy group, methylcarbamoylethyloxy group, dimethylcarbamoylmethyloxy group, dimethyl.
- Carbamoyl ethyloxy group ethyl carbamoyl methyloxy group, ethyl carbamoyl ethyloxy group, diethyl carbamoyl methyloxy group, diethyl carbamoyl ethyloxy group, ethyl methyl carbamoyl methyl oxy group, ethyl methyl carbamoyl ethyl oxy group, propyl carbamoyl methyl oxy group, propyl Carbamoylethyloxy group, dipropylcarbamoylmethyloxy group, dipropylcarbamoylethyloxy group and the like.
- “Sulfamoyl group substituted with one or two C1-C6 alkyl groups” A group in which one or two of the C1-C6 alkyl groups are bonded to a sulfamoyl group, specifically, for example, methyl sulfamoyl. Group, dimethylsulfamoyl group, ethylsulfamoyl group, ethylmethylsulfamoyl group, diethylsulfamoyl group, propylsulfamoyl group, dipropylsulfamoyl group and the like.
- C1-C4 alkyl group A linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, specifically, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, or an isobutyl group. , The sec-butyl group, or the tert-butyl group.
- C1-C4 alkoxy group A group in which the C1-C4 alkyl group is bonded to an oxygen atom. Specifically, for example, a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an isopropoxy group, or an n-butoxy group. , The sec-butoxy group, the isobutoxy group, or the tert-butoxy group.
- C1-C2 alkyl group A linear alkyl group having 1 or 2 carbon atoms, which is a methyl group and an ethyl group.
- Halogeno C1-C2 alkyl group A group in which the C1-C2 alkyl group is substituted with 1 to 5 halogen atoms. Specifically, for example, a trifluoromethyl group, a difluoromethyl group, 1,1-. It may be a difluoroethyl group, a 2,2-difluoroethyl group, or a 2,2,2-trifluoroethyl group.
- C1-C2 alkoxy group A group in which the C1-C2 alkyl group is bonded to an oxygen atom, specifically, a methoxy group and an ethoxy group.
- Halogeno C1-C2 alkoxy group A group in which the C1-C2 alkoxy group is substituted with 1 to 5 of the halogen atoms. Specifically, for example, a fluoromethoxy group, a difluoromethoxy group, or a dichloromethoxy group.
- Dibromomethoxy group Dibromomethoxy group, trifluoromethoxy group, trichloromethoxy group, 2-fluoroethoxy group, 2-bromoethoxy group, 2-chloroethoxy group, 2-iodoethoxy group, 2,2-difluoroethoxy group, 2,2 It is a 2-trifluoroethoxy group, a 2,2,2-trichloroethoxy group, a pentafluoroethoxy group, or the like.
- HydroxyC1-C4 alkyl group A group in which one hydroxy group is substituted on the C1-C4 alkyl group. Specifically, for example, a hydroxymethyl group, a hydroxyethyl group, or a hydroxypropyl group or hydroxybutyl. Group and so on.
- C1-C2 Alkoxy C1-C2 Alkoxy Group A group in which the C1-C2 alkoxy group is substituted with the C1-C2 alkoxy group. Specifically, for example, a methoxymethoxy group, a methoxyethoxy group, or an ethoxymethoxy group. , Or an ethoxyethoxy group.
- (C1-C4 alkyl) carbonyl group A group in which the C1-C4 alkyl group is bonded to a carbonyl group, specifically, for example, an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, an isobutyryl group, a pivaloyl group, or the like. Can be mentioned.
- (C1-C4 alkoxy) carbonyl group A group in which the C1-C4 alkoxy group is bonded to a carbonyl group. Specifically, for example, a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, an n-propoxycarbonyl group, or an isopropoxy. Examples thereof include a carbonyl group, an n-butoxycarbonyl group, an isobutoxycarbonyl group, a sec-butoxycarbonyl group, a tert-butoxycarbonyl group and the like.
- (C1-C4 alkoxy) carbonyloxy group A group in which the C1-C4 alkoxy group is bonded to a carbonyloxy group. Specifically, for example, a methoxycarbonyloxy group, an ethoxycarbonyloxy group, or an n-propoxycarbonyl. Examples thereof include an oxy group, an isopropoxycarbonyloxy group, an n-butoxycarbonyloxy group, an isobutoxycarbonyloxy group, a sec-butoxycarbonyloxy group, and a tert-butoxycarbonyloxy group.
- Phenyl C1-C4 alkoxy group A group in which a phenyl group is substituted at an arbitrary position of the C1-C4 alkoxy group. Specifically, for example, a benzyloxy group, a 1-phenylethyloxy group, or a 2-phenyl group. Ethyloxy group, 1-phenylpropyloxy group, 2-phenylpropyloxy group, 3-phenylpropyloxy group and the like can be mentioned.
- Carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C4 alkyl groups A carbamoyl group or a group in which one or two of the C1-C4 alkyl groups are bonded to a carbamoyl group, specifically. Is, for example, a carbamoyl group, a methylcarbamoyl group, a dimethylcarbamoyl group, an ethylcarbamoyl group, a diethylcarbamoyl group, an ethylmethylcarbamoyl group, a propylcarbamoyl group, or a dipropylcarbamoyl group.
- C1-C2 alkoxy group substituted with a carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C4 alkyl groups the C1-C2 alkoxy group substituted with the one or two C1-C4 alkyl groups.
- the carbamoyl group may be substituted, and specifically, for example, carbamoylmethyloxy group, carbamoylethyloxy group, methylcarbamoylmethyloxy group, methylcarbamoylethyloxy group, dimethylcarbamoylmethyloxy group, dimethyl.
- Carbamoyl ethyloxy group ethyl carbamoyl methyloxy group, ethyl carbamoyl ethyloxy group, diethyl carbamoyl methyloxy group, diethyl carbamoyl ethyloxy group, ethyl methyl carbamoyl methyl oxy group, ethyl methyl carbamoyl ethyl oxy group, propyl carbamoyl methyl oxy group, propyl Carbamoylethyloxy group, dipropylcarbamoylmethyloxy group, dipropylcarbamoylethyloxy group and the like.
- “Sulfamoyl group substituted with one or two C1-C4 alkyl groups” A group in which one or two of the C1-C4 alkyl groups are bonded to a sulfamoyl group, specifically, for example, methyl sulfamoyl. Group, dimethylsulfamoyl group, ethylsulfamoyl group, ethylmethylsulfamoyl group, diethylsulfamoyl group, propylsulfamoyl group, dipropylsulfamoyl group and the like.
- “Stem cell” A cell having self-renewal ability and pluripotency, and examples thereof include ES cells, iPS cells, and adult stem cells.
- Pluripotent stem cell A cell having the ability to differentiate into various cells in a living body, preferably an ES cell or an iPS cell.
- Insulin-producing cells cells that secrete insulin in response to hyperglycemia, etc., and have superior insulin expression capacity compared to other pancreatic hormones such as glucagon or somatostatin.
- Three-dimensional culture By culturing under conditions where cells do not adhere to the culture vessel, the cells are cultured in a sphere (also called “embryoid body” in pluripotent stem cells) formed by adhesion between cells. In this specification, it may be referred to as "sphere culture”.
- the present invention is a method for producing insulin-producing cells by differentiating pluripotent stem cells into insulin-producing cells, in which the cells are three-dimensionally cultured in a medium containing the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof.
- a method for producing an insulin-producing cell which comprises a step. The effect of promoting the differentiation of the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof into insulin-producing cells can be confirmed by the methods of Reference Example 1 and Example 1 described later.
- various stem cells can be adopted as long as they have the ability to differentiate into endoblast cells, but are preferably ES cells or iPS cells, and more preferably iPS cells.
- various mammals can be adopted, but preferably, pet animals such as humans, mice, rats, dogs and cats, cows, horses, pigs, sheep and the like. Domestic animals, more preferably humans.
- stage 1 in which Sox17-positive embryonic embryo cells are induced from pluripotent stem cells
- stage 2 in which Foxa2-positive primitive intestinal cells are induced from embryonic embryonic cells
- PDX1-positive pancreatic progenitor cells from primitive intestinal cells.
- Stage 3 is induced
- stage 4 in which Ngn3-positive pancreatic endocrine progenitor cells are induced from pancreatic progenitor cells
- stage 5 in which insulin-producing cells are finally induced from pancreatic endocrine progenitor cells.
- stage 1 is further subdivided into the state of mesoendoderm cells, and then stage 1-2, in which endoderm cells are induced, and stage 2 is the concentration of zinc in the differentiation medium.
- stage 2-1 and stage 2-2 may be further subdivided, and stage 5 may be further subdivided into stage 5-1 and stage 5-2 due to the difference in retinoic acid concentration in the differentiation medium.
- the display of the differentiation stage of a cell may be indicated by these stages.
- the medium used for these cultures is not particularly limited as long as it is a medium used for normal cell culture, and various media can be used.
- DMEM medium ⁇ -MEM medium, RPMI medium, StemFit medium.
- Essential8 ThermoFisher, A151001
- TeSR1 TeSR1
- NutriStem Step, 01-0005
- CMRL ThermoFisser, etc.
- Serum may be added to the medium, and serum substitutes such as KO-Serum and B-27 supplements can be added to the serum-free medium for use.
- the medium contains saccharides such as glucose, antioxidants such as ⁇ -mercaptoethanol and vitamin C, various amino acids such as essential amino acids and non-essential amino acids (NEAA), and various metals such as Ca 2+ , Mg 2+ , and Zn 2+.
- various culture aids used in normal cell culture such as an ion source and various growth factors such as EGF, FGF, KGF, and IGF, may be added.
- methionine-removed or reduced medium uses pluripotent stem cells for short-term (eg, 1 hour, 5 hours, 10 hours, 24 hours, etc.) culture treatment to induce differentiation of the treated cells.
- the medium in which the zinc ion concentration is reduced for example, 1 ⁇ M or less, preferably 0.5 ⁇ M or less
- the medium in which the zinc ion concentration is reduced is used only in the first half of the differentiation culture step (for example, at least a part of stage 1 or stage 2, preferably.
- the medium in which the concentration of such a specific component is adjusted can be prepared by not adding the desired component or reducing the amount of the desired component based on the information of the known medium composition. It is also possible to obtain a medium containing no desired component and add a specific component to a desired concentration.
- the methionine-reducing or removing medium can be prepared based on, for example, WO2015 / 125662.
- the AKM medium used as the zinc-removing medium in the examples was obtained from Ajinomoto Co., Inc. Bio-Fine Research Institute.
- the differentiation stage progresses by culturing in a medium containing an additive for signal induction suitable for each stage.
- the additives used for the medium of each stage are illustrated below. As such an additive, an appropriate type may be selected and used, or all the additives for the relevant stage may be used. In addition, additives for the front and rear stages may be used.
- stage 1 at least one selected from the activation of activin receptor and Wnt signal is required, and the medium additive used is usually an activin receptor agonist (eg, activin A), activation of WNT signal.
- Factors eg, Wnt proteins such as Wnt3A, GSK3 ⁇ inhibitors (eg, CHIR990221), etc.
- the culture period of stage 1 is 1 to 4 days, preferably 2 to 3 days.
- the GSK3 ⁇ inhibitor may be added throughout the period of stage 1 or may be added only to stage 1-1 and then in stage 1-2 a medium for stage 1 with reduced or no GSK3 ⁇ inhibitor may be used. ..
- An example of a medium for stage 1 is a medium containing 10 to 1000 ng / mL (preferably 100 ng / mL) of activin A and / or 1 to 10 ⁇ M (preferably 3 ⁇ M) of CHIR99021.
- stage 2 activation of the FGF receptor signal is required, and as an additive for the medium to be used, an FGF receptor agonist (for example, FGF10, KGF) or the like is usually used.
- an FGF receptor agonist for example, FGF10, KGF
- a sonic hedgehog inhibitor for example, KAAD-cyclopamine, SANT-l
- the culture period of stage 2 is 1 to 7 days, preferably 2 to 6 days.
- the sonic hedgehog inhibitor may be added throughout the stage 2 period or only in the first half of stage 2.
- stage 2 medium is a medium containing 5 to 500 ng / mL (preferably 50 ng / mL) of FGF10 or KGF and / or 0.05 to 5 ⁇ M (preferably 0.25 ⁇ M) of SANT1.
- Stage 3 requires at least one selected from activation of retinoic acid receptor signal, inhibition of BMP receptor signal, inhibition of sonic hedgehog signal, and activation of FGF receptor signal, addition of the medium used.
- the agents are usually retinoic acid receptor agonists (eg, retinoic acid), sonic hedgehog inhibitors (eg, KAAD-cyclopamine, SANT-l), BMP signal inhibitors (eg, Noggin, LDN193189), protein kinase C.
- An activator eg, indactum V
- a TGF ⁇ receptor kinase inhibitor for example, SB431542 can also be used as an additive.
- stage 3 media include 0.05 to 5 ⁇ M (preferably 0.15 ⁇ M) of SANT1, 0.1 to 10 ⁇ M (preferably 2 ⁇ M) of retinoic acid, and 0.01 to 1 ⁇ M (preferably 0.).
- Stage 4 requires at least one selected from inhibition of BMP receptor signal, inhibition of sonic hedgehog signal, activation of FGF receptor signal, and activation of retinoic acid receptor signal, addition of the medium used.
- a BMP signal inhibitor for example, Noggin, LDN193189
- a sonic hedgehog inhibitor for example, SANT-l
- a protein kinase C activator for example, indolactam V
- a TGF ⁇ receptor kinase inhibitor for example, ALK5 inhibitor II
- the culture period of stage 4 is 1 to 7 days, preferably 2 to 5 days.
- Examples of media for stage 4 are 0.5-50 ⁇ M (preferably 5 ⁇ M) ALK5 inhibitor (Calbiochem, 616452), 0.01-10 ⁇ M (preferably 0.3 ⁇ M) Indlactam V, and 0. Medium containing at least one of 01-1 ⁇ M (preferably 0.1 ⁇ M) LDN193189, 0.05-5 ⁇ M (preferably 0.25 ⁇ M) SANT1, 0.01-1 ⁇ M (preferably 0.1 ⁇ M).
- Retinoic acid 5 to 500 ng / mL (preferably 50 ng / mL) of KGF or FGF10, and 10 to 1000 nMM (preferably 100 nM of LDN193189) containing at least one medium.
- At stage 5 at least one selected from inhibition of TGF ⁇ receptor signal, inhibition of NOTCH signal, activation of thyroid hormone receptor signal, and activation of retinoic acid receptor signal is required and is an additive of the medium to be used.
- TGF ⁇ receptor kinase inhibitor for example, ALK5 inhibitor II
- ⁇ -secretase inhibitor for example, DAPT
- thyroid hormone T3, EGFR agonist for example, EGF
- retinoic acid receptor agonist for example, for example.
- Retinoic acid vitamin C and the like are used.
- a GLP-1 receptor agonist for example, GLP-1 peptide, exendin-4, etc.
- a nicotine amide for example, an adenylyl acid cyclase activator (for example, Forskolin), a glucocorticoid receptor agonist (for example, for example).
- Dexamethasone can also be used.
- the culture period of stage 5 is 5 to 20 days, preferably 7 to 15 days.
- Examples of media for stage 5 are media containing 5 to 500 ng / mL (preferably 50 ng / mL) of exendin 4 and / or 1 to 100 nM (preferably 10 mM) of nicotine amide, 0.5 to 100 ⁇ M (preferably 10 mM).
- ALK5 inhibitor (Calbiochem, 616452) preferably 10 ⁇ M), retinoic acid 0.01-1 ⁇ M (preferably 0.1 ⁇ M), DAPT 1-100 ⁇ M (preferably 10 ⁇ M), 1-500 ng / mL (preferably 33).
- the reduced retinoic acid concentration medium is preferably used in the latter half of stage 5.
- the method for producing insulin-producing cells of the present invention includes a step of three-dimensionally culturing cells in a medium containing a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof.
- a method usually used by those skilled in the art can be appropriately adopted, but a culture method using a low-adhesive or non-adhesive culture container, a stirring culture method, a hanging drop culture method, hydrogel or porous.
- An example of a culture method using a sex scaffold can be used.
- the bottom surface or side surface of a normal culture container may be coated with a polymer-based reagent or the like that inhibits cell adhesion, and the cell adhesion to the substrate is low.
- a culture vessel in which the material is adopted.
- Various shapes can be used for the container, but by using a container with a round bottom, sphere formation of cells can be promoted.
- sphere formation can be promoted by culturing on a shaker. Stirring culture using a spinner flask or a culture reactor can also promote sphere formation and can be adapted to mass culture.
- differentiation of pluripotent stem cells into insulin-producing cells is usually performed by three-dimensional culture over the entire process, but some steps (for example, pluripotent stem cells to endoplasmic reticulum).
- steps for example, pluripotent stem cells to endoplasmic reticulum.
- Inducing embryonic cells inducing primitive intestinal cells from embryonic embryonic cells, inducing pancreatic precursor cells from primitive intestinal cells, inducing pancreatic endocrine precursor cells from pancreatic precursor cells, or pancreatic endocrine precursor cells
- Three-dimensional culture may be performed only in one or more steps of inducing insulin-producing cells from the cells. When 3D culture is adopted in some steps, it is desirable to be in the late stage of the differentiation process (for example, after primitive intestinal cells).
- the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof may be added at least in at least a part of the steps in which the three-dimensional culture is adopted, and need not be added to all of them, and is not required for the three-dimensional culture. It does not prevent it from being added in the process (usually adhesive culture).
- the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof is added to the insulin-producing cells in the process of differentiation into insulin-producing cells, for example, by being added to the three-dimensional culture step of the differentiation stage after the primitive intestinal cells. Differentiation can be significantly promoted.
- the compound represented by the general formula (I) may be added at any step in the differentiation process from pluripotent stem cells to insulin-producing cells, but preferably, progenitor intestinal cells derived from pluripotent stem cells. It is added when culturing pancreatic progenitor cells and / or pancreatic endocrine progenitor cells. In the above differentiation stage, it corresponds to stage 3 to stage 5, and may be added to only one stage, two stages, or all three stages, but from stage 3 It is preferably added to all of Stage 5.
- the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof may be added in place of the above-mentioned additives for each stage, or may be additionally added.
- the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof can be added to the medium as a solid compound as it is, in the form of powder, or dissolved in an organic solvent such as dimethylsulfoxide.
- the amount of the addition is not particularly limited, but is set by those skilled in the art so that the differentiation progresses efficiently from pluripotent stem cells to insulin-producing cells.
- the compound represented by the general formula (I) is 1 ng / mL-5 mg / mL, preferably 10 ng / mL-5 mg / mL, more preferably 50 ng / mL-5 mg / mL. Even more preferably, it is added so as to be present in 100 ng / mL to 1 mg / mL medium.
- Examples of the method for producing insulin-producing cells of the present invention include the methods shown below, and specific examples thereof include protocol # 1 and protocol # 2 adopted in Example 1.
- the medium used for each stage is exemplified, but not limited to, below.
- Stage 1 Pluripotent stem cells (which may be pretreated) are cultured in a stage 1 medium which may contain a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof for 1 to 4 days. Induces germ layer cells in the embryo. Preferably, after culturing in the differentiation medium 1-1 or M1-1 AKM medium for 24 hours, the medium is replaced with the differentiation medium 1-2 or M1-2 AKM medium and cultured for 1 to 2 days.
- Stage 2 The culture containing the germ layer cells in the embryo is cultured for 2 to 6 days in a medium for stage 2 which may contain a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof to induce primitive intestinal cells. ..
- the cells are cultured in differentiation medium 2, M2 AKM medium or S2 medium for 2 to 3 days.
- the cells are cultured in a stage 2 medium having a reduced zinc concentration (for example, M2 AKM medium) for 2 days, and then in a normal zinc concentration medium for stage 2 (for example, S2 medium, differentiation medium 2). Incubate for 2-3 days.
- Stage 3 Cultures containing primitive intestinal cells are cultured for 2 to 8 days in a medium for stage 3 which may contain a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof to induce pancreatic progenitor cells.
- the cells are cultured in differentiation medium 3 for 5 to 7 days or in S3 medium for 2 to 4 days.
- Stage 4 Cultures containing pancreatic progenitor cells are cultured for 1 to 7 days in a medium for stage 4 which may contain a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof to induce pancreatic endocrine progenitor cells. .. Preferably, the cells are cultured in the differentiation medium 4 for 2 to 3 days, or in the S4 medium for 4 to 6 days.
- Stage 5 A culture containing pancreatic endocrine progenitor cells is cultured for 5 to 20 days in a medium for stage 5 which may contain a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof to induce insulin-producing cells. .. Preferably, the cells are cultured in the differentiation medium 5 for 10 to 15 days.
- the cells are cultured in a medium for stage 5 containing 0.1 ⁇ M or more of retinoic acid (for example, S5-1 medium) for 3 to 5 days, and then stage 5 containing a low concentration of retinoic acid of 0.05 ⁇ M or less. Incubate in medium (eg, S5-2 medium) for 2-4 days.
- a medium for stage 5 containing 0.1 ⁇ M or more of retinoic acid for example, S5-1 medium
- stage 5 containing a low concentration of retinoic acid of 0.05 ⁇ M or less Incubate in medium (eg, S5-2 medium) for 2-4 days.
- the AKM medium is insulin and Zn 2+ depleted StemFit Basic 03 medium (Ajinomoto).
- Differentiation medium 1-1 DMEM high glucose, L-Gln, NEAA, 0.01 mM ⁇ -mercaptoethanol, 100 ng / mL activin A, B27 supplement, 3 ⁇ M CHIR99021
- Differentiation Medium 1-2 DMEM High Glucose, L-Gln, NEAA, 0.01 mM ⁇ -mercaptoethanol, 100 ng / mL Actibin A, B27 Supplement M1-1
- AKM Medium 100 ng / mL Actibin A, 3 ⁇ M CHIR990221
- M1-2 AKM medium AKM medium supplemented with 100 ng / mL activin A and supplemented with 100 ng / mL IGF1 and 0.5 ⁇ M Zn.
- Differentiation medium 2 RPMI, L-Gln, NEAA, 0.01 mM ⁇ -mercaptoethanol, B27 supplement without insulin, 50 ng / mL FGF10, 0.25 ⁇ M SANT1.
- M2 AKM medium AKM medium supplemented with 50 ng / mL of FGF10 and 250 nM of SANT1 and supplemented with 0.5 ⁇ M of Zn.
- S2 medium StemFit Basic 03 supplemented with 50 ng / mL KGF and 44 ⁇ g / mL vitamin C.
- Differentiation medium 3 DMEM high glucose, L-Gln, NEAA, 0.01 mM ⁇ -mercaptoethanol, 0.15 ⁇ M SANT1, 2 ⁇ M retinoic acid, 0.1 ⁇ M LDN193189, B27 supplement.
- S3 medium StemFit Basic 03 supplemented with 50 ng / mL KGF, 50 nM indactam V, 2 ⁇ M retinoic acid, 250 nM SANT1, and 44 ⁇ g / mL vitamin C.
- Differentiation Medium 4 DMEM High Glucose, L-Gln, NEAA, 0.01 mM ⁇ -Mercaptoethanol, 5 ⁇ M ALK5 Inhibitor (Calbiochem, 616452), 0.3 ⁇ M Indractam V, 0.1 ⁇ M LDN193189, B27 Supplement S4 medium: StemFit Basic 03 supplemented with 50 ng / mL KGF, 100 nM retinoic acid, 250 nM SANT1, 44 ⁇ g / mL vitamin C, and 100 nM LDN193189.
- Differentiation medium 5 KO DMEM / F12, L-Gln, NEAA, 0.01 mM ⁇ -mercaptoethanol, 50 ng / mL exendin 4 , 10 mM nicotinamide, 10 ⁇ M ZnSO 4 , 1 mM N-acetyl-L- Cysteine, B27 supplement.
- S5-1 Medium StemFit Basic 03 supplemented with 10 ⁇ M ALK5 inhibitor, 10 ⁇ M DAPT, 33.3 ng / mL EGF, 100 nM retinoic acid, 1 ⁇ M T3, 44 ⁇ g / mL vitamin C.
- S5-2 medium StemFit Basic 03 supplemented with 10 ⁇ M ALK5 inhibitor, 10 ⁇ M DAPT, 33.3 ng / mL EGF, 25 nM retinoic acid, 1 ⁇ M T3.
- test compound and negative control 0.01% DMSO
- NKX6 insulin, NKX6.
- Immunocytochemical staining was performed on days 14 and 21 to confirm the positive effects of .1 and PDX1.
- GSIS was conducted on the 21st day.
- R 1 in the present invention is a hydrogen atom, a halogen atom, it can be mentioned C1-C6 alkyl group.
- a hydrogen atom, a chlorine atom, a bromine atom, or a methyl group is preferable, and a hydrogen atom, a chlorine atom, or a methyl group is more preferable.
- Any position can be taken as the replacement position of R 1 , and (Ii) to (Iiii) shown below can be taken.
- substituent R 2 in the present invention may be mentioned hydrogen atom or a C1-C6 alkyl group. It is preferably a hydrogen atom or a C1-C2 alkyl group, and more preferably a hydrogen atom or a methyl group.
- substituents optionally substituted aryl groups are independently selected from ⁇ substituent groups as substituents R 3 in the present invention, 1 to 4 independently selected from Substituent group ⁇
- substituent groups as substituents R 3 in the present invention, 1 to 4 independently selected from Substituent group ⁇
- Examples thereof include a C5-C10 cycloalkenyl group which may be substituted with a substituent of 1 to 4, or a heterocyclyl group which may be substituted with 1 to 4 substituents independently selected from the substituent group ⁇ . It is preferably selected independently from the naphthyl group, 1,3-benzodioxolyl group, 2,2-dihalogeno-1,3-benzodioxolyl group, C5-C10 cycloalkenyl group and substituent group ⁇ 1.
- 1,3-benzodioxolyl group 2,2-difluoro-1,3-benzodioxolyl group, C5-C8 cycloalkene-1-yl group, substituent group ⁇ 3. It may be substituted with one or two substituents independently selected, or with one or two substituents independently selected from the substituent group ⁇ 35. Alternatively, it is a 6-membered ring heterocyclyl group, particularly a 2,2-difluoro-1,3-benzodioxolyl group, a 1-tert-butoxycarbonyl-3,6-dihydro-2H-pyridine-4-yl group, or a fluorine.
- a phenyl group which may be substituted with two substituents is preferable. More particularly preferably, it consists of a phenyl or fluorine atom, a chlorine atom, a trifluoromethyl group, a tert-butoxy group, a trifluoromethoxy group, a 2,2,2-trifluoroethoxy group, a benzyloxy group and a phenoxy group.
- the respective substituent groups ⁇ to ⁇ are as follows.
- the substituent group ⁇ in the present invention includes a halogen atom, a cyano group, a carboxy group, a C1-C6 alkyl group, a C1-C6 alkoxy group, a halogeno C1-C6 alkyl group, a halogeno C1-C6 alkoxy group, and a hydroxy C1-C6 alkyl group.
- C1-C6 alkoxy C1-C6 alkoxy group C1-C6 alkoxy group, (C1-C6 alkyl) carbonyl group, (C1-C6 alkoxy) carbonyl group, (C1-C6 alkoxy) carbonyloxy group, phenyl C1-C6 alkoxy group, non-aromatic heterocyclyl
- Preferred substituent group ⁇ 1 halogen atom, cyano group, carboxy group, phenoxy group, benzoyl group, C1-C6 alkyl group, C1-C6 alkoxy group, halogeno C1-C6 alkyl group, halogeno C1-C6 alkoxy group, hydroxy C1-C6 alkyl group, C1-C6 alkoxy C1-C6 alkoxy group, (C1-C6 alkyl) carbonyl group, (C1-C6 alkoxy) carbonyl group, (C1-C6 alkoxy) carbonyloxy group, phenyl C1-C6 alkoxy group A 5- or 6-membered ring non-aromatic heterocyclyl group, a carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C6 alkyl groups, a carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C6 alkyl groups.
- Harogeno C1-C6 Alkoxy Group Hydroxy C1-C6 Alkoxy Group, C1-C6 Alkoxy C1-C6 Alkoxy Group, (C1-C6 Alkoxy) carbonyl Group, (C1-C6 Alkoxy) carbonyl Group, (C1-C6 Alkoxy) carbonyl Oxy group, phenyl C1-C6 alkoxy group, 5- or 6-membered ring non-aromatic heterocyclyl group, carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C6 alkyl groups, one or two C1-C6 alkyl A C1-C6 alkoxy group substituted with a carbamoyl group optionally substituted with a group, a sulfamoyl group substituted with one or two C1-C6 alkyl groups, and one independently selected from the substituent group ⁇ 2.
- substituent group ⁇ 3 halogen atom, cyano group, carboxy group, phenoxy group, benzoyl group, C1-C4 alkyl group, C1-C4 alkoxy group, halogeno C1-C2 alkyl group, halogeno C1-C2 alkoxy group.
- Hydroxy C1-C4 alkyl group C1-C2 alkoxy C1-C2 alkoxy group, (C1-C4 alkyl) carbonyl group, (C1-C4 alkoxy) carbonyl group, (C1-C4 alkoxy) carbonyloxy group, phenyl C1-C4 An alkoxy group, a morpholin-1-yl group, a carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C4 alkyl groups, and a carbamoyl group optionally substituted with one or two C1-C4 alkyl groups.
- a good phenyl group particularly preferably a fluorine atom, a chlorine atom, a trifluoromethyl group, a tert-butoxy group, a trifluoromethoxy group, a 2,2,2-trifluoroethoxy group, a benzyloxy group, or a phenoxy group. is there.
- substituent group ⁇ in the present invention examples include a halogen atom, a C1-C6 alkyl group, a C1-C6 alkoxy group, a halogeno C1-C6 alkyl group, a halogeno C1-C6 alkoxy group, and a (C1-C6 alkoxy) carbonyl group. .. Preferred are substituent group ⁇ 1: halogen atom, C1-C6 alkyl group, C1-C6 alkoxy group, and (C1-C6 alkoxy) carbonyl group, and more preferably substituent group ⁇ 2: halogen atom, C1-C6.
- the substituent group ⁇ 3 a fluorine atom, a chlorine atom, a C1-C4 alkyl group, and a C1-C4 alkoxy group, and particularly preferably a methyl group or a methoxy group.
- Substituent groups ⁇ in the present invention include substituent group ⁇ 2: halogen atom, C1-C6 alkyl group, C1-C6 alkoxy group, (C1-C6 alkyl) carbonyl group, and (C1-C6 alkoxy) carbonyl group. .. Preferred are substituent group ⁇ 3: halogen atom, C1-C4 alkyl group, C1-C4 alkoxy group, (C1-C4 alkyl) carbonyl group, and (C1-C4 alkoxy) carbonyl group, more preferably a fluorine atom. , Chlorine atom, methyl group, isobutoxy group, or tert-butoxycarbonyl group.
- n in the present invention can be 0 or 1.
- the compound represented by the general formula (I) has the following formula (II):
- R 1 ⁇ R 3 represents the same meaning] It is a compound having a dihydroindridinong structure represented by.
- ⁇ , *, R 4, R 5, and Y is a defined above] It is a group represented by.
- R 1 to R 4 , and n have the same meaning as above] It is a compound represented by.
- R 1 ⁇ R 3, R 5, n, and Y is a defined above] It is a compound represented by. Any position can be taken as the replacement position of R 5 , and (Vi) to (Viii) shown below can be taken.
- R 1 ⁇ R 3, R 5, and n have the same meaning] It is a compound represented by. Any position can be taken as the replacement position of R 5 , and (VI-i) to (VI-iii) shown below can be taken.
- R 1 to R 3 and n have the same meaning as above] It is a compound represented by.
- Hydrogen atoms as substituents R 4 in the present invention C1-C6 alkyl group, a halogeno C1-C6 alkyl or (C1-C6 alkoxy) carbonyl group, and the like. It is preferably a hydrogen atom, a C1-C4 alkyl group, or a halogeno C1-C2 alkyl group, and more preferably a hydrogen atom, a methyl group, or a trifluoromethyl group.
- substituent R 5 in the present invention is a hydrogen atom, a halogen atom or a C1-C6 alkyl group.
- a hydrogen atom, a fluorine atom or a methyl group is preferable.
- Examples of Y in the present invention include N or CH.
- Y is N
- (ii) in A represents a pyridine ring
- (ii) in A represents a benzene ring.
- the Y in (ii) of A is preferably CH.
- the compound having the general formula (I) is preferably the compound described in the synthesis example, and more preferably the following compound.
- Separation and analysis of each optical isomer from the racemic compound can be achieved by high performance liquid chromatography (HPLC) using a chiral column or the like. Identification of optical isomers by HPLC can be performed with reference to the retention time, but the retention time may be affected by column deterioration, reproducibility between devices, etc., so racemic compounds or optical isomers are preferable. This can be done by analyzing a mixture of body standard samples and analytical samples. Further, in the measurement of each optical isomer by HPLC, the order in which each optical isomer is eluted does not change under the same measurement conditions, so that it is relatively relative to the first peak having a relatively short retention time under specific conditions. It is possible that the second peak, which has a long retention time, characterizes the optical isomer.
- salt What is "the salt”? When a compound has an acidic group or a basic group, it can be made into a “salt with a base” or an “acid addition salt” by reacting with a base or an acid. Is shown. When used for the purpose of treating warm-blooded animals (particularly humans), the salt is preferably a pharmaceutically acceptable salt. In addition, “the salt” and “the pharmaceutically acceptable salt” also include the hydrate thereof.
- Preferred examples of the "salt with base" of the compound include alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts and lithium salts; alkaline earth metal salts such as magnesium salts and calcium salts; N-methylmorpholin salts, Organic base salts such as triethylamine salt, tributylamine salt, diisopropylethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N-methylpiperidine salt, pyridine salt, 4-pyrrolidinopyridine salt, picolin salt, or glycine salt, lysine salt, arginine salt, Amino acid salts such as ornithine salts, glutamates, asparaginates, and more preferably alkali metal salts or alkaline earth metal salts.
- alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts and lithium salts
- alkaline earth metal salts such as magnesium salts and calcium salts
- N-methylmorpholin salts Organic base salts such as triethylamine
- the "acid addition salt" of the compound include hydrofluoride, hydrochloride, hydrobromide, hydrohalogenates such as hydroiodide, nitrates, perchlorates, Inorganic acid salts such as sulfates and phosphates; lower alkane sulfonates such as methane sulfonate, trifluoromethane sulfonate, ethane sulfonate, benzene sulfonate, p-toluene sulfonate and the like.
- Organic acid salts such as aryl sulfonate, acetate, malate, fumarate, succinate, citrate, ascorbate, tartrate, oxalate, maleate; and glycine, lysine.
- Amino acid salts such as salts, arginine salts, ornithine salts, glutamates, asparaginates, more preferably hydrohalogenates (particularly hydrochlorides).
- the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof may absorb water and become adsorbed water or become a hydrate when left in the air or recrystallized.
- the present invention also includes compounds of such various hydrates, solvates and crystalline polyforms.
- the compound represented by the general formula (I) may have tautomers and geometric isomers depending on the type of substituent.
- the compound represented by the general formula (I) may be described in only one form of the isomer, but the present invention also includes other isomers, and the isomers are separated. Also includes those, or mixtures thereof.
- the compound represented by the general formula (I) may have an asymmetric carbon atom or an axial asymmetry, and an optical isomer based on this may exist.
- the present invention also includes separated optical isomers or mixtures thereof.
- isotope The compound represented by formula (I), the label body, i.e., one or more atoms isotope compounds (e.g., 2 H, 3 H, 13 C, 14 C, 35 S , etc.) was replaced with Compounds are also included.
- the label body i.e., one or more atoms isotope compounds (e.g., 2 H, 3 H, 13 C, 14 C, 35 S , etc.) was replaced with Compounds are also included.
- the present invention also includes pharmacologically acceptable prodrugs of the compounds represented by the general formula (I).
- a pharmacologically acceptable prodrug is a compound having a group that can be converted to an amino group, a hydroxyl group, a carboxy group, or the like by solvolysis or under physiological conditions. Examples of the group forming the prodrug include Prog. The groups described in Med, 5, 2157-2161 (1985) can be mentioned.
- the prodrug is a compound in which the amino group is acylated and phosphorylated (for example, the amino group is ecosanoidized, alanylated, or pentylaminocarbonyl).
- the amino group is ecosanoidized, alanylated, or pentylaminocarbonyl.
- a compound has a hydroxyl group
- the hydroxyl group is acylated, alkylated, phosphorylated, or booxidized (for example, the hydroxyl group is acetylated, palmitoylated, propanoylated, pivaloylated, succinylated, or fumarylated. , Alanylated, dimethylaminomethylcarbonylated compounds, etc.) and the like.
- the compound in which the carboxy group is esterified or amidated for example, the carboxy group is ethyl esterified, phenyl esterified, carboxymethyl esterified, dimethylaminomethyl esterified, pi Baroyloxymethyl esterification, ethoxycarbonyloxyethyl esterification, amidated or methylamided compounds, etc.
- the carboxy group is ethyl esterified, phenyl esterified, carboxymethyl esterified, dimethylaminomethyl esterified, pi Baroyloxymethyl esterification, ethoxycarbonyloxyethyl esterification, amidated or methylamided compounds, etc.
- the compounds represented by the general formula (I), their salts and their synthetic intermediates shall be produced by utilizing the characteristics based on the type of their basic skeleton or substituents and applying various known production methods. Can be done. As known methods, for example, “ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS”, 2nd edition, ACADEMIC PRESS, INC. , 1989, “Comprehensive Organic Transitions”, VCH Publicers Inc. , 1989, etc.
- the compound represented by the general formula (I) and a salt thereof can be synthesized according to the methods A to C described below.
- an appropriate protecting group a group that can be easily converted to the functional group
- it may be effective in manufacturing technology to protect with.
- protecting groups include the protecting groups described in Protective Groups in Organic Synthesis (3rd edition, 1999) by PGM Wuts and TW Greene. These reaction conditions may be appropriately selected and used.
- the optimum protecting group for the synthetic route is appropriately set by those skilled in the art.
- a desired compound can be obtained by introducing the protecting group, carrying out the reaction, and then removing the protecting group as necessary.
- the prodrug of the compound represented by the general formula (I) introduces a specific group at the stage from the raw material to the intermediate, or further reacts using the obtained compound, as in the case of the above protecting group.
- Can be manufactured by The reaction can be carried out by applying ordinary methods such as esterification, amidation and dehydration.
- the compound represented by the general formula (I) can be produced by using a known method or an intermediate that can be synthesized by a modified method thereof.
- an intermediate containing a group represented by the general formulas (ii) to (iv) corresponding to A can be produced by applying a known method or a modified method thereof using a commercially available raw material.
- the compound obtained in each of the following steps A to C may be a salt formed together with the compound.
- a salt formed together with the compound for example, hydrochloride or sulfate or the like, or sodium salt or potassium salt or the like can be mentioned.
- solvent used in the reaction of each step of the following methods A to C is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction and partially dissolves the starting material.
- Solvents include aliphatic hydrocarbons such as hexane, pentane, petroleum ether, cyclohexane; aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene; methylene chloride (methylene chloride), chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, Halogenized hydrocarbons such as chlorobenzene and dichlorobenzene; ethers such as diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, dimethoxyethane, diethylene glycol dimethyl ether; ketones such as acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone and cyclohexanone; acetic acid Et
- the acid used in the reaction of each step of the following methods A to C is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, and is selected from the following acid group.
- the acid group includes inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, phosphoric acid, sulfuric acid and nitrate, organic acids such as acetic acid, propionic acid, trifluoroacetic acid and pentafluoropropionic acid, and methane. It consists of organic sulfonic acids such as sulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and camphorsulfonic acid.
- the base used in the reaction of each step of the following methods A to C is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, and is selected from the following base group.
- the base group is an alkali metal carbonate such as lithium carbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, cesium carbonate; an alkali metal hydrogen carbonate such as lithium hydrogen carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate; lithium hydroxide, sodium hydroxide.
- Alkali metal hydroxides such as potassium hydroxide; alkaline earth metal hydroxides such as calcium hydroxide, barium hydroxide; alkali metal hydrides such as lithium hydride, sodium hydride, potassium hydride; Alkalimetal amides such as lithium amide, sodium amide, potassium amide; alkali metal alkoxides such as lithium methoxyd, sodium methoxyd, sodium ethoxydo, sodium tert-butoxide, potassium tert-butoxide; lithium such as lithium diisopropylamide Alkylamides; silylamides such as lithium bistrimethylsilylamide, sodium bistrimethylsilylamide; alkyllithiums such as n-butyllithium, sec-butyllithium, tert-butyllithium; methylmagnesium chloride, methylmagnesium bromide, methylmagnesium iodide Alkyl magnesium halides such as ethyl magnesium chloride, e
- reaction temperature differs depending on the solvent, starting material, reagent, etc.
- reaction time differs depending on the solvent, starting material, reagent, reaction temperature, etc.
- the target compound of each step is isolated from the reaction mixture according to a conventional method.
- the target compound is, for example, (i) leaking an insoluble matter such as a catalyst as necessary, and (ii) adding water and a solvent immiscible to water (for example, methylene chloride, diethyl ether, ethyl acetate, etc.) to the reaction mixture.
- a solvent immiscible to water for example, methylene chloride, diethyl ether, ethyl acetate, etc.
- the target compound is extracted, the (iii) organic layer is washed with water, dried with a desiccant such as anhydrous magnesium sulfate, and (iv) the solvent is distilled off.
- the obtained target compound is further purified by a conventional method, for example, recrystallization, reprecipitation, distillation, column chromatography (including normal phase and reverse phase) using silica gel or alumina, if necessary. can do.
- the obtained target compound can be identified by standard analytical techniques such as elemental analysis, NMR, mass spectrometry, and IR analysis, and its composition or purity can be analyzed.
- the target compound in each step can be used as it is in the next reaction without purification.
- the optical isomers are separated and purified by fractional recrystallization using an optically active amine such as (R) or (S) -phenethylamine, or separation using an optically active column. can do.
- an optically active amine such as (R) or (S) -phenethylamine
- Method A is a method for producing a compound (A2) that can be used as a synthetic intermediate when producing a compound represented by the general formula (I).
- Compound (A2) can also be produced by a known method or a modified method thereof, in addition to the synthetic method exemplified in this method and Examples.
- Step A-1 is a step of producing compound (A2) by allowing equal or excess amounts of a halogenating agent or bromotrimethylsilane and thiourea to act on compound (A1). is there.
- a halogenating agent include chlorine and bromine.
- the solvent for the reaction is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but dichloromethane, chloroform, ethanol, acetonitrile, N, N-dimethylformamide, acetic acid and the like are used.
- the reaction temperature is usually 0 to 100 ° C., and the reaction time is usually about 0.5 hours to 2 days.
- Method B is a method for producing a compound (B3) that can be used as a synthetic intermediate when producing a compound represented by the general formula (I).
- P 1 and P 2 in the figure below indicate a protecting group for an amino group or a hydrogen atom, and specific protecting groups include a Boc group (tert-butoxycarbonyl group), a Cbz group (benzyloxycarbonyl group), and a benzylidene group. , Or a diphenylmethylene group and the like.
- P 1 is a benzylidene group or a diphenylmethylene group
- P 2 shows the same protecting group as P 1 .
- R 3 and A may have a protecting group on the substituents contained therein, and each step includes a step of protecting the substituent and removing the protecting group as necessary.
- R 3 is synonymous with the above, X 1 is a halogen atom or a methanesulfonyloxy group, a leaving group such as a trifluoromethanesulfonyloxy group or a p-toluenesulfonyloxy group, and P 1 and P 2 are arbitrary protecting groups. Show]
- Step B1 to the coupling reaction step B1 of the substituent X 1 on A compound (B1), the presence of a palladium catalyst, an equal amount or excess amount of acid or boronic acid ester (R 3 - Conditions using B (OH) 2 or R 3- B (OR) 2 , R indicates an arbitrary alkyl group) (Suzuki-Miyaura coupling); Conditions using an organic tin reagent (R 3- SnR 3 ) (Stille coupling); or an organic zinc reagent (R 3 -ZnX; by X conditions using a halogen atom) (Negishi coupling) or the like, is a step of obtaining compound by performing the introduction of a substituent R 3 and (B2) ..
- a base can be added in the above reaction.
- the palladium catalyst include tetrakis (triphenylphosphine) palladium, [1,1'-bis (diphenylphosphino) ferrocene] palladium (II) dichloride dichloromethane complex (1: 1), and chloro (2-dicyclohexylphosphino-2').
- Organic bases such as potassium hydrogen carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium carbonate, sodium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, potassium phosphate, or inorganic bases such as sodium phosphate can be mentioned.
- the reaction solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but methanol, ethanol, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, 1,4-dioxane, water, N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, benzene, toluene. , Xylene, or a mixture thereof and the like.
- the reaction temperature is usually about 20 to 150 ° C.
- the reaction time is usually about 1 hour to 2 days.
- this coupling reaction see A. Meijere and F.M. It can be performed according to the method described in "Metal-Catalyzed Cross-Coupling Reactions (2nd edition, 2004)" by Diederich.
- Step B2 deprotection step B2 is a step for preparing a compound compound by removing the protecting groups P 1 and P 2 in (B2) (B3). It can be carried out for removing the protective group in R 3, if necessary in the present step.
- the reaction conditions vary depending on the kind of the protecting group P 1 and P 2 is, for example, T. W. Greene and P.M. G. It can be carried out according to the method described in "Protective Groups in Organic Synthesis (3rd Edition, 1999)" by Wuts.
- Method C is a method for producing a compound represented by the general formula (I) from a compound (C1) that can be synthesized by using a known method or a modified method thereof.
- R 1 to R 3 , n, A and X 1 are synonymous with the above, X 2 is a halogen atom, and P 3 is an arbitrary protecting group].
- Step C1 alkylation reaction step C1 introduces a substituent R 2 eq or excess amount of alkylating agent presence to the compound (C1), by treatment with a base, compound (C2 ) Is the process of manufacturing.
- a base compound (C2 )
- the alkylating agent an alkyl halide, an alkyl methanesulfonic acid ester, an alkyl p-toluenesulfonic acid ester or the like can be used.
- the base include potassium hexamethyldisilazide and sodium hexamethyldisilazide.
- the reaction solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but tetrahydrofuran is preferable.
- the reaction temperature is usually ⁇ 78 to 0 ° C.
- the reaction time is usually 0.5 to 24 hours.
- Step C-2 Halogenation and Alkylation
- the compound (C1) is halogenated with an equal amount or an excess amount of a halogenating agent, and then alkylated to obtain a compound (step C-2).
- the order of halogenation and alkylation can be changed as appropriate.
- the halogenating agent include N-bromosuccinimide and N-iodosuccinimide.
- the reaction solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but dichloromethane and dimethylformamide are preferable.
- the reaction temperature is usually about 0 to 50 ° C.
- the reaction time is usually 0.5 to 24 hours. Alkylation can be carried out in the same manner as in step C-1.
- Step C-3 is a step of carrying out a coupling reaction with compound (C3) to produce compound (C4). It can be carried out in the same manner as in step B-1.
- Step C-4 is a step of subjecting compound (C2) or compound (C5) to halogenation or a coupling reaction following halogenation to obtain compound (C4) or a compound represented by the general formula (I). is there.
- Halogenation can be carried out in the same manner as in step C-2, and the coupling reaction can be carried out in the same manner as in step B-1.
- Step C-5 Condensation reaction
- the protective group of the carboxy group of the compound (C2) or the compound (C4) is removed to obtain a carboxylic acid, and then the compound (A2) of the method A or the method B is used.
- This is a step of producing a compound represented by the compound (C5) or the general formula (I) by performing condensation using the compound (B3) of the above in an equal amount or an excess amount.
- Deprotection of the carboxy group is carried out by T.I. W. Greene and P.M. G. It can be carried out according to the method described in "Protective Groups in Organic Synthesis (3rd Edition, 1999)" by Wuts.
- the condensation reaction is carried out by allowing an appropriate sulfonylating agent or an appropriate condensing agent to act on the compound (C2) and the carboxylic acid obtained from the compound (C4) in the presence of a base.
- an appropriate sulfonylating agent or an appropriate condensing agent to act on the compound (C2) and the carboxylic acid obtained from the compound (C4) in the presence of a base.
- additives that accelerate the reaction can be added as needed.
- the sulfonylating agent include 2,4,6-triisopropylbenzenesulfonyl chloride, p-toluenesulfonyl chloride, benzenesulfonyl chloride and the like.
- condensing agent examples include WSC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), DCC (1,3-dicyclohexylcarbodiimide), and DMT-MM (4- (4,6-dimethoxy-1,3).
- WSC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
- DCC (1,3-dicyclohexylcarbodiimide
- DMT-MM 4- (4,6-dimethoxy-1,3).
- 5-Triazine-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride examples include CDI (1,1'-carbonyldiimidazole), DEPC (diethylphosphorusianidate), DPPA (diphenylphosphoryl azide) and the like. ..
- Examples of the base include aromatic amines such as pyridine and rutidin, and tertiary amines such as triethylamine, N, N-diisopropylethylamine and DMAP (4-dimethylaminopyridine).
- Typical examples of additives are HOAt (3H- [1,2,3] triazolo [4,5-b] pyridin-3-ol), HOBt (1H-benzotriazole-1-ol), HOSu (N). -Hydroxysuccinimide) and the like.
- the reaction solvent is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but dichloromethane and N, N-dimethylformamide are preferable.
- the reaction temperature is usually 0 to 50 ° C.
- the reaction time is usually 0.5 to 24 hours.
- Step (C-6) is a step of removing the protecting group of the carboxy group of the compound (C4) and then condensing it with an amine derivative to produce the compound (C6).
- the same method as in step (C-5) can be used.
- Step C-7 Coupling reaction Step (C-7) is a step of performing a coupling reaction with compound (C6) to produce a compound represented by the general formula (I). It can be carried out by using the same method as in step (B-1).
- the insulin-producing cells produced by the method of the present invention are useful for the treatment of diabetes because they exhibit functions similar to those of living pancreatic ⁇ cells.
- the cells produced by the production method of the present invention have a characteristic that the amount of insulin secreted is small when the sugar level in the surrounding environment is low, and the amount of insulin secreted is increased in an environment where the sugar level is high. Has. Therefore, the cells produced by the production method of the present invention provide a highly safe therapeutic method with a low risk of hypoglycemia.
- the cells are the target cells by evaluating the expression of pancreatic ⁇ -cell marker genes (eg, insulin, NKX6.1, PDX1, etc.) at the mRNA level or protein level in the cells prepared by the method of the present invention. be able to.
- pancreatic ⁇ -cell marker genes eg, insulin, NKX6.1, PDX1, etc.
- the insulin secretory capacity of the cells produced by the method of the present invention can be evaluated by the time-dependent GSIS activity measurement described in the method (6) of Example 1 below.
- the cells produced by the method of the present invention have the property of exhibiting rapid phase 1 insulin secretion and / or long-lasting phase 2 insulin secretion in time-dependent GSIS activity measurements.
- the cells produced by the method of the present invention are insulin in response to stimulation by an insulin secretagogue (eg, SU agent such as glybenclamide, GLP-1 receptor agonist such as exendin 4, KCl, etc.). It has properties such as enhanced secretion and enhanced c-peptide secretion.
- an insulin secretagogue eg, SU agent such as glybenclamide, GLP-1 receptor agonist such as exendin 4, KCl, etc.
- NKX6.1 which indicates functional maturation
- the insulin-producing cells produced by the method of the present invention are considered to be cells with enhanced functional maturation as pancreatic ⁇ cells, and are clearly different from known pluripotent stem cell-derived insulin-producing cells. The cells that are distinguished.
- the target of treatment with such insulin-producing cells is a patient with a disease caused by abnormal insulin secretion or deficiency of insulin secretion in pancreatic ⁇ cells, and specifically, a patient with type 1 diabetes or type 2 diabetes is exemplified.
- the cells produced by the method of the present invention may be transplanted as aggregates (spheres) formed by three-dimensional culture, or may be transplanted as dispersed cells. In addition, once dispersed cells can be processed into reaggregated aggregates or sheets and transplanted.
- the nuclear magnetic resonance (hereinafter, 1 H NMR) spectrum is described with a chemical shift value of ⁇ value (ppm) using tetramethylsilane as a standard substance.
- the split pattern is indicated by s for the single line, d for the double line, t for the triple line, q for the quadruple line, m for the multiple line, and br for the broad line.
- Mass spectrometry (hereinafter referred to as MS) was performed by an EI (Electrospray Ionization) method, an ESI (Electrospray Ionization) method, or a FAB (Fast Atom Bombardment) method.
- Reference synthesis example 12 5- (1,3-Benzodioxole-5-yl) Thiazole-2-amine Results according to the method of Reference Synthesis Example 10 using commercially available 1,3-benzodioxole-5-ylboronic acid. After obtaining the body, 123 mg (31%, 2 steps) of the title compound was obtained as a solid according to the method of Reference Synthesis Example 11.
- reaction mixture was concentrated under reduced pressure, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added, and the mixture was extracted with dichloromethane.
- Reference synthesis example 18 2-Bromo-8-oxo-N- [5- [4- (trifluoromethoxy) phenyl] thiazole-2-yl] -6,7-dihydro-5H-indolizine-5-carboxamide Obtained in Reference Synthesis Example 17 1N aqueous sodium hydroxide solution (0) in ethanol (2 mL) solution of methyl 2-bromo-8-oxo-6,7-dihydro-5H-indolizine-5-carboxamide (56.9 mg, 0.209 mmol). .5 mL, 0.50 mmol) was added, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 2 hours.
- the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain the title compound (48 mg, optical purity 99.9% ee) as a solid.
- the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain the title compound (48 mg, optical purity 99.8% ee) as a solid.
- Synthesis example 75 N- [4- [4- (difluoromethoxy) phenyl] phenyl] -8-oxo-6,7-dihydro-5H-indolizine-5-carboxamide
- Synthesis example 82 8-oxo-N- [5- [4- (trifluoromethoxy) phenyl] -2-pyridyl] -6,7-dihydro-5H-indolizine-5-carboxamide
- Reference Synthesis Example 7 N- ( Synthesis Example 11 using 5-bromo-2-pyridyl) -8-oxo-6,7-dihydro-5H-indolizine-5-carboxamide and commercially available [4- (trifluoromethoxy) phenyl] boronic acid. According to the method, 4.0 mg (yield 17%) of the title compound was obtained.
- the table below shows the structural formulas and physicochemical data of the reference synthesis examples and the compounds synthesized in the synthesis examples.
- the compound of Synthesis Example 1 was used as a positive control, and dimethyl sulfoxide (DMSO) (SIGMA, D2650) having a final concentration of 0.1% was used as a compound-free control. All compounds were dissolved in DMSO and two compound solutions were prepared so that the final concentrations of the compounds after addition to the medium were 2 ⁇ M and 10 ⁇ M. In the following evaluation, the compound solution was added to the medium to a final concentration of DMSO of 0.1%.
- DMSO dimethyl sulfoxide
- Non-Patent Document 6 the human iPS cell Toe strain (Pharmaceutical Infrastructure Research Institute) was replaced with cells (differentiation medium C) on day 7 of culture. after 2 days until (cell differentiation processes from FOXA2 positive primitive intestinal cells to PDX1-positive pancreatic progenitor cells) induced, the cells were harvested, bang-bang car liquid at 1x10 7 cells / mL / tube using a (Japan Genetics) The cells were stored in nitrogen to prepare cell stocks for evaluation.
- the cell stocks were lysed, and differentiation medium C (DMEM high glucos (Life technologies, 11965092), 0.25 ⁇ M SANT-1 for stage 3) was prepared.
- DMEM high glucos (Life technologies, 11965092), 0.25 ⁇ M SANT-1 for stage 3) was prepared.
- 0.1 ⁇ M LDN193189 (Stemgent, 04-0074), 10 ⁇ M SB431542, 2 ⁇ M Retinoic acid (Stemgent, 04-0021), 1% B27 serum free supplement (Life technology), after suspension in IIC, 17504044.
- # 5656 96-well plates coated with (Corning, after # 3340 1x10 5 were cells / well seeded in a).
- Differentiation medium E for stage 5 GLP-1 receptor agonist and nicotine amide-free; Knockout DMEM / F-20 (Life technologies, 12660012), 1% B27 cellum free), to which only the compound or DMSO was added. (Supplement) was added at 200 ⁇ L / well. After culturing for 2 days, the medium. Was removed, 150 ⁇ L / well of 4% paraformaldehyde phosphate buffer (Wako, 163-20145) was added, and the cells were fixed at room temperature for 30 to 60 minutes.
- PBS phosphate buffer
- T9181 phosphate buffer
- T9183 PBS-T
- Blocking was performed at room temperature for 1 hour using 20% Blocking One (Nacalai Tesque, Tokyo, Japan) diluted with.
- 50 ⁇ L / well of guinea pig anti-insulin antibody (abcam, ab7842) diluted 200-fold with 20% Blocking One was added and allowed to stand at 4 ° C. overnight.
- Alexa Fluor 548-labeled anti-guinea antibody (Life Technologies, A11075) and 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Roche Diagnostics, Basel) diluted 1000-fold with 20% Blocking One after washing 3 times with PBS-T. Switzerland) was added and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing with PBS-T three times, fluorescence images of cells were analyzed.
- the increase in the insulin-positive cell rate at each concentration of each compound was converted into a percentage (%) and used as the activity value.
- the primary evaluation of the compounds was performed using multiple wells at two concentrations of 2 ⁇ M and 10 ⁇ M for each compound, including positive controls.
- the activity intensity was determined by comparing the sum of the activity values at both concentrations with the positive control. The sum of the activity values at both concentrations was clearly higher than that of the compound untreated control, but it was described as + when it was lower than the positive control, ++ when it was equivalent to the positive control, and +++ when it was higher than the positive control. ..
- Example 1 (A) Results (1) Screening of novel ⁇ -cell differentiation inducers As previously reported (Sakano et al., 2014; Shiraki et al., 2008), it carries a GFP reporter gene driven by the Pdx1 promoter. Mouse ES cell line SK7 was used to establish an assay system for screening small molecule compounds that enhance ⁇ -cell differentiation. After a primary screening campaign with approximately 55,000 compounds followed by an iterative assay to confirm efficacy reproducibility and dose dependence, hit compound K-1 (compound synthesized in Synthesis Example 1) It was discovered as a novel compound that enhances ⁇ -cell differentiation (Fig. 1).
- K-1 increased the ratio of Pdx1-GFP + insulin + double positive cells and the expression of insulin 1 in a dose-dependent manner. K-1 further enhanced the increase in Pdx1-GFP + Ins + double-positive cells (Treff et al., 2006) by the ⁇ -secretase inhibitor LY411575. This result indicates that K-1 exhibits its efficacy by a mechanism of action different from that of ⁇ -secretase inhibition, which has previously been reported to promote pancreatic endocrine differentiation.
- K-1 and its derivatives promote the differentiation of human iPS cell-derived ⁇ cells.
- the efficacy of the compound for the differentiation of human iPS cells into insulin-expressing ⁇ (hiPS- ⁇ ) cells was shown in two different differentiation protocols and three human iPS cell lines (Toe, RPChiPSC771, and Ff-I01s01 (HLA homozygous patients). It was investigated using the derived iPSC)) (Fig. 2-1a).
- the present inventor first tested the treatment of Toe iPSCs with K-1 from late stage 3 to early stage 5 in monolayer cultures under differentiation protocol # 1. It resulted in enhanced differentiation into iPS- ⁇ cells (FIGS. 2-1a and b).
- K-3 compound synthesized in Synthesis Example 9
- K-4 compound synthesized in Synthesis Example 33
- K-5 compound synthesized in Synthesis Example 101b
- the effects of other derivatives were examined.
- K-3 and K-5 were found to be more potent than the original compound K-1 (Fig. 2-1b).
- K-3 was tested using another differentiation protocol recently established by the present inventor.
- the present inventor has previously discovered that a short period of pre-differentiation methionine removal treatment results in enhanced differentiation (Shiraki et al., 2014). Therefore, the present inventor incorporated short-term (5 hours) methionine removal and performed sphere culture of RPChiPS771 iPSC under differentiation protocol # 1 to obtain highly functional iPS- ⁇ cells (Shiraki et al.,. 2014).
- K-3 enhanced differentiation into INSULIN + PDX1 + double-positive cells at 0.25 ⁇ M (Fig. 2-1c).
- differentiation protocol # 2 was used. Here, cells were pretreated with methionine removal prior to differentiation and differentiated using a medium with adjustable zinc concentration.
- K-3 enhanced the differentiation of Ff-I01s01 into INSULIN + NKX6.1 +, NKX6.1 + PDX1 + double positive, and INSULIN + NKX6.1 + PDX1 + triple positive cells. These appeared at the end of stage 4 and then increased (Fig. 2-1d).
- K-3 most effectively enhances differentiation.
- K-3 also promoted the production of NKX6.1 + and INSULIN + NKX6.1 + double positive cells, especially by treatment in stages 3-5 (FIG. 2-1d).
- iPS- ⁇ cells treated with K-3 showed enhanced c-peptide secretion by stimulation with insulin secretagogues (glibenclamide, exendin 4, and KCl) (Fig. 2-2g), which is not the case. , Indicates that the compound enhances functional maturation or increases the insulin content of the cell.
- RPChiPS771 cells and Ffl-01s01 cells were cultured on syntheticmax II (Invitrogen, 3535XX1) coated dishes using Essential8 (Invitrogen, A151001) and StemFit AK03N (Ajinomoto), respectively.
- SK7 mouse ES cells were basically differentiated into ⁇ cells according to a previous report (Nakashima et al., 2015). Briefly, cells were placed in CellBIND 384-well (CORNING, 3770) cell culture plates with 5,000 cells per well, or in 96-well plates (Sigma) coated with 0.2% gelatin 20 per well, It was seeded with 000 cells. The cells were then cultured in medium 1 from day 1 to day 5.
- CORNING 384-well
- Medium 1 contains 0.1 mM NEAA (Gibco, 11140-50), 2 mM L-glutamine (Nacalai, 16948-04), 100 U / mL penicillin-streptomycin (Nacalai, 26252-94), 0.01 mM ⁇ . -Mercaptoethanol (Sigma), 1% insulin-transferase-selenium supplement (ITS: Life Technologies, 41400045), 0.25% Albumax (ThermoFisher, 11020021), and 10 ng / mL recombinant human activin-A (R & D). It consists of DMEM high glucose (Life Technologies, 11965092) supplemented with Systems, 338-AC).
- medium 2 consisting of medium 1 supplemented with 10 ⁇ M retinoic acid (Stemgent, 04-0021).
- the medium was replaced with medium 3 on day 6, and culture was continued until day 12 to induce differentiation into ⁇ -cells.
- Medium 3 contains 0.1 mM NEAA, 2 mM L-glutamine, 100 U / mL penicillin-streptomycin, 0.1 mM ⁇ -mercaptoethanol, 1% ITS, 0.25% Albumax, and 3 mM nicotinamide. It consists of DMEM low glucose (Life Technologies, 11885084) supplemented with (Sigma-Aldrich, N0636-500G). The test compound was added on day 8 and cells were fixed with 4% paraformaldehyde for analysis by a high content imager.
- Toe human iPS cells were seeded on CellBIND 6-well (CORNING, CLS3335) cell culture plates coated with synthemax II and differentiated into primitive intestinal cells by the method previously described (Shahjaral et al., 2014). Cells were dissociated with TrypLE Select (Thermo Fisher, 12563011) and cryopreserved in BanBanker (Nippon genesics) at a density of 1.0-2.0 ⁇ 10 7 cells / mL until use.
- stage 3 medium DMEM high glucose, 0.25 ⁇ M SANT1 (Wako, 197-16351), 0.1 ⁇ M LDN193189 (Stepment, 04-0074), 10 ⁇ M SB431542, 2 ⁇ M.
- the cells were thawed in retinoic acid, 1% B27 serum-free supplement (Life Technologies, 17504044), and seeded in CellBIND 96-well (Corning, 3340) cell culture plates coated with Synthemax II at 150,000 cells per well.
- Cells were cultured for 1 day in stage 3 medium containing test compound or negative control (0.01% DMSO) for 2 days and 1 day in stage 4 and 5 medium containing test compound or negative control, respectively. The cells were further cultured. The next day, the cells were fixed in 4% paraformaldehyde for analysis with a high content imager.
- RPChipS771 cells were maintained as described above and differentiated according to protocol # 1. Briefly, on day 0, cells were dissociated with a TrypLE Select and transferred to a low-adhesion 6-well plate (Greener, 657185) at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / mL in Ethential 8 medium and rotary shaker (95 rpm). ) Cultivated on. On the first day, the medium was replaced with methionine-depleted medium KA01 (Ajinomoto) and cultured for 5 hours.
- KA01 Ajinomoto
- the medium was replaced with differentiation medium 1 (DMEM high glucose, L-Gln, NEAA, 0.01 mM ⁇ -mercaptoethanol, 100 ng / mL activin A, B27 supplement, 3 ⁇ M CHIR99021) and the cells were cultured for 1 day ( Stage 1-1). Then, the medium was replaced with medium 1 containing no CHIR99021 and cultured for 2 days (stage 1-2).
- differentiation medium 1 DMEM high glucose, L-Gln, NEAA, 0.01 mM ⁇ -mercaptoethanol, 100 ng / mL activin A, B27 supplement, 3 ⁇ M CHIR99021
- N-acetyl-L-cysteine (B27 supplement) was continued for 13 days (stage 5).
- test compounds and negative controls (0.01% DMSO) were treated between stages 3 and 4 (Days 6-14) for insulin positives.
- immunostaining was performed on the 19th day, and a GSIS (Glucose Dimethyl Insulin Secretion) assay was performed on the 27th day.
- FfI-01s01 cells were maintained as described above and differentiated according to protocol # 2. Briefly, cells were dissociated with TripLE Select, transferred to a low adherence 6-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / mL in AK03N medium (Ajinomoto), cultured on a rotary shaker (95 rpm) for 24 hours, and cultured. The medium was then replaced with AK03N-based methionine-removing medium KA01 and the cells were cultured for 5 hours. The medium was then replaced with M1-1 AKM medium and the cells were cultured for 24 hours (stage 1-1).
- AK03N medium Ajinomoto
- the cells were cultured in M1-2 AKM medium for 2 days (stage 1-2), then in M2 AKM medium for 2 days (stage 2-1), and in S2 medium for 2 days (stage 2-2). Incubate in S3 medium for 2 days (stage 3), in S4 medium for 5 days (stage 4), in S5-1 medium for 4 days (stage 5-1), and in S5-2 medium for 3 days (stage 5). Stage 5).
- the AKM medium is insulin and Zn 2+ depleted StemFit Basic 03 medium.
- M1-1 AKM medium AKM (100 ng / mL IGF1, 0.5 ⁇ M Zn) medium supplemented with 100 ng / mL activin A and 3 ⁇ M CHIR990221.
- M1-2 AKM medium AKM (100 ng / mL IGF1, Z0.5 ⁇ M Zn) medium supplemented with 100 ng / mL activin A.
- M2 AKM medium AKM (0.5 ⁇ M Zn) supplemented with 50 ng / mL FGF10 and 250 nM SANT1.
- S2 medium StemFit Basic 03 supplemented with 50 ng / mL KGF and 44 ⁇ g / mL vitamin C.
- S3 medium StemFit Basic 03 supplemented with 50 ng / mL KGF, 50 nM indactam V, 2 ⁇ M retinoic acid, 250 nM SANT1, and 44 ⁇ g / mL vitamin C.
- S4 medium StemFit Basic 03 supplemented with 50 ng / mL KGF, 100 nM retinoic acid, 250 nM SANT1, 44 ⁇ g / mL vitamin C, and 100 nM LDN193189.
- S5-1 Medium StemFit Basic 03 supplemented with 10 ⁇ M ALK5 inhibitor, 10 ⁇ M DAPT, 33.3 ng / mL EGF, 100 nM retinoic acid, 1 ⁇ M T3, 44 ⁇ g / mL vitamin C.
- S5-2 medium StemFit Basic 03 supplemented with 10 ⁇ M ALK5 inhibitor, 10 ⁇ M DAPT, 33.3 ng / mL EGF, 25 nM retinoic acid, 1 ⁇ M T3.
- the test compound and negative control 0.01% DMSO
- Insulin staining was performed on the 14th day (at the end of stage 4) and the 21st day (at the end of stage 5) to confirm the effect on the positive of 1. and PDX1.
- the GSIS assay was performed on day 21.
- Nuclei were identified by DAPI staining and positive antibody staining was determined by the fluorescence intensity of the cytoplasmic region surrounding the nuclei. The number of cells positive for both insulin and GFP was counted and normalized by the total number of DAPI-positive cells or the positive area area. The median quadruple data was calculated and screening hits were defined as conditions with increased insulin and GFP positive cell counts compared to DMSO controls. The primary hit compounds were further tested for dose dependence and reproducibility as described in the text. The activity of the candidate compound was confirmed using the resynthesized compound. The activity of the selected candidate compounds was further analyzed by the Toe Human iPS Cell Assay System to select hit compounds that are effective against both mouse and human ⁇ -cell differentiation. Compounds were added as described above and efficacy was assessed by mRNA expression level by q-PCR in a series of experiments. Screening hits were defined as a dose-dependent condition with increased insulin expression levels compared to ⁇ -actin over DMSO controls.
- Mouse anti-NKX6.1 (Developmental Systems Hybridma Bank, University of Iowa; F64A6B4; 1 / 100x), Mormot anti-INSULIN (Dako; IR002; I1 / I-Si2; , Rabbit anti-C-peptide (Cell Signaling; 4595; 1 / 100x), rabbit anti-GFP (MBL International Corp; 598; 1 / 1000x), and mouse anti-GLUCAGON (Sigma-Aldrich; G2654; 1 / 1000x).
- the secondary antibodies used were Alexa 488-binding goat anti-mouse IgG (Invitrogen, A11029, 1/1000x), Alexa 488-binding donkey anti-guinea pig IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratory, 706-546-148), AF647-binding donkey anti-rabbit IgG.
- AF568-conjugated donkey anti-mouse IgG (BIOTIUM, 20105), Alexa 568-conjugated goat anti-guinea pig IgG (Invitrogen, A11075, 1/1000x), Alexa 568-conjugated goat A11031, 1/1000x), Alexa 568-binding goat anti-rabbit IgG (Invitrogen, A11036, 1/1000x), Alexa 633-binding goat anti-rabbit IgG (Invitrogen, A21072, 1/1000x). Cells were counterstained with DAPI (Thermo Fisher, D1306).
- Quantitative real-time PCR CDNA preparation of mouse ES cells is performed using the VILO master mix, and real-time PCR analysis is performed using the Taqman qPCR assay (Applied Biosystems TaqMan gene expression assay ID: mouse Hprt1, Mm03024075_m1; went. Gene expression was calculated by using a standard curve for each gene created by using a dilution series of the appropriate test sample mixture. The expression level of each gene was corrected by the Hprt1 expression level.
- GSIS glucose-stimulated insulin secretion
- High glucose stimulation was initiated by adding an additional amount of glucose to the cell suspension to increase the final glucose concentration from 3 to 20 mM. Sampling of the supernatant over time (10, 30, 60 minutes after the start of HG stimulation; 10 minutes for HG, 30 minutes for HG, and 60 minutes for HG, respectively), followed by 100 ⁇ M eccentric 4 and 20 mM KCl in sequence. It was added and incubated for 30 minutes (Ex4 30 minutes and KCl 30 minutes, respectively).
- the batch mode GSIS assay was performed as follows. After washing the resulting aliquot of human iPS- ⁇ cells with LG-KRBH as described above, the cells are incubated in LG-HKRB buffer for 30 minutes or 1 hour, followed by the same in HG-HKRB buffer. Incubated for hours. In some experiments, after washing the cells, the cells were divided into several aliquots and incubated for 1 hour in HG-HKRB buffer containing 0.01% DMSO or several insulin secretagogues. The C-peptide concentration of the sample was measured using an alphaLISA C-peptide kit (PerkinElmer, AL299F) or C-peptide ELISA and adjusted for the DNA content of the cells used in the GSIS assay.
- Neural cells play an inhibitory role in pancreatic differentiation of pluripotent stem cells. Genes Cells 1028-1045. Sakano, D., Shiraki, N., Kikawa, K., Yamazoe, T., Kataoka, M., Umeda, K., Araki, K., Mao, D., Matsumoto, S., Nakagata, N., et al. (2014). VMAT2 identified as a regulator of late-stage ⁇ -cell differentiation. Nat. Chem. Biol.
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Abstract
Description
[1]
多能性幹細胞をインスリン産生細胞に分化させることによりインスリン産生細胞を作製する方法であって、一般式(I)
R1:水素原子、ハロゲン原子、またはC1-C6アルキル基
R2:水素原子、またはC1-C6アルキル基
R3:置換基群αより独立して選択される1~4の置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基群αより独立して選択される1~4の置換基で置換されていてもよいC5-C10シクロアルケニル基、または置換基群αより独立して選択される1~4の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル基
置換基群α:ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、C1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシ基、ハロゲノC1-C6アルキル基、ハロゲノC1-C6アルコキシ基、ヒドロキシC1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシC1-C6アルコキシ基、(C1-C6アルキル)カルボニル基、(C1-C6アルコキシ)カルボニル基、(C1-C6アルコキシ)カルボニルオキシ基、フェニルC1-C6アルコキシ基、非芳香族ヘテロシクリル基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したC1-C6アルコキシ基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されたスルファモイル基、置換基群βより独立して選択される1~4の置換基で置換されていてもよいフェノキシ基、置換基群βより独立して選択される1~4の置換基で置換されていてもよいフェニル基、および置換基群βより独立して選択される1~4の置換基で置換されていてもよいベンゾイル基
置換基群β:ハロゲン原子、C1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシ基、ハロゲノC1-C6アルキル基、ハロゲノC1-C6アルコキシ基、および(C1-C6アルコキシ)カルボニル基
n:0、または1
A:下記式(i)~(iv)のいずれかで表される基
・および*:結合手を示し、・は一般式(I)のアミド基の窒素原子に結合し、*はR3に結合する
R4:水素原子、C1-C6アルキル基、ハロゲノC1-C6アルキル基、または(C1-C6アルコキシ)カルボニル基
R5:水素原子、ハロゲン原子、またはC1-C6アルキル基
Y:NまたはCH)]
で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を三次元培養する工程を含むことを特徴とするインスリン産生細胞の作製法。
[2]
一般式(I)で表される化合物におけるR3がナフチル基、1,3-ベンゾジオキソリル基、2,2-ジハロゲノ-1,3-ベンゾジオキソリル基、C5-C10シクロアルケニル基、置換基群α1より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群α1より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよい5もしくは6員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする[1]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
置換基群α1:ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、C1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシ基、ハロゲノC1-C6アルキル基、ハロゲノC1-C6アルコキシ基、ヒドロキシC1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシC1-C6アルコキシ基、(C1-C6アルキル)カルボニル基、(C1-C6アルコキシ)カルボニル基、(C1-C6アルコキシ)カルボニルオキシ基、フェニルC1-C6アルコキシ基、5もしくは6員環非芳香族ヘテロシクリル基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したC1-C6アルコキシ基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β1より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β1:ハロゲン原子、C1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシ基、および(C1-C6アルコキシ)カルボニル基
[3]
一般式(I)で表される化合物におけるR3がナフチル基、1,3-ベンゾジオキソリル基、2,2-ジハロゲノ-1,3-ベンゾジオキソリル基、C5-C10シクロアルケニル基、置換基群α2より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ2より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよい5もしくは6員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする[1]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
置換基群α2:ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、C1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシ基、ハロゲノC1-C6アルキル基、ハロゲノC1-C6アルコキシ基、ヒドロキシC1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシC1-C6アルコキシ基、(C1-C6アルキル)カルボニル基、(C1-C6アルコキシ)カルボニル基、(C1-C6アルコキシ)カルボニルオキシ基、フェニルC1-C6アルコキシ基、5もしくは6員環非芳香族ヘテロシクリル基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したC1-C6アルコキシ基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β2より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β2:ハロゲン原子、C1-C6アルキル基、およびC1-C6アルコキシ基
置換基群γ2:ハロゲン原子、C1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシ基、(C1-C6アルキル)カルボニル基、および(C1-C6アルコキシ)カルボニル基
[4]
一般式(I)で表される化合物におけるR3がナフチル基、1,3-ベンゾジオキソリル基、2,2-ジフルオロ-1,3-ベンゾジオキソリル基、C5-C8シクロアルケン-1-イル基、置換基群α3より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ3より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよい5もしくは6員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする[1]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
置換基群α3:ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、C1-C4アルキル基、C1-C4アルコキシ基、ハロゲノC1-C2アルキル基、ハロゲノC1-C2アルコキシ基、ヒドロキシC1-C4アルキル基、C1-C2アルコキシC1-C2アルコキシ基、(C1-C4アルキル)カルボニル基、(C1-C4アルコキシ)カルボニル基、(C1-C4アルコキシ)カルボニルオキシ基、フェニルC1-C4アルコキシ基、モルホリン-1-イル基、1つもしくは2つのC1-C4アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、1つもしくは2つのC1-C4アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したC1-C2アルコキシ基、1つもしくは2つのC1-C4アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β3より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β3:フッ素原子、塩素原子、C1-C4アルキル基、およびC1-C4アルコキシ基
置換基群γ3:ハロゲン原子、C1-C4アルキル基、C1-C4アルコキシ基、(C1-C4アルキル)カルボニル基、および(C1-C4アルコキシ)カルボニル基
[5]
一般式(I)で表される化合物におけるR1が水素原子、塩素原子、またはメチル基であることを特徴とする[1]~[4]のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[6]
一般式(I)で表される化合物におけるR2が水素原子、またはメチル基であることを特徴とする[1]~[5]のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[7]
一般式(I)で表される化合物におけるAが式(i)で表される基であって、R4が水素原子、C1-C6アルキル基、ハロゲノC1-C6アルキル基、または(C1-C6アルコキシ)カルボニル基であることを特徴とする[1]~[6]のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[8]
一般式(I)で表される化合物におけるR4が水素原子、メチル基、またはトリフルオロメチル基であることを特徴とする[7]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[9]
一般式(I)で表される化合物におけるAが式(ii)で表される基であって、R5が水素原子、ハロゲン原子、またはC1-C6アルキル基であることを特徴とする[1]~[6]のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[10]
一般式(I)で表される化合物におけるR5が水素原子、フッ素原子、またはメチル基であることを特徴とする[9]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[11]
一般式(I)で表される化合物におけるAが式(iii)で表される基であって、R5が水素原子、フッ素原子、またはメチル基であることを特徴とする[1]~[6]のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[12]
一般式(I)で表される化合物におけるAが式(iv)で表される基であることを特徴とする[1]~[6]のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[13]
一般式(I)で表される化合物におけるnが1であることを特徴とする[1]~[12]のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[14]
一般式(I)で表される化合物におけるR3が2,2-ジフルオロ-1,3-ベンゾジオキソリル基、1-tert-ブトキシカルボニル-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-4-イル基、またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、tert-ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、2,2,2-トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよいフェニル基であることを特徴とする[1]~[13]のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[15]
一般式(I)で表される化合物におけるR3がフェニル基またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、tert-ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、2,2,2-トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より選択されるいずれか1つの置換基でm位またはp位が置換されたフェニル基であることを特徴とする[1]~[13]のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[16]
一般式(I)で表される化合物が、以下の化合物群から選択されるいずれか1つであることを特徴とする[1]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
多能性幹細胞が、ヒトES細胞またはヒトiPS細胞である[1]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[18]
三次元培養が低接着性または非接着性の培養容器内で行われることを特徴とする[1]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[19]
多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化過程が以下の工程1~5を含み、工程3、工程4および工程5からなる群から選択される少なくとも一つの工程において、一般式(I)で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を培養することを特徴とする[1]~[18]のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法
工程1:多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導する工程、
工程2:胚体内胚葉細胞から原始腸管細胞を誘導する工程、
工程3:原始腸管細胞から膵臓前駆細胞を誘導する工程、
工程4:膵臓前駆細胞から膵内分泌前駆細胞を誘導する工程、および
工程5:膵内分泌前駆細胞からインスリン産生細胞を誘導する工程。
[20]
工程3、工程4および工程5において、一般式(I)で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を培養することを特徴とする[19]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[21]
工程1において、メチオニン除去培地による前処理をした多能性幹細胞を用いることを特徴とする [19]に記載のインスリン産生細胞の作製法。
[22]
[1]~[21]のいずれか1項に記載の方法で作製された多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞。
[23]
[1]~[21]のいずれか1項に記載の方法で作製された多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞を含むインスリン分泌異常又はインスリン分泌不全に起因する疾患の治療薬。
[24]
インスリン分泌異常又はインスリン分泌不全に起因する疾患が、1型糖尿病又は2型糖尿病である[23]に記載の治療薬。
本発明は、多能性幹細胞をインスリン産生細胞に分化させることによりインスリン産生細胞を作製する方法であって、一般式(I)であらわされる化合物またはその塩を含む培地で細胞を三次元培養する工程を含むことを特徴とするインスリン産生細胞の作製法を提供する。一般式(I)で表される化合物またはその塩のインスリン産生細胞への分化促進効果は、後述の参考例1や実施例1の方法により確認することができる。
前処理:多能性幹細胞を未分化維持培地(例えば、StemFit AK03N培地(味の素))中1×106細胞/mLの濃度で低付着6ウェルプレートに移し、ロータリーシェーカー(95 rpm)上で24時間以上培養する。以降の培養工程にも、同条件で三次元培養を適用する。分化誘導開始日に、培地を、AK03Nベースのメチオニン除去培地(KA01,味の素)に交換し、細胞を5時間培養する。
ステージ1;多能性幹細胞(前処理されていても良い)を、一般式(I)で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ1用培地で1~4日間培養して、胚体内胚葉細胞を誘導する。好ましくは、分化培地1-1またはM1-1 AKM培地で24時間培養した後、培地を分化培地1-2またはM1-2 AKM培地に交換して1~2日間培養する。
ステージ2:胚体内胚葉細胞を含む培養物を、一般式(I)で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ2用培地で2~6日間培養し、原始腸管細胞を誘導する。好ましくは、分化培地2、M2 AKM培地またはS2培地で2~3日間培養する。別の例としては、亜鉛濃度を低減させたステージ2用培地(例えば、M2 AKM培地)で2日間培養し、その後通常の亜鉛濃度のステージ2用培地(例えば、S2培地、分化培地2)で2~3日間培養する。
ステージ3:原始腸管細胞を含む培養物を、一般式(I)で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ3用培地で2~8日間培養して膵臓前駆細胞を誘導する。好ましくは、分化培地3で5~7日間またはS3培地で2~4日間培養する。
ステージ4:膵臓前駆細胞を含む培養物を、一般式(I)で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ4用培地で1~7日間培養し、膵内分泌前駆細胞を誘導する。好ましくは分化培地4で2~3日間、または、S4培地で4~6日間培養する。
ステージ5:膵内分泌前駆細胞を含む培養物を、一般式(I)で表される化合物またはその塩を含んでいても良いステージ5用培地で5~20日間培養し、インスリン産生細胞を誘導する。好ましくは、分化培地5で10~15日間培養する。別の態様としては、0.1μM以上のレチノイン酸を含むステージ5用培地(例えば、S5-1培地)で3~5日間培養し、その後0.05μM以下の低濃度のレチノイン酸を含むステージ5用培地(例えば、S5-2培地)で2~4日間培養する。
AKM培地はインスリンおよびZn2+除去StemFit Basic 03培地(味の素)である。
(ステージ1用培地例)
分化培地1-1;DMEM高グルコース、L-Gln、NEAA、0.01mMのβ-メルカプトエタノール、100ng/mLのアクチビンA、B27サプリメント、3μMのCHIR99021
分化培地1-2:DMEM高グルコース、L-Gln、NEAA、0.01mMのβ-メルカプトエタノール、100ng/mLのアクチビンA、B27サプリメント
M1-1 AKM培地:100ng/mLのアクチビンA、3μMのCHIR990221を添加し、100ng/mLのIGF1および0.5μMのZnを補充したAKM培地。
M1-2 AKM培地:100ng/mLアクチビンAを添加し、100ng/mLのIGF1および0.5μMのZnを補充したAKM培地。
(ステージ2用培地例)
分化培地2:RPMI、L-Gln、NEAA、0.01mMのβ-メルカプトエタノール、インスリンを除いたB27サプリメント、50ng/mLのFGF10、0.25μMのSANT1。
M2 AKM培地:50ng/mLのFGF10、250nMのSANT1を添加し、0.5μMのZnを補充したAKM培地。
S2培地:50ng/mLのKGFと44μg/mLのビタミンCを補充したStemFit Basic 03。
(ステージ3用培地例)
分化培地3:DMEM高グルコース、L-Gln、NEAA、0.01mMのβ-メルカプトエタノール、0.15μMのSANT1、2μMのレチノイン酸、0.1μMのLDN193189、B27サプリメント。
S3培地:50ng/mLのKGF、50nMのインドラクタムV、2μMのレチノイン酸、250nMのSANT1、44μg/mLのビタミンCを補充したStemFit Basic 03。
(ステージ4用培地例)
分化培地4:DMEM高グルコース、L-Gln、NEAA、0.01mMのβ-メルカプトエタノール、5μMのALK5阻害剤(Calbiochem, 616452)、0.3μMのインドラクタムV、0.1μMのLDN193189、B27サプリメント
S4培地:50ng/mLのKGF、100nMのレチノイン酸、250nMのSANT1、44μg/mLのビタミンC、100nMのLDN193189を補充したStemFit Basic 03。
(ステージ5用培地例)
分化培地5:KO DMEM/F12 、L-Gln、NEAA、0.01mMのβ-メルカプトエタノール、50ng/mLのエキセンディン4、10mMのニコチンアミド、10μMのZnSO4、1mMのN-アセチル-L-システイン、B27サプリメント。
S5-1培地:10μMのALK5阻害剤、10μMのDAPT、33.3ng/mLのEGF、100nMのレチノイン酸、1μMのT3、44μg/mLのビタミンCを補充したStemFit Basic 03。
S5-2培地:10μMのALK5阻害剤、10μMのDAPT、33.3 ng/mLのEGF、25 nMのレチノイン酸、1μMのT3を補充したStemFit Basic 03。
本発明における一般式(I)で表される化合物の好ましい態様について以下に説明する。
で表されるジヒドロピロリジノン(dihydropyrrolizinone)構造を有する化合物であり、n=1のとき、一般式(I)で表される化合物は以下の式(III):
で表されるジヒドロインドリジノン構造を有する化合物である。本発明におけるnとして好適にはn=1であり、ジヒドロインドリジノン構造を有する化合物がより好ましい。
で表される基である。
で表される化合物である。
で表される化合物である。R5の置換位置としては任意の位置を取ることができ、以下に示す(V-i)~(V-iii)をとり得る。
で表される化合物である。R5の置換位置としては任意の位置を取ることができ、以下に示す(VI-i)~(VI-iii)をとり得る。
で表される化合物である。
N-[5-(4-イソプロポキシフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
N-[5-(4-tert-ブトキシフェニル)-4-メチルチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
8-オキソ-N-[5-[4-(2,2,2-トリフルオロエトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
N-[6-(4-クロロフェニル)-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
8-オキソ-N-[5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドの光学活性体はそれぞれ、
(5R)-8-オキソ-N-[5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド、または
(5S)-8-オキソ-N-[5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドであり、
N-[5-(4-tert-ブトキシフェニル)-4-メチルチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドの光学活性体はそれぞれ、
(5R)-N-[5-(4-tert-ブトキシフェニル)-4-メチルチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド、または
(5S)-N-[5-(4-tert-ブトキシフェニル)-4-メチルチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドである。
「その塩」とは化合物では、酸性基または塩基性基を有する場合に、塩基または酸と反応させることにより、「塩基との塩」または「酸付加塩」にすることができるので、その塩を示す。温血動物(特にヒト)に対する治療の目的で使用する場合、その塩は薬学的に許容される塩が好ましい。また、「その塩」および「薬学的に許容される塩」とは、その水和物も包含する。
一般式(I)で表される化合物またはその塩は、大気中に放置したりまたは再結晶をすることにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となったりする場合があり、本発明には、そのような各種の水和物、溶媒和物および結晶多形の化合物も包含する。
一般式(I)で表される化合物には、置換基の種類によって、互変異性体や幾何異性体が存在しうる。本明細書中、一般式(I)で表される化合物が異性体の一形態のみで記載されることがあるが、本発明は、それ以外の異性体も包含し、異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
一般式(I)で表される化合物には、不斉炭素原子や軸不斉を有する場合があり、これに基づく光学異性体が存在しうる。本発明は、光学異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
一般式(I)で表される化合物は、ラベル体、すなわち、化合物の1または2以上の原子を同位元素(例えば、2H、3H、13C、14C、35S等)で置換した化合物も含まれる。
本発明には、一般式(I)で表される化合物の薬理学上許容されるプロドラッグも包含する。薬理学上許容されるプロドラッグとは、加溶媒分解によりまたは生理学的条件下で、アミノ基、水酸基、カルボキシ基等に変換されうる基を有する化合物である。プロドラッグを形成する基としては、例えば、Prog.Med,5,2157-2161(1985)に記載の基が挙げられる。
次に、一般式(I)で表される化合物の代表的な製造方法について説明する。一般式(I)で表される化合物は種々の製造方法により製造することができ、以下に示す製造方法は一例であり、本発明はこれらに限定して解釈されるべきではない。
A法は一般式(I)で表される化合物を製造する際に合成中間体として用いることのできる化合物(A2)を製造する方法である。化合物(A2)は本法および実施例で例示される合成法の他に公知の方法またはその変法などによっても製造することができる。
工程A-1は化合物(A1)に対して等量もしくは過剰量のハロゲン化剤もしくはブロモトリメチルシラン、およびチオウレアを作用させ、化合物(A2)を製造する工程である。ハロゲン化剤としては塩素、臭素などが挙げられる。反応の溶媒は、反応が進行する限り特に限定はされないが、ジクロロメタン、クロロホルム、エタノール、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド、酢酸等が用いられる。反応温度は通常、0~100℃であり、反応時間は通常、0.5時間~2日間程度である。
B法は一般式(I)で表される化合物を製造する際に合成中間体として用いることのできる化合物(B3)を製造する方法である。以下の図中のP1およびP2はアミノ基の保護基あるいは水素原子を示し、具体的な保護基としてはBoc基(tert-ブトキシカルボニル基)、Cbz基(ベンジルオキシカルボニル基)、ベンジリデン基、またはジフェニルメチレン基などが挙げられる。P1がベンジリデン基、ジフェニルメチレン基の場合にはP2はP1と同一保護基を示す。R3およびAはそれらに含まれる置換基上に保護基を有していてもよく、各工程は必要に応じて置換基の保護や保護基の除去を行う工程を含む。
工程B-1は化合物(B1)のA上の置換基X1に対し、パラジウム触媒存在下、等量もしくは過剰量のボロン酸もしくはボロン酸エステル(R3-B(OH)2またはR3-B(OR)2、Rは任意のアルキル基を示す)を用いる条件(鈴木・宮浦カップリング);有機スズ試薬(R3-SnR3)を用いる条件(Stilleカップリング);または有機亜鉛試薬(R3-ZnX;Xはハロゲン原子を示す)を用いる条件(根岸カップリング)等により、置換基R3の導入を行って化合物(B2)を得る工程である。上記反応では必要により、塩基を加えることができる。パラジウム触媒としては、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム、[1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]パラジウム(II)ジクロリド ジクロロメタン錯体(1:1)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2´4´6´-トリイソプロピル-1,1´-ビフェニル)[2-(2´-アミノ-1,1´-ビフェニル)]パラジウム(II)、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム、酢酸パラジウム(II)、アセチルアセトンパラジウム(II)、またはビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ジクロリド等が挙げられる。また、塩基としてはトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)、または1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]-5-ノネン(DBN)等の有機塩基、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、リン酸カリウム、またはリン酸ナトリウム等の無機塩基が挙げられる。反応溶媒としては、反応が進行する限り特に限定はされないが、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、1,4-ジオキサン、水、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン、またはこれらの混合物等を挙げることができる。反応温度は通常20~150℃程度である。反応時間は通常1時間~2日程度である。本カップリング反応についてはA.MeijereおよびF.Diederich著、「Metal-Catalyzed Cross-Coupling Reactions(第2版、2004年)」に記載の方法に準じて行うことができる。
工程B-2は化合物(B2)における保護基P1およびP2を除去して化合物(B3)を製造する工程である。本工程では必要に応じてR3における保護基の脱保護を行うことができる。本反応条件は保護基P1およびP2の種類により変わるが、例えば、T.W.GreeneおよびP.G.Wuts著、「Protective Groups in Organic Synthesis(第3版、1999年)」に記載の方法に準じて行うことができる。
C法は公知の方法またはその変法などを用いて合成可能な化合物(C1)から一般式(I)で表される化合物を製造する方法である。
工程C-1は化合物(C1)に対して等量もしくは過剰量のアルキル化剤存在下、塩基で処理することにより置換基R2を導入し、化合物(C2)を製造する工程である。アルキル化剤としてはハロゲン化アルキル、メタンスルホン酸アルキルエステルまたはp-トルエンスルホン酸アルキルエステル等を用いることができる。塩基としては、カリウムヘキサメチルジシラジド、ナトリウムヘキサメチルジシラジドなどが挙げられる。反応溶媒は、反応が進行する限り特に限定はされないが、テトラヒドロフランが好ましい。反応温度は通常、-78~0℃である。反応時間は通常、0.5~24時間である。
工程C-2は化合物(C1)に対して等量もしくは過剰量のハロゲン化剤を用いてハロゲン化を行った後、アルキル化を行うことによって化合物(C3)を製造する工程である。ハロゲン化とアルキル化の順番は適宜入れ替えることができる。ハロゲン化剤としては、例えばN-ブロモスクシンイミド、N-ヨードスクシンイミドなどが挙げられる。反応溶媒は、反応が進行する限り特に限定はされないが、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミドが好ましい。反応温度は通常0~50℃程度である。反応時間は通常0.5~24時間である。アルキル化は工程C-1と同様の方法で行うことができる。
工程C-3は化合物(C3)にカップリング反応を行って化合物(C4)を製造する工程である。工程B-1と同様の方法で行うことができる。
工程C-4は化合物(C2)または化合物(C5)に対してハロゲン化、またはハロゲン化に続くカップリング反応を行って化合物(C4)または一般式(I)で表される化合物を得る工程である。ハロゲン化は工程C-2、カップリング反応は工程B-1と同様の方法で行うことができる。
工程(C-5)は化合物(C2)または化合物(C4)のカルボキシ基の保護基を除去してカルボン酸とした後、A法の化合物(A2)またはB法の化合物(B3)を等量もしくは過剰量用いて縮合を行い、化合物(C5)または一般式(I)で表される化合物を製造する工程である。カルボキシ基の脱保護はT.W.GreeneおよびP.G.Wuts著、「Protective Groups in Organic Synthesis(第3版、1999年)」に記載の方法に準じて行うことができる。縮合反応は化合物(C2)および化合物(C4)から得られたカルボン酸に対して塩基存在下、適当なスルホニル化剤または適当な縮合剤を作用させることによって行う。縮合反応では必要に応じて反応を促進する添加剤を加えることができる。スルホニル化剤としては、例えば2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド、p-トルエンスルホニルクロリド、ベンゼンスルホニルクロリドなどが挙げられる。縮合剤としては、例えばWSC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド),DCC(1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド)、DMT-MM(4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド)、CDI(1、1´-カルボニルジイミダゾール)、DEPC(ジエチルホスホロシアニダート)、DPPA(ジフェニルホスホリルアジド)などが挙げられる。塩基としては、ピリジン、ルチジンなどの芳香族アミン類やトリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、DMAP(4-ジメチルアミノピリジン)などの3級アミン類などが挙げられる。添加剤の代表的な例として、HOAt(3H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-b]ピリジン-3-オール)、HOBt(1H-ベンゾトリアゾール-1-オール)、HOSu(N-ヒドロキシスクシンイミド)などが挙げられる。反応溶媒は、反応が進行する限り特に限定はされないが、ジクロロメタン、N,N-ジメチルホルムアミドが好ましい。反応温度は通常、0~50℃である。反応時間は通常、0.5~24時間である。
工程(C-6)は化合物(C4)のカルボキシ基の保護基を除去した後、アミン誘導体と縮合し、化合物(C6)を製造する工程である。工程(C-5)と同様の方法を用いることができる。
工程(C-7)は化合物(C6)に対してカップリング反応を行って一般式(I)で表される化合物を製造する工程である。工程(B-1)と同様の方法を用いて行うことができる。
本発明の方法で製造されるインスリン産生細胞は、生体の膵臓β細胞と類似した機能を示すため、糖尿病の治療に有用である。本発明の製法で製造された細胞は、良好なインスリン産生能に加えて、周辺環境の糖レベルが低い状況ではインスリンを分泌量が少なく、糖レベルが高い環境ではインスリン分泌量が増加するという特性を有する。そのため、本発明の製法で製造される細胞は、低血糖のリスクが少なく、安全性が高い治療方法を提供する。
mg:ミリグラム,g:グラム,μL:マイクロリットル,mL:ミリリットル,mmol:ミリモル,mM:ミリモル濃度,μM:マイクロモル濃度,μm:マイクロメートル,mm:ミリメートル,MHz:メガヘルツ。
N-(5-ブロモチアゾール-2-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボン酸(1.51g,8.43mmol)、市販の5-ブロモチアゾール-2-アミン(2.64g,10.2mmol)および3-ヒドロキシトリアゾロ[4,5-b]ピリジン(1.23g,9.04mmol)のジクロロメタン(30mL)溶液に、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド 塩酸塩(2.43g,12.6mmol)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.94mL,16.9mmol)を加え、室温にて2時間攪拌した。反応液を1N塩酸および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ろ過し、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/10%メタノール 酢酸エチル溶液=3/1-0/1)にて精製し、標記化合物1.88g(収率66%)を固体として得た。
N-(4-ブロモフェニル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の4-ブロモアニリンを用いて、参考合成例1の方法に準じて標記化合物4.66g(収率84%)を固体として得た。
N-(4-ブロモ-2-フルオロ-フェニル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の4-ブロモ-2-フルオロアニリンを用いて、参考合成例1の方法に準じて標記化合物345mg(収率58%)を固体として得た。
N-(5-ブロモ-4-メチル-チアゾール-2-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の5-ブロモ-4-メチル-チアゾール-2-アミンを用いて、参考合成例1の方法に準じて標記化合物252mg(収率25%)を固体として得た。
N-(6-ブロモ-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の2-アミノ-6-ブロモベンゾチアゾールを用いて、参考合成例1の方法に準じて標記化合物585mg(収率42%)を固体として得た。
N-(4-ブロモ-2-メチル-フェニル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の4-ブロモ-2-メチル-アニリンを用いて、参考合成例1の方法に準じて標記化合物515mg(収率66%)を固体として得た。
N-(5-ブロモ-2-ピリジル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の5-ブロモピリジン-2-アミンを用いて、参考合成例1の方法に準じて標記化合物455mg(収率58%)を固体として得た。
N-(2-クロロ-1,3-ベンゾチアゾール-6-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の2-クロロ-1,3-ベンゾチアゾール-6-アミンを用いて、参考合成例1の方法に準じて標記化合物637mg(収率76%)を固体として得た。
5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-アミン
WO2003014095記載のN-(5-ブロモチアゾール-2-イル)-1,1-ジフェニル-メタンイミン(1.46g,4.25mmol)、市販の4-(トリフルオロメトキシ)フェニルボロン酸(4.30g,20.0mmol)、炭酸カリウム(2.97g,21.5mmol)、水(3mL)および1,4-ジオキサン(15mL)の混合物に[1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]パラジウム(II)ジクロリド ジクロロメタン錯体(1:1)(338mg,0.414mmol)を加えて、窒素雰囲気下、100℃にて4時間攪拌した。反応混合物に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を合わせ、水および飽和食塩水にて洗浄した後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル=9/1-3/1)にて精製した。得られた油状物のメタノール(20mL)溶液に、1N塩酸(5mL,5.0mmol)を加え、室温にて5.5時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮し、析出した固体をジクロロメタンにて洗浄し、標記化合物897mg(収率81%)を固体として得た。
tert-ブチル N-[5-[4-(ジメチルカルバモイル)フェニル]チアゾール-2-イル]カーバメート
市販のtert-ブチル N-(5-ブロモチアゾール-2-イル)カーバメート(500mg,1.89mmol)の1,4-ジオキサン(30mL)溶液に、室温にて[4-(ジメチルカルバモイル)フェニル]ボロン酸(519mg,2.69mmol)および[1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]パラジウム(II)ジクロリド ジクロロメタン錯体(1:1)(74mg,0.09mmol)を加え攪拌した。反応混合物に炭酸カリウム(743mg,5.38mmol)および水(3.0mL)を加え、アルゴン雰囲気下、100℃にて4.5時間攪拌した。反応混合物に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を合わせ、水および飽和食塩水にて洗浄した後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=100/0-93/7、90/10-70/30)にて精製し、標記化合物172mg(収率28%)を固体として得た。
4-(2-アミノチアゾール-5-イル)-N,N-ジメチルベンズアミド
参考合成例10で得られたtert-ブチル N-[5-[4-(ジメチルカルバモイル)フェニル]チアゾール-2-イル]カーバメート(172mg、0.495mmol)のジクロロメタン(10mL)溶液に、室温にてトリフルオロ酢酸(2.0mL,26mmol)を加え、攪拌した後、放置した。反応液を減圧濃縮し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、ジクロロメタンにて抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物118mg(収率96%)を固体として得た。
5-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)チアゾール-2-アミン
市販の1,3-ベンゾジオキソール-5-イルボロン酸を用いて、参考合成例10の方法に準じて成績体を得た後、参考合成例11の方法に準じて標記化合物123mg(31%,2steps)を固体として得た。
4-(2-アミノチアゾール-5-イル)ベンゾニトリル
市販の4-(2-オキソエチル)ベンゾニトリル(142mg,0978mmol)のジクロロメタン(10mL)溶液に、氷冷下、臭素(56μL,1.09mmol)のジクロロメタン(0.56mL)溶液を加えた。反応液を室温まで戻した後、3時間攪拌した。氷冷下、反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え中和した後、ジクロロメタンにて抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣のエタノール(30mL)溶液に、チオウレア(150mg,1.97mmol)を加え、4.5時間加熱還流下、攪拌した。冷却後、減圧下にて溶媒を留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=99/1-95/5)にて精製し、標記化合物8.3mg(4.2%)を固体として得た。
tert-ブチル 2-[4-[2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)チアゾール-5-イル]フェノキシ]アセテート
市販のtert-ブチル 2-[4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェノキシ]アセテート(2.4g,7.2mmol)を用いて、参考合成例10の方法に準じて標記化合物248mg(11%)を固体として得た。
メチル 2-[4-(2-アミノチアゾール-5-イル)フェノキシ]アセテート
参考合成例14で得られたtert-ブチル 2-[4-[2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)チアゾール-5-イル]フェノキシ]アセテート(193mg,0.475mmol)を用いて、参考合成例11の方法に準じて固体を得た。得られた固体のテトラヒドロフラン(10mL)およびメタノール(3mL)の混合溶液に、室温にてトリメチルシリルジアゾメタン(0.6M ヘキサン溶液,1.0mL)を加え、6時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、ジクロロメタンにて抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=99/1-97/3)にて精製し、標記化合物92.5mg(収率74%)を固体として得た。
メチル 2-[4-[2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]チアゾール-5-イル]フェノキシ]アセテート
参考合成例15で得られたメチル 2-[4-(2-アミノチアゾール-5-イル)フェノキシ]アセテートを用いて、合成例1の方法に準じて標記化合物85.7mg(収率89%)を固体として得た。
メチル 2-ブロモ-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキシレート
市販のメチル 8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキシレート(261mg,1.35mmol)のジクロロメタン(5mL)溶液に、室温にてN-ブロモスクシンイミド(228mg,1.28mmol)を加え、4時間攪拌した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル=4/1-2/1)にて精製し、標記化合物56.9mg(収率16%)を固体として得た。
2-ブロモ-8-オキソ-N-[5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例17で得られたメチル 2-ブロモ-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキシレート(56.9mg,0.209mmol)のエタノール(2mL)溶液に、1N水酸化ナトリウム水溶液(0.5mL,0.50mmol)を加え、60℃にて2時間攪拌した。1N塩酸を用いて酸性とした後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去し、黄色固体(52.5mg)を得た。得られた固体(52.5mmol)および参考合成例9で得られた5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-アミンを用いて、合成例9の方法に準じて標記化合物48.0mg(収率55%)を固体として得た。
N-(5-ブロモチアゾール-2-イル)-2-メチル-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例17で得られたメチル 2-ブロモ-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキシレート(65.2mg,0.24mmol)、市販の2,4,6-トリメチル-1,3,5,2,4,6-トリオキサトリボリナン(0,201mL,1.44mmol)、炭酸カリウム(171mg,1.24mmol)の混合物に1,4-ジオキサン(1.5mL)および水(0.5mL)を加えた後、[1,1‘-ビス(ジ-tert-ブチルホスフィノ)フェロセン]パラジウム(II)ジクロリド(15.6mg,0.024mmol)を加え、窒素雰囲気下、100℃にて2.5時間攪拌した。反応液に水および1N塩酸を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣を用いて、参考合成例1の方法に準じて標記化合物23.9mg(収率22%)を固体として得た。
メチル 2-クロロ-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキシレート
市販のN-クロロスクシンイミドを用いて、参考合成例17の方法に準じて標記化合物56.3mg(収率5.2%)を固体として得た。
メチル 5-メチル-8-オキソ-6,7-ジヒドロインドリジン-5-カルボキシレート
市販のメチル 8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキシレート(987mg,4.89mmol)およびヨウ化メチル(1.27mL,20.4mmol)のテトラヒドロフラン溶液に、-78℃において1.0M カリウム ビス(トリメチルシリル)アミド テトラヒドロフラン溶液(11.2mL,11.2mmol)を30分以上かけて滴下した。同温度で1時間攪拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えてクエンチした。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル=6/1-1/1)にて精製し、標記化合物592mg(収率56%)を油状物として得た。
5-メチル-8-オキソ-6,7-ジヒドロインドリジン-5-カルボン酸
参考合成例21で得られたメチル 5-メチル-8-オキソ-6,7-ジヒドロインドリジン-5-カルボキシレート(63.0mg,0.304mmol)のエタノール(1.0mL)溶液に、1N水酸化ナトリウム水溶液(0.91mL,0.91mmol)を加え、80℃にて2時間攪拌した。反応液に1N塩酸を加えて中和した後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物48.3mg(収率82%)を固体として得た。
N-(5-ブロモチアゾール-2-イル)-5-メチル-8-オキソ-6,7-ジヒドロインドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例22で得られた5-メチル-8-オキソ-6,7-ジヒドロインドリジン-5-カルボン酸(472mg,2.44mmol)を用いて、参考合成例1の方法に準じて標記化合物628mg(収率73%)を固体として得た。
N-(5-ブロモ-4-イソプロピル-チアゾール-2-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の5-ブロモ-4-イソプロピル-チアゾール-2-アミンを用いて、参考合成例1の方法に準じて標記化合物287mg(収率43%)を固体として得た。
メチル 5-ブロモ-2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]チアゾール-4-カルボキシレート
市販のメチル 2-アミノ-5-ブロモチアゾール-4-カルボキシレートを用いて、参考合成例1の方法に準じて標記化合物219mg(収率29%)をアモルファス状物として得た。
8-オキソ-N-(5-フェニルチアゾール-2-イル)-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボン酸(1.5g,8.4mmol)、Journal of Medicinal Chemistry 1983, 26, 1158-1163記載の5-フェニルチアゾール-2-アミン(1.0g,5.7mmol)、N,N-ジメチルピリジン-4-アミン(0.14g,1.1mmol)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.5mL,14mmol)のジクロロメタン(50mL)溶液に、室温にて市販の2,4,6-トリイソプロピルスルホニル クロリド(2.5g,8.3mmol)を加え、3時間攪拌した。反応液にジクロロメタンを加え希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=99/1-95/5)にて精製し、標記化合物1.59g(収率83%)を固体として得た。
メチル 4-[2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]チアゾール-5-イル]ベンゾエート
WO2012121168記載のメチル 4-(2-アミノチアゾール-5-イル)ベンゾエートを用いて、合成例1の方法に準じて標記化合物18.4g(収率54%)を固体として得た。
N-[5-[4-(ジメチルカルバモイル)フェニル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例11で得られた4-(2-アミノチアゾール-5-イル)-N,N-ジメチルベンズアミドを用いて、合成例1の方法に準じて標記化合物7.17g(収率75%)を固体として得た。
N-[5-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例12で得られた5-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)チアゾール-2-アミンを用いて、合成例1の方法に準じて標記化合物130mg(収率62%)を固体として得た。
4-[2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]チアゾール-5-イル]安息香酸
合成例2で得られたメチル 4-[2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]チアゾール-5-イル]ベンゾエート(383mg,0.969mmol)のエタノール(3mL)および水(2mL)の混合溶液に、1N水酸化ナトリウム水溶液(3.8mL,3.8mmol)を加え、50℃にて4時間攪拌した。反応液に水を加え、1N塩酸にて中和し、析出した固体をろ取した。得られた固体を水で洗浄した後、乾燥し、標記化合物326mg(収率88%)を固体として得た。
N-[5-(4-カルバモイルフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
合成例5で得られた4-[2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]チアゾール-5-イル]安息香酸(17mg,0.045mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド(1mL)溶液に、室温にて[ジメチルアミノ(トリアゾロ[4,5-b]ピリジン-3-イロキシ)メチレン]-ジメチル-アンモニウム ヘキサフルオロホスフェート(25mg,0.067mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(39μL,0.22mmol)および7Mアンモニア メタノール溶液(64μL,0.45mmol)を加え、15時間攪拌した。反応液を直接シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/50%メタノール 酢酸エチル溶液 =95/5-90/10)にて精製し、標記化合物4.9mg(収率29%)を得た。
N-[5-(4-シアノフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例13で得られた4-(2-アミノチアゾール-5-イル)ベンゾニトリルを用いて、合成例1の方法に準じて標記化合物9.0mg(収率60%)を得た。
N-[5-[4-[2-(ジメチルアミノ)-2-オキソ-エトキシ]フェニル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例16で得られたメチル 2-[4-[2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]チアゾール-5-イル]フェノキシ]アセテート(84mg,0.197mmol)のテトラヒドロフラン(8.0mL)およびメタノール(3.0mL)の混合溶液に、室温にて5N水酸化ナトリウム水溶液(0.20mL,1.0mmol)を加え、攪拌した後、一晩放置した。5N塩酸にて中和し、減圧下にて溶媒を留去し固体を得た。得られた固体のN,N-ジメチルホルムアミド(3mL)溶液に、室温にてN,N-ジイソプロピルエチルアミン(52μL,0.30mmol)および2.0Mジメチルアミン テトラヒドロフラン溶液(0.50mL, 1.0mmol)を加えた後、[ジメチルアミノ(トリアゾロ[4,5-b]ピリジン-3-イロキシ)メチレン]ジメチルアンモニウム ヘキサフルオロホスフェート(42mg,0.11mmol)を加え、3時間攪拌した。反応液にジクロロメタンを加え希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=99/1-95/5)にて精製し、標記化合物39.1mg(収率89%)を固体として得た。
8-オキソ-N-[5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボン酸(109mg,0.61mmol)、参考合成例9で得られた5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-アミン(127mg,0.488mmol)、3-ヒドロキシトリアゾール[4,5-b]ピリジン(128mg,0.941mmol)のジクロロメタン(3mL)溶液に、室温にて1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド 塩酸塩(352mg,1.84mmol)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.531mL,3.05mmol)を加え、室温にて2時間攪拌した。反応液をジクロロメタンにて希釈した後、水および飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、ろ過し、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル溶液=3/1-0/1)にて精製し、標記化合物74.3mg(収率29%)を固体として得た。
(5R)-8-オキソ-N-[5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド および
(5S)-8-オキソ-N-[5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
合成例9で得られた8-オキソ-N-[5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドを用いてHPLC(カラム:YMC CHIRAL ART Cellulose-SB(5μm) 250x30mmI.D.、流速:31.8ml/min、溶媒:n-ヘキサン/エタノール=70/30)にて光学分割を行った。先に溶出する第一ピークを集めた後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物(48mg,光学純度 99.9%ee)を固体として得た。また、後から溶出する第二ピークを集めた後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物(48mg,光学純度 99.8%ee)を固体として得た。
N-[5-(4-tert-ブトキシフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例1で得られたN-(5-ブロモチアゾール-2-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド(137mg,0.401mmol)、市販の(4-tert-ブトキシフェニル)ボロン酸(389mg,2.01mmol)、炭酸セシウム(670mg,2.06mmol)の混合物にN,N-ジメチルホルムアミド(2mL)および水(1mL)を加えた後、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2´,4´,6´-トリイソプロピル-1,1´-ビフェニル)[2-(2´-アミノ-1,1´-ビフェニル)]パラジウム(II)(33.2mg,0.042mmol)を加え、窒素雰囲気下、90℃にて5時間攪拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル=3/1-0/1)にて精製し、標記化合物63.3mg(収率39%)を固体として得た。
N-[5-(4-クロロフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の4-クロロフェニルボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物11.0mg(収率6.4%)を固体として得た。
N-[5-(3-クロロフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の5-(3-クロロフェニル)チアゾール-2-アミンを用いて、合成例9の方法に準じて標記化合物158mg(収率48%)を固体として得た。
N-[5-(2-クロロフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の2-クロロフェニルボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物13.2mg(収率8.0%)を得た。
N-[5-(3-フルオロフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の5-(3-フルオロフェニル)チアゾール-2-アミンを用いて、合成例1の方法に準じて標記化合物127mg(収率87%)を固体として得た。
N-[5-(4-フルオロフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の5-(4-フルオロフェニル)チアゾール-2-アミンを用いて、合成例1の方法に準じて標記化合物198mg(収率64%)を固体として得た。
N-[5-(2-フルオロフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の5-(2-フルオロフェニル)チアゾール-2-アミンを用いて、合成例1の方法に準じて標記化合物119mg(収率82%)を固体として得た。
8-オキソ-N-[5-(p-トリル)チアゾール]-2-イル)-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の4-メチルフェニルボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物24.7mg(収率18%)を固体として得た。
N-[5-(o-トリル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の2-メチルフェニルボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物16.6mg(収率11%)を固体として得た。
N-[5-(m-トリル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の5-(m-トリル)チアゾール-2-アミンを用いて、合成例9の方法に準じて標記化合物115mg(収率58%)を得た。
8-オキソ-N-[5-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の[4-(トリフルオロメチル)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物32.9mg(収率17%)を得た。
N-[5-[4-(2-メトキシフェニル)フェニル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の[4-(2-メトキシフェニル)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物3.6mg(収率16%)を得た。
8-オキソ-N-[5-[4-(p-トリル)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の[4-(p-トリル)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物9.0mg(収率42%)を得た。
N-[5-(2-ナフチル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の4,4,5,5-テトラメチル-2-(2-ナフチル)-1,3,2-ジオキサボロランを用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物1.6mg(収率8.2%)を得た。
8-オキソ-N-[5-[3-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の[3-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物9.0mg(収率43%)を得た。
N-[5-(4-メトキシフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の(4-メトキシフェニル)ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物19.7mg(収率17%)を固体として得た。
N-[5-(3-メトキシフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の(3-メトキシフェニル)ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物1.9mg(収率38%)を得た。
N-[5-[2-メチル-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の[2-メチル-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物4.2mg(収率19%)を得た。
N-[5-[3-メチル-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の[3-メチル-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物8.4mg(収率38%)を得た。
N-[5-[3-クロロ-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の[3-クロロ-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物2.8mg(収率12%)を得た。
N-[5-[3-(ヒドロキシメチル)-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の[3-(ヒドロキシメチル)-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物9.1mg(収率40%)を得た。
N-[5-(4-ベンジルオキシフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の(4-ベンジルオキシフェニル)ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物7.6mg(収率34%)を得た。
N-[5-(4-イソプロポキシフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の(4-イソプロポキシフェニル)ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物29.0mg(収率24%)を固体として得た。
N-(4-メチル-5-フェニルチアゾール-2-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の4-メチル-5-フェニルチアゾール-2-アミンを用いて、合成例9の方法に準じて標記化合物160mg(収率82%)を得た。
N-[5-(4-tert-ブトキシフェニル)-4-メチルチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例4で得られたN-(5-ブロモ-4-メチルチアゾール-2-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド(106mg,0.300mmol)、市販の(4-tert-ブトキシフェニル)ボロン酸(292mg,1.50mmol)、炭酸セシウム(596mg,1.83mmol)の混合物にN,N-ジメチルホルムアミド(1.5mL)および水(1mL)を加えた後、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2´,4´,6´-トリイソプロピル-1,1´-ビフェニル)[2-(2´-アミノ-1,1´-ビフェニル)]パラジウム(II)(25.0mg,0.032mmol)を加え、窒素雰囲気下、90℃にて5時間攪拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル=3/1-0/1)にて精製した後、得られた固体をジエチルエーテルにて洗浄し、標記化合物65.0mg(収率51%)を固体として得た。
N-[4-メチル-5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例35の方法に準じて標記化合物72.0mg(収率49%)を得た。
N-[5-[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の[4-(ヒドロキシメチル)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物5.3mg(収率29%)を得た。
N-[5-[4-(2-メトキシエトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の[4-(2-メトキシエトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物0.6mg(収率2.7%)を得た。
N-[5-[4-(ジフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の[4-(ジフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物7.0mg(収率35%)を得た。
N-[5-(2,2-ジフルオロ-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の(2,2-ジフルオロ-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物9.4mg(収率45%)を得た。
N-[5-(4-モルフォリノフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の4-[4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル]モルホリンを用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物27.6mg(収率24%)を固体として得た。
N-[5-[4-(ジメチルスルファモイル)フェニル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の[4-(ジメチルスルファモイル)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物9.7mg(収率44%)を得た。
N-[5-(4-ベンジルオキシ-3-フルオロフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の(4-ベンジルオキシ-3-フルオロフェニル)ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物62.8mg(収率33%)を固体として得た。
N-[5-(4-ベンジルオキシ-2-フルオロフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の(4-ベンジルオキシ-2-フルオロフェニル)ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物9.7mg(収率42%)を得た。
8-オキソ-N-[5-[4-(2,2,2-トリフルオロエトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の[4-(2,2,2-トリフルオロエトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物53.0mg(収率28%)を固体として得た。
8-オキソ-N-[5-(4-フェノキシフェニル)チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の(4-フェノキシフェニル)ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物53.0mg(収率29%)を固体として得た。
N-[5-(4-ブロモフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の5-(4-ブロモフェニル)チアゾール-2-アミンを用いて、合成例9の方法に準じて標記化合物755mg(収率59%)を固体として得た。
tert-ブチル [4-[2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]チアゾール-5-イル]フェニル]カーボネート
市販の(4-tert-ブトキシカルボニルオキシフェニル)ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物1.0mg(収率4.3%)得た。
N-[5-(4-イソブトキシフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の(4-イソブトキシフェニル)ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物6.5mg(収率32%)を得た。
N-[5-(シクロヘキセン-1-イル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の2-(シクロヘキセン-1-イル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロランを用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物13.8mg(収率13%)を固体として得た。
tert-ブチル 4-[2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]チアゾール-5-イル]-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-カルボキシレート
市販のtert-ブチル 4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-カルボキシレートを用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物7.7mg(収率35%)を得た。
N-[5-(5-クロロ-6-イソブトキシ-3-ピリジル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の(5-クロロ-6-イソブトキシ-3-ピリジル)ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物3.2mg(収率15%)を得た。
tert-ブチル 3-[2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]チアゾール-5-イル]-2,5-ジヒドロピロール-1-カルボキシレート
市販のtert-ブチル 3-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)-2,5-ジヒドロピロール-1-カルボキシレートを用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物7.6mg(収率35%)を得た。
N-[5-(5-メチル-2-フリル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の4,4,5,5-テトラメチル-2-(5-メチル-2-フリル)-1,3,2-ジオキサボロランを用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物7.3mg(収率43%)を得た。
N-[5-(2,4-ジメチルチアゾール-5-イル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の2,4-ジメチル-5-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)チアゾールを用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物3.6mg(収率19%)を得た。
N-[5-(5-クロロ-2-チエニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の(5-クロロ-2-チエニル)ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物1.0mg(収率5.2%)を得た。
N-[5-(4-アセチルフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の(4-アセチルフェニル)ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物6.2mg(収率33%)を得た。
1-オキソ-N-[5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-2,3-ジヒドロピロリジン-3-カルボキサミド
市販の1-オキソ-2,3-ジヒドロピロリジン-3-カルボン酸を用いて、合成例9の方法に準じて標記化合物71.9mg(収率29%)を固体として得た。
8-オキソ-N-[6-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例5で得られたN-(6-ブロモ-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよび市販の[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物59.5mg(収率46%)を固体として得た。
N-[6-[4-(ジフルオロメトキシ)フェニル]-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例5で得られたN-(6-ブロモ-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよび市販の[4-(ジフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物11.2mg(収率49%)を得た。
N-[6-(2,2-ジフルオロ-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例5で得られたN-(6-ブロモ-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよび市販の(2,2-ジフルオロ-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物12.6mg(収率54%)を得た。
2-メチル-8-オキソ-N-[5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例18で得られた2-ブロモ-8-オキソ-N-[5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド(42.8mg,0.0856mmol)、市販の2,4,6-トリメチル-1,3,5,2,4,6-トリオキサトリボリナン(0.127mL,0.908mmol)、炭酸カリウム(184mg,1.33mmol)の混合物に1,4-ジオキサン(1.5mL)および水(0.5mL)を加えた後、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2´4´6´-トリイソプロピル-1,1´-ビフェニル)[2-(2´-アミノ-1,1´-ビフェニル)]パラジウム(II)(15.3mg,0.019mmol)を加え、窒素雰囲気下、100℃にて4時間攪拌した。原料が残存していたため、再度同様の操作を繰り返し原料の消失を確認した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル=9/1-1/1)にて精製し、標記化合物5.6mg(収率15%)を固体として得た。
N-[5-(4-tert-ブトキシフェニル)チアゾール-2-イル]-2-メチル-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例19で得られたN-(5-ブロモチアゾール-2-イル)-2-メチル-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドを用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物6.4mg(収率22%)を固体として得た。
2-クロロ-8-オキソ-N-[5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例20で得られたメチル 2-クロロ-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキシレート(66.2mg,0.291mmol)のエタノール(1mL)およびテトラヒドロフラン(1mL)混合溶液に、室温にて1N水酸化ナトリウム水溶液(0.5mL,0.5mmol)を加え2時間攪拌した。反応液に水を加えた後、1N塩酸を加えて酸性とし、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。得られた残渣(カルボン酸化合物62mg)を用いて、合成例9の方法に準じて標記化合物68.0mg(収率37%)を固体として得た。
5-メチル-8-オキソ-N-[5-[4-トリフルオロメトキシ]フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロインドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例23で得られたN-(5-ブロモチアゾール-2-イル)-5-メチル-8-オキソ-6,7-ジヒドロインドリジン-5-カルボキサミド(168mg,0.475mmol)、市販の[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸(588mg,2.86mmol)、炭酸セシウム(1.03g,3.16mmol)の混合物にN,N-ジメチルホルムアミド(2mL)および水(1mL)を加えた後、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2´4´6´-トリイソプロピル-1,1´-ビフェニル)[2-(2´-アミノ-1,1´-ビフェニル)]パラジウム(II)(38.6mg,0.049mmol)を加え、窒素雰囲気下、90℃にて4時間攪拌した。反応液に水を加えた後、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル=3/1-0/1)にて精製し、標記化合物59.7mg(収率29%)を固体として得た。
5-メチル-8-オキソ-N-[5-(p-トリル)チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロインドリジン-5-カルボキサミド
市販の4-メチルフェニルボロン酸を用いて、合成例65の方法に準じて標記化合物8.6mg(収率47%)を得た。
5-メチル-N-[5-(m-トリル)チアゾール-2-イル]-8オキソ-6,7-ジヒドロインドリジン-5-カルボキサミド
市販の3-メチルフェニルボロン酸を用いて、合成例65の方法に準じて標記化合物8.1mg(収率44%)を得た。
N-[5-(2,2-ジフルオロ-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)チアゾール-2-イル]-5-メチル-8-オキソ-6,7-ジヒドロインドリジン-5-カルボキサミド
市販の(2,2-ジフルオロ-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)ボロン酸を用いて、合成例65の方法に準じて標記化合物0.6mg(収率3.0%)を得た。
N-[5-(4-イソプロポキシフェニル)チアゾール-2-イル]-5-メチル-8-オキソ-6,7-ジヒドロインドリジン-5-カルボキサミド
市販の(4-イソプロポキシフェニル)ボロン酸を用いて、合成例65の方法に準じて標記化合物6.8mg(収率33%)を得た。
5-メチル-N-[5-[3-メチル-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロインドリジン-5-カルボキサミド
市販の[3-メチル-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例65の方法に準じて標記化合物8.3mg(収率37%)を得た。
N-[5-[3-クロロ-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-5-メチル-8-オキソ-6,7-ジヒドロインドリジン-5-カルボキサミド
市販の[3-クロロ-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例65の方法に準じて標記化合物5.0mg(収率21%)を得た。
5-メチル-8-オキソ-N-[5-[3-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-6,7-ジヒドロインドリジン-5-カルボキサミド
市販の[3-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例65の方法に準じて標記化合物7.8mg(収率36%)を得た。
8-オキソ-N-[4-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]フェニル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例2で得られたN-(4-ブロモフェニル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド(1.21g,3.62mmol)および市販の4-(トリフルオロメトキシフェニル)ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物1.29g(収率86%)を固体として得た。
N-[4-(2,2-ジフルオロ-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)フェニル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例2で得られたN-(4-ブロモフェニル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよび市販の(2,2-ジフルオロ-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物10.4mg(収率50%)を得た。
N-[4-[4-(ジフルオロメトキシ)フェニル]フェニル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例2で得られたN-(4-ブロモフェニル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよび市販の[4-(ジフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物11.5mg(収率58%)を得た。
N-[4-[3-クロロ-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]フェニル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例2で得られたN-(4-ブロモフェニル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよび市販の[3-クロロ-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物7.0mg(収率31%)を得た。
3-ブロモ-8-オキソ-N-[4-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]フェニル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
合成例73で得られた8-オキソ-N-[4-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]フェニル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド(150mg,0.363mmol)のジクロロメタン(15mL)溶液に、室温にてN-ブロモスクシイミド(45.9mg,0.258mmol)を加え4.5時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/10%メタノール 酢酸エチル溶液=3/1-1/1)にて精製し、標記化合物93.6mg(収率52%)を固体として得た。
N-[2-フルオロ-4-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]フェニル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例3で得られたN-(4-ブロモ-2-フルオロ-フェニル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよび市販の[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物73.4mg(収率91%)を固体として得た。
N-[4-[3-クロロ-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]-2-フルオロフェニル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例3で得られたN-(4-ブロモ-2-フルオロフェニル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよび市販の[3-クロロ-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物5.0mg(収率21%)を得た。
N-[4-(4-tert-ブトキシフェニル)-2-フルオロフェニル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例3で得られたN-(4-ブロモ-2-フルオロフェニル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドを用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物75.0mg(収率84%)を固体として得た。
N-[2-メチル-4-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]フェニル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例6で得られたN-(4-ブロモ-2-メチルフェニル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよび市販の[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物184mg(収率92%)を固体として得た。
8-オキソ-N-[5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]-2-ピリジル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例7で得られたN-(5-ブロモ-2-ピリジル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよび市販の[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物4.0mg(収率17%)を得た。
8-オキソ-N-[2-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]-1,3-ベンゾトリアゾール-6-イル]-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例8で得られたN-(2-クロロ-1,3-ベンゾチアゾール-6-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよび市販の[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物86.8mg(収率58%)を固体として得た。
N-[5-(2,2-ジフルオロ-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-4-メチルチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロインドリジン-5-カルボキサミド
市販の(2,2-ジフルオロ-1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)ボロン酸を用いて、合成例35の方法に準じて標記化合物10.4mg(収率48%)を得た。
N-[5-(4-ベンジルオキシ-3-フルオロフェニル)-4-メチル-チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の(4-ベンジルオキシ-3-フルオロフェニル)ボロン酸を用いて、合成例35の方法に準じて標記化合物10.4mg(収率44%)を得た。
N-[5-(4-イソブトキシフェニル)-4-メチル-チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の(4-イソブトキシフェニル)ボロン酸を用いて、合成例35の方法に準じて標記化合物12.2mg(収率58%)を得た。
N-[5-(5-クロロ-6-イソブトキシ-3-ピリジル)-4-メチルチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の(5-クロロ-6-イソブトキシ-3-ピリジル)ボロン酸を用いて、合成例35の方法に準じて標記化合物6.6mg(収率29%)を得た。
N-[4-メチル-5-[4-(2,2,2-トリフルオロエトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の[4-(2,2,2-トリフルオロエトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例35の方法に準じて標記化合物13.2mg(収率59%)を得た。
N-[4-メチル-5-[3-メチル-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の[3-メチル-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例35の方法に準じて標記化合物7.5mg(収率33%)を得た。
tert-ブチル 4-[4-メチル-2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]チアゾール-5-イル]-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-カルボキシレート
市販のtert-ブチル 4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-カルボキシレートを用いて、合成例35の方法に準じて標記化合物12.8mg(収率56%)を得た。
N-[5-[4-(ジフルオロメトキシ)フェニル]-4-メチルチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例5で得られたN-(6-ブロモ-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよび市販の[4-(ジフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例35の方法に準じて標記化合物10.9mg(収率52%)を得た。
N-[6-[3-メチル-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例5で得られたN-(6-ブロモ-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよび市販の[3-メチル-4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物14.0mg(収率58%)を得た。
N-[6-(4-クロロフェニル)-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例5で得られたN-(6-ブロモ-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよび市販の4-クロロフェニルボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物2.8mg(収率13%)を得た。
N-[6-(4-フルオロフェニル)-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例5で得られたN-(6-ブロモ-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよび市販の4-フルオロフェニルボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物13.0mg(収率64%)を得た。
N-[5-(4-ベンゾイルフェニル)チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
市販の4-ベンゾイルフェニルボロン酸を用いて、合成例11の方法に準じて標記化合物75.4mg(収率28%)を固体として得た。
N-[4-イソプロピル-5-[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
参考合成例24で得られたN-(5-ブロモ-4-イソプロピル-チアゾール-2-イル)-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよび市販の[4-(トリフルオロメトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例35の方法に準じて標記化合物112.2mg(収率66%)を得た。
N-[5-[1-(2-メチルプロパノイル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-4-イル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
合成例51で得られたtert-ブチル 4-[2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]チアゾール-5-イル]-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-カルボキシレート(139mg,0.315mmol)のジクロロメタン溶液(3mL)に、室温にてトリフルオロ酢酸(0.6mL)を加え、2時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、ジクロロメタンを加えて数回共沸し、油状物(226mg)を得た。得られた油状物(68mg)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.10mL)のジクロロメタン溶液(3mL)に、氷冷下、2-メチルプロパノイル クロリド(0.032mL,0.30mmol)を加えて2時間攪拌した。反応液をジクロロメタンにて希釈した後、水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下にて溶媒を留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル=4/1-1/2)にて精製し、標記化合物50.3mg(収率81%)を固体として得た。
N-[5-[1-(イソプロピルカルバモイル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-4-イル]チアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
合成例51で得られたtert-ブチル 4-[2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]チアゾール-5-イル]-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-カルボキシレートおよび2-イソシアナートプロパンを用いて、合成例97の方法に準じて標記化合物30.6mg(収率48%)を固体として得た。
メチル 2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]-5-[4-(2,2,2-トリフルオロエトキシ)フェニル]チアゾール-4-カルボキシレート
参考合成例25で得られたメチル 5-ブロモ-2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]チアゾール-4-カルボキシレートおよび市販の[4-(2,2,2-トリフルオロエトキシ)フェニル]ボロン酸を用いて、合成例35の方法に準じて標記化合物42.3mg(収率31%)を得た。
メチル 5-(4-tert-ブトキシフェニル)-2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]チアゾール-4-カルボキシレート
参考合成例25で得られたメチル 5-ブロモ-2-[(8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボニル)アミノ]チアゾール-4-カルボキシレートおよび市販の(4-tert-ブトキシフェニル)ボロン酸を用いて、合成例35の方法に準じて標記化合物45.8mg(収率38%)を得た。
(5R)-N-[5-(4-tert-ブトキシフェニル)-4-メチルチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド および
(5S)-N-[5-(4-tert-ブトキシフェニル)-4-メチルチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミド
合成例35で得られたN-[5-(4-tert-ブトキシフェニル)-4-メチルチアゾール-2-イル]-8-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-インドリジン-5-カルボキサミドおよびYMC CHIRAL ART Cellulose-SC(10μm) 250x10mmI.D.、流速:2.3ml/min、溶媒:n-ヘキサン/エタノール=40/60)にて光学分割を行った。先に溶出する第一ピークを集めた後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物(53mg,光学純度 >99%ee)をアモルファス状物として得た。また、後から溶出する第二ピークを集めた後、減圧下にて溶媒を留去し、標記化合物(53mg,光学純度 >99%ee)をアモルファス状物として得た。
ヒトiPS細胞からインスリン産生細胞への分化促進効果(薬効)の評価系は、公知情報(非特許文献6)を参考に構築した。また、各分化ステージで使用する培地も上記公知情報を参考に作成した(ステージ1~5に対して、各々、非特許文献6記載の分化培地A~E(Medium A~E)を使用。ただし、分化培地Eに関してはGLP-1受容体アゴニストおよびニコチンアミドを含んでいないものを使用)。
化合物の薬効を評価するため、陽性コントロールとして合成例1の化合物を使用し、化合物無処置コントロールとして終濃度0.1%のジメチルスルホキシド(DMSO)(SIGMA、D2650)を用いた。全ての化合物はDMSOで溶解させ、培地へ添加後の化合物の終濃度が2μMおよび10μMとなるように2種類の化合物溶液を調製した。以下の評価において、化合物溶液はDMSOの終濃度0.1%となるように培地に添加した。
まず、非特許文献6の「ヒトiPS細胞から膵β細胞への分化誘導」の方法に従い、ヒトiPS細胞Toe株(医薬基盤研究所)から培養7日目の細胞(分化培地Cに交換して2日後(FOXA2陽性原始腸管細胞からPDX1陽性膵前駆細胞への分化過程の細胞)まで誘導し、細胞を回収後、バンバンカー(日本ジェネティクス)を用いて1x107細胞/mL/チューブにて液体窒素中に保存し、評価用細胞ストックを作製した。薬効評価の開始時に本細胞ストックを溶解し、ステージ3用の分化培地C(DMEM high glucose(Life technologies、11965092)、0.25μM SANT-1、 0.1μM LDN193189(Stemgent、04-0074)、10μM SB431542, 2μM Retinoic acid(Stemgent、04-0021)、1% B27 serum free supplement(Life technologies、17504044)に懸濁後、シンセマックスII(Corning、#5656)でコートした96穴プレート(Corning、#3340)に1x105細胞/ウェル播種した。2日間培養後、培地を除去し、化合物あるいはDMSOのみを添加した新しいステージ3用の分化培地Cを100μL/ウェル添加した。2日間培養後、培地を除去し、化合物あるいはDMSOのみを添加した新しいステージ4用の分化培地D(DMEM high glucose、 0.1μM LDN193189、5μM TGF-β type I receptor kinase inhibitor II (Calbiochem 616452)、0.3μM (-)-indolactam V (Enzo life science ALX-420-011-C300)、1% B27 serum free supplement)を100μL/ウェル添加した。2~3日間培養後、培地を除去し、化合物あるいはDMSOのみを添加した新しいステージ5用の分化培地E(GLP-1受容体アゴニストおよびニコチンアミド不含;Knockout DMEM/F-20 (Life technologies、12660012)、 1% B27 serum free supplement)を200μL/ウェル添加した。2日間培養後、培地を除去し、4%パラホルムアルデヒドりん酸緩衝液(Wako、163-20145)を150μL/ウェル添加し、30~60分間室温に置いて細胞を固定した。1%のTriton X-100(Sigma、T8787)を含むりん酸緩衝液(PBS)(Takara、T9181)で15分間室温に置いた後、PBS-T(Takara、T9183)で洗浄し、PBS-Tで希釈した20% Blocking One(Nacalai tesque、Tokyo、Japan)を用いて室温で1時間ブロッキングを行った。Blocking Oneを除去後、20%Blocking Oneで200倍に希釈したモルモット抗インスリン抗体(アブカム、ab7842)を50μL/ウェル添加し、一晩4℃に置いた。PBS-Tで3回洗浄後、20%Blocking Oneで1000倍に希釈したAlexa Fluor 548標識抗モルモット抗体(Life Technologies、A11075)および6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(Roche Diagnostics、Basel、Switzerland)を添加して2時間室温に置いた。PBS-Tで3回洗浄後、細胞の蛍光画像の解析を行った。
(A)結果
(1)新規β細胞分化誘導剤のスクリーニング
以前に報告されたように(Sakano et al., 2014; Shiraki et al., 2008)、Pdx1プロモーターによって駆動されるGFPレポーター遺伝子を担持するマウスES細胞株SK7を、β細胞分化を増強する小分子化合物のスクリーニングのためのアッセイ系の確立のために使用した。
約55,000の化合物を用いた一次スクリーニングキャンペーン、続いて有効性の再現性および用量依存性を確認するための反復アッセイの後に、ヒット化合物K-1(合成例1で合成された化合物)がβ細胞分化を増強する新規化合物として発見された(図1)。K-1はPdx1-GFP+インスリン+二重陽性細胞の比率およびインスリン1の発現を用量依存的に増加させた。K-1は、γ-セクレターゼ阻害剤LY411575によるPdx1-GFP+Ins+二重陽性細胞の増加(Treff et al., 2006)を更に亢進した。この結果は、以前に膵臓内分泌分化を促進することが報告されているγ-セクレターゼ阻害とは異なる作用機序によって、K-1がその効力を示すことを表している。
ヒトiPS細胞のインスリン発現β(hiPS-β)細胞への分化に対する化合物の有効性を、2つの異なる分化プロトコールおよび3つのヒトiPS細胞株(Toe、RPChiPSC771、およびFf-I01s01(HLAホモ接合体患者由来のiPSC))を用いて調べた(図2-1a)。本発明者は、分化プロトコール#1の下で単層培養において、ステージ3の後期からステージ5の初期までの間のK-1によるToe iPSCの処理を最初に試験した。それはiPS-β細胞への強化された分化をもたらした(図2-1aおよびb)。本発明者はまたK-3(合成例9で合成された化合物)、K-4(合成例33で合成された化合物)、およびK-5(合成例101bで合成された化合物)のような他の誘導体の効果を検査した。K-3およびK-5は、元の化合物であるK-1よりも強力な効力を示すことが判明した(図2-1b)。
(1)mESおよびhiPS細胞株の培養
SK7マウスES細胞株は、Pdx1-GFP遺伝子を有するトランスジェニックマウス系統から樹立され、以前に記載されているように(Shiraki et al., 2008)、MEFフィーダー細胞(Stem cell technology)上で維持された。ToeヒトiPS細胞株は、国立バイオメディカルイノベーション研究所(Japan)の細胞バンクから入手し、以前に記載されたように(Shahjalal et al., 2014)、フィーダーフリー異種条件で維持した。RPChiPS771細胞はリプロセルから購入し、FfI-01s01細胞はCiRAから提供された。RPChiPS771細胞およびFfl-01s01細胞を、synthemax II(Invitrogen, 3535XX1)被覆皿上で、それぞれEssential8(Invitrogen, A1517001)およびStemFit AK03N(味の素)を使って培養した。
SK7マウスES細胞を、基本的に以前の報告(Nakashima et al., 2015)に従って、β細胞に分化させた。手短に言えば、細胞を、CellBIND 384ウェル(CORNING, 3770)細胞培養プレートに1ウェルあたり5,000細胞で、または0.2%ゼラチンでコーティングした96ウェルプレート(Sigma)に1ウェルあたり20,000細胞で、播種した。その後、細胞を培地1で1日目から5日目まで培養した。培地1は、0.1mMのNEAA(Gibco, 11140-50)、2mMのL-グルタミン(Nakalai, 16948-04)、100U/mLのペニシリン-ストレプトマイシン(Nakalai, 26252-94)、0.01mMのβ-メルカプトエタノール(Sigma)、1%のインスリン-トランスフェリン-セレンサプリメント(ITS:Life Technologies, 41400045)、0.25%のAlbumax(ThermoFisher, 11020021)、および10ng/mLの組換えヒトアクチビン-A(R&D Systems, 338-AC)を添加したDMEM高グルコース(Life Technologies, 11965092)からなる。続いて、10μMのレチノイン酸(Stemgent, 04-0021)を補充した培地1からなる培地2中で1日間培養した。6日目に培地を培地3に交換し、β細胞への分化を誘導するために12日目まで培養を続けた。培地3は、0.1mMのNEAA、2mMのL-グルタミン、100U/mLのペニシリン-ストレプトマイシン、0.1mMのβ-メルカプトエタノール、1%のITS、0.25%のAlbumax、および3mMのニコチンアミド(Sigma-Aldrich, N0636-500G)を添加したDMEM低グルコース(Life Technologies, 11885084)からなる。試験化合物を8日目に添加し、細胞をハイコンテントイメージャーによる分析のために4%パラホルムアルデヒドで固定した。
M1-1 AKM培地:100ng/mLのアクチビンA、3μMのCHIR990221を補充したAKM(100ng/mLのIGF1、0.5μMのZn)培地。
M1-2 AKM培地:100ng/mLアクチビンAを添加したAKM(100ng/mLのIGF1、Z0.5μMのZn)培地。
M2 AKM培地:50ng/mLのFGF10、250nMのSANT1を補充したAKM(0.5μMのZn)。
S2培地:50ng/mLのKGFと44μg/mLのビタミンCを補充したStemFit Basic 03。
S3培地:50ng/mLのKGF、50nMのインドラクタムV、2μMのレチノイン酸、250nMのSANT1、44μg/mLのビタミンCを補充したStemFit Basic 03。
S4培地:50ng/mLのKGF、100nMのレチノイン酸、250nMのSANT1、44μg/mLのビタミンC、100nMのLDN193189を補充したStemFit Basic 03。
S5-1培地:10μMのALK5阻害剤、10μMのDAPT、33.3ng/mLのEGF、100nMのレチノイン酸、1μMのT3、44μg/mLのビタミンCを補充したStemFit Basic 03。
S5-2培地:10μMのALK5阻害剤、10μMのDAPT、33.3 ng/mLのEGF、25 nMのレチノイン酸、1μMのT3を補充したStemFit Basic 03。
分化速度および細胞機能に対する化合物の有効性を評価する場合、試験化合物および陰性対照(0.01%DMSO)をステージ3および4の間(5日目~13日目)に処理し、インスリン、NKX6.1、およびPDX1の陽性に対する効果を確認するために、14日目(ステージ4終了時)および21日目(ステージ5終了時)に免疫染色を実施した。GSISアッセイは21日目に実施した。
約55,000の化合物からなる化学ライブラリーを、β細胞分化誘導物質についてスクリーニングした。一次スクリーニングに関しては、化合物を2mMの濃度になるようにDMSOに溶解し、SK-7マウスES細胞の分化の過程で、8日目に1:1000で添加し、10日目に培地を交換した。細胞を、12日目にモルモット抗インスリン、ウサギ抗GFPで免疫染色することによりアッセイした。蛍光画像は、OperettaハイコンテントイメージングシステムおよびHarmony画像解析ソフトウェア(PerkinElmer, Germany)により定量化した。核はDAPI染色により同定され、抗体染色の陽性は核を囲む細胞質領域の蛍光強度により決定された。インスリンおよびGFPの両方が陽性の細胞の数を数え、DAPI陽性総細胞数もしくは陽性エリア面積によって正規化した。4重データの中央値を計算し、スクリーニングヒットを、DMSO対照よりもインスリンおよびGFP陽性細胞数が増加した状態として定義した。本文に記載されているように、一次ヒット化合物を用量依存性および再現性についてさらに試験した。候補化合物の活性は再合成したものを用いて確認した。選択された候補化合物の活性は、マウスおよびヒトβ細胞分化の両方に対して有効性を有するヒット化合物を選択するために、ToeヒトiPS細胞アッセイシステムによってさらに分析された。化合物の添加は上記のようにして行い、有効性は3連の実験においてq-PCRによりmRNA発現レベルによって評価した。スクリーニングヒットは、用量依存的に、DMSO対照よりもβ-アクチンと比較して増加したインスリン発現レベルを伴う状態として定義された。
以下の抗体を使用して、通常のプロトコールと共に免疫細胞化学を実施した:ウサギ抗MAFA(Abcam; ab26405; 1/100x)、ヤギ抗PDX1(R&D systems; AF2419; 1/100x)、マウス抗NKX6.1(Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa; F64A6B4; 1/100x)、モルモット抗INSULIN(Dako; IR002; 1/10x)、マウス抗INSULIN(Sigma-Aldrich; I2018; 1/1000x)、ウサギ抗C-ペプチド(Cell Signaling; 4593; 1/100x)、ウサギ抗GFP(MBL International Corp; 598; 1/1000x)、およびマウス抗GLUCAGON(Sigma-Aldrich; G2654; 1/1000x)。使用した二次抗体は、Alexa 488結合ヤギ抗マウスIgG(Invitrogen, A11029, 1/1000x)、Alexa 488結合ロバ抗モルモットIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratory, 706-546-148)、AF647結合ロバ抗ウサギIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratory, 711-606-152)、AF568結合ロバ抗マウスIgG(BIOTIUM, 20105)、Alexa 568結合ヤギ抗モルモットIgG(Invitrogen, A11075, 1/1000x)、Alexa 568結合ヤギ抗マウスIgG(Invitrogen, A11031、1/1000x)、Alexa 568結合ヤギ抗ウサギIgG(Invitrogen, A11036, 1/1000x)、Alexa 633結合ヤギ抗ウサギIgG(Invitrogen, A21072, 1/1000x)であった。細胞をDAPI(ThermoFisher, D1306)で対比染色した。
マウスES細胞のcDNA調製はVILOマスターミックスを使用して行い、リアルタイムPCR分析はTaqman qPCRアッセイ(Applied Biosystems TaqMan gene expression assay ID: mouse Hprt1, Mm03024075_m1; mouse insulin1, Mm01950294_s1)を用いて製造元の説明書に従って行った。適切な試験試料の混合物の希釈系列を使用することによって作成された各遺伝子についての標準曲線を用いることによって遺伝子発現量を計算した。各遺伝子の発現レベルは、Hprt1発現レベルで補正した。
時間依存的GSIS活性測定は以下のようにして行った。得られたヒトiPS-β細胞のアリコートを低グルコース(LG:3mMグルコース)HKRB緩衝液(COSMOBIO, PMC-PNIMG)中で10分間数回洗浄した。細胞を、24ウェルプレート(CORNING、3415)中のトランスウェル透過性支持体中のLG-HKRB緩衝液中でさらに30分間インキュベートし、上清のごく一部をc-ペプチド測定(LG 30分)用のサンプルとして取った。細胞懸濁液に追加の量のグルコースを添加して最終グルコース濃度を3から20mMに増加させることによって、高グルコース刺激を開始した。上清のサンプリングを経時的に行い(HG刺激の開始後10、30、60分;それぞれHG 10分、HG 30分、およびHG 60分)、続いて100μMのエキセンディン4および20mMのKClを順次添加し、30分間インキュベートした(それぞれEx4 30分およびKCl 30分)。
GSISアッセイ後に細胞を回収し、そのDNAをAllPrep DNA/RNAマイクロキット(Qiagen, 80284)を用いて精製し、そしてDNAの濃度をQubitアッセイ(Lifescience technologies, Q32854)を用いて測定した。
Nakashima, R., Morooka, M., Shiraki, N., Sakano, D., Ogaki, S., Kume, K. and Kume, S. (2015). Neural cells play an inhibitory role in pancreatic differentiation of pluripotent stem cells. Genes Cells 1028-1045.
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Claims (24)
- 多能性幹細胞をインスリン産生細胞に分化させることによりインスリン産生細胞を作製する方法であって、一般式(I)
R1:水素原子、ハロゲン原子、またはC1-C6アルキル基
R2:水素原子、またはC1-C6アルキル基
R3:置換基群αより独立して選択される1~4の置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基群αより独立して選択される1~4の置換基で置換されていてもよいC5-C10シクロアルケニル基、または置換基群αより独立して選択される1~4の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル基
置換基群α:ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、C1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシ基、ハロゲノC1-C6アルキル基、ハロゲノC1-C6アルコキシ基、ヒドロキシC1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシC1-C6アルコキシ基、(C1-C6アルキル)カルボニル基、(C1-C6アルコキシ)カルボニル基、(C1-C6アルコキシ)カルボニルオキシ基、フェニルC1-C6アルコキシ基、非芳香族ヘテロシクリル基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したC1-C6アルコキシ基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されたスルファモイル基、置換基群βより独立して選択される1~4の置換基で置換されていてもよいフェノキシ基、置換基群βより独立して選択される1~4の置換基で置換されていてもよいフェニル基、および置換基群βより独立して選択される1~4の置換基で置換されていてもよいベンゾイル基
置換基群β:ハロゲン原子、C1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシ基、ハロゲノC1-C6アルキル基、ハロゲノC1-C6アルコキシ基、および(C1-C6アルコキシ)カルボニル基
n:0、または1
A:下記式(i)~(iv)のいずれかで表される基
・および*:結合手を示し、・は一般式(I)のアミド基の窒素原子に結合し、*はR3に結合する
R4:水素原子、C1-C6アルキル基、ハロゲノC1-C6アルキル基、または(C1-C6アルコキシ)カルボニル基
R5:水素原子、ハロゲン原子、またはC1-C6アルキル基
Y:NまたはCH)]
で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を三次元培養する工程を含むことを特徴とするインスリン産生細胞の作製法。 - 一般式(I)で表される化合物におけるR3がナフチル基、1,3-ベンゾジオキソリル基、2,2-ジハロゲノ-1,3-ベンゾジオキソリル基、C5-C10シクロアルケニル基、置換基群α1より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群α1より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよい5もしくは6員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする請求項1に記載のインスリン産生細胞の作製法。
置換基群α1:ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、C1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシ基、ハロゲノC1-C6アルキル基、ハロゲノC1-C6アルコキシ基、ヒドロキシC1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシC1-C6アルコキシ基、(C1-C6アルキル)カルボニル基、(C1-C6アルコキシ)カルボニル基、(C1-C6アルコキシ)カルボニルオキシ基、フェニルC1-C6アルコキシ基、5もしくは6員環非芳香族ヘテロシクリル基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したC1-C6アルコキシ基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β1より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β1:ハロゲン原子、C1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシ基、および(C1-C6アルコキシ)カルボニル基 - 一般式(I)で表される化合物におけるR3がナフチル基、1,3-ベンゾジオキソリル基、2,2-ジハロゲノ-1,3-ベンゾジオキソリル基、C5-C10シクロアルケニル基、置換基群α2より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ2より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよい5もしくは6員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする請求項1に記載のインスリン産生細胞の作製法。
置換基群α2:ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、C1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシ基、ハロゲノC1-C6アルキル基、ハロゲノC1-C6アルコキシ基、ヒドロキシC1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシC1-C6アルコキシ基、(C1-C6アルキル)カルボニル基、(C1-C6アルコキシ)カルボニル基、(C1-C6アルコキシ)カルボニルオキシ基、フェニルC1-C6アルコキシ基、5もしくは6員環非芳香族ヘテロシクリル基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したC1-C6アルコキシ基、1つもしくは2つのC1-C6アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β2より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β2:ハロゲン原子、C1-C6アルキル基、およびC1-C6アルコキシ基
置換基群γ2:ハロゲン原子、C1-C6アルキル基、C1-C6アルコキシ基、(C1-C6アルキル)カルボニル基、および(C1-C6アルコキシ)カルボニル基 - 一般式(I)で表される化合物におけるR3がナフチル基、1,3-ベンゾジオキソリル基、2,2-ジフルオロ-1,3-ベンゾジオキソリル基、C5-C8シクロアルケン-1-イル基、置換基群α3より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または置換基群γ3より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよい5もしくは6員環ヘテロシクリル基であることを特徴とする請求項1に記載のインスリン産生細胞の作製法。
置換基群α3:ハロゲン原子、シアノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、ベンゾイル基、C1-C4アルキル基、C1-C4アルコキシ基、ハロゲノC1-C2アルキル基、ハロゲノC1-C2アルコキシ基、ヒドロキシC1-C4アルキル基、C1-C2アルコキシC1-C2アルコキシ基、(C1-C4アルキル)カルボニル基、(C1-C4アルコキシ)カルボニル基、(C1-C4アルコキシ)カルボニルオキシ基、フェニルC1-C4アルコキシ基、モルホリン-1-イル基、1つもしくは2つのC1-C4アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基、1つもしくは2つのC1-C4アルキル基で置換されていてもよいカルバモイル基が置換したC1-C2アルコキシ基、1つもしくは2つのC1-C4アルキル基で置換されたスルファモイル基、および置換基群β3より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよいフェニル基
置換基群β3:フッ素原子、塩素原子、C1-C4アルキル基、およびC1-C4アルコキシ基
置換基群γ3:ハロゲン原子、C1-C4アルキル基、C1-C4アルコキシ基、(C1-C4アルキル)カルボニル基、および(C1-C4アルコキシ)カルボニル基 - 一般式(I)で表される化合物におけるR1が水素原子、塩素原子、またはメチル基であることを特徴とする請求項1~4のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
- 一般式(I)で表される化合物におけるR2が水素原子、またはメチル基であることを特徴とする請求項1~5のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
- 一般式(I)で表される化合物におけるAが式(i)で表される基であって、R4が水素原子、C1-C6アルキル基、ハロゲノC1-C6アルキル基、または(C1-C6アルコキシ)カルボニル基であることを特徴とする請求項1~6のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
- 一般式(I)で表される化合物におけるR4が水素原子、メチル基、またはトリフルオロメチル基であることを特徴とする請求項7に記載のインスリン産生細胞の作製法。
- 一般式(I)で表される化合物におけるAが式(ii)で表される基であって、R5が水素原子、ハロゲン原子、またはC1-C6アルキル基であることを特徴とする請求項1~6のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
- 一般式(I)で表される化合物におけるR5が水素原子、フッ素原子、またはメチル基であることを特徴とする請求項9に記載のインスリン産生細胞の作製法。
- 一般式(I)で表される化合物におけるAが式(iii)で表される基であって、R5が水素原子、フッ素原子、またはメチル基であることを特徴とする請求項1~6のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
- 一般式(I)で表される化合物におけるAが式(iv)で表される基であることを特徴とする請求項1~6のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
- 一般式(I)で表される化合物におけるnが1であることを特徴とする請求項1~12のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
- 一般式(I)で表される化合物におけるR3が2,2-ジフルオロ-1,3-ベンゾジオキソリル基、1-tert-ブトキシカルボニル-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-4-イル基、またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、tert-ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、2,2,2-トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より独立して選択される1つもしくは2つの置換基で置換されていてもよいフェニル基であることを特徴とする請求項1~13のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
- 一般式(I)で表される化合物におけるR3がフェニル基またはフッ素原子、塩素原子、トリフルオロメチル基、tert-ブトキシ基、トリフルオロメトキシ基、2,2,2-トリフルオロエトキシ基、ベンジルオキシ基、およびフェノキシ基からなる群より選択されるいずれか1つの置換基でm位またはp位が置換されたフェニル基であることを特徴とする請求項1~13のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法。
- 多能性幹細胞が、ヒトES細胞またはヒトiPS細胞である請求項1に記載のインスリン産生細胞の作製法。
- 三次元培養が低接着性または非接着性の培養容器内で行われることを特徴とする請求項1に記載のインスリン産生細胞の作製法。
- 多能性幹細胞からインスリン産生細胞への分化過程が以下の工程1~5を含み、工程3、工程4および工程5からなる群から選択される少なくとも一つの工程において、一般式(I)で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を培養することを特徴とする請求項1~18のいずれか1項に記載のインスリン産生細胞の作製法
工程1:多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を誘導する工程、
工程2:胚体内胚葉細胞から原始腸管細胞を誘導する工程、
工程3:原始腸管細胞から膵臓前駆細胞を誘導する工程、
工程4:膵臓前駆細胞から膵内分泌前駆細胞を誘導する工程、および
工程5:膵内分泌前駆細胞からインスリン産生細胞を誘導する工程。 - 工程3、工程4および工程5において、一般式(I)で表される化合物またはその塩を含む培地で細胞を培養することを特徴とする請求項19に記載のインスリン産生細胞の作製法。
- 工程1において、メチオニン除去培地による前処理をした多能性幹細胞を用いることを特徴とする 請求項19に記載のインスリン産生細胞の作製法。
- 請求項1~21のいずれか1項に記載の方法で作製された多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞。
- 請求項1~21のいずれか1項に記載の方法で作製された多能性幹細胞由来のインスリン産生細胞を含むインスリン分泌異常又はインスリン分泌不全に起因する疾患の治療薬。
- インスリン分泌異常又はインスリン分泌不全に起因する疾患が、1型糖尿病又は2型糖尿病である請求項23に記載の治療薬。
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