MD3442972T2

MD3442972T2 - Inhibitori ai bromodomeniului

Info

Publication number: MD3442972T2
Application number: MDE20190228T
Authority: MD
Inventors: Steven D Fidanze; Lisa A Hasvold; Dachun Liu; Keith F Mcdaniel; John PRATT; Michael Schrimpf; George S Sheppard; Le Wang; Bing Li
Original assignee: Abbvie Inc
Priority date: 2016-04-15
Filing date: 2017-04-14
Publication date: 2020-08-31
Also published as: EP3442972A4; HUE050217T2; CN109071534A; RS60302B1; MA52814A; PH12018501920B1; ME03759B; CN109071534B; EP3693369A2; PL3442972T3; KR102250415B1; PT3442972T; PH12018501920A1; MA44674A; UA124764C2; MX379459B; ECSP18083519A; CR20180541A; TWI764237B; AU2017251537B2

Abstract

Prezenta invenţie furnizează compuşi cu formula (I) în care R1, R2, R3, R4, R6, X1 şi X2 au oricare din valorile definite în specificaţie, şi săruri acceptabile farmaceutic ale acestora, care sunt utili ca agenţi în tratamentul bolilor şi afecţiunilor, incluzȃnd bolile inflamatorii, cancerul, şi SIDA. Sunt de asemenea furnizate compoziţii farmaceutice care cuprind compuşi cu formula (I).

Description

Bromodomeniile se referă la plierea structurală a proteinei conservate care se leagă la reziduurile de lizină N-acetilate care sunt găsite în unele proteine. Familia BET de bromodomenii conţinând proteine cuprinde patru membri (BRD2, BRD3, BRD4 şi BRDt). Fiecare membru al familiei BET utilizează două bromodomenii pentru a recunoaşte de obicei reziduurile de lizină N-acetilate, dar nu exclusiv pe cele găsite pe factorii de transcripţie (Shi, J., şi colab. Cancer Cell 25(2): 210-225 (2014)) sau pe cozile amino-terminale ale proteinelor histone. Numărȃnd de la capătul N-terminal al fiecărei proteine BET, bromodomeniile tandem sunt de obicei etichetate Domeniul de legare I (BDI) şi Domeniul de legare II (BDII). Aceste interacţiuni au modulat exprimarea genei prin recrutarea factorilor de transcripţie la locaţii genom specifice în cromatin. De exemplu, BRD4 legat la histonă recrutează factorul de transcripţie P-TEFb la promotori, conducând la exprimarea unui subset de gene implicate în progresul ciclului celular (Yang şi colab., Mol. Cell. Biol. 28: 967-976 (2008)). BRD2 şi BRD3 funcţionează de asemenea ca regulatori transcripţionali de creştere promovând gene (LeRoy şi colab., Mol. Cell 30: 51-60 (2008)). S-a stabilit recent că, membrii familiei BET sunt importanţi pentru întreţinerea câtorva tipuri de cancer (Zuber şi colab., Nature 478: 524-528 (2011); Mertz şi colab.; Proc. Nat'l. Acad. Sci. 108: 16669-16674 (2011); Delmore şi colab., Cell 146: 1-14, (2011); Dawson şi colab., Nature 478: 529-533 (2011)). Membrii familiei BET au fost de asemenea implicaţi în medierea răspunsurilor inflamatorii acute prin calea canonică NF-KB (Huang şi colab., Mol. Cell. Biol. 29: 1375-1387 (2009)) conducând la reglarea pozitivă a genelor asociate cu producţia de citokine (Nicodeme şi colab., Nature 468: 1119-1123, (2010)). Supresia inducerii de citokine de către inhibitorii bromodomeniului BET s-a arătat a fi o abordare eficientă în tratarea bolii renale mediată de inflamaţie pe un model la animale (Zhang, şi colab., J. Biol. Chem. 287: 28840-28851 (2012)). Funcţionarea BRD2 a fost legată de predispoziţia pentru dislipidemie sau pentru reglarea necorespunzătoare a adipogenezei, de profile inflamatorii ridicate şi de susceptibilitatea crescută la bolile autoimune (Denis, Discovery Medicine 10: 489-499 (2010)). Virusul imunodeficienţei umane utilizează BRD4 pentru a iniţia transcripţia de ARN viral din ADN-ul viral integrat stabil (Jang şi colab., Mol. Cell, 19: 523-534 (2005)). S-a arătat de asemenea că inhibitorii bromodomeniilor BET au reactivat transcripţia HIV în modelele de infectare cu celule T latente şi de infectare cu monocite latente (Banerjee, şi colab., J. Leukocyte Biol. doi:10,1189/jlb,0312165). BRDt are un rol important în spermatogeneză care este blocată de inhibitorii bromodomeniului BET (Matzuk, şi colab., Cell 150: 673-684 (2012)). Astfel, compuşii care inhibă legarea bromodomeniilor familiei BET la proteinele lor lizine acetilate cognate sunt urmăriţi pentru tratamentul cancerului, bolilor inflamatorii, bolilor renale, bolilor care implică metabolismul sau acumularea de grăsime, şi unele infecţii virale, precum şi pentru furnizarea unei metode de contracepţie masculină. Corespunzător, există o necesitate medicală continuă de a dezvolta noi medicamente pentru a trata aceste afecţiuni. US2014/0162971 A1 (AbbVie Inc.) descrie compuşi inhibitori de bromodomeniu care sunt utili ca agenţi în tratamentul a diferite boli şi afecţiuni.

REZUMAT

Într-un aspect, prezenta invenţie furnizează N-etil-4-[2-(4-fluoro-2,6-dimetilfenoxi)-5-(2-hidroxipropan-2-il)fenil]-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamidă, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Într-un alt aspect, prezenta invenţie furnizează N-etil-4-[2-(4-fluoro-2,6-dimetilfenoxi)-5-(2-hidroxipropan-2-il)fenil]-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamidă.

Compusul, sau sărurile acestuia, pot fi utilizate în metode pentru tratarea sau prevenirea tulburărilor care sunt ameliorate prin inhibarea BET. Astfel de metode cuprind administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un compus cu formula (I), singur, sau în combinaţie cu un purtător acceptabil farmaceutic.

DESCRIERE DETALIATĂ

Este divulgată aici N-etil-4-[2-(4-fluoro-2,6-dimetilfenoxi)-5-(2-hidroxipropan-2-il)fenil]-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamida, care are formula (I):

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Termenii „tratează«, „tratarea«, şi „tratament« se referă la o metodă de atenuare sau de abrogare a unei boli şi/sau a simptoamelor însoţitoare. În anumite realizări, „tratează«, „tratarea«, şi „tratament« se referă la ameliorarea cel puţin a unui parametru fizic, care nu poate fi discernut de catre subiect. În încă o altă realizare, „tratează«, „tratarea«, şi „tratament« se referă la modularea bolii sau tulburării, fie fizic (de exemplu, stabilizare a unui simptom discernabil), fie fiziologic (de exemplu, stabilizarea unui parametru fizic), sau ambele. Într-o realizare suplimentară, „tratează«, „tratarea«, şi „tratament« se referă la încetinirea progresului bolii sau tulburării.

Termenii „previne«, „prevenirea«, şi „prevenire« se referă la o metodă de prevenire a debutului unei boli şi/sau a simptoamelor sale însoţitoare sau împiedicarea unui subiect să dobândească o boală. Aşa cum s-a utilizat în acest document, „previne«, „prevenirea« şi „prevenire« includ de asemenea întȃrzierea debutului unei boli şi/sau a simptoamelor sale însoţitoare şi reducerea riscului subiectului de a dobândi sau dezvolta o boală sau tulburare.

Exprimarea „cantitate eficientă terapeutic« înseamnă o cantitate dintr-un compus, sau dintr-o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, suficientă pentru a preveni dezvoltarea sau pentru a atenua într-o oarecare măsură una sau mai multe simptoame ale afecţiunii sau tulburării care este tratată când se administrează singură sau în conjuncţie cu un alt agent terapeutic pentru tratamentul unui anumit subiect sau populaţie de subiecţi. „Cantitatea eficientă terapeutic« poate varia depinzând de compus, boala şi severitatea acesteia, şi vârsta, greutatea, sănătatea, etc., ale subiectului care este tratat. De exemplu la un om sau alt mamifer, o cantitate eficientă terapeutic poate fi determinată experimental în condiţii de laborator sau clinice, sau poate fi cantitatea necesară indicată de Administraţia Statelor Unite pentru alimente şi medicamente, sau de agenţii străine echivalente, pentru o anumită boală şi subiect care sunt tratate.

Termenul „subiect« este definit aici pentru a se referi la animale cum ar fi mamifere, incluzând, dar fără a se limita la, primate (de exemplu, oameni), vaci, oi, capre, porci, cai, câini, pisici, iepuri, şobolani, şoareci şi altele asemenea. Într-o realizare, subiectul este un om. Termenii „uman«, „pacient«, şi „subiect« sunt utilizaţi aici interschimbabil.

Compusul invenţiei este denumit prin utilizarea algoritmului de denumire Name 2015 al Advanced Chemical Development sau a algoritmului de denumire Struct=Nume ca o parte din CHEMDRAW® ULTRA v. 12.0.2.1076.

Trebuie să se înţeleagă că compusul invenţiei poate avea forme tautomerice, precum şi izomeri geometrici, şi că aceştia constituie de asemenea un aspect al invenţiei.

Prezenta divulgare include toţi compuşii etichetaţi izotopic acceptabili farmaceutic cu formula (I) în care unul sau mai mulţi atomi sunt înlocuiţi cu atomi având acelaşi număr atomic, dar o masă atomică sau număr de masă diferite de masa atomică sau numărul de masă care predomină în natură. Exemple de izotopi adecvaţi pentru includere în compuşii din divulgare includ izotopi de hidrogen, cum ar fi 2H şi 3H, de carbon, cum ar fi 11C, 13C şi 14C, de clor, cum ar fi 36Cl, de fluor, cum ar fi 18F, de iod, cum ar fi 123I şi 125I, de azot, cum ar fi 13N şi 15N, de oxigen, cum ar fi 15O, 17O şi 18O, de fosfor, cum ar fi 32P, şi de sulf, cum ar fi 35S. Anumiţi compuşi etichetaţi izotopic cu formula (I), de exemplu, cei care încorporează un izotop radioactiv, sunt utili în studiile medicamentoase şi/sau de distribuţie a ţesutului în substraturi. Izotopii radioactivi de tritiu, adică 3H, şi de carbon-14, adică 14C, sunt în special utili în acest scop, în lumina uşurinţei lor de încorporare şi a mijloacelor gata de detecţie. Substituţia cu izotopi mai grei cum ar fi deuteriul, adică 2H, poate permite anumite avantaje terapeutice care rezultă din mai marea stabilitate metabolică, de exemplu, perioadă de înjumătăţire crescută in vivo, sau cerinţe de dozaj reduse, şi prin urmare poate fi preferată în unele circumstanţe. Substituţia cu izotopi emitenţi de pozitroni, cum ar fi 11C, 18F, 15O şi 13N, poate fi utilă în studiile topografice de emisie de pozitroni (PET) pentru examinarea gradului de ocupare a receptorilor substratului. Compuşii etichetaţi izotopic cu formula (I) pot fi în general preparaţi prin tehnicile convenţionale cunoscute celor calificaţi în domeniu sau prin procedee analoage cu cele descrise în exemplele însoţitoare, utilizând un reactiv adecvat marcat izotopic în locul reactivului nemarcat utilizat anterior.

Desenele formulei din această descriere pot reprezenta numai una dintre posibilele forme tautomerice, geometrice, sau stereoizomerice. Trebuie să se înţeleagă că invenţia cuprinde orice formă tautomerică, geometrică, sau stereoizomerică, şi amestecuri ale acestora, şi nu se limitează doar la oricare din formele tautomerice, geometrice, sau stereoizomerice utilizate în desenele formulei.

Compusul cu Formula (I) poate fi utilizat sub formă de săruri acceptabile farmaceutic. Exprimarea „sare acceptabilă farmaceutic« înseamnă acele săruri care sunt, în domeniul unui raţionament medical temeinic, adecvate pentru utilizare în contact cu ţesuturile oamenilor şi animalelor inferioare, fără toxicitate nepotrivită, iritare, răspuns alergic şi altele asemenea, şi sunt proporţionale cu un raport rezonabil beneficiu/risc.

Sărurile acceptabile farmaceutic au fost descrise în S. M. Berge şi colab. J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66: 1-19.

Compusul cu Formula (I), care poate conţine o funcţionalitate fie bazică, fie acidă, sau ambele, poate fi convertit la o sare acceptabilă farmaceutic, când se doreşte, prin utilizarea unui acid sau baze adecvate. Sărurile pot fi preparate in situ în timpul izolării şi purificării finale a compusului invenţiei.

Exemple de săruri de adiţie cu acid includ, dar nu se limitează la, acetat, adipat, alginat, citrat, aspartat, benzoat, benzensulfonat, bisulfat, butirat, camforat, camforsulfonat, digluconat, glicerofosfat, hemisulfat, heptanoat, hexanoat, fumarat, clorhidrat, bromhidrat, iodhidrat, 2-hidroxietansulfonat (izotionat), lactat, malat, maleat, metansulfonat, nicotinat, 2-naftalinsulfonat, oxalat, palmitoat, pectinat, persulfat, 3-fenilpropionat, picrat, pivalat, propionat, succinat, tartrat, tiocianat, fosfat, glutamat, bicarbonat, p-toluensulfonat şi undecanoat. De asemenea, grupările de bază care conţin azot pot fi cuaternizate cu astfel de agenţi ca halide alchil inferioare cum ar fi, dar fără a se limita la, metil, etil, propil, şi cloruri butil, bromuri şi ioduri; sulfaţi dialchil cum ar fi dimetil, dietil, dibutil şi sulfaţi diamil; halide cu catenă lungă cum ar fi, dar fără a se limita la, decil, lauril, miristil şi cloruri stearil, bromuri şi ioduri; halide arilalchil cum ar fi bromuri benzil şi fenetil şi altele. Se obţin prin urmare produse dispersabile solubile în apă sau ulei. Exemple de acizi care pot fi utilizaţi pentru a forma săruri de adiţie cu acid acceptabile farmaceutic, includ astfel de acizi anorganici cum ar fi acidul clorhidric, acidul bromhidric, acidul sulfuric, şi acidul fosforic şi astfel de acizi organici cum ar fi acidul acetic, acidul fumaric, acidul maleic, acidul 4-metibenzensulfonic, acidul succinic şi acidul citric.

Sărurile de adiţie cu baze pot fi preparate in situ în timpul izolării şi purificării finale a compuşilor acestei invenţii prin punerea în reacţie a unui radical care conţine acid carboxilic cu o bază adecvată cum ar fi, dar fără a se limita la, hidroxid, carbonat sau bicarbonat ale unui cation de metal acceptabil farmaceutic sau cu amoniac sau o amină organică primară, secundară sau terţiară. Sărurile acceptabile farmaceutic includ, dar nu se limitează la, cationi pe bază de metale alcaline sau metale alcaline pământose cum ar fi, dar fără a se limita la, litiu, sodiu, potasiu, calciu, magneziu şi săruri de aluminiu şi altele asemenea şi amoniac cuaternar nontoxic şi cationi amină incluzând amoniu, tetrametilamoniu, tetraetilamoniu, metilamină, dimetilamină, trimetilamină, trietilamină, dietilamină, etilamină şi altele asemenea. Alte exemple de amine organice utile pentru formarea de săruri de adiţie ale unei baze includ etilendiamină, etanolamină, dietanolamină, piperidină, piperazină şi altele asemenea.

Termenul „promedicament acceptabil farmaceutic« sau „promedicament« aşa cum s-a utilizat în acest document, reprezintă acele promedicamente ale compusului din prezenta invenţie care sunt, în domeniul unui raţionament medical temeinic, adecvate pentru utilizare în contact cu ţesuturile oamenilor şi animalelor inferioare fără toxicitate nepotrivită, iritare, răspuns alergic, şi altele asemenea, proporţional cu un raport rezonabil beneficiu/risc, şi eficiente pentru utilizarea lor intenţionată.

Prezenta invenţie are în vedere un compus cu formula (I) format prin mijloace sintetice sau format prin biotransformarea in vivo a unui promedicament.

Compuşii descrişi aici pot exista în forme nesolvatate precum şi solvatate, incluzând formele hidrate, cum ar fi hidraţii hemi. În general, formele solvatate, cu solvenţi acceptabili farmaceutic cum ar fi apa şi etanolul printre alţii sunt echivalente cu formele nesolvatate pentru scopurile invenţiei.

Următoarele exemple pot fi utilizate în scopuri ilustrative şi nu ar trebui să se considere că îngustează domeniul invenţiei. Exemplul 35 este compusul invenţiei. Alte exemple sunt furnizate ca exemple comparative.

Exemple

Toţi reactivii au fost de calitate comercială şi au fost utilizaţi cum au fost primiţi, fără purificare suplimentară, dacă nu se afirmă altfel. Solvenţii anhidri disponibili comercial au fost utilizaţi pentru reacţiile efectuate sub atmosferă inertă. În toate celelalte cazuri au fost utilizaţi solvenţi de calitate reactivă, în afară de cazul când s-a specificat altfel. Deplasările chimice (δ) pentru spectrele 1H RMN au fost raportate în părţi la milion (ppm) faţă de tetrametilsilan (δ 0,00) sau vȃrful adecvat de solvent rezidual, adică CHCl3 (δ 7,27), ca referinţă internă. Multiplicările au fost date ca singure (s), doublet (d), triplet (t), cvartet (q), cvintuplet (quin), multiplet (m) şi larg (br).

Exemplul 1

4-[2-(2,6-dimetilfenoxi)-5-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il]-N-etil-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamidă

Metodă A pentru prepararea de etil 4-bromo-6-metil-7-oxo-1-tosil-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxilat:

Exemplul 1a

(E)-2-(5-bromo-2-metoxi-3-nitropiridin-4-il)-N,N-dimetiletenamină

5-Bromo-2-metoxi-4-metil-3-nitropiridină (15,0 g, 60,7 mmol) a fost dizolvat în dimetilformamidă (300 mL), şi s-a adăugat metanolat de litiu (6,07 mL, 6,07 mmol, 1 M). Amestecul de reacţie a fost încălzit la 100°C. La acest amestec s-a adăugat 1,1-dimetoxi-N,N-dimetilmetanamină (64,5 mL, 486 mmol) peste 10 minute. Amestecul de reacţie a fost agitat la 95°C timp de 16 ore. Amestecul de reacţie a fost răcit la temperatura ambiantă şi s-a adăugat apă cu grijă (300 mL, exothermic). Precipitatul rezultat a fost colectat prin filtrare în vid, spălat cu apă, şi uscat pentru a furniza compusul din titlu (13,9 g, 45,9 mmol, 76 % randament).

Exemplul 1b

4-bromo-7-metoxi-1H-pirolo[2,3-c]piridină

Exemplul 1a (13,9 g, 45,8 mmol) şi acetatul de etil (150 mL) au fost adăugate la suspensia de apă Ra-Ni 2800 (pre-spălată cu etanol) (6,9 g, 118 mmol) într-o sticlă din oţel inoxidabil rezistentă la presiune şi agitată timp de 30 minute la 30 psi de H2 şi temperatura ambiantă. Amestecul de reacţie a fost filtrat, şi concentrat. Reziduul a fost triturat cu diclorometan, şi solidul filtrat pentru a furniza compusul din titlu (5,82 g). Lichidul mamă a fost concentrat şi reziduul se triturează din nou cu diclorometan şi filtrat pentru a furniza un supliment de 1,63 g al compusului din titlu. Randament toal = 7,45 g, randament 72 %.

Exemplul 1c

4-bromo-7-metoxi-1-tosil-1H-pirolo[2,3-c]piridină

O soluţie din exemplul 1b (7,42 g, 32,7 mmol) în dimetilformamidă (235 mL) a fost agitată la temperatura ambiantă. La această soluţie s-a adăugat hidrură de sodiu (1,18 g, 1,96 g de dispersie în ulei 60 %, 49,0 mmol), şi amestecul de reacţie a fost agitat timp de 10 minute. Clorura de P-toluensulfonil (9,35 g, 49,0 mmol) a fost apoi adăugată în porţii, şi amestecul a fost agitat la temperatura ambiantă sub azot timp de 16 ore. Amestecul de reacţie a fost stins cu apă. Rezultatul bej solid a fost colectat prin filtrare în vid pe o pȃlnie Buchner, şi spălat cu apă. Solidul a fost colectat şi uscat într-un cuptor cu vid la 50°C pentru a furniza 12,4 g (100 %) de compus din titlu.

Exemplul 1d

etil 4-bromo-7-metoxi-1-tosil-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxilat

La o soluţie din exemplul 1c (12 g, 31,5 mmol) în tetrahidrofuran (150 mL) s-a adăugat diizopropilamidă de litiu (24,3 mL, 47,2 mmol) în picătură la -70°C. Amestecul a fost agitat de la -70°C pȃnă la - 50°C timp de 45 minute, urmat de adăugarea în picătură de carbonoclorurat de etil (5,12 g, 47,2 mmol). După 1,5 ore, amestecul de reacţie a fost stins cu soluţie apoasă de clorură de amoniu saturată, stratul organic a fost separat, şi faza apoasă a fost extrasă cu acetat de etil (3 x 300 mL). Straturile organice combinate au fost uscate pe sulfat de sodiu anhidru, filtrate, şi concentrate la presiune redusă. Produsul brut a fost triturat cu diclorometan şi metanol (1:10) pentru a furniza compusul din titlu (13 g, randament 91%).

Exemplul 1e

etil 4-bromo-7-oxo-1-tosil-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxilat

La un amestec din exemplul 1d (29 g, 64,0 mmol) şi iodură de sodiu (14,38 g, 96 mmol) în acetonitril (400 mL), s-a adăugat clorotrimetilsilan (10,43 g, 96 mmol) în picătură la temperatura ambiantă. Amestecul rezultat a fost agitat la temperatura ambiantă timp de 1 oră. S-a adăugat apă (0,576 g, 32,0 mmol) în picătură la amestecul de reacţie şi amestecul a fost agitat la 65°C timp de 3 ore. Amestecul de reacţie a fost răcit la temperatura ambiantă şi filtrat. Precipitatul a fost dizolvat în diclorometan, filtrat, şi concentrat pentru a furniza un solid care a fost triturat cu eter de petrol şi diclorometan pentru a furniza compusul din titlu (32 g, 97 %).

Exemplul 1f

etil 4-bromo-6-metil-7-oxo-1-tosil-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxilat

La o soluţie din exemplul 1e (18,72 g, 42,6 mmol) în anhidru dimetilformamidă (200 mL) s-a adăugat carbonat de cesiu (16,66 g, 51,1 mmol), urmat de adăugarea în picătură de iodometan (3,20 mL, 51,1 mmol). Amestecul de reacţie a fost agitat timp de 72 ore la temperatura ambiantă. A fost adăugată apă la amestecul de reacţie (500 mL) şi precipitatul a fost separat prin filtrare, spălat cu apă, şi uscat peste noapte într-un cuptor cu vid la 55°C pentru a furniza 17,9 g (93%) din compusul din titlu.

Metodă B pentru prepararea de etil 4-bromo-6-metil-7-oxo-1-tosil-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxilat:

Exemplul 1f-i

N-(2,2-dimetoxietil)-N-metil-1H-pirol-2-carboxamidă

O soluţie de acid 1H-pirol-2-carboxilic (50,0 g, 450 mmol) în 500 mL de tetrahidrofuran a fost răcită de la -5 la -8 °C, urmată de adăugarea de 2,2-dimetoxi-N-metiletanamină (64,4 g, 540 mmol) şi diizopropiletilamină (171 mL, 128 mmol). Amestecul de reacţie a fost agitat la această temperatură, în timp ce s-a adăugat anhidrida propilfosfonică (315 g, 495 mmol) în picătură peste 20 minute. După adăugare, amestecul de reacţie a fost încălzit la 23°C peste 15 minute. Amestecul de reacţie a fost agitat timp de 1 oră la temperatura ambiantă, şi apoi încălzit la 40°C. După 18 ore la 40°C, amestecul de reacţie a fost răcit într-o baie cu gheaţă şi diluat cu 1000 mL de apă şi 500 mL de acetat de etil. Stratul organic a fost separat. Stratul apos a fost extras înapoi de trei ori cu 250 mL de acetat de etil. Straturile combinate de acetat de etil au fost spălate cu 250 mL de apă şi 250 mL de saramură. Stratul organic rezultat a fost redus în cameră cu vid ridicat cu o acoperire de temperatură de 30-40°C. După ce volumul a fost redus cu 50% până la 850 mL, s-au adăugat 850 mL suplimentari de heptan şi distilarea a continuat în cameră cu vid ridicat cu o acoperire de temperatură de 30-40°C. Heptanul (550 mL) a fost distilat şi amestecul de reacţie a fost răcit la 15°C. Produsul a început să precipite şi apoi s-au adăugat 500 mL de heptan pentru a genera o suspensie, care a fost încălzită la 30-40°C pentru a îndepărta toate solidele care au aderat la peretele vasului. Suspensia a fost răcită la 25°C. 500 mL suplimentari de heptan au fost adăugaţi pentru a subţia suspensia. Suspensia a fost răcită într-o baie cu gheaţă şi filtrată la 0°C. Solidul a fost repede spălat cu heptan, şi apoi uscat într-un cuptor cu vid la 40°C peste noapte pentru a da compusul din titlu (63,6 g, randament 70,1%) ca un solid alb pufos.

Exemplul 1f-ii

6-metil-1H-pirolo[2,3-c]piridin-7(6H)-onă

La Exemplul 1f-i (50 g, 236 mmol) în 500 mL de tetrahidrofuran, s-a adăugat monohidrat de acid p-toluensulfonic (8,96 g, 47,1 mmol) şi amestecul de reacţie a fost agitat la 60°C timp de 5 ore. După acest timp, amestecul de reacţie a fost agitat timp de 12 ore, şi lăsat să se răcească la 23°C. În acest timp, produsul a început să precipite din amestecul de reacţie. S-a adăugat o soluţie de bicarbonat de sodiu (0,2 N, 500 mL), şi amestecul de reacţie a fost extras cu 250 mL de acetat de etil. Stratul organic a fost separat, şi stratul apos a fost extras înapoi de trei ori cu 188 mL de acetat de etil. Straturile organice combinate au fost spălate cu saramură (188 mL). Stratul organic rezultat a fost uscat cu sulfat de magneziu anhidru, filtrat printr-un filtru de 0,45 microni, şi stratul organic a fost redus până la 850 mL sub vid cu o acoperire de temperatură de 40°C. După acest timp, 500 mL de heptan au fost adăugaţi încet peste 10 minute la 25°C. S-a format o suspensie, care a fost răcită la 10°C şi agitată la această temperatură timp de 14 ore. Solidul rezultat a fost filtrat, spălat cu heptan, şi uscat într-un cuptor cu vid la 50°C pentru a da compusul din titlu (27,9 g, randament 80%) ca solid arămiu.

Exemplul 1f-iii

6-metil-1-tosil-1H-pirolo[2,3-c]piridin-7(6H)-onă

Un balon de 3000 mL tapetat, cu fund rotund a fost spălat cu azot şi încărcat cu Exemplul 1f-ii (121 g, 817 mmol). S-a adăugat tetrahidrofuran (1200 mL) şi amestecul de reacţie a fost răcit la -8°C. S-a adăugat o soluţie de tetrahidrofuran de bis(trimetilsilil)amidă de litiu (1M, 1022 mL, 1022 mmol) pentru a rezulta suspensia la o rată care a menţinut temperatura de reacţie internă sub 10°C. Soluţia a fost răcită la -8°C şi agitată timp de 1 oră. După acest timp, s-a adăugat clorura de p-toluensulfonil (238 g, 1225 mmol) în câteva porţii. Odată ce temperatura internă a amestecului de reacţie a fost stabilizată, conţinutul flaconului a fost lăsat să se încălzească la 20°C, punct în care produsul a început să precipite. Amestecul de reacţie a fost agitat timp de 2 ore, şi ţinut pentru încă 14 ore suplimentare. După acest timp, s-a adăugat heptan (600 mL) şi amestecul de reacţie a fost distilat până la un volum total de aproximativ 1200 mL. Soluţia a fost răcită la 0°C, şi solidul precipitat a fost filtrat într-o pȃlnie de filtrare de 2L cu o frită poroasă medie. Solidul colectat a fost apoi suspendat în 1200 mL de apă şi refiltrat. Suspensia suplimentară a fost generată utilizând solidul şi 1200 mL de metanol. După agitarea suspensiei timp de 15 minute, solidul a fost filtrat şi uscat la 35°C pentru a da compusul din titlu (215 g, randament 86%) ca un solid alburiu.

Exemplul 1f-iv

etil 6-metil-7-oxo-1-tosil-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxilat

La un balon cu fund rotund de 500 mL cu trei gâturi, s-a adăugat Exemplul 1f-iii (10,0 g, 33,1 mmol). Flaconul a fost ajustat cu un termocuplu şi purjat cu azot. După 30 minute flaconul a fost etanşat cu septa, şi s-a lăsat să intre azot. Solidul a fost apoi suspendat în 70 mL de tetrahidrofuran. Suspensia albicioasă a fost agitată şi răcită la -15°C. După păstrarea la această temperatură timp de 2 minute, s-a adăugat n-butillitiu în hexani (2,5 M, 13,0 ml, 32,5 mmol) la o rată care să menţină temperatura la +/- 5°C, care a dat o suspensie maro deschis. După adăugare, amestecul de reacţie a fost agitat timp de 5 minute, şi apoi răcit la -55°C. După păstrarea la această temperatură timp de 1 minut, s-a adăugat carbonoclorură de etil (4,6 ml, 50,7 mmol) la o rată care să menţină temperatura +/- 10°C. După completarea adăugării, amestecul de reacţie a fost agitat timp de 5 minute şi apoi s-a îndepărtat baia rece. Amestecul de reacţie a fost agitat pentru încă 180 minute suplimentare sau până când amestecul de reacţie s-a încălzit la 20°C. După acest timp, amestecul de reacţie a fost stins cu 50 mL de apă şi a fost adăugat la o pâlnie separatoare cu aproximativ 100 mL de apă suplimentari. S-a adăugat apoi acetat de etil (200 mL) şi straturile au fost separate. Stratul apos a fost apoi extras 2 X 100 mL cu acetat de etil. După îndepărtarea acetatului de etil, solidul brut maro închis a fost suspendat în 100 mL de acetonitril, care a produs un precipitat arămiu. Solidul a fost colectat, spălat cu 20 mL de acetonitril, şi uscat. Filtratul de acetonitril a fost distilat până când precipitarea a început din nou. Solidul arămiu a fost colectat prin filtrare, spălat cu acetonitril (1 x 20 mL), şi uscat. Solidul colectat a fost combinat pentru a da compusul din titlu (6,94 g, randament 57%) ca solid arămiu.

Exemplul 1f

Un flacon cu fund rotund de 250 mL a fost încărcat cu o bară de agitare şi Exemplul 1f-iv (3,00 g, 8,02 mmol). La flacon s-au adăugat 100 mL de tetrahidrofuran, şi amestecul de reacţie a fost agitat până la dizolvare completă (aproximativ 1 minut). La amestecul de reacţie sub agitare s-a adăugat hidrat de acid p-tolunsulfonic (0,763 g, 4,01 mmol), urmat de N-bromosuccinimidă (1,455 g, 8,17 mmol). Amestecul de reacţie a fost agitat la 23°C timp de 12,5 ore. După acest timp, tetrahidrofuranul a fost îndepărtat pe un evaporator rotativ, lăsȃnd un reziduu galben. Reziduul a fost suspendat în 200 etanol martor (75 mL), şi agitat ca o suspensie timp de 80 minute. Suspensia a fost filtrată şi spălată cu etanol (200 martor, 1 x 50 mL), pentru a furniza compusul din titlu (3,06 g, randament 84%) ca un solid alburiu.

Exemplul 1g

4-bromo-N-etil-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamidă

La o soluţie din exemplul 1f (10 g, 22,06 mmol) şi 2 M etanamină în tetrahidrofuran (90 mL, 180 mmol) la 20°C s-a adăugat 8 % g% metanolat de magneziu (88 mL, 66,7 mmol) în metanol. Amestecul de reacţie a fost încălzit la 55°C timp de 15 ore cu sistemul etanşat. Apoi amestecul a fost răcit la temperatura ambiantă şi diluat cu 0,5 N HCl (800 mL), agitat timp de 5 minute, şi filtrat. Solidul a fost spălat cu apă îngheţată şi uscat pentru a furniza 6,8 g (98 %) din compusul din titlu.

Exemplul 1h

N-etil-6-metil-7-oxo-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamidă

Un balon de 1 L cu fund rotund, cu trei gâturi a fost încărcat cu acetat de potasiu uscat (17,18 g, 175 mmol), Exemplul 1g (17,4 g, 58,4 mmol), 4,4,4',4',5,5,5',5'-octametil-2,2'-bi(1,3,2-dioxaborolan) (29,6 g, 117 mmol), cloro(2-diciclohexilfosfino-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenil)[2-(2'-amino-1,1'-bifenil)]paladiu(II) (1,837 g, 2,335 mmol), şi 2-diciclohexilfosfino-2',4',6'-triizopropilbifenil (1,113 g, 2,335 mmol), şi plasat sub azot. S-a adăugat 2-metil tetrahidrofuran anhidru degazat (500 mL) şi amestecul a fost încălzit la 75°C peste noapte. Amestecul a fost răcit la temperatura ambiantă, diluat cu apă şi acetat de etil şi amestecul bifazic a fost agitat timp de aproximativ o oră cu 1,2 g. (3,0 echiv. pe bază de moli de paladiu) de pirolidină ditiocarbamat de amoniu. Amestecul a fost filtrat printr-o priză de spălări cu diatomee pămȃntoasă cu acetat de etil şi 10 % metanol/acetat de etil. Filtratul a fost diluat suplimentar cu acetat de etil şi saramură, straturile au fost separate, şi stratul organic spălat cu apă şi saramură, uscat cu sulfat de sodiu anhidru, filtrat, şi concentrat. Produsul brut a fost triturat cu 300 mL de 20 % acetat de etil/heptan. Solidele uscate au furnizat 17,4g (86 %) de compus din titlu.

Exemplul 1i

acid 5-bromo-6-(2,6-dimetilfenoxi)nicotinic

O soluţie de acid 5-bromo-6-cloronicotinic (12 g, 50,8 mmol), 2,6-dimetilfenol (7,44 g, 60,9 mmol) şi carbonat de cesiu (49,6 g, 152 mmol) în dimetil sulfoxid (100 mL) a fost încălzită la 100°C timp de 40 ore, răcită la temperatura ambiantă, şi turnată în 500 mL de apă îngheţată. PH-ul a fost ajustat la un pH constant de 2 prin adăugarea cu grijă a 12 M HCl. Amestecul apos a fost extras cu acetat de etil (3 x 200 mL). Organicele combinate au fost spălate de două ori cu clorură de sodiu apoasă saturată, uscate pe sulfat de magneziu anhidru, tratate cu cărbune de decolorare, filtrate, şi concentrate. Materialul brut a fost adsorbit pe gel de siliciu şi cromatografiat pe un cartuş de siliciu de 330g, eluând cu 10-70 % 3:1 acetat de etil/etanol: heptani pentru a furniza 10,74 g (66 %) din compusul din titlu.

Exemplul 1j

5-bromo-6-(2,6-dimetilfenoxi)-N-metoxi-N-metilnicotinamidă

O soluţie din exemplul 1i (8,5 g, 26,4 mmol), clorhidrat de N1-((etilimino)metilen)-N3,N3-dimetilpropan-1,3-diamină (6,05 g, 31,6 mmol), hidrat de 1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-ol (5,12 g, 33,4 mmol), clorhidrat de N,O-dimetilhidroxilamină (5,21 g, 53,4 mmol) şi 4-metilmorfolină (10 mL, 91 mmol) în diclorometan (130 mL) a fost agitată la 25°C timp de 3 ore. Amestecul a fost spălat într-o pâlnie separatoare cu 50 mL de diclorometan, extras cu apă, spălat cu bicarbonat de sodiu apos, şi uscat pe sulfat de sodiu anhidru, filtrat, şi concentrat. Reziduul a fost purificat prin cromatografie (gel de siliciu, 0-50 % acetat de etil în heptan) pentru a furniza compusul din titlu (8,56 g, 89 %).

Exemplul 1k

1-(5-bromo-6-(2,6-dimetilfenoxi)piridin-3-il)etanonă

O soluţie din exemplul 1j (1,51 g, 4,13 mmol) în tetrahidrofuran (30 mL) a fost tratată cu o soluţie de metilclorură de magneziu (3,0 M soluţie în tetrahidrofuran, 1,8 mL, 5,40 mmol) şi agitată la 25°C timp de 90 de minute. Soluţia a fost turnată în clorură de amoniu apoasă şi extrasă în acetat de etil (100 mL), uscat pe sulfat de sodiu anhidru, filtrată, şi concentrată. Reziduul a fost purificat prin cromatografie (gel de siliciu, 0-100 % acetat de etil în heptan) pentru a furniza 0,875 g (66 %) din compusul din titlu.

Exemplul 11

2-(5-bromo-6-(2,6-dimetilfenoxi)piridin-3-il)propan-2-ol

O soluţie din exemplul 1k (0,239 g, 0,746 mmol) în tetrahidrofuran (5 mL) a fost tratată cu o soluţie de metilclorură de magneziu (3,0 M soluţie în tetrahidrofuran, 0,4 mL, 1,2 mmol) şi agitată la 25°C pentru 3,5 ore. Soluţia a fost turnată în clorură de amoniu apoasă şi extrasă în acetat de etil (60 mL), uscată pe sulfat de sodiu anhidru, filtrată, şi concentrată. Reziduul a fost purificat prin cromatografie (gel de siliciu, 0-100 % acetat de etil în heptan) pentru a furniza 0,195 g (78 %) din compusul din titlu.

Exemplul 1m

4-(2-(2,6-dimetilfenoxi)-5-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-3-il)-N-etil-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamidă

Exemplul 1h (222 mg, 0,643 mmol), Exemplul 11 (195 mg, 0,580 mmol), fosfat de potasiu (363 mg, 1,710 mmol), tris(dibenzilidenaceton)dipaladiu(0) (16,7 mg, 0,018 mmol) şi 1,3,5,7-tetrametil-6-fenil-2,4,8-trioxa-6-fosfaadamantană (18,3 mg, 0,063 mmol) au fost combinate şi barbotate cu azot timp de 15 minute, urmate de adăugarea unui amestec de tetrahidrofuran degazat (4,80 mL)/apă (1,20 mL). Amestecul a fost încălzit la 60°C timp de 3 ore. Amestecul a fost diluat cu 20 mL de acetat de etil, spălat cu clorură de sodiu apoasă saturată, uscat cu sulfat de sodiu anhidru, filtrat şi evaporat. Reziduurile au fost purificate prin HPLC cu fază inversă (C18, CH3CN/apă (0,1 % acid trifluoroacetic), 0-100 % gradient) pentru a furniza compusul din titlu ca sare cu acid trifluoroacetic. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,31 (bs, 1H), 8,35 (t, J = 5,3 Hz, 1H), 8,10 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,06 (m, 1H), 7,01 (m, 1H), 6,88 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 3,61 (s, 3H), 3,28 (m, 2H), 1,99 (s, 6H), 1,48 (s, 6H), 1,12 (t, J = 7,2 Hz, 3H). MS (ESI+) m/z 475,2 (M+H)+.

Exemplul 3

4-[2-(2,6-dimetilfenoxi)-5-(2-hidroxipropan-2-il)fenil]-N-etil-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamidă

Exemplul 3a

acid 3-bromo-4-(2,6-dimetilfenoxi)benzoic

Un amestec de metil 3-bromo-4-fluorobenzoat (10,80 g, 46,3 mmol), 2,6-dimetilfenol (6,24 g, 51,1 mmol) şi carbonat de cesiu (16,6 g, 50,9 mmol) în dimetil sulfoxid (95 mL) a fost încălzit la 190°C timp de 20 ore. Amestecul a fost lăsat să se răcească, apoi turnat în 400 mL de saramură, acidulat cu HCl şi extras cu 500 mL de acetat de etil. Extractele organice au fost spălate cu saramură şi uscate pe sulfat de magneziu anhidru. După filtrare materialul brut a fost adsorbit pe gel de siliciu şi cromatografiat pe un cartuş de gel de siliciu de 220 g eluând cu 10-70 % 3:1 acetat de etil/etanol:heptani pentru a furniza 13,54g (91 %) din compusul din titlu.

Exemplul 3b

3-bromo-4-(2,6-dimetilfenoxi)-N-metoxi-N-metilbenzamidă

Exemplul 3b a fost preparat în conformitate cu procedura utilizată pentru prepararea din exemplul 1j, substituind Exemplul 3a cu de exemplu 1i.

Exemplul 3c

1-(3-bromo-4-(2,6-dimetilfenoxi)fenil)etanonă

Metoda A

La un amestec de exemplu 3b (1,19 g, 3,27 mmol) în tetrahidrofuran (24 mL) a fost adăugată prin seringă clorură de metilmagneziu (3,0 M soluţie în tetrahidrofuran, 1,4 mL, 4,20 mmol) şi amestecul a fost agitat la temperatura ambiantă. După 90 minute, soluţia a fost turnată în clorură de amoniu apoasă saturată şi extrasă în acetat de etil (100 mL). Organicele au fost uscate pe sulfat de sodiu anhidru, filtrate, şi concentrate la presiune redusă. Reziduul a fost purificat prin cromatografie intermitentă (gel de siliciu, 0-100% acetat de etil/heptan) pentru a furniza compusul din titlu (0,631 g, randament 61%).

Metoda B:

Un amestec de carbonat de potasiu (4,78 g, 34,6 mmol) 2,6-dimetilfenol (2,96 g, 24,19 mmol) 1-(3-bromo-4-fluorofenil)etanonă (5 g, 23,04 mmol) în dimetilacetamidă (50 mL) a fost agitat la 80°C timp de 1,5 ore. După răcirea la temperatura ambiantă, s-a adăugat apă (40 mL). Amestecul a fost extras cu acetat de etil, şi faza organică combinată a fost spălată cu apă, saramură, şi concentrată pentru a furniza compusul din titlu (7,1 g, 22,24 mmol, randament 97%).

Exemplul 3d

2-(3-bromo-4-(2,6-dimetilfenoxi)fenil)propan-2-ol

Metoda A:

La o soluţie din exemplul 3c (0,365 g, 1,144 mmol) în tetrahidrofuran (10,00 mL) s-a adăugat prin seringă clorură de metilmagneziu (3,0 M soluţie în tetrahidrofuran, 1 mL, 3,00 mmol), şi amestecul a fost agitat la temperatura ambiantă. După 3,5 ore, soluţia a fost partiţionată între clorura de amoniu apoasă saturată (50 mL) şi acetatul de etil (75 mL). Organicele au fost uscate pe sulfat de sodiu anhidru, filtrate, şi concentrate la presiune redusă. Reziduul a fost purificat prin cromatografie intermitentă (gel de siliciu, 0-100% acetat de etil/heptan) pentru a furniza compusul din titlu (0,247g, randament 64%).

Metoda B:

La o soluţie de 2,6-dimetilfenol (11,53 g, 94 mmol) şi metil 3-bromo-4-fluorobenzoat (20 g, 86 mmol) în dimetil sulfoxid (80 mL) s-a adăugat carbonat de cesiu (41,9 g, 129 mmol). Amestecul a fost agitat la 80°C sub azot timp de 2 ore, răcit, diluat cu 200 mL de apă, şi agitat timp de 10 minute. Amestecul a fost transferat la o pâlnie separatoare şi s-au extras 4 x 200 mL cu metil terţ-butil eter. Extractele organice au fost combinate, uscate pe sulfat de sodiu anhidru, filtrate şi concentrate. Purificarea prin cromatografie (siliciu, 0-10 % acetat de etil în heptani) a furnizat metil 3-bromo-4-(2,6-dimetilfenoxi)benzoat ca un ulei care s-a solidificat după repaus (25,7 g, 82%). La o soluţie din acest material (11,08 g, 33,1 mmol) în tetrahidrofuran (165 mL) sub azot la 23°C, s-a adăugat bromură de metilmageziu (33,1 mL, 99 mmol, 3,0 M în eter dietil) într-o manieră în picătură. Reacţia a fost exotermică. Amestecul de reacţie a fost agitat timp de 1 oră permiţând ca temperatura internă să se răcească până la aproximativ temperatura ambiantă. Amestecul a fost turnat în 5 % clorură de amoniu apoasă rece şi partiţionat cu 400 mL eter dietil. Stratul organic a fost spălat cu clorură de sodiu apoasă saturată, uscat pe sulfat de sodiu anhidru, filtrat, şi concentrat. Purificarea prin cromatografie (siliciu, 0-25 % acetat de etil în heptani) a dat compusul din titlu (9,0 g, 81%).

Exemplul 3e

4-(2-(2,6-dimetilfenoxi)-5-(2-hidroxipropan-2-il)fenil)-N-etil-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamidă

Exemplul 3e a fost preparat în conformitate cu procedura utilizată pentru prepararea din exemplul 1m, substituind Exemplul 3d cu de exemplu 11. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,21 (bds, 1H), 8,34 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 7,52 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,34 (s, 1H), 7,31 (dd, J = 8,6, 2,4 Hz, 1H), 7,12 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,04 (m, 1H), 6,86 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,28 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 3,60 (s, 3H), 3,28 (m 2H), 2,02 (s, 6H), 1,44 (s, 6H), 1,12 (t, J = 7,2 Hz, 3H). MS (ESI+) m/z 474,2 (M+H)+.

Exemplul 32

N-terţ-butil-4-[2-(2,6-dimetilfenoxi)-5-(2-hidroxipropan-2-il)fenil]-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamidă

Exemplul 32a

acid 4-bromo-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxilic

Un balon de 500 mL cu fund rotund a fost încărcat cu Exemplul 1f (7,9 g, 17,43 mmol) şi dioxan (100 mL). La această soluţie s-a adăugat 2M NaOH (34,9 mL, 69,7 mmol), şi amestecul de reacţie a fost încălzit la 80°C timp de 2 ore. După răcire, amestecul de reacţie a fost diluat cu HCl (0,1 N) la pH 2. S-a adăugat apoi IN HCl în picătură pentru a scădea pH-ul până la aproximativ 1. Amestecul rezultat a fost agitat viguros timp de aproximativ o oră. Amestecul a fost filtrat şi solidul rezultat a fost spălat cu apă şi uscat pentru a furniza compusul din titlu (4,44 g, randament 94%).

Exemplul 32b

4-bromo-N-(terţ-butil)-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamidă

La o suspensie din exemplul 32a (2,98 g, 11,0 mmol) în diclorometan (30 mL) s-au adăugat 4 picături de dimetilformamidă urmată de adăugarea de clorură de oxalil (1,93 mL, 22,0 mmol). Amestecul a fost agitat la temperatura ambiantă timp de 3 ore şi concentrat. La reziduu s-au adăugat tetrahidrofuran (30 mL) şi 2-metilpropan-2-amină (3,47 mL, 33,0 mmol) şi amestecul s-a agitat la temperatura ambiantă timp de 1 oră. Amestecul a fost partiţionat cu acetat de etil şi apă. Stratul organic a fost spălat cu clorură de sodiu apoasă saturată, uscat cu sulfat de sodiu anhidru, filtrat, şi concentrat. Reziduul rezultat a fost triturat cu acetat de etil/heptani (1:1) pentru a furniza compusul din titlu (3,35 g, 10,27 mmol, 93 %).

Exemplul 32c

N-(terţ-butil)-6-metil-7-oxo-4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamidă

Un amestec de acetat de potasiu anhidru (26,6 g, 271 mmol), Exemplul 32b (29,5 g, 90 mmol), 4,4,4',4',5,5,5',5'-octametil-2,2'-bi(1,3,2-dioxaborolan) (45,9 g, 181 mmol), cloro(2-diciclohexilfosfino-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenil)[2-(2'-amino-1,1'-bifenil)]paladiu(II) (2,85 g, 3,62 mmol), şi 2-diciclohexilfosfino-2',4',6'-triizopropilbifenil (1,725 g, 3,62 mmol) a fost degazat sub un curent de azot. La acest amestec s-a adăugat 2-metil tetrahidrofuran anhidru degazat (1 L). Suspensia galbenă rezultată a fost încălzită la 80°C peste noapte. Amestecul de reacţie a fost răcit la temperatura ambiantă şi apoi diluat cu apă (500 mL) şi acetat de etil (500 mL) şi agitat timp de 90 de minute cu 1,8 g. (3,0 echivalenţi pe bază de moli de paladiu) de pirolidină ditiocarbamat de amoniu. Amestecul rezultat a fost filtrat prin diatomee pămȃntoasă şi tampon de diatomee pămȃntoasă, a fost clătit cu acetat de etil. Filtratul a fost spălat cu saramură. Stratul organic a fost amestecat cu aproximativ 20 g. SiliaMetS Tiol® (un tiol ataşat pe siliciu printr-o catenă alchil, un debarasor de paladiu de la Silicycle), şi acest amestec a fost agitat timp de aproximativ o oră. Amestecul a fost uscat pe sulfat de sodiu anhidru, filtrat, şi concentrat la presiune redusă. Reziduul a fost purificat pe o Grace Reveleris X2 MPLC utilizând o coloană cu gel de siliciu Teledyne-Isco RediSep Rf Aur 750 g., eluând cu 50 % până la 60 % până la 70 % până la 80 % acetat de etil/heptan pentru a furniza compusul din titlu. Acest material a fost sonicat în 250 mL de 20 % acetat de etil/heptan. Solidul a fost colectat prin filtrare, spălat cu 20% acetat de etil/heptan, şi uscat pentru a furniza compusul din titlu (17,6 g, randament 52%).

Exemplul 32d

Un curent de gaz azotos a fost umflat peste un amestec din exemplul 32c (15,0 g, 40,2 mmol), Exemplul 3d (16,2 g, 48,2 mmol), 1,3,5,7-tetrametil-6-fenil-2,4,8-trioxa-6-fosfaadamantană (1,175 g, 4,02 mmol), fosfat de potasiu (21,33 g, 100 mmol), şi tris(dibenzilidenaceton)dipaladiu (1,104 g, 1,206 mmol) timp de o oră. Între timp, într-un flacon de 1 L au fost amestecate dioxan anhidru (300 mL) şi apă (75 mL). Această soluţie a fost degazată timp de o oră prin barbotarea azotului prin ea. După o oră, solvenţii au fost transferaţi prin canulă în amestecul de solide degazate. Pe măsură ce solvenţii au fost adăugaţi, s-a observat o exotermă şi temperatura a crescut de la 20,5°C până la 32,0°C. Când amestecul de reacţie a fost suficient amestecat, el a fost încălzit la 80°C timp de 2,5 ore. Amestecul de reacţie a fost răcit la temperatura ambiantă şi diluat cu acetat de etil şi apă. Amestecul a fost agitat timp de o oră cu aproximativ 600 mg. (3,0 echivalenţi. pe bază de moli de paladiu) de pirolidină ditiocarbamat de amoniu. Amestecul rezultat a fost filtrat prin diatomee pămȃntoasă. Tamponul de diatomee pămȃntoasă a fost spălat cu acetat de etil. Filtratele rezultate au fost turnate într-o pâlnie separatoare şi amestecul a fost diluat suplimentar cu acetat de etil şi saramură. Stratul organic a fost spălat cu apă (2X) şi saramură. Stratul organic a fost uscat cu sulfat de sodiu anhidru, filtrat, şi concentrat la presiune redusă. Reziduul a fost purificat pe o Grace Reveleris X2 MPLC utilizând o coloană cu gel de siliciu Teledyne Isco RediSep Rf Aur 330 g. eluând cu 70 % până la 80 % până la 90 % acetat de etil/heptani până la 100 % acetat de etil. Materialul pur rezultat a fost dizolvat prin încălzire în etanol, concentrat la presiune redusă, şi uscat pentru a produce compusul din titlu (18,0 g, randament 89%). 1H RMN (501 MHz, DMSO-d6) δ 12,34 (s, 1H), 7,85 (s, 1H), 7,52 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,28 (dd, J = 8,6, 2,4 Hz, 1H), 7,10 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 7,03 (dd, J = 8,3, 6,6 Hz, 1H), 6,85 (s, 1H), 6,26 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 4,97 (s, 1H), 3,59 (s, 3H), 2,00 (s, 6H), 1,42 (s, 6H), 1,35 (s, 9H). MS (ESI+) m/z 502,1 (M+H)+.

Exemplul 35

N-etil-4-[2-(4-fluoro-2,6-dimetilfenoxi)-5-(2-hidroxipropan-2-il)fenil]-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamidă

Exemplul 35a

4-fluoro-2,6-dimetilfenol

O soluţie de 2-bromo-5-fluoro-1,3-dimetilbenzen (25 g, 123 mmol) în tetrahidrofuran (300 mL) a fost răcită la -78°C şi s-a adăugat n-butillitiu (59,1 mL, 148 mmol) în picătură la o rată care să menţină temperatura internă la sau sub -75°C. Amestecul a fost agitat timp de 2 ore şi apoi s-a adăugat trimetilborat (16,51 mL, 148 mmol) şi amestecul a fost agitat timp de 3 ore la -78°C, apoi încălzit la temperatura ambiantă. După 4 ore, amestecul a fost răcit la -10°C şi s-a adăugat o soluţie prerăcită de NaOH (7,39 g, 185 mmol) şi 30 % peroxid de hidrogen (201 mL, 1970 mmol). Odată ce adăugarea a fost completă, amestecul a fost lăsat să se încălzească la temperatura ambiantă peste noapte. PH-ul amestecului a fost ajustat la pH 1 cu 2M HCl. S-au adăugat 400 mL de eter etil şi 200 mL de apă şi straturile au fost separate. Stratul apos a fost extras cu 3 x 200 mL de eter, şi straturile organice combinate au fost spălate cu NaHCO3 saturată şi NaS2O3 saturată, apoi au fost agitate cu o soluţie NaS2O5 apoasă saturată (200 mL) timp de 15 minute. Faza organică a fost uscată cu sulfat de magneziu anhidru, filtrată, şi concentrată. Reziduurile au fost preluate în 1/1 dietil eter/pentan şi spălate printr-o priză de siliciu. Concentrarea filtratului a furnizat 11,47g (67%) de compus din titlu.

Exemplul 35b

metil 3-bromo-4-(4-fluoro-2,6-dimetilfenoxi)benzoat

La o soluţie din exemplul 35a (1,86 g, 13,27 mmol) şi metil 3-bromo-4-fluorobenzoat (2,099 mL, 14,20 mmol) în dimetil sulfoxid (14 mL) s-a adăugat carbonat de cesiu (6,49 g, 19,91 mmol). Amestecul a fost încălzit la 80°C timp de 2 ore, răcit, şi diluat cu apă (100 mL), apoi extras cu metil terţ-butil eter (200 mL). Faza apoasă a fost extrasă cu porţii suplimentare (2 x 100 mL) de metil terţ-butil eter. Organicele combinate au fost uscate pe sulfat de sodiu anhidru, filtrate, şi concentrate. Materialul brut a fost purificat prin cromatografie (gel de siliciu, eluând cu 0-25 % acetat de etil/heptani) pentru a furniza 4,56g (97%) de compus din titlu.

Exemplul 35c

2-(3-bromo-4-(4-fluoro-2,6-dimetilfenoxi)fenil)propan-2-ol

Un flacon conţinând o soluţie din exemplul 35b (2,49 g, 7,05 mmol) în tetrahidrofuran (28,0 mL) a fost plasat într-o baie de apă, şi apoi tratat cu 3 M bromură de metilmagneziu în tetrahidrofuran (7,0 mL, 21,00 mmol). După 30 minute, amestecul a fost stins prin adăugarea de 100 mL de clorură de amoniu apoasă şi partiţionat cu 100 mL de eter dietil. Organicele au fost spălate cu apă şi uscate pe sulfat de sodiu anhidru. După filtrare şi îndepărtarea solventului, materialul brut a fost cromatografiat (cartuş de siliciu, 0-100 % acetat de etil/heptani) pentru a furniza 2,056 g (83 %) de compus din titlu.

Exemplul 35d

Metoda A:

Un amestec din exemplul 35c, exemplul 1h (0,280 g, 0,810 mmol), 1,3,5,7-tetrametil-6-fenil-2,4,8-trioxa-6-fosfaadamantană (0,021 g, 0,073 mmol), tris(dibenzilidenaceton)dipaladiu(0) (4) (0,017 g, 0,019 mmol), şi fosfat de potasiu (0,331 g, 1,557 mmol) în dioxan (4 mL) şi apă (1 mL) a fost degazat şi umplut înapoi cu azot de şase ori. Amestecul de reacţie a fost încălzit la 60°C timp de 12 ore. Amestecul de reacţie a fost partiţionat între apă şi acetat de etil. Stratul apos a fost extras cu suplimentarea acetatului de etil (3 x 20 mL). Straturile organice combinate au fost spălate cu saramură, uscate pe sulfat de magneziu anhidru, filtrate, şi concentrate. Reziduul a fost purificat prin cromatografie intermitentă pe coloană cu gel de siliciu eluând cu 5 % metanol în acetat de etil. Produsul brut a fost purificat suplimentar prin HPLC preparativă cu fază inversă (C18, CH3CN/apă (0,1 % acid trifluoroacetic), 20-80 % gradient). Fracţiunile dorite au fost combinate şi criodesicate pentru a furniza compusul din titlu (0,14 g, 0,285 mmol, 45,7 % randament). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,20 (s, 1H), 8,32 (t, J = 5,3 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,46 - 7,21 (m, 2H), 6,96 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 6,83 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,29 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 3,58 (s, 3H), 3,24 (dt, J = 12,6, 6,2 Hz, 2H), 2,00 (s, 6H), 1,42 (s, 6H), 1,10 (t, J = 7,2 Hz, 2H). MS (ESI+) m/z 492,2 (M+H)+.

Metoda B:

Etapa 1: Preparare de etil 4-(2-(4-fluoro-2,6-dimetilfenoxi)-5-(2-hidroxipropan-2-il)fenil)-6-metil-7-oxo-1-tosil-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxilat

Un flacon cu trei gâturi a fost încărcat cu o bară de agitare, şi ajustat cu un termocuplu şi condensator de reflux. La flacon s-au adăugat bis(pinacolato)diboron (27,0 g, 106 mmol), tris(dibenzilidenaceton)dipaladiu(0) (605 mg, 0,661 mmol), 1,3,5,7-tetrametil-6-fenil-2,4,8-trioxa-6-fosfaadamantană (465 mg, 1,591 mmol), exemplul 1f preparat prin metoda B (38,832 g, 86 mmol), şi acetat de potasiu (17,67 g, 180 mmol). Flaconul conţinând solidele a fost purjat cu azot timp de 30 minute şi un flacon separat conţinând 350 mL de tetrahidrofuran a fost barbotat timp de 30 minute. După acest timp, cele trei gâturi ale flaconului au fost astupate şi 350 mL de tetrahidrofuran barbotat au fost transferate la solide utilizând o canulă. Amestecul de reacţie a fost apoi agitat şi încălzit la 60°C până când reacţia a fost considerată completă prin HPLC (22 ore). După acest timp, amestecul de reacţie a fost filtrat printr- un strat de diatomee pămȃntoasă, şi colectat într-un flacon cu fund rotund. Tamponul de diatomee pămȃntoasă a fost spălat cu tetrahidrofuran (1 x 50 mL) şi adăugat la reacţie. Amestecul de reacţie a fost apoi barbotat cu azot timp de 30 minute. Într-un flacon separat, fosfatul de potasiu tribazic (52,0 g, 548 mmol) a fost dizolvat în apă (50 mL) şi soluţia a fost barbotată cu azot timp de 30 minute. După acest timp, flaconul conţinând amestecul de reacţie a fost deschis (sub flux scăzut de azot) şi exemplul 35c (28,8 g, 82 mmol) a fost adăugat ca solid. Imediat după adăugare, soluţia de fosfat şi apă a fost adăugată prin canulă. Amestecul de reacţie a fost apoi încălzit la 60°C timp de 2 ore sau până când s-a observat consumul complet din exemplul 35C. Componentele volatile au fost apoi îndepărtate pe un evaporator rotativ. La amestecul rămas s-au adăugat 300 mL de acetat de etil pentru a dizolva complet reziduul brut. Straturile apos şi organic au fost separate, şi stratul apos a fost extras cu acetat de etil (2 x 250 mL). Straturile organice au fost combinate şi spălate cu 5% cisteină/8% bicarbonat de sodiu (2 x 100 mL). Straturile organice şi apoase au fost separate şi componenta organică a fost îndepărtată pe un evaporator rotativ lăsȃnd un solid galben/maro deschis. Solidul a fost dizolvat în metil terţ-butil eter (450 mL) pentru a da o soluţie galbenă şi 900 mL de heptan au fost adăugaţi pentru a promova precipitarea. Solidul alburiu a fost filtrat şi spălat repede cu 200 mL de heptan. Filtratul a fost concentrat până când precipitarea a început din nou. Solidul a fost din nou filtrat şi spălat. O cantitate finală de solvent a fost îndepărtată din al doilea filtrat, şi a început să se formeze un precipitat. Răcirea filtratului, urmată de filtrarea şi spălarea solidului cu heptan, a dat al treilea şi lotul final al compusului din titlu (41,69 g, 75%).

Etapa 2: Preparare de acid 4-(2-(4-fluoro-2,6-dimetilfenoxi)-5-(2-hidroxipropan-2-il)fenil)-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxilic

O fiolă de 24 mL dram a fost încărcată cu o bară de agitare şi etil 4-(2-(4-fluoro-2,6-dimetilfenoxi)-5-(2-hidroxipropan-2-il)fenil)-6-metil-7-oxo-1-tosil-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxilat (140 mg, 0,216 mmol). Solidul a fost dizolvat în 3 mL de tetrahidrofuran şi s-a adăugat hidroxid de potasiu apos (4,45 M, 0,60 mL, 2,67 mmol). Amestecul a fost agitat la 60°C timp de 22 ore. La fiolă s-au adăugat 10 mL de acetat de etil. Amestecul de reacţie a fost transferat la o pâlnie separatoare şi agitat. Straturile organice şi apoase au fost separate. Stratul apos a fost extras cu acetat de etil suplimentar (2 x 10 mL). Stratul apos a fost apoi ajustat la pH = 3 utilizând 1 M HCl, şi extras cu acetat de etil (3 x 10 mL). Fracţiunile de acetat de etil colectate după ajustarea pH-ului au fost combinate şi distilate din reacţie utilizând un evaporator rotativ pentru a furniza compusul din titlu (80 mg, randament 80%).

Etapa 3: Preparare de N-etil-4-[2-(4-fluoro-2,6-dimetilfenoxi)-5-(2-hidroxipropan-2-il)fenil]-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamidă

Un flacon de 50 mL cu fund rotund a fost încărcat cu o bară de agitare şi acid 4-(2-(4-fluoro-2,6-dimetilfenoxi)-5-(2-hidroxipropan-2-il)fenil)-6-metil-7 -oxo-6, 7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxilic (80 mg, 0,388 mmol). Flaconul a fost spălat cu azot, şi s-au adăugat 3,8 mL de anhidru N,N-dimetilforamidă. Soluţia galben deschisă a fost agitată ca HATU (1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinium 3-oxid hexafluorofosfat,166 mg, 0,437 mmol) a fost adăugat într-o porţie ca solid. Amestecul de reacţie galben strălucitor a fost agitat timp de 10 minute. După acest timp, s-a adăugat etanamină (0,40 ml, 0,800 mmol) şi amestecul de reacţie a fost agitat încă 20 minute suplimentare înainte de a se adăuga diizopropiletilamină (0,20 ml, 1,145 mmol). După 12 ore, s-au adăugat 20 mL de apă la amestecul de reacţie determinând precipitarea produsului ca solid alb. Solidul a fost spălat repede cu apă suplimentară (2 x 10 mL) şi uscat pentru a furniza compusul din titlu (70 mg, randament 83%).

Exemple biologice

Test de legare a domeniului bromodomeniu

Un test de transfer de energie cu rezonanţă fluorescentă rezolvat în timp (TR-FRET) a fost utilizat pentru a determina afinităţile compuşilor din exemplele listate în Tabelul 1 pentru fiecare bromodomeniu al BRD4. Brodomeniile prim etichetat His (BDI: aminoacizii K57-E168) şi al doilea (BDII: aminoacizii E352- M457) ale BRD4 au fost exprimate şi purificate. Un inhibitor BET etichetat Alexa647 a fost utilizat ca sondă fluorescentă în test.

Sinteza compusului inhibitor al bromodomeniului etichetat Alexa647 al acidului 2-((6S,Z)-4-(4-clorofenil)-2,3,9-trimetil-6H-tieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-il)acetic.

Metil 2-((6S,Z)-4-(4-clorofenil)-2,3,9-trimetil-6H-tieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-il)acetatul (vezi de exemplu, WO 2006129623)(100,95 mg, 0,243 mmol a fost suspendat în 1 mL metanol la care a fost adăugată o soluţie proaspăt preparată de hidroxid monohidrat de litiu (0,973 mL, 0,5 M, 0,487 mmol) şi agitată la temperatura ambiantă timp de 3 ore. Metanolul s-a evaporat şi pH-ul a fost ajustat cu acid clorhidric apos (1 M, 0,5 mL, 0,5 mmol) şi extras de patru ori cu acetat de etil. Straturile combinate de acetat de etil au fost uscate pe sulfat de magneziu şi evaporate pentru a da acidul 2-((6S,Z)-4-(4-clorofenil)-2,3,9-trimetil-6H-tieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-il)acetic (85,3 mg, 87,0%); ESI-MS m/z = 401,1 [(M+H)+] care a fost utilizat direct în reacţia următoare.

N-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)-2-((6S,Z)-4-(4-clorofenil)-2,3,9-trimetil-6H-tieno[3,2f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-il)acetamidă bis(2,2,2-trifluoroacetat).

Acidul 2-((6S,Z)-4-(4-clorofenil)-2,3,9-trimetil-6H-tieno[3,2f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-il)acetic)(85,3 mg, 0,213 mmol) combinat cu 2,2'-(etan-1,2-diilbis(oxi))dietanamină (Sigma-Aldrich, 0,315 mg, 2,13 mmol) a fost combinat în 5 mL dimetilformamidă anhidră. (1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1 -iloxi)tripirolidin-1 - ylfosfonium hexafluorofosfat(V) (PyBOB, CSBio, Menlo Park CA; 332 mg, 0,638 mmol) a fost adăugat şi reacţia a fost agitată la temperatura ambiantă timp de 16 ore. Reacţia a fost diluată până la 6 mL cu dimetilsulfoxid:apă (9:1, v:v) şi purificată în două injecţii cu o coloană de colectare în timp Waters Deltapak C18 200 x 25 mm, eluată cu un gradient de 0,1% acid trifluoroacetic (v/v) în apă şi acetonitril. Fracţiunile conţinând cele două produse purificate au fost liofilizate pentru a da N-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)-2-((6S,Z)-4-(4-clorofenil)-2,3,9-trimetil-6H-tieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-il)acetamidă bis(2,2,2-trifluoroacetat) (134,4 mg, 82,3%); ESI-MS m/z = 531,1 [(M+H)+]; 529,1 [(M-H)-] şi (S,Z)-N,N'-(2,2'-(etan-1,2-diilbis(oxi))bis(etan-2,1-diil))bis(2-((6S,Z)-4-(4-clorofenil)-2,3,9-trimetil-6H-tieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-il)acetamidă) bis(2,2,2-trifluoroacetat) (3,0 mg, 1,5%); ESI-MS m/z = 913,2 [(M+H)+]; 911,0 [(M-H)-].

N-(2-(2-(2-amido-(Alexa647)-etoxi)etoxi)etil)-2-((6S,Z)-4-(4-clorofenil)-2,3,9-trimetil-6H-tieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-il)acetamidă(2,2,2-trifluoroacetat).

N-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)-2-((6S,Z)-4-(4-clorofenil)-2,3,9-trimetil-6H-tieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-il)acetamidă bis(2,2,2-trifluoroacetat) (5,4 mg, 0,0071 mmol) combinată cu acid carboxilic Alexa Fluor® 647, ester succinimidil (Life Technologies, Grand Island, NY; 3 mg, 0,0024 mmol) a fost combinată în 1 mL dimetilsulfoxid anhidru conţinând diizopropiletilamină (1% v/v) şi agitată la temperatura ambiantă timp de 16 ore. Reacţia a fost diluată până la 3 mL cu dimetilsulfoxid:apă (9:1, v:v) şi purificată într-o injecţie cu o coloană de colectare în timp Waters Deltapak C18 200 x 25 mm, eluată cu un gradient de 0,1% acid trifluoroacetic (v/v) în apă şi acetonitril. Fracţiunile conţinând produsul purificat au fost liofilizate pentru a da N-(2-(2-(2-amido-(Alexa647)-etoxi)etoxi)etil)-2-((6S,Z)-4-(4-clorofenil)-2,3,9-trimetil-6H-tieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-il)acetamidă(2,2,2-trifluoroacetat) (1,8 mg); MALDI-MS m/z = 1371,1, 1373,1 [(M+H)+] ca pulbere albastră închisă.

Test

Seriile de diluţii ale compuşilor au fost preparate în DMSO printr-o diluţie serială de aproximativ 3 ori. Diluţiile compuşilor au fost adăugate direct în plăci de testare albe, de volum scăzut (Perkin Elmer Proxiplate 384 Plus# 6008280) utilizând Labcyte Echo în conjuncţie cu Labcyte Acces şi Thermo Multidrop CombinL robotics. Compuşii au fost apoi suspendaţi în opt microlitri (µL) de tampon de testare (20 mM fosfat de sodiu, pH 6,0, 50 mM NaCl, 1 mM dihidrat de sare de disodiu a acidului etilendiaminotetraacetic, 0,01% Triton X-100, 1 mM DL-Ditiotreitol) conţinând bromodomeniul etichetat His, anticorpul anti-His conjugat Europiu (Invitrogen PV5596) şi sonda conjugată Alexa-647.

Concentraţia finală de amestec de test IX a conţinut 2% DMSO, 12 nM BRD4 etichetat His (BDI_K57-E168) şi 100 nM sondă sau 4 nM BRD4 etichetat His (BDII_E352-M457) şi 30 nM sondă, şi 1 nM anticorp etichetat anti-His conjugat Europiu, şi concentraţii de compus în intervalul: 49,02 µM-0,61 nM sau 0,98 µM - 0,15 nM.

După o oră de echilibrare la temperatura camerei, rapoartele TR-FRET au fost determinate utilizând un cititor de placă multietichetă Envision (Ex 340, Em 495/520).

Datele TR-FRET au fost normalizate la mijloacele celor 24 de controale fără compus („ridicate«) şi cele 8 controale conţinând 1 µM de sondă neetichetată („scăzute«). Procentele de inhibare au fost reprezentate grafic ca funcţie de concentraţia compusului şi datele au fost ajustate cu ecuaţia logistică cu 4 parametri pentru a obţine IC50S. Constantele de inhibare (Ki) au fost calculate din IC50S, sonda Kd şi concentraţia sondei.

Valorile Ki medii sunt raportate în Tabelul 1.

Tabelul 1

Exemplu # Ki de legare TR-FRET: BRD4 (BDI_K57-E168) (µM) Ki de legare TR-FRET: BRD4 (BDII_E352-M457) (µM) 32 0,599 0,0028 35 0,426 0,0014 Compus X 0,00209 0,000952 Compus Y 0,0216 0,00132 Compus Z 0,0699 0,0155

Compusul X este N-[4-(2,4-difluorofenoxi)-3-(6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-4-il)fenil]etansulfonamidă;

Compusul Y este 4-[2-(2,4-difluorofenoxi)-5-(metilsulfonil)fenil]-N-etil-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamidă; şi

Compusul Z este 4-[5-(hidroximetil)-2-fenoxifenil]-6-metil-1,6-dihidro-7H-pirolo[2,3-c]piridin-7-onă.

Toţi compuşii testaţi au fost găsiţi ca având selectivitate pentru BRD4 BDII faţă de BRD4 BDI în testul TR-FRET descris mai sus, şi sunt cel puţin de 10 ori selectivi pentru BRD4 BDII faţă de BRD4 BDI. Într-o realizare, compuşii prezenţi sunt aproximativ de la 50 până la aproximativ 100 de ori selectivi pentru BRD4 BDII faţă de BRD4 BDI. Într-o realizare, compuşii prezenţi sunt aproximativ de la 100 până la aproximativ 200 de ori selectivi pentru BRD4 BDII faţă de BRD4 BDI. Într-o realizare, compuşii prezenţi sunt cel puţin de aproximativ 200 de ori selectivi pentru BRD4 BDII faţă de BRD4 BDI.

Testul de inhibare al creşterii tumorale xenogrefă

Au fost evaluate efectele compusului din exemplele 32, 35 şi compusului X pentru inhibarea creşterii de tumori xenogrefe SKM-1_FP1 şi LNCaP-FGC. Şorecii SCID Beige femele (Charles River) au fost utilizaţi pentru modelul lateral SKM-1_FP1 de xenogrefă. Şorecii NSG masculi (JAX Labs) au fost utilizaţi pentru studiul LNCaP-FGC. Celulele au fost suspendate în PBS, amestecate cu Matrigel (fenol roşu liber, Becton Dickinson Biosciences Discovery Labware) într-un raport de 1:4 (V/V) şi inoculaţi subcutanat în partea laterală (cinci milioane de celule pe situs) a şoarecilor. Şoarecii inoculaţi au fost repartizaţi aleator în grupuri şi tratamentul a fost iniţiat când volumul tumoral mediu a fost de 0,2-0,25 cm3. Compuşii au fost administraţi oral în (volum %): 1,5% DMSO, 30% PEG 400, şi 68,5% Phosol 53 MCT. Creşterea tumorii în partea laterală a fost evaluată prin măsurarea dimensiunii tumorii cu şublere şi calcularea volumului utilizând formula (L Ч W2/2). Grupurile de studiu au fost oprite înainte ca volumul tumoral să ajungă la 3 cm3. Inhibarea creşterii tumorii a fost evaluată în momentul încheierii grupului tratat cu vehicul prin calcularea raportului dintre volumul mediu al grupului cu medicamente de test şi volumul mediu al grupului (de control) netratat (T/C) şi calcularea inhibării procentuale a creşterii tumorale (%TGI). %TGI = ((1-T/C) Ч 100). Rezultatele sunt raportate în Tabelul 2.

Marginile de eficacitate şi expunere ale inhibitorilor BET selectivi BDII

Eficacitatea în AML (leucemie mieloidă acută) şi cancerul la prostată a fost studiată cu doi compuşi inhibitori BET selectivi BDII (Exemplul 35 şi Exemplul 32), şi un pan inhibitor BET (Compus X), la xenogrefa SKM-1 (AML) de şoarece şi LNCaP (prostată) (Tabelul 2).

Studiile toxicologice de paisprezece zile pe şobolani au fost efectuate cu Exemplul 35, Exemplul 32, şi Compusul X, şi expunerile tolerate maxime au fost determinate pe baza observaţiilor în-viaţă incluzând semnele clinice, greutatea corporală, şi consumul de alimente. Compuşii au fost dozaţi oral o dată zilnic, la şobolanii Sprague-Dawley. Marginile de expunere calculate din expunerile tolerate la şobolan faţă de expunerile eficace în modelele de xenogrefe la şoarece sunt raportate în Tabelul 2.

Tabelul 2

Rezultatele eficacităţii la şoarece din studiile de xenogrefă Expunerea tolerată maximă la şobolan Raport AUC (expunere tolerată maximă la şobolan/expunerea eficace la şoarece) Exemplu AML (SKM-1) Prostată (LNCaP) AUC (ug∗ore/ml) (doză) AML (SKM-1) Prostată (LNCaP) AUC (µg∗ore/mL) Doză (mg/kg) %TGI AUC (ug∗ore /mL) Doză (mg/kg) %TGI Ex. 35 0,84 4,7 74 1,1 4,7 64 27,5 (30 mg/kg) 32x 25x Ex. 32 5 9,4 76 12,6 30 60 69,2 (30 mg/kg) 14x 5,5x Compus X 1,2 1 76 1,2 1 64 0,725 (1 mg/kg) 0,6x 0,6x

Claims

1. N-etil-4-[2-(4-fluoro-2,6-dimetilfenoxi)-5-(2-hidroxipropan-2-il)fenil]-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamidă, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

2. N-etil-4-[2-(4-fluoro-2,6-dimetilfenoxi)-5-(2-hidroxipropan-2-il)fenil]-6-metil-7-oxo-6,7-dihidro-1H-pirolo[2,3-c]piridin-2-carboxamidă.