CN115850489A - 抗pd-1抗体 - Google Patents

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铃木定彦
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Abstract

本发明提供一种对于大鼠以外的动物也能够反复施用的抗PD‑1抗体。本发明的抗PD‑1抗体包含(a)L链和(b)H链，所述L链具有包含具有QSLEYSDGYTY(序列号16)的氨基酸序列的CDR1、具有GVS的氨基酸序列的CDR2及具有FQATHDPDT(序列号17)的氨基酸序列的CDR3的L链可变区、和大鼠以外的动物抗体的L链恒定区，所述H链具有包含具有GFSLTSYY(序列号18)的氨基酸序列的CDR1、具有IRSGGST(序列号19)的氨基酸序列的CDR2及具有ARTSSGYEGGFDY(序列号20)的氨基酸序列的CDR3的H链可变区和大鼠以外的动物抗体的H链恒定区。本发明提供一种医药组合物，其包含所述抗PD‑1抗体作为有效成分。本发明还提供制造所述抗PD‑1抗体的方法。

Description

抗PD-1抗体
本申请是申请日为2017年8月10日、申请号为201780050367.6、发明名称为“抗PD-1抗体”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种抗PD-1抗体，更具体而言，涉及具有包含大鼠抗牛PD-1抗体的互补链决定区(CDR)的可变区和大鼠以外的动物的抗体的恒定区的抗PD-1抗体。
背景技术
免疫抑制受体Programmed death 1(PD-1)和作为其配体的Programmed deathligand 1(PD-L1)是由京都大学本庶佑等人鉴定为抑制过度的免疫响应、与免疫耐受密切相关的因子的分子(非专利文献1：Ishida Y，Agata Y，Shibahara K，Honjo T The EMBOJ.，11(11)：3887-3895；Nov.1992.)。近年来已表明还参与肿瘤中的免疫抑制，在人类医疗中，开发出阻碍PD-1的作用的抗体药并得到实用化(小野药品工业株式会社“OPDIVO(注册商标)”)。
此前，本发明人等进行了针对动物难治性疾病的以PD-1或PD-L1为标靶的免疫细胞疗法的开发，阐明该新型免疫细胞疗法可以横跨疾病并且横跨动物地应用(非专利文献2：Ikebuchi R，Konnai S，Shirai T，Sunden Y，Murata S，Onuma M，Ohashi K.Vet.Res.，42：103；Sep.26，2011.、非专利文献3：Ikebuchi R，Konnai S，Okagawa T，Yokoyama K，Nakajima C，Suzuki Y，Murata S，Ohashi K.Vet.Res.，44：59；Jul.22，2013.、非专利文献4：Ikebuchi R，Konnai S，Okagawa T，Yokoyama K，Nakajima C，Suzuki Y，Murata S，Ohashi K.Immunology.142(4)：551-61；Aug.2014.、非专利文献5：Maekawa N，Konnai S，Ikebuchi R，Okagawa T，Adachi M，Takagi S，Kagawa Y，Nakajima C，Suzuki Y，Murata S，Ohashi K.PLoS One.，9(6)：e98415；Jun.10，2014.、非专利文献6：Mingala CN，Konnai S，Ikebuchi R，Ohashi K.Comp.Immunol.Microbiol.Infect.Dis.，34(1)：55-63；Jan.2011.)。
但是，由于本发明人等此前所制作的抗体为大鼠抗体，因此无法对大鼠以外的动物反复施用。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Ishida Y，Agata Y，Shibahara K，Honjo T.The EMBO Journal.11(11)：3887-3895；Nov.1992.
非专利文献2：Ikebuchi R，Konnai S，Shirai T，Sunden Y，Murata S，Onuma M，Ohashi K.Vet.Res.，42：103；Sep.2011.
非专利文献3：Ikebuchi R，Konnai S，Okagawa T，Yokoyama K，Nakajima C，Suzuki Y，Murata S，Ohashi K.Vet.Res.，44：59；Jul.22，2013.
非专利文献4：Ikebuchi R，Konnai S，Okagawa T，Yokoyama K，Nakajima C，Suzuki Y，Murata S，Ohashi K.Immunology，142(4)：551-61；Aug.2014.
非专利文献5：Maekawa N，Konnai S，Ikebuchi R，Okagawa T，Adachi M，TakagiS，Kagawa Y，Nakajima C，Suzuki Y，Murata S，Ohashi K.PLoS One，9(6)：e98415；Jun.10，2014.
非专利文献6：Mingala CN，Konnai S，Ikebuchi R，Ohashi K.Comp.Immunol.Microbiol.Infect.Dis.，34(1)：55-63；Jan.2011.
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于，提供一种对于大鼠以外的动物也能够反复施用的抗PD-1抗体。
用于解决问题的方法
本发明人等确定了能够阻碍牛PD-1与PD-L1的结合的大鼠抗牛PD-1单克隆抗体(5D2)的可变区，并将该可变区基因与牛免疫球蛋白(牛IgG1，其中为了抑制ADCC活性而对CH2结构域的Fcγ受体预想结合部位施加了突变(参照图1、图11。氨基酸序号及突变：251E→P，252L→V，253P→A，254G→缺失，348A→S，349P→S；Ikebuchi R，Konnai S，Okagawa T，Yokoyama K，Nakajima C，Suzuki Y，Murata S，Ohashi K.Immunology 2014Aug；142(4)：551-561.)。)的恒定区基因组合而得到嵌合抗体基因，培养增殖导入了所得的嵌合抗体基因的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell：CHO细胞)，由此成功地制作出大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体。此外，确定了大鼠抗牛PD-1单克隆抗体(5D2)的可变区的CDR。本发明是根据这些见解而完成的发明。
本发明的主旨如下所示。
(1)一种抗PD-1抗体，其包含(a)L链和(b)H链，所述L链具有包含具有QSLEYSDGYTY(序列号16)的氨基酸序列的CDR1、具有GVS的氨基酸序列的CDR2及具有FQATHDPDT(序列号17)的氨基酸序列的CDR3的L链可变区、和大鼠以外的动物抗体的L链恒定区，所述H链具有包含具有GFSLTSYY(序列号18)的氨基酸序列的CDR1、具有IRSGGST(序列号19)的氨基酸序列的CDR2及具有ARTSSGYEGGFDY(序列号20)的氨基酸序列的CDR3的H链可变区和大鼠以外的动物抗体的H链恒定区。
(2)根据(1)中记载的抗体，其中，L链可变区和H链可变区来自于大鼠。
(3)根据(2)中记载的抗体，其中，L链可变区为大鼠抗牛PD-1抗体的L链可变区，H链可变区为大鼠抗牛PD-1抗体的H链可变区。
(4)根据(3)中记载的抗体，其中，L链可变区具有序列号1的氨基酸序列，H链可变区具有序列号2的氨基酸序列。
(5)根据(1)～(4)中任一项记载的抗体，其中，大鼠以外的动物抗体的L链恒定区具有Lambda链或Kappa链的恒定区的氨基酸序列。
(6)根据(1)～(5)中任一项记载的抗体，其中，大鼠以外的动物抗体的H链恒定区具有相当于人的IgG4的免疫球蛋白的恒定区的氨基酸序列，或者被导入了使ADCC活性和/或CDC活性降低的突变。
(7)根据(6)中记载的抗体，其中，大鼠以外的动物为牛，牛抗体的L链恒定区具有Lambda链的恒定区的氨基酸序列，并且牛抗体的H链恒定区被导入了使ADCC活性和/或CDC活性降低的突变。
(8)根据(7)中记载的抗体，其中，牛抗体的L链恒定区具有序列号3的氨基酸序列，牛抗体的H链恒定区具有序列号4的氨基酸序列。
(9)根据(1)～(8)中任一项记载的抗体，其具有两条L链和两条H链的四链结构。
(10)一种医药组合物，其包含(1)～(9)中任一项记载的抗体作为有效成分。
(11)根据(10)中记载的医药组合物，其用于癌症和/或感染症的预防和/或治疗。
(12)根据(11)中记载的医药组合物，其中，癌症和/或感染症选自肿瘤性疾病、白血病、约内氏病、无浆体病(アナプラズマ病)、细菌性乳腺炎、真菌性乳腺炎、支原体感染症(例如支原体性乳腺炎、支原体性肺炎等)、结核病、小型梨浆虫病(小型ピロプラズマ病)、隐孢子虫病、球虫病、锥虫病及利什曼病中。
(13)一种人工基因DNA，其包含(a’)编码L链的DNA和(b’)编码H链的DNA，所述L链具有包含具有QSLEYSDGYTY(序列号16)的氨基酸序列的CDR1、具有GVS的氨基酸序列的CDR2及具有FQATHDPDT(序列号17)的氨基酸序列的CDR3的L链可变区、和大鼠以外的动物抗体的L链恒定区，所述H链具有包含具有GFSLTSYY(序列号18)的氨基酸序列的CDR1、具有IRSGGST(序列号19)的氨基酸序列的CDR2及具有ARTSSGYEGGFDY(序列号20)的氨基酸序列的CDR3的H链可变区和大鼠以外的动物抗体的H链恒定区。
(14)一种载体，其包含(13)中记载的人工基因DNA。
(15)一种宿主细胞，其被利用(14)中记载的载体进行了转化。
(16)一种抗体的制造方法，其包括培养(15)中记载的宿主细胞、并从培养物中采集抗PD-1抗体的操作。
(17)一种DNA，其编码L链，所述L链具有包含具有QSLEYSDGYTY(序列号16)的氨基酸序列的CDR1、具有GVS的氨基酸序列的CDR2及具有FQATHDPDT(序列号17)的氨基酸序列的CDR3的L链可变区、和大鼠以外的动物抗体的L链恒定区。
(18)一种DNA，其编码H链，所述H链具有包含具有GFSLTSYY(序列号18)的氨基酸序列的CDR1、具有IRSGGST(序列号19)的氨基酸序列的CDR2及具有ARTSSGYEGGFDY(序列号20)的氨基酸序列的CDR3的H链可变区、和大鼠以外的动物抗体的H链恒定区。
发明效果
根据本发明，可以得到新型的抗PD-1抗体。该抗体对于大鼠以外的动物也可以利用。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请日本特愿2016-159090及日本特愿2017-099615的说明书和/或附图中记载的内容。
附图说明
图1为大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2的氨基酸序列。表示出大鼠抗牛PD-1抗体5D2的L链可变区及H链可变区中的CDR1、CDR2及CDR3区域，此外，还表示出对牛IgG1(CH2结构域)施加了突变的氨基酸(氨基酸序号及突变：251E→P，252L→V，253P→A，254G→缺失，348A→S，349P→S)。
图2为pDN112载体与大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2的示意图。
图3为大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2的产生量及纯化纯度。
图4为大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2的结合性。
图5为大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2的牛PD-1/PD-L1结合阻碍活性。
图6为向BLV实验感染牛施用后的大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2的血中浓度的推移。
图7为施用了大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2的BLV实验感染牛的对BLV抗原的T细胞的细胞增殖响应。
图8为施用了大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2的BLV实验感染牛的BLV前病毒量的变化。
图9为大鼠抗牛PD-1抗体5D2与绵羊PD-1的交叉反应性。
图10为大鼠抗牛PD-1抗体5D2与水牛的T细胞的交叉反应性。
图11为牛IgG1恒定区的立体结构及Fcγ受体预想结合部位。
图12为pDC6载体。
图13为大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2 IgG1 WT及IgG1 ADCC-的纯化纯度。
图14为大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2 IgG1 WT及IgG1 ADCC-的与各牛Fcγ受体的结合性。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明提供一种抗PD-1抗体，其包含(a)L链和(b)H链，所述L链具有包含具有QSLEYSDGYTY(序列号16)的氨基酸序列的CDR1、具有GVS的氨基酸序列的CDR2及具有FQATHDPDT(序列号17)的氨基酸序列的CDR3的L链可变区、和大鼠以外的动物抗体的L链恒定区，所述H链具有包含具有GFSLTSYY(序列号18)的氨基酸序列的CDR1、具有IRSGGST(序列号19)的氨基酸序列的CDR2及具有ARTSSGYEGGFDY(序列号20)的氨基酸序列的CDR3的H链可变区和大鼠以外的动物抗体的H链恒定区。
大鼠抗牛PD-1抗体5D2(后述)的L链可变区中的CDR1～3分别为包含QSLEYSDGYTY(序列号16)的氨基酸序列的区域、包含GVS的氨基酸序列的区域、包含FQATHDPDT(序列号17)的氨基酸序列的区域(参照图1)。
另外，大鼠抗牛PD-1抗体5D2的H链可变区中的CDR1～3分别为包含GFSLTSYY(序列号18)的氨基酸序列的区域、包含IRSGGST(序列号19)的氨基酸序列的区域及包含ARTSSGYEGGFDY(序列号20)的氨基酸序列的区域(参照图1)。
在QSLEYSDGYTY(序列号16)的氨基酸序列、GVS的氨基酸序列及FQATHDPDT(序列号17)的氨基酸序列、以及GFSLTSYY(序列号18)的氨基酸序列、IRSGGST(序列号19)的氨基酸序列及ARTSSGYEGGFDY(序列号20)的氨基酸序列中，可以缺失、置换或加入1个、2个、3个、4个或5个氨基酸，即使导入这些突变，也可以具有作为PD-1抗体的L链可变区的CDR或H链可变区的CDR的功能。
本说明书中，所谓抗体，是除了包括全长抗体以外、还包括Fab、F(ab)’2、ScFv、二聚抗体、VH、VL、Sc(Fv)2、双特异性sc(Fv)2、微型抗体、ScFv-Fc单体、ScFv-Fc二聚体等被低分子化了的抗体的概念。
本发明的抗PD-1抗体中，L链可变区和H链可变区可以来自于大鼠。例如，可以是L链可变区为大鼠抗牛PD-1抗体的L链可变区，H链可变区为大鼠抗牛PD-1抗体的H链可变区。
将大鼠抗牛PD-1抗体的L链可变区的氨基酸序列及H链可变区的氨基酸序列分别表示于序列号1及2中，然而在序列号1及2的氨基酸序列中，可以缺失、置换或加入1或多个(例如5个以下、至多10个左右)氨基酸，即使导入这些突变，也可以具有作为PD-1抗体的L链可变区或H链可变区的功能。
大鼠以外的动物抗体的L链恒定区及H链恒定区可以来自于产生与大鼠抗牛PD-1抗体5D2发生交叉反应的PD-1的动物。
在抗体的L链中，有Kappa链(卡帕链)和Lambda链(兰姆达链)，本发明的抗PD-1抗体中，大鼠以外的动物的抗体的L链恒定区无论具有Kappa链或Lambda链的哪个链的恒定区的氨基酸序列都可以，对于存在比率，就牛、绵羊、猫、狗、马而言是Lambda链的一方高，就小鼠、大鼠、人、猪而言是Kappa链的一方高。由于认为优选存在比率高的链的一方，因此就牛、绵羊、猫、狗、马而言优选具有Lambda链的恒定区的氨基酸序列，就小鼠、大鼠、人、猪而言优选具有Kappa链的恒定区的氨基酸序列。
大鼠以外的动物的抗体的H链恒定区可以具有相当于人的IgG4的免疫球蛋白的恒定区的氨基酸序列。H链根据恒定区的差别被分为γ链、μ链、α链、δ链、ε链，根据该差别分别形成IgG、IgM、IgA、IgD、IgE的5种类型(同种型)的免疫球蛋白。
免疫球蛋白G(IgG)占人免疫球蛋白的70-75％，是血浆中最多的单体的抗体。具有两条轻链和两条重链的四链结构。人IgG1、IgG2、IgG4的分子量约为146000，而人IgG3的连接Fab区域与Fc区域的铰链部长，分子量也大到170000。人IgG1占人IgG的65％左右，人IgG2占25％左右，人IgG3占7％左右，人IgG4占3％左右。平均地分布于血管内外。人IgG1由于对效应细胞表面的Fc受体、补体因子具有强亲和性，因此诱导抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)，另外，将补体活化而诱导补体依赖性细胞毒作用(CDC)。人IgG2和人IgG4由于对Fc受体、补体因子的亲和性低，因此ADCC活性及CDC活性低。
免疫球蛋白M(IgM)是占人免疫球蛋白的约10％的、结合5个基本的四链结构而得的五聚体的抗体。分子量为970000。通常仅存在于血中，是针对感染微生物最先产生、担任早期免疫的免疫球蛋白。
免疫球蛋白A(IgA)占人免疫球蛋白的10-15％。分子量为160000。分泌型IgA是结合2个IgA而得的二聚体的抗体。IgA1存在于血清、鼻涕、唾液、母乳中，在肠液中存在大量IgA2。
免疫球蛋白D(IgD)是人免疫球蛋白的1％以下的单体的抗体。存在于B细胞表面，参与抗体产生的诱导。
免疫球蛋白E(IgE)是人免疫球蛋白的0.001％以下的仅极微量存在的单体的抗体。被认为参与针对寄生虫的免疫反应，而在寄生虫稀少的发达国家中，特别是与支气管哮喘、过敏有很大关系。
就狗而言，作为IgG的H链，鉴定出IgG-A(相当于人IgG2)、IgG-B(相当于人IgG1)、IgG-C(相当于人IgG3)、IgG-D(相当于人IgG4)的序列。本发明的抗体中，优选不同时具有ADCC活性、CDC活性的IgGH链恒定区(就人而言是IgG4)。在没有鉴定出相当于人IgG4的免疫球蛋白的恒定区的情况下，可以使用通过对相当于人IgG1的免疫球蛋白的该区域施加突变而不同时具有ADCC活性、CDC活性的区域。
就牛而言，作为IgG的H链，鉴定出IgG1、IgG2、IgG3的序列。本发明的抗体中，优选不同时具有ADCC活性、CDC活性的IgGH链恒定区(就人而言是IgG4)。已知人IgG1的恒定区就野生型而言具有ADCC活性及CDC活性，而通过对特定的部分施加氨基酸置换、缺失，可以使它们的活性降低。在牛中，由于没有鉴定出相当于人IgG4的免疫球蛋白的恒定区，因此可以对相当于人IgG1的免疫球蛋白的该区域施加突变并使用该区域。作为其一例，将对牛抗体的H链恒定区(IgG1链，GenBank：X62916)的CH2结构域施加了突变的氨基酸序列和核苷酸序列(将密码子最佳化了的序列)分别表示于序列号4及8中。
更优选如下的抗PD-1抗体，即，牛抗体的L链恒定区具有Lambda链的恒定区的氨基酸序列，并且牛抗体的H链恒定区被导入了使ADCC活性和/或CDC活性降低的突变。
本发明的抗PD-1抗体包含大鼠-牛嵌合抗体、牛化抗体、完全牛型抗体，然而动物并不限定为牛，可以例示出入、狗、猪、猴、小鼠、猫、马、山羊、绵羊、水牛、兔、仓鼠、豚鼠等等。
例如，本发明的抗PD-1抗体可以是牛抗体的L链恒定区具有序列号3的氨基酸序列、牛抗体的H链恒定区具有序列号4的氨基酸序列的抗PD-1抗体。
在序列号3及4的氨基酸序列中，可以缺失、置换或加入1或多个(例如5个以下、至多10个左右)氨基酸，即使导入这些突变，也可以具有作为抗体的L链恒定区或H链恒定区的功能。
本发明的抗PD-1抗体可以是具有两条L链和两条H链的四链结构。
本发明的抗PD-1抗体可以如下所示地制造。合成包含鉴定了的大鼠抗牛PD-1抗体的可变区序列和大鼠以外的动物(例如牛等)的抗体(优选为对相当于人IgG1的免疫球蛋白的该区域施加突变、使ADCC活性和/或CDC活性降低的抗体)的恒定区序列的人工基因，将该人工基因插入载体(例如质粒)后，导入宿主细胞(例如CHO细胞等哺乳类细胞)，并培养该宿主细胞，由此从培养物中采集抗体。
将本发明人等鉴定了的大鼠抗牛PD-1抗体的L链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列分别表示于序列号1及5中。此外，将密码子最佳化后的核苷酸序列表示于序列号11中。
将本发明人等鉴定了的大鼠抗牛PD-1抗体的H链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列分别表示于序列号2及6中。此外，将密码子最佳化后的核苷酸序列表示于序列号12中。
将牛抗体的L链恒定区(Lambda链，GenBank：X62917)的氨基酸序列和核苷酸序列分别表示于序列号3及7中。此外，将密码子最佳化后的核苷酸序列表示于序列号13中。
将牛抗体的H链恒定区(IgG1链，改变GenBank：X62916)的氨基酸序列和核苷酸序列(密码子最佳化后)分别表示于序列号4及8中。
另外，序列号9表示包含大鼠抗牛PD-1抗体的L链可变区和牛抗体的L链恒定区(Lambda链，GenBank：X62917)的嵌合L链的氨基酸序列。将包含大鼠抗牛PD-1抗体的L链可变区和牛抗体的L链恒定区(Lambda链，GenBank：X62917)的嵌合L链的核苷酸序列(密码子最佳化后)表示于序列号14中。
序列号10表示包含大鼠抗牛PD-1抗体的H链可变区和牛抗体的H链恒定区(IgG1链，改变GenBank：X62916)的嵌合H链的氨基酸序列。将包含大鼠抗牛PD-1抗体的H链可变区和牛抗体的H链恒定区(IgG1链，改变GenBank：X62916)的嵌合H链的核苷酸序列(密码子最佳化后)表示于序列号15中。
除此以外，大鼠以外的动物的L链恒定区及H链恒定区的氨基酸序列和核苷酸序列可以从公知的数据库获得，可以利用这些序列。
将牛的L链恒定区及H链恒定区的氨基酸序列和核苷酸序列集中整理于下述的表中。
(表)
Figure BDA0004069052850000111
/>
Figure BDA0004069052850000121
Figure BDA0004069052850000131
将绵羊、水牛、人的L链恒定区及H链恒定区的氨基酸序列和核苷酸序列集中整理于下述的表中。
(表)
Figure BDA0004069052850000141
/>
Figure BDA0004069052850000151
/>
Figure BDA0004069052850000161
在序列号3、21～28、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、以及59的氨基酸序列中，可以缺失、置换或加入1或多个(例如5个以下、至多10个左右)氨基酸，即使导入这些突变，也可以具有作为Ig重链或轻链的恒定区的功能。
已知人IgG1的恒定区就野生型而言具有ADCC活性及CDC活性，然而通过对特定的部分施加氨基酸置换、缺失，可以降低它们的活性。在人以外的动物中，在没有鉴定出相当于人IgG4的免疫球蛋白的恒定区的情况下，可以使用对相当于人IgG1的免疫球蛋白的该区域施加突变、降低了ADCC活性及CDC活性的区域。
本发明提供一种人工基因DNA，其包含(a’)编码L链的DNA和(b’)编码H链的DNA，所述L链具有包含具有QSLEYSDGYTY(序列号16)的氨基酸序列的CDR1、具有GVS的氨基酸序列的CDR2及具有FQATHDPDT(序列号17)的氨基酸序列的CDR3的L链可变区、和大鼠以外的动物抗体的L链恒定区，所述H链具有包含具有GFSLTSYY(序列号18)的氨基酸序列的CDR1、具有IRSGGST(序列号19)的氨基酸序列的CDR2及具有ARTSSGYEGGFDY(序列号20)的氨基酸序列的CDR3的H链可变区和大鼠以外的动物抗体的H链恒定区。另外，本申请发明还提供一种编码L链的DNA，所述L链具有包含具有QSLEYSDGYTY(序列号16)的氨基酸序列的CDR1、具有GVS的氨基酸序列的CDR2及具有FQATHDPDT(序列号17)的氨基酸序列的CDR3的L链可变区、和大鼠以外的动物抗体的L链恒定区。此外，本发明还提供一种编码H链的DNA，所述H链具有包含具有GFSLTSYY(序列号18)的氨基酸序列的CDR1、具有IRSGGST(序列号19)的氨基酸序列的CDR2及具有ARTSSGYEGGFDY(序列号20)的氨基酸序列的CDR3的H链可变区、和大鼠以外的动物抗体的H链恒定区。
对于(a)具有包含具有QSLEYSDGYTY(序列号16)的氨基酸序列的CDR1、具有GVS的氨基酸序列的CDR2及具有FQATHDPDT(序列号17)的氨基酸序列的CDR3的L链可变区、和大鼠以外的动物抗体的L链恒定区的L链、以及(b)具有包含具有GFSLTSYY(序列号18)的氨基酸序列的CDR1、具有IRSGGST(序列号19)的氨基酸序列的CDR2及具有ARTSSGYEGGFDY(序列号20)的氨基酸序列的CDR3的H链可变区和大鼠以外的动物抗体的H链恒定区的H链，已经在前面叙述。(a’)的DNA为编码(a)的L链的DNA(基因)，(b’)的DNA为编码(b)的H链的DNA(基因)，包含(a’)的DNA和(b’)的DNA的人工基因DNA可以使用市售的合成机合成。也可以向人工基因DNA加入限制性酶识别部位、KOZAK序列、poly(A)加尾信号序列、启动子序列、内含子序列等。
另外，本发明还提供包含所述人工基因DNA的载体。
作为载体，可以使用大肠杆菌来源的质粒(例如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、枯草杆菌来源的质粒(例如pUB110、pTP5、pC194)、酵母来源质粒(例如pSH19、pSH15)、λ噬菌体等噬菌体、逆转录病毒、痘苗病毒等动物病毒、杆状病毒等昆虫病原病毒等。后述的实施例中，使用了pDN1 12(Marzi A，Yoshida R，Miyamoto H，Ishijima M，Suzuki Y，Higuchi M，Matsuyama Y，Igarashi M，Nakayama E，Kuroda M，Saijo M，Feldmann F，BriningD，Feldmann H，Takada A.PLoS One，7：e36192，Apr.27，2012；Ikebuchi R，Konnai S，OkagawaT，Yokoyama K，Nakajima C，Suzuki Y，Murata S，Ohashi K.Immunology，142(4)：551-561，Aug.2014.)。
也可以向载体中加入启动子、增强子、剪接信号、poly(A)加尾信号、内含子序列、选择标记、SV40复制起始点等。
此外，本发明还提供利用所述载体进行了转化的宿主细胞。通过培养该宿主细胞，并从培养物中采集抗体，可以制造抗PD-1抗体。由此，本发明还提供一种抗体的制造方法，该制造方法包括培养所述宿主细胞、并从培养物中采集抗PD-1抗体的操作。本发明的抗体的制造方法中，可以将整合了包含编码L链的DNA和编码H链的DNA的人工基因DNA的载体转染到宿主细胞中，也可以将整合了编码L链的DNA的载体和整合了编码H链的DNA的载体共转染到宿主细胞中。
作为宿主细胞，可以例示出细菌细胞(例如埃希菌属细菌、芽孢杆菌属细菌、枯草杆菌等)、真菌细胞(例如酵母、曲霉等)、昆虫细胞(例如S2细胞、Sf细胞等)、动物细胞(例如CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、C127细胞、3T3细胞、BHK细胞、HEK293细胞等)、植物细胞等。其中，优选作为二氢叶酸还原酶缺损细胞的CHO-DG44细胞(CHO-DG44(dhfr-/-))。
要将重组载体导入宿主，可以利用分子克隆第二版，J.Sambrook et al.，ColdSpringHarborLab.Press，1989中记载的方法(例如磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、转染法、显微注射法、脂质体转染法、电穿孔法、转化法、刮棒负载法(スクレ一プロ一デイング法)、鸟枪法(ショツトガン法)等)或感染来进行。
可以用培养基培养转化体，从培养物中采集本发明的抗PD-1抗体。在抗体被分泌到培养基中的情况下，只要回收培养基并从该培养基中分离、纯化抗体即可。在抗体产生于受到转化的细胞内的情况下，只要将该细胞溶解并从其溶解物中分离、纯化抗体即可。
作为培养基，可以例示出OptiCHO培养基、Dynamis培养基、CD CHO培养基、ActiCHO培养基、FortiCHO培养基、Ex-Cell CD CHO培养基、BalanCD CHO培养基、ProCHO5培养基、Cellvento CHO-100培养基等，然而并不限定于它们。
培养基的pH根据所培养的细胞而不同，然而一般而言为pH6.8～7.6，多数情况下适合为pH7.0～7.4。
在所培养的细胞为CHO细胞的情况下，CHO细胞的培养可以使用本领域人员公知的方法进行。例如，通常可以在气相的CO2浓度为0-40％、优选为2-10％的气氛下、在30-39℃、优选在37℃左右进行培养。
适合的培养期间通常为1天～3个月，优选为1天～3周。
抗体的分离及纯化可以利用公知的方法进行。作为公知的分离、纯化法，可以使用盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的差的方法、透析法、超滤法、凝胶过滤法、以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法等利用分子量的差的方法、离子交换色谱等利用电荷的差的方法、亲和层析等利用特异性亲和性的方法、反相高速液体色谱等利用疏水性的差的方法、等电点电泳法等利用等电点的差的方法等。
本发明的抗PD-1抗体可以作为动物用或人用的抗体药利用。由此，本发明提供包含上述的抗PD-1抗体作为有效成分的医药组合物。
本发明的医药组合物可以用于癌症和/或感染症的预防和/或治疗。作为癌症和/或感染症，可以例示出肿瘤性疾病(例如恶性黑色素瘤、肺癌、胃癌、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、食道癌、卵巣癌等)、白血病、约内氏病、无浆体病、细菌性乳腺炎、真菌性乳腺炎、支原体感染症(例如支原体性乳腺炎、支原体性肺炎等)、结核病、小型梨浆虫病、隐孢子虫病、球虫病、锥虫病及利什曼病等，然而并不限定于它们。
可以将本发明的抗PD-1抗体溶解于PBS等缓冲液、生理盐水、灭菌水等中，根据需要用过滤器等进行过滤灭菌后，利用注射向受试动物(也包括人)施用。另外，可以向该溶液中添加添加剂(例如着色剂、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、溶解助剂、稳定化剂、保存剂、抗氧剂、缓冲剂、等渗剂、pH调节剂等)等。作为施用路径，可以是静脉、肌肉、腹腔、皮下、皮内施用等，另外，也可以经鼻、经口施用。
本发明的抗PD-1抗体的施用量、施用的次数及频率根据受试动物的症状、年龄、体重、施用方法、施用形态等而不同，例如通常可以对每一成年动物以至少一次、可以获得所期望的效果的频率施用0.1～100mg/kg体重、优选1～10mg/kg体重。
本发明的医药组合物可以单独使用，也可以与外科手术、放疗、癌症疫苗等其他免疫细胞疗法、分子靶向治疗药组合使用。由此可以期待协同效应。
实施例
以下，基于实施例对本发明进行详细说明，然而本发明并不限定于这些实施例。
〔实施例1〕大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体的建立
序论
免疫抑制受体Programmed death 1(PD-1)和作为其配体的Programmed deathligand 1(PD-L1)是由京都大学本庶佑等人鉴定为抑制过度的免疫响应、与免疫耐受密切相关的因子的分子。近年来还阐明参与肿瘤中的免疫抑制。本实施例中，以建立对牛的感染症的新型治疗法为目的，制作了大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2，并确认了体外(invitro)及体内(in vivo)的效果，所述大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2是培养增殖表达嵌合抗体基因的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamsterovary cell：CHO细胞)而得，所述嵌合抗体基因是将能够阻碍牛PD-1与PD-L1的结合的大鼠抗牛PD-1单克隆抗体5D2的可变区基因、和牛免疫球蛋白(牛IgG1及Igλ。其中，为了抑制ADCC活性，对牛IgG1 CH2结构域的Fcγ受体预想结合部位施加了突变(图1、图11)。氨基酸序号及突变：250E→P，251L→V，252P→A，253G→缺失，347A→S，348P→S；Ikebuchi R，Konnai S，Okagawa T，Yokoyama K，Nakajima C，Suzuki Y，Murata S，Ohashi K.Immunology，142(4)：551-561；Aug.2014.)的恒定区基因组合而得。
材料、方法、以及实验结果
2.1.牛PD-1及PD-L1表达细胞的构建
对牛PD-1基因(GenBank登记号AB510901；Ikebuchi R，Konnai S，Sunden Y，OnumaM，Ohashi K.Microbiol.Immunol.，54(5)：291-298；May 2010.)及牛PD-L1基因(GenBank登记号AB510902；Ikebuchi R，Konnai S，Shirai T，Sunden Y，Murata S，Onuma M，OhashiK.Vet.Res.，42：103；Sep.26，2011.)确定cDNA全长的碱基序列，根据其基因信息制作出牛PD-1或PD-L1表达细胞。首先，为了制作牛PD-1或PD-L1表达质粒，以所合成的牛外周血单核细胞(PBMC)来源cDNA为模板，使用向5′末端侧加入限制性酶NotI及HindIII(牛PD-1)、或NheI及XhoI(牛PD-L1)识别部位的引物(boPD-1-myc F及R、或boPD-L1-EGFP F及R)进行了PCR。对所得的PCR产物利用NotI(Takara公司)及HindIII(Takara公司；牛PD-1)、或NheI(Takara公司)及XhoI(Takara公司；牛PD-L1)进行处理后，使用FastGene Gel/PCR提取试剂盒(NIPPON Genetics公司)进行纯化，导入进行了同样的限制性酶处理的pCMV-Tag1载体(Agilent Technologies公司；牛PD-1)或pEGFP-N2载体(Clontech公司；牛PD-L1)中，进行了克隆。使用QIAGEN Plasmid Midi kit(Qiagen公司)提取所得的目标的表达质粒，在用于实验前以-30℃保存。以后，将所制作的表达质粒表示为pCMV-Tag1-boPD-1或pEGFP-N2-boPD-L1。
引物(boPD-1-myc F)：
ATATGCGGCCGCATGGGGACCCCGCGGGCGCT(序列号61)；
引物(boPD-1-myc R)：
GCGCAAGCTTTCAGAGGGGCCAGGAGCAGT(序列号62)；
引物(boPD-L1-EGFP F)：
CTAGCTAGCACCATGAGGATATATAGTGTCTTAAC(序列号63)；
引物(boPD-L1-EGFP R)：
CAATCTCGAGTTACAGACAGAAGATGACTGC(序列号64)。
依照以下的步骤，制作出牛PD-1表达细胞。首先，使用Lipofectamine LTX(Invitrogen公司)将2.5μg的pCMV-Tag1-boPD-1导入4×106个的CHO-DG44细胞中。48小时后，将培养基更换为包含G418(Enzo Life Science公司)800μg/ml、GlutaMAX添加剂(Lifetechnologies公司)20ml/l、10％Pluronic F-68(Life technologies公司)18ml/1的CDDG44培养基(Life technologies公司)，进行了选择。使所得的表达细胞与大鼠抗牛PD-1抗体5D2在室温下反应，清洗后，与抗大鼠IgG微珠标记抗体(Miltenyi Biotec公司)在室温下进一步反应。使用Auto MACS(Miltenyi Biotec公司)分离高表达牛PD-1的细胞，为了进一步提高纯度，利用同様的步骤进行了再分离。对所制作出的表达细胞利用极限稀释法进行克隆，得到牛PD-1高表达CHO DG44细胞(牛PD-1表达细胞)。
依照以下的步骤，制作出牛PD-L1膜表达细胞。首先，使用Lipofectamine LTX(Invitrogen公司)将2.5μg的pCMV-Tag1-boPD-L1或作为阴性对照的pEGFP-N2导入4×106个的CHO-DG44细胞中。48小时后，将培养基更换为包含G418(Enzo Life Science公司)800μg/ml、GlutaMAX添加剂(Life technologies公司)20ml/l、10％Pluronic F-68(Lifetechnologies公司)18ml/l的CD DG44培养基(Life technologies公司)，在进行选择的同时利用极限稀释法进行了克隆(牛PD-L1表达细胞)。为了确认所制作出的表达细胞中的牛PD-L1的表达，利用倒立型共聚焦激光显微镜LSM700(ZEISS公司)，使EGFP的细胞内局部可视化。
2.2.可溶性牛PD-1的构建
依照以下的步骤，构建出牛PD-1-Ig表达质粒。制成使牛PD-1(GenBank登记号AB510901)的信号肽及细胞外区域与已知的牛IgG1(GenBank登记号X62916)的恒定区结合了的基因序列，对CHO细胞进行密码子的最佳化后，以将选择性酶(NotI)识别序列、KOZAK序列、牛PD-1信号肽序列、牛PD-1基因细胞外区域序列、牛IgG1 Fc区域序列、选择性酶(XbaI)识别序列依照上述的顺序配置的方式进行了基因合成。需要说明的是，牛IgG1为了抑制ADCC活性，对CH2结构域的Fcγ受体预想结合部位施加了突变(突变插入部位：185E→P，186L→V，187P→A，189G→缺失，281A→S，282P→S；Ikebuchi R，Konnai S，Okagawa T，Yokoyama K，Nakajima C，Suzuki Y，Murata S，Ohashi K.Immunology，142(4)：551-561；Aug.2014.该论文的Figure 2中给出了PD-1-Ig的氨基酸序列、突变插入部位)。将所合成出的基因链利用NotI(Takara公司)及XbaI(Takara公司)处理后，使用FastGene Gel/PCR提取试剂盒(NIPPON Genetics公司)纯化，整合到进行了同样的选择性酶处理的表达用载体pDN11(由北海道大学人畜共患感染症研究中心铃木定彦教授分与)的克隆位点(位于PCMV下游、INRBG与PABGH之间的NotI及XbaI选择性酶识别序列)中，构建出牛PD-1-Ig表达载体。使用QIAGEN Plasmid Midi kit(Qiagen公司)纯化表达质粒，在用于实验前以-30℃保存。以后，将所制作的表达质粒表示为pDN11-boPD-1-Ig。
依照以下的步骤，构建出牛PD-1-His表达质粒。以扩增牛PD-1(GenBank登记号AB510901)的信号肽及细胞外区域的方式，设计了向5′末端侧加入选择性酶NotI及XhoI识别部位的引物(boPD-1-His F及R)。需要说明的是，向反向引物中加入了编码6×组氨酸(His)标签的基因序列。以所合成出的牛PBMC来源cDNA为模板进行PCR，对各个PCR产物利用NotI(Takara公司)及XhoI(Takara公司)进行处理后，使用FastGene Gel/PCR提取试剂盒(NIPPON Genetics公司)纯化，导入进行了同样的选择性酶处理的pCXN2.1(+)载体(NiwaH，Yamamura K，Miyazaki J.Gene，108(2)：193-199；Dec.15，1991；由顺天堂大学大学院医学研究科横沟岳彦教授分与)，进行了克隆。将表达质粒利用FastGene Xpress PlasmidPLUS Kit(NIPPON Genetics公司)纯化，在用于实验前以-30℃保存。以后，将所制作的表达质粒表示为pCXN2.1-boPD-1-His。
引物(boPD-1-His F)：
ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGGGGACCCCGCGGGCGCT(序列号65)；
引物(boPD-1-His R)：
GCCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGGATGACCAGGCTCTGCATCT(序列号66)。
依照以下的步骤，制作出可溶性牛PD-1-Ig表达细胞。使用Lipofectamine LTX(Invitrogen公司)将2.5μg的pDN11-boPD-1-Ig导入4×106个CHO-DG44细胞中。48小时后，将培养基更换为包含G418(Enzo Life Science公司)800μg/ml、GlutaMAX添加剂(Lifetechnologies公司)20ml/l的CD OptiCHO培养基(Life technologies公司)，培养3周后进行了选择。利用使用了抗牛IgGF(c)兔多克隆抗体(Rockland公司)的ELISA法测定出所得的细胞株的培养上清液中的Fc融合重组蛋白的浓度，进行了高表达Fc融合重组蛋白的细胞株的挑选。将所得的高表达细胞株转移到不包含G418的培养基中，进行14天振荡培养后回收培养上清液。将包含Fc融合重组蛋白的培养上清液用Centricon Plus-70(Millipore公司)超滤后，使用Ab-CapcherExtra(ProteNova公司)纯化Fc融合重组蛋白。纯化后，利用PD-10脱盐柱(GE Healthcare公司)将缓冲液置换为磷酸缓冲生理盐水(PBS；pH 7.4)，在用于实验前以-30℃保存(牛PD-1-Ig)。利用使用了抗牛IgGF(c)兔多克隆抗体(Rockland公司)的ELISA法测定出纯化后的牛PD-1-Ig的浓度。在ELISA的各清洗操作中使用了全自动洗板机BIOWASHER 50(DS Pharma Biomedical公司)，在吸光度的测定中使用了微板读数仪MTP-650FA(CORONA电气公司)。
依照以下的步骤，制作出可溶性牛PD-1-His表达细胞。使用Expifectamine(LifeTechnologies公司)将30μg的pCXN2.1-boPD-1-His导入7.5×107个Expi293F细胞(LifeTechnologies公司)中，进行7天振荡培养后回收培养上清液。从培养上清液中使用TALON金属亲和树脂(Clontech公司；牛PD-1-His)纯化重组蛋白。纯化后，利用PD MiniTrap G-25(GE Healthcare公司)将缓冲液置换为PBS(pH 7.4)，在用于实验前以-30℃保存(牛PD-1-His)。对纯化后的牛PD-1-His浓度利用使用Nanodrop8000分光光度计(Thermo FisherScientific公司)测定出的吸光度(280nm)进行定量。
2.3.大鼠抗牛PD-1单克隆抗体产生细胞的制作
将牛PD-1-Ig(前述)对大鼠的足跖进行免疫，使用髂骨淋巴结法建立杂交瘤，得到大鼠抗牛PD-1单克隆抗体产生杂交瘤5D2株。对于大鼠抗牛PD-1单克隆抗体的建立方法，在以下的非专利文献中记载有其详情(Ikebuchi R，Konnai S，Okagawa T，Yokoyama K，Nakajima C，Suzuki Y，Murata S，Ohashi K.Vet.Res.，44：59；Jul.22，2013)。
2.4.大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体表达载体的制作
建立以大鼠抗牛PD-1抗体5D2作为抗体可变区融合了牛IgG1及牛Igλ的抗体恒定区的大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2。
首先，从产生大鼠抗牛PD-1抗体5D2的杂交瘤中利用RACE法鉴定出可变区(重链及轻链)的基因。然后，制成使大鼠抗牛PD-1抗体5D2的重链及轻链可变区序列与已知的牛IgG1(重链；改变GenBank登记号X62916)及牛Igλ(轻链；GenBank登记号X62917)的恒定区结合的基因序列，进行了密码子最佳化(序列号9及10(氨基酸序列)、序列号14及15(密码子最佳化后核苷酸序列))。需要说明的是，牛IgG1中为了抑制ADCC活性，对CH2结构域的Fcγ受体预想结合部位施加了突变(参照图1、图11。氨基酸序号及突变：251E→P，252L→V，253P→A，254G→缺失，348A→S，349P→S；Ikebuchi R，Konnai S，Okagawa T，Yokoyama K，Nakajima C，Suzuki Y，Murata S，Ohashi K.Immunology，142(4)：551-561；Aug.2014.)。然后，以将NotI选择性酶识别序列、KOZAK序列、嵌合抗体轻链序列、poly(A)加尾信号序列(PABGH)、启动子序列(PCMV)、SacI选择性酶识别序列、内含子序列(INRBG)、KOZAK序列、嵌合抗体重链序列、XbaI选择性酶识别序列依照上述的顺序配置的方式人工地合成出基因。将所合成出的基因链利用NotI(Takara公司)及XbaI(Takara公司)处理后，使用FastGeneGel/PCR提取试剂盒(NIPPON Genetics公司)纯化，导入进行了同样的选择性酶处理的表达质粒pDN112(由北海道大学人畜共患感染症研究中心铃木定彦教授分与)的克隆位点(位于PCMV下游、INRBG与PABGH之间的NotI及XbaI选择性酶识别序列)，进行了克隆(图2)。使用QIAGEN Plasmid Midi kit(Qiagen公司)提取所得的目标的表达质粒，在用于实验前以-30℃保存。以后，将所制作的表达质粒表示为pDN112-boPD-1ch5D2。
2.5.大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体的表达(图3)
将所制作出的pDN112-boPD-1ch5D2使用Lipofectamine LTX(Life technologies公司)导入作为二氢叶酸还原酶缺损(dfhr-/-)细胞的CHO-DG44细胞。48小时后，将培养基更换为包含2mM GlutaMAX添加剂(Life technologies公司)及G418硫酸盐800μg/ml(EnzoLife Science公司)的CD OptiCHO培养基(Life technologies公司)，培养3周而进行了基于表达细胞的选择及极限稀释法的克隆。然后，利用使用了抗牛IgGF(c)兔多克隆抗体(Rockland公司)的斑点印迹法及ELISA法测定培养上清液中所含的嵌合抗体的浓度，筛选出高表达克隆。此外，对筛选出的大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体高表达克隆在包含60nM的甲氨蝶呤(Mtx；和光纯药工业公司)的培养基中施加负荷，由此进行了基因扩增处理。将如上所述地建立的大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体稳定表达细胞转移到不包含Mtx的CD OptiCHO培养基中，进行14天的振荡培养(125rpm，37℃，5％CO2)。利用使用了抗牛IgGF(c)兔多克隆抗体(Rockland公司)的ELISA法，对培养上清液中的嵌合抗体产生量进行定量。需要说明的是，在ELISA的各清洗操作中使用了全自动洗板机BIOWASHER50(DS Pharma Biomedical公司)，在吸光度的测定中使用了微板读数仪MTP-650FA(CORONA电气公司)。将第14天的培养上清液以10000g离心10分钟而除去细胞后，将离心上清液通过Steritop-GP 0.22μm过滤器(Millipore公司)而灭菌，在用于纯化前以4℃保存。
将结果表示于图3A中。大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体表达细胞株当中产生量最高的克隆在14天的振荡培养中向培养上清液中分泌出91.7mg/L的嵌合抗体。
2.6.大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体的纯化
从利用上述的方法准备的培养上清液中，使用Ab CapcherExtra(ProteNova公司)将各嵌合抗体纯化。与树脂的结合使用开管柱法，作为平衡化缓冲液及清洗缓冲液使用1.5M甘氨酸/3M NaCl(pH 8.0)。作为洗脱缓冲液使用0.1M甘氨酸-HCl(pH 2.8)，作为中和缓冲液使用1M Tris(pH 9.0)。对纯化了的抗体使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare公司)及Amicon Ultra-15(50kDa、Millipore公司)进行了置换为PBS(pH 7.4)的缓冲液置换及浓缩。将纯化了的嵌合抗体通过0.22μm注射器过滤器(Pall Life Sciences公司)而进行灭菌，在用于实验前以4℃保存。
2.7.大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体的纯化纯度的确认(图3)
为了确认纯化了的大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体的纯度，利用SDS-PAGE及CBB染色进行了抗体蛋白质的检测。将纯化了的大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2悬浮于Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad公司)中，在还原条件下(利用2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich公司)还原)或非还原条件下进行变性处理(95℃、5分钟)。对所制备的样品使用10％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。此时，作为分子量标记使用了Precision Plus Protein全蓝蛋白质标准品(Bio-Rad公司)。电泳后，利用Quick-CBB(和光纯药工业公司)进行凝胶的染色，接下来在蒸馏水中进行脱色。
将结果表示于图3B中。在还原条件下在25kDa(轻链)及50kDa(重链)的预估的位置确认到大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体的条带，在非还原条件下在150kDa的预估的位置确认到大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体的条带。
2.8.大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体的结合特异性(图4)
利用流式细胞仪法确认了大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体与牛PD-1表达细胞(前述)特异性地结合。首先，使大鼠抗牛PD-1抗体5D2或大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2与牛PD-1表达细胞在室温下反应30分钟。清洗后，使别藻蓝蛋白(APC)标记抗大鼠Ig山羊抗体(SouthernBiotech公司)或Alexa Fluor 647标记抗牛IgG(H+L)山羊F(ab′)2(JacksonImmunoResearch公司)在室温下反应30分钟。作为阴性对照抗体，使用了大鼠IgG2a(κ)同种型对照(BD Biosciences公司)或牛IgG1抗体(Bethyl公司)。清洗后，利用FACS Verse(BDBiosciences公司)检测出结合于细胞表面的各大鼠抗体或大鼠-牛嵌合抗体。需要说明的是，在所有的清洗操作及抗体的稀释中，使用了加入有1％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司)的PBS。
将实验结果表示于图4中。显示出大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2与大鼠抗牛PD-1抗体5D2同样地与牛PD-1表达细胞结合。
2.9.大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体的PD-1结合亲和性
利用使用了分子间相互作用分析装置(Biacore X100；GE Healthcare公司)的表面等离子体共振法，计测出大鼠抗PD-1抗体5D2及大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2与牛PD-1的结合亲和性。将牛PD-1-His(前述)作为配体固定于传感器芯片CM5(GE Healthcare公司)，以大鼠抗PD-1抗体5D2或大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2作为待分析物使之反应，进行了单动力学(シングルカイネテイクス)分析。在相同条件下重复3次实验，在各个实验中确定结合常数(kd值)和解离常数(ka值)，求出结合亲和性(KD值)。
将实验结果表示于下述的表中。大鼠-牛抗牛PD-1嵌合抗体与PD-1蛋白的结合亲和性是与大鼠抗牛PD-1抗体5D2相同的程度，在统计学上观察不到差别(P＞0.05；Welch的t检验)。
Figure BDA0004069052850000281
2.10.大鼠-牛嵌合抗PD-1抗体的牛PD-1/PD-L1结合阻碍活性(图5)
使用牛PD-L1表达细胞(前述)及牛PD-1-Ig(前述)，进行了利用抗PD-1抗体的牛PD-1/PD-L1结合阻碍试验。首先，向96孔板中添加使用Lightning-Link Type A生物素标记试剂盒(Innova Biosciences公司)进行了生物素标记的牛PD-1-Ig(终浓度5μg/ml)，使之与终浓度(0、0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50μg/ml)的大鼠抗牛PD-1抗体5D2或大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2在37℃反应30分钟。使该混合液与1×105个牛PD-L1表达细胞在37℃反应30分钟。清洗后，使APC标记抗生蛋白链菌素(BioLegend公司)在室温下反应30分钟，检测出结合于细胞表面的牛PD-1-Ig。分析中使用了FACS Verse(BD Biosciences公司)。需要说明的是，在所有的清洗操作及抗体的稀释中，使用了加入有1％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司)的PBS。将未添加抗体时的牛PD-1-Ig结合细胞的比例设为100％，作为相对值表示出各抗体浓度下的牛PD-1-Ig结合细胞的比例。
将实验结果表示于图5中。大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2以与大鼠抗牛PD-1抗体5D2相同的程度阻碍了PD-1-Ig与PD-L1表达细胞的结合。
2.11.大鼠抗牛PD-1抗体的CDR分析
使用NCBI IGBLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，确定了大鼠抗牛PD-1抗体5D2的互补链决定区(CDR)。将结果表示于图1中。
2.12.大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体对牛的接种试验
对BLV实验感染小牛(荷尔斯泰因种、公、4月龄、体重173.5kg)静脉滴注所建立的大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2 14mg(0.08mg/kg)。从感染牛中经时地进行采血，采集血液(使用肝素钠(味之素制药株式会公司)作为抗凝剂)及血清。利用使用了Percoll(GEHealthcare公司)的密度梯度离心法从血液中分离出外周血单核细胞(PBMC)。
2.13.施用的大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体的血中动态(图6)
将牛PD-1-His(前述)以终浓度10μg/ml在ELISA板(H型，住友电木公司)中在4℃固相化一晚。其后，将各孔用加入有0.05％Tween20的Tris-缓冲盐水溶液(TBS-T)200μl清洗5次，使用加入有1％脱脂牛奶的TBS-T在室温下进行1小时封闭。再次同样地进行清洗，将从试验牛中采集的血清添加到各孔中，在室温下反应1小时。清洗后，使辣根过氧化物酶标记抗牛IgGF(c)兔多克隆抗体(Rockland公司)在室温下反应1小时。再次清洗各孔，加入TMB单组分底物(Bethyl公司)，进行了显色。其后，用0.18M稀硫酸停止酶反应，使用微板读数仪MTP-650FA(CORONA电气公司)测定出吸光度(450nm)。在板的各清洗操作中，使用了全自动洗板机BIO WASHER 50(DS Pharma Biomedical公司)。
将实验结果表示于图6中。直到施用后第70天(临床试验结束时)都从试验牛的血清中检测出大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体。特别是施用后1周维持了高抗体浓度。
2.14.T细胞对BLV抗原的细胞增殖响应(图7)
将牛PBMC悬浮于PBS中，使羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；Invitrogen公司)在室温下反应20分钟，进行了标记。用包含10％钝化胎牛血清(Cell Culture Technologies公司)、青霉素200U/ml、链霉素200μg/ml、0.01％L-谷氨酸(Life Technologies公司)的RPMI1640培养基(Sigma-Aldrich公司)清洗2次后，用相同培养基调整为4×106个/ml。向PBMC中添加2％BLV感染胎绵羊肾细胞(FLK-BLV)培养上清液、2％BLV非感染胎绵羊肾细胞(FLK)培养上清液、或BLVgp51肽混合物0.1μg/ml或1μg/ml，在37℃、5％CO2条件下培养6天。6天后，回收PBMC，与Alexa Fluor 647标记小鼠抗牛CD4抗体(CC30，AbD Serotec公司)、多甲藻素-叶绿素-蛋白质复合物/花青苷5.5标记小鼠抗牛CD8抗体(CC63，AbD Serotec公司)及藻红蛋白/花青苷7(PE/Cy7)标记抗牛IgM小鼠抗体(IL-A30，AbD Serotec公司)在4℃反应20分钟。在抗体的标记时使用了Zenon Mouse IgG1标记试剂盒(Life Technologies公司)或Lightning-Link Kits(Innova Biosciences公司)。在分析时使用了FACS Verse(BDBiosciences公司)。需要说明的是，在所有的清洗操作及抗体的稀释中，使用了加入有1％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司)的PBS。对于增殖了的T细胞(CFSElow细胞)的比例，使用Dunnett的方法进行了统计学检验。
将实验结果表示于图7中。利用大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体的施用，CD4+T细胞中的BLV特异性细胞增殖响应与施用前相比，从刚刚施用后起在统计学上明显地增加。
2.15.BLV前病毒量的推移(图8)
从分离出的牛PBMC中使用Wizard DNA Purification kit(Promega公司)提取DNA。对所提取出的DNA的浓度以使用Nanodrop 8000分光光度计(Thermo FisherScientific公司)测定出的吸光度(260nm)作为基准进行定量。为了测定PBMC中的BLV前病毒量，使用Cycleave PCR Reaction Mix SP(Takara公司)及牛白血病病毒检测用探针/引物/阳性对照(Takara公司)进行实时PCR。测定中使用了LightCycler480System II(RocheDiagnosis公司)。对于测定出的前病毒量，使用Dunnett的方法进行了统计学检验。
将实验结果表示于图8中。利用大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体的施用，PBMC中的BLV前病毒量与施用前相比，从刚刚施用后起在统计学上明显地减少，保持低的值不变地推移至临床试验结束时(第70天)。
〔实施例2〕抗PD-1抗体向其他动物种类的应用
1.材料、方法、以及实验结果
1.1.绵羊及水牛PD-1基因的鉴定
为了确定绵羊及水牛PD-1cDNA编码区(CDS)全长，首先设计以牛及绵羊PD-1基因的碱基序列(GenBank登记号BC123854及XM_012176227)为基础扩增基因的CDS全长的引物(ovPD-1CDS F及R、buPD-1CDS F1、R1、F2及R2)，以所合成出的绵羊或水牛PBMC来源cDNA作为模板实行了PCR法。对所得的扩增产物，依照常法利用毛细管测序仪确定出碱基序列(Mingala CN，Konnai S，Ikebuchi R，Ohashi K.Comp.Immunol.Microbiol.Infect.Dis.，34(1)：55-63；Jan.2011.鉴定水牛PD-1基因的论文)。
引物(ovPD-1CDS F)：ATGGGGACCCCGCGGGCGCC(序列号67)；
引物(ovPD-1CDS R)：TCAGAGGGGCCAGGAGCAGTGTCCA(序列号68)；
引物(buPD-1CDS F1)：ATGGGGACCCCGCGGGCGCT(序列号69)；
引物(buPD-1CDS R1)：GATGACCAGGCTCTGCATCT(序列号70)；
引物(buPD-1CDS F2)：AATGACAGCGGCGTCTACTT(序列号71)；
引物(buPD-1CDS R2)：TCAGAGGGGCCAGGAGCAGT(序列号72)。
1.2.绵羊PD-1表达COS-7细胞的构建
为了制作绵羊PD-1表达质粒，以所合成出的绵羊PBMC来源cDNA为模板、使用向5′末端侧加入选择性酶BglII及SmaI识别部位而设计的引物(ovPD-1-EGFP F及R)进行了PCR。对所得的PCR产物利用BglII及SmaI(Takara公司)处理后，使用FastGene Gel/PCR提取试剂盒(NIPPON Genetics公司)纯化，导入进行了同样的选择性酶处理的pEGFP-N2载体(Clontech公司)，进行了克隆。使用FastGene Xpress Plasmid PLUS Kit(NIPPONGenetics公司)提取表达质粒，在用于实验前以-30℃保存。以后，将所制作的表达质粒表示为pEGFP-N2-ovPD-1。
引物(ovPD-1-EGFP F)：
GAAGATCTATGGGGACCCCGCGGGCGCCG(序列号73)；
引物(ovPD-1-EGFP R)：
GACCCGGGGAGGGGCCAGGAGCAGTGTCC(序列号74)。
将5×104/cm2的COS-7细胞在6孔板中进行传代，在包含10％钝化胎牛血清(Invitrogen公司)、0.01％L-谷氨酸(Life Technologies公司)的RPMI 1640培养基中在37℃、5％CO2存在下培养一晚。将pEGFP-N2-ovPD-1或作为阴性对照的pEGFP-N20.4μg/cm2使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)导入COS-7细胞并培养48小时(ovPD-1-EGFP表达细胞)。为了确认所制作出的表达细胞中的绵羊PD-1的表达，利用全功能荧光显微镜BZ-9000(KEYENCE公司)使EGFP的细胞内局部可视化。
1.3.大鼠抗牛PD-1抗体5D2与绵羊PD-1的反应性(图9)
利用流式细胞仪法确认到大鼠抗牛PD-1单克隆抗体与绵羊PD-1发生交叉反应。将绵羊PD-1-EGFP表达COS-7细胞使用加入有10％钝化山羊血清(Invitrogen公司)的PBS在室温下封闭15分钟，使10μg/ml的大鼠抗牛PD-1抗体5D2在室温下反应30分钟，清洗后使APC标记抗大鼠Ig山羊抗体(Beckman Coulter公司)在室温下反应30分钟。作为阴性对照抗体，使用了大鼠IgG2a(κ)同种型对照(BD Biosciences公司)。在分析时使用了FACS Verse(BDBiosciences公司)。需要说明的是，在所有的清洗操作及抗体的稀释中，使用了加入有1％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司)的PBS。
将实验结果以图9表示。确认了大鼠抗牛PD-1抗体5D2与绵羊PD-1表达细胞结合。
1.4.大鼠抗牛PD-1抗体5D2与水牛的淋巴细胞的反应性(图10)
从水牛(Bubalus bubalis；亚洲水牛)的外周血中，利用使用了Percoll(GEHealthcare公司)的密度梯度离心法分离出外周血单核细胞(PBMC)。将分离出的水牛PBMC悬浮于包含10％钝化胎牛血清(Cell Culture Technologies公司)、青霉素200U/ml、链霉素200μg/ml、0.01％L-谷氨酸(Life Technologies公司)的RPMI 1640培养基(Sigma-Aldrich公司)中，调整为2×106个/ml。向该PBMC中添加醋酸佛波豆蔻酯(phorbol12-myristate acetate)(PMA)20ng/ml及离子霉素(ionomycin)1μg/ml(Sigma-Aldrich公司)，在37℃、5％CO2条件下培养2天。回收所培养的PBMC，使用加入有10％钝化山羊血清(Invitrogen公司)的PBS在室温下封闭15分钟，使大鼠抗牛PD-1抗体5D2、小鼠抗牛CD8抗体(38.65，AbD Serotec公司)在37℃反应30分钟。作为阴性对照抗体，使用了大鼠IgG2a(κ)同种型对照(BD Biosciences公司)。清洗后，使APC标记山羊抗大鼠Ig抗体(Beckman Coulter公司)、PE标记山羊抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter公司)在室温下反应30分钟。进一步清洗后，使Alexa Flour488标记小鼠抗牛CD4抗体(CC30，AbD Serotec公司)及PE/Cy7标记抗牛IgM小鼠抗体(IL-A30，AbD Serotec公司)在室温下反应30分钟。作为抗体的标记使用了Zenon Mouse IgG1标记试剂盒(Life Technologies公司)或Lightning-Link Kits(InnovaBiosciences公司)。在分析时使用了FACS Verse(BD Biosciences公司)。需要说明的是，在所有的清洗操作及抗体的稀释中，使用了加入有10％钝化山羊血清(Invitrogen公司)的PBS。
将实验结果以图10表示。大鼠抗牛PD-1抗体5D2与利用PMA/离子霉素刺激活化了的水牛的CD4+T细胞(IgM-CD4+)及CD8+T细胞(IgM-CD8+)强烈地结合。
〔实施例3〕具有野生型或突变型牛IgG1的大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体与牛Fcγ受体的结合性
序论
实施例1中，以建立对牛的感染症的新型治疗法为目的建立了大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体。此时，为了抑制借助嵌合抗体的ADCC活性，对牛IgG1 CH2结构域的Fcγ受体预想结合部位施加了突变(图1、图11)。本实施例中，为了研究该氨基酸突变的效果，制作具有突变型牛IgG1(上述、IgG1 ADCC-)和野生型牛IgG1(IgG1 WT)的大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体，确认了与已知的牛Fcγ受体的结合性。
材料、方法、以及实验结果
2.1.大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体表达载体的制作
建立具有野生型牛IgG1(IgG1 WT)或突变型牛IgG1(上述、IgG1 ADCC-)的大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2。
依照实施例1中记载的步骤，制作出编码具有突变型IgG1(IgG1 ADCC-)的大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2的表达质粒(序列号9及10(氨基酸序列)、序列号14及15(密码子最佳化后核苷酸序列)。需要说明的是，在ch5D2 IgG1 ADCC-中所用的牛IgG1中为了抑制ADCC活性，对CH2结构域的Fcγ受体预想结合部位施加了突变(参照图1及图11。氨基酸序号及突变：251E→P，252L→V，253P→A，254G→缺失，348A→S，349P→S；Ikebuchi R，Konnai S，Okagawa T，Yokoyama K，Nakajima C，Suzuki Y，Murata S，Ohashi K.Immunology，142(4)：551-561；Aug.2014.)。以后，将所制作出的表达质粒表示为pDN112-boPD-1ch5D2 IgG1ADCC-。
依照以下的步骤，制作出编码具有野生型IgG1(IgG1 WT)的大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2的表达质粒。首先，为了扩增野生型的牛IgG1(GenBank登记号X62916)恒定区的基因，以所合成出的牛PBMC来源cDNA为模板、使用向5′末端侧加入选择性酶NheI及XbaI识别部位而设计的引物(boIgG1 CH1 F及boIgG1 CH3 R)进行了PCR。将扩增了的基因链利用NheI(Takara公司)及XbaI(Takara公司)处理后，使用FastGene Gel/PCR提取试剂盒(NIPPON Genetics公司)纯化，导入进行了同样的选择性酶处理的pDN112-boPD-1ch5D2IgG1 ADCC-，进行了克隆。此外，将该质粒用QIAGEN Plasmid Midi kit(Qiagen公司)纯化，利用NotI(Takara公司)及XbaI(Takara公司)处理，得到ch5D2的轻链(序列号9(氨基酸序列)、序列号14(核苷酸序列))及重链(IgG1 WT)(序列号75(氨基酸序列)、序列号76(核苷酸序列))的表达盒。将该基因片段用FastGene Gel/PCR提取试剂盒(NIPPON Genetics公司)纯化，导入表达质粒pDC6(由北海道大学人畜共患感染症研究中心铃木定彦教授分与)的克隆位点(位于PCMV下游、INRBG与PABGH之间的NotI及XbaI选择性酶识别序列)，进行了克隆(图12)。使用QIAGEN Plasmid Midi kit(Qiagen公司)提取所得的目标的表达质粒，在用于实验前以-30℃保存。以后，将所制作出的表达质粒表示为pDC6-boPD-1ch5D2 IgG1 WT。
引物(boIgG1CH 1F)：CTAGCTAGCACCACAGCCCCGAAAGTCT(序列号77)；
引物(boIgG1 CH3 R)：
TGCTCTAGATTATTTACCCGCAGACTTAGA(序列号78)。
2.2.大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体的表达及纯化
向7.5×107个的Expi293F细胞(Life Technologies公司)中使用Expfiectamine(Life Technologies公司)导入30μg的pDC6-boPD-1ch5D2IgG1 WT或pDN112-boPD-1ch5D2IgG1 ADCC-，进行5～7天振荡培养后回收培养上清液。从培养上清液中使用AbCapcherExtra(ProteNova公司)纯化各嵌合抗体。与树脂的结合使用开管柱法，作为平衡化缓冲液及清洗缓冲液使用1.5M甘氨酸/3M NaCl(pH 8.0)。作为洗脱缓冲液使用0.1M甘氨酸-HCl(pH 2.8)，作为中和缓冲液使用1M Tris(pH 9.0)。对纯化了的抗体使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare公司)及Amicon Ultra-15(50kDa、Millipore公司)进行了置换为PBS(pH7.4)的缓冲液置换及浓缩。将纯化了的嵌合抗体通过0.22μm注射器过滤器(Pall LifeSciences公司)而进行灭菌，在用于实验前以4℃保存。对纯化后的各嵌合抗体浓度利用使用Nanodrop8000分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司)测定出的吸光度(280nm)进行了定量。
2.3.大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体的纯化纯度的确认(图13)
为了确认纯化了的大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体(ch5D2 IgG1 WT及ch5D2 IgG1ADCC-)的纯度，利用SDS-PAGE及CBB染色进行了抗体蛋白质的检测。将纯化了的各嵌合抗体悬浮于Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad公司)中，在还原条件下(利用2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich公司)还原)或非还原条件下进行变性处理(95℃、5分钟)。对所制备的样品使用SuperSep Ace 5％-20％梯度聚丙烯酰胺凝胶(和光纯药工业公司)进行电泳。此时，作为分子量标记使用了Precision Plus Protein全蓝蛋白质标准品(Bio-Rad公司)。电泳后，利用Quick-CBB(和光纯药工业公司)进行凝胶的染色，接下来在蒸馏水中进行脱色。
将结果表示于图13中。还原条件下确认到25kDa(轻链)及50kDa(重链)，非还原条件下在150kDa的预估的位置确认到ch5D2 IgG1 WT及ch5D2 IgG1 ADCC-的条带。
2.4.可溶性牛Fcγ受体(FcγR)的构建
依照以下的步骤，构建了牛FcγRI-His、FcγRII-His、FcγRIII-His及Fcγ2R-His表达质粒。以扩增牛FcγRI、FcγRII、FcγRIII及Fcγ2R(GenBank登记号NM_174538、NM_174539、NM_001077402及NM_001001138)的信号肽及细胞外区域的方式，设计了向5′末端侧加入有选择性酶NotI及XhoI识别部位的引物(boFcγRI-His F及R、boFcγRIII-His F及R、或boFcγ2R-His F及R)或向5′末端侧加入有选择性酶NheI及EcoRV识别部位的引物(boFcγRIII-His F及R)。需要说明的是，向反向引物中加入了编码6×组氨酸(His)标签的基因序列。以所合成出的牛PBMC来源cDNA为模板进行PCR，将各自的PCR产物利用NotI(Takara公司)及XhoI(Takara公司)(FcγRI-His、FcγRIII-His及Fcγ2R-His)或NheI(Takara公司)及EcoRV(Takara公司)(FcγRII-His)处理后，使用FastGene Gel/PCR提取试剂盒(NIPPON Genetics公司)纯化，导入进行了同样的选择性酶处理的pCXN2.1(+)载体(Niwa H，Yamamura K，Miyazaki J.Gene，108(2)：193-199；Dec.15，1991；由顺天堂大学大学院医学研究科横沟岳彦教授分与)，进行了克隆。利用FastGene Xpress Plasmid PLUSKit(NIPPON Genetics公司)纯化表达质粒，在用于实验前以-30℃保存。以后，将所制作出的表达质粒表示为pCXN2.1-boFcγRI-His、pCXN2.1-boFcγRII-His、pCXN2.1-boFcγRIII-His或pCXN2.1-boFcγ2R-His。
引物(boFcγRI-His F)：
ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGTGGCTCATAATAGCTCT(序列号79)；
引物(boFcγRI-His R)：
GCCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGAGGAGTTGTTGACTGGAGGC(序列号80)；
引物(boFcγRII-His F)：
ATAAGAATGCTAGCCACCATGGGGATCCCCTCATTCCT(序列号81)；
引物(boFcγRII-His R)：
GCCGATATCTTAATGGTGATGGTGATGGTGCGATGAGGGGCCGCTCGAGC(序列号82)；
引物(boFcγRIII-His F)：
ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGTG GCAACTGCTACCACC(序列号83)；
引物(boFcγRIII-His R)：
GCCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGGTGCCAAGGTAGAAAGAATG(序列号84)；
引物(boFcγ2R-His F)：
ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGGCCCCCACCCTCCCTGCCTTGCTCT(序列号85)；
引物(boFcγ2R-His R)：
GCCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGATTCTGCATCGTGTAGTCTG(序列号86)。
依照以下的步骤，制作出可溶性牛FcγRI-His、FcγRII-His、FcγRIII-His及Fcγ2R-His表达细胞。向7.5×107个的Expi293F细胞(Life Technologies公司)中使用Expifectamine(Life Technologies公司)导入30μg的pCXN2.1-boFcγRI-His、pCXN2.1-boFcγRII-His、pCXN2.1-boFcγRIII-His或pCXN2.1-boFcγ2R-His，进行5～7天振荡培养后回收培养上清液。从培养上清液中使用TALON金属亲和树脂(Clontech公司)纯化重组蛋白。纯化后，利用Amicon Ultra-15离心超滤装置(10kDa、Millipore公司)将缓冲液置换为PBS(pH 7.4)，在用于实验前以-30℃保存(牛PD-1-His)。对纯化后的牛FcγRI-His、FcγRII-His、FcγRIII-His及Fcγ2R-His浓度利用使用Nanodrop8000分光光度计(ThermoFisher Scientific公司)测定出的吸光度(280nm)进行了定量。
2.5.大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2 IgG1 WT及IgG1 ADCC-与牛FcγR的结合性(图14)
将大鼠-牛嵌合抗牛PD-1抗体ch5D2 IgG1 WT或IgG1 ADCC-以终浓度50、25、12.5、6.25、3.12、1.5610nM在Nunc MaxiSorp ELISA板(Nunc公司)中在37℃固相化2小时。其后，将各孔用加入有0.05％Tween20的PBS(PBS-T)200μl清洗5次，使用SuperBlock(PBS)封闭缓冲液(Thermo Fisher Scientific公司)在37℃进行30分钟封闭。再次同样地进行清洗，将牛FcγRI-His、FcγRII-His、FcγRIII-His或Fcγ2R-His以终浓度10μg/ml添加到各孔中，在37℃反应1小时。清洗后，使抗多聚组氨酸标签小鼠单克隆抗体(Abcam公司)在37℃反应30分钟。然后，清洗各孔，使辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgG山羊多克隆抗体(MPBiomedicals公司)在37℃反应30分钟。再次清洗各孔，加入TMB单组分底物(Bethyl公司)，进行了显色。其后，用0.18M稀硫酸停止酶反应，使用微板读数仪MTP-900(CORONA电气公司)测定出吸光度(450nm)。在板的各清洗操作中，使用了全自动洗板机BIOWASHER 50(DSPharma Biomedical公司)。
将实验结果表示于图14中。IgG1 WT与牛FcγRI-His强结合，与牛FcγRII-His弱结合。另一方面，IgG1 ADCC-未与牛FcγRI-His及FcγRII-His结合。另外，IgG1 WT及IgG1ADCC-均未观察到与牛FcγRIII-His及牛Fcγ2R-His的结合。
将本说明书中引用的所有出版物、专利及专利申请原样不变地作为参考纳入本说明书中。
产业上的可利用性
本发明的抗PD-1抗体可以用于动物的癌症、感染症的预防和/或治疗。
<序列号1>
序列号1表示大鼠抗牛PD-1抗体的L链可变区的氨基酸序列。下划线部：从NH2末端起依次为CDR1、CDR2、CDR3。
Figure BDA0004069052850000391
<序列号2>
序列号2表示大鼠抗牛PD-1抗体的H链可变区的氨基酸序列。下划线部：从NH2末端起依次为CDR1、CDR2、CDR3。
Figure BDA0004069052850000392
<序列号3>
序列号3表示牛抗体的L链恒定区(牛Ig lambda，GenBank：X62917)的氨基酸序列。
Figure BDA0004069052850000393
<序列号4>
序列号4表示牛抗体的H链恒定区(牛IgG1，改变GenBank：X62916)的氨基酸序列。在突变部位划有下划线。氨基酸序号及突变：123E→P，124L→V，125P→A，126G→缺失，218A→S，219P→S
Figure BDA0004069052850000394
<序列号5>
序列号5表示大鼠抗牛PD-1抗体的L链可变区的核苷酸序列。
Figure BDA0004069052850000401
将序列号5的核苷酸序列的密码子最佳化后核苷酸序列表示于<序列号11>中。
Figure BDA0004069052850000402
<序列号6>
序列号6表示大鼠抗牛PD-1抗体的H链可变区的核苷酸序列。
Figure BDA0004069052850000403
Figure BDA0004069052850000411
将序列号6的核苷酸序列的密码子最佳化后核苷酸序列表示于<序列号12>中。
Figure BDA0004069052850000412
<序列号7>
序列号7表示牛抗体的L链恒定区(牛Ig lambda，GenBank：X62917)的核苷酸序列。
Figure BDA0004069052850000413
将序列号7的核苷酸序列的密码子最佳化后核苷酸序列表示于<序列号13>中。
Figure BDA0004069052850000414
Figure BDA0004069052850000421
<序列号8>
序列号8表示牛抗体的H链恒定区(牛IgG1，改变GenBank：X62916)的核苷酸序列(密码子最佳化后)。
Figure BDA0004069052850000422
Figure BDA0004069052850000431
<序列号9>
序列号9表示包含大鼠抗牛PD-1抗体的L链可变区和牛抗体的L链恒定区的嵌合L链的氨基酸序列。
Figure BDA0004069052850000432
<序列号10>
序列号10表示包含大鼠抗牛PD-1抗体的H链可变区和牛抗体的H链恒定区(牛IgG1，改变GenBank：X62916)的嵌合H链的氨基酸序列。
Figure BDA0004069052850000433
<序列号14>
表示包含大鼠抗牛PD-1抗体的L链可变区和牛抗体的L链恒定区的嵌合L链的核苷酸序列(密码子最佳化后核苷酸序列)。
Figure BDA0004069052850000434
Figure BDA0004069052850000441
<序列号15>
表示包含大鼠抗牛PD-1抗体的H链可变区和牛抗体的H链恒定区(牛IgG1，改变GenBank：X62916)的嵌合H链的核苷酸序列(密码子最佳化后核苷酸序列)。
Figure BDA0004069052850000442
Figure BDA0004069052850000451
<序列号16>
序列号16表示大鼠抗牛PD-1抗体5D2的L链可变区的CDR1的氨基酸序列(QSLEYSDGYTY)。
<序列号17>
序列号17表示大鼠抗牛PD-1抗体5D2的L链可变区的CDR3的氨基酸序列(FQATHDPDT)。
<序列号18>
序列号18表示大鼠抗牛PD-1抗体5D2的H链可变区的CDR1的氨基酸序列(GFSLTSYY)。
<序列号19>
序列号19表示大鼠抗牛PD-1抗体5D2的H链可变区的CDR2的氨基酸序列(IRSGGST)。
<序列号20>
序列号20表示大鼠抗牛PD-1抗体5D2的H链可变区的CDR3的氨基酸序列(ARTSSGYEGGFDY)。
<序列号21>
序列号21表示牛抗体(IgG1突变体1)的H链恒定区(CH1～CH3)的氨基酸序列。
<序列号22>
序列号22表示牛抗体(IgG1突变体2)的H链恒定区(CH1～CH3)的氨基酸序列。
<序列号23>
序列号23表示牛抗体(IgG1突变体3)的H链恒定区(CH1～CH3)的氨基酸序列。
<序列号24>
序列号24表示牛抗体(IgG2突变体1)的H链恒定区(CH1～CH3)的氨基酸序列。
<序列号25>
序列号25表示牛抗体(IgG2突变体2)的H链恒定区(CH1～CH3)的氨基酸序列。
<序列号26>
序列号26表示牛抗体(IgG2突变体3)的H链恒定区(CH1～CH3)的氨基酸序列。
<序列号27>
序列号27表示牛抗体(IgG3突变体1)的H链恒定区(CH1～CH3)的氨基酸序列。
<序列号28>
序列号28表示牛抗体(IgG3突变体2)的H链恒定区(CH1～CH3)的氨基酸序列。
<序列号29>
序列号29表示牛抗体(IgG1突变体1)的H链恒定区(CH1～CH3)的核苷酸序列。
<序列号30>
序列号30表示牛抗体(IgG1突变体2)的H链恒定区(CH1～CH3)的核苷酸序列。
<序列号31>
序列号31表示牛抗体(IgG1突变体3)的H链恒定区(CH1～CH3)的核苷酸序列。
<序列号32>
序列号32表示牛抗体(IgG2突变体1)的H链恒定区(CH1～CH3)的核苷酸序列。
<序列号33>
序列号33表示牛抗体(IgG2突变体2)的H链恒定区(CH1～CH3)的核苷酸序列。
<序列号34>
序列号34表示牛抗体(IgG2突变体3)的H链恒定区(CH1～CH3)的核苷酸序列。
<序列号35>
序列号35表示牛抗体(IgG3突变体1)的H链恒定区(CH1～CH3)的核苷酸序列。
<序列号36>
序列号36表示牛抗体(IgG3突变体2)的H链恒定区(CH1～CH3)的核苷酸序列。
<序列号37>
序列号37表示绵羊抗体(IgG1)的H链恒定区(CH1～CH3)的氨基酸序列。
<序列号38>
序列号38表示绵羊抗体(IgG1)的H链恒定区(CH1～CH3)的核苷酸序列。
<序列号39>
序列号39表示绵羊抗体(IgG2)的H链恒定区(CH1～CH3)的氨基酸序列。
<序列号40>
序列号40表示绵羊抗体(IgG2)的H链恒定区(CH1～CH3)的核苷酸序列。
<序列号41>
序列号41表示绵羊抗体的L链(Igkappa(CK))恒定区的氨基酸序列。
<序列号42>
序列号42表示绵羊抗体的L链(Igkappa(CK))恒定区的核苷酸序列。
<序列号43>
序列号43表示绵羊抗体的L链(Iglambda(CL))恒定区的氨基酸序列。
<序列号44>
序列号44表示绵羊抗体的L链(Iglambda(CL))恒定区的核苷酸序列。
<序列号45>
序列号45表示水牛抗体(推定为IgG1)的H链恒定区(CH1～CH3)的氨基酸序列。
<序列号46>
序列号46表示水牛抗体(推定为IgG1)的H链恒定区(CH1～CH3)的核苷酸序列。
<序列号47>
序列号47表示水牛抗体(推定为IgG2)的H链恒定区(CH1～CH3)的氨基酸序列。
<序列号48>
序列号48表示水牛抗体(推定为IgG2)的H链恒定区(CH1～CH3)的核苷酸序列。
<序列号49>
序列号49表示水牛抗体(推定为IgG3)的H链恒定区(CH1～CH3)的氨基酸序列。
<序列号50>
序列号50表示水牛抗体(推定为IgG3)的H链恒定区(CH1～CH3)的核苷酸序列。
<序列号51>
序列号51表示水牛抗体的L链(推定为Iglambda)恒定区(CL)的氨基酸序列。
<序列号52>
序列号52表示水牛抗体的L链(推定为Iglambda)恒定区(CL)的核苷酸序列。
<序列号53>
序列号53表示人抗体(IgG4突变体1)的H链恒定区(CH1～CH3)的氨基酸序列。
<序列号54>
序列号54表示人抗体(IgG4突变体1)的H链恒定区(CH1～CH3)的核苷酸序列。
<序列号55>
序列号55表示人抗体(IgG4突变体2)的H链恒定区(CH1～CH3)的氨基酸序列。
<序列号56>
序列号56表示人抗体(IgG4突变体2)的H链恒定区(CH1～CH3)的核苷酸序列。
<序列号57>
序列号57表示人抗体(IgG4突变体3)的H链恒定区(CH1～CH3)的氨基酸序列。
<序列号58>
序列号58表示人抗体(IgG4突变体3)的H链恒定区(CH1～CH3)的核苷酸序列。
<序列号59>
序列号59表示人抗体的L链恒定区的氨基酸序列。
<序列号60>
序列号60表示人抗体的L链恒定区的核苷酸序列。
<序列号61～74>
序列号61～74依次表示引物boPD-1-myc F、boPD-1-myc R、boPD-L1-EGFP F、boPD-L1-EGFP R、boPD-1-His F、boPD-1-His R、ovPD-1CDS F、ovPD-1CDS R、buPD-1CDSF1、buPD-1CDS R1、buPD-1CDS F2、buPD-1CDS R2、ovPD-1-EGFP F及ovPD-1-EGFP R的核苷酸序列。
<序列号75>
序列号75表示包含大鼠抗牛PD-1抗体的H链可变区和牛抗体的H链恒定区(牛IgG1，GenBank：X62916)的嵌合H链的核苷酸序列。
Figure BDA0004069052850000501
Figure BDA0004069052850000511
<序列号76>
序列号75表示包含大鼠抗牛PD-1抗体的H链可变区和牛抗体的H链恒定区(牛IgG1，GenBank：X62916)的嵌合H链的氨基酸序列。
Figure BDA0004069052850000512
<序列号77～86>
序列号77～86依次表示引物boIgG1 CH1 F、boIgG1 CH3 R、boFcγRI-His F、boFcγRI-His R、boFcγRII-His F、boFcγRII-His R、boFcγRIII-His F、boFcγRIII-His R、boFcγ2R-His F及boFcγ2R-His R的核苷酸序列。

Claims (19)

1.一种抗PD-1抗体，其包含(a)L链和(b)H链，
所述L链具有包含具有QSLEYSDGYTY即序列号16的氨基酸序列的CDR1、具有GVS的氨基酸序列的CDR2及具有FQATHDPDT即序列号17的氨基酸序列的CDR3的L链可变区、和大鼠以外的动物抗体的L链恒定区，
所述H链具有包含具有GFSLTSYY即序列号18的氨基酸序列的CDR1、具有IRSGGST即序列号19的氨基酸序列的CDR2及具有ARTSSGYEGGFDY即序列号20的氨基酸序列的CDR3的H链可变区、和大鼠以外的动物抗体的H链恒定区。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中，
L链可变区和H链可变区来自于大鼠。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中，
L链可变区为大鼠抗牛PD-1抗体的L链可变区，H链可变区为大鼠抗牛PD-1抗体的H链可变区。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中，
L链可变区具有序列号1的氨基酸序列，H链可变区具有序列号2的氨基酸序列。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的抗体，其中，
大鼠以外的动物抗体的L链恒定区具有Lambda链或Kappa链的恒定区的氨基酸序列。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的抗体，其中，
大鼠以外的动物抗体的H链恒定区具有相当于人的IgG4的免疫球蛋白的恒定区的氨基酸序列，或者被导入了使ADCC活性和/或CDC活性降低的突变。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中，
大鼠以外的动物为牛，牛抗体的L链恒定区具有Lambda链的恒定区的氨基酸序列，并且牛抗体的H链恒定区被导入了使ADCC活性和/或CDC活性降低的突变。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中，
牛抗体的L链恒定区具有序列号3的氨基酸序列，牛抗体的H链恒定区具有序列号4的氨基酸序列。
9.根据权利要求1～4中任一项所述的抗体，其具有两条L链和两条H链的四链结构。
10.一种医药组合物，其包含权利要求1～9中任一项所述的抗体作为有效成分。
11.根据权利要求10所述的医药组合物，其用于癌症和/或感染症的预防和/或治疗。
12.根据权利要求11所述的医药组合物，其中，
癌症和/或感染症选自肿瘤性疾病、白血病、约内氏病、无浆体病、细菌性乳腺炎、真菌性乳腺炎、支原体感染症、结核病、小型梨浆虫病、隐孢子虫病、球虫病、锥虫病及利什曼病。
13.根据权利要求12所述的医药组合物，其中，支原体感染症选自支原体性乳腺炎及支原体性肺炎。
14.一种人工基因DNA，其包含(a’)编码L链的DNA和(b’)编码H链的DNA，
所述L链具有包含具有QSLEYSDGYTY即序列号16的氨基酸序列的CDR1、具有GVS的氨基酸序列的CDR2及具有FQATHDPDT即序列号17的氨基酸序列的CDR3的L链可变区、和大鼠以外的动物抗体的L链恒定区，
所述H链具有包含具有GFSLTSYY即序列号18的氨基酸序列的CDR1、具有IRSGGST即序列号19的氨基酸序列的CDR2及具有ARTSSGYEGGFDY即序列号20的氨基酸序列的CDR3的H链可变区、和大鼠以外的动物抗体的H链恒定区。
15.一种载体，其包含权利要求14所述的人工基因DNA。
16.一种宿主细胞，其被权利要求15所述的载体进行了转化。
17.一种抗体的制造方法，其包括培养权利要求16所述的宿主细胞、从培养物中采集抗PD-1抗体的操作。
18.一种DNA，其编码L链，
所述L链具有包含具有QSLEYSDGYTY即序列号16的氨基酸序列的CDR1、具有GVS的氨基酸序列的CDR2及具有FQATHDPDT即序列号17的氨基酸序列的CDR3的L链可变区、和大鼠以外的动物抗体的L链恒定区。
19.一种DNA，其编码H链，
所述H链具有包含具有GFSLTSYY即序列号18的氨基酸序列的CDR1、具有IRSGGST即序列号19的氨基酸序列的CDR2及具有ARTSSGYEGGFDY即序列号20的氨基酸序列的CDR3的H链可变区、和大鼠以外的动物抗体的H链恒定区。
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