CN110418842B - Pd-l1检测用抗pd-l1抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供可使黑色素瘤等肿瘤细胞染色的抗PD‑L1抗体。本发明提供抗PD‑L1抗体,其含有(a)轻链和(b)重链,所述(a)轻链包含具有KSISKY(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR1、具有SGS的氨基酸序列的CDR2及具有QQHNEYPLT(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR3,所述(b)重链包含具有GYTFTDYI(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的CDR1、具有INPDSGGN(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR2及具有ARGITMMVVISHWKFDF(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的CDR3。用于检测PD‑L1的组合物,其包含上述抗PD‑L1抗体作为有效成分。还提供制造上述抗PD‑L1抗体的方法。
Description
技术领域
本发明涉及PD-L1检测用抗PD-L1抗体。
背景技术
恶性黑色素瘤为源自黑色素细胞的在犬的口腔内中最常可发现的恶性肿瘤之一(非专利文献1:Todoroff et al.,J Am Vet Med Assoc.1979Sep 15;175(6):567-71.),大多显示高浸润性及转变性,因此期望进行早期的诊断、治疗。但另一方面,黑色素瘤的组织变异较广,显示出上皮样、圆形细胞样、纤维肉瘤样等各种形态,为组织诊断困难的肿瘤之一。对诊断而言,重要的是黑色素的确认,但在众多恶性黑色素瘤中不具有黑色素,也有仅凭组织学观察判断不足以诊断的情况。因此,正在进行基于免疫组织化学方法的诊断标记的探索,这之中,已经报道了Melan A/MART-1、波形蛋白、S100、神经特异性的烯醇化酶等的有用性(非专利文献2:Ramos-Vara et a1.,Vet Pathol.2000Nov;37(6):597-608.)。然而,即使是作为最广泛使用的诊断标记的Melan A/MART-1,阳性率也因报告而各种各样,大体上为60%左右(非专利文献3:Koenig etal.,Vet Pathol.2001Jul;38(4):427-35.),由于灵敏度的问题,对于在实际的诊断中的有用性仍存在争议性。另外,由于Melan A/MART-1在无色素性恶性黑色素瘤中不染色(非专利文献3:Koenig et al.,Vet Pathol.2001Jul;38(4):427-35.),对诊断的应用受到限制。从这样的背景出发,期望开发相对于恶性黑色素瘤为高灵敏度的新型诊断标记。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Todoroff et al.,J Am Vet Med Assoc.1979Sep 15;175(6):567-71.
非专利文献2:Ramos-Vara et al.,Vet Pathol.2000Nov;37(6):597-608.
非专利文献3:Koenig et al.,Vet Pathol.2001Jul;38(4):427-35.
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供可使黑色素瘤等肿瘤细胞染色的抗PD-L1抗体。
用于解决技术问题的方案
本发明人至今已经建立了与各种动物的PD-L1发生反应的单克隆抗体。其中,已经明确大鼠抗牛PD-L1单克隆抗体(6C11-3A11)能够极其有效地使黑色素瘤肿瘤细胞染色,目前,在对使用嵌合抗体治疗的临床试验候选犬进行选择时使用。另外,本PD-L1抗体(6C11-3A11)能够进行针对羊、猪、牛的PD-L1的免疫组织化学染色。进一步,确定了本PD-L1抗体(6C11-3A11)的可变区的CDR。本发明是根据上述的见解完成的。
本发明的要点如下所述。
(1)抗PD-L1抗体,其含有(a)轻链和(b)重链,所述(a)轻链包含具有KSISKY(SEQID NO:1)的氨基酸序列的CDR1、具有SGS的氨基酸序列的CDR2及具有QQHNEYPLT(SEQ IDNO:2)的氨基酸序列的CDR3,所述(b)重链包含具有GYTFTDYI(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的CDR1、具有INPDSGGN(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR2及具有ARGITMMVVISHWKFDF(SEQID NO:5)的氨基酸序列的CDR3。
(2)根据(1)所述的抗体,其源自大鼠。
(3)根据(2)所述的抗体,其为大鼠抗牛PD-L1抗体。
(4)根据(3)所述的抗体,其轻链可变区具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列,重链可变区具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
(5)根据(1)~(4)中任一项所述的抗体,其轻链恒定区具有κ链的恒定区的氨基酸序列。
(6)根据(1)~(5)中任一项所述的抗体,其重链恒定区具有IgG2a的恒定区的氨基酸序列。
(7)根据(5)或(6)所述的抗体,其轻链恒定区具有SEQ ID NO:8、10~12中的任一个氨基酸序列,重链恒定区具有SEQ ID NO:9或13的氨基酸序列。
(8)根据(1)~(7)中任一项所述的抗体,其具有2条轻链和2条重链的4条链结构。
(9)用于检测PD-L1的组合物,其包含(1)~(8)中任一项所述的抗体作为有效成分。
(10)用于癌症和/或传染病的诊断的(9)所述的组合物。
(11)(10)所述的组合物,其中,癌症和/或传染病选自由以下组成的组:肿瘤疾病、白血病、约尼病(Johne′s disease)、无形体病、细菌性乳腺炎、真菌性乳腺炎、支原体传染病(例如:支原体性乳腺炎、支原体性肺炎等)、结核病、小梨浆虫(Piroplasma)病(东方泰勒虫(Theileria orientalis)传染病)、隐孢子虫病、球虫病、锥虫病及利什曼病。
(12)根据(9)所述的组合物,其用于选择适于使用抗PD-L1抗体治疗的受试动物。
(13)DNA,其编码(1)所述的抗PD-L1抗体。
(14)载体,其包含(13)所述的DNA。
(15)经(14)所述的载体转化的宿主细胞。
(16)抗体的制造方法,其包括:培养(15)所述的宿主细胞,从培养物提取抗PD-L1抗体。
(17)编码抗PD-L1抗体的轻链的DNA,所述轻链包含具有KSISKY(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR1、具有SGS的氨基酸序列的CDR2及具有QQHNEYPLT(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR3。
(18)编码抗PD-L1抗体的重链的DNA,所述重链包含具有GYTFTDYI(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的CDR1、具有INPDSGGN(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR2及具有ARGITMMVVISHWKFDF(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的CDR3。
发明的效果
根据本发明而得到了可使黑色素瘤等肿瘤细胞染色的新型抗PD-L1抗体。
本说明书中包含在作为本申请的优先权的基础的日本专利申请,日本特愿2017-61389的说明书和/或附图中记载的内容。
附图简单说明
[图1]大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11的结合特异性。虽然大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11未与EGFP表达细胞结合,但与犬PD-L1-EGFP表达细胞发生了特异性结合。
[图2]大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11的预测的CDR区域。示出了大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11的轻链可变区及重链可变区中的CDR1、CDR2及CDR3区域。
[图3]犬黑色素瘤比较免疫组织化学染色图像。左:用市售抗体(MelanA抗体)进行染色。几乎没有染色。右:用本发明人等建立的PD-L1抗体(6C11-3A11)进行染色。能够极其有效地使肿瘤细胞染色。
[图4]犬黑色素瘤免疫组织化学染色图像。
[图5-1]其它肿瘤的免疫组织化学染色图像。左上:犬淋巴瘤病例。右上:犬骨肉瘤病例。左下:犬肾细胞癌例1。右下:犬肾细胞癌病例2。
[图5-2]其它肿瘤的免疫组织化学染色图像。左:犬鳞状细胞癌病例。右:犬纤维肉瘤病例。
[图6]羊利斯特菌病例的免疫组织化学染色图像。左:显示了神经症状的羊利斯特菌病的脑病变的PD-L1染色图像。右:左图的放大照片。
[图7]猪传染病的免疫组织化学染色图像。左:猪圆环病毒2型感染病例。右:猪支原体肺炎例。
[图8]大鼠Igκ链的恒定区的氨基酸序列比对(轻链)。
[图9]大鼠IgG2a链的恒定区的氨基酸序列比对(重链)。
[图10]pDC6载体和大鼠-人嵌合抗PD-L1抗体的模式图。
[图11]大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11和6G7-E1的相对于犬PD-L1-EGFP表达细胞的结合。6C11-3A11与犬PD-L1-EGFP表达细胞发生了特异性结合。
[图12]犬的皮肤鳞状细胞癌、鼻内腺癌及移行细胞癌中的免疫组织化学染色图像。用6G7-E1的情况未检测到特异性的信号。用6C11-3A11的情况,肿瘤细胞发生了染色。
[图13]犬的肛门囊腺癌、软组织肉瘤及骨肉瘤中的免疫组织化学染色图像。在肛门囊腺癌和软组织肉瘤中,用6G7-E1没有观察到特异性的信号,另一方面,用6C11-3A11的情况,肿瘤细胞发生了染色。在骨肉瘤中,虽然利用两种抗体使肿瘤细胞染色,但用6C11-3A11得到了更强的信号。
[图14]犬的口腔内恶性黑色素瘤、乳腺癌、组织细胞肉瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤及传染性性病肿瘤中的基于6C11-3A11的免疫组织化学染色图像。在除了传染性性病肿瘤以外的肿瘤种类中,使肿瘤细胞上的PD-L1染色。
[图15]大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11相对于牛PD-L1-EGFP表达细胞的结合。6C11-3A11与牛PD-L1-EGFP表达细胞发生了特异性结合。
[图16]在约尼病野外感染牛及实验感染牛的回肠病变部中的基于(a)6C11-3A11及(b)Ziehl-Neelsen染色的免疫组织化学染色图像。6C11-3A11在约尼病菌(M.aviumsubsp.paratuberculosis)感染(Ziehl-Neelsen染色阳性)细胞中检测到了PD-L1的表达。
具体实施方式
以下详细地说明本发明。
本发明提供一种抗PD-L1抗体,其含有(a)轻链和(b)重链,所述(a)轻链包含具有KSISKY(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR1、具有SGS的氨基酸序列的CDR2及具有QQHNEYPLT(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR3,所述(b)重链包含具有GYTFTDYI(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列的CDR1、具有INPDSGGN(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR2及具有ARGITMMVVISHWKFDF(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的CDR3。
本发明人等建立的大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11(单克隆抗体)的轻链可变区中的CDR1~3分别为:包含KSISKY(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的区域、包含SGS的氨基酸序列的区域、包含QQHNEYPLT(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的区域(参考图2)。
另外,大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11的重链可变区中的CDR1~3分别为:包含GYTFTDYI(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的区域、包含INPDSGGN(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的区域、包含ARGITMMVVISHWKFDF(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的区域(参考图2)。
在KSISKY(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列、SGS的氨基酸序列及QQHNEYPLT(SEQ IDNO:2)的氨基酸序列、以及GYTFTDYI(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列、INPDSGGN(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列及ARGITMMVVISHWKFDF(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列中,可以缺失、置换或添加1个、2个、3个、4个或5个氨基酸,即使导入了这些突变,也可具有作为PD-L1抗体的轻链可变区的CDR或重链可变区的CDR的功能。
在本说明书中,抗体的概念也包含除了全长抗体以外的Fab、F(ab)’2、ScFv、双抗体(Diabody)、VH、VL、Sc(Fv)2、双特异性sc(Fv)2、小抗体(Minibody)、ScFv-Fc单体、ScFv-Fc二聚体等小分子抗体。
本发明的抗PD-L1抗体可以源自大鼠,例如:可以为大鼠抗牛PD-L1抗体。
将大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11(单克隆抗体)的轻链可变区的氨基酸序列及重链可变区的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:6及7,但在SEQ ID NO:6及7的氨基酸序列中,可以缺失、置换或添加1或多个(例如:5个以下,多则10个左右)的氨基酸,即使导入了这些突变,也可具有作为PD-L1抗体的轻链可变区或重链可变区的功能。
在抗体的轻链中,存在κ链和λ链,在本发明的抗PD-L1抗体中,轻链恒定区可以是具有κ链或λ链中的任一种链的恒定区的氨基酸序列的那些,对存在比率而言,在羊、猫、犬、马中,λ链(Lambda链)的一方较高,在小鼠、大鼠、人、猪中,κ链(Kappa链)的一方较高。大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11(单克隆抗体)为源自大鼠的IgG2a,轻链恒定区具有κ链的恒定区的氨基酸序列。
本发明的抗PD-L1抗体的重链恒定区可以具有大鼠IgG2a的恒定区的氨基酸序列。重链根据恒定区的差异分为γ链、μ链、α链、δ链、ε链,根据该差异分别形成了IgG、IgM、IgA、IgD、IgE5个种类(同种型)的免疫球蛋白。
免疫球蛋白G(IgG)占人免疫球蛋白的70-75%,是血浆中最多的单体的抗体。具有2条轻链和2条重链的4条链结构。人IgG1、IgG2、IgG4的分子量为约146,000,人IgG3的连接Fab区域和Fc区域的铰链部较长,分子量也大,为170,000。人IgG1占人IgG的65%左右、人IgG2占25%左右、人IgG3占7%左右、人IgG4占3%左右。平均分布于血管内外。人IgG1由于具有与效应子细胞表面的Fc受体、补体因子的强亲和性,因此诱导抗体依赖性细胞毒活性(ADCC),另外,活化补体而诱导补体依赖性细胞毒活性(CDC)。人IgG2和人IgG4对Fc受体、补体因子的亲和性较低,因此ADCC活性及CDC活性较低。
免疫球蛋白M(IgM)占人免疫球蛋白的约10%,是五个基本的4条链结构结合而成的五聚体的抗体。分子量为970,000。通常仅存在于血中,是对于感染微生物最先产生的,负责初期免疫的免疫球蛋白。
免疫球蛋白A(IgA)占人免疫球蛋白的10~15%。分子量为160,000。分泌型IgA形成2个IgA结合而成的二聚体的抗体。IgA1存在于血清、鼻涕、唾液、母乳中,在肠液中大量存在IgA2。
免疫球蛋白D(IgD)为人免疫球蛋白的1%以下的单体的抗体。存在于B细胞表面,参与抗体产生的诱导。
免疫球蛋白E(IgE)为单体的抗体,仅以人免疫球蛋白的0.001%以下的极微量存在。认为其参与对寄生虫的免疫反应,而在寄生虫罕见的发达国家中,较多参与特别是支气管哮喘、变态反应。
大鼠中,作为IgG的重链鉴定了IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG2c的序列。大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11具有IgG2a的重链恒定区的氨基酸序列。
在本发明的抗体中,更优选轻链恒定区为具有κ链的恒定区的氨基酸序列、重链恒定区为具有IgG2a的恒定区的氨基酸序列的抗PD-L1抗体。
将本发明人等鉴定的大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11的轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列,分别示于SEQ ID NO:6及14。
将本发明人等鉴定的大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11的重链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列,分别示于SEQ ID NO:7及15。
将本发明人等鉴定的大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11的轻链恒定区(κ链)的氨基酸序列和核苷酸序列,分别示于SEQ ID NO:8及16。这些序列与National Center forBiotechnology Information(NCBI)提供的碱基序列数据库GenBank中以#XM_008775358.2的登记编号登记的序列、GenBank中以#BC062802.1的登记编号登记的序列、GenBank中以#BC088255.1的登记编号登记的序列、GenBank中以#L22653.1的登记编号登记的序列、GenBank中以#L22655.1的登记编号登记的序列、GenBank中以#M14434.1的登记编号登记的序列相同。
将本发明人等鉴定的大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11的重链恒定区(IgG2a)的氨基酸序列和核苷酸序列分别示于SEQ ID NO:9及17。这些序列与GenBank中以#BC088240.1的登记编号登记的序列、GenBank中以#BC091257.1的登记编号登记的序列、GenBank中以#BC091272.1的登记编号登记的序列、GenBank中以#BC088423.1的登记编号登记的序列、GenBank中以#L22652.1的登记编号登记的序列、GenBank中以#L22654.1的登记编号登记的序列相同。
此外,对大鼠抗体的轻链恒定区及重链恒定区的氨基酸序列和核苷酸序列而言,可以从公知的数据库获取,可以利用这些序列。
将作为大鼠Igκ链的氨基酸序列和核苷酸序列而在GenBank中以#V01241.1的登记编号登记的序列示于SEQ ID NO:10和18。
将作为大鼠Igκ链的氨基酸序列和核苷酸序列而在GenBank中以#X16129.1的登记编号登记的序列示于SEQ ID NO:11和19。
将作为大鼠Igκ链的氨基酸序列和核苷酸序列而在GenBank中以#DQ402471.1的登记编号登记的序列示于SEQ ID NO:12和20。
将作为大鼠IgG2a的重链恒定区而在GenBank中以#DQ402472.1的登记编号登记的序列示于SEQ ID NO:13和21。
本发明的抗PD-L1抗体,可以是轻链恒定区具有SEQ ID NO:8、10~12中的任一个氨基酸序列,重链恒定区具有SEQ ID NO:9或13的氨基酸序列的抗PD-L1抗体。
在SEQ ID NO:8~13的氨基酸序列中,可以缺失、置换或添加1或多个(例如:5个以下,多则10个左右)氨基酸,即使导入了这些突变,也可具有作为抗体的轻链恒定区或重链恒定区的功能。
将大鼠抗体的轻链恒定区及重链恒定区的氨基酸序列的比对分别示于图8及9。上述氨基酸的缺失、置换、添加等突变,可以在图8及9所示的突变部位或其附近的部位产生。
本发明的抗PD-L1抗体可以为嵌合抗体。抗体的轻链可变区和重链可变区可以源自大鼠,例如可以为:轻链可变区为大鼠抗牛PD-L1抗体(例如:6C11-3A11)的轻链可变区,重链可变区为大鼠抗牛PD-L1抗体的重链可变区,轻链恒定区及重链恒定区源自除了大鼠以外的动物。例如,在使用小鼠抗体的恒定区进行嵌合化的情况下,由于针对小鼠抗体的第二抗体存在各种市售的,因此推测对于检验诊断是有用的。除了大鼠以外的动物抗体的轻链恒定区及重链恒定区的氨基酸序列和核苷酸序列,可以从公知的数据库获取,可以利用这些序列。
人、小鼠、牛、犬、羊、猪、水牛的轻链恒定区及重链恒定区的氨基酸序列和核苷酸序列汇集于下述表中。
(表)
在SEQ ID NO:8~13、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120及122的氨基酸序列中,可以缺失、置换或添加1或多个(例如:5个以下,多则10个左右)氨基酸,即使导入了这些突变,也可具有作为Ig重链或轻链的恒定区的功能。
本发明的抗PD-L1抗体可以具有2条轻链和2条重链的4条链结构。
本发明的抗PD-L1抗体可以如下所述地制造。通过合成包含本发明的抗PD-L1抗体的轻链序列(可变区序列和恒定区序列)和重链序列(可变区序列和恒定区序列)的人工基因,将该人工基因插入载体(例如:质粒)中后,导入宿主细胞(例如:CHO细胞等哺乳类细胞)中,培养该宿主细胞,由此从培养物提取抗体。在进行人工基因的合成时,也可以将核苷酸序列的密码子最优化。
本发明提供编码包含轻链和重链的抗PD-L1抗体的DNA,所述轻链包含具有(a)KSISKY(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR1、具有SGS的氨基酸序列的CDR2及具有QQHNEYPLT(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR3,所述重链包含具有(b)GYTFTDYI(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列的CDR1、具有INPDSGGN(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR2及具有ARGITMMVVISHWKFDF(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的CDR3。另外,本发明提供编码抗PD-L1抗体的轻链的DNA((a’)的DNA),所述轻链包含具有KSISKY(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR1、具有SGS的氨基酸序列的CDR2及具有QQHNEYPLT(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR3。进一步,本发明提供编码抗PD-L1抗体的重链的DNA((b’)的DNA),所述重链包含具有GYTFTDYI(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的CDR1、具有INPDSGGN(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR2及具有ARGITMMVVISHWKFDF(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的CDR3。
对于具有(a)KSISKY(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的CDR1、具有SGS的氨基酸序列的CDR2及具有QQHNEYPLT(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的CDR3的轻链和,具有(b)GYTFTDYI(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的CDR1、具有INPDSGGN(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的CDR2及具有ARGITMMVVISHWKFDF(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的CDR3的重链而言,如上所述。包含(a’)的DNA和(b’)的DNA的DNA,可以使用市售的合成仪进行合成。也可以在该DNA中增加:限制酶识别位点、KOZAK序列、polyA添加信号序列、启动子序列、内含子序列等。
另外,本发明也提供包含编码上述抗PD-L1抗体的DNA的载体。
作为载体,可以使用源自大肠杆菌的质粒(例如,pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、源自枯草杆菌的质粒(例如,pUB110、pTP5、pC194)、源自酵母的质粒(例如,pSH19、pSH15)、λ噬菌体等噬菌体、逆转录病毒、痘苗病毒等动物病毒,杆状病毒等昆虫致病病毒等。在后述的实施例中,使用pDC6(日本专利第5704753号、US专利9096878、EU专利2385115、香港(中国)专利HK1163739、澳大利亚专利2009331326)。
也可以在载体中增加:启动子、增强子、剪接信号、polyA添加信号、内含子序列、选择性标记、SV40复制起点等。
进一步,本发明也提供经上述载体转化的宿主细胞。通过培养该宿主细胞,从培养物提取抗体,由此可以制造抗PD-L1抗体。因此,本发明也提供抗体的制造方法,其包括:培养上述宿主细胞,从培养物提取抗PD-L1抗体。在本发明的抗体的制造方法中,可以将内置有包含编码轻链的DNA和编码重链的DNA的DNA的载体转染宿主细胞,也可以将内置有编码轻链的DNA的载体、和装配有编码重链的DNA的载体与宿主细胞共转染。
作为宿主细胞,可以例示:细菌细胞(例如:埃希氏菌属、芽孢杆菌属、枯草杆菌等)、真菌细胞(例如:酵母、曲霉等)、昆虫细胞(例如:S2细胞、Sf细胞等)、动物细胞(例如:CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、C127细胞、3T3细胞、BHK细胞、HEK293细胞等)、植物细胞等。其中,优选作为二氢叶酸还原酶缺陷细胞的CHO-DG44细胞(CHO-DG44(dhfr-/-))。
为了将重组载体导入宿主,可以采用Molecular Cloning 2nd Edition,J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989中记载的方法(例如:磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、转染法、显微注射法、脂质转化法、电穿孔法、转导法、划痕标记法(scrape loading)、鸟枪法等)或感染而进行。
可以将转化体在培养基中培养,从培养物提取本发明的抗PD-L1抗体。在抗体被分泌至培养基的情况下,只要回收培养基,从该培养基分离抗体、进行纯化即可。在抗体是在经转化的细胞内产生的情况下,只要将该细胞溶解,从该溶解物分离抗体、进行纯化即可。
作为培养基,可以例示:OptiCHO培养基、Dynamis培养基、CD CHO培养基、ActiCHO培养基、FortiCHO培养基、Ex-Cell CD CHO培养基、BalanCD CHO培养基、ProCHO 5培养基、Cellvento CHO-100培养基等,但不限于这些
培养基的pH因培养的细胞而异,通常为pH 6.8~7.6,多数情况适宜为pH 7.0~7.4。
在培养的细胞为CHO细胞的情况下,CHO细胞的培养可以使用本领域技术人员公知的方法进行。例如,通常可以在气相的CO2浓度为0-40%、优选为2-10%的气体氛围中,于30-39℃、优选为37℃左右进行培养。
适当的培养时间通常为1天~3个月、优选为1天~3周。
抗体的分离及纯化,可以根据公知的方法进行。作为公知的分离、纯化法,可以使用:盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度差异的方法、透析法、超滤法、凝胶过滤法、及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法等利用分子量差异的方法、离子交换层析等利用电荷差异的方法、亲和层析法等利用特异性的亲和性的方法、反相高效液相层析等利用疏水性的差异的方法、等电点电泳法等利用等电点的差异的方法等。
本发明的抗PD-L1抗体也可以通过杂交瘤的培养而制造。杂交瘤可以利用已经报道的(Ikebuchi R,Konnai S,Okagawa T,Yokoyama K,Nakajima C,Suzuki Y,Murata S,Ohashi K.Immunology.2014Aug;142(4):551-61.)中记载的方法进行制备。产生抗PD-L1抗体6C11-3A11的杂交瘤,由本发明人等的研究室(北海道大学,大学院兽医学研究科,动物疾病控制学讲座、传染病学教室)保存。
本发明的抗PD-L1抗体可以利用于PD-L1的检测。因此,本发明提供用于检测PD-L1的组合物,其包含上述的抗PD-L1抗体作为有效成分。
PD-L1的检测,可通过例如:免疫组织化学染色法、免疫细胞化学染色法、流式细胞术、酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白质印迹法等进行,但不限于这些。
作为被检物,以例示从生物体提取的组织、体液(例如:血液(除了全血、血浆、血清以外的,红细胞、白细胞、淋巴细胞等特定的细胞),尿、唾液等)等试样,细胞培养液、培养细胞(建立株的细胞、初代培养细胞、经传代的细胞等)等。对被检物的来源没有特别的限制,可列举:大鼠、犬、绵羊、山羊、猪、猫、人、马、牛、水牛、牦牛、兔、小鼠、仓鼠、豚鼠等。
本发明的抗PD-L1抗体也可以用放射性同位素、酶、发光物质、荧光物质、生物素等标记。另外,在进行与靶标分子(PD-L1)特异性结合的一次抗体(本发明的抗PD-L1抗体)的反应后,使其和与该一次抗体结合的二次抗体发生反应,进行靶标分子的检测的情况下,可以对二次抗体进行标记。
PD-L1在癌细胞和病毒感染细胞中强表达,因此,本发明的组合物可以使用于癌症和/或传染病的诊断。通常,基于PD-L1和抗PD-L1抗体的结合体的量(浓度)来确定被检物中的PD-L1的量(浓度)。被检物中的PD-L1的量(浓度)如果与阴性对照(例如:正常的周围组织(结缔组织、血管等))相比更高,则可诊断为癌症和/或传染病。或者,如果在被检物中检测到PD-L1,则可诊断为癌症和/或传染病。
作为癌症和/或传染病,可以例示:肿瘤疾病(例如:恶性黑色素瘤、肺癌、胃癌、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、食道癌、卵巢癌等)、白血病、约尼病、无形体病、细菌性乳腺炎、真菌性乳腺炎、支原体传染病(例如:支原体性乳腺炎、支原体性肺炎等)、结核病、小梨浆虫(Piroplasma)病(东方泰勒虫(Theileria orientalis)传染病)、隐孢子虫病、球虫病、锥虫病及利什曼病等,但不限于这些。
利用本发明的组合物,可以选择适于使用抗PD-L1抗体治疗的受试动物。例如:治疗的候选动物满足以下2点即可:
1.通过病理检验被诊断为癌症(例如:黑色素瘤)或传染病的病例,
2.用抗PD-L1抗体的情况下显示阳性的病例。
阴性对照可以为正常的周围组织(结缔组织、血管等),阳性对照可以为癌症(例如:黑色素瘤)或传染病的病例。基本上,可以将肿瘤的基本整个区域用免疫组织化学染色成为阳性的那些作为临床试验的对象。
对受试动物没有特别的限制,可列举:大鼠、犬、绵羊、山羊、猪、猫、人、马、牛、水牛、牦牛、兔、小鼠、仓鼠、豚鼠等。
本发明的组合物可以进一步包含:用于检测标记的试剂、稀释液、洗涤液、记载了诊断或选择基准的使用说明书等。
实施例
以下,结合实施例对本发明进行详细的说明,但本发明并不限定于这些实施例。
[实施例1]
1.绪论
免疫抑制受体程序性死亡1(Programmed death 1,PD-1)和作为其配体的程序性死亡配体1(Programmed death ligand 1,PD-L1)作为与抑制过量的免疫应答、免疫耐受为深度相关的因子,是由京都大学的本庶佑等鉴定的分子。近年来也已经揭晓其参与各种动物的传染病、肿瘤中的免疫抑制。在本实施例中,通过对大鼠进行免疫而制备了抗牛PD-L1单克隆抗体,筛选了可检测犬的PD-L1的克隆(6C11-3A11)。另外,通过免疫组织化学染色法研究了在除了犬恶性黑色素瘤以外的恶性肿瘤、猪、羊的传染病中,抗牛PD-L1抗体6C11-3A1 1是否对PD-L1的检测有用。
2.材料及方法
2.1大鼠抗牛PD-L1单克隆抗体产生细胞
鉴定牛PD-L1基因序列(Ikebuchi R,Konnai S,Shirai T,Sunden Y,Murata S,Onuma M,Ohashi K.Vet Res.2011Sep26;42:103.),利用其基因信息制备了重组牛PD-L1。将所述重组蛋白质对大鼠的足跖进行免疫,使用髂骨淋巴结法建立杂交瘤,而得到了多株大鼠抗牛PD-L1单克隆抗体产生杂交瘤。(Ikebuchi R,Konnai S,Okagawa T,Yokoyama K,Nakajima C,Suzuki Y,Murata S,Ohashi K.Immunology.2014Aug;142(4):551-61.)。大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11为利用所述免疫大鼠建立的单克隆抗体之一。
2.2全长犬PD-L1基因的鉴定
为了确定犬PD-L1 cDNA的全长,首先根据国家生物技术信息中心(The NationalCenter for Biotechnology Information,NCBI)中既已登记的犬PD-L1的预测的碱基序列(GenBank登记号:XM_541302),以对基因的开放阅读框架(ORF)内部进行扩增的方式设计了引物(cPD-L1内部F及R)而进行了PCR法。对于得到的扩增产物,按照常规方法利用毛细管测序仪确定了碱基序列。进一步,为了确定全长PD-L1 cDNA的碱基序列,以上述已确定的犬PD-L1 cDNA序列为基础设计了引物(cPD-L15′GSP及3′GSP),分别使用用于快速扩增cDNA末端的5′RACE系统(5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends)及用于快速扩增cDNA末端的3′RACE系统(3′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends)(Invitrogen公司),进行了5′及3′RACE法。通过5′及3′RACE法得到的目标的基因片段,按照上述的方法而确定了碱基序列(Maekawa N,Konnai S,Ikebuchi R,Okagawa T,Adachi M,Takagi S,Kagawa Y,Nakajima C,Suzuki Y,Murata S,Ohashi K.PLoS One.2014Jun 10;9(6):e98415.)。
引物(cPD-L1内部F):ATGAGAATGTTTAGTGTCTT(SEQ ID NO:22)
引物(cPD-L1内部R):TTATGTCTCTTCAAATTGTATATC(SEQ ID NO:23)
引物(cPD-L15′GSP):TTTTAGACAGAAAGTGA(SEQ ID NO:24)
引物(cPD-L13′GSP):GACCAGCTCTTCTTGGGGAA(SEQ ID NO:25)
2.3犬PD-L1表达COS-7细胞的构建
为了制备犬PD-L1-EGFP表达质粒,以合成的源自比格犬PBMC的cDNA为模板,使用在5′末端侧增加了限制酶BglII及EcoRI(PD-L1)识别位点而设计而成的引物(cPD-L1-EGFPF及R)进行了PCR。将得到的PCR产物用BglII(New England Biolabs公司)及EcoRI(Takara公司)处理后,使用FastGene Gel/PCR提取试剂盒(NIPPON Genetics公司)进行纯化,克隆至用同样的限制酶处理的pEGFP-N2载体(Clontech公司)上。使用QIAGEN PlasmidMidi试剂盒(Qiagen公司)提取得到的目标的表达质粒,保存于-30℃直至用于实验为止。后文中,将制备成的表达质粒记作pEGFP-N2-cPD-L1。
引物(cPD-L1-EGFPF):GAAGATCTATGAGAATGTTTAGTGTC(SEQ ID NO:26)
引物(cPD-L1-EGFPR):GGAATTCTGTCTCTTCAAATTGTATATC(SEQ ID NO:27)
将5×104/cm2的COS-7细胞传代至6孔板中,利用包含10%灭活胎牛血清、0.01%L-谷氨酰胺的RPMl1640培养基在37℃,5%CO2存在下过夜培养。用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司)将pEGFP-N2-cPD-L1或作为阴性对照的pEGFP-N 20.4μg/cm2,分别导入COS-7细胞中,培养48小时(犬PD-L1-EGFP表达细胞或EGFP表达细胞)。为了确认制备成的表达细胞中的PD-L1的表达,利用倒置共聚焦激光显微镜LSM700(ZEISS公司)将增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的细胞内存在可视化(Maekawa N,Konnai S,Ikebuchi R,Okagawa T,Adachi M,Takagi S,Kagawa Y,Nakajima C,Suzuki Y,Murata S,Ohashi K.PLoS One.2014Jun 10;9(6):e98415.)。
2.4大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11相对于犬PD-L1的交叉反应性
为了确认大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11与犬PD-L1发生特异性结合,使用2.3中制备的犬PD-L1-EGFP表达细胞或EGFP表达细胞进行了流式细胞术。使10μg/ml的抗牛PD-L1抗体6C11-3A11,相对于2×105-1×106个的细胞于室温反应30分钟,洗涤后使用别藻蓝蛋白(Allophycocyanine)标记的山羊抗大鼠Ig抗体(Beckman Coulter公司),进行了结合在细胞表面的抗体的检测。分析中使用FACS Verse(Becton,Dickinson and Company公司)。作为阴性对照抗体,使用大鼠IgG2a(κ)同种型对照(BD Biosciences公司)。需要说明的是,在全部的洗涤操作及抗体的稀释中,使用加入10%灭活山羊血清的PBS。将结果示于图1。
2.5大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11的CDR分析
利用产生大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11的杂交瘤,采用RACE法鉴定了抗体重链及轻链基因。使用NCBI IGBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)确定了大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11的互补决定区(CDR)。将结果示于图2。
2.6使用犬肿瘤组织,羊、猪感染组织的免疫组织化学染色
为了确认大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11能够应用于相对于犬肿瘤的PD-L1免疫组织化学染色,使用福尔马林固定、石蜡包埋的犬肿瘤样品进行了免疫组织化学染色。按照常规方法进行了脱石蜡处理后,利用柠檬酸缓冲液进行了微波处理(5分钟,2次)。之后,使用PD-L1抗体(6C11-3A11)(400倍稀释)反应30分钟后,使用Simple stain mouse MAX-PO(Rat)(Nichirei Bioscience公司)反应了30分钟。生色利用二氨基联苯胺(DAB)反应了10分钟。
将结果示于图3、4、5-1、5-2、6及7。
其中只有黑色素瘤专用抗体和市售的抗Melan A抗体几乎未染色(图3左)。另一方面,本发明人等建立的PD-L1抗体(6C11-3A11)极其有效地将肿瘤细胞染色(图3右)。PD-L1抗体(IgG:6C11-3A11)能够进行几乎全部黑色素瘤病例的染色。
在犬黑色素瘤中,肿瘤细胞对PD-L1抗体(6C11-3A11)呈弥漫性阳性。(阳性数/研究数:12/12,阳性率100%)
在犬淋巴瘤中,对PD-L1抗体(6C11-3A11)呈弥漫性阳性。在犬骨肉瘤中,一部分的肿瘤细胞的细胞质中确认到阳性图像。在犬肾细胞癌中,在各种组织型中,肿瘤细胞弥漫性地呈阳性。
在羊利斯特菌病例中,将显示了神经症状的羊利斯特菌病的脑病变的PD-L1染色图像示于图6左。在其放大照片中,在向脑病变部浸润的巨噬细胞中确认到了PD-L1的表达(图6右)。
在猪圆环病毒2型感染病例中,在淋巴滤泡中染色到PD-L1,在这些细胞中也染色到了病毒(图7左)。
在猪支原体肺炎例中,在肺病变中发生了许多巨噬细胞的浸润,在这些浸润细胞中染色到了PD-L1(图7右)。
如上所述,抗牛PD-L1抗体6C11-3A11可以在以犬恶性黑色素瘤为首的各种犬肿瘤以及羊、猪的传染病中用于基于免疫组织化学染色法的PD-L1的检测,显示了可跨动物地且跨疾病地用于疾病的诊断的可能性。
[实施例2]
1.绪论
单克隆抗体可通过培养杂交瘤并从其培养上清液纯化抗体而产生。另外,在其抗体的基因序列已被鉴定时,可以将表达其基因序列的载体转染培养细胞,由此制备抗体的表达细胞,作为杂交瘤的代替。在本实施例中,例示利用使用表达载体和哺乳类细胞的蛋白质的表达体系产生抗体的方法。
2.材料及方法
2.1大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11表达载体的制备
基于[实施例1]的2.5中鉴定的大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11的基因信息进行了基因合成,使得NotI限制酶识别序列、KOZAK序列、抗体轻链序列、polyA添加信号序列(PABGH)、启动子序列(PCMV)、SacI限制酶识别序列、内含子序列(INRBG)、KOZAK序列、抗体重链序列、XbaI限制酶识别序列以上述的顺序配置。此时,对抗体的基因而言,可以使用根据用于表达的细胞的种类而进行了密码子最优化而成的那些。将合成的基因链,利用限制酶识别序列组装到表达用载体pDC6(由北海道大学人兽共通传染病研究中心,铃木定彦教授分赠)的克隆位点(位于PCMV下游、INRBG和PABGH之间的NotI及XbaI限制酶识别序列),使得以上述的顺序配置,构建了大鼠抗PD-L1抗体6C11-3A11表达载体。
2.2大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11的表达
将2.1中制备的大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11表达pDC6载体转染作为二氢叶酸还原酶缺陷细胞的CHO-DG44细胞(CHO-DG44(dfhr-/-)),通过斑点印迹法选择高表达克隆。在意图进一步增加表达量的情况下,可以通过用含有60nM、250nM、1000nM的甲氨蝶呤(Mtx)的培养基施加负荷,由此进行基因扩增处理。可以将如上所述地制备的大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11稳定表达细胞转移到不包含Mtx的Opti-CHO培养基中,进行14天的震荡培养(125rpm,37℃,5%CO2),由此得到包含目标抗体的培养上清液。培养上清液中的抗体可以通过亲和层析法、离子交换层析等公知的方法进行纯化,用于各实验。
[实施例3]
1.绪论
在本实施例中,出于建立针对肿瘤疾病的新型诊断法的目的,使表达嵌合抗体基因的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell:CHO细胞)培养增殖,得到大鼠-人嵌合抗PD-L1抗体,所述嵌合抗体基因为大鼠抗牛PD-L1单克隆抗体(6C11-3A11)的可变区基因与人免疫球蛋白(IgG4)的恒定区基因组合而成。
2.材料及方法
2.1大鼠-人嵌合抗PD-L1抗体表达载体的制备(图10)
以下,将大鼠抗牛PD-L1单克隆抗体6C11-3A11作为大鼠-人嵌合抗PD-L1抗体的可变部分,而建立大鼠-人嵌合抗PD-L1抗体。
利用产生大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11的杂交瘤鉴定了可变区(重链及轻链)基因。进一步,制备了使该大鼠抗体重链及轻链可变区序列与已知的人抗体的重链IgG4的恒定区及轻链κ链的恒定区结合而成的基因序列,进行了密码子最优化后进行了基因合成,使得NotI限制酶识别序列、KOZAK序列、嵌合抗体轻链序列、polyA添加信号序列(PABGH)、启动子序列(PCMV)、SacI限制酶识别序列、内含子序列(INRBG)、KOZAK序列、嵌合抗体重链序列、XbaI限制酶识别序列以上述的顺序配置。利用限制酶识别序列,将合成的基因链组装到表达用载体pDC6(由北海道大学人兽共通传染病研究中心,铃木定彦教授分赠)的克隆位点(位于PCMV下游、INRBG和PABGH之间的NotI及XbaI限制酶识别序列),使得以上述的顺序配置(图10),构建了大鼠-人嵌合抗PD-L1抗体表达载体。将该表达载体转染作为二氢叶酸还原酶缺陷细胞的CHO-DG44细胞(CHO-DG44(dfhr-/-)),通过斑点印迹法选择高表达克隆。在意图进一步增加表达量的情况下,可以通过用含有60nM、250nM、1000nM的甲氨蝶呤(Mtx)的培养基施加负荷,由此进行基因扩增处理。可以将如上所述地制备的大鼠-人嵌合抗PD-L1抗体稳定表达细胞转移到不包含Mtx的Opti-CHO培养基中,进行14天的震荡培养(125rpm,37℃,5%CO2),由此得到包含目标抗体的培养上清液。培养上清液中的抗体可以通过亲和层析法、离子交换层析等公知的方法进行纯化,用于各实验。
[实施例4]
1.绪论
对于犬肿瘤中的PD-L1,过去已经建立了基于使用大鼠抗牛PD-L1抗体6G7-E1的免疫组织化学染色法的检验法,已报道了在各种肿瘤中的表达状态(Maekawa N,Konnai S,Okagawa T,Ikebuchi R,Izumi Y,Takagi S,Kagawa Y,Nakajima C,Suzuki Y,Kato Y,Murata S,Ohashi K.PLoS One.2016Jun 11(6):e0157176.)。在本实施例中,为了研究大鼠抗牛PD-L1单克隆抗体6C11-3A11在犬肿瘤中的PD-L1的表达分析中是否比现有的抗PD-L1抗体-6G7-E1更有用,在各种犬肿瘤中进行了免疫组织化学染色,进行了6G7-E1和6C11-3A11的PD-L1检测灵敏度的直接比较。
2.材料和方法
2.1基于使用犬PD-L1-EGFP稳定表达CHO-DG44细胞的流式细胞术的比较(图11)
首先,为了制备犬PD-L1膜表达细胞,使用Lipofectamine LTX(Invitrogen公司),将在[实施例1]的2.3中制备的犬PD-L1-EGFP表达质粒(pEGFP-N2-cPD-L1)或作为阴性对照的pEGFP-N2(2.5μg)导入4×106个的CHO-DG44细胞。48小时后,培养基交换为包含G418(EnzoLife Science公司)800μg/ml、GlutaMAX补充剂(Life technologies公司)20ml/l、10%Pluronic F-68(Life technologies公司)18ml/l的CD DG44培养基(Lifetechnologies公司),进行了稳定表达细胞的筛选和基于极限稀释法的克隆。使制备的犬PD-L1膜表达细胞或EGFP表达细胞与大鼠抗牛PD-L1单克隆抗体6C11-3A1 1或6G7-E1于室温反应30分钟,洗涤后使用别藻蓝蛋白标记的山羊抗大鼠Ig抗体(Beckman Coulter公司),进行了结合在细胞表面的抗体的检测。分析中使用FACS Verse(Becton,Dickinson andCompany公司)。作为阴性对照抗体,使用大鼠IgG2a(κ)或IgM(κ)同种型对照(BDBiosciences公司)。需要说明的是,在全部的洗涤操作及抗体的稀释中,使用加入10%灭活山羊血清的PBS。
结果如图11所示。大鼠抗牛PD-L1单克隆抗体6C11-3A11及6G7-E1与犬PD-L1膜表达细胞发生了特异性结合。对得到的荧光强度而言,6C11-3A11比6G7-E1高,提示了6C11-3A11为高亲和性抗体。
2.2各种犬肿瘤的PD-L1表达分析(免疫组织化学染色)中的两种抗体的检测灵敏度的比较
对犬的皮肤鳞状细胞癌(n=5)、鼻内腺癌(n=5)、移行细胞癌(n=5)、肛门囊腺癌(n=5)、软组织肉瘤(n=5)、骨肉瘤(n=5)的样品,依照[实施例1]的2.6所示的方法,进行了基于大鼠抗牛PD-L1单克隆抗体6C11-3A11的免疫组织化学染色。利用大鼠抗牛PD-L1单克隆抗体6G7-E1,也使用源自相同被检物的切片,通过同样的方法进行了免疫组织化学染色。此时使用的6G7-E1的终浓度为10μg/ml,对第二抗体而言,使用生物素标记的山羊抗大鼠IgM抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)。
将结果示于图12及图13。在鳞状细胞癌、鼻内腺癌、移行细胞癌、肛门囊腺癌及软组织肉瘤中,在基于6G7-E1的染色中未观察到特异性信号,在使用6C11-3A11的染色中得到了良好的阳性反应。一方面,在骨肉瘤中,虽然在6G7-E1中也得到了特异性信号,但就其强度而言,还是基于6C11-3A11染色的一方优异。对利用6C11-3A11染色得到的这些肿瘤的PD-L1阳性率而言,除了软组织肉瘤以外,在上述全部的肿瘤种类中为100%(5例中有5例)。另一方面,在软组织肉瘤中以80%(5例中有4例)为PD-L1阳性。
接着,利用使用6C11-3A11的免疫组织化学染色分析了口腔恶性黑色素瘤(n=17)、乳腺癌(n=10)、组织细胞肉瘤(n=10)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(n=10)、传染性性病肿瘤(n=4)的样品的PD-L1表达。
将结果示于图14。这些肿瘤的PD-L1阳性率为:口腔恶性黑色素瘤中100%(17例中有17例)、乳腺癌中100%(10例中有10例)、组织细胞肉瘤中20%(10例中有2例)、弥漫性大B细胞淋巴瘤中20%(10例中有2例),传染性性病肿瘤中0%(4例中有0例)。
根据以上的结果显示,在犬PD-L1的检测中,6C11-3A11比作为现有的抗PD-L1抗体的6G7-E1更优异。
[实施例5]
1.绪论
约尼病为基于鸟分支杆菌副结核亚种(Mycobacterium aviumsubsp.paratuberculosis)的牛的慢性传染病。在罹患约尼病的牛中,在作为约尼病菌的感染局部的回肠病变部中,确认了约尼病菌感染细胞中的PD-L1的表达(Okagawa T,KonnaiS,Nishimori A,Ikebuchi R,Mizorogi S,Nagata R,Kawaji S,Tanaka S,Kagawa Y,Murata S,Mori Y和Ohashi K.Infect Immun,84:77-89,2016.)。在本实施例中,出于研究大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11是否能够用于牛的PD-L1的检测为目的,进行了约尼病患病牛的回肠病变部的免疫组织化学染色。
2.材料及方法
2.1.牛PD-L1表达细胞的构建
对于牛PD-L1基因(GenBank登记号AB510902;IKebuchi R,Konnai S,Shirai T,Sunden Y,Murata S,Onuma M,Ohashi K.Vet.Res.2011Sep.26;42:103.)确定cDNA全长的碱基序列,根据其基因信息制备了牛PD-L1膜表达细胞。首先,为了制备牛PD-L1表达质粒,以合成的源自牛PBMC的cDNA为模板,使用在5′末端侧增加了限制酶NheI及XhoI识别位点的引物(boPD-L1-EGFPF及R)进行了PCR。将得到的PCR产物用NheI(Takara公司)及XhoI(Takara公司)处理后,使用FastGene Gel/PCR提取试剂盒(NIPPON Genetics公司)进行纯化,导入至进行了同样的限制酶处理的pEGFP-N2载体(Clontech公司),进行克隆。使用QIAGEN Plasmid Midi试剂盒(Qiagen公司)提取得到的目标的表达质粒,保存于-30℃直至用于实验为止。后文中,将制备成的表达质粒记作pEGFP-N2-boPD-L1。
引物(boPD-L1-EGFP F):CTAGCTAGCACCATGAGGATATATAGTGTCTTAAC(SEQ ID NO:124)
引物(boPD-L1-EGFP R):CAATCTCGAGTTACAGACAGAAGATGACTGC(SEQ ID NO:125)
按照以下顺序,制备了牛PD-L1膜表达细胞。首先,使用Lipofectamine LTX(Invitrogen公司)向4×106个的CHO-DG44细胞导入2.5μg的pEGFP-N2-boPD-L1或作为阴性对照的pEGFP-N2。48小时后,培养基交换为包含G418(EnzoLife Science公司)800μg/ml、GlutaMAX补充剂(Life technologies公司)20ml/l、10%Pluronic F-68(Lifetechnologies公司)18ml/1的CD DG44培养基(Life technologies公司),进行了选择,同时采用极限稀释法进行了克隆(牛PD-L1-EGFP表达细胞以及EGFP表达细胞)。为了确认制备成的牛PD-L1-EGFP表达细胞中的牛PD-L1的表达,利用倒置共聚焦激光显微镜LSM700(ZEISS公司)将EGFP的细胞内存在可视化。
2.2.大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11的与牛PD-L1的结合特异性
通过流式细胞术确认了大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11对于牛PD-L1-EGFP表达细胞(上文所述)发生特异性结合。首先,使大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11,或作为阴性对照抗体的大鼠IgG2a(κ)同种型对照(BD Biosciences公司)与牛PD-L1表达细胞、或EGFP表达细胞(阴性对照)于室温反应30分钟。洗涤后,使APC标记的抗大鼠Ig山羊抗体(SouthernBiotech公司)于室温反应30分钟。洗涤后,通过FACS Verse(BD Biosciences公司)检测了结合在细胞表面的抗体。需要说明的是,在全部的洗涤操作及抗体的稀释中,使用加入1%牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司)的PBS。
将结果示于图15。显示大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11与牛PD-L1表达细胞发生特异性结合。
2.3.使用牛感染组织的免疫组织化学染色
为了确认大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11能够应用于相对于牛组织的PD-L1免疫组织化学染色,使用福尔马林固定、石蜡包埋的牛组织样品进行了免疫组织化学染色。使用约尼病的野外发病牛(#1,出现了腹泻、重度消瘦等约尼病的临床症状)、约尼病菌实验感染牛(#65,观察到排菌及腹泻等临床症状;Okagawa T,Konnai S,Nishimori A,Ikebuchi R,Mizorogi S,Nagata R,Kawaji S,Tanaka S,Kagawa Y,Murata S,Mori Y和OhashiK.Infect Immun,84:77-89,2016.)及非感染对照牛(C#6)的回肠组织块(由农研机构动物卫生研究部门森康行博士分赠),进行了免疫组织化学染色。按照常规方法进行了脱石蜡处理后,利用柠檬酸缓冲液进行了微波处理(5分钟,2次)。之后,使用大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11(稀释400倍)反应30分钟后,使用Simple stain mouse MAX-PO(Rat)(NichireiBioscience公司)反应了30分钟。最后,与二氨基联苯胺(DAB)反应10分钟使其生色,使用光学显微镜进行观察。
将结果示于图16。大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11,在野外发病牛#1及实验感染牛#65的回肠病变部中,检测到约尼病菌感染细胞(利用Ziehl-Neelsen染色确认)中的PD-L1的表达(图16a,b)。另一方面,由于在非感染牛(C#6)的回肠中不表达PD-L1,因此没有确认到大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11的反应(非特异性反应)(图16a)。
如上所述,显示大鼠抗牛PD-L1抗体6C11-3A11在牛的组织中能够用于基于免疫组织化学染色法的PD-L1的检测。
本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请均整体作为参考并入本说明书中。
工业实用性
本发明的抗PD-L1抗体可以利用于癌症和/或传染病的诊断。另外,可以利用于适于使用抗PD-L1抗体治疗的受试动物的选择。
序列表白由文本
<SEQ ID NO:1>示出抗PD-L1抗体6C11-3A11(IgG2a)的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:2>示出抗PD-L1抗体6C11-3A11(IgG2a)的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:3>示出抗PD-L1抗体6C11-3A11(IgG2a)的重链可变区的CDR1的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:4>示出抗PD-L1抗体6C11-3A11(IgG2a)的重链可变区的CDR2的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:5>示出抗PD-L1抗体6C11-3A11(IgG2a)的重链可变区的CDR3的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:6>示出抗PD-L1抗体6C11-3A11(IgG2a)的轻链可变区的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:7>示出抗PD-L1抗体6C11-3A11(IgG2a)的重链可变区的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:8>示出抗PD-L1抗体6C11-3A11(IgG2a)的轻链(κ链)恒定区的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:9>示出抗PD-L1抗体6C11-3A11(IgG2a)的重链恒定区的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:10>示出大鼠抗体(IgG2a)的轻链(κ链)恒定区的氨基酸序列(GenBank:#V01241.1)。
<SEQ ID NO:11>示出大鼠抗体(IgG2a)的轻链(κ链)恒定区的氨基酸序列(GenBank:#X16129.1)。
<SEQ ID NO:12>示出大鼠抗体(IgG2a)的轻链(κ链)恒定区的氨基酸序列(GenBank:#DQ402471.1)。
<SEQ ID NO:13>示出大鼠抗体(IgG2a)的重链恒定区的氨基酸序列(GenBank:#DQ402472.1)。
<SEQ ID NO:14>示出抗PD-L1抗体6C11-3A11(IgG2a)的轻链可变区的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:15>示出抗PD-L1抗体6C11-3A11(IgG2a)的重链可变区的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:16>示出抗PD-L1抗体6C11-3A11(IgG2a)的轻链(κ链)恒定区的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:17>示出抗PD-L1抗体6C11-3A11(IgG2a)的重链恒定区的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:18>示出大鼠抗体(IgG2a)的轻链(κ链)恒定区的核苷酸序列(GenBank:#V01241.1)。
<SEQ ID NO:19>示出大鼠抗体(IgG2a)的轻链(κ链)恒定区的核苷酸序列(GenBank:#X16129.1)。
<SEQ ID NO:20>示出大鼠抗体(IgG2a)的轻链(κ链)恒定区的核苷酸序列(GenBank:#DQ402471.1)。
<SEQ ID NO:21>示出大鼠抗体(IgG2a)的重链恒定区的核苷酸序列(GenBank:#DQ402472.1)。
<SEQ ID NO:22~27>SEQ ID NO:22~27依次示出:引物cPD-L1内部F、cPD-L1内部R、cPD-L15’GSP、cPD-L13’GSP、cPD-L1-EGFPF及cPD-L1-EGFPR的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:28>
SEQ ID NO:28示出人抗体的轻链(κ链)恒定区的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:29>
SEQ ID NO:29示出人抗体的轻链(κ链)恒定区的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:30>
SEQ ID NO:30示出人抗体(IgG4变体1)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:31>
SEQ ID NO:31示出人抗体(IgG4变体1)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:32>
SEQ ID NO:32示出人抗体(IgG4变体2)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:33>
SEQ ID NO:33示出人抗体(IgG4变体2)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:34>
SEQ ID NO:34示出人抗体(IgG4变体3)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:35>
SEQ ID NO:35示出人抗体(IgG4变体3)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:36>
SEQ ID NO:36示出小鼠抗体的轻链(κ链)恒定区的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:37>
SEQ ID NO:37示出小鼠抗体的轻链(κ链)恒定区的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:38>
SEQ ID NO:38示出小鼠抗体的轻链(λ链)恒定区的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:39>
SEQ ID NO:39示出小鼠抗体的轻链(λ链)恒定区的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:40>
SEQ ID NO:40示出小鼠抗体的轻链(λ链)恒定区的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:41>
SEQ ID NO:41示出小鼠抗体的轻链(λ链)恒定区的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:42>
SEQ ID NO:42示出小鼠抗体的轻链(λ链)恒定区的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:43>
SEQ ID NO:43示出小鼠抗体的轻链(λ链)恒定区的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:44>
SEQ ID NO:44示出小鼠抗体(IgG1变体1)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:45>
SEQ ID NO:45示出小鼠抗体(IgG1变体1)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:46>
SEQ ID NO:46示出小鼠抗体(IgG1变体2)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:47>
SEQ ID NO:47示出小鼠抗体(IgG1变体2)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:48>
SEQ ID NO:48示出小鼠抗体(IgG2a变体1)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:49>
SEQ ID NO:49示出小鼠抗体(IgG2a变体1)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:50>
SEQ ID NO:50示出小鼠抗体(IgG2a变体2)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:51>
SEQ ID NO:51示出小鼠抗体(IgG2a变体2)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:52>
SEQ ID NO:52示出小鼠抗体(IgG2b变体1)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:53>
SEQ ID NO:53示出小鼠抗体(IgG2b变体1)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:54>
SEQ ID NO:54示出小鼠抗体(IgG2b变体2)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:55>
SEQ ID NO:55示出小鼠抗体(IgG2b变体2)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:56>
SEQ ID NO:56示出小鼠抗体(IgG2c变体1)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:57>
SEQ ID NO:57示出小鼠抗体(IgG2c变体1)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:58>
SEQ ID NO:58は、小鼠抗体(IgG2c变体2)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列示出。
<SEQ ID NO:59>
SEQ ID NO:59示出小鼠抗体(IgG2c变体2)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:60>
SEQ ID NO:60示出小鼠抗体(IgG2c变体3)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:61>
SEQ ID NO:61示出小鼠抗体(IgG2c变体3)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:62>
SEQ ID NO:62示出小鼠抗体(IgG3)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:63>
SEQ ID NO:63示出小鼠抗体(IgG3)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列示出。
<SEQ ID NO:64>
SEQ ID NO:64示出牛抗体的轻链(λ链)恒定区的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:65>
SEQ ID NO:65示出牛抗体的轻链(λ链)恒定区的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:66>
SEQ ID NO:66示出牛抗体(IgG1变体1)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:67>
SEQ ID NO:67示出牛抗体(IgG1变体1)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:68>
SEQ ID NO:68示出牛抗体(IgG1变体2)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:69>
SEQ ID NO:69示出牛抗体(IgG1变体2)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:70>
SEQ ID NO:70示出牛抗体(IgG1变体3)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:71>
SEQ ID NO:71示出牛抗体(IgG1变体3)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:72>
SEQ ID NO:72示出牛抗体(IgG2变体1)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:73>
SEQ ID NO:73示出牛抗体(IgG2变体1)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:74>
SEQ ID NO:74示出牛抗体(IgG2变体2)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:75>
SEQ ID NO:75示出牛抗体(IgG2变体2)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:76>
SEQ ID NO:76示出牛抗体(IgG2变体3)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:77>
SEQ ID NO:77示出牛抗体(IgG2变体3)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:78>
SEQ ID NO:78示出牛抗体(IgG3变体1)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:79>
SEQ ID NO:79示出牛抗体(IgG3变体1)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:80>
SEQ ID NO:80示出牛抗体(IgG3变体2)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:81>
SEQ ID NO:81示出牛抗体(IgG3变体2)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:82>
SEQ ID NO:82示出犬抗体的轻链(λ链)恒定区的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:83>
SEQ ID NO:83示出犬抗体的轻链(λ链)恒定区的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:84>
SEQ ID NO:84示出犬抗体(IgG-D)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:85>
SEQ ID NO:85示出犬抗体(IgG-D)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:86>
SEQ ID NO:86示出羊抗体的轻链(κ链)恒定区的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:87>
SEQ ID NO:87示出羊抗体的轻链(κ链)恒定区的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:88>
SEQ ID NO:88示出羊抗体的轻链(λ链)恒定区的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:89>
SEQ ID NO:89示出羊抗体的轻链(λ链)恒定区的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:90>
SEQ ID NO:90示出羊抗体(IgG1)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:91>
SEQ ID NO:91示出羊抗体(IgG1)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:92>
SEQ ID NO:92示出羊抗体(IgG2)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:93>
SEQ ID NO:93示出羊抗体(IgG2)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:94>
SEQ ID NO:94示出猪抗体(IgG1a)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:95>
SEQ ID NO:95示出猪抗体(IgG1a)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:96>
SEQ ID NO:96示出猪抗体(IgG1b)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:97>
SEQ ID NO:97示出猪抗体(IgG1b)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:98>
SEQ ID NO:98示出猪抗体(IgG2a)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:99>
SEQ ID NO:99示出猪抗体(IgG2a)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:100>
SEQ ID NO:100示出猪抗体(IgG2b)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:101>
SEQ ID NO:101示出猪抗体(IgG2b)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:102>
SEQ ID NO:102示出猪抗体(IgG3)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:103>
SEQ ID NO:103示出猪抗体(IgG3)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:104>
SEQ ID NO:104示出猪抗体(IgG4a)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:105>
SEQ ID NO:105示出猪抗体(IgG4a)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:106>
SEQ ID NO:106示出猪抗体(IgG4b)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:107>
SEQ ID NO:107示出猪抗体(IgG4b)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:108>
SEQ ID NO:108示出猪抗体(IgG5a)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:109>
SEQ ID NO:109示出猪抗体(IgG5a)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:110>
SEQ ID NO:110示出猪抗体(IgG5b)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:111>
SEQ ID NO:111示出猪抗体(IgG5b)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:112>
SEQ ID NO:112示出猪抗体(IgG6a)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:113>
SEQ ID NO:113示出猪抗体(IgG6a)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:114>
SEQ ID NO:114示出猪抗体(IgG6b)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:115>
SEQ ID NO:115示出猪抗体(IgG6b)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:116>
SEQ ID NO:116示出水牛抗体的轻链(推定为Igλ)恒定区(CL)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:117>
SEQ ID NO:117示出水牛抗体的轻链(推定为Igλ)恒定区(CL)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:118>
SEQ ID NO:118示出水牛抗体(推定为IgG1)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:119>
SEQ ID NO:119示出水牛抗体(推定为IgG1)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:120>
SEQ ID NO:120示出水牛抗体(推定为IgG2)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:121>
SEQ ID NO:121示出水牛抗体(推定为IgG2)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:122>
SEQ ID NO:112示出水牛抗体(推定为IgG3)的重链恒定区(CH1~CH3)的氨基酸序列。
<SEQ ID NO:123>
SEQ ID NO:123示出水牛抗体(推定为IgG3)的重链恒定区(CH1~CH3)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:124>
SEQ ID NO:124示出引物(boPD-L1-EGFP F)的核苷酸序列。
<SEQ ID NO:125>
SEQ ID NO:125示出引物(boPD-L1-EGFP R)的核苷酸序列。
Claims (22)
1.抗PD-L1抗体,其由(a)轻链和(b)重链组成,所述(a)轻链包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为KSISKY的CDR1、氨基酸序列为SGS的CDR2及SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列为QQHNEYPLT的CDR3,所述(b)重链包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列为GYTFTDYI的CDR1、SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列为INPDSGGN的CDR2及SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列为ARGITMMVVISHWKFDF的CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体,其源自大鼠。
3.根据权利要求2所述的抗体,其为大鼠抗牛PD-L1抗体。
4.根据权利要求3所述的抗体,其轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:6的氨基酸序列,重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的抗体,其轻链恒定区具有κ链的恒定区的氨基酸序列。
6.根据权利要求1~4中任一项所述的抗体,其重链恒定区具有IgG2a的恒定区的氨基酸序列。
7.根据权利要求5所述的抗体,其轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ IDNO:8、10~12中的任一个氨基酸序列,重链恒定区的氨基酸序列为SEQ IDNO:9或13的氨基酸序列。
8.根据权利要求1~4中任一项所述的抗体,其由2条轻链和2条重链的4条链结构组成。
9.用于检测PD-L1的组合物,其包含权利要求1~8中任一项所述的抗体作为有效成分。
10.根据权利要求9所述的组合物,其用于癌症和/或传染病的诊断。
11.根据权利要求10所述的组合物,其中,癌症和/或传染病选自由以下组成的组:肿瘤疾病、白血病、约尼病、无形体病、细菌性乳腺炎、真菌性乳腺炎、支原体传染病、结核病、小梨浆虫病、隐孢子虫病、球虫病、锥虫病及利什曼病。
12.根据权利要求11所述的组合物,其中所述支原体传染病为支原体性乳腺炎或支原体性肺炎。
13.根据权利要求9所述的组合物,其用于选择适于使用抗PD-L1抗体治疗的受试动物。
14.DNA,其编码权利要求1所述的抗PD-L1抗体。
15.载体,其包含权利要求14所述的DNA。
16.宿主细胞,其用权利要求15所述的载体转化。
17.抗体的制造方法,其包括:培养权利要求16所述的宿主细胞,从培养物提取抗PD-L1抗体。
18.编码抗PD-L1抗体的轻链的DNA和编码抗PD-L1抗体的重链的DNA的组合,所述轻链包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为KSISKY的CDR1、氨基酸序列为SGS的CDR2及SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列为QQHNEYPLT的CDR3,所述重链包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列为GYTFTDYI的CDR1、SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列为INPDSGGN的CDR2及SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列为ARGITMMVVISHWKFDF的CDR3。
19.权利要求1~8中任一项所述的抗体在制备用于检测受试动物中的PD-L1的检测剂中的用途,其中所述受试动物选自由犬、绵羊、山羊、猪、马、水牛、牦牛和牛组成的组。
20.根据权利要求19所述的用途,其中所述检测剂用于诊断选自由以下组成的组的疾病:肿瘤疾病、白血病、约尼病、无形体病、利斯特菌病、圆环病毒2型感染及支原体传染病。
21.根据权利要求20所述的用途,其中所述支原体传染病为支原体性肺炎。
22.根据权利要求19所述的用途,其中,所述检测剂用于选择适于使用抗PD-L1抗体治疗的受试动物。
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