MD3661534T2 - Compoziție sinergică ca promotor al autofagiei - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la o compoziţie sinergică cuprinzând un extract uscat dintr-o plantă din genul Galeopsis şi un compus care promovează autofagia selectat dintre biotină şi R-N1-spermidină sau o sare a acestora, în care R este hidrogensau metil sau amestecuri ale acestora. Compoziţiile sinergice conform invenţiei potfi sub forma unei formulări topice sau formulări orale şi sunt folositoare ca promotoriai autofagiei în special în celulele foliculilor firelor de păr ale scalpului uman şi în promovarea creşterii părului şi/sau în tratamentul subţierii sau pierderii.

Description

DOMENIUL INVENŢIEI

Invenţia se referă la compoziţii sinergice şi utilizarea lor ca promotor al autofagiei în domeniul nutriţional, medical sau cosmetic.

STADIUL TEHNICII

Autofagia (sau autofagocitoza) este mecanismul natural, reglat al celulei care dezasamblează componentele inutile sau disfuncţionale. Autofagia permite degradarea ordonată şi reciclarea componentelor celulare. În macroautofagie, constituenţii citoplasmatici vizaţi sunt izolaţi de restul celulei într-o veziculă cu membrană dublă cunoscută sub numele de autofagozom. Autofagozomul fuzionează în cele din urmă cu lizozomii, iar conţinutul este degradat şi reciclat. Sunt descrise în mod obişnuit trei forme de autofagie: macroautofagie, microautofagie şi autofagie mediată de însoţitori (CMA), împreună cu mitofagie. În boală, autofagia a fost văzută ca un răspuns adaptativ la stres, care promovează supravieţuirea, în timp ce în alte cazuri pare să promoveze moartea şi morbiditatea celulară. În cazul extrem al foametei, defalcarea componentelor celulare promovează supravieţuirea celulară prin menţinerea nivelului de energie celulară. Prin urmare, autofagia joacă un rol crucial în reglementarea sănătăţii, bolii şi îmbătrânirii, precum procesele celulare centrale precum răspunsurile adaptive la stres, diferenţierea, dezvoltarea ţesuturilor şi homeostazia.

În Angeleen Fleming şi colab. „Modulatorii chimici ai autofagiei ca sonde biologice şi potenţiale terapeutice», Nature Chemical Biology 7, 9-17 (2011) autorii au demonstrat că autofagia are funcţii pleiotrope neaşteptate care favorizează supravieţuirea celulei, inclusiv furnizarea de nutrienţi în caz de foame, curăţarea interiorului celular, apărarea împotriva infecţiilor şi prezentarea antigenului. Autofagia defectuoasă este, prin urmare, asociată cu o gamă diversă de stări de boală, inclusiv neurodegenerarea, cancerul şi boala Crohn.

În Teng Yu şi colab., „Ţintirea autofagiei în bolile de piele, J Mol Med (2015) 93:31-38„ se studiază şi se raportează mecanismele autofagiei asupra patogenezei bolilor de piele. Concret, este raportat rolul autofagiei în tulburări autoimune ale pielii precum psoriazis, lupus eritematos sistematic (LES) şi vitiligo, afecţiuni infecţioase ale pielii, cancer de piele, precum carcinom cu celule scuamoase şi melanom.

Pentru a modula terapeutic autofagia pentru investigarea supresoarelor şi inductorilor de autofagie au fost studiate modele de organe umane.

Cererile de brevet internaţional WO 2014/016407A1 şi WO 03/063851A1 dezvăluie o compoziţie care conţine spermidină şi biotină pentru tratamentul căderii părului.

Yuval Ramot şi colab. în „Spermidina promovează creşterea părului uman şi este un modulator nou al funcţiilor celulelor stem epiteliale umane» Plus One, vol. 6, nr. 7, 27 iulie 2011 pag. 22564 dezvăluie utilizarea spermidinei în promovarea creşterii părului uman. WO 2015/063678A1 dezvăluie utilizarea extractelor de Galeopsis pentru tratamentul căderii părului. D. Pinto şi colab: „ 209 Extracte de Galeopsis segetum Necker pentru prevenţia şi tratamentul părului» în The Journal of Investigative Dermatology: Journal of the official society for investigative dermatology and the European society for dermatological research», vol. 136 nr. 9, 1 septembrie 2016 pag. S196, dezvăluie utilizarea extractelor din Galeopsis segetum Necker pentru prevenirea şi tratamentul căderii părului.

În Tobias Eiserberg şi colab., „Inducerea autofagiei de către spermidină promovează longevitatea» Nature cell biology, volumul 11, numărul 11, noiembrie 2009, efectele spermidinei, o poliamină naturală, au fost studiate în drojdie, muşte şi viermi. Autorii au raportat că administrarea de spermidină a prelungit durata de viaţă a acestora. În plus, administrarea de spermidină a inhibat potenţial stresul oxidativ la şoarecii în vârstă. S-a demonstrat că autofagia a constituit calea majoră de degradare lizozomală pentru reciclarea materialului celular deteriorat şi potenţial dăunător.

Inventatorii şi-au dat seama că, ca (mini)organe complete, remodelate ciclic, cultura de organe a foliculilor de păr (HF) ale scalpului uman poate oferi un astfel de model, deoarece astfel de foliculi, după o activitate de creştere masivă (anagen) intră spontan în involuţia organului determinată de apoptoză. (catagen). După cum se ştie, ciclul de viaţă al bulbului de păr al foliculului este reprezentat în esenţă de trei faze ulterioare: anagen (creştere), catagen (involuţie) şi telogen (faza de repaus).

În mod surprinzător, inventatorii au descoperit că ciclul de viaţă al foliculului de păr poate fi modulat prin mecanismul de autofagie şi, pe baza modelului de scalp uman, agenţii de promovare a foliculului de păr au fost investigaţi.

Având în vedere studiul, inventatorii au emis ipoteza că HF al scalpului anagen în stadiu avansat, al căror epiteliu al matricei de păr proliferează cu o rată mai mare decât majoritatea tumorilor maligne şi este expus la o serie de factori de stres, sunt susceptibile de a suferi o presiune din ce în ce mai mare pentru a menţine homeostazia tisulară. şi poate necesita un flux substanţial de autofagie pentru a le menţine creşterea.

După cum se ştie, diferiţi factori de stres afectează negativ ciclul de viaţă al foliculului de păr, determinând astfel o reducere a numărului de fire de păr şi rărirea acestora.

Prin urmare, un obiectiv al prezentei invenţii este de a furniza o compoziţie adecvată ca promotor al autofagiei în celulele foliculilor de păr ai scalpului uman.

Un alt obiectiv, prin urmare, este de a furniza o compoziţie pentru promovarea creşterii părului şi/sau inhibarea sau întârzierea căderii părului la nivelul scalpului uman.

Un alt obiect este furnizarea unei compoziţii pentru tratamentul stărilor mediate de autofagie.

REZUMATUL INVENŢIEI

Pornind de la studierea culturii de organe a foliculilor de păr (HF) ai scalpului uman, inventatorii au descoperit o combinaţie de compuşi care induc autofagie în modelul studiat şi care prezintă un efect sinergic în promovarea autofagiei în special în celulele foliculilor de păr ai scalpului uman. După investigare, compoziţia având un efect sinergic a fost în mod neaşteptat un extract de plantă din genul Galeopsis combinat cu un alt compus care promovează autofagia, în special în celulele scalpului uman selectate dintre R-N.1-spermidină sau sarea acesteia, în care R este hidrogen sau metil, biotină şi un amestec al acestora. Prin urmare, obiectivele de mai sus au fost atinse printr-o compoziţie sinergică care cuprinde un extract de plantă din genul Galeopsis şi R-N1-spermidină sau o sare a acesteia, în care R este hidrogen sau metil. Alternativ, obiectivele de mai sus au fost atinse printr-o compoziţie sinergică care cuprinde un extract de plantă din genul Galeopsis şi biotină. Într-o altă variantă de realizare alternativă, obiectivele de mai sus au fost atinse printr-o compoziţie sinergică care cuprinde un extract de plantă din genul Galeopsis, biotină şi R-N1-spermidină sau o sare a acesteia, în care R este hidrogen sau metil. De preferinţă şi surprinzător, inventatorii au observat că administrarea compoziţiilor de mai sus, fie pe cale locală, fie pe cale orală de administrare, a promovat într-un mod sinergic autofagia în celulele în special a foliculilor de păr, la un subiect care suferă de rărirea părului, determinând astfel o îngroşarea progresivă a zonelor suferinde ale scalpului. Conform unui alt aspect, prezenta invenţie asigură utilizarea cosmetică a compoziţiilor de mai sus pentru stimularea creşterii fiziologice a părului, aşa cum este definit în revendicarea 16. În conformitate cu încă un alt aspect, prezenta invenţie furnizează, prin urmare, compoziţiile de mai sus pentru utilizare în tratamentul unei boli a scalpului aşa cum este definită în revendicarea 17.

DESCRIEREA FIGURILOR

Figura 1 prezintă imagini reprezentative ale celulelor U2OS transduse cu un construct care exprimă proteina autofagică LC3 fuzionată cu o proteină fluorescentă roşie (RFP) tratată timp de 6 ore cu substanţele indicate. Inductorul de autofagie caracterizat anterior, spermidina, a fost folosit ca referinţă pozitivă.

Figura 2 prezintă imagini reprezentative ale celulelor U2OS transduse cu un construct care exprimă proteina SQSTM1/p62 fuzionată cu o proteină fluorescentă roşie (RFP) tratată timp de 6 ore cu substanţele indicate. Turn-over-ul SQSTM1/p62 depinde în principal de procesul de degradare mediat de autofagie.

Figura 3 prezintă nivelurile de LC3 şi SQSTM1 lipidate în celulele U2OS umane tratate cu doze echimolare de N1-metilspermidină şi spermidină, aşa cum este raportat în Exemplul 14.

DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢIEI

Prin urmare, invenţia se referă la o compoziţie sinergică aşa cum este definită în revendicarea 1. Într-un exemplu de realizare preferat şi avantajos, invenţia se referă la o compoziţie sinergică a unui extract de plantă din genul Galeopsis, R-N1-spermidină sau o sare a acesteia, în care R este hidrogen sau metil, şi biotină.

Extractul din compoziţiile de mai sus provine dintr-o plantă aparţinând genului Galeopsis.

Într-o variantă de realizare, extractul de Galeopsis este un extract uscat în special din specia Galeopsis segetum, cunoscută în mod obişnuit sub numele de urzici de cânepă, adică o specie de plantă cu flori din familia salviei, Lamiaceae.

Într-un alt exemplu de realizare, extractul de Galeopsis este un extract în special din specia Galeopsis tetrahit.

În anumite variante de realizare, extractul de plantă este un amestec de extracte din Galeopsis segetum şi Galeopsis tetrahit.

Extractul conform invenţiei este obţinut prin extracţia dintr-o parte a plantei, cum ar fi rădăcini, frunze, fructe şi flori, de preferinţă părţile aeriene ale plantei. Conform unor exemple de realizare, extractul de plantă conform invenţiei este obţinut prin extracţia dintr-o parte a plantei sau dintr-un ţesut al acesteia folosind un solvent acceptabil fiziologic ca mediu de extracţie.

Prin termenul de „solvent acceptabil din punct de vedere fiziologic», se înţelege un solvent care nu produce reacţii adverse semnificative atunci când este introdus în corpul uman sau aplicat organismului uman. De obicei, prin termenul solvent se înţelege solventul utilizat pentru extragerea componentelor biologic active dintr-o porţiune de plantă de Galeopsis.

Un solvent adecvat pentru obţinerea extractului de plantă este un lichid acceptabil din punct de vedere fiziologic în care cel puţin unele dintre componentele biologic active ale plantei selectate sunt solubile şi în care nu suferă o modificare care să le priveze de activitate.

Părţile morfologice preferate ale plantei utilizate pentru efectuarea extracţiei este sistemul lăstarilor care include tulpini, frunze, floare şi flori.

Solventul utilizat pentru efectuarea extracţiei poate fi un solvent acceptabil din punct de vedere fiziologic. Solvenţii adecvaţi pot fi solvenţi nepolari, cum ar fi dietil eter, cloroform, solvenţi aprotici polari, cum ar fi acetatul de etil, dicloroetanul şi solvenţi protici polari, cum ar fi alcooli C1-C6 si solutii apoase care le contin. Se preferă utilizarea solvenţilor protici polari. Solvenţii protici polari tipici includ apă, etanol, propanol, alcool izopropilic şi amestecuri ale acestora. Solvenţii preferaţi sunt apa, alcoolul etilic şi un amestec al acestora.

în anumite exemple de realizare, după extracţia cu un solvent protic polar, de preferinţă etanol, extractul este de preferinţă filtrat, concentrat şi clarificat. Extractul obţinut este apoi, de preferinţă, purificat. Purificarea este mai preferabil efectuată prin eluare în coloană cu un solvent. Solventul poate fi, de exemplu, apă sau etanol. Extractul purificat este apoi de preferinţă concentrat şi uscat. Extractul uscat astfel obţinut poate fi opţional măcinat şi opţional adăugat cu excipienţi pentru a se obţine extractul uscat final care va fi utilizat în compoziţiile conform invenţiei. Excipienţii opţionali cuprinşi în extractul uscat sunt de preferinţă selectaţi din grupul constând din maltodextrină şi silicagel coloidal anhidru.

Pentru a obţine extractul de plantă din Galeopsis tetrahit, tehnicile de extracţie solid-lichid pot fi utilizate pentru a separa/extrage unul sau mai multe componente biologic active din ţesuturile vegetale ale plantei.

în anumite exemple de realizare, extracţia unuia sau mai multor componente biologic active are loc prin macerarea unei porţiuni sau a matricii vegetale a Galeopsis tetrahit într-un solvent adecvat, aşa cum este menţionat mai sus.

De exemplu, un extract adecvat poate fi obţinut prin scufundarea sau macerarea unei părţi din părţile aeriene ale Galeopsis într-un amestec apă-etanol, pentru un timp adecvat pentru îmbogăţirea solventului unuia sau mai multor componente biologic active conţinute în porţiunea de plantă. În aceste condiţii, extracţia componentelor biologic active din ţesuturile vegetale ale plantei selectate are loc, în mod substanţial, prin difuzie şi/sau osmoză. Timpul de macerare a porţiunilor de plantă în solvent este variabil, de exemplu de la 1 la 48 de ore.

În conformitate cu anumite variante de realizare, extractul uscat de Galeopsis este obţinut prin următorii paşi:

• măcinarea a cel puţin o parte a plantei Galeopsis; • extragerea cu un solvent, de preferinţă un solvent acceptabil fiziologic; • filtrarea extractului; • purificarea extractului filtrat, de preferinţă prin eluare într-o coloană cu un solvent; • uscarea extractului purificat; • măcinarea extractului uscat purificat. în unele exemple de realizare, etapa de extracţie poate fi repetată de două sau de trei ori. Când solventul este îndepărtat, de exemplu prin evaporare, se poate adăuga opţional un suport solid sau un excipient, cum ar fi, cu titlu de exemplu nelimitator, amidonuri sau maltodextrine, pentru a obţine extractul sub formă de pulbere uscată. De obicei, extractul obţinut din Galeopsis Tetrahit sau segetum, poate fi fluid, moale sau uscat şi, de preferinţă, este uscat. De exemplu: • în extractul fluid, 1 ml de extract conţine componente biologic active solubile în 1 g de medicament vegetal; • în extractul moale, solventul este parţial evaporat în special până când extractul nu umezeşte o hârtie de filtru; • în extractul uscat, solventul este evaporat aproape complet pentru a obţine o pulbere. Se pot prepara extracte din Galeopsis de polaritate diferită. De exemplu, este posibil să se obţină un extract cu polaritate mare utilizând un solvent polar, cum ar fi o soluţie hidroalcoolică, un extract cu polaritate intermediară folosind un solvent mai puţin polar, cum ar fi acetatul de etil sau un extract apolar folosind CO2 supercritic cu care se pot extrage fracţii de fito-complexe active. în anumite exemple de realizare, extracţia este efectuată utilizând un raport de greutate între solvent şi matrice vegetală variind de la 1:10 la 10:1. Este posibil să se extragă componentele vegetale biologic active din planta de Galeopsis folosind tehnici de extracţie alternative precum, de exemplu, prin digestie, infuzie, stoarcere, decoct, percolare, extracţie în contracurent, extracţie soxhlet, extracţie cu gaze supercritice sau ultrasunete. Pe lângă extractul de plantă, compoziţia sinergică poate cuprinde R-N1-spermidină sau sarea acesteia, în care R este hidrogen sau metil. Spermidina este o poliamină, având denumirea IUPAC N'-(3-aminopropil)butan-1,4-diamină. Spermidina poate fi prezentă în compoziţie sub formă de sare, de preferinţă o sare acceptabilă farmaceutic, mai preferabil sub formă de triclorhidrat. Pe lângă extractul de plantă, compoziţia sinergică poate cuprinde Biotină, o vitamina B solubilă în apă, numită şi vitamina B7 şi cunoscută anterior ca vitamina H sau coenzima R. Biotina este compusă dintr-un inel ureido fuzionat cu un inel tetrahidrotiofen având denumirea IUPAC acid 5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il]pentanoic (Număr CAS 58-85-5). Inventatorii au dezvăluit pentru prima dată proprietatea biotinei de a fi un promotor al autofagiei în celulele umane, în special în celulele foliculilor de păr ai scalpului uman. Prin urmare, prezenta dezvăluire se referă la biotină sau o compoziţie care conţine biotină conform oricăreia dintre exemplele de realizare descrise mai sus, pentru uz cosmetic sau nutraceutic sau medical ca promotor al autofagiei în tratamentul bolilor modulate de autofagie. Bolile modulate de autofagie sunt de exemplu selectate din grupul constând din neurodegenerare, cancer, boala Crohn şi boli de piele. În mod specific dintre bolile de piele, pot fi citate afecţiunile autoimune ale pielii, cum ar fi psoriazisul, lupusul eritematos sistematic (LES) şi vitiligo, tulburările infecţioase ale pielii, tulburările de cancer de piele, cum ar fi carcinomul cu celule scuamoase şi melanomul. Pentru prima dată extractul din genul Galeopsis, de preferinţă din speciile Galeopsis segetum şi Galeopsis tetrahit este utilizat ca promotor al autofagiei în tratamentul bolilor de piele. De preferinţă şi surprinzător, inventatorii au observat că administrarea compoziţiilor de mai sus, în mod tipic fie pe calea topică, fie pe cale orală, a promovat într-un mod sinergic autofagia în celulele foliculilor de păr ai scalpului uman la un subiect care suferă de subţierea părului, determinând astfel o ingrosare progresiva a zonelor suferinde ale scalpului. De obicei, compoziţia conform invenţiei cuprinde un purtător, diluant sau excipient acceptabil din punct de vedere fiziologic şi/sau farmaceutic. Purtătorul, diluantul sau excipientul adecvat din punct de vedere fiziologic sau farmaceutic poate fi selectat pe baza căii de administrare pentru care este destinată compoziţia farmaceutică rezultată. Orice purtător şi/sau excipient adecvat pentru forma de preparat dorită pentru administrare este avut în vedere în utilizările extractului de plante sau ingredientelor active descrise aici. În scopul prezentei invenţii, termenul "purtător" se referă la un excipient, vehicul, diluant sau adjuvant, care poate fi prezent în compoziţia invenţiei. Compoziţia conform invenţiei poate fi formulată într-o formă pentru aplicare topică sau într-o formă pentru administrare orală. în unele exemple de realizare, compoziţia este pentru aplicare locală. În această cerere, compoziţia conform invenţiei poate fi aplicată, într-o cantitate eficientă, direct pe scalpul sau pielea unei fiinţe umane. De exemplu, în tratamentul căderii sau al formelor de subţiere a părului se poate aplica direct pe scalp o cantitate activă din punct de vedere cosmetic/fiziologic de compoziţie, o dată sau de mai multe ori pe zi convenabil pentru cicluri de 2-3 luni, alternate cu perioade de absenţă a tratamentului. Conform acestor aspecte, o metodă de tratament cosmetic este dezvăluită aici cuprinzând aplicarea pe scalp, sau pe o porţiune a acestuia, a unei cantităţi eficiente dintr-o compoziţie conform uneia sau mai multor exemple de realizare descrise şi/sau revendicate aici. Cantitatea de extract uscat de Galeopsis, de preferinţă sub forma speciilor Galeopsis segetum sau Galeopsis tetrahit, în formularea topică a compoziţiilor conform invenţiei este în intervalul de la 0,0003% până la 0,01% greutate în greutate faţă de greutatea totală. a formulării. Cantitatea de biotină din formularea topică a compoziţiilor conform invenţiei este în intervalul de la 0,0006% până la 0,075% greutate în greutate faţă de greutatea totală a formulării. În formă topică, compoziţia cuprinde de preferinţă N1-metilspermidină. În forma topică, N1-metil spermidină sau spermidină este de preferinţă cuprinsă în intervalul de 0,0005-0,1 % în greutate faţă de greutatea totală a formulării. Printre excipienţii obişnuiţi din formularea topică pentru uz cosmetic sau pentru uz farmaceutic pot fi citaţi conservanţi, agenţi bactericizi, agenţi de emulsionare, tampoane, lubrifianţi, agenţi de umectare, agenţi de condiţionare şi agenţi de colorare. Compoziţia pentru aplicare topică poate fi sub formă solidă, semisolidă sau fluidă. Formulările adecvate în formă solidă includ creme, geluri, unguente, paste, unguente. în alte exemple de realizare, formularea pentru administrare locală este sub formă fluidă, de exemplu sub formă de loţiuni, geluri, şampoane, suspensii, emulsii. În cazul formelor de formulări fluide sau semifluide, extractul de plantă poate fi diluat într-un purtător în formă lichidă acceptabilă fiziologic, cum ar fi apă, alcool, soluţie hidroalcoolică sau glicerică sau amestecat cu alte lichide adecvate pentru aplicare locală. Cu titlu de exemplu, compoziţiile conform invenţiei sub formă lichidă pot fi preparate prin dizolvarea componentelor în apă şi/sau alcool. Compoziţia lichidă poate fi tamponată pentru a atinge un interval de pH selectat în mod convenabil de la 5 la 7 pentru a fi compatibil cu pH-ul scalpului şi apoi filtrată şi ambalată în recipiente adecvate, cum ar fi sticle sau fiole. În unele exemple de realizare, compoziţiile invenţiei pot cuprinde excipienţi utilizaţi în mod obişnuit în formularea preparatelor cosmetice sau farmaceutice pentru uz local, cum ar fi conservanţi, agenţi bactericizi, stabilizatori, emulgatori, tampon, agenţi de umectare, coloranţi şi alţi excipienţi utilizaţi în mod obişnuit în tehnicile de preparare. Într-o variantă de realizare, formularea pentru aplicarea locală este sub forma unei emulsii care conţine extractul purtat într-un excipient adecvat. În unele exemple de realizare, compoziţia pentru aplicare topică cuprinde un excipient de tip hidroximetilceluloză şi/sau gelifiere cu HLB adecvat pentru formulare şi substanţe. Conform altor exemple de realizare, compoziţia invenţiei este în formă pentru administrare orală. În aceste cazuri, compoziţia conţine componentele aşa cum s-a definit anterior şi unul sau mai multe vehicule sau excipienţi adecvaţi pentru administrare orală. Cantitatea de extract de Galeopsis, de preferinţă sub forma speciilor Galeopsis segetum sau Galeopsis tetrahit, în formularea orală a compoziţiilor conform invenţiei este în intervalul de la 0,1 mg la 20 mg per doză unică. Cantitatea de biotină din formularea orală a compoziţiilor conform invenţiei este în intervalul de la 0,03 mg până la 0,08 mg per doză unică. În formă orală, compoziţia cuprinde de preferinţă spermidină sau o sare a acesteia, mai preferabil spermidina este sub formă de sare. În forma orală, N1-metilspermidină (sau sarea sa) sau spermidină (sau sarea sa) este de preferinţă cuprinsă în intervalul de la 0,3 mg la 0,8 mg per doză unică. Cu titlu de exemplu, excipienţii adecvaţi pentru administrare orală includ derivaţi de celuloză, cum ar fi hidroximetilceluloza, hidroxipropil metilceluloza, metilceluloza, hidroxipropil celuloza, hidroxietil celuloza, carboxietil celuloza, etilhidroxietil celuloza, acetat butirat de celuloză, acetat de celuloză ftalat şi amestecuri ale acestora. Alte exemple de excipienţi adecvaţi includ polimerii aparţinând familiei lactamelor, cum ar fi pirolidona şi derivaţii săi, de exemplu polivinilpirolidonă, polivinilpolipirolidonă şi amestecurile acestora, săruri anorganice cum ar fi fosfatul de calciu sau dicalcic, lubrifianţi precum stearat de magneziu, triacilgliceroli şi amestecuri ale acestora. Compoziţiile pentru administrare orală pot fi sub formă solidă sau lichidă. Compoziţiile tipice în formă solidă includ tablete, capsule, pulberi, granule, pastile. Exemple de compoziţii sub formă lichidă includ soluţii, emulsii, suspensii, siropuri. Compoziţiile pot fi, de asemenea, sub formă de eliberare controlată a componentelor active conţinute în acestea. Tabletele cuprind în general un purtător sau excipient adecvat în care extractul de plantă este dispersat, de obicei sub formă uscată. Printre excipienţii sau purtătorii tipici pentru administrarea orală, agenţii de dezintegrare, aditivii, conservanţii pot fi incluşi în formularea compoziţiei. În anumite exemple de realizare, compoziţia invenţiei este un produs nutritiv, un produs dietetic sau un produs nutraceutic. Termenul supliment nutritiv înseamnă un produs care îmbunătăţeşte starea nutriţională şi poate fi utilizat pentru a susţine sau îmbunătăţi activitatea funcţională a unuia sau mai multor organe sau funcţionalitatea corpului uman în limitele fiziologice. Compoziţiile conform invenţiei fiind promotori de autofagie sunt, prin urmare, produse nutraceutice şi cosmeceutice care favorizează creşterea părului. Conform unui alt aspect, prezenta invenţie prevede, prin urmare, utilizarea cosmetică a compoziţiilor sinergice menţionate mai sus, aşa cum sunt definite în revendicarea 16. În conformitate cu un alt aspect specific, utilizarea formulării topice sau orale care cuprinde compoziţiile menţionate mai sus pentru stimularea creşterii fiziologice a părului este dezvăluită aici. În conformitate cu încă un alt aspect, prezenta invenţie asigură compoziţiile sinergice menţionate mai sus pentru utilizare în tratamentul aşa cum este definit în revendicarea 17. în conformitate cu un alt aspect specific, prezenta invenţie prevede, prin urmare, utilizarea cosmetică a formulării topice sau orale cuprinzând compoziţiile de mai sus pentru promovarea creşterii părului sau pentru tratamentul sau prevenirea căderii părului. Legătura dintre promovarea autofagiei şi activităţile menţionate mai sus ale compoziţiilor invenţiei sunt dovedite prin testele descrise în următorul Exemplu 13. În special, articolul ştiinţific al Chiara Parodi şi colab.: „Autofagia este esenţială pentru menţinerea creşterii unui (mini)organ uman: Dovezi din cultura de organe a foliculului de păr al scalpului» publicat pe PLOS Biology vol. 16(3), 2018, 28. Mar: 10.1371/ jurnal.pbio.2002864 arată că testul efectuat pe celulele epiteliale ale osteosarcomului osos uman este un model consacrat pentru demonstrarea eficacităţii compoziţiei în stimularea creşterii părului. Experimental se arată sinergismul în stimularea autofagiei într-un model in vitro validat. Datele şi publicaţia arată că autofagia este esenţială pentru creşterea foliculului de păr. Compoziţia conform invenţiei stimulează autofagia şi, în consecinţă, este eficientă în stimularea creşterii părului. în anumite aspecte, invenţia furnizează compoziţia de mai sus pentru utilizare în tratamentul tulburărilor de creştere a părului, cum ar fi în cazul alopeciei androgenetice sau defluvium. Într-un alt aspect, invenţia prevede utilizarea compoziţiilor de mai sus ca promotoare ale autofagiei aşa cum este definit în revendicările 18 şi 19. Inventatorii au descoperit, de asemenea, că o compoziţie cuprinzând N1-metilspermidină şi biotină a fost potrivită ca promotor al autofagiei în tratamentul bolilor de piele. Cantităţile administrate şi frecvenţa de administrare a compoziţiei vor depinde de tipul şi severitatea bolilor de tratat. Invenţia va fi acum detaliată prin referire la exemple de realizare specifice care arată rezultatele sinergice obţinute de compoziţiile invenţiei şi nu ar trebui să fie considerate limitative. Cantităţile de componente indicate sunt exprimate ca procente (%) de greutate în greutate (g/g) sau în mg per doză unică de administrare.

PĂRŢI EXPERIMENTALE

Exemplul 1

Prepararea extractului de Galeopsis segetum

Prepararea extractului uscat de Galeopsis segetum a fost realizată prin extracţie cu etanol 40% urmată de purificare pe coloană. Paşii sunt descrişi în paragrafele următoare.

Extracţie

Părţile aeriene uscate de G. segetum au fost extrase de două ori la 50°C timp de 2 ore cu etanol 40%. Solidul şi lichidul au fost separate printr-un decantor.

Levigatele au fost filtrate, concentrate sub vid şi apoi limpezite prin centrifugare.

Purificare

O coloană a fost umplută cu răşină absorbantă schimbătoare de ioni XAD7HP care a fost înmuiată anterior în etanol 95% şi menţinută în contact timp de 10 ore. Coloana umplută a fost apoi spălată cu apă continuând până când conductivitatea eluatului a atins aceeaşi valoare cu a apei încărcate.

Purificarea extractului s-a făcut pe coloana împachetată XAD7HP eluând iniţial cu apă şi apoi cu etanol 70%.

Eluaţii colectaţi au fost concentraţi sub vid.

S-a adăugat etanol la soluţia concentrată şi apoi soluţia a fost încălzită la 70-75°C timp de 30 de minute pentru a reduce nivelul de încărcare biologică.

Soluţia a fost din nou concentrată sub vid, uscată la 50°C timp de 24 de ore şi apoi măcinată şi amestecată cu excipienţi (maltodextrină şi silicagel coloidal anhidru 90/10) pentru a se obţine produsul final.

Exemplul 2

Prepararea extractului de Galeopsis tetrahit

Prepararea extractului uscat de Galeopsis tetrahit a fost efectuată urmând exact aceeaşi procedură descrisă la paragrafele precedente pentru extracţia Galeopsis segetum.

Exemplul 3

Şampon revitalizant

Ingrediente % g/g Zetesol MGS/B 16-49 Lauroil Sarcosinat de sodiu 4-12 Mirasheen CP 820/G 2-6 Rewoderm LI S 80 1-4 Euxyl K 701 1-2 BC 2262 0,5-1,4 Cocamide MIPA 0,5-1,4 Proteina de grâu hidrolizată cu potasiu undecilenoil 0,5-1,4 Acid citric monohidrat 0,4-1,2 Betaină monohidrat 0,2-0,7 Clorura de lauril metil glucet-10 hidroxipropildimoniu 0,2-0,7 Gafquat 755 N-O 0,2-0,5 D-Pantenol 0,1-0,3 Etilendiamină disuccinat trisodic 0,1-0,3 BHA 0,01-0,02 Hialuronat de hidroxipropiltrimoniu 0.01-0.02 Extract uscat de Galeopsis segetum 0,003-0,009 Biotina 0,001-0,03 Meditanox H-10 0,0005-0,0015 N1-Metilspermidină 0,0005-0,1 Lecitina 0,0004-0,0011 Fomblin HC/PU-CAT5 0,0002-0,0005 Apă până la 100 ml

Exemplul 4

Şampon întăritor

Ingrediente%g/g Zetesol MGS/B 15-50 N-lauroil sarcosinat de sodiu 4-12 Mirasheen CP 820/G 2-6 Rewoderm LI S 80 1-4 Euxyl K 701 1-2 Cocamide MIPA 0,5-1,4 Proteina de grâu hidrolizată cu potasiu undecilenoil 0,5-1,4 Acid citric monohidrat 0,4-1,1 BC 2262 0,3-0,8 Betaină monohidrat 0,2-0,7 Clorura de lauril metil glucet-10 hidroxipropildimoniu 0,2-0,7 Abil Soft AF 100 0,2-0,6 Gafquat 755 N-O 0,2-0,5 D-Pantenol 0,1-0,3 Etilendiamină disuccinat trisodic 0,1-0,3 BHA 0,01-0,02 Hialuronat de hidroxipropiltrimoniu 0,01-0,02 Extract uscat de Galeopsis segetum 0,003-0,009 Biotina 0,001-0,003 Meditanox H-10 0,001-0,002 N1-Metilspermidină 0,001-0,002 Lecitină NAT 8539 0,0004-0,0011 Fomblin HC/PU-CAT5 0,0002-0,0005 Apă până la 100 ml

Exemplul 5

Loţiune

Ingrediente % g/g Etanol 9-27 Pantotenat de calciu 1-2 PEG-40 Ulei de ricin hidrogenat 1-2 Acid lactic sol. 80% 0,1-0,4 Lypobelle soiaglicon 0,04-0,13 Hialuronat de hidroxipropiltrimoniu 0,03-0,1 N1-metilspermidină 0,03-0,09 Lecitină NAT 8539 0,02-0,07 Octadecil di-t-butil-4-hidroxihidrocinamat 0,02-0,07 Fomblin HC/PU-CAT5 0,009-0,027 Biotina 0,007-0,022 Meditanox H-10 0,0005-0,0015 Apă până la 100 ml

Exemplul 6

Balsam fortifiant

Ingrediente % g/g Clorura de cetil trimetil amoniu 3-9 Alcool cetil stearilic 3-8 Silsoft 8812 2-7 Arlacel 165-PA-(MV) 2-5 Stearat de gliceril 2-5 lactat de alchil C12-13 1-3 Dow Corning CE 8401 1-2 Xilitol 1-2 Bioscontrol sinergie BAS 0,3-0,9 Hidroxietilceluloza 0,3-0,9 D-Pantenol 0,3-0,8 Uniglucan G-51 0,3-0,8 Acid lactic lichid 0,1-0,4 Fitantriol 0,1-0,3 Benzoat de sodiu 0,1-0,3 Dehidroacetat de sodiu 0,1-0,3 Ciclopentasiloxan 0,1-0,2 EDTA disodic dihidrat 0,1-0,2 Sericină 0,1-0,2 Hialuronat de hidroxipropiltrimoniu 0,01-0,02 Extract uscat de Galeopsis segetum 0-0,01 Biotina 0,01-0,03 Meditanox H-10 0,001-0,002 Lecitină NAT 8539 0,0004-0,0011 Fomblin HC/PU-CAT5 0,0002-0,0005 N1-metilspermidină 0,025-0,075 Apă până la 100 ml

Exemplul 7

Balsam fortifiant

Ingrediente % g/g Alcool cetostearilic 4-11 Clorura de cetil trimetil amoniu 3-8 Soluţie cationică transparentă Aquacat PF618 2-6 1,2 Propandiol 2-5 SI-TEC AME 6057 1-3 Incroquat behenyl TMS 1-2 D-Pantenol 0,4-1,2 Fenoxietanol 0,4-1,2 Stearat de gliceril 0,4-1,2 Complexul meu 0,4-1,2 Ceraphyl 60 0,3-0,8 Collasurge - LQ- (WD) 0,3-0,8 Ulei de şofrănel 0,2-0,5 Amipearl argint intens1161 0,1-0,3 Acetat de tocoferil 0,1-0,3 Hidroxietilceluloza 0,1-0,3 Uvinul A plus B 0,1-0,2 Ciclopentasiloxan 0,1-0,2 Dekaben BL 0,1-0,2 EDTA disodic dihidrat 0,1-0,2 Rewoteric AM 2C NM 0,1-0,2 acid citric monohidrat 0,03-0,08 Hidroxitoluen butilat 0,03-0,08 Pantotenat de calciu 0,01-0,03 Hialuronat de hidroxipropiltrimoniu 0,01-0,02 Biotina 0,001-0,02 SK-Influx V 0,001-0,003 Rutin 0,0006-0,0017 Extract uscat de Galeopsis tetrahit 0,001-0,002 Meditanox H-10 0,0005-0,0015 Extract uscat din seminţe de Vitis vinifera 0,0005-0,0015 Lecitină NAT 8539 0,0004-0,0012 Ulei de zeaxantina Sol. 20% 0,0002-0,0006 Fomblin HC/PU-CAT5 0,0002-0,0005 N1-metilspermidină 0,0045-0,0135 Apă până la 100 ml

Exemplul 8

Gel fortifiant

Ingrediente (INCI) % g/g Polimer Fixate PLUS 2-5 PEG-40 Ulei de ricin hidrogenat 1-3 Parfum Apollon 436/F 0505436F 1-2 Sorbitol nu se cristalizează 70% 1-2 Hidroximetilglicinat de sodiu 0,5-1,5 Hidroxipropil guar 0,4-1,2 Benzofenona-4 0,15-0,45 Luviquat Polyquatenium 11 0,15-0,45 EDTA disodic dihidrat 0,05-0,15 Taurin 0,03-0,08 Pantotenat de calciu 0,01-0,03 N1-metilspermidină 0,00275-0,00825 Extract uscat de Galeopsis tetrahit 0,0003-0,0009 Biotina 0,00075-0,0025 Meditanox H-10 0,0001-0,0002 Apă până la 100 ml

Exemplul 9

Cremă

Ingrediente %g/g Octildodecanol 11,5-15,5 Alcool cetil stearilic 8,5-11,5 Ceară de esteri cetilici 2,6-3,5 Monostearat de sorbitan 1,7-2,3 Polisorbat 60 1,3-1,7 Alcool benzilic 0,9-1,2 N1-Metilspermidină 0,0428-0,058 Biotina 0,0119-0,0161 Apă până la 100 ml

Exemplul 10

Tablete

Ingrediente Cantitate (mg) Metionină 200-400 Vitamina C acoperită 50-150 Celuloză microcristalină 40-160 extract uscat din seminţe de Vitis vinifera 30-90 Hidroxipropil-metilceluloză K100 20-70 Zeaxantina 5% 20-70 Acetat de vitamina E 50% 20-50 Drojdie de seleniu 2000 ppm 20-40 Bisglicinat de zinc 28,2% 10-40 Dioxid de siliciu coloidal 10-20 Olea Europaea L. extract uscat de frunze 5-15 Pantotenat de calciu 5-11 Polietilen glicol 6000 4-12 Stearat de magneziu 4-12 Polivinilpirolidonă K30 3-10 Extract uscat de Galeopsis segetum 0.1-20 Bisglicinat de cupru 30% 2-6 Rutin 1-4 Vitamina B6 1-4 Acid hialuronic 1-2 Triclorhidrat de spermidină 0,3-0,8 Acid folic 0,1-0,3 Biotină 0,03-0,08

Exemplul 11

Tablete

Ingrediente Cantitate (mg) Celuloză microcristalină 40-160 Hidroxipropil-metilceluloză K100 20-70 Acetat de vitamina E 50% 20-50 Bisglicinat de zinc 28,2% 10-40 Dioxid de siliciu coloidal 10-20 Polietilen glicol 6000 4-12 Stearat de magneziu 4-12 Polivinilpirolidonă K30 3-10 Bisglicinat de cupru 30% 2-6 Vitamina B6 1-4 Acid hialuronic 1-2 Triclorhidrat de spermidină 0,3-0,8 Biotină 0,03-0,08

Exemplul 12

Tablete

Ingrediente Cantitate (mg) Celuloză microcristalină 40-160 Hidroxipropil-metilceluloză K100 20-70 Acetat de vitamina E 50% 20-50 Bisglicinat de zinc 28,2% 10-40 Dioxid de siliciu coloidal 10-20 Extract uscat de Galeopsis segetum 5-20 Polietilen glicol 6000 4-12 Stearat de magneziu 4-12 Polivinilpirolidonă K30 3-10 Bisglicinat de cupru 30% 2-6 Vitamina B6 1-4

Exemplul 13

Materiale şi metode

Analiza imunoblot.

Celulele U2OS au fost crescute la confluenţă de 80% în glucoză mediu ridicat de Eagle modificat Dulbecco (4,5 g/ID-glucoză) care conţine L-glutamina 4mM, ser fetal bovin (FBS) 10% şi tratate cu spermidină (Lot.2010112716), Galeopsis segetum IDN 6781), Biotină (Lot. 2014124160) sau combinaţiile acestora. Probele de proteine au fost extrase în tampon RIPA aşa cum s-a raportat anterior (De Mei C, Ercolani L, Parodi C, Veronesi M, Vecchio CL, Bottegoni G, et al. Inhibarea duală a REV-EPBβ şi autofagia ca o nouă abordare farmacologică pentru a induce citotoxicitatea în celulele canceroase. Oncogene. 2015;34(20):2597-608). Nivelurile p62/SQSTM1 şi GAPDH au fost analizate cu anticorpi specifici anti-p62/SQSTM1 şi anti-GADPH. Experimentele de imunoblot au fost efectuate în tampon TBS-T care conţine 5% albumină serică bovină (BSA). Anticorpii anti-LC3B şi anti-GAPDH au fost diluaţi 1:1000 şi, respectiv, 1:50000. Anticorpii secundari conjugaţi HPR complementari au fost diluaţi 1:10000. La reacţia cu reactivul de detectare ECL Western blot, semnalele chemiluminescente au fost obţinute cu un analizor de imagine luminiscent LAS-4000 şi densitatea optică a semnalului de bandă specifică a fost calculată cu software-ul de analiză a imaginii Photoshop. GAPDH a fost adoptat ca control de încărcare şi semnalele GAPDH au fost utilizate pentru a normaliza nivelurile de proteină p62 între diferite probe.

Imunobloturile au fost repetate de cel puţin 4 ori pentru a exprima valoarea ca medie ± SEM.

Analiza fluorescentă a inhibării autofagiei.

Celulele U2OS au fost însămânţate cu 3000 de celule/godeu în plăci cu 48 de godeuri, lamelă Nr. 1,5 neacoperită, diametru de sticlă de 6 mm, acoperite anterior cu soluţie de gelatină şi transduse cu 0,2 µl de baculovirus/10 000 de celule conţinând o proteină himerică p62-proteină roşie fluorescentă (p62-RFP). La 48 de ore după transducţie, celulele au fost tratate cu spermidină, biotină, Galeopsis sau vehicul şi monitorizate timp de 24 de ore utilizând microscopia NIKON Live Cell Imaging.

Activitatea sinergică a spermidinei. G. segetum şi biotinei pentru a induce autofagia în celulele umane

Pentru a evalua dacă biotina şi/sau extractul de Galeopsis segetum pot afecta autofagia, inventatorii au monitorizat acumularea de autofagozom în celulele U2OS cultivate prin microscopie fluorescentă cu celule vii (Klionsky DJ, Abdelmohsen K, Abe A, Abedin MJ, Abeliovich H, Acevedo Arozena A, et al. Orientări pentru utilizarea şi interpretarea testelor pentru monitorizarea autofagiei. Autofagie. 2016; 12(1): 1-222). Astfel, celulele au fost transduse cu construct care conţine proteina autofagică, LC3, fuzionată cu o proteină fluorescentă roşie (RFP). Apoi, acumularea de puncte fluorescente LC3 la adăugarea de biotină (200ng/ml) sau extract uscat de Galeopsis (100ng/ml) a fost monitorizată prin achiziţionarea de imagini la fiecare 30 de minute timp de 6 ore. Spermidina (10 µM) a fost adoptată ca un control pozitiv al unui compus inductor de autofagie (Pietrocola F, Lachkar S, Enot D, Niso-Santano M, Bravo-San Pedro J, Sica V, et al. Spermidina induce autofagia prin inhibarea acetiltransferazei EP300. Moartea celulară şi diferenţierea. 2015;22(3):509-16).

Această analiză a relevat o acumulare marcată de puncte fluorescente LC3 atât în celulele tratate cu biotină, cât şi cu Galeopsis (a se vedea imaginile reprezentative din Figura 1). După cum este evident în Figura 1, tratamentul cu spermidină a dus la o acumulare marcată de puncte fluorescente LC3 (adică acumularea de autofagozomi). Atât biotina, cât şi extractul uscat de Galeopsis segetum au produs o acumulare similară de puncte roşii LC3.

Deoarece punctele LC3-RFP se pot acumula, de asemenea, la o blocare a fluxului autofagic, degradarea dependentă de autofagie a proteinei SQSTM1/p62 (Klionsky DJ, Abdelmohsen K, Abe A, Abedin MJ, Abeliovich H, Acevedo Arozena A, et al. Orientări pentru utilizarea şi interpretarea testelor pentru monitorizarea autofagiei. Autofagie. 2016; 12(1): 1-222) a fost astfel monitorizată. p62 a servit ca linker între LC3 şi substraturile ubiquitinate (Pankiv S, Clausen TH, Lamark T, Brech A, Bruun J-A, Outzen H, et al. p62/SQSTM1 se leagă direct de Atg8/LC3 pentru a facilita degradarea agregatelor proteice ubiquitinate prin autofagie. Jurnalul de chimie biologică. 2007;282(33):24131-45). Proteinele poliubiquitinate legate de p62 şi p62 au fost încorporate în autofagozomul complet şi au fost degradate în autolizozomi, servind astfel ca un indice al degradării autofagice (Klionsky DJ, Abdelmohsen K, Abe A, Abedin MJ, Abeliovich H, Acevedo Arozena A, et al. Orientări pentru utilizarea şi interpretarea testelor pentru monitorizarea autofagiei. Autofagie. 2016; 12(1): 1-222).

În consecinţă, efectele biotinei şi Galeopsis asupra degradării p62 mediată de autofagie au fost evaluate prin analizarea numărului de autofagozomi p62-RFP prin microscopie fluorescentă directă. Celulele au fost astfel transduse cu un construct care exprimă proteina p62 fuzionată cu RFP. Apoi, punctele fluorescente p62 au fost monitorizate după adăugarea de biotină, Galeopsis, spermidină sau vehicul. Sprijinind pe deplin faptul că atât biotina, cât şi Galeopsis au acţionat ca inductori de autofagie, a fost observată o reducere drastică a punctelor p62-RFP în celulele tratate în comparaţie cu vehiculul (vezi imaginile reprezentative din Figura 2).

După cum se vede în figura 2, tratamentul cu inductorul de autofagie caracterizat anterior, spermidină, a redus semnificativ punctele fluorescente p62 şi semnalele fluorescente, indicând astfel că atât biotina, cât şi extractul de Galeopsis segetum acţionează ca inductori de autofagie, aceste tratamente producând o reducere puternică a semnalelor fluorescente p62.

Odată validată activitatea de inducere a autofagiei a biotinei şi Galeopsis şi după ce s-a validat utilizarea p62 ca marker adecvat al procesului de autofagie, efectele combinaţiilor de compuşi asupra nivelurilor proteinei p62 au fost evaluate prin analiză imunoblot cu anticorpi specifici anti-p62 (De Mei C, Ercolani L, Parodi C, Veronesi M, Vecchio CL, Bottegoni G, et al. Inhibarea duală a REV-EPBβ şi autofagia ca o nouă abordare farmacologică pentru a induce citotoxicitatea în celulele canceroase. Oncogene. 2015;34(20):2597-608).

Această analiză a indicat un efect sinergic semnificativ între spermidină, biotină şi Galeopsis în inducerea degradării p62 mediată de autofagie (Tabelul 1).

tabelul 1

Tratament Procentul de reducere a p62 faţă de vehicul (% ± SEM) Reducerea p62 aşteptată din efectele aditive Efecte sinergice Spermidină 5 ± 0,11 Biotina 21 ± 1,5 Galeopsis 24 ± 2,1 Spermidină + Biotină 45 ± 2,5 26 ± 1,61 DA Spermidină + Galeopsis 51 ± 3,3 29 ± 2,21 DA Biotina + Galeopsis 67 ± 5,5 45 ± 3,6 DA Spermidină + Galeopsis + Biotină 78 ± 3,9 50 ± 3,71 DA

Într-adevăr, combinaţia de spermidină (0,5 µM) şi biotină (19,91 ng/ml) a dus la o reducere a p62 de aproape două ori mai mare decât reducerea aşteptată de efectele aditive (45% faţă de 26%). Rezultate similare au fost obţinute pentru combinaţia de spermidină şi Galeopsis (7,9 ng/ml) (51% VS 29%) şi amestec de biotină/Galeopsis (67% vs 45%). În cele din urmă, o combinaţie a tuturor celor trei compuşi (0,5 µM spermidină + 7,9 ng/ml Galeopsis + 19,91 ng/ml biotină) a generat o reducere remarcabilă de 78% a nivelurilor de proteină p62.

Exemplul 14

Au fost evaluate nivelurile de LC3 şi SQSTM1 lipidate în celulele U2OS umane tratate cu doze echimolare de N1-metilspermidină şi spermidină. Ca rezultat, în comparaţie cu vehiculul, ambii compuşi au crescut nivelurile formei LC3-II lipidate şi au stimulat degradarea SQSTM1 mediată de autofagie. Celulele U2OS umane cultivate în mod specific au fost tratate 6 ore cu vehicul sau doze echimolare de spermidină şi N1-metilspermidină (100 µM). Nivelurile de LC3 lipidat (LC3-II) şi SQSTM1 au fost apoi evaluate prin analiză de imunoblotare ca în exemplul 13 cu anticorp specific. Semnalele de actină au fost adoptate ca control al încărcării. Analiza densitometrică a semnalelor proteice este raportată ca niveluri relative de proteine normalizate de ACTINĂ. Valoarea eşantionului de vehicul a fost setată la 1. Afişată ca medie ± SEM, n=3. *P<0,05 şi *P<0,01, compuşi faţă de vehicul. Rezultatele sunt raportate în figura 3 (A şi B). Aceste rezultate validează faptul că N1-metilspermidină păstrează activitatea de a induce autofagia, ca analogul său desmetilat.

Claims (19)

1. O compoziţie sinergică care cuprinde un extract de plantă din genul Galeopsis şi un compus care promovează autofagia selectat dintre R-N1-spermidină sau o sare a acesteia, în care R este hidrogen sau metil, biotină şi amestecuri ale acestora.

2. Compoziţie sinergică conform revendicării 1, în care extractul de plantă din genul Galeopsis este selectat dintre speciile de Galeopsis segetum şi Galeopsis tetrahit şi amestecuri ale acestora.

3. Compoziţie sinergică conform revendicării 2, în care extractul de plantă din genul Galeopsis este un extract uscat care poate fi obţinut prin procedeul care cuprinde următoarele etape:

- măcinarea a cel puţin unei părţi din planta din genul Galeopsis;

- extragerea cu un solvent, de preferinţă un solvent acceptabil fiziologic;

- filtrarea extractului;

- purificarea extractului filtrat, de preferinţă prin eluare în coloană cu un solvent;

- uscarea extractului purificat;

- măcinarea extractului uscat purificat; şi

- opţional adăugarea de excipienţi.

4. Compoziţie sinergică conform revendicării 3, în care excipienţii cuprind maltodextrină şi/sau silicagel coloidal anhidru.

5. Compoziţie sinergică conform oricăreia dintre revendicările 1-4, în care spermidina este prezentă în compoziţie sub formă de triclorhidrat.

6. O formulare topică care cuprinde compoziţia sinergică conform oricăreia dintre revendicările 1-5 şi cel puţin un excipient adecvat pentru administrare topică.

7. Formulare topică conform revendicării 6, în care cantitatea de extract de plantă din genul Galeopsis este în intervalul de la 0,0003% la 0,01% în greutate faţă de greutatea totală a compoziţiei.

8. Formulare topică conform revendicării 6 sau revendicării 7, în care cantitatea de biotină este în intervalul de la 0,0006% la 0,075% în greutate în raport cu greutatea totală a compoziţiei.

9. Formulare topică conform oricăreia dintre revendicările 6-8, în care compoziţia cuprinde R-N1-spermidină sau o sare a acesteia, în care R este metil sau hidrogen, în intervalul 0,0005-0,1% în greutate faţă de greutatea totală a compoziţiei.

10. Formulare topică conform oricăreia dintre revendicările 6-9, în care formularea este într-o formă selectată din grupul constând dintr-un şampon, un gel, un balsam, o loţiune, un elixir, o emulsie, o spumă, un fard şi o cremă.

11. O formulare orală care cuprinde compoziţia sinergică conform oricăreia dintre revendicările 1-5 şi cel puţin un excipient adecvat pentru administrare orală.

12. Formulare orală conform revendicării 11, în care cantitatea de extract uscat al plantei din genul Galeopsis în formularea orală este în intervalul de la 0,1 mg la 20 mg per doză unică.

13. Formulare orală conform revendicării 11 sau 12, în care cantitatea de biotină din formularea orală este în intervalul de la 0,03 mg la 0,08 mg per doză unică.

14. Formulare orală conform revendicării 11 sau 12, în care compoziţia cuprinde R-N1-spermidină sau o sare a acesteia, în care R este metil sau hidrogen, în intervalul de la 0,3 mg până la 0,8 mg per doză unică.

15. Formulare orală conform oricăreia dintre revendicările 11-14, în care formularea este o formulare solidă selectată din grupul constând dintr-un comprimat, o capsulă, pulberi, granule şi o pilulă.

16. Utilizare cosmetică a compoziţiei sinergice conform oricăreia dintre revendicările 1-5 sau o formulare topică conform oricăreia dintre revendicările 6-10 sau o formulare orală conform oricăreia dintre revendicările 11-15 în promovarea creşterii părului şi/sau prevenirea căderii părului.

17. Compoziţie sinergică conform oricăreia dintre revendicările 1-5 sau o formulare topică conform oricăreia dintre revendicările 6-10 sau o formulare orală conform oricăreia dintre revendicările 11-15 pentru utilizare în tratamentul alopeciei androgenetice sau defluvium.

18. Compoziţie sinergică conform oricăreia dintre revendicările 1-5 pentru utilizare ca promotor al autofagiei în tratamentul unei boli modulate de autofagie.

19. Compoziţie sinergică pentru utilizare conform revendicării 18 în care bolile modulate de autofagie sunt selectate din grupul constând din neurodegenerare, cancer, boala Crohn şi boli de piele.