KR960005167B1

KR960005167B1 - 3-l-피로글루타밀-l-티아졸리딘-4-카르복실산 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR960005167B1
Application number: KR1019880000537A
Authority: KR
Inventors: 폴리 스테파노
Original assignee: 폴리 인다스트리아 키미카 에스.피.에이.; 지오바니 키아리
Priority date: 1987-01-26
Filing date: 1988-01-25
Publication date: 1996-04-22
Also published as: NZ223287A; GR3003060T3; ATE67212T1; EP0276752B1; FI880324A; IE60185B1; ES2003856A4; ES2003856T3; AU1067388A; DE3864691D1; NO170686B; IL85102A; IT8719165A0; JPS63201187A; AU613890B2; IL85102A0; IE880178L; FI880324A0; GR880300151T1; FI89369C

Abstract

내용 없음.

Description

3-L-피로글루타밀-L-티아졸리딘-4-카르복실산 및 그 제조 방법

본 발명은 하기 식(Ⅰ)의 3-L-피로글루타밀-L-티아졸리딘-4-카르복실산, 그 약학적 허용염과 그 제조방법, 및 이들을 포함하는 항독성, 항산화성, 면역자극성, 소염성 및 항-노화성 작용을 가진 약학 조성물에 관한 것이다:

본 발명에 따른 염의 예는 리신, 아르기닌, 알칼리 수산화물 또는 알칼리토 수산화물, 트로메타민, 트리에틸아민, 트리에탄올아민, 피페리딘 등과 같은 비독성 염기를 가진 약학적 허용염이다. 일부 염들은 보다 높은 용해도, 보다 양호한 약력학적 또는 감각 수용적 특성, 보다 높은 안정성 등과 같은 특별한 장점을 나타내 보일 수 있다: 그러나, 이러한 모든 특성은 식(Ⅰ)의 3-L-피로글루타밀-L-티아졸리딘-4-카르복실산의 생리학적 작용에 비하면 부수적인 것이다.

실제로, 화합물(Ⅰ)은 파라세타몰 종독으로부터 쥐의 간을 보호하는 작용, 쥐의 이온화 방사선에 대한 노출에 따른 증상을 완화시키는 작용 및 면역계에 긍정적으로 영향을 주는 작용과 같은 유리한 약리학적 특성을 지닌 것으로 입증되었다. 후술하는 약리학적 시험에서는, 약호 PGTCA로 나타낸 화합물(Ⅰ)을 피로글루타민산(PGA) 및 4-티아졸리딘카르복실산(TCA)과 비교하였다.

쥐의 파라세타몰 중독에 대한 효과

체중이 150±10g인 수컷 위스터(Wister) 쥐를 사용하였다. 쥐를 어느 정도 안정화시킨 후 시험에 사용하였다.

a) 1회 복강내 투여 실험

쥐들은 하기 처리방식에 따라 각각 20마리씩 7군으로 나누었다.

1군 대조군

2군 PGTCA 4.1 μmole/kg 복강내 투여

3군 PGTCA 4.1 μmole/kg 복강내 투여

4군 PGTCA 205 μmole/kg 복강내 투여

5군 PGA 4.1 μmole/kg+TCA 4.1 μmole/kg

6군 PGA 41 μmole/kg+TCA 41 μmole/kg

7군 PGA 205 μmole/kg+TCA 205 μmole/kg

각 군의 모든 동물들을 12시간동안 절식시킨 후 5000mg/kg 용량의 파라세타몰을 경구 투여시켰다. 파라세타몰을 투여하면서 동시에 다른 약리학적 처리를 수행하였다. 처리한지 48시간후에 각기 다른 실험 군들에서 치사된 쥐들을 발견하였다. 살아있는 쥐는 참수시켜 죽인 후 간을 적출하여 조직 병리학적 검사를 수행하였다. 간의 병변 정도는 다음과 같이 설정하였다:

O급 : 정상조직 상태.

Ⅰ급 : 중심 소엽의 괴사가 소엽의 25% 미만으로 확장된 상태.

Ⅱ급 : 인접한 중심 소엽 영역사이에 브릿지 병변을 나타내면서 중심 소엽의 괴사가 확장된 상태.

Ⅲ급 : 넓은 범위에 걸쳐 괴사가 이루어진 상태.

병변 정도를 설정하기 위해서 각 조직을 6부위씩 검사하였다.

b) 반복적인 복강내 투여에 의한 실험

상기 a)에 기재된 바와 동일한 처리를 행하였다.

2∼7군의 모든 동물들은 8일 동안 매일 처리하였다. 8일째 되는날, 상기와 같이 각기 상이한 약리학적 처리를 수행하면서 동시에 7군의 모든 동물(12시간 굶긴후)에게 파라세타몰 5000mg/kg을 경구투여 시켰다. 이어서, 동물을 48시간 동안 관찰하였다; 2∼7군에 속하는 동물들은 상기 언급된 처리방식으로 계속 처리하였다.

파라세타몰을 투여한지 48시간후, 살아있는 동물들을 체크하고, 이들의 간을 조직 병리학적으로 검사하였다.

하기의 표 Ⅰ에 보고된 결과에 따르면, 높은 투여량(205μmole/kg, 복강내)과 중간 투여량(41μmole/kg, 복강내)의 PGTCA로 단기간동안 처리하는 두 경우 모두에서, 다량의 파라세타몰에 의해 유발된 쥐의 간 손상이 상당히 감소됨을 알 수 있다. PGA와 TCA의 혼합물은 높은 투여량(205μmole/kg의 TCA, 복강내)으로 투여할 경우에만 간 손상이 상당히 감소되었다.

결론적으로, PGTCA는 높은 투여량과 중간 투여량을 투여했을때 모두 파라세타몰에 의한 치사율을 감소시키는 반면, PGA와 TCA의 혼합 투여시에는 높은 양을 투여할 경우에만 그 효과가 나타날 수 있다. 또한, 반복적으로 투여하는 실험에서는, PGA와 TCA의 혼합 투여시에 비해 PGTCA로 처리했을 때 그 효과가 월등한 것으로 입증되었다(표 Ⅱ).

[표 Ⅰ]

[표 Ⅱ]

이온화 방사선에 대한 노출 증상에 미치는 효과

스위스산 수컷 쥐(체중 30±5g)을 사용하였으며, 상기한 바와 완전히 동일한 처리방식에 따라 각각 20마리씩 7군으로 나누었다. 방사선을 조사하기 전 15일동안 약리학적 처리를 수행하며 이 처리는 시험이 끝날때까지 계속하였다. 대조군 동물에는 담체를 투여하였다.

15일째 되는날, 모든 동물에게 700r의 X-선을 조사하였다(필립 메탈릭스장치, 180kv,15mA,Cu 0.5mm+AI 1mm 필터 사용). 방사선 조사후에는 모든 동물을 15일간 매일 체크하였다. 방사능에 대한 보호도는 10일 및 15일째의 생존율(%)로 평가하였다. 표 Ⅲ에 제시된 실험 결과는, PGTCA가 높은 투여량과 중간 투여량에서 모두 상당한 방사능에 대한 보호작용을 갖는다는 것을 보여준다.

PGA와 TCA의 혼합투여시에는, 단지 높은 투여량에서만 그 효과가 나타날 수 있다.

수컷 쥐를 대상으로 한 몇가지 면역학적 파라미터에 대한 활성

가능한 면역 자극 또는 면역 조절 활성을 측정하기 위해서는, 생리학적 또는 의사(擬似) 생리학적 면역 결핍 모델을 사용하여야 한다.

이러한 목적에 가장 많이 사용되는 모델중 하나는 노화 모델이다. 사실상, 노화는 T-헬퍼 임파구 기능의 감소 및 T-임파구에 면역 의존성 반응, 즉 지연된 형태의 과감작, 유사 분열 유발제에 대한 증식 반응, T-세포 융해성 세포의 분화의 억제와 연관이 있다. 이러한 현상과 관련된 매카니즘은, 흉선 퇴축, T-억제물질 세포 유도 및 인터류킨 2의 변형된 합성과 관련된 흉선 호르몬 생성의 감소에 기인될 수 있다. B세포는, 상기 요인들보다는 그 작용력이 약한 것으로 판단된다.

때문에, 임파구 세포의 반응성을 밝히는 두 가지 테스트를 사용하여 어린 동물 및 노화된(늙은) 동물을 PGTCA로 생체내 처리했을때의 효과를 평가하였다.

이러한 목적을 위해서, 성숙한 수컷 쥐(생후 5-6개월)를 정상 면역 경쟁 시스템을 가진 동물 모델로서 사용하고, 의사(擬似) 생리학적 면역 결핍 모델로서 늙은 쥐(생후 17-18개월)를 사용하였다.

PGTCA로의 처리는 1일 2회씩 1,10 및 50mg/kg의 투여량으로 복강내 투여함으로써 수행하였다.

사용된 면역학적 테스트는 디니트로클로로벤젠(DNCB)에 의해 유도된 지연된 유형의 과민증과 콘카나발린 A(ConA)에 대한 T 임파구의 반응이었다.

DNCB 감작

PGTCA(또는 담체)로 4주간 미리 처리하고 4주 후에, 각 동물(1군당 5마리의 쥐)에게 0.02ml의 DNCB(200mg/ml의 농도로 아세톤에 용해시킨 것)를 등 피부 부위의 약 1㎠ 면적에 도포하였다. 이에 따른 염증 반응은, 1∼7일간 구경측정기를 사용하여 발적 부위의 직경을 측정함으로써 평가하였다. 이 기간 동안에는 동물에게 상기 약물을 계속 투여시켰다.

ConA를 이용한 블라스티제이션(blastization) 시험

1, 10 및 50mg/kg의 투여량으로 PGTCA를 4주간 처리한 후, 동물을 죽이고 비장을 완전 멸균 조건하에서 적출하였다. 임파구는 이소림프(Isolimph) 구배방식으로 분리하였다. ConA(2.5㎍/ml)존재하에 1×10⁶세포/ml 농도의 임파구를 마이크로컵 내에서 48시간동안 항온 처리하였다. 이어서, 16시간동안³H-티미딘을 혼입시켜 유사 분열 활성을 평가하였다.

얻어진 결과를 통해, 노화된 동물에 있어서 DNCB 반응의 감속도(염증면적으로 평가)를 알 수 있다. PGTCA로 처리했을때, 어린 동물에 있어서는 50mg/kg의 투여량에서만 반응이 상당히 증가한 반면에, 늙은 동물에 있어서는 PGTCA를 10mg/kg 투여했을때 이미 최대의 강력한 효과를 보였다.

PGTCA의 면역 자극 활성은 또한, ConA를 사용한 블라스티제이션 시험을 통해 확인되었다(표 Ⅳ). 또한 이러한 경우의 반응은, 어느 정도의 세포면역 결핍 현상을 나타내 보이는 동물에 있어서 더욱 두드러진다.

쥐에 대해서는 세포 독성류의 과민 반응을 사용하였고, 숫양의 적혈구와 함께 로제트(rosettes)를 형성하는 T세포 시험으로 평가하였다(S.D. Wilson Immunology, 1971, 21, 233). 표 Ⅴ-A/B에 지시된 바에 따라, 하루에 2회씩 50mg/kg를 복강내 투여한 후에 시험 처리하였다.

먼저 체중이 약 25g인 수컷 COBS CD-1 쥐를 8일간 PGTCA로 처리하였다.

처리 시작후 4일째 동물에게, 0.2ml의 PBS중의 5×10⁸숫양 적혈구를 복강내 투여하여 면역시켰다. 이때 적혈구는 숫양의 구연산 첨가 혈액을 10분간 1500r.p.m.으로 원심 분리하여 침전된 적혈구 PBS 중에서 10분간 1200r.p.m.으로 2회 세정한 후 첫번째 층을 걷어내 PBS중에 현탁시킴으로써 제조하는데, 그 농도는 콜터 계수기(Coulter Counter)로 계측한 결과 2.5×10⁹적혈구/ml로 제공된다.

면역 후 6일째 되는날, 로제트 시험을 수행하였다.

먼저 경부를 탈구시켜 쥐를 죽인뒤 비장을 적출하였다.

이어서, 비장을 얼음중에 유지시킨 1ml의 행크(Hank)용액에 넣은뒤 펄프화하고, 균질화 시킨후 거즈를 통해 여과시켰다.

균질화된 생성물은 행크 용액중에서 10분간 1200r.p.m.으로 원심분리시킴으로써 2회 세정한 후 재현탁시켰다. 100μl의 저혈구 현탁액(3×10⁸/μl)+비장 세포 현탁액(6×10⁷/ml)을 0.8ml의 행크 용액에 넣고 1분간 교반하면서 혼합였다. 수거된 샘플은 4℃에서 교반하지 않고 24시간동안 항온 처리하였다. 항온 처리후에는, 이들을 교반한 뒤 뷕커

실에서 ml당 로제트를 형성하는 세포수(갯수/ml)를 측정하였다.

로제트를 형성하는 시험에서는, PGTCA로 처리할 경우 감작된 동물의 대조군에 비해 로제트의 수가 상당히 증가한 반면, 감작되지 않은 동물에 있어서는 변화가 거의 없음이 입증되었다.

이로써 PGTCA는, T임파구 집단에 대해 활성을 지니는 반면, B임파구의 수는 증가시키지 않으므로 특이적인 면역 자극을 유도한다는 것이 밝혀졌다.

[표 Ⅲ]

[표 Ⅳ]

[표 Ⅴ]

*p<0.05

더우기, 화합물(Ⅰ)은 10mg/kg의 투여량에서 노화된 쥐의 대뇌 신경 작용으로 개선시키며, 50mg/kg의 투여량에서는 보다 더 개선시키는 것으로 입증되었다. 또한, 수컷 쥐의 교미에도 마찬가지로 바람직한 영향을 준다는 사실이 밝혀졌는데, 즉 교미의 빈도가 증가하고 잠복 기간이 단축되었다.

상기 결과를 통해, 화합물(Ⅰ)은 면역 방어력의 결핍, 자가 면역 계통의 질환 및 노화 작용의 치료를 비롯한 각종 병리학적 징후의 치료에 용이하게 사용할 수 있음이 입증되었다.

식(Ⅰ)의 화합물은 또한, 만성 염증 또는 이온화 방사선의 노출에 따른 결과인 과다한 산화 과정을 서로 비교하는데 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 식(Ⅰ)의 화합물은, 국제 지표(급성 독성 데이타인 LD₅₀값은 하기 표 Ⅵ로 제시)를 기준으로 평가했을때 경구 또는 비경구 방식으로 급속히 투여하면 독성이 거의 없다.

[표 Ⅵ]

전술된 치료용도에서는, 화합물(Ⅰ)을 담체 및 통상적인 기술, 예를 들면 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, 핵크 출판사, 뉴욕소재]에 기재된 방법을 사용하여 약학 조성물로 제조한다.

약제 형태로는, 예를 들면 경구용 또는 비경구용의 정제, 캡슐, 피하 정제, 과립 또는 용액이 있다.

일반적으로 단위 투여형태는 활성 성분을 10∼500mg 포함한다. 일일 투여량은 환자의 증상 및 병세의 심각도에 좌우되는데, 즉 경구 투여시에는 대개 2 또는 3회에 걸쳐 0.1∼4g의 일일 투여량으로 투여하는 한편, 비경구 투여시에는 대개 50∼2000mg의 일일 투여량이면 충분하다.

본 발명은, L-피로글루탐산의 활성화된 에스테르를 디메틸 포름아미드, 지방족 디알킬아미드 또는 디메틸설폭사이드와 같은 용매중에서 용해시킨 트리에틸아민, 디에틸이소프로필아민 또는 우수한 트리알킬아민과 같은 유기 염기의 존재하에 L-티아졸리딘-4-카르복실산과 반응시키는 식(Ⅰ)의 화합물의 제조방법도 또한 포함하는데, 여기서 활성화된 에스테르로는 펜타클로로페놀, 2,4,5-트리클로로페놀, 또는 N-히드록시 숙신이미드와의 에스테르를 사용하거나, 또는 알칼리 용액중의 L-피로글루타모일클로라이드 및 L-티아졸리딘-4-카르복실산을 사용한다.

생성물의 화학 구조는 NMR스펙트럼 및 IR스펙트럼의 원소분석(C,H,N,S)을 통해 결정하였다.

하기의 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 이에 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

[실시예 1]

문헌[J. Med. Chem. 13, 844(1970)]에 기재된 방법에 따라 제조한 60g(0.158몰)의 펜타클로로페닐-L-피로글루타메이트, 20.85g(0.158몰)의 4-티아졸리딘 카르복실산 및 16g(0.158몰)의 트리에틸아민을 450ml의 디메틸포름아미드중에서 실온하에 24시간 동안 진탕하였다. 이어서, 불용성 물질을 여과하고 15℃ 및 감압하에 용매를 증발시킨 후 잔류물을 다시 넣고, 에틸 에테르를 사용하여 펜타클로로페놀을 추출한 후, 수성상을 염산으로 산성화하고, 형성된 침전물은 10℃에서 여과하였다.

이어서, 물로 재결정함으로써 융점이 192-194℃인 백색 결정질 생성물(수율 70%)을 수득하였다.

C₉H₁₂N₂O₄S의 분석결과:

[실시예 2]

50ml의 2N NaOH중에 13.3g(0.1몰)의 L-티아졸리딘-4-카르복실산을 교반하여 용해시킨 용액에, 25ml의 아세톤 중에 1.48g(0.1몰)의 L-피로 글루타모일클로라이드(미합중국 특허 제4,278,681호)를 용해시킨 용액 및 50ml의 2N NaOH를 동시에 적가하되, 온도는 0℃로, pH는 7.5∼8.5로 유지시켰다. 첨가가 끝날 무렵, 감압하에 이것을 1/2부피로 농축시키고, 진한 염산으로 산성화한 후, 0℃에서 방치하여 형성된 결정을 여과하고, 이어서 물로 재결정함으로써 실시예 1에서와 동일한 특성을 갖는 생성물 12g(49%)을 수득하였다.

Claims

식(Ⅰ)의 3-L-피로글루타밀-L-티아졸리딘-4-카르복실산 또는 그 약학적 허용염:
L-피로글루탐산의 활성화 에스테르 또는 그 산 클로라이드를 L-티아졸리딘-4-카르복실과 반응시키는 것을 특징으로 하는 제1항의 화합물의 제조방법.
제2항에 있어서, 0℃에서 염기 또는 물의 존재하에, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드 및 지방족 디알킬아미드로 이루어진 군중에서 선택된 불활성 용매중에서 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 피로글루탐산의 활성화 에스테르가 펜타클로로페놀, 2,4,5-트리클로로페놀, N-히드록시-숙신이미드와의 에스테르인 것을 특징으로 하는 방법.
활성성분인 제1항의 화합물 또는 그 염들중 한종을 약학적 허용 담체와 혼합된 상태로 함유하는, 면역 자극성, 항독성, 소염성, 항산화성 및 항-노화성 작용을 가진 약학 조성물.
제5항에 있어서, 경구 또는 비경구용의 정제, 캡슐, 피하 정제, 과립 또는 용액 형태인 조성물.