KR20190132651A - Pd-l1 검출용 항 pd-l1 항체 - Google Patents

Pd-l1 검출용 항 pd-l1 항체 Download PDF

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Abstract

멜라노마 등의 종양 세포를 염색 가능한 항 PD-L1 항체를 제공한다.
(a) KSISKY (서열 번호 1) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SGS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 QQHNEYPLT (서열 번호 2) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는 L 사슬과, (b) GYTFTDYI (서열 번호 3) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, INPDSGGN (서열 번호 4) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARGITMMVVISHWKFDF (서열 번호 5) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는 H 사슬을 포함하는, 항 PD-L1 항체. 상기 항 PD-L1 항체를 유효 성분으로서 포함하는, PD-L1 을 검출하기 위한 조성물. 상기 항 PD-L1 항체를 제조하는 방법도 제공한다.

Description

PD-L1 검출용 항 PD-L1 항체
본 발명은, PD-L1 검출용 항 PD-L1 항체에 관한 것이다.
악성 흑색종은 멜라노사이트에서 유래하는 개의 구강 내에 있어서 가장 일반적으로 볼 수 있는 악성 종양의 하나로 (비특허문헌 1 : Todoroff et al., J Am Vet Med Assoc. 1979 Sep 15 ; 175(6) : 567-71.), 높은 침윤성 및 전이성을 나타내는 경우가 많기 때문에 조기의 진단·치료가 요망된다. 그러나 한편으로, 멜라노마는 조직 베리에이션이 넓고, 상피형이나 원형 세포형, 선유육종형 등 여러 가지 형태를 나타내어, 조직 진단이 어려운 종양의 하나이다. 진단에는 멜라닌 색소의 확인이 중요하지만, 많은 악성 흑색종에서는 멜라닌 색소를 가지지 않고, 조직학적 소견만으로는 진단에 이르지 못하는 경우도 있다. 이 때문에 면역 조직 화학적 수법에 의한 진단 마커의 탐색이 실시되어 왔고, 그것들 중 Melan A/MART-1, 비멘틴, S100, 신경 특이적 에놀라아제 등의 유용성이 보고되어 있다 (비특허문헌 2 : Ramos-Vara et al., Vet Pathol. 2000 Nov ; 37(6) : 597-608.). 그러나, 가장 널리 사용되고 있는 진단 마커인 Melan A/MART-1 에서조차, 양성률은 보고에 따라 여러 가지이지만 대략 60 ％ 정도이고 (비특허문헌 3 : Koenig et al., Vet Pathol. 2001 Jul ; 38(4) : 427-35.), 감도의 문제로부터 실제 진단에 있어서의 유용성에 대해서는 아직도 논의의 대상이다. 또한 Melan A/MART-1 은 무색소성의 악성 흑색종에서는 염색되지 않는 (비특허문헌 3 : Koenig et al., Vet Pathol. 2001 Jul ; 38(4) : 427-35.) 점에서, 진단에 대한 응용이 제한되어 있다. 이와 같은 배경으로부터, 악성 흑색종에 대한 고감도인 신규 진단 마커의 개발이 요망되고 있다.
Todoroff et al., J Am Vet Med Assoc. 1979 Sep 15 ; 175(6) : 567-71. Ramos-Vara et al., Vet Pathol. 2000 Nov ; 37(6) : 597-608. Koenig et al., Vet Pathol. 2001 Jul ; 38(4) : 427-35.
본 발명은, 멜라노마 등의 종양 세포를 염색 가능한 항 PD-L1 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 지금까지 여러 가지 동물의 PD-L1 에 반응하는 모노클로날 항체를 수립해 왔다. 그 중에서 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 (6C11-3A11) 는, 매우 효율적으로 멜라노마 종양 세포를 염색 가능한 것이 밝혀져, 현재, 키메라 항체 치료를 이용한 치험 (治驗) 후보견의 선정시에 사용하고 있다. 또, 본 PD-L1 항체 (6C11-3A11) 는, 양, 돼지, 소의 PD-L1 에 대한 면역 조직 화학 염색이 가능하다. 또한, 본 PD-L1 항체 (6C11-3A11) 의 가변 영역의 CDR 을 결정하였다. 본 발명은, 이들의 지견에 의해 완성된 것이다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
(1) (a) KSISKY (서열 번호 1) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SGS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 QQHNEYPLT (서열 번호 2) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는 L 사슬과, (b) GYTFTDYI (서열 번호 3) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, INPDSGGN (서열 번호 4) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARGITMMVVISHWKFDF (서열 번호 5) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는 H 사슬을 포함하는, 항 PD-L1 항체.
(2) 래트에서 유래하는 (1) 에 기재된 항체.
(3) 래트 항소 PD-L1 항체인 (2) 에 기재된 항체.
(4) L 사슬 가변 영역이 서열 번호 6 의 아미노산 서열을 갖고, H 사슬 가변 영역이 서열 번호 7 의 아미노산 서열을 갖는, (3) 에 기재된 항체.
(5) L 사슬 정상 영역이, Kappa 사슬의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖는 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(6) H 사슬 정상 영역이, IgG2a 의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖는 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(7) L 사슬 정상 영역이 서열 번호 8, 10 ∼ 12 중 어느 아미노산 서열을 갖고, H 사슬 정상 영역이 서열 번호 9 또는 13 의 아미노산 서열을 갖는 (5) 또는 (6) 에 기재된 항체.
(8) L 사슬 2 개와 H 사슬 2 개의 4 개 사슬 구조를 갖는 (1) ∼ (7) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(9) (1) ∼ (8) 중 어느 하나에 기재된 항체를 유효 성분으로서 포함하는, PD-L1 을 검출하기 위한 조성물.
(10) 암 및/또는 감염증의 진단에 사용되는 (9) 에 기재된 조성물.
(11) 암 및/또는 감염증이, 종양성 질환, 백혈병, 요네병, 아나플라즈마병, 세균성 유방염, 진균성 유방염, 마이코플라즈마 감염증 (예를 들어, 마이코플라즈마성 유방염, 마이코플라즈마성 폐렴 등), 결핵, 소형 피로플라즈마병, 크립토스포리듐증, 콕시듐증, 트리파노소마병 및 리슈마니아증으로 이루어지는 군에서 선택되는 (10) 에 기재된 조성물.
(12) 항 PD-L1 항체를 사용한 치료에 적절한 피험 동물을 선정하기 위해 사용되는 (9) 에 기재된 조성물.
(13) (1) 에 기재된 항 PD-L1 항체를 코드하는 DNA.
(14) (13) 에 기재된 DNA 를 포함하는 벡터.
(15) (14) 에 기재된 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
(16) (15) 에 기재된 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 항 PD-L1 항체를 채취하는 것을 포함하는, 항체의 제조 방법.
(17) KSISKY (서열 번호 1) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SGS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 QQHNEYPLT (서열 번호 2) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는, 항 PD-L1 항체의 L 사슬을 코드하는 DNA.
(18) GYTFTDYI (서열 번호 3) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, INPDSGGN (서열 번호 4) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARGITMMVVISHWKFDF (서열 번호 5) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는, 항 PD-L1 항체의 H 사슬을 코드하는 DNA.
본 발명에 의해, 멜라노마 등의 종양 세포를 염색 가능한 신규 항 PD-L1 항체가 얻어졌다.
본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본 특허출원 2017-61389 의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1 은, 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 의 결합 특이성. 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 은 EGFP 발현 세포에는 결합하지 않았지만, 개 PD-L1-EGFP 발현 세포에 특이적으로 결합하였다.
도 2 는, 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 의 예상 CDR 영역. 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 의 L 사슬 가변 영역 및 H 사슬 가변 영역에 있어서의, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 나타낸다.
도 3 은, 개 멜라노마 비교 면역 조직 화학 염색 이미지. 좌 : 시판 항체 (MelanA 항체) 로 염색. 거의 염색되지 않는다. 우 : 본 발명자들이 수립한 PD-L1 항체 (6C11-3A11) 로 염색. 매우 효과적으로 종양 세포를 염색 가능하다.
도 4 는, 개 멜라노마 면역 조직 화학 염색 이미지.
도 5a 는, 다른 종양의 면역 조직 화학 염색 이미지. 좌상 : 개 림프종 증례. 우상 : 개 골육종 증례. 좌하 : 개 신세포암 증례 1. 우하 : 개 신세포암 증례 2.
도 5b 는, 다른 종양의 면역 조직 화학 염색 이미지. 좌 : 개 편평 상피암 증례. 우 : 개 선유육종 증례.
도 6 은, 양 리스테리아 증례의 면역 조직 화학 염색 이미지. 좌 : 신경 증상을 나타낸 양 리스테리아증의 뇌병변의 PD-L1 염색 이미지. 우 : 좌 확대 사진.
도 7 은, 돼지 감염증의 면역 조직 화학 염색 이미지. 좌 : 돼지 써코 바이러스 2 형 감염증 예. 우 : 돼지 마이코플라즈마 폐렴 예.
도 8 은, 래트 Ig kappa 사슬의 정상 영역의 아미노산 서열 얼라인먼트 (L 사슬).
도 9 는, 래트 IgG2a 사슬의 정상 영역의 아미노산 서열 얼라인먼트 (H 사슬).
도 10 은, pDC6 벡터와 래트-인간 키메라 항 PD-L1 항체의 모식도.
도 11 은, 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 과 6G7-E1 의 개 PD-L1-EGFP 발현 세포에 대한 결합. 6C11-3A11 은 개 PD-L1-EGFP 발현 세포에 특이적으로 결합하였다.
도 12 는, 개의 피부 편평 상피암, 비강내 선암 및 이행 상피암에 있어서의 면역 조직 화학 염색 이미지. 6G7-E1 에서는 특이적 시그널은 검출되지 않았다. 6C11-3A11 에서는 종양 세포가 염색되었다.
도 13 은, 개의 항문낭 선암, 연부 조직 육종 및 골육종에 있어서의 면역 조직 화학 염색 이미지. 항문낭 선암과 연부 조직 육종에 있어서는, 6G7-E1 에서는 특이적 시그널이 관찰되지 않는 한편으로 6C11-3A11 에서는 종양 세포가 염색되었다. 골육종에 있어서는 양항체에서 종양 세포가 염색되었지만, 6C11-3A11 에서 보다 강한 시그널이 얻어졌다.
도 14 는, 개의 구강내 악성 흑색종, 유선 선암, 조직구 육종, 미만성 대세포성 B 세포 림프종 및 가이식성 성기 육종에 있어서의 6C11-3A11 에 의한 면역 조직 화학 염색 이미지. 가이식성 성기 육종을 제외한 종양종에 있어서, 종양 세포 상의 PD-L1 이 염색되었다.
도 15 는, 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 의 소 PD-L1-EGFP 발현 세포에 대한 결합. 6C11-3A11 은 소 PD-L1-EGFP 발현 세포에 특이적으로 결합하였다.
도 16 은, 요네병 야외 감염 소 및 실험 감염 소의 회장 병변부에 있어서의 (a) 6C11-3A11 및 (b) Ziehl-Neelsen 염색에 의한 면역 조직 화학 염색 이미지. 6C11-3A11 은 요네균 감염 (Ziehl-Neelsen 염색 양성) 세포에 있어서 PD-L1 의 발현을 검출하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은, (a) KSISKY (서열 번호 1) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SGS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 QQHNEYPLT (서열 번호 2) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는 L 사슬과, (b) GYTFTDYI (서열 번호 3) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, INPDSGGN (서열 번호 4) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARGITMMVVISHWKFDF (서열 번호 5) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는 H 사슬을 포함하는, 항 PD-L1 항체를 제공한다.
본 발명자들이 수립한 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 (모노클로날 항체) 의 L 사슬 가변 영역에 있어서의 CDR1 ∼ 3 은, 각각, KSISKY (서열 번호 1) 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역, SGS 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역, QQHNEYPLT (서열 번호 2) 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역이다 (도 2 참조).
또, 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 의 H 사슬 가변 영역에 있어서의 CDR1 ∼ 3 은, 각각, GYTFTDYI (서열 번호 3) 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역, INPDSGGN (서열 번호 4) 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역, ARGITMMVVISHWKFDF (서열 번호 5) 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역이다 (도 2 참조).
KSISKY (서열 번호 1) 의 아미노산 서열, SGS 의 아미노산 서열 및 QQHNEYPLT (서열 번호 2) 의 아미노산 서열, 그리고, GYTFTDYI (서열 번호 3) 의 아미노산 서열, INPDSGGN (서열 번호 4) 의 아미노산 서열 및 ARGITMMVVISHWKFDF (서열 번호 5) 의 아미노산 서열에 있어서는, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어도 되고, 이들의 변이가 도입되어도, PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역의 CDR 또는 H 사슬 가변 영역의 CDR 로서의 기능을 가질 수 있다.
본 명세서에 있어서, 항체란, 전장 항체 외에, Fab, F(ab)'2, ScFv, Diabody, VH, VL, Sc(Fv)2, 이중특이성 (Bispecific) sc(Fv)2, Minibody, ScFv-Fc 모노머 (monomer), ScFv-Fc 다이머 (dimer) 등의 저분자화된 것도 포함하는 개념이다.
본 발명의 항 PD-L1 항체는, 래트에서 유래하는 것이어도 되고, 예를 들어, 래트 항소 PD-L1 항체이면 된다.
래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 (모노클로날 항체) 의 L 사슬 가변 영역의 아미노산 서열 및 H 사슬 가변 영역의 아미노산 서열을, 각각, 서열 번호 6 및 7 에 나타내지만, 서열 번호 6 및 7 의 아미노산 서열에 있어서는, 1 개 혹은 복수 개 (예를 들어, 5 개 이하, 많아도 10 개 정도) 의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어도 되고, 이들의 변이가 도입되어도, PD-L1 항체의 L 사슬 가변 영역 또는 H 사슬 가변 영역으로서의 기능을 가질 수 있다.
항체의 L 사슬에는, Kappa 사슬과 Lambda 사슬이 있고, 본 발명의 항 PD-L1 항체에 있어서, L 사슬 정상 영역은, Kappa 사슬 또는 Lambda 사슬의 어느 쪽의 사슬의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖는 것이어도 되지만, 존재 비율은, 양, 고양이, 개, 말에서는 Lambda 사슬 (람다 사슬) 쪽이 높고, 마우스, 래트, 인간, 돼지에서는 Kappa 사슬 (카파 사슬) 쪽이 높다. 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 (모노클로날 항체) 은 래트 유래의 IgG2a 이고, L 사슬 정상 영역이, Kappa 사슬의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 항 PD-L1 항체의 H 사슬 정상 영역은, 래트 IgG2a 의 정상 영역의 아미노산 서열을 가지면 된다. H 사슬은, 정상 영역의 차이에 의해, γ 사슬, μ 사슬, α 사슬, δ 사슬, ε 사슬로 나누어지고, 이 차이에 의해 각각 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 의 5 종류의 클래스 (아이소타입) 의 면역 글로불린이 형성된다.
면역 글로불린 G (IgG) 는 인간 면역 글로불린의 70 ∼ 75 ％ 를 차지하고, 혈장 중에 가장 많은 단량체의 항체이다. 경사슬 2 개와 중사슬 2 개의 4 개 사슬 구조를 갖는다. 인간 IgG1, IgG2, IgG4 는 분자량은 약 146,000 이지만, 인간 IgG3 은 Fab 영역과 Fc 영역을 연결하는 힌지부가 길고, 분자량도 170,000 으로 크다. 인간 IgG1 은 인간 IgG 의 65 ％ 정도, 인간 IgG2 는 25 ％ 정도, 인간 IgG3 은 7 ％ 정도, 인간 IgG4 는 3 ％ 정도를 차지한다. 혈관 내외에 평균하여 분포한다. 인간 IgG1 은, 이펙터 세포 표면의 Fc 리셉터나 보체 인자에 강한 친화성을 갖기 때문에, 항체 의존성 세포 상해 활성 (ADCC) 을 유도하고, 또, 보체를 활성화하여 보체 의존성 세포 상해 활성 (CDC) 을 유도한다. 인간 IgG2 와 인간 IgG4 는, Fc 리셉터나 보체 인자에 대한 친화성이 낮은 점에서, ADCC 활성 및 CDC 활성이 낮다.
면역 글로불린 M (IgM) 은 인간 면역 글로불린의 약 10 ％ 를 차지하는, 기본의 4 개 사슬 구조가 5 개 결합한 5 량체의 항체이다. 분자량은 970,000. 통상 혈중에만 존재하고, 감염 미생물에 대하여 최초로 산생되고, 초기 면역을 담당하는 면역 글로불린이다.
면역 글로불린 A (IgA) 는 인간 면역 글로불린의 10 ∼ 15 ％ 를 차지한다. 분자량은 160,000. 분비형 IgA 는 2 개의 IgA 가 결합한 2 량체의 항체로 되어 있다. IgA1 은 혈청, 콧물, 타액, 모유 중에 존재하고, 장액에는 IgA2 가 많이 존재한다.
면역 글로불린 D (IgD) 는 인간 면역 글로불린의 1 ％ 이하의 단량체의 항체이다. B 세포 표면에 존재하고, 항체 산생의 유도에 관여한다.
면역 글로불린 E (IgE) 는 인간 면역 글로불린의 0.001 ％ 이하로 극미량밖에 존재하지 않는 단량체의 항체이다. 기생충에 대한 면역 반응에 관여하고 있다고 생각되지만, 기생충이 드문 선진국에 있어서는, 특히 기관지 천식이나 알레르기에 크게 관여하고 있다.
래트에서는, IgG 의 H 사슬로서, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG2c 의 서열이 동정되어 있다. 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 은, IgG2a 의 H 사슬 정상 영역의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 항체에 있어서, L 사슬 정상 영역이, Kappa 사슬의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖고, H 사슬 정상 영역이 IgG2a 의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖는 항 PD-L1 항체가 보다 바람직하다.
본 발명자들이 동정한 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 의 L 사슬 가변 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을, 각각, 서열 번호 6 및 14 에 나타낸다.
본 발명자들이 동정한 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 의 H 사슬 가변 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을, 각각, 서열 번호 7 및 15 에 나타낸다.
본 발명자들이 동정한 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 의 L 사슬 정상 영역 (kappa 사슬) 의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을, 각각, 서열 번호 8 및 16 에 나타낸다. 이들 서열은, National Center for Biotechnology Information (NCBI) 이 제공하는 염기 서열 데이터베이스 GenBank 에 #XM_008775358.2 의 등록 번호로 등록되어 있는 서열, GenBank 에 #BC062802.1 의 등록 번호로 등록되어 있는 서열, GenBank 에 #BC088255.1 의 등록 번호로 등록되어 있는 서열, GenBank 에 #L22653.1 의 등록 번호로 등록되어 있는 서열, GenBank 에 #L22655.1 의 등록 번호로 등록되어 있는 서열, GenBank 에 #M14434.1 의 등록 번호로 등록되어 있는 서열과 동일하다.
본 발명자들이 동정한 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 의 H 사슬 정상 영역 (IgG2a) 의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을, 각각, 서열 번호 9 및 17 에 나타낸다. 이들 서열은, GenBank 에 #BC088240.1 의 등록 번호로 등록되어 있는 서열, GenBank 에 #BC091257.1 의 등록 번호로 등록되어 있는 서열, GenBank 에 #BC091272.1 의 등록 번호로 등록되어 있는 서열, GenBank 에 #BC088423.1 의 등록 번호로 등록되어 있는 서열, GenBank 에 #L22652.1 의 등록 번호로 등록되어 있는 서열, GenBank 에 #L22654.1 의 등록 번호로 등록되어 있는 서열과 동일하다.
이 밖에, 래트 항체의 L 사슬 정상 영역 및 H 사슬 정상 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열은, 공지된 데이터베이스로부터 입수할 수 있고, 이들 서열을 이용할 수 있다.
래트 Ig kappa 사슬의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열로서, GenBank 에 #V01241.1 의 등록 번호로 등록되어 있는 서열을 서열 번호 10 과 18 에 나타낸다.
래트 Ig kappa 사슬의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열로서, GenBank 에 #X16129.1 의 등록 번호로 등록되어 있는 서열을 서열 번호 11 과 19 에 나타낸다.
래트 Ig kappa 사슬의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열로서, GenBank 에 #DQ402471.1 의 등록 번호로 등록되어 있는 서열을 서열 번호 12 와 20 에 나타낸다.
래트 IgG2a 의 H 사슬 정상 영역으로서, GenBank 에 #DQ402472.1 의 등록 번호로 등록되어 있는 서열을 서열 번호 13 과 21 에 나타낸다.
본 발명의 항 PD-L1 항체는, L 사슬 정상 영역이 서열 번호 8, 10 ∼ 12 중 어느 아미노산 서열을 갖고, H 사슬 정상 영역이 서열 번호 9 또는 13 의 아미노산 서열을 갖는 항 PD-L1 항체이면 된다.
서열 번호 8 ∼ 13 의 아미노산 서열에 있어서는, 1 개 혹은 복수 개 (예를 들어, 5 개 이하, 많아도 10 개 정도) 의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어도 되고, 이들의 변이가 도입되어도, 항체의 L 사슬 정상 영역 또는 H 사슬 정상 영역으로서의 기능을 가질 수 있다.
래트 항체의 L 사슬 정상 영역 및 H 사슬 정상 영역의 아미노산 서열의 얼라인먼트를 각각 도 8 및 9 에 나타낸다. 상기의 아미노산의 결실, 치환, 부가 등의 변이는, 도 8 및 9 에 나타내는 변이 부위 또는 그 근방의 부위에 발생되어 있으면 된다.
본 발명의 항 PD-L1 항체는, 키메라 항체여도 된다. 항체의 L 사슬 가변 영역과 H 사슬 가변 영역이 래트에서 유래하면 되고, 예를 들어, L 사슬 가변 영역이 래트 항소 PD-L1 항체 (예를 들어, 6C11-3A11) 의 L 사슬 가변 영역이고, H 사슬 가변 영역이 래트 항소 PD-L1 항체의 H 사슬 가변 영역이고, L 사슬 정상 영역 및 H 사슬 정상 영역이 래트 이외의 동물 유래의 것이면 된다. 예를 들어, 마우스 항체의 정상 영역을 사용하여 키메라화한 경우, 마우스 항체에 대한 2 차 항체는 각종 시판되고 있기 때문에, 검사 진단에 유용할 것이다. 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 정상 영역 및 H 사슬 정상 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열은, 공지된 데이터베이스로부터 입수할 수 있고, 이들 서열을 이용할 수 있다.
인간, 마우스, 소, 개, 양, 돼지, 물소의 L 사슬 정상 영역 및 H 사슬 정상 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을 하기의 표에 정리하였다.
[표]
Figure pct00001
Figure pct00002
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서열 번호 8 ∼ 13, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120 및 122 의 아미노산 서열에 있어서는, 1 개 혹은 복수 개 (예를 들어, 5 개 이하, 많아도 10 개 정도) 의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어도 되고, 이들의 변이가 도입되어도, Ig 중사슬 또는 경사슬의 정상 영역으로서의 기능을 가질 수 있다.
본 발명의 항 PD-L1 항체는, L 사슬 2 개와 H 사슬 2 개의 4 개 사슬 구조를 가지면 된다.
본 발명의 항 PD-L1 항체는, 이하와 같이 하여 제조할 수 있다. 본 발명의 항 PD-L1 항체의 경사슬 서열 (가변 영역 서열과 정상 영역 서열) 과 중사슬 서열 (가변 영역 서열과 정상 영역 서열) 을 포함하는 인공 유전자를 합성하고, 그 인공 유전자를 벡터 (예를 들어, 플라스미드) 에 삽입 후, 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포 등의 포유류 세포) 에 도입하고, 그 숙주 세포를 배양함으로써, 배양물로부터 항체를 채취한다. 인공 유전자의 합성에 있어서는, 뉴클레오티드 서열의 코돈을 최적화해도 된다.
본 발명은, (a) KSISKY (서열 번호 1) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SGS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 QQHNEYPLT (서열 번호 2) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는 L 사슬과, (b) GYTFTDYI (서열 번호 3) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, INPDSGGN (서열 번호 4) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARGITMMVVISHWKFDF (서열 번호 5) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는 H 사슬을 포함하는, 항 PD-L1 항체를 코드하는 DNA 를 제공한다. 또, 본 발명은, KSISKY (서열 번호 1) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SGS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 QQHNEYPLT (서열 번호 2) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는, 항 PD-L1 항체의 L 사슬을 코드하는 DNA ((a') 의 DNA) 를 제공한다. 또한, 본 발명은, GYTFTDYI (서열 번호 3) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, INPDSGGN (서열 번호 4) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARGITMMVVISHWKFDF (서열 번호 5) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는, 항 PD-L1 항체의 H 사슬을 코드하는 DNA ((b') 의 DNA) 를 제공한다.
(a) KSISKY (서열 번호 1) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SGS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 QQHNEYPLT (서열 번호 2) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는 L 사슬과, (b) GYTFTDYI (서열 번호 3) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, INPDSGGN (서열 번호 4) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARGITMMVVISHWKFDF (서열 번호 5) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는 H 사슬에 대해서는, 상기 서술하였다. (a') 의 DNA 와 (b') 의 DNA 를 포함하는 DNA 는, 시판되는 합성기를 사용하여 합성할 수 있다. 이 DNA 에는, 제한 효소 인식 부위, KOZAK 서열, 폴리 A 부가 시그널 서열, 프로모터 서열, 인트론 서열 등을 부가해도 된다.
또, 본 발명은, 상기의 항 PD-L1 항체를 코드하는 DNA 를 포함하는 벡터도 제공한다.
벡터로는, 대장균 유래의 플라스미드 (예, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), 고초균 유래의 플라스미드 (예, pUB110, pTP5, pC194), 효모 유래 플라스미드 (예, pSH19, pSH15), λ 파지 등의 박테리오파지, 레트로 바이러스, 백시니아 바이러스 등의 동물 바이러스, 바큘로 바이러스 등의 곤충 병원 바이러스 등을 사용할 수 있다. 후술하는 실시예에서는, pDC6 (일본 특허 제5704753호, US Patent 9096878, EU Patent 2385115, Hong Kong (China) patent HK1163739, Australia Patent 2009331326) 을 사용한다.
벡터에는, 프로모터, 인핸서, 스플라이싱 시그널, 폴리 A 부가 시그널, 인트론 서열, 선택 마커, SV40 복제 오리진 등을 부가해도 된다.
또한, 본 발명은, 상기 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포도 제공한다. 이 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 항체를 채취함으로써, 항 PD-L1 항체를 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 상기 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 항 PD-L1 항체를 채취하는 것을 포함하는, 항체의 제조 방법도 제공한다. 본 발명의 항체의 제조 방법에 있어서, L 사슬을 코드하는 DNA 와 H 사슬을 코드하는 DNA 를 포함하는 DNA 를 삽입한 벡터를 숙주 세포에 트랜스펙션해도 되고, L 사슬을 코드하는 DNA 를 삽입한 벡터와 H 사슬을 코드하는 DNA 를 삽입한 벡터를 숙주 세포에 코트랜스펙션해도 된다.
숙주 세포로는, 세균 세포 (예를 들어, 에쉐리히아 속균, 바실루스 속균, 고초균 등), 진균 세포 (예를 들어, 효모, 아스페르길루스 등), 곤충 세포 (예를 들어, S2 세포, Sf 세포 등), 동물 세포 (예를 들어, CHO 세포, COS 세포, HeLa 세포, C127 세포, 3T3 세포, BHK 세포, HEK293 세포 등), 식물 세포 등을 예시할 수 있다. 이 중, 디하이드로엽산 환원 효소 결손 세포인 CHO-DG44 세포 (CHO-DG44(dhfr-/-)) 가 바람직하다.
재조합 벡터를 숙주에 도입하려면, Molecular Cloning 2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989 에 기재된 방법 (예를 들어, 인산칼슘법, DEAE-덱스트란법, 트랜스펙션법, 마이크로인젝션법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법, 형질 도입법, 스크레이프 로딩법, 쇼트건법 등) 또는 감염에 의해 실시할 수 있다.
형질 전환체를 배지에서 배양하고, 배양물로부터 본 발명의 항 PD-L1 항체를 채취할 수 있다. 항체가 배지에 분비되는 경우에는, 배지를 회수하고, 그 배지로부터 항체를 분리하고, 정제하면 된다. 항체가 형질 전환된 세포 내에 산생되는 경우에는, 그 세포를 용해하고, 그 용해물로부터 항체를 분리하고, 정제하면 된다.
배지로는, OptiCHO 배지, Dynamis 배지, CD CHO 배지, ActiCHO 배지, FortiCHO 배지, Ex-Cell CD CHO 배지, BalanCD CHO 배지, ProCHO 5 배지, Cellvento CHO-100 배지 등을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
배지의 pH 는 배양하는 세포에 따라 상이하지만, 일반적으로는 pH 6.8 ∼ 7.6, 대부분의 경우 pH 7.0 ∼ 7.4 가 적당하다.
배양하는 세포가 CHO 세포인 경우, CHO 세포의 배양은 당업자에 공지된 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 통상, 기상의 CO2 농도가 0 ∼ 40 ％, 바람직하게는, 2 ∼ 10 ％ 의 분위기하, 30 ∼ 39 ℃, 바람직하게는 37 ℃ 정도에서, 배양하는 것이 가능하다.
적당한 배양 기간은, 통상 1 일 ∼ 3 개월이고, 바람직하게는 1 일 ∼ 3 주간이다.
항체의 분리 및 정제는, 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 공지된 분리, 정제법으로는, 염석이나 용매 침전법 등의 용해도의 차를 이용하는 방법, 투석법, 한외 여과법, 겔 여과법, 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 등의 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피 등의 하전의 차를 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기 영동법 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등이 사용된다.
본 발명의 항 PD-L1 항체는, 하이브리도마의 배양에 의해 제조할 수도 있다. 하이브리도마는, 기보 (Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology. 2014 Aug ; 142(4) : 551-61.) 에 기재된 방법으로 제작할 수 있다. 항 PD-L1 항체 6C11-3A11 을 산생하는 하이브리도마는, 본 발명자들의 연구실 (홋카이도 대학 대학원 수의학 연구과 동물 질병 제어학 강좌·감염증학 교실) 에 보관되어 있다.
본 발명의 항 PD-L1 항체는, PD-L1 의 검출에 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 상기의 항 PD-L1 항체를 유효 성분으로서 포함하는, PD-L1 을 검출하기 위한 조성물을 제공한다.
PD-L1 의 검출은, 예를 들어 면역 조직 화학 염색법, 면역 세포 화학 염색법, 플로 사이토메트리, 효소 결합 면역 흡착법 (ELISA), 웨스턴 블롯법 등으로 실시할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
검체로는, 생체로부터 채취된 조직이나 체액 (예를 들어, 혈액 (전혈, 혈장, 혈청 외에, 적혈구, 백혈구, 림프구 등의 특정 세포), 뇨, 타액 등) 등의 시료, 세포 배양액, 배양 세포 (주화된 세포, 초대 배양 세포, 계대된 세포 등) 등을 예시할 수 있다. 검체의 유래는, 특별히 제한되지 않고, 래트, 개, 양, 염소, 돼지, 고양이, 인간, 말, 소, 물소, 야크, 토끼, 마우스, 햄스터, 모르모트 등을 들 수 있다.
본 발명의 항 PD-L1 항체는, 방사성 동위 원소, 효소, 발광 물질, 형광 물질, 비오틴 등으로 표지되어도 된다. 또, 타깃 분자 (PD-L1) 에 특이적으로 결합하는 1 차 항체 (본 발명의 항 PD-L1 항체) 의 반응 후, 이 1 차 항체에 결합하는 2 차 항체를 반응시켜, 타깃 분자의 검출을 실시하는 경우에는, 2 차 항체를 표지하면 된다.
PD-L1 은, 암세포나 바이러스 감염 세포에 강하게 발현하고 있기 때문에, 본 발명의 조성물은, 암 및/또는 감염증의 진단에 사용할 수 있다. 통상, PD-L1 과 항 PD-L1 항체의 결합체의 양 (농도) 에 기초하여, 검체 중의 PD-L1 의 양 (농도) 이 결정된다. 검체 중의 PD-L1 의 양 (농도) 이, 음성 컨트롤 (예를 들어, 정상적인 주위 조직 (결합 조직이나 혈관 등)) 과 비교하여 높으면, 암 및/또는 감염증이라고 진단될 수 있다. 혹은, 검체 중에 PD-L1 이 검출되면, 암 및/또는 감염증이라고 진단될 수 있다.
암 및/또는 감염증으로는, 종양성 질환 (예를 들어, 악성 흑색종, 폐암, 위암, 신장암, 유암, 방광암, 식도암, 난소암 등), 백혈병, 요네병, 아나플라즈마병, 세균성 유방염, 진균성 유방염, 마이코플라즈마 감염증 (예를 들어, 마이코플라즈마성 유방염, 마이코플라즈마성 폐렴 등), 결핵, 소형 피로플라즈마병, 크립토스포리듐증, 콕시듐증, 트리파노소마병 및 리슈마니아증 등을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 의해, 항 PD-L1 항체를 사용한 치료에 적절한 피험 동물을 선정할 수 있다. 예를 들어, 치료의 후보 동물은, 이하의 2 점 :
1. 병리 검사에서 암 (예를 들어, 멜라노마) 또는 감염증으로 진단된 증례
2. 항 PD-L1 항체에서 양성을 나타낸 증례
를 만족하고 있는 것으로 하면 된다. 음성 컨트롤은, 정상적인 주위 조직 (결합 조직이나 혈관 등) 으로 하고, 양성 컨트롤은, 암 (예를 들어, 멜라노마) 또는 감염증의 증례로 하면 된다. 기본적으로는, 종양의 거의 전영역이 면역 조직 화학 염색으로 양성이 되는 것을 치험의 대상으로 하면 된다.
피험 동물은, 특별히 제한되지 않고, 래트, 개, 양, 염소, 돼지, 고양이, 인간, 말, 소, 물소, 야크, 토끼, 마우스, 햄스터, 모르모트 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물은, 추가로, 표지를 검출하기 위한 시약, 희석액, 세정액, 진단·선정 기준을 기재한 사용 설명서 등을 포함해도 된다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
1. 서론
면역 억제 수용체 Programmed death 1 (PD-1) 과 그 리간드인 Programmed death ligand 1 (PD-L1) 은 과잉의 면역 응답을 억제하고, 면역 관용에 깊이 관련하고 있는 인자로서 교토 대학, 혼죠 타스쿠씨 등에 의해 동정된 분자이다. 각종 동물의 감염증이나 종양에 있어서의 면역 억제에 관여하고 있는 것도 최근 밝혀지고 있다. 본 실시예에서는, 래트를 면역함으로써 항소 PD-L1 모노클로날 항체를 작성하고, 개의 PD-L1 을 검출 가능한 클론 (6C11-3A11) 을 선별하였다. 또한 개 악성 흑색종 그 밖의 악성 종양이나, 돼지·양의 감염증에 있어서, 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 이 PD-L1 의 검출에 유용한지를 면역 조직 화학 염색법에 의해 검토하였다.
2. 재료 및 방법
2.1 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 산생 세포
소 PD-L1 유전자 서열을 동정하고 (Ikebuchi R, Konnai S, Shirai T, Sunden Y, Murata S, Onuma M, Ohashi K. Vet Res. 2011 Sep 26 ; 42 : 103.), 그 유전자 정보로부터 재조합 소 PD-L1 을 제작하였다. 동 재조합 단백질을 래트의 족척에 면역하고, 장골 림프절법을 사용하여 하이브리도마를 수립하여, 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를 복수 얻었다 (Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology. 2014 Aug ; 142(4) : 551-61.). 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 은 동 면역 래트로부터 수립된 모노클로날 항체의 하나이다.
2.2 완전장 개 PD-L1 유전자의 동정
개 PD-L1 cDNA 전장을 결정하기 위해, 먼저 The National Center for Biotechnology Information (NCBI) 에 이미 등록되어 있는 개 PD-L1 의 예상 염기 서열 (GenBank accession number ; XM_541302) 로부터 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 내부를 증폭하도록 프라이머 (cPD-L1 inner F 및 R) 를 설계하고 PCR 법을 실시하였다. 얻어진 증폭 산물에 대하여, 통상적인 방법에 따라 캐필러리 시퀸서에 의해 염기 서열을 결정하였다. 또한 완전장 PD-L1 cDNA 의 염기 서열을 결정하기 위해, 상기에서 결정한 개 PD-L1 cDNA 서열을 기초로 프라이머 (cPD-L1 5' GSP 및 3' GSP) 를 설계하고, 각각 5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends 및 3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends (Invitrogen 사) 를 사용하여 5' 및 3' RACE 법을 실시하였다. 5' 및 3' RACE 법에 의해 얻어진 목적으로 하는 유전자 단편은 상기의 방법에 따라 염기 서열을 결정하였다 (Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One. 2014 Jun 10 ; 9(6) : e98415.).
프라이머 (cPD-L1 inner F) : ATGAGAATGTTTAGTGTCTT (서열 번호 22)
프라이머 (cPD-L1 inner R) : TTATGTCTCTTCAAATTGTATATC (서열 번호 23)
프라이머 (cPD-L1 5' GSP) : TTTTAGACAGAAAGTGA (서열 번호 24)
프라이머 (cPD-L1 3' GSP) : GACCAGCTCTTCTTGGGGAA (서열 번호 25)
2.3 개 PD-L1 발현 COS-7 세포의 구축
개 PD-L1-EGFP 발현 플라스미드를 제작하기 위해, 합성한 비글 PBMC 유래 cDNA 를 주형으로, 5' 말단측에 제한 효소 BglII 및 EcoRI (PD-L1) 인식 부위를 부가하여 설계한 프라이머 (cPD-L1-EGFP F 및 R) 를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 BglII (New England Biolabs 사) 및 EcoRI (Takara 사) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 pEGFP-N2 벡터 (Clontech 사) 에 클로닝을 실시하였다. 얻어진 목적의 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit (Qiagen 사) 를 사용하여 추출하고, 실험에 제공할 때까지 -30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제작한 발현 플라스미드를 pEGFP-N2-cPD-L1 로 표기하였다.
프라이머 (cPD-L1-EGFP F) : GAAGATCTATGAGAATGTTTAGTGTC (서열 번호 26)
프라이머 (cPD-L1-EGFP R) : GGAATTCTGTCTCTTCAAATTGTATATC (서열 번호 27)
5×104/㎠ 의 COS-7 세포를 6 웰 플레이트에 계대하고, 10 ％ 비동화 소 태자 혈청, 0.01 ％ L-글루타민을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 37 ℃, 5 ％ CO2 존재하에서 하룻밤 배양하였다. pEGFP-N2-cPD-L1 또는 음성 대조로서 pEGFP-N2 0.4 ㎍/㎠ 를 Lipofectamine 2000 시약 (Invitrogen 사) 을 사용하여, COS-7 세포에 각각 도입하고 48 시간 배양하였다 (개 PD-L1-EGFP 발현 세포 또는 EGFP 발현 세포). 제작한 발현 세포에 있어서의 PD-L1 의 발현을 확인하기 위해, 도립형 공초점 레이저 현미경 LSM700 (ZEISS 사) 에 의해, Enhanced green fluorescent protein (EGFP) 의 세포 내 국재를 가시화하였다 (Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One. 2014 Jun 10 ; 9(6) : e98415.).
2.4 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 의 개 PD-L1 에 대한 교차 반응성
래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 이 개 PD-L1 에 특이적으로 결합하는 것을 확인하기 위해, 2.3 에서 제작한 개 PD-L1-EGFP 발현 세포 또는 EGFP 발현 세포를 사용하여 플로 사이토메트리를 실시하였다. 2×105-1×106 개의 세포에 대하여, 10 ㎍/㎖ 의 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 을 실온에서 30 분간 반응시키고, 세정한 후에 알로피코시아닌 (Allophycocyanine) 표지 염소 항래트 Ig 항체 (Beckman Coulter 사) 를 사용하여 세포 표면에 결합한 항체의 검출을 실시하였다. 해석에는 FACS Verse (Becton, Dickinson and Company 사) 를 사용하였다. 음성 대조 항체로서, 래트 IgG2a(κ) 아이소타입 컨트롤 (BD Biosciences 사) 을 사용하였다. 또한, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 10 ％ 비동화 염소 혈청가 (加) PBS 를 사용하였다. 결과를 도 1 에 나타낸다.
2.5 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 의 CDR 해석
래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 을 산생하는 하이브리도마로부터 항체 중사슬 및 경사슬 유전자를 RACE 법에 의해 동정하였다. NCBI IGBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) 를 사용하여, 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 의 상보성 결정 영역 (CDR) 을 결정하였다. 결과를 도 2 에 나타낸다.
2.6 개 종양 조직, 양·돼지 감염 조직을 사용한 면역 조직 화학 염색
래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 이 개 종양에 대한 PD-L1 면역 조직 화학 염색에 응용 가능한 것을 확인하기 위해, 포르말린 고정, 파라핀 포매 개 종양 샘플을 사용하여 면역 조직 화학 염색을 실시하였다. 통상적인 방법에 따라, 탈파라핀 처치 후, 시트르산 버퍼로 마이크로웨이브 처치 (5 분, 2 회) 를 실시하였다. 그 후, PD-L1 항체 (6C11-3A11) (400 배 희석) 를 사용하여 30 분 반응 후, 심플스테인 마우스 MAX-PO (Rat) (니치레이 바이오사이언스사) 를 사용하여 30 분간 반응시켰다. 발색은 디아미노벤지딘 (DAB) 으로 10 분 반응시켰다.
결과를 도 3, 4, 5a, 5b, 6 및 7 에 나타낸다.
유일하게, 멜라노마 전용 항체로 시판되고 있는 항 MelanA 항체는 거의 염색되지 않았다 (도 3 좌). 한편, 본 발명자들이 수립한 PD-L1 항체 (6C11-3A11) 는 매우 효과적으로 종양 세포를 염색하였다 (도 3 우). PD-L1 항체 (IgG : 6C11-3A11) 는, 거의 모든 멜라노마 증례의 염색이 가능하였다.
개 멜라노마에서는, 종양 세포는 PD-L1 항체 (6C11-3A11) 에 미만성에 양성을 나타내고 있었다. (양성수/검토수 : 12/12, 양성률 100 ％)
개 림프종에서는, PD-L1 항체 (6C11-3A11) 에 미만성에 양성을 나타내고 있다. 개 골육종에서는, 일부의 종양 세포의 세포질에 양성 이미지가 확인되었다. 개 신세포암에서는, 여러 가지 조직형에 있어서, 미만성에 종양 세포는 양성을 나타냈다.
양 리스테리아 증례에 있어서는, 신경 증상을 나타낸 양 리스테리아증의 뇌병변의 PD-L1 염색 이미지를 도 6 좌측에 나타낸다. 그 확대 사진에서는, 뇌병변부에 침윤하는 마크로파지에 PD-L1 의 발현이 확인되었다 (도 6 우).
돼지 써코 바이러스 2 형 감염증 예에 있어서는, PD-L1 이 림프 여포에서 염색되고, 이들의 세포에서 바이러스가 염색되어 있다 (도 7 좌).
돼지 마이코플라즈마 폐렴 예에 있어서는, 폐병변에서 다수의 마크로파지의 침윤이 일어나 있고, 이들의 침윤 세포에서 PD-L1 이 염색되어 있다 (도 7 우).
이상과 같이, 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 은 개 악성 흑색종을 비롯한 각종 개 종양 그리고 양·돼지의 감염증에 있어서 면역 조직 화학 염색법에 의한 PD-L1 의 검출에 사용 가능하고, 동물 횡단적 또한 질병 횡단적으로 질병의 진단에 사용할 수 있는 가능성이 밝혀졌다.
[실시예 2]
1. 서론
모노클로날 항체는 하이브리도마를 배양하고, 그 배양 상청으로부터 항체를 정제함으로써 산생할 수 있다. 또, 그 항체의 유전자 서열이 동정된 경우에는, 그 유전자 서열을 발현시키는 벡터를 배양 세포에 트랜스펙션함으로써 항체의 발현 세포를 작성하고, 하이브리도마의 대체로 할 수 있다. 본 실시예에서는, 발현 벡터와 포유류 세포를 사용한 단백질의 발현계에 의해 항체를 산생하는 방법을 예시한다.
2. 재료 및 방법
2.1 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 발현 벡터의 제작
[실시예 1] 의 2.5 에서 동정한 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 의 유전자 정보를 기초로, NotI 제한 효소 인식 서열, KOZAK 서열, 항체 경사슬 서열, 폴리 A 부가 시그널 서열 (PABGH), 프로모터 서열 (PCMV), SacI 제한 효소 인식 서열, 인트론 서열 (INRBG), KOZAK 서열, 항체 중사슬 서열, XbaI 제한 효소 인식 서열을 상기의 순으로 배치하도록 유전자 합성을 실시한다. 이 때, 항체의 유전자는 발현시키는 세포의 종류에 따라 코돈 최적화를 실시한 것을 사용해도 된다. 합성한 유전자 사슬을, 발현용 벡터 pDC6 (홋카이도 대학 인수 공통 감염증 리서치 센터 스즈키 야스히코 교수로부터 분여) 의 클로닝 사이트 (PCMV 하류, INRBG 와 PABGH 의 사이에 있는 NotI 및 XbaI 제한 효소 인식 서열) 에 제한 효소 인식 서열을 이용하여 상기의 순으로 배치하도록 삽입하고, 래트 항 PD-L1 항체 6C11-3A11 발현 벡터를 구축한다.
2.2 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 의 발현
2.1 에서 작성한 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 발현 pDC6 벡터를 디하이드로엽산 환원 효소 결손 세포인 CHO-DG44 세포 (CHO-DG44(dfhr-/-)) 에 트랜스펙션하고, 고발현 클론을 도트 블롯법에 의해 선발한다. 더욱 발현량을 증대시키고 싶은 경우에는 60 nM, 250 nM, 1000 nM 의 메토트렉세이트 (Mtx) 를 포함하는 배지에서 부하를 가함으로써 유전자 증폭 처리를 실시할 수 있다. 상기와 같이 작성한 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 안정 발현 세포는, Mtx 를 포함하지 않는 Opti-CHO 배지로 옮겨, 14 일간의 진탕 배양 (125 rpm, 37 ℃, 5 ％ CO2) 을 실시함으로써 목적의 항체를 포함하는 배양 상청을 얻을 수 있다. 배양 상청 중의 항체는 어피니티 크로마토그래피나 이온 교환 크로마토그래피 등의 공지된 방법에 의해 정제하고, 각 실험에 사용할 수 있다.
[실시예 3]
1. 서론
본 실시예에서는, 종양 질환에 대한 신규 진단법의 확립을 목적으로 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 (6C11-3A11) 의 가변 영역 유전자와, 인간 면역 글로불린 (IgG4) 의 정상 영역 유전자를 조합한 키메라 항체 유전자를 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cell : CHO 세포) 를 배양 증식시켜, 래트-인간 키메라 항 PD-L1 항체를 얻는다.
2. 재료 및 방법
2.1 래트-인간 키메라 항 PD-L1 항체 발현 벡터의 제작 (도 10)
이하, 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 6C11-3A11 을 래트-인간 키메라 항 PD-L1 항체의 가변부로 하고, 래트-인간 키메라 항 PD-L1 항체를 수립한다.
래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 을 산생하는 하이브리도마로부터 가변 영역 (중사슬 및 경사슬) 유전자를 동정하였다. 또한, 당해 래트 항체 중사슬 및 경사슬 가변 영역 서열을 이미 알려진 인간 항체의 중사슬 IgG4 의 정상 영역 및 경사슬 카파 사슬의 정상 영역과 결합시킨 유전자 서열을 작성하고, 코돈 최적화를 실시한 후, NotI 제한 효소 인식 서열, KOZAK 서열, 키메라 항체 경사슬 서열, 폴리 A 부가 시그널 서열 (PABGH), 프로모터 서열 (PCMV), SacI 제한 효소 인식 서열, 인트론 서열 (INRBG), KOZAK 서열, 키메라 항체 중사슬 서열, XbaI 제한 효소 인식 서열을 상기의 순으로 배치하도록 유전자 합성을 실시한다. 합성한 유전자 사슬을, 발현용 벡터 pDC6 (홋카이도 대학 인수 공통 감염증 리서치 센터 스즈키 야스히코 교수로부터 분여) 의 클로닝 사이트 (PCMV 하류, INRBG 와 PABGH 의 사이에 있는 NotI 및 XbaI 제한 효소 인식 서열) 에 제한 효소 인식 서열을 이용하여 상기의 순으로 배치하도록 삽입하고 (도 10), 래트-인간 키메라 항 PD-L1 항체 발현 벡터를 구축한다. 이 발현 벡터를 디하이드로엽산 환원 효소 결손 세포인 CHO-DG44 세포 (CHO-DG44(dfhr-/-)) 에 트랜스펙션하고, 고발현 클론을 도트 블롯법에 의해 선발한다. 더욱 발현량을 증대시키고 싶은 경우에는 60 nM, 250 nM, 1000 nM 의 메토트렉세이트 (Mtx) 를 포함하는 배지에서 부하를 가함으로써 유전자 증폭 처리를 실시할 수 있다. 상기와 같이 작성한 래트-인간 키메라 항 PD-L1 항체 안정 발현 세포는, Mtx 를 포함하지 않는 Opti-CHO 배지로 옮겨, 14 일간의 진탕 배양 (125 rpm, 37 ℃, 5 ％ CO2) 을 실시함으로써 목적의 항체를 포함하는 배양 상청을 얻을 수 있다. 배양 상청 중의 항체는 어피니티 크로마토그래피나 이온 교환 크로마토그래피 등의 공지된 방법에 의해 정제하고, 각 실험에 사용할 수 있다.
[실시예 4]
1. 서론
개 종양에 있어서의 PD-L1 에 대해서는, 과거에 래트 항소 PD-L1 항체 6G7-E1 을 사용한 면역 조직 화학 염색법에 의한 검사법이 수립되고, 각종 종양에 있어서의 발현 상태가 보고되어 있다 (Maekawa N, Konnai S, Okagawa T, Ikebuchi R, Izumi Y, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Kato Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One. 2016 Jun 11(6) : e0157176.). 본 실시예에서는, 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 6C11-3A11 이, 개 종양에 있어서의 PD-L1 의 발현 해석에 있어서, 기존의 항 PD-L1 항체인 6G7-E1 보다 유용한지를 검토하기 위해, 각종 개 종양에 있어서 면역 조직 화학 염색을 실시하고, 6G7-E1 과 6C11-3A11 의 PD-L1 검출 감도의 직접 비교를 실시하였다.
2. 재료와 방법
2.1 개 PD-L1-EGFP 안정 발현 CHO-DG44 세포를 사용한 플로 사이토메트리에 의한 비교 (도 11)
먼저, 개 PD-L1 막 발현 세포를 작성하기 위해, [실시예 1] 의 2.3 에서 제작한 개 PD-L1-EGFP 발현 플라스미드 (pEGFP-N2-cPD-L1) 혹은 음성 대조로서 pEGFP-N2 (2.5 ㎍) 를, 4×106 개의 CHO-DG44 세포에 Lipofectamine LTX (Invitrogen 사) 를 사용하여 도입하였다. 48 시간 후, G418 (Enzo Life Science 사) 800 ㎍/㎖, GlutaMAX 보충제 (Life technologies 사) 20 ㎖/ℓ, 10 ％ Pluronic F-68 (Life technologies 사) 18 ㎖/ℓ 를 포함하는 CD DG44 배지 (Life technologies 사) 로 배지 교환하고, 안정 발현 세포의 선별과 한계 희석법에 의한 클로닝을 실시하였다. 작성한 개 PD-L1 막 발현 세포 혹은 EGFP 발현 세포에, 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 6C11-3A11 또는 6G7-E1 을 실온에서 30 분간 반응시키고, 세정한 후에 알로피코시아닌 (Allophycocyanine) 표지 염소 항래트 Ig 항체 (Beckman Coulter 사) 를 사용하여 세포 표면에 결합한 항체의 검출을 실시하였다. 해석에는 FACS Verse (Becton, Dickinson and Company 사) 를 사용하였다. 음성 대조 항체로서, 래트 IgG2a(κ) 또는 IgM(κ) 아이소타입 컨트롤 (BD Biosciences 사) 을 사용하였다. 또한, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 10 ％ 비동화 염소 혈청가 PBS 를 사용하였다.
결과를 도 11 에 나타낸다. 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 6C11-3A11 및 6G7-E1 은, 개 PD-L1 막 발현 세포에 특이적으로 결합하였다. 얻어진 형광 강도는 6G7-E1 보다 6C11-3A11 쪽이 높고, 6C11-3A11 이 고친화성 항체인 것이 시사되었다.
2.2 각종 개 종양의 PD-L1 발현 해석 (면역 조직 화학 염색) 에 있어서의 양항체의 검출 감도의 비교
개의 피부 편평 상피암 (n = 5), 비강내 선암 (n = 5), 이행 상피암 (n = 5), 항문낭 선암 (n = 5), 연부 조직 육종 (n = 5), 골육종 (n = 5) 의 샘플에 대하여, [실시예 1] 의 2.6 에 나타낸 방법에 따라 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 6C11-3A11 에 의한 면역 조직 화학 염색을 실시하였다. 래트 항소 PD-L1 모노클로날 항체 6G7-E1 에 의해서도, 동일한 검체 유래의 절편을 사용하여 면역 조직 화학 염색을 동일한 방법에 의해 실시하였다. 이 때 사용한 6G7-E1 의 종농도는 10 ㎍/㎖ 이고, 2 차 항체에는 비오틴 표지 염소 항래트 IgM 항체 (Jackson ImmunoResearch Laboratories 사) 를 사용하였다.
결과를 도 12 및 도 13 에 나타낸다. 편평 상피암, 비강내 선암, 이행 상피암, 항문낭 선암, 및 연부 조직 육종에 있어서는 6G7-E1 에 의한 염색에서는 특이적인 시그널이 관찰되지 않은 데 대하여, 6C11-3A11 을 사용한 염색에서는 양호한 양성 반응이 얻어졌다. 한편으로 골육종에 있어서는, 6G7-E1 에서도 특이적인 시그널이 얻어지기는 했지만, 그 강도는 6C11-3A11 에 의한 염색 쪽이 우수했다. 6C11-3A11 염색에 의해 얻어진 이들 종양의 PD-L1 양성률은 연부 조직 육종을 제외한 상기 모든 종양종에서 100 ％ (5 례 중 5 례) 였다. 한편, 연부 조직 육종에서는 80 ％ (5 례 중 4 례) 에서 PD-L1 양성이었다.
다음으로 6C11-3A11 을 사용한 면역 조직 화학 염색에 의해, 구강내 악성 흑색종 (n = 17), 유선 선암 (n = 10), 조직구 육종 (n = 10), 미만성 대세포성 B 세포 림프종 (n = 10), 가이식성 성기 육종 (n = 4) 의 샘플의 PD-L1 발현을 해석하였다.
결과를 도 14 에 나타낸다. 이들 종양의 PD-L1 양성률은 구강내 악성 흑색종에서 100 ％ (17 례 중 17 례), 유선 선암에서 100 ％ (10 례 중 10 례), 조직구 육종에서 20 ％ (10 례 중 2 례), 미만성 대세포성 B 세포 림프종에서 20 ％ (10 례 중 2 례), 가이식성 성기 육종에서 0 ％ (4 례 중 0 례) 였다.
이상의 결과로부터, 개 PD-L1 의 검출에 있어서, 6C11-3A11 은 기존의 항 PD-L1 항체인 6G7-E1 보다 우수한 것이 밝혀졌다.
[실시예 5]
1. 서론
요네병은, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis 에 의한 소의 만성 감염증이다. 요네병에 이환한 소에서는, 요네균의 감염 국소인 회장 병변부에서, 요네균 감염 세포에 있어서의 PD-L1 의 발현이 확인되어 있다 (Okagawa T, Konnai S, Nishimori A, Ikebuchi R, Mizorogi S, Nagata R, Kawaji S, Tanaka S, Kagawa Y, Murata S, Mori Y and Ohashi K. Infect Immun, 84 : 77-89, 2016.). 본 실시예에서는, 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 이 소의 PD-L1 의 검출에 사용 가능한지 검토하는 목적으로 요네병 이환 소의 회장 병변부의 면역 조직 화학 염색을 실시하였다.
2. 재료 및 방법
2.1. 소 PD-L1 발현 세포의 구축
소 PD-L1 유전자 (GenBank accession number AB510902 ; Ikebuchi R, Konnai S, Shirai T, Sunden Y, Murata S, Onuma M, Ohashi K. Vet. Res. 2011 Sep. 26 ; 42 : 103.) 에 대하여 cDNA 전장의 염기 서열을 결정하고, 그 유전자 정보로부터 소 PD-L1 막 발현 세포를 제작하였다. 먼저, 소 PD-L1 발현 플라스미드를 제작하기 위해, 합성한 소 PBMC 유래 cDNA 를 주형으로 하여, 5' 말단측에 제한 효소 NheI 및 XhoI 인식 부위를 부가한 프라이머 (boPD-L1-EGFP F 및 R) 를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 NheI (Takara 사) 및 XhoI (Takara 사) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 pEGFP-N2 벡터 (Clontech 사) 에 도입하고, 클로닝을 실시하였다. 얻어진 목적의 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit (Qiagen 사) 를 사용하여 추출하고, 실험에 제공할 때까지 -30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제작한 발현 플라스미드를 pEGFP-N2-boPD-L1 로 표기한다.
프라이머 (boPD-L1-EGFP F) : CTAGCTAGCACCATGAGGATATATAGTGTCTTAAC (서열 번호 124)
프라이머 (boPD-L1-EGFP R) : CAATCTCGAGTTACAGACAGAAGATGACTGC (서열 번호 125)
이하의 순서에 따라, 소 PD-L1 막 발현 세포를 제작하였다. 먼저, 4×106 개의 CHO-DG44 세포에 2.5 ㎍ 의 pEGFP-N2-boPD-L1 혹은 음성 대조로서 pEGFP-N2 를 Lipofectamine LTX (Invitrogen 사) 를 사용하여 도입하였다. 48 시간 후, G418 (Enzo Life Science 사) 800 ㎍/㎖, GlutaMAX 보충제 (Life technologies 사) 20 ㎖/ℓ, 10 ％ 플루로닉 (Pluronic) F-68 (Life technologies 사) 18 ㎖/ℓ 를 포함하는 CD DG44 배지 (Life technologies 사) 로 배지 교환하고, 셀렉션을 실시함과 동시에 한계 희석법에 의해 클로닝을 실시하였다 (소 PD-L1-EGFP 발현 세포 그리고 EGFP 발현 세포). 제작한 소 PD-L1-EGFP 발현 세포에 있어서의 소 PD-L1 의 발현을 확인하기 위해, 도립형 공초점 레이저 현미경 LSM700 (ZEISS 사) 에 의해, EGFP 의 세포 내 국재를 가시화하였다.
2.2. 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 의 소 PD-L1 에 대한 결합 특이성
래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 이 소 PD-L1-EGFP 발현 세포 (전술) 에 대하여 특이적으로 결합하는 것을 플로 사이토메트리법에 의해 확인하였다. 먼저, 소 PD-L1 발현 세포, 혹은 EGFP 발현 세포 (음성 대조) 에 대하여 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11, 또는 음성 대조 항체로서 래트 IgG2a(κ) 아이소타입 컨트롤 (BD Biosciences 사) 을 실온에서 30 분간 반응시켰다. 세정 후, APC 표지 항래트 Ig 염소 항체 (Southern Biotech 사) 를 실온에서 30 분간 반응시켰다. 세정 후, 세포 표면에 결합한 항체를 FACS Verse (BD Biosciences 사) 에 의해 검출하였다. 또한, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 1 ％ 소 혈청 알부민 (Sigma-Aldrich 사) 을 첨가한 PBS 를 사용하였다.
결과를 도 15 에 나타낸다. 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 은, 소 PD-L1 발현 세포에 특이적으로 결합하는 것이 밝혀졌다.
2.3. 소 감염 조직을 사용한 면역 조직 화학 염색
래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 이 소 조직에 대한 PD-L1 면역 조직 화학 염색에 응용 가능한 것을 확인하기 위해, 포르말린 고정, 파라핀 포매 소 조직 샘플을 사용하여 면역 조직 화학 염색을 실시하였다. 요네병의 야외 발증 소 (#1, 설사나 중증의 삭수 (削瘦) 등 요네병의 임상 증상을 나타내고 있었다), 요네균 실험 감염 소 (#65, 배균 및 설사 등의 임상 증상이 관찰되었다 ; Okagawa T, Konnai S, Nishimori A, Ikebuchi R, Mizorogi S, Nagata R, Kawaji S, Tanaka S, Kagawa Y, Murata S, Mori Y and Ohashi K. Infect Immun, 84 : 77-89, 2016.) 및 비감염 컨트롤 소 (C#6) 의 회장 조직 블록 (농연 기구·동물 위생 연구 부문 모리 야스유키 박사로부터 분여) 을 사용하여, 면역 조직 화학 염색을 실시하였다. 통상적인 방법에 따라, 탈파라핀 처치 후, 시트르산 버퍼로 마이크로웨이브 처치 (5 분, 2 회) 를 실시하였다. 그 후, 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 (400 배 희석) 을 사용하여 30 분 반응 후, 심플스테인 마우스 MAX-PO (Rat) (니치레이 바이오사이언스사) 를 사용하여 30 분간 반응시켰다. 마지막으로, 아미노벤지딘 (DAB) 에 10 분 반응시켜 발색시키고, 광학 현미경을 사용하여 관찰하였다.
결과를 도 16 에 나타낸다. 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 은, 야외 발증 소 #1 및 실험 감염 소 #65 의 회장 병변부에 있어서, 요네균 감염 세포 (Ziehl-Neelsen 염색으로 확인) 에 있어서의 PD-L1 의 발현을 검출하였다 (도 16a, b). 한편, 비감염 소 (C#6) 의 회장에는 PD-L1 은 발현하고 있지 않기 때문에, 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 의 반응 (비특이적 반응) 은 확인되지 않았다 (도 16a).
이상과 같이, 래트 항소 PD-L1 항체 6C11-3A11 은 소의 조직에 있어서 면역 조직 화학 염색법에 의한 PD-L1 의 검출에 사용 가능한 것이 밝혀졌다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 하여 본 명세서에 받아들이는 것으로 한다.
산업상 이용가능성
본 발명의 항 PD-L1 항체는, 암 및/또는 감염증의 진단에 이용할 수 있다. 또, 항 PD-L1 항체를 사용한 치료에 적절한 피험 동물의 선정에 이용할 수 있다.
서열표 프리텍스트
＜서열 번호 1＞ 항 PD-L1 항체 6C11-3A11(IgG2a) 의 L 사슬 가변 영역의 CDR1 의 아미노산 서열을 나타낸다.
KSISKY
＜서열 번호 2＞ 항 PD-L1 항체 6C11-3A11(IgG2a) 의 L 사슬 가변 영역의 CDR3 의 아미노산 서열을 나타낸다.
QQHNEYPLT
＜서열 번호 3＞ 항 PD-L1 항체 6C11-3A11(IgG2a) 의 H 사슬 가변 영역의 CDR1 의 아미노산 서열을 나타낸다.
GYTFTDYI
＜서열 번호 4＞ 항 PD-L1 항체 6C11-3A11(IgG2a) 의 H 사슬 가변 영역의 CDR2 의 아미노산 서열을 나타낸다.
INPDSGGN
＜서열 번호 5＞ 항 PD-L1 항체 6C11-3A11(IgG2a) 의 H 사슬 가변 영역의 CDR3 의 아미노산 서열을 나타낸다.
ARGITMMVVISHWKFDF
＜서열 번호 6＞ 항 PD-L1 항체 6C11-3A11(IgG2a) 의 L 사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
Figure pct00013
＜서열 번호 7＞ 항 PD-L1 항체 6C11-3A11(IgG2a) 의 H 사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
Figure pct00014
＜서열 번호 8＞ 항 PD-L1 항체 6C11-3A11(IgG2a) 의 L 사슬 (kappa 사슬) 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
Figure pct00015
＜서열 번호 9＞ 항 PD-L1 항체 6C11-3A11(IgG2a) 의 H 사슬 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
Figure pct00016
＜서열 번호 10＞ 래트 항체 (IgG2a) 의 L 사슬 (kappa 사슬) 정상 영역의 아미노산 서열 (GenBank : #V01241.1) 을 나타낸다.
Figure pct00017
＜서열 번호 11＞ 래트 항체 (IgG2a) 의 L 사슬 (kappa 사슬) 정상 영역의 아미노산 서열 (GenBank : #X16129.1) 을 나타낸다.
Figure pct00018
＜서열 번호 12＞ 래트 항체 (IgG2a) 의 L 사슬 (kappa 사슬) 정상 영역의 아미노산 서열 (GenBank : #DQ402471.1) 을 나타낸다.
Figure pct00019
＜서열 번호 13＞ 래트 항체 (IgG2a) 의 H 사슬 정상 영역의 아미노산 서열 (GenBank : #DQ402472.1) 을 나타낸다.
Figure pct00020
＜서열 번호 14＞ 항 PD-L1 항체 6C11-3A11(IgG2a) 의 L 사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
Figure pct00021
＜서열 번호 15＞ 항 PD-L1 항체 6C11-3A11(IgG2a) 의 H 사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
Figure pct00022
＜서열 번호 16＞ 항 PD-L1 항체 6C11-3A11(IgG2a) 의 L 사슬 (kappa 사슬) 정상 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
Figure pct00023
＜서열 번호 17＞ 항 PD-L1 항체 6C11-3A11(IgG2a) 의 H 사슬 정상 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
Figure pct00024
＜서열 번호 18＞ 래트 항체 (IgG2a) 의 L 사슬 (kappa 사슬) 정상 영역의 뉴클레오티드 서열 (GenBank : #V01241.1) 을 나타낸다.
Figure pct00025
＜서열 번호 19＞ 래트 항체 (IgG2a) 의 L 사슬 (kappa 사슬) 정상 영역의 뉴클레오티드 서열 (GenBank : #X16129.1) 을 나타낸다.
Figure pct00026
＜서열 번호 20＞ 래트 항체 (IgG2a) 의 L 사슬 (kappa 사슬) 정상 영역의 뉴클레오티드 서열 (GenBank : #DQ402471.1) 을 나타낸다.
Figure pct00027
＜서열 번호 21＞ 래트 항체 (IgG2a) 의 H 사슬 정상 영역의 뉴클레오티드 서열 (GenBank : #DQ402472.1) 을 나타낸다.
Figure pct00028
＜서열 번호 22 ∼ 27＞ 서열 번호 22 ∼ 27 은, 순서대로, 프라이머 cPD-L1 inner F, cPD-L1 inner R, cPD-L1 5' GSP, cPD-L1 3' GSP, cPD-L1-EGFP F 및 cPD-L1-EGFP R 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 28＞
서열 번호 28 은, 인간 항체의 L 사슬 (kappa 사슬) 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 29＞
서열 번호 29 는, 인간 항체의 L 사슬 (kappa 사슬) 정상 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 30＞
서열 번호 30 은, 인간 항체 (IgG4 변이 (variant) 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 31＞
서열 번호 31 은, 인간 항체 (IgG4 변이 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 32＞
서열 번호 32 는, 인간 항체 (IgG4 변이 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 33＞
서열 번호 33 은, 인간 항체 (IgG4 변이 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 34＞
서열 번호 34 는, 인간 항체 (IgG4 변이 3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 35＞
서열 번호 35 는, 인간 항체 (IgG4 변이 3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 36＞
서열 번호 36 은, 마우스 항체의 L 사슬 (kappa 사슬) 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 37＞
서열 번호 37 은, 마우스 항체의 L 사슬 (kappa 사슬) 정상 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 38＞
서열 번호 38 은, 마우스 항체의 L 사슬 (lambda 사슬) 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 39＞
서열 번호 39 는, 마우스 항체의 L 사슬 (lambda 사슬) 정상 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 40＞
서열 번호 40 은, 마우스 항체의 L 사슬 (lambda 사슬) 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 41＞
서열 번호 41 은, 마우스 항체의 L 사슬 (lambda 사슬) 정상 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 42＞
서열 번호 42 는, 마우스 항체의 L 사슬 (lambda 사슬) 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 43＞
서열 번호 43 은, 마우스 항체의 L 사슬 (lambda 사슬) 정상 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 44＞
서열 번호 44 는, 마우스 항체 (IgG1 변이 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 45＞
서열 번호 45 는, 마우스 항체 (IgG1 변이 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 46＞
서열 번호 46 은, 마우스 항체 (IgG1 변이 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 47＞
서열 번호 47 은, 마우스 항체 (IgG1 변이 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 48＞
서열 번호 48 은, 마우스 항체 (IgG2a 변이 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 49＞
서열 번호 49 는, 마우스 항체 (IgG2a 변이 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 50＞
서열 번호 50 은, 마우스 항체 (IgG2a 변이 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 51＞
서열 번호 51 은, 마우스 항체 (IgG2a 변이 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 52＞
서열 번호 52 는, 마우스 항체 (IgG2b 변이 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 53＞
서열 번호 53 은, 마우스 항체 (IgG2b 변이 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 54＞
서열 번호 54 는, 마우스 항체 (IgG2b 변이 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 55＞
서열 번호 55 는, 마우스 항체 (IgG2b 변이 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 56＞
서열 번호 56 은, 마우스 항체 (IgG2c 변이 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 57＞
서열 번호 57 은, 마우스 항체 (IgG2c 변이 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 58＞
서열 번호 58 은, 마우스 항체 (IgG2c 변이 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 59＞
서열 번호 59 는, 마우스 항체 (IgG2c 변이 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 60＞
서열 번호 60 은, 마우스 항체 (IgG2c 변이 3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 61＞
서열 번호 61 은, 마우스 항체 (IgG2c 변이 3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 62＞
서열 번호 62 는, 마우스 항체 (IgG3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 63＞
서열 번호 63 은, 마우스 항체 (IgG3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 64＞
서열 번호 64 는, 소 항체의 L 사슬 (lambda 사슬) 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 65＞
서열 번호 65 는, 소 항체의 L 사슬 (lambda 사슬) 정상 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 66＞
서열 번호 66 은, 소 항체 (IgG1 변이 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 67＞
서열 번호 67 은, 소 항체 (IgG1 변이 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 68＞
서열 번호 68 은, 소 항체 (IgG1 변이 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 69＞
서열 번호 69 는, 소 항체 (IgG1 변이 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 70＞
서열 번호 70 은, 소 항체 (IgG1 변이 3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 71＞
서열 번호 71 은, 소 항체 (IgG1 변이 3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 72＞
서열 번호 72 는, 소 항체 (IgG2 변이 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 73＞
서열 번호 73 은, 소 항체 (IgG2 변이 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 74＞
서열 번호 74 는, 소 항체 (IgG2 변이 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 75＞
서열 번호 75 는, 소 항체 (IgG2 변이 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 76＞
서열 번호 76 은, 소 항체 (IgG2 변이 3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 77＞
서열 번호 77 은, 소 항체 (IgG2 변이 3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 78＞
서열 번호 78 은, 소 항체 (IgG3 변이 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 79＞
서열 번호 79 는, 소 항체 (IgG3 변이 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 80＞
서열 번호 80 은, 소 항체 (IgG3 변이 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 81＞
서열 번호 81 은, 소 항체 (IgG3 변이 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 82＞
서열 번호 82 는, 개 항체의 L 사슬 (lambda 사슬) 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 83＞
서열 번호 83 은, 개 항체의 L 사슬 (lambda 사슬) 정상 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 84＞
서열 번호 84 는, 개 항체 (IgG-D) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 85＞
서열 번호 85 는, 개 항체 (IgG-D) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 86＞
서열 번호 86 은, 양 항체의 L 사슬 (kappa 사슬) 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 87＞
서열 번호 87 은, 양 항체의 L 사슬 (kappa 사슬) 정상 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 88＞
서열 번호 88 은, 양 항체의 L 사슬 (lambda 사슬) 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 89＞
서열 번호 89 는, 양 항체의 L 사슬 (lambda 사슬) 정상 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 90＞
서열 번호 90 은, 양 항체 (IgG1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 91＞
서열 번호 91 은, 양 항체 (IgG1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 92＞
서열 번호 92 는, 양 항체 (IgG2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 93＞
서열 번호 93 은, 양 항체 (IgG2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 94＞
서열 번호 94 는, 돼지 항체 (IgG1a) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 95＞
서열 번호 95 는, 돼지 항체 (IgG1a) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 96＞
서열 번호 96 은, 돼지 항체 (IgG1b) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 97＞
서열 번호 97 은, 돼지 항체 (IgG1b) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 98＞
서열 번호 98 은, 돼지 항체 (IgG2a) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 99＞
서열 번호 99 는, 돼지 항체 (IgG2a) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 100＞
서열 번호 100 은, 돼지 항체 (IgG2b) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 101＞
서열 번호 101 은, 돼지 항체 (IgG2b) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 102＞
서열 번호 102 는, 돼지 항체 (IgG3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 103＞
서열 번호 103 은, 돼지 항체 (IgG3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 104＞
서열 번호 104 는, 돼지 항체 (IgG4a) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 105＞
서열 번호 105 는, 돼지 항체 (IgG4a) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 106＞
서열 번호 106 은, 돼지 항체 (IgG4b) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 107＞
서열 번호 107 은, 돼지 항체 (IgG4b) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 108＞
서열 번호 108 은, 돼지 항체 (IgG5a) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 109＞
서열 번호 109 는, 돼지 항체 (IgG5a) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 110＞
서열 번호 110 은, 돼지 항체 (IgG5b) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 111＞
서열 번호 111 은, 돼지 항체 (IgG5b) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 112＞
서열 번호 112 는, 돼지 항체 (IgG6a) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 113＞
서열 번호 113 은, 돼지 항체 (IgG6a) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 114＞
서열 번호 114 는, 돼지 항체 (IgG6b) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 115＞
서열 번호 115 는, 돼지 항체 (IgG6b) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 116＞
서열 번호 116 은, 물소 항체의 L 사슬 (Ig lambda 로 추정됨) 정상 영역 (CL) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 117＞
서열 번호 117 은, 물소 항체의 L 사슬 (Ig lambda 로 추정됨) 정상 영역 (CL) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 118＞
서열 번호 118 은, 물소 항체 (IgG1 로 추정됨) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 119＞
서열 번호 119 는, 물소 항체 (IgG1 로 추정됨) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 120＞
서열 번호 120 은, 물소 항체 (IgG2 로 추정됨) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 121＞
서열 번호 121 은, 물소 항체 (IgG2 로 추정됨) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 122＞
서열 번호 112 는, 물소 항체 (IgG3 으로 추정됨) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 123＞
서열 번호 123 은, 물소 항체 (IgG3 으로 추정됨) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 124＞
서열 번호 124 는, 프라이머 (boPD-L1-EGFP F) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 125＞
서열 번호 125 는, 프라이머 (boPD-L1-EGFP R) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO UNIVERSITY FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES, LTD. <120> Anti-PD-L1 antibodies for detection of PD-L1 <130> FP-233PCT <150> JP 2017-61389 <151> 2017-03-27 <160> 125 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Bubalus arnee <400> 1 Lys Ser Ile Ser Lys Tyr 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Bubalus arnee <400> 2 Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Bubalus arnee <400> 3 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ile 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Bubalus arnee <400> 4 Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Asn 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Bubalus arnee <400> 5 Ala Arg Gly Ile Thr Met Met Val Val Ile Ser His Trp Lys Phe Asp 1 5 10 15 Phe <210> 6 <211> 127 <212> PRT <213> Bubalus arnee <400> 6 Met Arg Val Gln Ile Gln Phe Trp Gly Leu Leu Leu Leu Trp Thr Ser 1 5 10 15 Gly Ile Gln Cys Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Asn Leu Ala 20 25 30 Ala Ser Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Asn Cys Lys Ala Ser 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Bubalus arnee <400> 44 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro 100 105 110 Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 115 120 125 Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser 130 135 140 Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu 145 150 155 160 Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 165 170 175 Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn 180 185 190 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro 195 200 205 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aaccatctca 660 aaacccaaag ggtcagtaag agctccacag gtatatgtct tgcctccacc agaagaagag 720 atgactaaga aacaggtcac tctgacctgc atggtcacag acttcatgcc tgaagacatt 780 tacgtggagt ggaccaacaa cgggaaaaca gagctaaact acaagaacac tgaaccagtc 840 ctggactctg atggttctta cttcatgtac agcaagctga gagtggaaaa gaagaactgg 900 gtggaaagaa atagctactc ctgttcagtg gtccacgagg gtctgcacaa tcaccacacg 960 actaagagct tctcccggac tccgggtaaa tga 993 <210> 50 <211> 330 <212> PRT <213> Bubalus arnee <400> 50 Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Asn 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tacgtggagt ggaccaacaa cgggaaaaca gagctaaact acaagaacac tgaaccagtc 840 ctggactctg atggttctta cttcatgtac agcaagctga gagtggaaaa gaagaactgg 900 gtggaaagaa atagctactc ctgttcagtg gtccacgagg gtctgcacaa tcaccacacg 960 actaagagct tctcccggac tccgggtaaa tga 993 <210> 52 <211> 336 <212> PRT <213> Bubalus arnee <400> 52 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys 85 90 95 Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu 130 135 140 Thr Pro Lys Val Thr 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caagctcaat 900 atgaaaacaa gcaagtggga gaaaacagat tccttctcat gcaacgtgag acacgagggt 960 ctgaaaaatt actacctgaa gaagaccatc tcccggtctc cgggtaaatg a 1011 <210> 54 <211> 336 <212> PRT <213> Bubalus arnee <400> 54 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Ser Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys 85 90 95 Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu 130 135 140 Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro 145 150 155 160 Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val 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ccgaggtcac gtgtgtggtg 420 gtgaacgtgg gccacgataa ccccgaggtg cagttctcct ggttcgtgga cgacgtggag 480 gtgcacacgg ccaggacgaa gccgagagag gagcagttca acagcacgta ccgcgtggtc 540 agcgccctgc ccatccagca ccaggactgg actggaggaa aggagttcaa gtgcaaggtc 600 aacatcaaag gcctctcggc ctccatcgtg aggatcatct ccaggagcaa agggccggcc 660 cgggagccgc aggtgtatgt cctggaccca cccaaggaag agctcagcaa aagcacggtc 720 agcgtcacct gcatggtcat cggcttctac ccagaagatg tagacgtgga gtggcagaga 780 gaccggcaga ctgagtcgga ggacaagtac cgcacgaccc cgccccagct ggacgccgac 840 cgctcctact tcctgtacag caagctcagg gtggacagga acagctggca gagaggagac 900 acctacacgt gtgtggtgat gcacgaggcc ctgcacaatc actacatgca gaagtccacc 960 tctaagtctg cgggtaaatg a 981 <210> 76 <211> 327 <212> PRT <213> Bubalus arnee <400> 76 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ser Ser Cys Cys Gly 1 5 10 15 Asp Lys Ser Ser Ser Gly Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 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tgcccatcca gcaccaggac tggactggag gaaaggagtt caagtgcaag 600 gtcaacatca aaggcctctc ggcctccatc gtgaggatca tctccaggag caaagggccg 660 gcccgggagc cgcaggtgta tgtcctggac ccacccaagg aagagctcag caaaagcacg 720 gtcagcctca cctgcatggt catcggcttc tacccagaag atgtagacgt ggagtggcag 780 agagaccggc agactgagtc ggaggacaag taccgcacga ccccgcccca gctggacgcc 840 gaccgctcct acttcctgta cagcaagctc agggtggaca ggaacagctg gcagagagga 900 gacacctaca cgtgtgtggt gatgcacgag gccctgcaca atcactacat gcagaagtcc 960 acctctaagt ctgcgggtaa atga 984 <210> 78 <211> 352 <212> PRT <213> Bubalus arnee <400> 78 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ala Ser Ser Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Ser Glu Thr Gln Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys 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atgtcaacca cccggccacc accaccaagg tggacaagcg tgttggaaca 300 aagaccaaac caccatgtcc catatgccca ggctgtgaag tggccgggcc ctcggtcttc 360 atcttccctc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc agacccccga ggtcacgtgc 420 gtggtggtgg acgtcagcaa ggagcacgcc gaggtccagt tctcctggta cgtggacggc 480 gtagaggtgc acacggccga gacgagacca aaggaggagc agttcaacag cacctaccgt 540 gtggtcagcg tcctgcccat ccagcaccag gactggctga aggggaagga gttcaagtgc 600 aaggtcaaca acgtagacct cccagccccc atcacgagga ccatctccaa ggctataggg 660 cagagccggg agccgcaggt gtacaccctg cccccacccg ccgaggagct gtccaggagc 720 aaagtcaccg taacctgcct ggtcattggc ttctacccac ctgacatcca tgttgagtgg 780 aagagcaacg gacagccgga gccagagggc aattaccgca ccaccccgcc ccagcaggac 840 gtggacggga ccttcttcct gtacagcaag ctcgcggtgg acaaggcaag atgggaccat 900 ggagaaacat ttgagtgtgc ggtgatgcac gaggctctgc acaaccacta cacccagaag 960 tccatctcca agactcaggg taaatga 987 <210> 96 <211> 328 <212> PRT <213> Bubalus arnee <400> 96 Ala Pro Lys Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Gly Arg 1 5 10 15 Asp 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Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Thr Val Thr Val Pro Ala Arg Ser Ser Ser Arg Lys Cys 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Asn His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp Leu 85 90 95 Cys Val Gly Arg Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Gly Asn Gly 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 115 120 125 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 130 135 140 Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Glu Glu Val His 145 150 155 160 Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 165 170 175 Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys 180 185 190 Glu Phe Glu Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr 195 200 205 Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Pro Ser Arg Glu Pro Gln Val Tyr 210 215 220 Thr Leu Ser Pro Ser Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile 225 230 235 240 Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp 245 250 255 Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Ser Thr Pro 260 265 270 Pro Gln Glu Asp Glu Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ala 275 280 285 Val Asp Lys Ala Arg Leu Gln Ser Gly Gly Ile His Cys Ala Val Met 290 295 300 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr 305 310 315 320 <210> 115 <211> 960 <212> DNA <213> Bubalus arnee <400> 115 gcccccaaga cggccccatc ggtctaccct ctggccccct gcggcaggga cacgtctggc 60 cctaacgtgg ccttgggctg cctggcctca agctacttcc ccgagccagt gaccgtgacc 120 tggaactcgg gcgccctgac cagtggcgtg cacaccttcc catccgtcct gcagccgtca 180 gggctctact ccctcagcag cacggtgacc gtgccggcca ggagctcgtc cagaaagtgc 240 ttcacgtgca atgtcaacca cccggccacc accaccaagg tggacctgtg tgttggacga 300 ccatgtccca tatgcccagc ctgtgaaggg aacgggccct cggtcttcat cttccctcca 360 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccccgagg tcacgtgcgt ggtggtagat 420 gtgagccagg aaaacccgga ggtccagttc tcctggtacg tggacggcga agaggtgcac 480 acggccgaga cgaggccaaa ggaggagcag ttcaacagca cctaccgtgt ggtcagcgtc 540 ctgcccatcc agcaccagga ctggctgaag ggaaaggagt tcgagtgcaa ggtcaacaac 600 aaagacctcc cagcccccat cacaaggatc atctccaagg ccaaagggcc gagccgggag 660 ccgcaggtgt acaccctgtc cccatccgcc gaggagctgt ccaggagcaa agtcagcata 720 acctgcctgg tcactggctt ctacccacct gacatcgatg tcgagtggaa gagcaacgga 780 cagccggagc cagagggcaa ttaccgctcc accccgcccc aggaggacga ggacgggacc 840 tacttcctgt acagcaaact cgcggtggac aaggcgaggt tgcagagtgg aggcatccac 900 tgtgcggtga tgcacgaggc tctgcacaac cactacaccc agaagtccat ctccaagact 960 <210> 116 <211> 105 <212> PRT <213> Bubalus arnee <400> 116 Gln Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Thr Glu 1 5 10 15 Glu Leu Ser Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ser Met Thr Val Ala Arg Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile 35 40 45 Thr Arg Asn Val Glu Thr Thr Arg Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys Ser 65 70 75 80 Lys Gly Ser Tyr Ser Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Thr 85 90 95 Lys Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser 100 105 <210> 117 <211> 318 <212> DNA <213> Bubalus arnee <400> 117 cagcccaagt ccgcaccctc agtcaccctg ttcccaccct ccacggagga gctcagcgcc 60 aacaaggcca ccctggtgtg tctcatcagc gacttctacc cgggtagcat gaccgtggcc 120 aggaaggcag acggcagcac catcacccgg aacgtggaga ccacccgggc ctccaaacag 180 agcaacagca agtacgcggc cagcagctac ctgagcctga cgggcagcga gtggaaatcg 240 aaaggcagtt acagctgcga ggtcacgcac gaggggagca ccgtgacaaa gacagtgaag 300 ccctcagagt gttcttag 318 <210> 118 <211> 266 <212> PRT <213> Bubalus arnee <400> 118 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ser Thr Val Thr Ala Pro Ala Ser Ala Thr Lys Ser Gln 20 25 30 Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp 35 40 45 Lys Ala Val Val Pro Pro Cys Arg Pro Lys Pro Cys Asp Cys Cys Pro 50 55 60 Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 65 70 75 80 Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 85 90 95 Val Val Asp Val Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe 100 105 110 Val Asp Asp Val Glu Val Asn Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu 115 120 125 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His 130 135 140 Asn Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Tyr Asn Glu 145 150 155 160 Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln 165 170 175 Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Asp Glu Leu 180 185 190 Ser Lys Ser Thr Val Ser Ile Thr Cys Met Val Thr Gly Phe Tyr Pro 195 200 205 Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Lys Asp Gly Gln Pro Glu Ser Glu 210 215 220 Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr 225 230 235 240 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asn Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly 245 250 255 Gly Ala Tyr Thr Cys Val Val Met His Glu 260 265 <210> 119 <211> 801 <212> DNA <213> Bubalus arnee <400> 119 gagcggcgtg cacaccttcc cggccgtcct tcagtcctcc gggctctact ctctcagcag 60 cacggtgacc gcgcccgcca gcgccacaaa aagccagacc ttcacctgca acgtagccca 120 cccggccagc agcaccaagg tggacaaggc tgttgttccc ccatgcagac cgaaaccctg 180 tgattgctgc ccaccccctg agctccccgg aggaccctct gtcttcatct tcccaccaaa 240 acccaaggac accctcacaa tctctggaac tcctgaggtc acgtgtgtgg tggtggacgt 300 gggccacgat gaccccgagg tgaagttctc ctggttcgtg gacgatgtgg aggtaaacac 360 agccaggacg aagccaagag aggagcagtt caacagcacc taccgcgtgg tcagcgccct 420 gcccatccag cacaacgact ggactggagg aaaggagttc aagtgcaagg tctacaatga 480 aggcctccca gcccccatcg tgaggaccat ctccaggacc aaagggcagg cccgggagcc 540 gcaggtgtac gtcctggccc caccccagga cgagctcagc aaaagcacgg tcagcatcac 600 ttgcatggtc actggcttct acccagacta catcgccgta gagtggcaga aagatgggca 660 gcctgagtca gaggacaaat atggcacgac cccgccccag ctggacagcg atggctccta 720 cttcctgtac agcaggctca gggtgaacaa gaacagctgg caagaaggag gcgcctacac 780 gtgtgtagtg atgcatgagg c 801 <210> 120 <211> 309 <212> PRT <213> Bubalus arnee <400> 120 Ala Ser Ile Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Arg Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Thr Val Thr Ala Pro Ala Ser Ala Thr Lys Ser Gln Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Thr 85 90 95 Ala Val Gly Phe Ser Ser Asp Cys Cys Lys Phe Pro Lys Pro Cys Val 100 105 110 Arg Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 115 120 125 Met Ile Thr Gly Asn Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly 130 135 140 Arg Asp Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Gly Asp Val Glu 145 150 155 160 Val His Thr Gly Arg Ser Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 165 170 175 Tyr Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Asn Asp Trp Thr Gly 180 185 190 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 195 200 205 Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln 210 215 220 Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Val 225 230 235 240 Ser Val Thr Cys Met Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val 245 250 255 Glu Trp His Arg Asp Arg Gln Ala Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Arg Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg 275 280 285 Leu Lys Val Asn Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly Gly Ala Tyr Thr Cys 290 295 300 Val Val Met His Glu 305 <210> 121 <211> 929 <212> DNA <213> Bubalus arnee <400> 121 gcctccatca cagccccgaa agtctaccct ctgacttctt gccgcgggga aacgtccagc 60 tccaccgtga ccctgggctg cctggtctcc agctacatgc ccgagccggt gaccgtgacc 120 tggaactcgg gtgccctgaa gagcggcgtg cacaccttcc cggccgtcct tcagtcctct 180 gggctctact ctctcagcag cacggtgacc gcgcccgcca gcgccacaaa aagccagacc 240 ttcacctgca acgtagccca cccggccagc agcaccaagg tggacacggc tgttgggttc 300 tccagtgact gctgcaagtt tcctaagcct tgtgtgaggg gaccatctgt cttcatcttc 360 ccgccgaaac ccaaagacac cctgatgatc acaggaaatc ccgaggtcac atgtgtggtg 420 gtggacgtgg gccgggataa ccccgaggtg cagttctcct ggttcgtggg tgatgtggag 480 gtgcacacgg gcaggtcgaa gccgagagag gagcagttca acagcaccta ccgcgtggtc 540 agcaccctgc ccatccagca caatgactgg actggaggaa aggagttcaa gtgcaaggtc 600 aacaacaaag gcctcccagc ccccatcgtg aggaccatct ccaggaccaa agggcaggcc 660 cgggagccgc aggtgtacgt cctggcccca ccccaggaag agctcagcaa aagcacggtc 720 agcgtcactt gcatggtcac tggcttctac ccagactaca tcgccgtaga gtggcataga 780 gaccggcagg ctgagtcgga ggacaagtac cgcacgaccc cgccccagct ggacagcgat 840 ggctcctact tcctgtacag caggctcaag gtgaacaaga acagctggca agaaggaggc 900 gcctacacgt gtgtagtgat gcatgaggc 929 <210> 122 <211> 352 <212> PRT <213> Bubalus arnee <400> 122 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ala Ser Ser Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Asn 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Met Pro Thr Ser Thr Ala Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Thr 85 90 95 Ala Val Thr Ala Arg His Pro Val Pro Lys Thr Pro Glu Thr Pro Ile 100 105 110 His Pro Val Lys Pro Pro Thr Gln Glu Pro Arg Asp Glu Lys Thr Pro 115 120 125 Cys Gln Cys Pro Lys Cys Pro Glu Pro Leu Gly Gly Leu Ser Val Phe 130 135 140 Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro 145 150 155 160 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val 165 170 175 Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Arg Met 180 185 190 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala 195 200 205 Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Arg Glu Lys Glu Phe Lys Cys 210 215 220 Lys Val Asn Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser 225 230 235 240 Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro 245 250 255 Pro Arg Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu Ser Leu Thr Cys Leu Ile 260 265 270 Thr Gly Phe Tyr Pro Glu Glu Val Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly 275 280 285 Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr His Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp 290 295 300 Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asn Arg Ser 305 310 315 320 Ser Trp Gln Glu Gly Asp His Tyr Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala 325 330 335 Leu Arg Asn His Tyr Lys Glu Lys Pro Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 340 345 350 <210> 123 <211> 1059 <212> DNA <213> Bubalus bubalis <400> 123 gcctccacca cagccccgaa agtctaccct ctggcatcca gctgcgggga cacgtccagc 60 tccaccgtga ccctgggctg cctggtctcc agctacatgc ccgagccggt gaccgtgacc 120 tggaactcgg gtgccctgaa gaacggcgtg cacaccttcc cggccgtccg gcagtcctcc 180 gggctctact ctctcagcag catggtgacc atgcccacca gcaccgcagg aacccagacc 240 ttcacctgca acgtagccca cccggccagc agcaccaagg tggacacggc tgtcactgca 300 aggcatccgg tcccgaagac accagagaca cctatccatc ctgtaaaacc cccaacccag 360 gagcccagag atgaaaagac accctgccag tgtcccaaat gcccagaacc tctgggagga 420 ctgtctgtct tcatcttccc accgaaaccc aaggacaccc tcacaatctc tggaacgccc 480 gaggtcacgt gtgtggtggt ggacgtgggc caggatgacc ccgaagtgca gttctcctgg 540 ttcgtggatg acgtggaggt gcacacagcc aggatgaagc caagagagga gcagttcaac 600 agcacctacc gcgtggtcag cgccctgccc atccagcacc aggactggct gcgggaaaag 660 gagttcaagt gcaaggtcaa caacaaaggc ctcccggccc ccatcgtgag gaccatctcc 720 aggaccaaag ggcaggcccg ggagccacag gtgtatgtcc tggccccacc ccgggaagag 780 ctcagcaaaa gcacgctcag cctcacctgc ctaatcaccg gcttctaccc agaagaggta 840 gacgtggagt ggcagagaaa tgggcagcct gagtcagagg acaagtacca cacgacccca 900 ccccagctgg acgctgacgg ctcctacttc ctgtacagca ggctcagggt gaacaggagc 960 agctggcagg aaggagacca ctacacgtgt gcagtgatgc atgaagcttt acggaatcac 1020 tacaaagaga agcccatctc gaggtctccg ggtaaatga 1059 <210> 124 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 124 ctagctagca ccatgaggat atatagtgtc ttaac 35 <210> 125 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 125 caatctcgag ttacagacag aagatgactg c 31

Claims (18)

  1. (a) KSISKY (서열 번호 1) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SGS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 QQHNEYPLT (서열 번호 2) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는 L 사슬과, (b) GYTFTDYI (서열 번호 3) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, INPDSGGN (서열 번호 4) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARGITMMVVISHWKFDF (서열 번호 5) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는 H 사슬을 포함하는, 항 PD-L1 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    래트에서 유래하는, 항 PD-L1 항체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    래트 항소 PD-L1 항체인, 항 PD-L1 항체.
  4. 제 3 항에 있어서,
    L 사슬 가변 영역이 서열 번호 6 의 아미노산 서열을 갖고, H 사슬 가변 영역이 서열 번호 7 의 아미노산 서열을 갖는, 항 PD-L1 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    L 사슬 정상 영역이, Kappa 사슬의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖는, 항 PD-L1 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    H 사슬 정상 영역이, IgG2a 의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖는, 항 PD-L1 항체.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    L 사슬 정상 영역이 서열 번호 8, 10 ∼ 12 중 어느 아미노산 서열을 갖고, H 사슬 정상 영역이 서열 번호 9 또는 13 의 아미노산 서열을 갖는, 항 PD-L1 항체.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    L 사슬 2 개와 H 사슬 2 개의 4 개 사슬 구조를 갖는, 항 PD-L1 항체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 유효 성분으로서 포함하는, PD-L1 을 검출하기 위한 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    암 및/또는 감염증의 진단에 사용되는, 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    암 및/또는 감염증이, 종양성 질환, 백혈병, 요네병, 아나플라즈마병, 세균성 유방염, 진균성 유방염, 마이코플라즈마 감염증 (예를 들어, 마이코플라즈마성 유방염, 마이코플라즈마성 폐렴 등), 결핵, 소형 피로플라즈마병, 크립토스포리듐증, 콕시듐증, 트리파노소마병 및 리슈마니아증으로 이루어지는 군에서 선택되는, 조성물.
  12. 제 9 항에 있어서,
    항 PD-L1 항체를 사용한 치료에 적절한 피험 동물을 선정하기 위해 사용되는, 조성물.
  13. 제 1 항에 기재된 항 PD-L1 항체를 코드하는 DNA.
  14. 제 13 항에 기재된 DNA 를 포함하는 벡터.
  15. 제 14 항에 기재된 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
  16. 제 15 항에 기재된 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 항 PD-L1 항체를 채취하는 것을 포함하는, 항체의 제조 방법.
  17. KSISKY (서열 번호 1) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SGS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 QQHNEYPLT (서열 번호 2) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는, 항 PD-L1 항체의 L 사슬을 코드하는 DNA.
  18. GYTFTDYI (서열 번호 3) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, INPDSGGN (서열 번호 4) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARGITMMVVISHWKFDF (서열 번호 5) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 갖는, 항 PD-L1 항체의 H 사슬을 코드하는 DNA.
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