CN115611890B - 一种新型噻吩类bet溴结构域抑制剂、其制备方法及医药用途 - Google Patents

一种新型噻吩类bet溴结构域抑制剂、其制备方法及医药用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供式(I)化合物、其药用盐及其制备方法和医药用途。该化合物在治疗疾病和病症中可用作药剂，所述疾病和病症包括癌症、炎性、自身免疫性疾病等。

Description

一种新型噻吩类BET溴结构域抑制剂、其制备方法及医药用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种新型噻吩类BET溴结构域抑制剂、其制备方法及医药用途。
背景技术
组蛋白乙酰化是表观遗传研究的重要组成部分，乙酰化的组蛋白可通过 DNA聚合酶与RNA聚合酶及转录因子作用，激活基因转录。溴结构域和超末端结构域(BET)家族属于溴结构域蛋白家族(bromodomain proteins，BRDs)，是一类进化上高度保守的蛋白，其可识别并结合组蛋白尾部的乙酰化赖氨酸残基，招募染色质调节相关蛋白、转录因子、染色质重塑因子等，从而在调控基因转录和染色质重塑中发挥重要作用，其与细胞生长、增殖分化、凋亡坏死等多种生物学过程相关，是重要的表观遗传“阅读器”。
目前为止，已发现人体基因组共编码61种溴结构域，分布在46种不同的蛋白质中。BRDs家族由BRD2、BRD3、BRD4、BRDT 4个亚型组成，它们均含有2个两个串联溴结构域(BD1、BD2)和一个超末端(ET)结构域。两个溴结构域主要负责识别并结合乙酰化赖氨酸残基，ET结构域则与辅助因子相互作用。BET蛋白的异常表达与多种疾病关联，虽然BET家族的4个成员具有相似的结构，但其生物学功能仍存在差异，尤其是BRD4与癌症和炎症等多种疾病密切相关[Jung M,et al.,Epigenomics，2015，7(3)：487-501.]。
靶向BET蛋白对于发展靶向癌症，炎症和病毒的新的治疗策略是有益的。目前已有针对BET蛋白的小分子抑制剂进入临床前和临床研究阶段，其主要用于癌症及自身免疫疾病的治疗。例如：Picaud等人(Picaud S，et al.,Nature，2010， 468(7327)：1067-1073.)于2010年开发的BET小分子抑制剂JQ1，相关生物学实验表明，JQ1对癌症、心血管疾病、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染及炎症等疾病具有潜在的治疗价值；GSK公司报道(WO2011054553A)BET小分子抑制剂I-BET762(GSK525762，Nicodeme E，et al.,Nature，2010，468，7327)：在抗炎及抗癌方面作用明显，现已进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验阶段；Resverlogix Corp公司开发的RVX-208(McLure KG,et al.,PLoS One，2013，8，12：e83190.)是选择性作用于BD2的喹唑啉酮类抑制剂，临床数据表明，其对冠状动脉综合征、动脉粥样硬化和糖尿病等疾病疗效显著,目前已进入Ⅲ期临床试验；OncoEthix 公司开发的OTX015(Brand M.et al.,ACS ChemBiol，2015，10(1)：22-39.)，可作用于儿童与青年睾丸核蛋白(NUT)中线癌(NMC)、前列腺癌等实体瘤，现已进入Ⅱ期临床试验。Incyte公司在CN106414442A专利中公开了化合物INCB-057643，处于I期临床试验阶段；Abbive公司在WO2017177955A1中公开了一类选择性BET蛋白抑制剂，其中化合物ABBV-744在临床前研究中表现出更好的安全性，目前处于I期临床试验阶段。
综上所述，BET蛋白抑制剂作为药物研发具有很好的应用前景，开发新型高效低毒的BET蛋白抑制剂存在持续的临床需求。
发明内容
本发明提供了一种BET蛋白抑制剂，具有式(I)的化合物：
其中：
R1为氢或C1-C6烷基；
R2为氢、-C(O)Rx、-C(O)ORx、-C(O)NHRx、-C(O)NRx1Ry1或-S(O)2NRx1Ry1；
R3、R4和R5分别独立地选自氢、卤素、氰基、羟基、氨基、硝基、C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C3烷氧基或C1-C3卤代烷基；
Rx、Ry分别独立选自氢、C1-C6烷基或C3-C6环烷基；
Rx1、Ry1独立选自氢、C1-C6烷基、C1-C6杂烷基，或者Rx1、Ry1与N原子连接成3～8元环。
在某些优选的实施方案中，R1为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基或环丙基。
在某些优选的实施方案中，R2为氢、-C(O)OCH3、-C(O)OCH2CH3、 -C(O)NHCH3、-C(O)NHCH2CH3、-C(O)N(CH3)2、-C(O)N(CH2CH3)2或
在某些优选的实施方案中，R3、R4和R5分别独立地选自氢、氟、氯、溴、碘、氰基、羟基、氨基、甲基、乙基、异丙基、环丙基、甲氧基、乙氧基或三氟甲基。
在某些优选的实施方案中，所述化合物选自：
在另一方面，本申请还提供了通式(I)化合物的制备方法，包括但不限于以下步骤：
或者
式(Ia)化合物和式(Ib)化合物、或者式(Ic)化合物和式(Id)化合物，经催化偶联反应制得式(I)化合物，各基团定义如权利要求1～4任一项所述，X选自Cl、 Br或I。
在另一个方面，本申请还提供了中间体式(Ib)：
其中各基团定义如前述，X选自CI、Br或I。
在另一个方面，本申请还提供了中间体式(Id)：
其中各基团定义如前述。
在另一个方面，本申请还涉及前述通式(I)化合物在制备预防或治疗与BET 蛋白相关疾病的药物中的用途。
在某些实施方案中，所述与BET蛋白相关疾病包括但不限于肿瘤疾病、炎性疾病、自身免疫疾病、病毒感染。
在某些实施方案中，所述肿瘤疾病包括但不限于肿瘤疾病包括非实体瘤、实体瘤，例如急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(包括单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、髓单核细胞性白血病和早幼粒细胞性白血病)、急性T-细胞白血病、B细胞急性淋巴白血病、血管肉瘤、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、支气管癌、前列腺癌、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、慢性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病和慢性粒细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌。
本发明提供的如化合物(I)所示结构的BET蛋白抑制剂，其具有较好的 BET蛋白抑制活性及良好的药代动力学性质和安全性，为新一代高效低毒的BET 蛋白抑制剂。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
定义和一般性说明
除非另有说明，本申请中所用的术语具有下列含义。一个特定的术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域普通的含义去理解。
本申请中的某些结构单元或者基团中的共价键未与具体的原子连接时，表示该共价键可以与该结构单元或者基团中的任意原子连接，只要不违背价键连接规则。
“烷基”指仅由碳原子和氢原子组成的饱和烃基，碳碳之间、碳氢之间均为单键相连，烷基基团可以是直链或支链的。代表性的支链烷基基团具有一个、两个或三个支链。烷基基团可任选地被一个或多个如本文所定义的取代基取代。例如 C1-C6烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基及其全部异构体。烷基也可以是其他基团的一部分，所述其他基团可以是烷氧基((C1-C6烷基)-O-)等。
“杂烷基”指包含至少一个杂原子烷基；其中杂原子指氮原子、氧原子、硫原子等。。
“卤素”指氟、氯、溴或碘。
“硝基”指-NO2。
“环烷基”指仅由碳原子和氢原子两种原子组成的成环饱和烃基
“烷氧基”指环烷基-O-。
“卤代烷基”指被一个或多个、优选1-3个(例如1个、2个或3个)卤素原子取代的如上定义的烷基。卤代烷基包括单卤代烷基、二卤代烷基、全卤代烷基等，如氯代甲基、二氯甲基、二氟甲基、二溴甲基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、全氟乙基、2,2,2-三氟-1,1-二氯乙基等。
在本文中，除非另有说明，使用的术语“Cm-Cn”是指由该术语修饰的该部分中具有m-n个碳原子(n大于m，且二者为整数)。例如，C1-C6表示其修饰的部分中具有1-6个碳原子，例如1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、 5个碳原子或6个碳原子。
在本申请中，当化学名称和结构式不一致时，应当以结构式所示为准，除非如上下文可以推断化学名称而非结构式是正确的。
化合物的结构是通过质谱(MS)或核磁共振(1HNMR)来确定的。
核磁共振氢谱(1HNMR)的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲亚砜(DMSO)，内标为四甲基硅烷(TMS)，化学位移是以百万分之一10-6(ppm)作为单位给出。
质谱(MS)的测定用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Therm，型号：FinniganLCQ advantage MAX)进行。
薄层硅胶使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板。
柱层析一般使用烟台黄海硅胶200-300目硅胶为载体。
在本发明的术语，“氮气保护”是指例如将反应瓶连接一个1L容积的氮气气球。
在本发明未给出特殊说明的情况下，本发明反应中提及的溶液是水溶液。
在本发明的术语“室温”是指温度处于10℃-25℃之间。
一般反应流程1
Scheme 1
通式(I)化合物的实施方式可根据一般反应流程1(Scheme 1)制备，其中R1～ R5及X如上文中所定义，X选自Cl、Br或I。如一般反应流程1所示，中间体(Ia) 的硼酸酯或硼酸(参照WO2017177955A1中描述的方法合成)和片段(Ib)的溴化物或其它卤代物，经Suzuki偶联条件(N.Miyama and A.Suzuki,Chem.Rev.1995, 95:2457-2483,J.Organomet.Chem.1999,576:147-148)得到式(I)化合物。
一般反应流程2
Scheme 2
或者，通式(I)化合物还可根据一般反应流程2(Scheme 2)制备，其中R1～R5及X如上文中所定义，X选自Cl、Br或I。如一般反应流程2所示，中间体(Ic) 的溴化物或其它卤代物(参照WO2017177955A1中描述的方法合成)和片段(Id) 的硼酸酯或硼酸，经Suzuki偶联条件(N.Miyama and A.Suzuki,Chem.Rev.1995, 95:2457-2483,J.Organomet.Chem.1999,576:147-148)得到式(I)化合物。
中间体的合成(Ia-1)，路线为：
步骤1:2-(5-溴-2-甲氧基-3-硝基吡啶-4-基)-N,N-二甲基甲叉基-2-胺(Ia-1-1)
5000mL三口瓶中加入5-溴-2-甲氧基-4-甲基-3-硝基吡啶(308.2g,1.22mol)，加DMF(1500mL)搅拌溶解，冰浴冷却至0℃，氮气保护下，分批加入甲醇钠(33.7g, 0.61mol)，加毕，升温至90℃毕搅拌反应半小时。待反应液自然降温至80℃以下，分批加入N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(891.9g,7.62mol)，升温保持90℃反应1 小时。TLC监测反应进程(PE/EA＝10/1)，原料反应完全，将反应液冷却至室温后，倾入冰水中(1L)，收集析出固体产物，水洗(1000mL*3)，50℃减压烘干得中间体Ia-1-1(302.4g,收率80.2％)，ESI-MS m/z:302/304[M+H]+。
步骤2:4-溴-7-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶(Ia-1-2)
5000mL三口瓶中加入前述中间体Ia-1-1(301.6g,0.98mol)，加AcOH(1200 mL)搅拌充分，冰浴冷却至0℃，氮气保护下，分批加入还原铁粉(307.6g,5.38mol)，加毕，升温至105℃，搅拌反应4小时。待原料反应完全，加适量乙酸乙酯稀释反应液，加饱和盐水洗涤、萃取，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化，处理得中间体Ia-1-2(201.3g,收率88.8％)，ESI-MS m/z:227/229[M+H]+。
步骤3:4-溴-7-甲氧基-1-对甲苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶(Ia-1-3)
3000mL三口瓶中加入前述中间体Ia-1-2(200.0g,0.86mol)，加THF(1000mL) 搅拌充分，冰浴冷却至0℃，氮气保护下，分批加入钠氢(60％,51.8g,1.30mol)，加毕，保持冰浴冷却，继续搅拌反应30分钟，继之，加入对甲苯磺酰氯(200.8g, 1.04mol)，自然升至室温搅拌反应1小时。TLC监测反应进程，待原料反应完全，将反应液冷却至室温，加入冰氯化铵溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取，加饱和盐水洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化，处理得中间体Ia-1-3(257.3g,收率76.6％)，ESI-MS m/z:381/383[M+H]+。
步骤4:4-溴-7-甲氧基-1-对甲苯磺酰基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-甲酸丙酯(Ia-1-4)
2000mL三口瓶中加入前述中间体Ia-1-3(238.3g,0.61mol)，加THF(800mL) 搅拌溶解，干冰浴冷却至-60℃以下，氮气保护，分批滴加LDA的THF溶液(2M, 460mL,0.92mol)，加毕，保持干冰浴冷却，继续搅拌反应1小时，继之，加入氯甲酸丙酯(115.2g,0.92mol)，搅拌反应2小时。TLC监测反应进程，待原料反应完全，滴加饱和氯化铵溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取，加饱和盐水洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化，处理得中间体Ia-1-4(243.0g,收率83.2％)，ESI-MS m/z:467/469[M+H]+。
步骤5:4-溴-7-氧代-1-对甲苯磺酰基-6,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-甲酸丙酯(Ia-1-5)
2000mL三口瓶中加入前述中间体Ia-1-4(239.2g,0.50mol)，加入乙腈溶剂(1000mL)搅拌溶解，冰浴冷却至-5℃以下，氮气保护，分批加碘化钠(115.2g, 0.75mol)、Me3Si-Cl(83.5g,0.75mol)，加毕，自然升至室温继续搅拌反应1小时，升温至60℃搅拌反应1小时。TLC监测反应进程，待原料反应完全，加入硫代硫酸钠溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取，加饱和盐水洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化，处理得中间体Ia-1-5(196.8 g,收率84.8％)，ESI-MS m/z:453/455[M+H]+。
步骤6:4-溴--6-甲基-7-氧代-1-对甲苯磺酰基--6,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-甲酸丙酯(Ia-1-6)
2000mL三口瓶中加入前述中间体Ia-1-5(193.4g,0.42mol)，加DMF(1000mL) 搅拌溶解，室温下加入Cs2CO3(209.1g,0.63mol)，预搅拌10分钟，冰浴冷却至0℃以下，分批加入碘甲烷(72.9g,0.50mol)，自然升至室温继续搅拌反应3小时。TLC 监测反应进程，待原料反应完全，加乙酸乙酯萃取，饱和盐水洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化，处理得中间体Ia-1-6(174.6g,收率87.6％)，ESI-MS:m/z＝467/469(M+H)+；
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ8.29(d,J＝8.4Hz,1H),7.95(m,2H),7.52(d, J＝8.0Hz,2H),7.04(s,1H),4.31(t,J＝6.4Hz,2H),3.45(s,3H),2.43(s,3H),1.79–1.70(m,2H),0.97(t,J＝7.2Hz,3H)。
步骤7:4-溴-6-甲基-7-氧代-6,7-二氢-1H-吡咯[2,3-c]嘧啶-2-甲酸(Ia-1-7)
2000mL三口瓶中加入前述中间体Ia-1-6(172.0g,0.36mol)，加甲醇/水(3:1) 混合溶剂(1000mL)搅拌溶解，室温下加入LiOH(16.5g,0.90mol)，室温继续搅拌反应6小时。TLC监测反应进程，待原料反应完全，回收甲醇，剩余反应液加乙酸乙酯萃取，饱和盐水洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化，处理得中间体Ia-1-7(91.3g,收率91.5％)，ESI-MS: m/z＝271/273(M+H)+；
步骤8:4-溴-N-乙基-6-甲基-7-氧代--6,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(Ia-1-8)
2000mL三口瓶中加入前述中间体Ia-1-7(90.7g,0.33mol)，加乙腈溶剂(400mL)搅拌溶解，室温下加入缩合剂EDCI(128.8g,0.66mol)、HOBt(67.5g,0.50mol)乙胺溶液，室温搅拌反应8小时。TLC监测反应进程，待原料反应完全，冷至室温，加水、乙酸乙酯萃取，加饱和盐水洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化，处理得中间体Ia-1-8(83.4g,收率83.6％)， ESI-MS:m/z＝298/300(M+H)+；
步骤9:N-乙基-6-甲基-7-氧代-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-6,7- 二氢-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(Ia-1)
1000mL三口瓶中加入前述中间体Ic-1(45.6g,0.15mol)、联硼酸频那醇酯(62.4g,0.24mol)、配体Xphos(3.66g,7.5mmol)、醋酸钾(18.08g,0.18mol)，加1,4- 二氧六环溶剂(500mL)搅拌混合均匀，氮气置换3次，氮气流下加入Pd2(dba)3催化剂(7.0g,7.5mmol)，继之，在氮气保护下升温至90℃反应3小时。TLC监测反应进程，待原料反应完全，加乙酸乙酯稀释，水洗萃取，加饱和盐水洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化，处理得中间体Ia-1(43.2g,收率81.6％)，ESI-MS:m/z＝346.2(M+H)+；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.12(s,1H),9.39(br-s,1H),7.60(s,1H), 7.05(s,1H),3.51(s,3H),3.29-3.25(m,2H),1.31(s,12H),1.13(t,J＝3.2Hz,3H). 实施例1N-乙基-4-(3-(4-氟-2,6-二甲基苯氧基)-5-(2-羟基-2-甲基丙基)噻吩-2- 基)-6-甲基-7-氧代-6,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(1)
合成路线：
步骤1:甲基4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼烷-2-基)噻吩-2-甲酸酯(1-1)
500mL三口瓶中加入4-溴噻吩-2-甲酸甲酯(80.3g,358mmol)，溶于1,4- 二氧六环(50mL)，氮气保护下，于室温加入联硼酸频那醇酯194.6g,751mmol) and KOAc(143.0g,1.43mol)、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(16.02g, 21.4mmol)，氮气置换3次，升温至85℃反应8h。反应完成，反应液自然冷却至室温，加水稀释，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化得类白色固体1-1(84.8g，收率86.7％)。ESI-MS:m/z＝269.1(M+H)+
步骤2:5-羧酸甲酯噻吩-3-硼酸(1-2)
2000mL三口瓶中加入上一步反应中间体1-1(82.3g,300mmol)，溶于丙酮/水混合物(1:1，800mL)。冰浴冷却至0℃以下，依次加入NH4OAc(118.4g, 1.50mol)、NaIO4(328.4g,1.50mol)，搅拌10分钟，自然升温至室温反应约4h。待反应完成，加水稀释，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂得粗品1-2(37.6g，收率65.8％)。ESI-MS:m/z＝187.1(M+H)+
步骤3:4-羟基噻吩-2-甲酸甲酯(1-3)
1000mL三口瓶中加入上一步反应中间体1-2(37.5g,197.6mmol)，溶于THF(400mL)，冰浴冷却至0℃以下，1分钟内恒速滴加50％双氧水溶液(68.4g,988 mmol)，自然升温至室温反应约3h。再次将反应液冷却至0℃以下，滴加饱和 Na2S2O3溶液淬灭反应,乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化得粉红色固体1-3(19.8g，收率62.2％)。ESI-MS:m/z＝159.1(M+H)+.
步骤4:甲基4-(2,6-二甲基-4-硝基苯氧基)噻吩-2-甲酸酯(1-4)
500mL三口瓶中加入上一步反应中间体1-3(16.1g,99.8mmol)，溶于乙腈(150mL)，室温搅拌下，依次加入2-氟-1,3-二甲基-5-硝基苯(20.7g,119.8mmol)和 Cs2CO3(66.4g,199.7mmol)，升温至85℃反应10h。待反应完成，反应液自然冷却至室温，加水稀释，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化得类白色固体1-4(17.8g，收率56.9％)。ESI-MS:m/z＝308.4(M+H)+；
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ8.13(s,2H),7.48(d,J＝4.0Hz,1H),6.89(d, J＝4.0Hz,1H),3.81(s,3H),2.22(s,6H).
步骤5:methyl 4-(4-amino-2,6-dimethylphenoxy)thiophene-2-carboxylate(1-5)
500mL三口瓶中加入上一步反应中间体1-4(15.3g,48.8mmol)，加入250mL二氯甲烷搅拌溶解，冰浴冷却至0℃以下，加入冰醋酸(30mL,488.0mmol)，继之小心分批加入锌粉(25.9g,390mmol)，保持充分搅拌，自然升至室温继续反应4 h.待反应完成，加入二氯甲烷稀释，硅藻土过滤，滤液再次冷却至0℃以下，加水稀释，饱和NaHCO3溶液调节pH至9～10，补加二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化得浅黄色固体1-5(11.6g，收率84％)。ESI-MS:m/z＝278.0 (M+H)+.
步骤6:4-(4-氟-2,6-二甲基苯氧基)噻吩-2-甲酸甲酯(1-6)
500mL三口瓶中加入上一步反应中间体1-5(11.2g,39.6mmol)，加冰醋酸(150 mL)搅拌均匀，冰浴冷却至0℃以下，分批加入NaNO2(4.18g,59.4mmol)，充分搅拌10分钟，保持冰浴冷却，加入浓度48％的四氟硼酸水溶液(3.9g,43.5mmol)，继续搅拌反应半小时,自然升温至室温，撤去冰浴，转为油浴加热至100℃搅拌反应1h.将反应液再次冷却至0℃以下,小心滴加饱和NaHCO3溶液中和至pH 9～10，加乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化得类白色固体1-6(3.1g，收率27.4％)。ESI-MS:m/z＝281.0(M+H)+.
步骤7:(4-(4-氟-2,6-二甲基苯氧基)噻吩-2-基)甲醇(1-7)
250mL三口瓶中加入上一步反应中间体1-6(3.05g,10.7mmol)，溶于无水四氢呋喃(50mL)，冰浴冷却至0℃以下，恒速滴加浓度2M的氢化铝锂四氢呋喃溶液(10.7ml,21.4mmol)，滴加完毕，继续在氮气保护下，保持0℃反应1.5小时。待反应完成，小心加入冰水淬灭，加乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化得浅黄色油状产物1-7(2.23g，收率81.2％)。ESI-MS:m/z＝253.0(M+H)+.
步骤8:2-(溴甲基)-4-(4-氟-2,6-二甲基苯氧基)噻吩(1-8)
50mL三口瓶中加入上一步反应中间体1-7(2.20g；8.60mmol)，加30mL四氢呋喃溶解，冰浴冷却至0℃以下，恒速滴加三溴化磷(1.6mL；17.1mmol)，加完，保持0℃，继续搅拌反应30分钟,自然升至室温反应3h。待反应完毕，将反应液再次冷却至0℃以下,加入饱和NaHCO3溶液淬灭反应，补加乙酸乙酯稀释、萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，得黄色油状粗品1-8(2.26g，收率82.4％)。ESI-MS: m/z＝315/317(M+H)+.
步骤9:2-(4-(4-氟-2,6-二甲基苯氧基)噻吩-2-基)乙腈(1-9)
150mL三口瓶中加入上一步反应中间体1-8(2.20g,6.87mmol)，溶于60mL乙腈。加入氢氧化锂(0.35g,8.24mmol)搅拌充分，氮气保护、冰浴冷却至0℃以下，滴加入TMSCN(0.83g,8.24mmol)，自然升至室温搅拌反应10h。待反应完成，加水稀释，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂、柱层析纯化得浅黄色油状1-9(1.62 g，收率88.6％)。ESI-MS:m/z＝262.1(M+H)+
步骤10:2-(4-(4-氟-2,6-二甲基苯氧基)噻吩-2-基)乙酸甲酯(1-10)
100mL三口瓶中加入上一步反应中间体1-9(1.60g,6.0mmol)，加25mL甲醇搅拌溶解，室温滴加SOCl2(1.3mL,18.0mmol)，滴加完毕，反应液继续搅拌反应10h,待反应完成，减压回收溶剂，加乙酸乙酯溶解、水洗萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化得黄色油状产物1-10(1.49g，收率82.7％)。ESI-MS:m/z＝295.1 (M+H)+.
步骤11:1-(4-(4-氟-2,6-二甲基苯氧基)噻吩-2-基)-2-甲基丙-2-醇(1-11)
50mL三口瓶中加入上一步反应中间体1-10(0.52g,1.73mmol)，加10mL无水四氢呋喃溶解，冰浴冷却至0℃以下，缓慢滴加甲基溴化镁的四氢呋喃溶液 MeMgBr(3M,3.2mL,9.53mmol)，滴加完毕，自然升至室温搅拌反应2h，再次将反应液冷却至0℃以下，滴加饱和NH4Cl溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化得类白色固体产物1-11(0.37g，收率71.2％)。 ESI-MS:m/z＝295.1(M+H)+.
步骤12:1-(5-溴-4-(4-氟-2,6-二甲基苯氧基)噻吩-2-基)-2-甲基丙-2-醇(1-12)
50mL三口瓶中加入上一步反应中间体1-11(360mg,1.20mmol)，加20mL无水四氢呋喃溶解，氮气流保护下，于-78℃滴加LDA(2.0M in THF,0.90mL)，滴加完毕，保持-60℃搅拌反应15分钟，再次将反应液冷却至-78℃，另取N-溴代丁二酰亚胺(261mg,1.44mmol)溶于2mL无水四氢呋喃，将上述溶液滴加入反应液，搅拌反应1h，自然升至室温搅拌反应12h，待反应完成，再次将反应液冷却至-78℃，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化得棕黄色油状产物1-12(282mg，收率61.9％)。ESI-MS:m/z＝373/375(M+H)+.
步骤13:N-乙基-4-(3-(4-氟-2,6-二甲基苯氧基)-5-(2-羟基-2-甲基丙基)噻吩-2- 基)-6-甲基-7-氧代-6,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(1)
25mL三口瓶中加入上一步反应中间体1-12(102mg,0.27mmol)，加10mL无水四氢呋喃溶解，搅拌下加入中间体Ia-1(104mg,0.295mmol)、Cs2CO3(134mg, 0.40mmol)、Xantphos(15.9mg,0.026mmol)，氮气置换3次，向反应体系中加入 Pd2(dba)3催化剂(12.55mg,0.013mmol)，再次氮气置换，并在氮气保护下加热至65℃回流反应8h。待反应完成，反应液冷至室温,加乙酸乙酯稀释反应液，水洗、合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，制备柱纯化得产物1(36.0mg，收率25.7％)。ESI-MS: m/z＝512.2(M+H)+；
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ12.28(s,1H)，8.43(m,-NH,1H),7.56(s,1H), 7.17(s,1H),7.00-6.98(d,J＝8.0Hz,2H),6.11(s,1H),4.50(s,1H),3.58(s,3H), 3.31–3.26(m,2H),2.73(s,2H),2.12(s,6H),1.16-1.13(m,3H),1.08(s,6H).实施例2N-环丙基-4-(3-(4-氟-2,6-二甲基苯氧基)-5-(2-羟基-2-甲基丙基)噻吩-2- 基)-6-甲基-7-氧代-6,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(2)
实施例2
合成路线：
步骤1:4-溴-N-环丙基-6-甲基-7-氧代-6,7-二氢-1h-吡咯[2,3-c]吡啶-2- 甲酰胺(2-1)
250mL三口瓶中加入前述中间体Ia-1-7(8.94g,33mmol)，加乙腈溶剂(40mL) 搅拌溶解，室温下加入缩合剂EDCI(12.88g,66mmol)、HOBt(6.75g,50mmol)乙胺溶液，室温搅拌反应8小时。TLC监测反应进程，待原料反应完全，冷至室温，加水、乙酸乙酯萃取，加饱和盐水洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化，处理得中间体Ia-1-8(8.42g,收率82.3％)， ESI-MS:m/z＝310/312(M+H)+；
步骤2:N-环丙基-6-甲基-7-氧代-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-6,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(2-2)
100mL三口瓶中加入前述中间体2-1(5g,16.1mmol)、联硼酸频那醇酯(6.54g,25.76mmol)、配体Xphos(766mg,1.61mmol)、醋酸钾(4.73g,48.3mmol)，加1,4-二氧六环溶剂(50mL)搅拌混合均匀，氮气置换3次，氮气流下加入Pd2(dba)3催化剂 (742mg,0.81mmol)，继之，在氮气保护下升温至90℃反应3小时。TLC监测反应进程，待原料反应完全，加乙酸乙酯稀释，水洗萃取，加饱和盐水洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，柱层析纯化，处理得中间体2-2(4.4g,收率76.5％)，ESI-MS:m/z＝358.2(M+H)+；
步骤3:N-环丙基-4-(3-(4-氟-2,6-二甲基苯氧基)-5-(2-羟基-2-甲基丙基)噻吩-2-基)-6-甲基-7-氧代-6,7-二氢-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(2)
25mL三口瓶中加入上一步反应中间体1-12(149.3mg,0.4mmol)，加10mL无水四氢呋喃溶解，搅拌下加入中间体2-2(157.2mg,0.44mmol)、Cs2CO3(195.5mg, 0.6mmol)、X-phos(19mg,0.04mmol)，氮气置换3次，向反应体系中加入Pd2(dba)3催化剂(18.3mg,0.02mmol)，再次氮气置换，并在氮气保护下加热至65℃回流反应8h。待反应完成，反应液冷至室温,加乙酸乙酯稀释反应液，水洗、合并有机相，饱和氯化钠溶液洗涤，有机层加无水硫酸钠干燥过夜，过滤干燥剂，滤液减压回收溶剂，制备柱纯化得产物2(69.3mg，收率33.1％)。ESI-MS:m/z＝524.2 (M+H)+；
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ12.26(s,1H)，8.38(m,-NH,1H),7.58(s,1H), 7.15(s,1H),7.05-6.98(d,J＝8.0Hz,2H),6.14(s,1H),4.56(s,1H),3.55(s,3H),2.71(s,2H),2.65-2.61(m,1H),2.14(s,6H),1.09(s,6H),0.76-0.69(m,2H), 0.62-0.58(m,2H).
实施例3N-乙基–N-异丙基-4-(3-(4-氟-2,6-二甲基苯氧基)-5-(2-羟基-2-甲基丙基)噻吩-2-基)-6-甲基-7-氧代-6,7-二氢-1h-吡咯[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(3)
参考实施例2的合成方法，以乙基异丙胺替换环丙胺，按相同的操作方法，制备目标化合物3。总收率22.31％，ESI-MS:m/z＝554.2(M+H)+；
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ12.24(s,1H)，7.59(s,1H),7.12(s,1H),7.04-6.98 (d,J＝8.0Hz,2H),6.15(s,1H),4.55(s,1H),3.81–3.78(m,1H),3.53(s,3H),3.31–3.28(m,2H),2.78(s,2H),2.15(s,6H),1.16-1.07(m,15H).
实施例4N-乙基–N-甲基-4-(3-(4-氟-2,6-二甲基苯氧基)-5-(2-羟基-2-甲基丙基)噻吩-2-基)-6-甲基-7-氧代-6,7-二氢-1h-吡咯[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(4)
参考实施例2的合成方法，以N，N-乙基甲基胺替换环丙胺，按相同的操作方法，制备目标化合物4。总收率18.65％，ESI-MS:m/z＝526.2(M+H)+；
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ12.27(s,1H),7.55(s,1H),7.19(s,1H),7.01-6.98(d,J＝8.0Hz,2H),6.10(s,1H),4.52(s,1H),3.59(s,3H),3.42(s,3H),3.30–3.26(m,2H),2.74(s,2H),2.11(s,6H),1.16-1.12(m,3H),1.06(s,6H).
实施例5N，N-二乙基-4-(3-(4-氟-2,6-二甲基苯氧基)-5-(2-羟基-2-甲基丙基)噻吩-2-基)-6-甲基-7-氧代-6,7-二氢-1h-吡咯[2,3-c]吡啶-2-甲酰胺(5)
参考实施例2的合成方法，以二乙胺替换环丙胺，按相同的操作方法，制备目标化合物5。总收率18.65％，ESI-MS:m/z＝540.2(M+H)+；
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ12.29(s,1H),7.50(s,1H),7.15(s,1H),7.02-6.98(d,J＝8.0Hz,2H),6.13(s,1H),4.58(s,1H),3.64(s,3H),3.30–3.22(m,4H),2.77(s,2H),2.11(s,6H),1.17-1.10(m,6H),1.05(s,6H).
实施例6 4-(3-(4-氟-2,6-二甲基苯氧基)-5-(2-羟基-2-甲基丙基)噻吩-2-基)-6- 甲基-2-(吡咯烷-1-羰基)-1,6-二氢-7h-吡咯[2,3-c]吡啶-7-酮(6)
参考实施例2的合成方法，以吡咯烷替换环丙胺，按相同的操作方法，制备目标化合物6。总收率24.86％，ESI-MS:m/z＝538.2(M+H)+；1H NMR(400MHz, d6-DMSO)δ12.29(s,1H),7.48(s,1H),7.11(s,1H),7.01-6.96(d,J＝8.0Hz,2H), 6.12(s,1H),4.57(s,1H),3.65(s,3H),3.50–3.45(m,4H),2.73(s,2H),2.14(s,6H),1.87-1.82(m,4H),1.15(s,6H).
试验例1细胞实验(MV4-11细胞增殖抑制实验)
通过CCK-8试剂测定细胞活力
第一天：细胞铺板
1)收集培养瓶中的MV4-11细胞悬液至15mL离心管中，将细胞悬液于 1000rpm离心4min。
2)弃离心管中上清液，加入适量新鲜完全培养基(IMDM+10％FBS+1％P/S)，重悬细胞。取20μL细胞液，加入20μL台盼蓝，CounterStar计数。
3)据活细胞密度和所需铺板细胞数量，计算所需细胞悬液体积和完全培养基体积。MV4-11细胞铺板密度为1*104个/孔，100μL/孔。
4)使用电动排枪吸取100μL上述细胞悬液加入96孔板中。空白对照孔加入 150μL完全培养基。96孔板的周边孔加入PBS，防止液体蒸发。96孔板放培养箱过夜培养。
第二天：化合物配制：
1)取出用DMSO溶解的化合物，并进行梯度稀释(96孔PCR板稀释,从左往右依次为A列、B列等，至J列)。
A列初始浓度为10mM；
B取A稀释，2μL到8μL DMSO，得2000μM的终浓度；
C取B稀释，2μL到8uL DMSO，得400μM的终浓度；
D取C稀释，2μL到8uL DMSO，得80μM的终浓度；
E取D稀释，2uL到8uL DMSO，得16μM的终浓度；
F取E稀释，2μL到8uL DMSO，得3.2μM的终浓度；
G取F稀释，2μL到8uL DMSO，得0.64μM的终浓度；
H取G稀释，2μL到8uL DMSO，得0.128μM的终浓度；
I取H稀释，2μL到8uL DMSO，得0.0256μM的终浓度；
J取I稀释，2μL到8uL DMSO，得0.00512μM的终浓度；
采用低速离心机1000rpm条件下离心1min。
2)3×化合物配制：(96孔细胞培养板稀释)
使用10μL手动排枪取中B～J列溶液各3μL到197μL完全培养基中，得到终浓度分别为：30000，6000，1200，240，48，9.6，1.92，0.384，0.0768nM的 3×化合物溶液；取3μL DMSO到197μL完全培养基中作control用。将得到的96 孔细胞培养板振荡器上500rpm，30min振荡。
化合物处理：
1)使用手动排枪，体积设置为50μL，吸取配置好的上述各浓度的3×化合物溶液加入到第一天过夜培养后的96孔板的对应孔中，每孔总培养体积为150ul。使96孔板中化合物的终浓度为10uM，2uM，400nM，80nM，16nM，3.2nM，0.64nM，0.128nM，0.0256nM。将得到的96孔细胞培养板振荡器上以500rpm 振荡10min。
2)将铺好的96孔板放到CO2培养箱中培养72小时。
第五天：结果检测：
1)使用排枪，体积设置为15μL，以15μL/孔的量向96孔细胞培养板加入 CCK-8检测液。
2)将96孔细胞培养板放入CO2培养箱中，孵育4小时。
3)使用MD酶标仪读取450nm吸收值，计算抑制率，GraphPad计算IC50值。
本申请示例性化合物的细胞增殖实验结果如表1所示。
表1：示例性的化合物细胞增殖抑制实验结果
本申请化合物在MV4-11体外细胞增殖抑制实验中表现出良好的肿瘤细胞生长抑制作用。
试验例2本申请化合物的体内药效试验测试
目的：测试受试化合物对MV4-11白血病裸鼠移植瘤体内生长的抑制作用。
方法：NOD-SCID小鼠皮下接种MV4-11细胞，建立MV4-11小鼠移植瘤模型。接种16天后(d16)，平均肿瘤体积约为210mm3，根据肿瘤体积大小采用随机区组法将荷瘤鼠分组，每组6只，包括溶剂对照组、受试样品不同给药剂量组，给药体积均为10mL/kg，每天给药一次。各组均采用灌胃给药，连续给药21天，溶剂对照组灌胃给予空白溶剂(20％β环糊精溶液)。开始给予测试药物后每周两次测量肿瘤体积、称重。实验结束后安乐死动物。
本申请实施例1化合物的动物体内药效结果如表2所示。
表2：实施例1化合物的动物体内药效结果
对比溶剂对照组，本申请实施例1化合物各剂量组均表现出显著的体内抑瘤活性。
要理解的是，上文的详述和附随实施例仅是示例性的，且不应被视为限制本发明的范围，该范围仅由所附权利要求及其对等物规定。本领域技术人员容易看出对所公开的实施方案的各种变动和修改。可以在不背离其精神和范围的情况下作出这样的变动和修改，包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成法、制剂和/或使用方法相关的那些。本文中引用的所有出版物、专利和专利申请出于各种目的全文经此引用并入本文。

Claims (9)

1.式(I)化合物
其中：
R1为氢或C1-C6烷基；
R2为-C(O)NHRx或-C(O)NRx1Ry1；
R3、R4和R5分别独立地选自氢、卤素或C1-C6烷基；
Rx选自氢、C1-C6烷基或C3-C6环烷基；
Rx1、Ry1独立选自氢、C1-C6烷基，或者Rx1、Ry1与N原子连接成3-8元环。
2.如权利要求1所述的式(I)化合物，其特征在于，
R1为氢、甲基、乙基、正丙基或异丙基。
3.如权利要求1所述的式(I)化合物，其特征在于，其中
R2为-C(O)NHCH2CH3、-C(O)N(CH3)2、-C(O)N(CH2CH3)2、
4.如权利要求1所述的式(I)化合物，其特征在于，其中
R3、R4和R5分别独立地选自氢、氟、氯、溴、甲基、乙基或异丙基。
5.如权利要求1所述的式(I)化合物，其特征在于，所述化合物选自：
6.一种合成权利要求1～5任一项所述的式(I)化合物的方法，其特征在于反应式如下：
或者
式(Ia)化合物和式(Ib)化合物、或者式(Ic)化合物和式(Id)化合物，经催化偶联反应制得式(I)化合物，各基团定义如权利要求1～5任一项所述，X选自Cl、Br或I。
7.中间体式(Ib)
其中各基团定义如权利要求1～5任一项所述，X选自CI、Br或I。
8.中间体式(Id)
其中各基团定义如权利要求1～5任一项所述。
9.如权利要求1～5任一项所述的化合物在制备预防或治疗与BET蛋白相关疾病的药物中的用途；所述与BET蛋白相关疾病为髓单核细胞性白血病。
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