BR112020002216B1 - Uma composição sinérgica como um promotor de autofagia - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a uma composição sinérgica compreendendo um extrato seco de planta de gênero Galeopsis e um composto promovendo autofagia selecionado a partir de R- N1-espermidina ou como um sal da mesma, em que R é hidrogênio ou metil, biotina e misturas das mesmas. As composições sinérgicas em concordância com a presente invenção podem estar na forma de uma formulação tópica ou formulação oral e são úteis como um promotor de autofagia, especialmente em células de folículos capilares do couro cabeludo humano e em promoção de crescimento de cabelo (crescimento capilar) e/ou no tratamento de queda de cabelo ou de perda de cabelo.

Description

DESCRIÇÃO CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção se refere a composições sinérgicas e sua utilização como um promotor de autofagia nos campos nutricional, médico ou cosmético.

ESTADO DA TÉCNICA

[0002] Autofagia (ou autofagocitose) é o mecanismo natural, regulado, da célula que desmonta componentes desnecessários ou disfuncionais. Autofagia possibilita a degradação e reciclagem ordenadamente de componentes celulares. Na macroautofagia, constituintes citoplasmáticos visados são isolados a partir do resto da célula dentro de uma vesícula de membrana dupla conhecida como um autofagossomo. O autofagossomo essencialmente funde com lisossomos e os conteúdos são degradados e reciclados. Três formas de autofagia são comumente descritas: macroautofagia, microautofagia, e autofagia mediada por chaperona [chaperone-mediated autophagy (CMA)], juntamente com mitofagia. Em doença, autofagia tem sido como uma resposta adaptativa para estresse, que promove sobrevivência, enquanto que em outros casos ela aparece para promover morte e morbidade de célula. No caso extremo de inanição, a quebra de componentes celulares promove sobrevivência celular por manutenção de nível de energia célula.

[0003] Conseqüentemente, autofagia exerce um papel crucial em saúde, doença e envelhecimento regulando tais processos celulares centrais como respostas de estresse adaptativas, diferenciação, desenvolvimento de tecido e homeostase.

[0004] Em Angeleen Fleming e outros, “Chemical modulators of autophagy as biological probes and potencial therapeutics”, Nature e Chemical Biology 7, 9-17 (2.011),os autores demonstraram que autofagia possui funções pleiotrópicas inesperadas que favorecem sobrevivência da célula, incluindo suprimento de nutriente sob inanição, limpeza do interior celular, defesa contra infecção e apresentação de antígeno. Autofagia defeituosa (deficiente) é, portanto, associada com uma faixa diversa de estados de doença, incluindo neurodegeneração, câncer e doença de Crohn.

[0005] Em Teng Yu e outros, “Targeting autophagy in skin diseases, J Mol Med (2.015) 93:31-38”, os mecanismos de autofagia sobre a patogênese de doenças de pele são estudados e relatados. Especialmente o papel da autofagia - em distúrbios autoimunes de pele, tais como psoríase, lúpus eritematoso sistêmico [systematic lupus erythematosus (SLE)] e vitiligo, - distúrbios infecciosos de pele, - distúrbios de câncer de pele, tais como carcinoma e melanoma escamoso de célula, são relatados.

[0006] De maneira tal a terapeuticamente modular autofagia para investigação, supressores e indutores de modelos de órgão humano de autofagia foram estudados.

[0007] Em Tobias Eiserberg e outros, “Induction of autophagy by spermidime promotes longevity”, Nature cell biology, volume 11, número 11, Novembro de 2.009, os efeitos de espermidina, uma poliamina natural, foram estudados em levedura, moscas e vermes. Os autores relataram que a administração de espermedina estendeu o tempo de vida dos mesmos. Adicionalmente, administração de espermidina potencialmente inibiu estresse oxidativo em ratos envelhecidos. Foi demonstrado que autofagia constituiu o principal caminho de degradação lisossômica para reciclagem de material celular danificado e potencialmente prejudicial (nocivo).

[0008] Os inventores perceberam que como um (mini)órgão completo, ciclicamente remodelado, a cultura de órgão de folículos capilares de couro cabeludo humano (HFs) podem proporcionar um tal modelo na medida em que tais folículos, depois de atividade de crescimento massiva (anágena), espontaneamente adentram para a involução de órgão tracionado por apoptose (catágena). Como é conhecido, o ciclo de vida do bulbo capilar do folículo é essencialmente representado por três subseqüentes fases: anágena (crescimento), catágena (involução) e telógena (fase de repouso).

[0009] Surpreendentemente, os inventores descobriram que o ciclo de vida do folículo de cabelo pode ser modulado pelo mecanismo de autofagia e sobre a base do modelo de folículo de cabelo de couro cabeludo humano, agentes de promoção foram investigados.

[0010] Em vista do estudo, os inventores admitiram a hipótese de que HFs de couro cabeludo anágeno de último estágio, cujo epitélio de matriz de cabelo prolifera em uma alta taxa do que a maior parte de tumors malignos e é exposto para um número de estressores, são susceptíveis para virem sob pressão crescente para manter homeostase de tecido e podem requerer um substancial fluxo de autofagia para seu fluxo para manter seu crescimento.

[0011] Como é conhecido, diferentes estressores negativamente afetam o ciclo de vida do folículo de cabelo, por conseqüência, determinando uma redução do número de cabelos e sua queda.

[0012] Conseqüentemente, um objetivo da presente invenção é o de proporcionar uma composição adequada como um promotor de autofagia em células de folículos de cabelo (folículos capilares) de couro cabeludo humano.

[0013] Um outro objetivo da presente invenção, portanto, é o de proporcionar uma composição para promoção de crescimento de cabelo e/ou para inibição ou para retardar perda de cabelo no couro cabeludo humano.

[0014] Um outro objetivo da presente invenção é o da provisão de uma composição para o tratamento de condições mediadas por autofagia.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0015] Começando a partir do estudo da cultura de órgão de folículos de cabelo de couro cabeludo humano (HFs), os inventores descobriram uma combinação de compostos induzindo autofagia no modelo estudado e mostrando um efeito sinérgico em promoção de autofagia, especialmente em células de couro cabeludo humano, folículos de cabelo (folículos capilares).

[0016] Depois de investigação, a composição possuindo um efeito sinérgico foi inesperadamente de um extrato de planta de gênero Galeopsis combinado com um adicional composto promovendo autofagia, especialmente em células de couro cabeludo humano, selecionados a partir de R-N1-espermidina ou seu sal, biotina e misturas dos mesmos.

[0017] Conseqüentemente, os anteriormente mencionados objetivos da presente invenção foram conseguidos por uma composição sinérgica compreendendo um extrato de planta de gênero Galeopsis e R-N1-espermidina ou um sal da mesma, em que R é hidrogênio ou metil.

[0018] Alternativamente, os anteriormente mencionados objetivos da presente invenção foram conseguidos por uma composição sinérgica compreendendo um extrato de planta de gênero Galeopsis e biotina.

[0019] Em uma adicional concretização alternativa, os anteriormente mencionados objetivos da presente invenção foram conseguidos por uma composição sinérgica compreendendo um extrato de planta de gênero Galeopsis, biotina e R-N1-espermidina ou um sal da mesma, em que R é hidrogênio.

[0020] Preferivelmente e surpreendentemente, os inventores observaram que a administração das composições anteriormente mencionadas, tanto pela via tópica ou quanto pela via oral de administração, promoveu de uma maneira sinérgica, a autofagia em células especialmente de folículos de cabelo, em um sujeito que sofre a partir de queda de cabelo, por conseqüência, determinando um espessamento progressivo das áreas afetadas (sofridas) do couro cabeludo.

[0021] Em concordância com um aspecto adicional, a presente invenção, portanto, proporciona para a utilização das composições anteriormente mencionadas para estimulação do crescimento fisiológico do cabelo.

[0022] Em concordância com um ainda adicional aspecto, a presente invenção, portanto, proporciona as composições anteriormente mencionadas para utilização no tratamento ou na prevenção de perda de cabelo ou de uma doença de couro cabeludo.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0023] A Figura 1 mostra imagens representativas de células USO2 transduzidas com uma construção expressando a proteína autofágica LC3 fundida com uma Proteína Fluorescente Vermelha [Red Fluorescent Protein (RFP)] tratada 6 horas com as substâncias indicadas. O indutor de autofagia previamente caracterizado, espermidina, foi utilizado como referência positiva.

[0024] A Figura 2 mostra imagens representativas de células U2OS transduzidas com uma construção expressando a proteína SQSTM1/p62 fundida com uma Proteína Fluorescente Vermelha (RFP) tratada 6 horas com as substâncias indicadas. Transformação (turn-over) de SQSTM1/p62 primordialmente depende do processo de degradação mediado por autofagia.

[0025] A Figura 3 mostra os níveis de LC3 e SQSTM1 lipidadas em células U2OS humanas tratadas com doses eqüimolares de N1-metilespermidina e espermidina como relatadas no Exemplo 14.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0026] A presente invenção, portanto, se refere a uma composição sinérgica conforme definida na reivindicação de patente independente 1 anexada. Em uma concretização preferida e vantajosa, a presente invenção se refere a uma composição sinérgica de um extrato de planta de gênero Galeopsis, R-N1-espermidina ou um sal da mesma, em que R é hidrogênio ou metil, e biotina.

[0027] O extrato da composição das composições anteriormente mencionadas se origina a partir de uma planta pertencendo para o gênero Galeopsis.

[0028] Em uma concretização, o extrato de Galeopsis é um extrato seco, em particular da espécie Galeopsis segetum, comumente conhecida como urtiga de cânhamo felpudo (Downy Hemp-nettle), isto é, uma espécie de planta florida da família da sálvia, Lamiaceae.

[0029] Em uma outra concretização, o extrato de Galeopsis é um extrato, em particular da espécie Galeopsis tetrahit.

[0030] Em determinadas concretizações, o extrato de planta é uma mistura de extratos a partir de Galeopsis segetum e Galeopsis tetrahit.

[0031] O extrato da presente invenção é obtido por extração a partir de uma parte da planta, tais como raízes, folhas, frutos e flores, preferivelmente as partes aéreas da planta.

[0032] Em concordância com algumas concretizações, o extrato de planta da presente invenção é obtido por extração a partir de uma parte da planta ou a partir de um tecido da mesma utilizando um solvente fisiologicamente aceitável como o meio de extração.

[0033] Com o termo de “solvente fisiologicamente aceitável”, se quer significar um solvente que não produz reações adversas significativas quando introduzido para o corpo humano ou aplicado para o organismo humano. Tipicamente, com o termo “solvente” se quer significar o solvente utilizado para extração dos componentes biologicamente ativos a partir de uma porção de planta de Galeopsis.

[0034] Um solvente adequado para obter o extrato de planta é um líquido fisiologicamente aceitável no qual pelo menos alguns dos componentes biologicamente ativos da planta selecionada são solúveis e no qual eles não sofrem uma alteração que priva os mesmos de atividade.

[0035] As partes morfológicas preferidas da planta utilizada para realização da extração é o sistema de rebento que inclui hastes, folhas, floração e flores.

[0036] O solvente utilizado para realização da extração pode ser um solvente fisiologicamente aceitável. Solventes adequados podem ser solventes não polares, tais como dietil éter, clorofórmio; solventes apróticos polares, tais como etil acetato, dicloroetano; e solventes próticos polares, tais como alcoóis C1 - C6 e soluções aquosas contendo os mesmos. A utilização de solventes próticos polares é preferida. Típicos solventes próticos polares incluem água, etanol, propanol, isopropil álcool, e misturas dos mesmos. Solventes preferidos são água, etil álcool e uma mistura dos mesmos.

[0037] Em determinadas concretizações, depois da extração com solvente prótico polar, preferivelmente etanol, o extrato é preferivelmente filtrado, concentrado e clarificado. O extrato obtido é, então, preferivelmente purificado. A purificação é mais preferivelmente realizada por eluição em coluna com um solvente. O solvente pode ser, por exemplo, água ou etanol. O extrato purificado é, então, preferivelmente concentrado e seco. O extrato seco assim obtido pode ser opcionalmente triturado e opcionalmente adicionado com excipientes para fornecer o extrato seco final para ser utilizado nas composições inventivas. Os excipientes opcionais compreendidos no extrato seco são preferivelmente selecionados a partir do grupo consistindo de maltodextrina e sílica gel anidra coloidal.

[0038] Para obter o extrato de planta de Galeopsis tetrahit, técnicas de extração sólido-líquido podem ser utilizadas para separar/extrair um ou mais componentes biologicamente ativos a partir dos tecidos vegetais da planta.

[0039] Em determinadas concretizações, a extração de um ou mais componentes biologicamente ativos acontece por maceração de uma porção ou matriz de vegetal de Galeopsis tetrahit em um solvente adequado como referido anteriormente.

[0040] Por exemplo, um extrato adequado pode ser obtido por mergulho ou maceração de uma porção de partes aéreas de Galeopsis em uma mistura água-etanol, por um período de tempo adequado para enriquecimento do solvente de um ou mais componentes biologicamente ativos contidos na porção de planta. Sob estas condições, a extração dos componentes biologicamente ativos a partir dos tecidos de planta da planta selecionada acontece, substancialmente, por difusão e/ou osmose. O tempo de maceração das porções de planta no solvente é variável, por exemplo, a partir de 1 hora até 48 horas.

[0041] Em concordância com determinadas concretizações, o extrato seco da Galeopsis é obtenível pelas seguintes etapas: - trituração de pelo menos uma parte da planta de gênero Galeopsis; - extração com um solvente, preferivelmente um solvente fisiologicamente aceitável; - filtragem do extrato; - purificação do extrato filtrado, preferivelmente por eluição em uma coluna com um solvente; - secagem do extrato purificado; - trituração do extrato purificado seco.

[0042] Em algumas concretizações, a etapa de extração pode ser repetida duas ou três vezes. Quando o solvente é removido, por exemplo, por evaporação, um suporte ou excipiente sólido pode opcionalmente ser adicionado, tal como, por intermédio de exemplo não limitante, amidos ou maltodextrinas, para obter o extrato na forma de pó seco.

[0043] Tipi camente, o extrato obtido a partir de Galeopsis Tetrahit ou segetum, pode ser fluido, suave ou seco e preferivelmente é seco.

[0044] Por exemplo: - no extrato fluido, 1 ml de extrato contém componentes biologicamente ativos solúveis em 1 g de droga vegetal; - no extrato suave, o solvente é parcialmente evaporado, em particular até que o extrato não molha um papel de filtro; - no extrato seco, o solvente é evaporado quase completamente para obter um pó.

[0045] É possível preparar extratos de Galeopsis de diferente polaridade.

[0046] Por exemplo, é possível obter um extrato de alta polaridade utilizando um solvente polar, tal como uma solução hidro-alcoólica, um extrato de polaridade intermediária utilizando um solvente menos polar, tal como etilacetato, ou um extrato apolar utilizando CO2 supercrítico com o qual é possível extrair frações de complexos fito ativos.

[0047] Em determinadas concretizações, a extração é realizada utilizando uma proporção em peso entre solvente e matriz vegetal variando a partir de 1:10 até 10:1.

[0048] É possível extrair os componentes de planta biologicamente ativos a partir da planta Galeopsis por utilização de técnicas de extração alternativas, tais como, por exemplo, por digestão, infusão, esmagamento, decocção, percolação, extração em contracorrente, soxhlet, extração com gases supercríticos ou ultrassons.

[0049] Em adição para o extrato de planta, a composição sinérgica pode compreender R-N1-espermidina ou seu sal, em que R é hidrogênio ou metil. Espermidina é uma poliamina, possuindo o nome IUPAC N’-(3-aminopropil)butano- 1,4-diamina. Espermidina pode estar presente na composição na forma de um sal, preferivelmente um sal farmaceuticamente aceitável, mais preferivelmente na forma de trihidrocloreto.

[0050] Em adição para o extrato de planta, a composição sinérgica pode compreender Biotina, uma vitamina B solúvel em água, também chamada vitamina B7 e antigamente conhecida como vitamina H ou coenzima R.

[0051] Biotina é composta de um anel de ureído fundido com um anel de tetrahidrotiofeno possuindo o nome IUPAC ácido pentanóico 5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H- tieno[3,4-d]imidazol-4-il] (número CAS 58-85-5).

[0052] Os inventores revelaram pela primeira vez a propriedade da biotina de ser um promotor de autofagia em células humanas, especificamente células de folículos de cabelo (folículos capilares) de couro cabeludo humano.

[0053] Conseqüentemente, a presente invenção também se refere para biotina ou para uma composição contendo biotina em concordância com qualquer uma das concretizações descritas anteriormente, para utilização cosmética ou nutracêutica ou médica como um promotor de autofagia no tratamento de doenças moduladas por autofagia.

[0054] Doenças moduladas por autofagia são, por exemplo, selecionadas a partir do grupo consistindo de neurodegeneração, câncer, doença de Crohn e doenças de pele. Especificamente entre as doenças de pele, distúrbios autoimunes de pele, tais como psoríase, lúpus eritematoso sistêmico [systematic lupus erythematosus (SLE)] e vitiligo, - distúrbios infecciosos de pele, - distúrbios de câncer de pele, tais como carcinoma e melanoma escamoso de célula, podem ser citados.

[0055] Pel a primeira vez, o extrato de gênero Galeopsis, preferivelmente das espécies de Galeopsis segetum e Galeopsis tetrahit, é utilizado como um promotor de autofagia no tratamento de doenças de pele.

[0056] Preferivelmente e surpreendentemente, os inventores observaram que a administração das composições anteriormente mencionadas, tipicamente tanto pela via tópica ou quanto pela via oral de administração, promoveu de uma maneira sinérgica a autofagia em células de folículos de cabelo (folículos capilares) de couro cabeludo humano em um sujeito sofrendo a partir de queda de cabelo, por conseqüência, determinando um espessamento progressivo das áreas afetadas (sofridas) do couro cabeludo.

[0057] Tipi camente, a composição da presente invenção compreende um veículo (suporte), diluente ou excipiente fisiologicamente e/ou farmaceuticamente aceitável.

[0058] O veículo (suporte), diluente ou excipiente fisiologicamente e/ou farmaceuticamente adequado pode ser selecionado com base sobre a via de administração para a qual a resultante composição farmacêutica é intencionada. Qualquer veículo (suporte) e/ou excipiente adequado para a forma de preparação desejada para administração é contemplado nas utilizações do extrato de planta ou ingredientes ativos nas mesmas aqui descritas.

[0059] Dentro do escopo da presente invenção, o termo “veículo (suporte)” se refere para um excipiente, veículo, diluente ou adjuvante, que podem ou podem estar presentes na composição da presente invenção.

[0060] A composição da presente invenção pode ser formulada em uma forma para aplicação tópica ou em uma forma para administração oral.

[0061] Em algumas concretizações, a composição é para a aplicação tópica. Neste pedido de patente, a composição da presente invenção pode ser aplicada, em uma quantidade efetiva, diretamente sobre o couro cabeludo ou pele de um ser humano.

[0062] Por exemplo, no tratamento de formas de perda ou queda de cabelo, uma quantidade de composição cosmeticamente/fisiologicamente ativa pode ser aplicada diretamente sobre o couro cabeludo, uma vez ou mais vezes por dia convenientemente por ciclos perdurando por 2 - 3 meses, alternados com períodos de ausência de tratamento.

[0063] Em concordância para estes aspectos, a presente invenção também se refere para um método de tratamento cosmético compreendendo a aplicação sobre o couro cabeludo, ou porção do mesmo, de uma quantidade efetiva de uma composição em concordância com uma ou mais das concretizações aqui descritas e/ou reivindicadas.

[0064] A quantidade do extrato seco de Galeopsis, preferivelmente na forma de espécies de Galeopsis segetum e Galeopsis tetrahit, na formulação tópica das composições da presente invenção está na faixa de 0,0003% em peso até 0,01% em peso com respeito para o peso total da formulação.

[0065] A quantidade de biotina na formulação tópica dos componentes da presente invenção está na faixa de 0,00006% em peso até 0,075% em peso com respeito para o peso total da formulação.

[0066] Na forma tópica, a composição compreende preferivelmente N1-metilespermidina. Na forma tópica N1- metilespermidina ou espermidina é preferivelmente compreendida na faixa de 0,0005% em peso - 0,01% em peso com respeito para o peso total da formulação.

[0067] Entre os excipientes comumente na formulação tópica para utilização cosmética ou para utilização farmacêutica, preservativos, agentes bacterianos, agentes emulsificantes, tampões, lubrificantes, agentes de umedecimento, agentes de condicionamento e agentes de coloração podem ser citados.

[0068] A composição para aplicação tópica pode estar em forma sólida, semissólida ou fluida. Formulações adequadas em forma sólida incluem cremes, géis, pomadas, pastas, ungüentos.

[0069] Em outras concretizações, a formulação para administração local está em forma fluida, por exemplo, na forma de loções, géis, xampus, suspensões, emulsões.

[0070] No caso de forma de formulações fluidas ou semifluidas, o extrato de planta pode ser diluído em um veículo (suporte) em forma liquida fisiologicamente aceitável, tais como água, álcool, solução hidro-alcoólica ou glicérica ou misturado com outros líquidos adequados para aplicação local.

[0071] Por intermédio de exemplo, as composições da presente invenção em forma líquida podem ser preparadas por dissolução dos componentes em água e/ou álcool. A composição líquida pode ser tamponada para alcançar uma faixa de pH convencionalmente selecionada a partir de 5 até 7 para ser compatível com o pH do couro cabeludo e, então, filtrada e embalada em containeres adequados, tais como vasilhames ou frascos.

[0072] Em algumas concretizações, as composições da presente invenção podem compreender excipientes comumente utilizados na formulação de preparações cosméticas ou farmacêuticas para utilização local, tais como preservativos, agentes bacterianos, estabilizadores, emulsificadores, tampões, umidificadores e outros excipientes comumente utilizados em técnicas de preparação.

[0073] Em uma concretização, a formulação para a aplicação local está na forma de uma emulsão contendo o extrato veiculado (suportado) em um excipiente adequado. Em algumas concretizações, a composição para aplicação tópica compreende um excipiente do tipo hidroximetilcelulose e/ou gelificação com HBL adequado para a formulação e as substâncias.

[0074] Em concordância com outras concretizações, a composição da presente invenção está em forma para administração oral. Nestes casos, a composição contém os componentes como previamente definidos e um ou mais veículos ou excipientes adequados para administração oral.

[0075] A quantidade do extrato de Galeopsis, preferivelmente na forma de espécies de Galeopsis segetum ou Galeopsis tetrahit, na formulação oral das composições da presente invenção está na faixa de 0,1 mg até 20 mg por dose única.

[0076] A quantidade de biotina na formulação oral das composições da presente invenção está na faixa de 0,03 mg até 0,08 por dose única.

[0077] Na forma oral, a composição compreende preferivelmente espermidina ou um sal da mesma, mais preferivelmente a espermidina está na forma de um sal.

[0078] Na forma oral, N1-espermidina (ou seu sal), ou espermidina (ou seu sal) é preferivelmente compreendida na faixa de 0,3 mg até 0,8 mg por dose única.

[0079] Por intermédio de exemplo, excipientes adequados para administração oral incluem derivados de celulose, tais como hidroximetilcelulose, hidroxipropil metilcelulose, metilcelulose, hidroxipropil celulose, hidroxietil celulose, carboxietilcelulose, etilhidroxoetil celulose, acetato butirato celulose, acetato ftalato celulose, e misturas das mesmas.

[0080] Exemplos adicionais de excipientes adequados incluem polímeros pertencendo para a família de lactama, tais como pirrolidona e seus derivados, por exemplo, polivinilpirrolidona, polivinilpolipirrolidona e suas misturas; sais inorgânicos, tais como cálcio ou dicálcio fosfato; lubrificantes, tais como estearato de magnésio, triacilgliceróis e misturas dos mesmos.

[0081] As composições para administração oral podem estar em forma sólida ou líquida. Típicas composições de forma sólida incluem tabletes, cápsulas, pós, grânulos, pílulas. Exemplos de composições em forma líquida incluem soluções, emulsões, suspensões, xaropes. As composições podem também estar na forma de liberação controlada dos componentes ativos contidos nas mesmas.

[0082] Os tabletes geralmente compreendem um veículo (suporte) ou excipiente adequado no qual o extrato de planta é dispersado, tipicamente em forma seca.

[0083] Ent re os excipientes ou veículos (suportes) típicos para agentes de desintegração de administração oral, enchimentos, preservativos, podem ser incluídos na formulação da composição. Em determinadas concretizações, a composição da presente invenção é um produto nutricional, um produto dietético ou um produto nutracêutico.

[0084] O termo suplemento nutricional significa um produto, que aperfeiçoa o status nutricional e pode ser utilizado para suportar ou aperfeiçoar a atividade funcional de um ou mais órgãos ou a funcionalidade do corpo humano dentro dos limites fisiológicos. As composições da presente invenção são promotoras de autofagia sendo, portanto, nutracêuticas e cosmecêuticas de promoção de crescimento de cabelo.

[0085] Em concordância com um aspecto adicional, a presente invenção, portanto, proporciona para a utilização das composições sinérgicas acima citadas para estimulação do crescimento fisiológico do cabelo e/ou para o tratamento de perda de cabelo.

[0086] Em concordância com um adicional aspecto específico, a presente invenção, portanto, proporciona para a utilização da formulação tópica ou oral compreendendo as composições acima citadas para estimulação do crescimento fisiológico do cabelo.

[0087] Em concordância com ainda um adicional aspecto, a presente invenção, portanto, proporciona para as composições sinérgicas acima citadas para utilização de um promotor de autofagia em células de folículos capilares de couro cabeludo humano no tratamento e na prevenção de perda de cabelo e para estimulação de crescimento de cabelo.

[0088] Em concordância com um adicional aspecto específico, a presente invenção, portanto, proporciona para a utilização da formulação tópica ou oral compreendendo as composições acima mencionadas para estimulação do crescimento de cabelo ou para o tratamento ou prevenção de perda de cabelo.

[0089] A conexão/ligação (link) entre a promoção de autofagia e as atividades acima mencionadas das composições da presente invenção é comprovada pelos testes descritos no Exemplo 13 a seguir. Em particular, o artigo científico de Chiara Parodi e outros: “Autophagy is essencial for maintaining the growth of a human (mini)organ: Evidence fron scalp hair follicle organ culture” publicado em PLOS Biology volume 16(3), 2.018, 28. Março: 10.1371/journal.pbio.2002864 mostra que o teste realizado sobre células epiteliais osteossarcoma de osso humano é um modelo estabelecido para provisão da eficácia da composição sobre a estimulação de crescimento de cabelo.

[0090] O experimento mostra o sinergismo na estimulação e autofagia em um validado modelo in vitro. A data e publicação mostram que autofagia é essencial para o crescimento de folículo de cabelo. A composição da presente invenção estimula autofagia e, conseqüentemente, é efetiva em estimulação de crescimento de cabelo.

[0091] Em determinados aspectos, a presente invenção proporciona a composição acima citada para utilização no tratamento de um distúrbio no crescimento de cabelo, tal como no caso de alopecia androgenética ou deflúvio.

[0092] Em um adicional aspecto, a presente invenção proporciona para a utilização das composições acima cotadas como um promotor de autofagia no tratamento de um distúrbio de pele.

[0093] Os inventores descobriram também que uma composição compreendendo N-metilespermidina e biotina era adequada como um promotor de autofagia no tratamento de doenças de pele.

[0094] As quantidades administradas e a freqüência de administração da composição irão depender do tipo e severidade das doenças para serem tratadas.

[0095] A presente invenção irá ser agora detalhada por referência para concretizações específicas mostrando os resultados sinérgicos conseguidos pelas composições da presente invenção e não deveriam ser consideradas limitativas. As quantidades dos componentes indicados são expressas como porcentagens (%) em peso por peso (w/w) ou em mg por dose única de administração.

PARTES EXPERIMENTAIS Exemplo Número 1 Preparação do extrato de Galeopsis segetum

[0096] A preparação de extrato seco de Galeopsis segetum foi desempenhada por extração com etanol 40% seguida por purificação de coluna. As etapas são descritas nos parágrafos a seguir.

Extração

[0097] Partes áreas dessecadas trituradas de Galeopsis segetum foram extraídas duas vezes a 50 0C por 2 horas com etanol a 40%. Sólido e líquido foram separados por um decantador.

[0098] Os lixiviados foram filtrados, concentrados sob vácuo e, então, clarificados por centrifugação.

Purificação

[0099] Uma coluna foi preenchida com resina sorvente XAD7HP de troca iônica que foi previamente encharcada em etanol a 95% e mantida em contato por 10 horas. A coluna empacotada foi, então, lavada com água continuando até que a condutividade do eluato alcançou o mesmo valor da água carregada.

[0100] A purificação do extrato foi feita sobre a coluna empacotada XAD7HP eluída inicialmente com água e, então, com etanol a 70%.

[0101] Os eluatos coletados foram concentrados sob vácuo.

[0102] Et anol foi adicionado para a solução concentrada e, então, a solução foi aquecida a 70 0C - 70C por 30 minutos de maneira tal a reduzir o nível de carga biológica.

[0103] A solução foi novamente concentrada sob vácuo, seca a 50 0C por 24 horas e, então, triturada e misturada com excipientes (maltodextrina e sílica gel anidra coloidal 90/10) para fornecer o produto final.

Exemplo Número 2 Preparação do extrato de Galeopsis tetrahit

[0104] A preparação de extrato seco de Galeopsis tetrahit foi desempenhada seguindo exatamente o mesmo procedimento descrito nos parágrafos antecedentes para a extração de Galeopsis segetum. Exemplo Número 3

Exemplo Número 4

Exemplo Número 5

Exemplo Número 6

Exemplo Número 7

Exemplo Número 8

Exemplo Número 9

Exemplo Número 10

Exemplo Número 11

Exemplo Número 12

Exemplo Número 13 Materiais e métodos Análise por imunotransferência.

[0105] Células U2OS foram cultivadas até 80% de confluência em Dulbecco Modified Eagle’s Medium High Glucose (4,5 g/ID-Glucose) contendo 4 mM de L-glutamina, 10% de soro de feto bovino [fetal bovine serum (FBS)] tratadas com Espermidina (Lot.2010112716). Galeopsis segetum (IDN 6781), Biotina (Lot. 2014124160) ou suas combinações. Amostras de proteína foram extraídas em tampão RIPA como previamente relatado (DE Mei C, Ercolani L, Parodi C, Verones M, Vecchio CL, Bottegoni G, e outros, Dual inhibition of REV-ERBβ e autophagy as a novel pharmacological approach to induce cytotoxicity in câncer cells. Oncogene. 2015;34(20):2597-608). Níveis de p62/SQSTM1 e de GAPDH foram analisados com anticorpos específicos de anti-p62/SQSTM1 e anti-GADPH. Experimentos de imunotransferência foram desempenhados em tampão TBS-T contendo 5% de albumina de soro bovino [bovine serum albumin (BSA)]. Anticorpos de anti-LC3B e anti-GAPDH foram diluídos a 1:1.000 e 1:50.000, respectivamente. Anticorpos secundários HPR conjugados complementares foram diluídos a 1:10.000. Sobre reação com reagente de detecção de manchas ECL Western, sinais quimioluminescentes foram adquiridos com um analisador de imagem luminescente LAS-4000 e densidade óptica de sinal de banda específico foi calculado com software de análise de imagem de Photoshop. GAPDH foi adotado como um controle de carregamento e sinais de GAPDH foram utilizados para normalizar níveis de proteína p62 entre diferentes amostras.

[0106] Imunotransferência foi repetida pelo menos 4 vezes de maneira tal a expressar valor como médio ± SEM. Análise Fluorescente de Inibição de Autofagia.

[0107] Células U2OS foram semeadas 3.000 células/poço em 48 placas (lâminas) de poço, No. 1.5 Uncoated Coverslip, 6 mm de diâmetro de vidro, previamente revestido com solução de gelatina, e transduzida com 0,2ul di de baculovírus/10.000 células contendo uma proteína quimérica p62-Red Fluorescent Protein (p62-RFP). Em 48 horas de pós-transdução as células foram tratadas com Espermidina, Biotina, Galeopsis, ou veículo e monitoradas por 24 horas utilizando microscopia NIKON Live Cell Imaging.

Atividade sinérgica de espermidina, Galeopsis segetum e biotina para induzir autofagia em células humanas

[0108] De maneira tal a avaliar se biotina e/ou extrato de Galeopsis segetum podem afetar autofagia, os inventores monitoraram o acúmulo de autofagossomo em células U2OS de cultura por microscopia fluorescente ao vivo (Klionsky DJ, Abdelmohsen K, Abe A, Abedin MJ, Abeliovich H, Acevedo Arozena A, e outros. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy, 2016;12(1):1-222) . Por conseqüência, células foram transduzidas com construção contendo a proteína de autofagia, LC3, fundida com uma Proteína Fluorescente Vermelha [Red Fluorescent Protein (RFP)]. Então, acúmulo de pontos LC3 fluorescentes sobre adição de biotina (200 ng/ml) ou extrato seco de Galeopsis (100 ng/ml) foi monitorado por aquisição de imagens a cada 30 minutos por 6 horas. Espermidina (10 μM) foi adotada como um controle positivo de um composto indutor de autofagia (Pietrocola F, Lachkar S, Enot D, Niso-Santano M, Bravo-San Pedro J, Sica V, e outros. Spermidine induces autophagy by inhibiting the acetyltransferase EP300. Cell Death & Differentiation. 2015;22(3):509-16).

[0109] E sta análise revelou um acúmulo marcado de pontos LC3 fluorescentes em ambas as células tratadas por biotina e Galeopsis (ver imagens representativas na Figura 1). Como é evidente na Figura 1 tratamento de espermidina resultou em um acúmulo marcado de pontos fluorescentes LC3 (isto é, acúmulo de autofagossomos). Tanto a biotina e quanto o extrato seco de Galeopsis segetum produziram um acúmulo similar de pontos vermelhos LC3.

[0110] Devido para o fato de que os pontos LC3- RFP podem também acumular sobre um bloqueio do fluxo autofágico, a degradação dependente de autofagia da proteína SQSTM1/p62 (Klionsky DJ, Abdelmohsen K, Abe A, Abedin MJ, Abeliovich H, Acevedo Arozena A, e outros. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy, 2016;12(1):1-222) foi, por conseqüência, monitorada. p62 serviu como uma conexão (link) entre LC3 e substratos ubiquitinados [Pankiv S, Clausen TH, Lamark T, Brech A, Bruun J-A, Outzen, e outros. p62/SQSTM1 se liga diretamente para Atg8/LC3 para facilitar degradação de agregados proteína ubiquitinados por autofagia. Journal of Biological Chemistry. (2007;282(33):24131-45)]. Proteínas poliubiquitinadas p62 e p62-ligada se tornam incorporadas para o autofagossomo completado e onde degradado em autolisossomos, por conseqüência, servindo como um índice de degradação autofágica (Klionsky DJ, Abdelmohsen K, Abe A, Abedin MJ, Abeliovich H, Acevedo Arozena A, e outros. Guidelines for a use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy, 2016;12(1):1-222).

[0111] Em concordância com isso, os efeitos de biotina e Galeopsis sobre degradação de p62 mediada por autofagia foram avaliados analisando o número de autofagossomos de p62-REF por microscopia fluorescente ao vivo. Células foram, por conseqüência, transduzidas com uma construção expressando a proteína p62 fundida com a RFP. Então, pontos fluorescentes de p62 foram monitorados sobre adição de biotina, Galeopsis, espermidina ou veículo.

[0112] Completamente suportando que tanto biotina e quanto Galeopsis atuaram como indutores de autofagia, uma redução drástica de pontos de p62-RFP foi observada em células tratadas comparada com veículo (ver imagens representativas na Figura 2).

[0113] Como é observado na Figura 2, o tratamento com o indutor de autofagia previamente caracterizado, espermidina, marcadamente reduziu pontos fluorescentes de p62 e sinais fluorescentes, por conseqüência, indicando que tanto biotina e quanto extrato de Galeopsis segetum atuam como indutores de autofagia, estes tratamentos produziram uma forte redução de sinais fluorescentes de p62.

[0114] Uma vez validada a atividade de indução de autofagia de biotina e Galeopsis, e tendo validada a utilização de p62 como um marcador adequado do processo de autofagia, os efeitos de combinações de compostos sobre níveis de proteína p62 por análise de imunotransferência com anticorpos específicos anti-p62 foram avaliados (De Mei C, Ercolani L, Parodi C, Verones M, Vecchio CL, Bottegoni G, e outros, Dual inhibition of VER-ERBβ and autophagy as a novel pharmacological approach to induce cytotoxicity in câncer cells. Oncogene. 2015;34(20):2597-608).

[0115] E sta análise indicou uns efeitos sinérgicos significativos entre espermidina, biotina e Galeopsis em indução de degradação mediada por autofagia de p62 (Tabela 1).

[0116] Sem dúvida, a combinação de espermidina (0,5 μM) e biotina (19,91 ng/ml) resultou em uma redução de p62 quase duas vezes maior do que a redução esperada por efeitos aditivos (45% vs 26%). Resultados similares foram obtidos para a combinação de espermidina e Galeopsis (7,9 ng/ml) (51% vs 29%) e mistura de biotina/Galeopsis (67% vs 45%). Finalmente, uma combinação de todos os três compostos (0,5 μM de espermidina + 7,9 ng/ml de Galeopsis + 19,91 ng/ml de biotina) gerou uma notável redução de 78% de níveis de proteína de p62.

Exemplo Número 14

[0117] Os níveis de LC3 e de SQSTM1 lipidadas em células humanas U2OS tratadas com doses eqüimolares de N1- metilespermidina e espermidina foram avaliados. Como um resultado, comparado com veículo ambos os compostos aumentaram os níveis da LC3-II lipidada e estimularam degradação mediada por autofagia de SQSTM1. Especificamente, células U2OS humanas cultivadas foram tratadas por 6 horas com veículo ou doses eqüimolares de espermidina e N1-metilespermidina (100 μM) . Os níveis de LC3 (LC3-II) e SQSTM1 lipidadas foram, então, acessados por análise de imunotransferência como no Exemplo 8 com anticorpo específico. Sinais de ACTIN foram adotados como um controle de carregamento. Análise de densitometria de sinais de proteína é relatada como níveis de proteína relativos normalizados por ACTIN. Valor de amostra de veículo foi ajustado para 1. Mostrado como médio ± SEM., n=3. *P < 0,05 e **P < 0,01, compostos versus veículo. Os resultados são relatados na Figura 3 (A e B). Estes resultados validaram que o N1-metilespermidina retém a atividade para induzir autofagia, como seu análogo desmetilado.

Claims (19)

1. Composição sinérgica caracterizada pelo fato de que compreende um extrato de planta de gênero Galeopsis e um composto promovendo autofagia selecionado a partir de R-N1-espermidina ou um sal desta, em que R é hidrogênio ou metila, biotina e misturas destas.

2. Composição sinérgica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o extrato de planta de gênero Galeopsis é selecionado a partir das espécies de Galeopsis segetum e Galeopsis tetrahit e misturas destas.

3. Composição sinérgica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o extrato de planta de gênero Galeopsis é um extrato seco obtido pelo processo compreendendo as seguintes etapas: - triturar pelo menos uma parte da planta de gênero Galeopsis; - extrair com um solvente, preferivelmente um solvente fisiologicamente aceitável; - filtrar o extrato; - purificar o extrato filtrado, preferivelmente por eluição em uma coluna com um solvente; - secar o extrato purificado; - triturar o extrato seco purificado; e - opcionalmente, adicionar excipientes.

4. Composição sinérgica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que os excipientes compreendem maltodextrina e/ou sílica gel anidra coloidal.

5. Composição sinérgica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que Espermidina está presente na composição na forma de trihidrocloreto.

6. Formulação tópica caracterizada pelo fato de que compreende a composição sinérgica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e pelo menos um excipiente adequado para administração tópica.

7. Formulação tópica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a quantidade do extrato de planta de gênero Galeopsis está na faixa de 0,0003% a 0,01% em peso, em relação ao peso total da composição.

8. Formulação tópica, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que a quantidade de biotina está na faixa de 0,0006% a 0,075% em peso, em relação ao peso total da composição.

9. Formulação tópica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizada pelo fato de que a composição compreende R-N1-espermidina ou um sal desta, em que R é metil ou hidrogênio, na faixa de 0,0005% a 0,1% em peso, em relação ao peso total da composição.

10. Formulação tópica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizada pelo fato de que a formulação está em uma forma selecionada a partir do grupo consistindo em um xampu, um gel, um condicionador, uma loção, um bálsamo, uma emulsão, uma espuma, uma maquiagem e um creme.

11. Formulação oral caracterizada pelo fato de que compreende a composição sinérgica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e pelo menos um excipiente adequado para administração oral.

12. Formulação oral, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a quantidade do extrato seco da planta de gênero Galeopsis na formulação oral está na faixa de 0,1 mg a 20 mg por dose única.

13. Formulação oral, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que a quantidade de biotina na formulação oral está na faixa de 0,03 mg a 0,08 mg por dose única.

14. Formulação oral, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que a composição compreende R-N1-espermidina ou um sal desta, em que R é metil ou hidrogênio, na faixa de 0,3 mg a 0,8 mg por dose única.

15. Formulação oral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizada pelo fato de que a formulação é uma formulação sólida selecionada a partir do grupo consistindo em um tablete, uma cápsula, pós, grânulos e uma pílula.

16. Uso cosmético da composição sinérgica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou de uma formulação tópica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 10, ou de uma formulação oral, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado pelo fato de que na promoção de crescimento capilar e/ou na prevenção de perda de cabelo.

17. Composição sinérgica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou uma formulação tópica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 10, ou uma formulação oral, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de alopecia androgenética ou deflúvio.

18. Composição sinérgica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que é para uso como um promotor de autofagia no tratamento de uma doença modulada por autofagia.

19. Composição sinérgica para uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que as doenças moduladas por autofagia são selecionadas a partir do grupo consistindo em neurodegeneração, câncer, doença de Crohn e doenças de pele.

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