KR20190038911A - 항 pd-1 항체 - Google Patents

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국립대학법인 홋가이도 다이가쿠
후소 야쿠힝 고교 가부시끼가이샤
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Abstract

래트 이외의 동물에게도 여러 회 투여가 가능한 항 PD-1 항체를 제공한다. (a) QSLEYSDGYTY (서열 번호 16) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, GVS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 FQATHDPDT (서열 번호 17) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 정상 영역을 갖는 L 사슬과, (b) GFSLTSYY (서열 번호 18) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IRSGGST (서열 번호 19) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARTSSGYEGGFDY (서열 번호 20) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 정상 영역을 갖는 H 사슬을 포함하는, 항 PD-1 항체. 상기 항 PD-1 항체를 유효 성분으로서 포함하는, 의약 조성물. 상기 항 PD-1 항체를 제조하는 방법도 제공한다.

Description

항 PD-1 항체
본 발명은, 항 PD-1 항체에 관한 것이고, 보다 상세하게는 래트 항소 PD-1 항체의 상보 사슬 결정 영역 (CDR) 을 포함하는 가변 영역과 래트 이외의 동물의 항체의 정상 영역을 갖는 항 PD-1 항체에 관한 것이다.
면역 억제 수용체 Programmed death 1 (PD-1) 과 그 리간드인 Programmed death ligand 1 (PD-L1) 은 과잉의 면역 응답을 억제하고, 면역 관용에 깊게 관련되어 있는 인자로서 쿄토 대학, 혼조 다스쿠씨 등에 의해 동정된 분자이다 (비특허문헌 1 : Ishida Y, Agata Y, Shibahara K, Honjo T The EMBO J., 11 (11) : 3887 - 3895 ; Nov. 1992.). 종양에 있어서의 면역 억제에 관여하고 있는 것도 최근 명확하게 되어, 인간 의료에서는, PD-1 의 기능을 저해하는 항체 의약이 개발되어, 실용화되고 있다 (오노 약품 공업 주식회사 「옵디보 (등록상표)」).
지금까지, 본 발명자들은, 동물 난치성 질병에 대한 PD-1 또는 PD-L1 을 표적으로 하는 면역 요법의 개발을 실시하고, 이 신규 면역 요법이 질병 횡단적 또한 동물 횡단적으로 응용이 가능한 것을 분명히 해 왔다 (비특허문헌 2 : Ikebuchi R, Konnai S, Shirai T, Sunden Y, Murata S, Onuma M, Ohashi K. Vet. Res., 42 : 103 ; Sep. 26, 2011., 비특허문헌 3 : Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Vet. Res., 44 : 59 ; Jul. 22, 2013., 비특허문헌 4 : Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology. 142 (4) : 551-61 ; Aug. 2014., 비특허문헌 5 : Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One., 9 (6) : e98415 ; Jun. 10, 2014., 비특허문헌 6 : Mingala CN, Konnai S, Ikebuchi R, Ohashi K. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 34 (1) : 55 - 63 ; Jan. 2011.).
그러나, 본 발명자들이 지금까지 제조한 항체는, 래트 항체이기 때문에, 래트 이외의 동물에게는 여러 회 투여할 수 없다.
Ishida Y, Agata Y, Shibahara K, Honjo T. The EMBO Journal. 11 (11) : 3887 - 3895 ; Nov. 1992. Ikebuchi R, Konnai S, Shirai T, Sunden Y, Murata S, Onuma M, Ohashi K. Vet. Res., 42 : 103 ; Sep. 2011. Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Vet. Res., 44 : 59 ; Jul. 22, 2013. Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology, 142 (4) : 551 - 61 ; Aug. 2014. Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One, 9 (6) : e98415 ; Jun. 10, 2014. Mingala CN, Konnai S, Ikebuchi R, Ohashi K. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 34 (1) : 55 - 63 ; Jan. 2011.
본 발명은, 래트 이외의 동물에게도 여러 회 투여가 가능한 항 PD-1 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 소 PD-1 및 PD-L1 의 결합을 저해 가능한 래트 항소 PD-1 모노클로날 항체 (5D2) 의 가변 영역을 결정하고, 이 가변 영역 유전자와, 소 면역 글로불린 (소 IgG1, 단 ADCC 활성을 억제하기 위해서, CH2 도메인의 Fcγ 수용체 예상 결합 부위에 변이를 가하였다 (도 1, 도 11 참조. 아미노산 번호 및 변이 : 251 E → P, 252 L → V, 253 P → A, 254 G → 삭제, 348 A → S, 349 P → S ; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug ; 142 (4) : 551 - 561.).) 의 정상 영역 유전자를 조합한 키메라 항체 유전자를 도입한 차이니즈 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cell : CHO 세포) 를 배양 증식시킴으로써, 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체를 제조하는 것에 성공하였다. 또한, 래트 항소 PD-1 모노클로날 항체 (5D2) 의 가변 영역의 CDR 을 결정하였다. 본 발명은, 이들 지견에 의해 완성된 것이다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
(1) (a) QSLEYSDGYTY (서열 번호 16) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, GVS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 FQATHDPDT (서열 번호 17) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 정상 영역을 갖는 L 사슬과, (b) GFSLTSYY (서열 번호 18) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IRSGGST (서열 번호 19) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARTSSGYEGGFDY (서열 번호 20) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 정상 영역을 갖는 H 사슬을 포함하는, 항 PD-1 항체.
(2) L 사슬 가변 영역과 H 사슬 가변 영역이 래트에서 유래하는 (1) 에 기재된 항체.
(3) L 사슬 가변 영역이 래트 항소 PD-1 항체의 L 사슬 가변 영역이고, H 사슬 가변 영역이 래트 항소 PD-1 항체의 H 사슬 가변 영역인 (2) 에 기재된 항체.
(4) L 사슬 가변 영역이 서열 번호 1 의 아미노산 서열을 갖고, H 사슬 가변 영역이 서열 번호 2 의 아미노산 서열을 갖는 (3) 에 기재된 항체.
(5) 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 정상 영역이, Lambda 사슬 또는 Kappa 사슬의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖는 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(6) 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 정상 영역이, 인간의 IgG4 에 상당하는 면역 글로불린의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖거나, 혹은 ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 저하시키는 변이가 도입된 것인 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(7) 래트 이외의 동물이 소이고, 소 항체의 L 사슬 정상 영역이, Lambda 사슬의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖고, 또한 소 항체의 H 사슬 정상 영역이, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 저하시키는 변이가 도입된 것인 (6) 에 기재된 항체.
(8) 소 항체의 L 사슬 정상 영역이 서열 번호 3 의 아미노산 서열을 갖고, 소 항체의 H 사슬 정상 영역이 서열 번호 4 의 아미노산 서열을 갖는 (7) 에 기재된 항체.
(9) L 사슬 2 개와 H 사슬 2 개의 4 개 사슬 구조를 갖는 (1) ∼ (8) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(10) (1) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 항체를 유효 성분으로서 포함하는, 의약 조성물.
(11) 암 및/또는 감염증의 예방 및/또는 치료를 위한 (10) 에 기재된 의약 조성물.
(12) 암 및/또는 감염증이, 종양성 질환, 백혈병, 요네병, 아나플라스마병, 세균성 유방염, 진균성 유방염, 마이코플라스마 감염증 (예를 들어, 마이코플라스마성 유방염, 마이코플라스마성 폐렴 등), 결핵, 소형 파이로플라스마병, 크립토스포리듐증, 콕시듐증, 트리파노소마병 및 리슈마니아증으로 이루어지는 군에서 선택되는 (11) 에 기재된 의약 조성물.
(13) (a') QSLEYSDGYTY (서열 번호 16) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, GVS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 FQATHDPDT (서열 번호 17) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 정상 영역을 갖는 L 사슬을 코드하는 DNA 와, (b') GFSLTSYY (서열 번호 18) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IRSGGST (서열 번호 19) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARTSSGYEGGFDY (서열 번호 20) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 정상 영역을 갖는 H 사슬을 코드하는 DNA 를 포함하는, 인공 유전자 DNA.
(14) (13) 에 기재된 인공 유전자 DNA 를 포함하는 벡터.
(15) (14) 에 기재된 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
(16) (15) 에 기재된 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 항 PD-1 항체를 채취하는 것을 포함하는, 항체의 제조 방법.
(17) QSLEYSDGYTY (서열 번호 16) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, GVS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 FQATHDPDT (서열 번호 17) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 정상 영역을 갖는 L 사슬을 코드하는 DNA.
(18) GFSLTSYY (서열 번호 18) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IRSGGST (서열 번호 19) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARTSSGYEGGFDY (서열 번호 20) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 정상 영역을 갖는 H 사슬을 코드하는 DNA.
본 발명에 의해, 신규 항 PD-1 항체가 얻어졌다. 이 항체는, 래트 이외의 동물에도 이용 가능하다.
본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원, 일본 특허출원 2016-159090 및 일본 특허출원 2017-099615의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.
도 1 은 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 의 아미노산 서열이다. 래트 항소 PD-1 항체 5D2 의 L 사슬 가변 영역 및 H 사슬 가변 영역에 있어서의, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 나타내고, 또한 소 IgG1 (CH2 도메인) 에 변이를 가한 아미노산 (아미노산 번호 및 변이 : 251 E → P, 252 L → V, 253 P → A, 254 G → 삭제, 348 A → S, 349 P → S) 도 나타낸다.
도 2 는 pDN112 벡터와 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 의 모식도이다.
도 3 은 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 의 산생량 및 정제 순도이다.
도 4 는 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 의 결합성이다.
도 5 는 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 의 소 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성이다.
도 6 은 BLV 실험 감염소에의 투여 후의 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 의 혈중 농도의 추이이다.
도 7 은 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 를 투여한 BLV 실험 감염소에 있어서의 BLV 항원에 대한 T 세포의 세포 증식 응답이다.
도 8 은 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 를 투여한 BLV 실험 감염소에 있어서의 BLV 프로바이러스량의 변화이다.
도 9 는 양 PD-1 에 대한 래트 항소 PD-1 항체 5D2 의 교차 반응성이다.
도 10 은 물소의 T 세포에 대한 래트 항소 PD-1 항체 5D2 의 교차 반응성이다.
도 11 은 소 IgG1 정상 영역의 입체 구조 및 Fcγ 수용체 예상 결합 부위이다.
도 12 는 pDC6 벡터이다.
도 13 은 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 IgG1 WT 및 IgG1 ADCC- 의 정제 순도이다.
도 14 는 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 IgG1 WT 및 IgG1 ADCC- 의 각 소 Fcγ 수용체에 대한 결합성이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은, (a) QSLEYSDGYTY (서열 번호 16) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, GVS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 FQATHDPDT (서열 번호 17) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 정상 영역을 갖는 L 사슬과, (b) GFSLTSYY (서열 번호 18) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IRSGGST (서열 번호 19) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARTSSGYEGGFDY (서열 번호 20) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 정상 영역을 갖는 H 사슬을 포함하는, 항 PD-1 항체를 제공한다.
래트 항소 PD-1 항체 5D2 (후술) 의 L 사슬 가변 영역에 있어서의 CDR1 ∼ 3 은, 각각 QSLEYSDGYTY (서열 번호 16) 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역, GVS 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역, FQATHDPDT (서열 번호 17) 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역이다 (도 1 참조).
또, 래트 항소 PD-1 항체 5D2 의 H 사슬 가변 영역에 있어서의 CDR1 ∼ 3 은, 각각 GFSLTSYY (서열 번호 18) 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역, IRSGGST (서열 번호 19) 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역 및 ARTSSGYEGGFDY (서열 번호 20) 의 아미노산 서열로 이루어지는 영역이다 (도 1 참조).
QSLEYSDGYTY (서열 번호 16) 의 아미노산 서열, GVS 의 아미노산 서열 및 FQATHDPDT (서열 번호 17) 의 아미노산 서열, 그리고 GFSLTSYY (서열 번호 18) 의 아미노산 서열, IRSGGST (서열 번호 19) 의 아미노산 서열 및 ARTSSGYEGGFDY (서열 번호 20) 의 아미노산 서열에 있어서는, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어도 되고, 이들의 변이가 도입되어도, PD-1 항체의 L 사슬 가변 영역의 CDR 또는 H 사슬 가변 영역의 CDR 로서의 기능을 가질 수 있다.
본 명세서에 있어서 항체란, 전체 길이 항체 외에, Fab, F(ab)'2, ScFv, Diabody, VH, VL, Sc(Fv)2, Bispecific sc(Fv)2, Minibody, ScFv-Fc monomer, ScFv-Fc dimer 등의 저분자화된 것도 포함하는 개념이다.
본 발명의 항 PD-1 항체에 있어서, L 사슬 가변 영역과 H 사슬 가변 영역이 래트에서 유래하면 된다. 예를 들어, L 사슬 가변 영역이 래트 항소 PD-1 항체의 L 사슬 가변 영역이고, H 사슬 가변 영역이 래트 항소 PD-1 항체의 H 사슬 가변 영역이면 된다.
래트 항소 PD-1 항체의 L 사슬 가변 영역의 아미노산 서열 및 H 사슬 가변 영역의 아미노산 서열을, 각각 서열 번호 1 및 2 에 나타내지만, 서열 번호 1 및 2 의 아미노산 서열에 있어서는, 1 혹은 복수 개 (예를 들어, 5 개 이하, 많아도 10 개 정도) 의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어도 되고, 이들의 변이가 도입되어도, PD-1 항체의 L 사슬 가변 영역 또는 H 사슬 가변 영역으로서의 기능을 가질 수 있다.
래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 정상 영역 및 H 사슬 정상 영역은, 래트 항소 PD-1 항체 5D2 와 교차 반응하는 PD-1 을 산생하는 동물 유래의 것이면 된다.
항체의 L 사슬에는, Kappa 사슬 (카파 사슬) 과 Lambda 사슬 (람다 사슬) 이 있고, 본 발명의 항 PD-1 항체에 있어서, 래트 이외의 동물의 항체의 L 사슬 정상 영역은, Kappa 사슬 또는 Lambda 사슬 중 어느 쪽의 사슬의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖는 것이어도 되지만, 존재 비율은, 소, 양, 고양이, 개, 말에서는 Lambda 사슬 쪽이 높고, 마우스, 래트, 인간, 돼지에서는 Kappa 사슬 쪽이 높다. 존재 비율이 높은 사슬 쪽이 바람직하다고 생각되므로, 소, 양, 고양이, 개, 말에서는 Lambda 사슬의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하고, 마우스, 래트, 인간, 돼지에서는 Kappa 사슬의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.
래트 이외의 동물의 항체의 H 사슬 정상 영역은, 인간의 IgG4 에 상당하는 면역 글로불린의 정상 영역의 아미노산 서열을 가지면 된다. H 사슬은, 정상 영역의 차이에 따라 γ 사슬, μ 사슬, α 사슬, δ 사슬, ε 사슬로 나누어지고, 이 차이에 의해 각각 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 의 5 종류의 클래스 (아이소타입) 의 면역 글로불린이 형성된다.
면역 글로불린 G (IgG) 는 인간 면역 글로불린의 70 - 75 ％ 를 차지하고, 혈장 중에 가장 많은 단량체의 항체이다. 경사슬 2 개와 중사슬 2 개의 4 개 사슬 구조를 가진다. 인간 IgG1, IgG2, IgG4 는 분자량은 약 146,000 이지만, 인간 IgG3 은 Fab 영역과 Fc 영역을 연결하는 힌지부가 길고, 분자량도 170,000 으로 크다. 인간 IgG1 은 인간 IgG 의 65 ％ 정도, 인간 IgG2 는 25 ％ 정도, 인간 IgG3 은 7 ％ 정도, 인간 IgG4 는 3 ％ 정도를 차지한다. 혈관 내외에 평균하여 분포한다. 인간 IgG1 은, 이펙터 세포 표면의 Fc 리셉터나 보체 인자에 강한 친화성을 가지므로, 항체 의존성 세포 상해 활성 (ADCC) 을 유도하고, 또 보체를 활성화하여 보체 의존성 세포 상해 활성 (CDC) 을 유도한다. 인간 IgG2 와 인간 IgG4 는, Fc 리셉터나 보체 인자에 대한 친화성이 낮은 점에서, ADCC 활성 및 CDC 활성이 낮다.
면역 글로불린 M (IgM) 은 인간 면역 글로불린의 약 10 ％ 를 차지하는, 기본의 4 개 사슬 구조가 5 개 결합한 5 량체의 항체이다. 분자량은 970,000. 통상 혈중에만 존재하고, 감염 미생물에 대해 처음에 산생되어, 초기 면역을 담당하는 면역 글로불린이다.
면역 글로불린 A (IgA) 는 인간 면역 글로불린의 10 - 15 ％ 를 차지한다. 분자량은 160,000. 분비형 IgA 는 2 개의 IgA 가 결합한 2 량체의 항체로 되어 있다. IgA1 은 혈청, 콧물, 타액, 모유 중에 존재하고, 장액에는 IgA2 가 많이 존재한다.
면역 글로불린 D (IgD) 는 인간 면역 글로불린의 1 ％ 이하의 단량체의 항체이다. B 세포 표면에 존재하고, 항체 산생의 유도에 관여한다.
면역 글로불린 E (IgE) 는 인간 면역 글로불린의 0.001 ％ 이하로 극미량밖에 존재하지 않는 단량체의 항체이다. 기생충에 대한 면역 반응에 관여하고 있다고 생각되지만, 기생충이 드문 선진국에 있어서는, 특히 기관지 천식이나 알레르기에 크게 관여하고 있다.
개에서는, IgG 의 H 사슬로서, IgG-A (인간 IgG2 에 상당), IgG-B (인간 IgG1 에 상당), IgG-C (인간 IgG3 에 상당), IgG-D (인간 IgG4 에 상당) 의 서열이 동정되어 있다. 본 발명의 항체에서는, ADCC 활성, CDC 활성을 모두 갖지 않는 IgG H 사슬 정상 영역이 바람직하다 (인간에서는 IgG4). 인간 IgG4 에 상당하는 면역 글로불린의 정상 영역이 동정되어 있지 않은 경우에는, 인간 IgG1 에 상당하는 면역 글로불린의 당해 영역에 변이를 가함으로써, ADCC 활성, CDC 활성을 모두 가지지 않게 된 것을 사용하면 된다.
소에서는, IgG 의 H 사슬로서, IgG1, IgG2, IgG3 의 서열이 동정되어 있다. 본 발명의 항체에서는, ADCC 활성, CDC 활성을 모두 갖지 않는 IgG H 사슬 정상 영역이 바람직하다 (인간에서는 IgG4). 인간 IgG1 의 정상 영역은 야생형에서는 ADCC 활성 및 CDC 활성을 갖지만, 특정 부분에 아미노산 치환이나 결손을 가함으로써, 그들 활성을 저하시킬 수 있는 것이 알려져 있다. 소에 있어서, 인간 IgG4 에 상당하는 면역 글로불린의 정상 영역이 동정되어 있지 않기 때문에, 인간 IgG1 에 상당하는 면역 글로불린의 당해 영역에 변이를 가하여, 이것을 사용할 수 있다. 그 일례로서, 소 항체의 H 사슬 정상 영역 (IgG1 사슬, GenBank : X62916) 의 CH2 도메인에 변이를 가한 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열 (코돈을 최적화한 것) 을, 각각 서열 번호 4 및 8 에 나타낸다.
소 항체의 L 사슬 정상 영역이, Lambda 사슬의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖고, 또한 소 항체의 H 사슬 정상 영역이, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 저하시키는 변이가 도입된 것인 항 PD-1 항체가 보다 바람직하다.
본 발명의 항 PD-1 항체는, 래트-소 키메라 항체, 소화 항체, 완전 소형 항체를 포함하지만, 동물은, 소로 한정되는 것은 아니고, 인간, 개, 돼지, 원숭이, 마우스, 고양이, 말, 염소, 양, 물소, 토끼, 햄스터, 모르모트 등등을 예시할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 항 PD-1 항체는, 소 항체의 L 사슬 정상 영역이 서열 번호 3 의 아미노산 서열을 갖고, 소 항체의 H 사슬 정상 영역이 서열 번호 4 의 아미노산 서열을 갖는 항 PD-1 항체이면 된다.
서열 번호 3 및 4 의 아미노산 서열에 있어서는, 1 혹은 복수 개 (예를 들어, 5 개 이하, 많아도 10 개 정도) 의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어도 되고, 이들의 변이가 도입되어도, 항체의 L 사슬 정상 영역 또는 H 사슬 정상 영역으로서의 기능을 가질 수 있다.
본 발명의 항 PD-1 항체는, L 사슬 2 개와 H 사슬 2 개의 4 개 사슬 구조를 가지면 된다.
본 발명의 항 PD-1 항체는, 이하와 같이 하여 제조할 수 있다. 동정한 래트 항소 PD-1 항체의 가변 영역 서열과 래트 이외의 동물 (예를 들어, 소 등) 의 항체 (바람직하게는, 인간 IgG1 에 상당하는 면역 글로불린의 당해 영역에 변이를 가하여, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 저하시킨 것) 의 정상 영역 서열을 포함하는 인공 유전자를 합성하고, 그 인공 유전자를 벡터 (예를 들어, 플라스미드) 에 삽입 후, 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포 등의 포유류 세포) 에 도입하고, 그 숙주 세포를 배양함으로써, 배양물로부터 항체를 채취한다.
본 발명자들이 동정한 래트 항소 PD-1 항체의 L 사슬 가변 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을, 각각 서열 번호 1 및 5 에 나타낸다. 또한, 코돈 최적화 후의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 11 에 나타낸다.
본 발명자들이 동정한 래트 항소 PD-1 항체의 H 사슬 가변 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을, 각각 서열 번호 2 및 6 에 나타낸다. 또한, 코돈 최적화 후의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 12 에 나타낸다.
소 항체의 L 사슬 정상 영역 (Lambda 사슬, GenBank : X62917) 의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을, 각각 서열 번호 3 및 7 에 나타낸다. 또한, 코돈 최적화 후의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 13 에 나타낸다.
소 항체의 H 사슬 정상 영역 (IgG1 사슬, GenBank : X62916 을 개변) 의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후) 을, 각각 서열 번호 4 및 8 에 나타낸다.
또, 서열 번호 9 는, 래트 항소 PD-1 항체의 L 사슬 가변 영역과 소 항체의 L 사슬 정상 영역 (Lambda 사슬, GenBank : X62917) 으로 이루어지는 키메라 L 사슬의 아미노산 서열을 나타낸다. 래트 항소 PD-1 항체의 L 사슬 가변 영역과 소 항체의 L 사슬 정상 영역 (Lambda 사슬, GenBank : X62917) 으로 이루어지는 키메라 L 사슬의 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후) 을 서열 번호 14 에 나타낸다.
서열 번호 10 은, 래트 항소 PD-1 항체의 H 사슬 가변 영역과 소 항체의 H 사슬 정상 영역 (IgG1 사슬, GenBank : X62916 을 개변) 으로 이루어지는 키메라 H 사슬의 아미노산 서열을 나타낸다. 래트 항소 PD-1 항체의 H 사슬 가변 영역과 소 항체의 H 사슬 정상 영역 (IgG1 사슬, GenBank : X62916 을 개변) 으로 이루어지는 키메라 H 사슬의 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후) 을 서열 번호 15 에 나타낸다.
이 외, 래트 이외의 동물의 L 사슬 정상 영역 및 H 사슬 정상 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열은, 공지된 데이터베이스로부터 입수할 수 있고, 이들 서열을 이용할 수 있다.
소의 L 사슬 정상 영역 및 H 사슬 정상 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을 하기 표에 정리하였다.
(표)
Figure pct00001
Figure pct00002
양, 물소, 인간의 L 사슬 정상 영역 및 H 사슬 정상 영역의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을 하기 표에 정리하였다.
(표)
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
서열 번호 3, 21 ∼ 28, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 및 59 의 아미노산 서열에 있어서는, 1 혹은 복수 개 (예를 들어, 5 개 이하, 많아도 10 개 정도) 의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어도 되고, 이들 변이가 도입되어도, Ig 중사슬 또는 경사슬의 정상 영역으로서의 기능을 가질 수 있다.
인간 IgG1 의 정상 영역은 야생형에서는 ADCC 활성 및 CDC 활성을 갖지만, 특정 부분에 아미노산 치환이나 결손을 가함으로써, 그들 활성을 저하시킬 수 있는 것이 알려져 있다. 인간 이외의 동물에 있어서, 인간 IgG4 에 상당하는 면역 글로불린의 정상 영역이 동정되어 있지 않은 경우, 인간 IgG1 에 상당하는 면역 글로불린의 당해 영역에 변이를 가하여, ADCC 활성 및 CDC 활성을 저하시킨 것을 사용할 수 있다.
본 발명은, (a') QSLEYSDGYTY (서열 번호 16) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, GVS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 FQATHDPDT (서열 번호 17) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 정상 영역을 갖는 L 사슬을 코드하는 DNA 와, (b') GFSLTSYY (서열 번호 18) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IRSGGST (서열 번호 19) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARTSSGYEGGFDY (서열 번호 20) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 정상 영역을 갖는 H 사슬을 코드하는 DNA 를 포함하는, 인공 유전자 DNA 를 제공한다. 또, 본원 발명은, QSLEYSDGYTY (서열 번호 16) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, GVS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 FQATHDPDT (서열 번호 17) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 정상 영역을 갖는 L 사슬을 코드하는 DNA 도 제공한다. 또한, 본 발명은, GFSLTSYY (서열 번호 18) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IRSGGST (서열 번호 19) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARTSSGYEGGFDY (서열 번호 20) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 정상 영역을 갖는 H 사슬을 코드하는 DNA 도 제공한다.
(a) QSLEYSDGYTY (서열 번호 16) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, GVS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 FQATHDPDT (서열 번호 17) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 정상 영역을 갖는 L 사슬, 그리고 (b) GFSLTSYY (서열 번호 18) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IRSGGST (서열 번호 19) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARTSSGYEGGFDY (서열 번호 20) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 정상 영역을 갖는 H 사슬에 대해서는, 상기 서술하였다. (a') 의 DNA 는 (a) 의 L 사슬을 코드하는 DNA (유전자) 이고, (b') 의 DNA 는 (b) 의 H 사슬을 코드하는 DNA (유전자) 이며, (a') 의 DNA 와 (b') 의 DNA 를 포함하는 인공 유전자 DNA 는, 시판되는 합성기를 사용하여 합성할 수 있다. 인공 유전자 DNA 에는, 제한 효소 인식 부위, KOZAK 서열, 폴리 A 부가 시그널 서열, 프로모터 서열, 인트론 서열 등을 부가해도 된다.
또, 본 발명은, 상기 인공 유전자 DNA 를 포함하는 벡터도 제공한다.
벡터로는, 대장균 유래의 플라스미드 (예, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), 고초균 유래의 플라스미드 (예, pUB110, pTP5, pC194), 효모 유래 플라스미드 (예, pSH19, pSH15), λ 파지 등의 박테리오파지, 레트로바이러스, 백시니아바이러스 등의 동물 바이러스, 바큘로바이러스 등의 곤충 병원 바이러스 등을 사용할 수 있다. 후술하는 실시예에서는, pDN112 (Marzi A, Yoshida R, Miyamoto H, Ishijima M, Suzuki Y, Higuchi M, Matsuyama Y, Igarashi M, Nakayama E, Kuroda M, Saijo M, Feldmann F, Brining D, Feldmann H, Takada A. PLoS One, 7 : e36192, Apr. 27, 2012 ; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology, 142 (4) : 551 - 561, Aug. 2014.) 를 사용하였다.
벡터에는, 프로모터, 인핸서, 스플라이싱 시그널, 폴리 A 부가 시그널, 인트론 서열, 선택 마커, SV40 복제 오리진 등을 부가해도 된다.
또한, 본 발명은, 상기 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포도 제공한다. 이 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 항체를 채취함으로써, 항 PD-1 항체를 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 상기 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 항 PD-1 항체를 채취하는 것을 포함하는, 항체의 제조 방법도 제공한다. 본 발명의 항체의 제조 방법에 있어서, L 사슬을 코드하는 DNA 와 H 사슬을 코드하는 DNA 를 포함하는 인공 유전자 DNA 를 삽입한 벡터를 숙주 세포에 트랜스펙션해도 되고, L 사슬을 코드하는 DNA 를 삽입한 벡터와 H 사슬을 코드하는 DNA 를 삽입한 벡터를 숙주 세포에 코트랜스펙션해도 된다.
숙주 세포로는, 세균 세포 (예를 들어, 에쉐리히아속균, 바실루스속균, 고초균 등), 진균 세포 (예를 들어, 효모, 아스페르길루스 등), 곤충 세포 (예를 들어, S2 세포, Sf 세포 등), 동물 세포 (예를 들어, CHO 세포, COS 세포, HeLa 세포, C127 세포, 3T3 세포, BHK 세포, HEK293 세포 등), 식물 세포 등을 예시할 수 있다. 이 중, 디하이드로엽산 환원 효소 결손 세포인 CHO-DG44 세포 (CHO-DG44(dhfr-/-)) 가 바람직하다.
재조합 벡터를 숙주에 도입하려면, Molecular Cloning 2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989 에 기재된 방법 (예를 들어, 인산칼슘법, DEAE-덱스트란법, 트랜스펙션법, 마이크로인젝션법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법, 형질 도입법, 스크레이프 로딩법, 샷건법 등) 또는 감염에 의해 실시할 수 있다.
형질 전환체를 배지에서 배양하고, 배양물로부터 본 발명의 항 PD-1 항체를 채취할 수 있다. 항체가 배지에 분비되는 경우에는, 배지를 회수하고, 그 배지로부터 항체를 분리하고, 정제하면 된다. 항체가 형질 전환된 세포 내에 산생되는 경우에는, 그 세포를 용해하고, 그 용해물로부터 항체를 분리하고, 정제하면 된다.
배지로는, OptiCHO 배지, Dynamis 배지, CD CHO 배지, ActiCHO 배지, FortiCHO 배지, Ex-Cell CD CHO 배지, BalanCD CHO 배지, ProCHO 5 배지, Cellvento CHO-100 배지 등을 예시할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
배지의 pH 는 배양하는 세포에 따라 상이하지만, 일반적으로는 pH 6.8 ∼ 7.6, 대부분의 경우 pH 7.0 ∼ 7.4 가 적당하다.
배양하는 세포가 CHO 세포인 경우, CHO 세포의 배양은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 통상 기상의 CO2 농도가 0 - 40 ％, 바람직하게는 2 - 10 ％ 의 분위기하, 30 - 39 ℃, 바람직하게는 37 ℃ 정도에서 배양할 수 있다.
적당한 배양 기간은, 통상 1 일 ∼ 3 개월이고, 바람직하게는 1 일 ∼ 3 주간이다.
항체의 분리 및 정제는, 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 공지된 분리, 정제법으로는, 염석이나 용매 침전법 등의 용해도의 차를 이용하는 방법, 투석법, 한외 여과법, 겔 여과법, 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 등의 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피 등의 하전의 차를 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기 영동법 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등이 이용된다.
본 발명의 항 PD-1 항체는, 동물용 또는 인간용의 항체 의약으로서 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 상기 항 PD-1 항체를 유효 성분으로서 포함하는, 의약 조성물을 제공한다.
본 발명의 의약 조성물은, 암 및/또는 감염증의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다. 암 및/또는 감염증으로는, 종양성 질환 (예를 들어, 악성 흑색종, 폐암, 위암, 신장암, 유암, 방광암, 식도암, 난소암 등), 백혈병, 요네병, 아나플라스마병, 세균성 유방염, 진균성 유방염, 마이코플라스마 감염증 (예를 들어, 마이코플라스마성 유방염, 마이코플라스마성 폐렴 등), 결핵, 소형 파이로플라스마병, 크립토스포리듐증, 콕시듐증, 트리파노소마병 및 리슈마니아증 등을 예시할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항 PD-1 항체를 PBS 등의 완충액, 생리 식염수, 멸균수 등에 용해하고, 필요에 따라 필터 등으로 여과 멸균한 후, 주사에 의해 피험 동물 (인간도 포함한다) 에 투여하면 된다. 또, 이 용액에는, 첨가제 (예를 들어, 착색제, 유화제, 현탁제, 계면 활성제, 용해 보조제, 안정화제, 보존제, 산화 방지제, 완충제, 등장화제, pH 조절제 등) 등을 첨가해도 된다. 투여 경로로는, 정맥, 근육, 복강, 피하, 피내 투여 등이 가능하고, 또 경비, 경구 투여해도 된다.
본 발명의 항 PD-1 항체의 투여량, 투여의 횟수 및 빈도는, 피험 동물의 증상, 연령, 체중, 투여 방법, 투여 형태 등에 따라 상이하지만, 예를 들어 통상 성수 (成獸) 1 마리당 0.1 ∼ 100 mg/kg 체중, 바람직하게는, 1 ∼ 10 mg/kg 체중을, 적어도 1 회, 원하는 효과가 얻어지는 빈도로 투여하면 된다.
본 발명의 의약 조성물은, 단독으로 사용해도 되지만, 외과 수술, 방사선 요법, 암 백신 등 다른 면역 요법이나 분자 표적 치료약과 조합하여 사용해도 된다. 이로써, 상승 효과를 기대할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
〔실시예 1〕래트-소 키메라 항소 PD-1 항체의 수립
서론
면역 억제 수용체 Programmed death 1 (PD-1) 과 그 리간드인 Programmed death ligand 1 (PD-L1) 은 과잉의 면역 응답을 억제하고, 면역 관용에 깊게 관련되어 있는 인자로서 쿄토 대학, 혼조 다스쿠씨 등에 의해 동정된 분자이다. 종양에 있어서의 면역 억제에 관여하고 있는 것도 최근 명백하게 되어 있다. 본 실시예에서는, 소의 감염증에 대한 신규 치료법의 수립을 목적으로 소 PD-1 및 PD-L1 의 결합을 저해 가능한 래트 항소 PD-1 모노클로날 항체 5D2 의 가변 영역 유전자와, 소 면역 글로불린 (소 IgG1 및 Igλ. 단, ADCC 활성을 억제하기 위해서, 소 IgG1 CH2 도메인의 Fcγ 수용체 예상 결합 부위에 변이를 가하였다 (도 1, 도 11). 아미노산 번호 및 변이 : 250 E → P, 251 L → V, 252 P → A, 253 G → 삭제, 347 A → S, 348 P → S ; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology, 142 (4) : 551 - 561 ; Aug. 2014.) 의 정상 영역 유전자를 조합한 키메라 항체 유전자를 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cell, CHO 세포) 를 배양 증식시켜 얻은 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 를 제조하고, in vitro 및 in vivo 의 효과를 확인하였다.
재료, 방법, 및 실험 결과
2.1. 소 PD-1 및 PD-L1 발현 세포의 구축
소 PD-1 유전자 (GenBank accession number AB510901 ; Ikebuchi R, Konnai S, Sunden Y, Onuma M, Ohashi K. Microbiol. Immunol., 54 (5) : 291 - 298 ; May 2010.) 및 소 PD-L1 유전자 (GenBank accession number AB510902 ; Ikebuchi R, Konnai S, Shirai T, Sunden Y, Murata S, Onuma M, Ohashi K. Vet. Res., 42 : 103 ; Sep. 26, 2011.) 에 대해 cDNA 전체 길이의 염기 서열을 결정하고, 그 유전자 정보로부터 소 PD-1 또는 PD-L1 발현 세포를 제조하였다. 먼저, 소 PD-1 또는 PD-L1 발현 플라스미드를 제조하기 위해, 합성한 소 말초혈 단핵구 (PBMC) 유래 cDNA 를 주형으로 하여, 5′말단 측에 제한 효소 NotI 및 HindIII (소 PD-1), 혹은 NheI 및 XhoI (소 PD-L1) 인식 부위를 부가한 프라이머 (boPD-1-myc F 및 R, 혹은 boPD-L1-EGFP F 및 R) 를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 NotI (Takara 사) 및 HindIII (Takara 사 ; 소 PD-1), 혹은 NheI (Takara 사) 및 XhoI (Takara 사 ; 소 PD-L1) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 pCMV-Tag1 vector (Agilent Technologies 사 ; 소 PD-1) 또는 pEGFP-N2 vector (Clontech 사 ; 소 PD-L1) 에 도입하여, 클로닝을 실시하였다. 얻어진 목적의 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit (Qiagen 사) 를 사용하여 추출하고, 실험에 제공할 때까지 -30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제조한 발현 플라스미드를 pCMV-Tag1-boPD-1 또는 pEGFP-N2-boPD-L1 로 표기한다.
프라이머 (boPD-1-myc F) : ATATGCGGCCGCATGGGGACCCCGCGGGCGCT (서열 번호 61)
프라이머 (boPD-1-myc R) : GCGCAAGCTTTCAGAGGGGCCAGGAGCAGT (서열 번호 62)
프라이머 (boPD-L1-EGFP F) : CTAGCTAGCACCATGAGGATATATAGTGTCTTAAC (서열 번호 63)
프라이머 (boPD-L1-EGFP R) : CAATCTCGAGTTACAGACAGAAGATGACTGC (서열 번호 64)
이하의 순서에 따라, 소 PD-1 발현 세포를 제조하였다. 먼저, 4 × 106 개의 CHO-DG44 세포에 2.5 ㎍ 의 pCMV-Tag1-boPD-1 을 Lipofectamine LTX (Invitrogen 사) 를 사용하여 도입하였다. 48 시간 후, G418 (Enzo Life Science 사) 800 ㎍/ml, GlutaMAX supplement (Life technologies 사) 20 ml/l, 10 ％ Pluronic F-68 (Life technologies 사) 18 ml/l 를 포함하는 CD DG44 배지 (Life technologies 사) 에 배지 교환하고, 셀렉션을 실시하였다. 얻어진 발현 세포를 래트 항소 PD-1 항체 5D2 와 실온에서 반응시키고, 세정 후, 항래트 IgG 마이크로 비즈 표지 항체 (Miltenyi Biotec 사) 와 실온에서 추가로 반응시켰다. Auto MACS (Miltenyi Biotec 사) 를 사용하여 소 PD-1 을 고발현하는 세포를 분리하고, 또한 순도를 높이기 위해 동일한 순서로 재분리를 실시하였다. 제조한 발현 세포에 대해 한계 희석법에 의해 클로닝을 실시하여, 소 PD-1 고발현 CHO DG44 세포를 얻었다 (소 PD-1 발현 세포).
이하의 순서에 따라, 소 PD-L1 막 발현 세포를 제조하였다. 먼저, 4 × 106 개의 CHO-DG44 세포에 2.5 ㎍ 의 pEGFP-N2-boPD-L1 혹은 음성 대조로서 pEGFP-N2 를 Lipofectamine LTX (Invitrogen 사) 를 사용하여 도입하였다. 48 시간 후, G418 (Enzo Life Science 사) 800 ㎍/ml, GlutaMAX supplement (Life technologies 사) 20 ml/l, 10 ％ Pluronic F-68 (Life technologies 사) 18 ml/l 를 포함하는 CD DG44 배지 (Life technologies 사) 에 배지 교환하고, 셀렉션을 실시함과 동시에 한계 희석법에 의해 클로닝을 실시하였다 (소 PD-L1 발현 세포). 제조한 발현 세포에 있어서의 소 PD-L1 의 발현을 확인하기 위해서, 도립형 공초점 레이저 현미경 LSM700 (ZEISS 사) 에 의해, EGFP 의 세포 내 국재를 가시화하였다.
2.2. 가용성 소 PD-1 의 구축
이하의 순서에 따라, 소 PD-1-Ig 발현 플라스미드를 구축하였다. 소 PD-1 (GenBank accession number AB510901) 의 시그널 펩티드 및 세포 외 영역을 이미 알려진 소 IgG1 (GenBank accession number X62916) 의 정상 영역과 결합시킨 유전자 서열을 작성하고, CHO 세포에 코돈의 최적화를 실시한 후, 제한 효소 (NotI) 인식 서열, KOZAK 서열, 소 PD-1 시그널 펩티드 서열, 소 PD-1 유전자 세포 외 영역 서열, 소 IgG1 Fc 영역 서열, 제한 효소 (XbaI) 인식 서열을 상기 순서로 배치하도록 유전자 합성을 실시하였다. 또한, 소 IgG1 은 ADCC 활성을 억제하기 위해서, CH2 도메인의 Fcγ 수용체 예상 결합 부위에 변이를 가하였다 (변이 삽입 지점 : 185 E → P, 186 L → V, 187 P → A, 189 G → 삭제, 281 A → S, 282 P → S ; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology, 142(4) : 551-561 ; Aug. 2014. 이 논문의 Figure 2 에 PD-1-Ig 의 아미노산 서열, 변이 삽입 지점이 게재되어 있다). 합성한 유전자 사슬을 NotI (Takara 사) 및 XbaI (Takara 사) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 발현용 벡터 pDN11 (홋카이도 대학 인수 공통 감염증 리서치 센터 스즈키 야스히코 교수로부터 분여) 의 클로닝 사이트 (PCMV 하류, INRBG 와 PABGH 의 사이에 있는 NotI 및 XbaI 제한 효소 인식 서열) 에 삽입하여, 소 PD-1-Ig 발현 벡터를 구축하였다. 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit (Qiagen 사) 에 의해 정제하고, 실험에 제공할 때까지 -30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제조한 발현 플라스미드를 pDN11-boPD-1-Ig 로 표기한다.
이하의 순서에 따라, 소 PD-1-His 발현 플라스미드를 구축하였다. 소 PD-1 (GenBank accession number AB510901) 의 시그널 펩티드 및 세포 외 영역을 증폭하도록, 5′말단 측에 제한 효소 NotI 및 XhoI 인식 부위를 부가한 프라이머 (boPD-1-His F 및 R) 를 설계하였다. 또한, 리버스 프라이머에는 6 × 히스티딘 (His) 태그를 코드하는 유전자 서열을 부가하였다. 합성한 소 PBMC 유래 cDNA 를 주형으로 PCR 을 실시하고, 각각의 PCR 산물을 NotI (Takara 사) 및 XhoI (Takara 사) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 pCXN2.1(+) vector (Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Gene, 108 (2) : 193 - 199 ; Dec. 15, 1991 ; 준텐도 대학 대학원 의학 연구과 요코미조 타케히코 교수로부터 분여) 에 도입하고, 클로닝을 실시하였다. 발현 플라스미드는 FastGene Xpress Plasmid PLUS Kit (NIPPON Genetics 사) 에 의해 정제하고, 실험에 제공할 때까지 -30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제조한 발현 플라스미드를 pCXN2.1-boPD-1-His 로 표기한다.
프라이머 (boPD-1-His F) : ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGGGGACCCCGCGGGCGCT (서열 번호 65)
프라이머 (boPD-1-His R) : GCCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGGATGACCAGGCTCTGCATCT (서열 번호 66)
이하의 순서에 따라, 가용성 소 PD-1-Ig 발현 세포를 제조하였다. 4 × 106 개의 CHO-DG44 세포에 2.5 ㎍ 의 pDN11-boPD-1-Ig 를 Lipofectamine LTX (Invitrogen 사) 를 사용하여 도입하였다. 48 시간 후, G418 (Enzo Life Science 사) 800 ㎍/ml, GlutaMAX supplement (Life technologies 사) 20 ml/l 를 포함하는 CD OptiCHO 배지 (Life technologies 사) 에 배지 교환하고, 3 주간 배양하여 셀렉션을 실시하였다. 얻어진 세포주의 배양 상청 중의 Fc 융합 재조합 단백질의 농도는 항소 IgG F(c) 토끼 폴리클로날 항체 (Rockland 사) 를 사용한 ELISA 법을 이용하여 측정하고, Fc 융합 재조합 단백질을 고발현하는 세포주의 선별을 실시하였다. 얻어진 고발현 세포주는 G418 을 포함하지 않는 배지로 옮기고, 14 일간 진탕 배양을 실시하여 배양 상청을 회수하였다. Fc 융합 재조합 단백질을 포함하는 배양 상청은, Centricon Plus-70 (Millipore 사) 을 사용하여 한외 여과한 후에, Ab-Capcher Extra (ProteNova 사) 를 사용하여 Fc 융합 재조합 단백질을 정제하였다. 정제 후, PD-10 Desalting Column (GE Healthcare 사) 에 의해 버퍼를 인산 완충 생리 식염수 (PBS ; pH 7.4) 로 치환하고, 실험에 제공할 때까지 -30 ℃ 에서 보존하였다 (소 PD-1-Ig). 정제 후의 소 PD-1-Ig 의 농도는 항소 IgG F(c) 토끼 폴리클로날 항체 (Rockland 사) 를 사용한 ELISA 법에 의해 측정하였다. ELISA 의 각 세정 조작에는 Auto Plate Washer BIO WASHER 50 (DS Pharma Biomedical 사) 을 사용하고, 흡광도의 측정에는 Microplate Reader MTP-650FA (코로나 전기사) 를 사용하였다.
이하의 순서에 따라, 가용성 소 PD-1-His 발현 세포를 제조하였다. 7.5 × 107 개의 Expi293F 세포 (Life Technologies 사) 에 30 ㎍ 의 pCXN2.1-boPD-1-His 를 Expifectamine (Life Technologies 사) 을 사용하여 도입하고, 7 일간 진탕 배양을 실시하여 배양 상청을 회수하였다. 배양 상청으로부터 TALON Metal Affinity Resin (Clontech 사 ; 소 PD-1-His) 을 사용하여 재조합 단백질을 정제하였다. 정제 후, PD MiniTrap G-25 (GE Healthcare 사) 에 의해 버퍼를 PBS (pH 7.4) 로 치환하고, 실험에 제공할 때까지 -30 ℃ 에서 보존하였다 (소 PD-1-His). 정제 후의 소 PD-1-His 농도는, Nanodrop8000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific 사) 를 사용하여 측정한 흡광도 (280 nm) 에 의해 정량하였다.
2.3. 래트 항소 PD-1 모노클로날 항체 산생 세포의 제조
소 PD-1-Ig (전술) 를 래트의 족척에 면역하고, 장골 림프절법을 이용하여 하이브리도마를 수립하여, 래트 항소 PD-1 모노클로날 항체 산생 하이브리도마 5 D2 주를 얻었다. 래트 항소 PD-1 모노클로날 항체의 수립법에 대해서는, 이하의 비특허문헌에 그 상세가 기재되어 있다 (Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Vet. Res., 44 : 59 ; Jul. 22, 2013).
2.4. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 발현 벡터의 제조
래트 항소 PD-1 항체 5D2 를 항체 가변 영역으로 하여 소 IgG1 및 소 Igλ 의 항체 정상 영역을 융합시킨, 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 를 수립하였다.
먼저, 래트 항소 PD-1 항체 5D2 를 산생하는 하이브리도마로부터 가변 영역 (중사슬 및 경사슬) 의 유전자를 RACE 법에 의해 동정하였다. 다음으로, 래트 항소 PD-1 항체 5D2 의 중사슬 및 경사슬 가변 영역 서열을 이미 알려진 소 IgG1 (중사슬 ; GenBank Accession number X62916 을 개변) 및 소 Igλ (경사슬 ; GenBank Accession number X62917) 의 정상 영역과 결합시킨 유전자 서열을 작성하고, 코돈 최적화를 실시하였다 (서열 번호 9 및 10 (아미노산 서열), 서열 번호 14 및 15 (코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열). 또한, 소 IgG1 에는 ADCC 활성을 억제하기 위해서, CH2 도메인의 Fcγ 수용체 예상 결합 부위에 변이를 가하였다 (도 1, 도 11 참조. 아미노산 번호 및 변이 : 251 E → P, 252 L → V, 253 P → A, 254 G → 삭제, 348 A → S, 349 P → S ; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology, 142 (4) : 551-561 ; Aug. 2014.). 그리고, NotI 제한 효소 인식 서열, KOZAK 서열, 키메라 항체 경사슬 서열, 폴리 A 부가 시그널 서열 (PABGH), 프로모터 서열 (PCMV), SacI 제한 효소 인식 서열, 인트론 서열 (INRBG), KOZAK 서열, 키메라 항체 중사슬 서열, XbaI 제한 효소 인식 서열을 상기 순서로 배치하도록 유전자를 인공적으로 합성하였다. 합성한 유전자 사슬을 NotI (Takara 사) 및 XbaI (Takara 사) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 발현 플라스미드 pDN112 (홋카이도 대학 인수 공통 감염증 리서치 센터 스즈키 야스히코 교수로부터 분여) 의 클로닝 사이트 (PCMV 하류, INRBG 와 PABGH 의 사이에 있는 NotI 및 XbaI 제한 효소 인식 서열) 에 도입하고, 클로닝을 실시하였다 (도 2). 얻어진 목적의 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit (Qiagen 사) 를 사용하여 추출하고, 실험에 제공할 때까지 -30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제조한 발현 플라스미드를 pDN112-boPD-1ch5D2 로 표기한다.
2.5. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체의 발현 (도 3)
제조한 pDN112-boPD-1ch5D2 를 Lipofectamine LTX (Life technologies 사) 를 사용하여, 디하이드로엽산 환원 효소 결손 (dfhr-/-) 세포인 CHO-DG44 세포에 도입하였다. 48 시간 후, 2mM GlutaMAX supplement (Life technologies 사) 및 G418 sulfate 800 ㎍/ml (Enzo Life Science 사) 를 포함하는 CD OptiCHO 배지 (Life technologies 사) 에 배지 교환하고, 3 주간 배양하여 발현 세포의 셀렉션 및 한계 희석법에 의한 클로닝을 실시하였다. 다음으로, 항소 IgG F(c) 토끼 폴리클로날 항체 (Rockland 사) 를 사용한 도트 블롯법 및 ELISA 법에 의해 배양 상청에 포함되는 키메라 항체의 농도를 측정하고, 고발현 클론을 선발하였다. 또한, 선발한 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 고발현 클론에 대해, 60 nM 의 메토트렉세이트 (Mtx ; 와코 준야쿠 공업사) 를 포함하는 배지에서 부하를 가함으로써 유전자 증폭 처리를 실시하였다. 이상과 같이 하여 수립한 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 안정 발현 세포를, Mtx 를 포함하지 않는 CD OptiCHO 배지에 옮기고, 14 일간의 진탕 배양을 실시하였다 (125 rpm, 37 ℃, 5 ％ CO2). 항소 IgG F(c) 토끼 폴리클로날 항체 (Rockland 사) 를 사용한 ELISA 법을 이용하여, 배양 상청 중의 키메라 항체 산생량을 정량하였다. 또한, ELISA 의 각 세정 조작에는 Auto Plate Washer BIO WASHER 50 (DS Pharma Biomedical 사) 을 사용하고, 흡광도의 측정에는 Microplate Reader MTP-650FA (코로나 전기사) 를 사용하였다. 14 일째의 배양 상청을 10,000 g 으로 10 분간 원심하여 세포를 제거한 후, 원심 상청을 Steritop-GP 0.22 ㎛ 필터 (Millipore 사) 에 통과시켜 멸균하고, 정제에 제공할 때까지 4 ℃ 에서 보존하였다.
결과를 도 3A 에 나타낸다. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 발현 세포주 중, 가장 산생량이 높은 클론은, 14 일간의 진탕 배양에서 91.7 mg/L 의 키메라 항체를 배양 상청 중에 분비하였다.
2.6. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체의 정제
상기 방법에 의해 준비한 배양 상청으로부터, Ab Capcher Extra (ProteNova 사) 를 사용하여 각 키메라 항체를 정제하였다. 레진에의 결합은 오픈 칼럼법을 이용하고, 평형화 버퍼 및 세정 버퍼로서 1.5 M Glycine/3 M NaCl (pH 8.0) 을 사용하였다. 용출 버퍼로는 0.1 M Glycine-HCl (pH 2.8) 을, 중화 버퍼로는 1 M Tris (pH 9.0) 를 사용하였다. 정제한 항체는, PD-10 Desalting Column (GE Healthcare 사) 및 Amicon Ultra-15 (50 kDa, Millipore 사) 를 사용하여, PBS (pH 7.4) 로의 버퍼 치환 및 농축을 실시하였다. 정제한 키메라 항체는, 0.22 ㎛ 시린지 필터 (Pall Life Sciences 사) 를 통과시켜 멸균하고, 실험에 제공할 때까지 4 ℃ 에서 보존하였다.
2.7. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체의 정제 순도의 확인 (도 3)
정제한 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체의 순도를 확인하기 위해, SDS-PAGE 및 CBB 염색에 의해 항체 단백질의 검출을 실시하였다. 정제한 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 를 Laemmli Sample Buffer (Bio-Rad 사) 에 현탁하고, 환원 조건하 (2-메르캅토에탄올 (Sigma-Aldrich 사) 에 의해 환원) 또는 비환원 조건하에서 변성 처리 (95 ℃, 5 분) 를 실시하였다. 조제한 샘플은 10 ％ 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 전기 영동하였다. 이때, 분자량 마커로서 Precision Plus Protein All Blue Standards (Bio-Rad 사) 를 사용하였다. 영동 후, Quick-CBB (와코 준야쿠 공업사) 에 의해 겔의 염색을 실시하고, 계속해서 증류수 중에서 탈색을 실시하였다.
결과를 도 3B 에 나타낸다. 환원 조건에서는 25 kDa (경사슬) 및 50 kDa (중사슬), 비환원 조건에서는 150 kDa 의 상정된 위치에 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체의 밴드가 확인되었다.
2.8. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체의 결합 특이성 (도 4)
래트-소 키메라 항소 PD-1 항체가 소 PD-1 발현 세포 (전술) 에 특이적으로 결합하는 것을 플로 사이토메트리법에 의해 확인하였다. 먼저, 소 PD-1 발현 세포에 대해 래트 항소 PD-1 항체 5D2 또는 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 를 실온에서 30 분간 반응시켰다. 세정 후, Allophycocyanine (APC) 표지 항래트 Ig 염소 항체 (SouthernBiotech 사) 또는 Alexa Fluor 647 표지 항소 IgG(H+L) 염소 F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch 사) 를 실온에서 30 분간 반응시켰다. 음성 대조 항체로서, 래트 IgG2a(κ) 아이소타입 컨트롤 (BD Biosciences 사) 또는 소 IgG1 항체 (Bethyl 사) 를 사용하였다. 세정 후, 세포 표면에 결합한 각 래트 항체 또는 래트-소 키메라 항체를 FACS Verse (BD Biosciences 사) 에 의해 검출하였다. 또한, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 1 ％ 소 혈청 알부민 (Sigma-Aldrich 사) 을 첨가한 PBS 를 사용하였다.
실험 결과를 도 4 에 나타낸다. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 는, 래트 항소 PD-1 항체 5D2 와 마찬가지로 소 PD-1 발현 세포에 결합하는 것이 나타났다.
2.9. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체의 PD-1 결합 친화성
분자 간 상호작용 해석 장치 (Biacore X100 ; GE Healthcare 사) 를 사용한 표면 플라스몬 공명법에 의해, 래트 항 PD-1 항체 5D2 및 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 의 소 PD-1 에 대한 결합 친화성을 계측하였다. 소 PD-1-His (전술) 를 리간드로서 센서 칩 CM5 (GE Healthcare 사) 에 고정하고, 래트 항 PD-1 항체 5D2 또는 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 를 애널라이트로서 반응시켜, 싱글 카이네틱스 해석을 실시하였다. 동일한 조건으로 실험을 3 회 반복하고, 각각의 실험에서 결합 정수 (kd 값) 와 해리 정수 (ka 값) 를 결정하고, 결합 친화성 (KD 값) 을 구하였다.
실험 결과를 하기 표에 나타낸다. 래트-소 항소 PD-1 키메라 항체의 PD-1 단백질에 대한 결합 친화성은, 래트 항소 PD-1 항체 5D2 와 동일한 정도이고, 통계학적으로 차는 보이지 않았다 (P > 0.05 ; Welch 의 t 검정).
Figure pct00006
2.10. 래트-소 키메라 항 PD-1 항체의 소 PD-1/PD-L1 결합 저해 활성 (도 5)
소 PD-L1 발현 세포 (전술) 및 소 PD-1-Ig (전술) 를 사용하여, 항 PD-1 항체에 의한 소 PD-1/PD-L1 결합 저해 시험을 실시하였다. 먼저, 96 웰 플레이트에 최종 농도 (0, 0.39, 0.78, 1.56, 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50 ㎍/ml) 의 래트 항소 PD-1 항체 5D2 또는 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 와, Lightning-Link Type A Biotin Labeling Kit (Innova Biosciences 사) 를 사용하여 비오틴 표지한 소 PD-1-Ig (최종 농도 5 ㎍/ml) 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 30 분간 반응시켰다. 이 혼합액을 1 × 105 개의 소 PD-L1 발현 세포와 37 ℃ 에서 30 분간 반응시켰다. 세정 후, APC 표지 스트렙트아비딘 (BioLegend 사) 을 실온에서 30 분간 반응시켜, 세포 표면에 결합한 소 PD-1-Ig 를 검출하였다. 해석에는 FACS Verse (BD Biosciences 사) 를 사용하였다. 또한, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 1 ％ 소 혈청 알부민 (Sigma-Aldrich 사) 을 첨가한 PBS 를 사용하였다. 항체 비첨가 시의 소 PD-1-Ig 결합 세포의 비율을 100 ％ 로 하고, 각 항체 농도에 있어서의 소 PD-1-Ig 결합 세포의 비율을 상대값으로서 나타냈다.
실험 결과를 도 5 에 나타낸다. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 는, 래트 항소 PD-1 항체 5D2 와 동일한 정도로 PD-L1 발현 세포에 대한 PD-1-Ig 의 결합을 저해하였다.
2.11. 래트 항소 PD-1 항체의 CDR 해석
NCBI IGBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) 를 사용하여, 래트 항소 PD-1 항체 5D2 의 상보성 결정 영역 (CDR) 을 결정하였다. 결과를 도 1 에 나타낸다.
2.12. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체의 소에 대한 접종 시험
BLV 실험 감염 송아지 (홀스타인종, 수컷, 4 개월령, 체중 173.5 kg) 에 수립한 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 14 mg (0.08 mg/kg) 을 점적 정맥주사하였다. 감염소로부터 시간 경과적으로 채혈을 실시하고, 혈액 (항응고제로서, 헤파린나트륨 (아지노모토 제약 주식회사) 을 사용) 및 혈청을 채취하였다. Percoll (GE Healthcare 사) 을 사용한 밀도 구배 원심법에 의해 혈액으로부터 말초혈 단핵구 (PBMC) 를 분리하였다.
2.13. 투여한 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체의 혈중 동태 (도 6)
소 PD-1-His (전술) 를 최종 농도 10 ㎍/ml 로 ELISA 플레이트 (H 타입, 스미토모 베이클라이트사) 에서 4 ℃ 에서 하룻밤, 고상화하였다. 그 후, 각 웰을 0.05 ％ Tween20 첨가 Tris-buffered saline (TBS-T) 200 μl 로 5 회 세정하고, 1 ％ 스킴 밀크 첨가 TBS-T 를 사용하여 실온에서 1 시간 블로킹을 실시하였다. 재차 동일하게 세정을 실시하고, 시험소로부터 채취한 혈청을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 세정 후에, Horseradish peroxidase 표지 항소 IgG F(c) 토끼 폴리클로날 항체 (Rockland 사) 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. 재차 각 웰을 세정하고, TMB One Component Substrate (Bethyl 사) 를 첨가하여, 발색을 실시하였다. 그 후, 0.18 M 묽은 황산으로 효소 반응을 정지시키고, Microplate Reader MTP-650FA (코로나 전기사) 를 사용하여 흡광도 (450 nm) 를 측정하였다. 플레이트의 각 세정 조작에는, Auto Plate Washer BIO WASHER 50 (DS Pharma Biomedical 사) 을 사용하였다.
실험 결과를 도 6 에 나타낸다. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체는, 투여 후 70 일째 (임상시험 종료 시) 까지 시험소의 혈청 중으로부터 검출되었다. 특히, 투여 후 1 주간은 높은 항체 농도를 유지하고 있었다.
2.14. BLV 항원에 대한 T 세포의 세포 증식 응답 (도 7)
소 PBMC 를 PBS 에 현탁하고, Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE ; Invitrogen 사) 를 실온에서 20 분간 반응시켜, 표지하였다. 10 ％ 비동화 소 태자 혈청 (Cell Culture Technologies 사), 페니실린 200 U/ml, 스트렙토마이신 200 ㎍/ml, 0.01 ％ L-글루타민 (Life Technologies 사) 을 포함하는 RPMI 1640 배지 (Sigma-Aldrich 사) 로 2 회 세정한 후, 동일 배지로 4 × 106 개/ml 로 조정하였다. PBMC 에 2 ％ BLV 감염 양 태자 신장 세포 (FLK-BLV) 배양 상청, 2 ％ BLV 비감염 양 태자 신장 세포 (FLK) 배양 상청, 혹은 BLV gp51 펩티드 믹스 0.1 ㎍/ml 또는 1 ㎍/ml 를 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 6 일간 배양하였다. 6 일 후, PBMC 를 회수하고, Alexa Fluor 647 표지 마우스 항소 CD4 항체 (CC30, AbD Serotec 사), Peridinin-chlorophyll-protein complex/cyanin 5.5 표지 마우스 항소 CD8 항체 (CC63, AbD Serotec 사) 및 R-Phycoerythrin/cyanin 7 (PE/Cy7) 표지 항소 IgM 마우스 항체 (IL-A30, AbD Serotec 사) 와 4 ℃ 에서 20 분간 반응시켰다. 항체의 표지에는 Zenon Mouse IgG1 Labeling Kits (Life Technologies 사) 또는 Lightning-Link Kits (Innova Biosciences 사) 를 사용하였다. 해석에는 FACS Verse (BD Biosciences 사) 를 사용하였다. 또한, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 1 ％ 소 혈청 알부민 (Sigma-Aldrich 사) 을 첨가한 PBS 를 사용하였다. 증식한 T 세포 (CFSElow 세포) 의 비율에 관해서, Dunnett 의 방법을 이용하여 통계 검정을 실시하였다.
실험 결과를 도 7 에 나타낸다. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체의 투여에 의해, CD4+ T 세포에 있어서의 BLV 특이적인 세포 증식 응답이 투여 전에 비해, 투여 직후부터 통계학적으로 유의하게 증가하였다.
2.15. BLV 프로바이러스량의 추이 (도 8)
분리한 소 PBMC 로부터 Wizard DNA Purification kit (Promega 사) 를 사용하여 DNA 를 추출하였다. 추출한 DNA 의 농도는, Nanodrop 8000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific 사) 를 사용하여 측정한 흡광도 (260 nm) 를 기준으로 하여 정량하였다. PBMC 중의 BLV 프로바이러스량을 측정하기 위해, Cycleave PCR Reaction Mix SP (Takara 사) 및 소 백혈병 바이러스 검출용 Probe/Primer/Positive control (Takara 사) 을 사용하여 리얼타임 PCR 을 실시하였다. 측정에는 LightCycler480 System II (Roche Diagnosis 사) 를 사용하였다. 측정한 프로바이러스량에 관해서는, Dunnett 의 방법을 이용하여 통계 검정을 실시하였다.
실험 결과를 도 8 에 나타낸다. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체의 투여에 의해, PBMC 중의 BLV 프로바이러스량이 투여 전에 비해, 투여 직후부터 통계학적으로 유의하게 감소하고, 임상시험 종료 시 (70 일째) 까지 낮은 값인 채 추이하였다.
〔실시예 2〕항 PD-1 항체의 다른 동물종에의 응용
1. 재료, 방법, 및 실험 결과
1.1. 양 및 물소 PD-1 유전자의 동정
양 및 물소 PD-1 cDNA 코딩 영역 (CDS) 전체 길이를 결정하기 위해서, 먼저 소 및 양 PD-1 유전자의 염기 서열 (GenBank accession number BC123854 및 XM_012176227) 을 기초로 유전자의 CDS 전체 길이를 증폭하는 프라이머 (ovPD-1 CDS F 및 R, buPD-1 CDS F1, R1, F2 및 R2) 를 설계하고, 합성한 양 또는 물소 PBMC 유래 cDNA 를 주형으로 하여 PCR 법을 실시하였다. 얻어진 증폭 산물에 대해, 통상적인 방법에 따라 캐필러리 시퀸서에 의해 염기 서열을 결정하였다 (Mingala CN, Konnai S, Ikebuchi R, Ohashi K. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 34 (1) : 55 - 63 ; Jan. 2011. 물소 PD-1 유전자를 동정한 논문).
프라이머 (ovPD-1 CDS F) : ATGGGGACCCCGCGGGCGCC (서열 번호 67)
프라이머 (ovPD-1 CDS R) : TCAGAGGGGCCAGGAGCAGTGTCCA (서열 번호 68)
프라이머 (buPD-1 CDS F1) : ATGGGGACCCCGCGGGCGCT (서열 번호 69)
프라이머 (buPD-1 CDS R1) : GATGACCAGGCTCTGCATCT (서열 번호 70)
프라이머 (buPD-1 CDS F2) : AATGACAGCGGCGTCTACTT (서열 번호 71)
프라이머 (buPD-1 CDS R2) : TCAGAGGGGCCAGGAGCAGT (서열 번호 72)
1.2. 양 PD-1 발현 COS-7 세포의 구축
양 PD-1 발현 플라스미드를 제조하기 위해, 합성한 양 PBMC 유래 cDNA 를 주형으로, 5′말단 측에 제한 효소 BglII 및 SmaI 인식 부위를 부가하여 설계한 프라이머 (ovPD-1-EGFP F 및 R) 를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 BglII 및 SmaI (Takara 사) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 pEGFP-N2 vector (Clontech 사) 에 도입하여, 클로닝을 실시하였다. 발현 플라스미드는 FastGene Xpress Plasmid PLUS Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 추출하고, 실험에 제공할 때까지 -30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제조한 발현 플라스미드를 pEGFP-N2-ovPD-1 로 표기하였다.
프라이머 (ovPD-1-EGFP F) : GAAGATCTATGGGGACCCCGCGGGCGCCG (서열 번호 73)
프라이머 (ovPD-1-EGFP R) : GACCCGGGGAGGGGCCAGGAGCAGTGTCC (서열 번호 74)
5 × 104/㎠ 의 COS-7 세포를 6 웰 플레이트에 계대하고, 10 ％ 비동화 소 태자 혈청 (Invitrogen 사), 0.01 ％ L-글루타민 (Life Technologies 사) 을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 37 ℃, 5 ％ CO2 존재하에서 하룻밤 배양하였다. pEGFP-N2-ovPD-1 혹은 음성 대조로서 pEGFP-N2 0.4 ㎍/㎠ 를 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 사) 을 사용하여, COS-7 세포에 각각 도입하여 48 시간 배양하였다 (ovPD-1-EGFP 발현 세포). 제조한 발현 세포에 있어서의 양 PD-1 의 발현을 확인하기 위해서, 올인원 형광 현미경 BZ-9000 (KEYENCE 사) 에 의해, EGFP 의 세포 내 국재를 가시화하였다.
1.3. 양 PD-1 에 대한 래트 항소 PD-1 항체 5D2 의 반응성 (도 9)
양 PD-1 에 래트 항소 PD-1 모노클로날 항체가 교차 반응하는 것을 플로 사이토메트리법에 의해 확인하였다. 양 PD-1-EGFP 발현 COS-7 세포를 10 ％ 비동화 염소 혈청 (Invitrogen 사) 첨가 PBS 를 사용하여 실온에서 15 분간 블로킹하고, 10 ㎍/ml 의 래트 항소 PD-1 항체 5D2 를 실온에서 30 분간 반응시키고, 세정한 후에 APC 표지 항래트 Ig 염소 항체 (Beckman Coulter 사) 를 실온에서 30 분간 반응시켰다. 음성 대조 항체로서, 래트 IgG2a(κ) 아이소타입 컨트롤 (BD Biosciences 사) 을 사용하였다. 해석에는 FACS Verse (BD Biosciences 사) 를 사용하였다. 또한, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 1 ％ 소 혈청 알부민 (Sigma-Aldrich 사) 첨가 PBS 를 사용하였다.
실험 결과를 도 9 에 나타낸다. 래트 항소 PD-1 항체 5D2 는, 양 PD-1 발현 세포에 결합하는 것이 확인되었다.
1.4. 물소의 림프구에 대한 래트 항소 PD-1 항체 5D2 의 반응성 (도 10)
물소 (Bubalus bubalis ; 아시아물소) 의 말초혈로부터, Percoll (GE Healthcare 사) 을 사용한 밀도 구배 원심법에 의해 말초혈 단핵구 (PBMC) 를 분리하였다. 분리한 물소 PBMC 를 10 ％ 비동화 소 태자 혈청 (Cell Culture Technologies 사), 페니실린 200 U/ml, 스트렙토마이신 200 ㎍/ml, 0.01 ％ L-글루타민 (Life Technologies 사) 을 포함하는 RPMI 1640 배지 (Sigma-Aldrich 사) 에 현탁하고, 2 × 106 개/ml 로 조정하였다. 이 PBMC 에 phorbol 12-myristate acetate (PMA) 20 ng/ml 및 ionomycin 1 ㎍/ml (Sigma-Aldrich 사) 를 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 2 일간 배양하였다. 배양한 PBMC 를 회수하고, 10 ％ 비동화 염소 혈청 (Invitrogen 사) 첨가 PBS 를 사용하여 실온에서 15 분간 블로킹하고, 래트 항소 PD-1 항체 5D2, 마우스 항소 CD8 항체 (38.65, AbD Serotec 사) 를 실온에서 30 분간 반응시켰다. 음성 대조 항체로서, 래트 IgG2a(κ) 아이소타입 컨트롤 (BD Biosciences 사) 을 사용하였다. 세정 후, APC 표지 염소 항래트 Ig 항체 (Beckman Coulter 사), PE 표지 염소 항마우스 IgG 항체 (Beckman Coulter 사) 를 실온에서 30 분간 반응시켰다. 추가로 세정 후, Alexa Flour488 표지 마우스 항소 CD4 항체 (CC30, AbD Serotec 사) 및 PE/Cy7 표지 항소 IgM 마우스 항체 (IL-A30, AbD Serotec 사) 를 실온에서 30 분간 반응시켰다. 항체의 표지에는 Zenon Mouse IgG1 Labeling Kits (Life Technologies 사) 또는 Lightning-Link Kits (Innova Biosciences 사) 를 사용하였다. 해석에는 FACS Verse (BD Biosciences 사) 를 사용하였다. 또한, 모든 세정 조작 및 항체의 희석에는, 10 ％ 비동화 염소 혈청 (Invitrogen 사) 첨가 PBS 를 사용하였다.
실험 결과를 도 10 에 나타낸다. 래트 항소 PD-1 항체 5D2 는, PMA/ionomycin 자극에 의해 활성화시킨 물소의 CD4+ T 세포 (IgM-CD4+) 및 CD8+ T 세포 (IgM-CD8+) 에 강하게 결합하였다.
〔실시예 3〕야생형 또는 변이형 소 IgG1 을 갖는 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체의 소 Fcγ 수용체에 대한 결합성
서론
실시예 1 에서는, 소의 감염증에 대한 신규 치료법의 수립을 목적으로 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체를 수립하였다. 이때, 키메라 항체를 개재한 ADCC 활성을 억제하기 위해서, 소 IgG1 CH2 도메인의 Fcγ 수용체 예상 결합 부위에 변이를 가하였다 (도 1, 도 11). 본 실시예에서는, 이 아미노산 변이의 효과를 검토하기 위해서, 변이형 소 IgG1 (상기 서술, IgG1 ADCC-) 과 야생형 소 IgG1 (IgG1 WT) 을 갖는 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체를 제조하고, 이미 알려진 소 Fcγ 수용체에 대한 결합성을 확인하였다.
재료, 방법, 및 실험 결과
2.1. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 발현 벡터의 제조
야생형 소 IgG1 (IgG1 WT) 또는 변이형 소 IgG1 (상기 서술, IgG1 ADCC-) 을 갖는, 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 를 수립하였다.
실시예 1 에 기재한 순서에 따라, 변이형 IgG1 (IgG1 ADCC-) 을 갖는 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 를 코드하는 발현 플라스미드를 제조하였다 (서열 번호 9 및 10 (아미노산 서열), 서열 번호 14 및 15 (코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열). 또한, ch5D2 IgG1 ADCC- 에 사용한 소 IgG1 에는 ADCC 활성을 억제하기 위해서, CH2 도메인의 Fcγ 수용체 예상 결합 부위에 변이를 가하였다 (도 1 및 도 11 참조. 아미노산 번호 및 변이 : 251 E → P, 252 L → V, 253 P → A, 254 G → 삭제, 348 A → S, 349 P → S ; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology, 142 (4) : 551 - 561 ; Aug. 2014.). 이후, 제조한 발현 플라스미드를 pDN112-boPD-1ch5D2 IgG1 ADCC- 로 표기한다.
이하의 순서에 따라, 야생형 IgG1 (IgG1 WT) 을 갖는 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 를 코드하는 발현 플라스미드를 제조하였다. 먼저 야생형의 소 IgG1 (GenBank accession number X62916) 정상 영역의 유전자를 증폭하기 위해, 합성한 소 PBMC 유래 cDNA 를 주형으로, 5′말단 측에 제한 효소 NheI 및 XbaI 인식 부위를 부가하여 설계한 프라이머 (boIgG1 CH1 F 및 boIgG1 CH3 R) 를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 증폭한 유전자 사슬을 NheI (Takara 사) 및 XbaI (Takara 사) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 pDN112-boPD-1ch5D2 IgG1 ADCC- 에 도입하고, 클로닝을 실시하였다. 또한, 이 플라스미드를 QIAGEN Plasmid Midi kit (Qiagen 사) 를 사용하여 정제하고, NotI (Takara 사) 및 XbaI (Takara 사) 에 의해 처리하여, ch5D2 의 경사슬 (서열 번호 9 (아미노산 서열), 서열 번호 14 (뉴클레오티드 서열)) 및 중사슬 (IgG1 WT) (서열 번호 75 (아미노산 서열), 서열 번호 76 (뉴클레오티드 서열)) 의 발현 카세트를 얻었다. 이 유전자 단편을 FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 발현 플라스미드 pDC6 (홋카이도 대학 인수 공통 감염증 리서치 센터 스즈키 야스히코 교수로부터 분여) 의 클로닝 사이트 (PCMV 하류, INRBG 와 PABGH 의 사이에 있는 NotI 및 XbaI 제한 효소 인식 서열) 에 도입하고, 클로닝을 실시하였다 (도 12). 얻어진 목적의 발현 플라스미드는 QIAGEN Plasmid Midi kit (Qiagen 사) 를 사용하여 추출하고, 실험에 제공할 때까지 -30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제조한 발현 플라스미드를 pDC6-boPD-1ch5D2 IgG1 WT 로 표기한다.
프라이머 (boIgG1 CH1 F) : CTAGCTAGCACCACAGCCCCGAAAGTCT (서열 번호 77)
프라이머 (boIgG1 CH3 R) : TGCTCTAGATTATTTACCCGCAGACTTAGA (서열 번호 78)
2.2. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체의 발현 및 정제
7.5 × 107 개의 Expi293F 세포 (Life Technologies 사) 에 30 ㎍ 의 pDC6-boPD-1ch5D2 IgG1 WT 혹은 pDN112-boPD-1ch5D2 IgG1 ADCC- 를 Expifectamine (Life Technologies 사) 을 사용하여 도입하고, 5 ∼ 7 일간 진탕 배양을 실시하여 배양 상청을 회수하였다. 배양 상청으로부터 Ab Capcher Extra (ProteNova 사) 를 사용하여 각 키메라 항체를 정제하였다. 레진에의 결합은 오픈 칼럼법을 이용하고, 평형화 버퍼 및 세정 버퍼로서 1.5 M Glycine/3 M NaCl (pH 8.0) 을 사용하였다. 용출 버퍼로는 0.1 M Glycine-HCl (pH 2.8) 을, 중화 버퍼로는 1 M Tris (pH 9.0) 를 사용하였다. 정제한 항체는, PD-10 Desalting Column (GE Healthcare 사) 및 Amicon Ultra-15 (50 kDa, Millipore 사) 를 사용하여, PBS (pH 7.4) 로의 버퍼 치환 및 농축을 실시하였다. 정제한 키메라 항체는, 0.22 ㎛ 시린지 필터 (Pall Life Sciences 사) 를 통과시켜 멸균하고, 실험에 제공할 때까지 4 ℃ 에서 보존하였다. 정제 후의 각 키메라 항체 농도는, Nanodrop8000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific 사) 를 사용하여 측정한 흡광도 (280 nm) 에 의해 정량하였다.
2.3. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체의 정제 순도의 확인 (도 13)
정제한 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 (ch5D2 IgG1 WT 및 ch5D2 IgG1 ADCC-) 의 순도를 확인하기 위해, SDS-PAGE 및 CBB 염색에 의해 항체 단백질의 검출을 실시하였다. 정제한 각 키메라 항체를 Laemmli Sample Buffer (Bio-Rad 사) 에 현탁하고, 환원 조건하 (2-메르캅토에탄올 (Sigma-Aldrich 사) 에 의해 환원) 또는 비환원 조건하에서 변성 처리 (95 ℃, 5 분) 를 실시하였다. 조제한 샘플은 SuperSep Ace 5 ％ - 20 ％ 그레이디언트 폴리아크릴아미드 겔 (와코 준야쿠 공업사) 을 사용하여 전기 영동하였다. 이때, 분자량 마커로서 Precision Plus Protein All Blue Standards (Bio-Rad 사) 를 사용하였다. 영동 후, Quick-CBB (와코 준야쿠 공업사) 에 의해 겔의 염색을 실시하고, 계속해서 증류수 중에서 탈색을 실시하였다.
결과를 도 13 에 나타낸다. 환원 조건에서는 25 kDa (경사슬) 및 50 kDa (중사슬), 비환원 조건에서는 150 kDa 의 상정된 위치에 ch5D2 IgG1 WT 및 ch5D2 IgG1 ADCC- 의 밴드가 확인되었다.
2.4. 가용성 소 Fcγ 수용체 (FcγR) 의 구축
이하의 순서에 따라, 소 FcγRI-His, FcγRII-His, FcγRIII-His 및 Fcγ2 R-His 발현 플라스미드를 구축하였다. 소 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 Fcγ2R (GenBank accession number NM_174538, NM_174539, NM_001077402및 NM_001001138) 의 시그널 펩티드 및 세포 외 영역을 증폭하도록, 5′말단 측에 제한 효소 NotI 및 XhoI 인식 부위를 부가한 프라이머 (boFcγRI-His F 및 R, boFcγRIII-His F 및 R, 또는 boFcγ2R-His F 및 R) 혹은 5′말단 측에 제한 효소 NheI 및 EcoRV 인식 부위를 부가한 프라이머 (boFcγRIII-His F 및 R) 를 설계하였다. 또한, 리버스 프라이머에는 6 × 히스티딘 (His) 태그를 코드하는 유전자 서열을 부가하였다. 합성한 소 PBMC 유래 cDNA 를 주형으로 PCR 을 실시하고, 각각의 PCR 산물을 NotI (Takara 사) 및 XhoI (Takara 사) (FcγRI-His, FcγRIII-His 및 Fcγ2R-His) 혹은 NheI (Takara 사) 및 EcoRV (Takara 사) (FcγRII-His) 에 의해 처리한 후, FastGene Gel/PCR Extraction Kit (NIPPON Genetics 사) 를 사용하여 정제하고, 동일한 제한 효소 처리를 실시한 pCXN2.1(+) vector (Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Gene, 108 (2) : 193 - 199 ; Dec. 15, 1991 ; 쥰텐도 대학 대학원 의학 연구과 요코미 타케히코 교수로부터 분여) 에 도입하고, 클로닝을 실시하였다. 발현 플라스미드는 FastGene Xpress Plasmid PLUS Kit (NIPPON Genetics 사) 에 의해 정제하고, 실험에 제공할 때까지 -30 ℃ 에서 보존하였다. 이후, 제조한 발현 플라스미드를 pCXN2.1-boFcγRI-His, pCXN2.1-boFcγRII-His, pCXN2.1-boFcγRIII-His 혹은 pCXN2.1-boFcγ2R-His 로 표기한다.
프라이머 (boFcγRI-His F) : ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGTGGCTCATAATAGCTCT (서열 번호 79)
프라이머 (boFcγRI-His R) : GCCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGAGGAGTTGTTGACTGGAGGC (서열 번호 80)
프라이머 (boFcγRII-His F) : ATAAGAATGCTAGCCACCATGGGGATCCCCTCATTCCT (서열 번호 81)
프라이머 (boFcγRII-His R) : GCCGATATCTTAATGGTGATGGTGATGGTGCGATGAGGGGCCGCTCGAGC (서열 번호 82)
프라이머 (boFcγRIII-His F) : ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGTGGCAACTGCTACCACC (서열 번호 83)
프라이머 (boFcγRIII-His R) : GCCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGGTGCCAAGGTAGAAAGAATG (서열 번호 84)
프라이머 (boFcγ2R-His F) : ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGGCCCCCACCCTCCCTGCCTTGCTCT (서열 번호 85)
프라이머 (boFcγ2R-His R) : GCCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGATTCTGCATCGTGTAGTCTG (서열 번호 86)
이하의 순서에 따라, 가용성 소 FcγRI-His, FcγRII-His, FcγRIII-His 및 Fcγ2R-His 발현 세포를 제조하였다. 7.5 × 107 개의 Expi293F 세포 (Life Technologies 사) 에 30 ㎍ 의 pCXN2.1-boFcγRI-His, pCXN2.1-boFcγRII-His, pCXN2.1-boFcγRIII-His 혹은 pCXN2.1-boFcγ2R-His 를 Expifectamine (Life Technologies 사) 을 사용하여 도입하고, 5 ∼ 7 일간 진탕 배양을 실시하여 배양 상청을 회수하였다. 배양 상청으로부터 TALON Metal Affinity Resin (Clontech 사) 을 사용하여 재조합 단백질을 정제하였다. 정제 후, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit (10 kDa, Millipore 사) 에 의해 버퍼를 PBS (pH 7.4) 로 치환하고, 실험에 제공할 때까지 -30 ℃ 에서 보존하였다 (소 PD-1-His). 정제 후의 소 FcγRI-His, FcγRII-His, FcγRIII-His 및 Fcγ2R-His 농도는, Nanodrop8000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific 사) 를 사용하여 측정한 흡광도 (280 nm) 에 의해 정량하였다.
2.5. 래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 IgG1 WT 및 IgG1 ADCC- 의 소 FcγR 에 대한 결합성 (도 14)
래트-소 키메라 항소 PD-1 항체 ch5D2 IgG1 WT 또는 IgG1 ADCC- 를 최종 농도, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.5610 nM 으로 Nunc MaxiSorp ELISA 플레이트 (Nunc 사) 에서 37 ℃ 에서 2 시간 고상화하였다. 그 후, 각 웰을 0.05 ％ Tween20 첨가 PBS (PBS-T) 200 μl 로 5 회 세정하고, SuperBlock (PBS) Blocking Buffer (Thermo Fisher Scientific 사) 를 사용하여 37 ℃ 에서 30 분간 블로킹을 실시하였다. 재차 동일하게 세정을 실시하고, 소 FcγRI-His, FcγRII-His, FcγRIII-His 또는 Fcγ2R-His 를 최종 농도 10 ㎍/ml 로 각 웰에 첨가하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 세정 후에, 항폴리히스티딘 태그 마우스 모노클로날 항체 (Abcam 사) 를 37 ℃ 에서 30 분간 반응시켰다. 다음으로, 각 웰을 세정하고, Horseradish peroxidase 표지 항마우스 IgG 염소 폴리클로날 항체 (MP Biomedicals 사) 를 37 ℃ 에서 30 분간 반응시켰다. 재차 각 웰을 세정하고, TMB One Component Substrate (Bethyl 사) 를 첨가하여, 발색을 실시하였다. 그 후, 0.18 M 묽은 황산으로 효소 반응을 정지시키고, Microplate Reader MTP-900 (코로나 전기사) 을 사용하여 흡광도 (450 nm) 를 측정하였다. 플레이트의 각 세정 조작에는, Auto Plate Washer BIO WASHER 50 (DS Pharma Biomedical 사) 을 사용하였다.
실험 결과를 도 14 에 나타낸다. IgG1 WT 는 소 FcγRI-His 에 강하게 결합하고, 소 FcγRII-His 에는 약하게 결합하였다. 한편, IgG1 ADCC- 는 소 FcγRI-His 및 FcγRII-His 와 결합하지 않았다. 또, IgG1 WT 및 IgG1 ADCC- 모두 소 FcγRIII-His 및 소 Fcγ2R-His 와의 결합은 보이지 않았다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 받아들이는 것으로 한다.
산업상 이용가능성
본 발명의 항 PD-1 항체는, 동물의 암이나 감염증의 예방 및/또는 치료에 이용할 수 있다.
서열표 프리텍스트
＜서열 번호 1＞
서열 번호 1 은, 래트 항소 PD-1 항체의 L 사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. 밑줄부 : NH2 말단으로부터 순서대로 CDR1, CDR2, CDR3.
Figure pct00007
＜서열 번호 2＞
서열 번호 2 는, 래트 항소 PD-1 항체의 H 사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. 밑줄부 : NH2 말단으로부터 순서대로 CDR1, CDR2, CDR3.
Figure pct00008
＜서열 번호 3＞
서열 번호 3 은, 소 항체의 L 사슬 정상 영역 (소 Ig lambda, GenBank : X62917) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
Figure pct00009
＜서열 번호 4＞
서열 번호 4 는, 소 항체의 H 사슬 정상 영역 (소 IgG1, GenBank : X62916 을 개변) 의 아미노산 서열을 나타낸다. 변이 지점에 밑줄을 그었다. 아미노산 번호 및 변이 : 123 E → P, 124 L → V, 125 P → A, 126 G → 삭제, 218 A → S, 219 P → S
Figure pct00010
＜서열 번호 5＞
서열 번호 5 는, 래트 항소 PD-1 항체의 L 사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
Figure pct00011
서열 번호 5 의 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열을 ＜서열 번호 11＞ 에 나타낸다.
Figure pct00012
＜서열 번호 6＞
서열 번호 6 은, 래트 항소 PD-1 항체의 H 사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
Figure pct00013
서열 번호 6 의 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열을 ＜서열 번호 12＞ 에 나타낸다.
Figure pct00014
＜서열 번호 7＞
서열 번호 7 은, 소 항체의 L 사슬 정상 영역 (소 Ig lambda, GenBank : X62917) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
Figure pct00015
서열 번호 7 의 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열을 ＜서열 번호 13＞ 에 나타낸다.
Figure pct00016
＜서열 번호 8＞
서열 번호 8 은, 소 항체의 H 사슬 정상 영역 (소 IgG1, GenBank : X62916 을 개변) 의 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후) 을 나타낸다.
Figure pct00017
＜서열 번호 9＞
서열 번호 9 는, 래트 항소 PD-1 항체의 L 사슬 가변 영역과 소 항체의 L 사슬 정상 영역으로 이루어지는 키메라 L 사슬의 아미노산 서열을 나타낸다.
Figure pct00018
＜서열 번호 10＞
서열 번호 10 은, 래트 항소 PD-1 항체의 H 사슬 가변 영역과 소 항체의 H 사슬 정상 영역 (소 IgG1, GenBank : X62916 을 개변) 으로 이루어지는 키메라 H 사슬의 아미노산 서열을 나타낸다.
Figure pct00019
＜서열 번호 14＞
래트 항소 PD-1 항체의 L 사슬 가변 영역과 소 항체의 L 사슬 정상 영역으로 이루어지는 키메라 L 사슬의 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열) 을 나타낸다.
Figure pct00020
＜서열 번호 15＞
래트 항소 PD-1 항체의 H 사슬 가변 영역과 소 항체의 H 사슬 정상 영역 (소 IgG1, GenBank : X62916 을 개변) 으로 이루어지는 키메라 H 사슬의 뉴클레오티드 서열 (코돈 최적화 후 뉴클레오티드 서열) 을 나타낸다.
Figure pct00021
＜서열 번호 16＞
서열 번호 16 은, 래트 항소 PD-1 항체 5D2 의 L 사슬 가변 영역의 CDR1 의 아미노산 서열 (QSLEYSDGYTY) 을 나타낸다.
＜서열 번호 17＞
서열 번호 17 은, 래트 항소 PD-1 항체 5D2 의 L 사슬 가변 영역의 CDR3 의 아미노산 서열 (FQATHDPDT) 을 나타낸다.
＜서열 번호 18＞
서열 번호 18 은, 래트 항소 PD-1 항체 5D2 의 H 사슬 가변 영역의 CDR1 의 아미노산 서열 (GFSLTSYY) 을 나타낸다.
＜서열 번호 19＞
서열 번호 19 는, 래트 항소 PD-1 항체 5D2 의 H 사슬 가변 영역의 CDR2 의 아미노산 서열 (IRSGGST) 을 나타낸다.
＜서열 번호 20＞
서열 번호 20 은, 래트 항소 PD-1 항체 5D2 의 H 사슬 가변 영역의 CDR3 의 아미노산 서열 (ARTSSGYEGGFDY) 을 나타낸다.
＜서열 번호 21＞
서열 번호 21 은, 소 항체 (IgG1 variant 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 22＞
서열 번호 22 는, 소 항체 (IgG1 variant 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 23＞
서열 번호 23 은, 소 항체 (IgG1 variant 3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 24＞
서열 번호 24 는, 소 항체 (IgG2 variant 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 25＞
서열 번호 25 는, 소 항체 (IgG2 variant 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 26＞
서열 번호 26 은, 소 항체 (IgG2 variant 3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 27＞
서열 번호 27 은, 소 항체 (IgG3 variant 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 28＞
서열 번호 28 은, 소 항체 (IgG3 variant 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 29＞
서열 번호 29 는, 소 항체 (IgG1 variant 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 30＞
서열 번호 30 은, 소 항체 (IgG1 variant 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 31＞
서열 번호 31 은, 소 항체 (IgG1 variant 3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 32＞
서열 번호 32 는, 소 항체 (IgG2 variant 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 33＞
서열 번호 33 은, 소 항체 (IgG2 variant 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 34＞
서열 번호 34 는, 소 항체 (IgG2 variant 3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 35＞
서열 번호 35 는, 소 항체 (IgG3 variant 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 36＞
서열 번호 36 은, 소 항체 (IgG3 variant 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 37＞
서열 번호 37 은, 양 항체 (IgG1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 38＞
서열 번호 38 은, 양 항체 (IgG1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 39＞
서열 번호 39 는, 양 항체 (IgG2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 40＞
서열 번호 40 은, 양 항체 (IgG2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 41＞
서열 번호 41 은, 양 항체의 L 사슬 (Ig kappa(CK)) 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 42＞
서열 번호 42 는, 양 항체의 L 사슬 (Ig kappa(CK)) 정상 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 43＞
서열 번호 43 은, 양 항체의 L 사슬 (Ig lambda(CL)) 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 44＞
서열 번호 44 는, 양 항체의 L 사슬 (Ig lambda(CL)) 정상 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 45＞
서열 번호 45 는, 물소 항체 (IgG1 로 추정된다) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 46＞
서열 번호 46 은, 물소 항체 (IgG1 로 추정된다) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 47＞
서열 번호 47 은, 물소 항체 (IgG2 로 추정된다) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 48＞
서열 번호 48 은, 물소 항체 (IgG2 로 추정된다) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 49＞
서열 번호 49 는, 물소 항체 (IgG3 으로 추정된다) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 50＞
서열 번호 50 은, 물소 항체 (IgG3 으로 추정된다) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 51＞
서열 번호 51 은, 물소 항체의 L 사슬 (Ig lambda 로 추정된다) 정상 영역 (CL) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 52＞
서열 번호 52 는, 물소 항체의 L 사슬 (Ig lambda 로 추정된다) 정상 영역 (CL) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 53＞
서열 번호 53 은, 인간 항체 (IgG4 variant 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 54＞
서열 번호 54 는, 인간 항체 (IgG4 variant 1) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 55＞
서열 번호 55 는, 인간 항체 (IgG4 variant 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 56＞
서열 번호 56 은, 인간 항체 (IgG4 variant 2) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 57＞
서열 번호 57 은, 인간 항체 (IgG4 variant 3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 58＞
서열 번호 58 은, 인간 항체 (IgG4 variant 3) 의 H 사슬 정상 영역 (CH1 ∼ CH3) 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 59＞
서열 번호 59 는, 인간 항체의 L 사슬 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 60＞
서열 번호 60 은, 인간 항체의 L 사슬 정상 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 61 ∼ 74＞
서열 번호 61 ∼ 74 는, 순서대로, 프라이머 boPD-1-myc F, boPD-1-myc R, boPD-L1-EGFP F, boPD-L1-EGFP R, boPD-1-His F, boPD-1-His R, ovPD-1 CDS F, ovPD-1 CDS R, buPD-1 CDS F1, buPD-1 CDS R1, buPD-1 CDS F2, buPD-1 CDS R2, ovPD-1-EGFP F 및 ovPD-1-EGFP R 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
＜서열 번호 75＞
서열 번호 75 는, 래트 항소 PD-1 항체의 H 사슬 가변 영역과 소 항체의 H 사슬 정상 영역 (소 IgG1, GenBank : X62916) 으로 이루어지는 키메라 H 사슬의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
Figure pct00022
＜서열 번호 76＞
서열 번호 75 는, 래트 항소 PD-1 항체의 H 사슬 가변 영역과 소 항체의 H 사슬 정상 영역 (소 IgG1, GenBank : X62916) 으로 이루어지는 키메라 H 사슬의 아미노산 서열을 나타낸다.
Figure pct00023
＜서열 번호 77 ∼ 86＞
서열 번호 77 ∼ 86 은, 순서대로, 프라이머 boIgG1 CH1 F, boIgG1 CH3 R, boFcγRI-His F, boFcγRI-His R, boFcγRII-His F, boFcγRII-His R, boFcγRIII-His F, boFcγRIII-His R, boFcγ2R-His F 및 boFcγ2R-His R 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAISO UNIVERSITY <120> Anti-PD-1 antibodies <130> FP-222PCT <150> JP P2016-159090 <151> 2016-08-15 <150> JP P2017-099615 <151> 2017-05-19 <160> 86 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 131 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 1 Met Lys Val Pro Gly Arg Leu Leu Val Leu Leu Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Ser Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Val Ser Leu Ser Val 20 25 30 Thr Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Glu Tyr Ser Asp Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gln Ala Thr His Asp Pro Asp Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Leu Lys 130 <210> 2 <211> 138 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2 Met Ala Ile Leu Val Leu Leu Leu Cys 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Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp Trp 180 185 190 Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu Pro 195 200 205 Ser Ser Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Pro Ala Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser 225 230 235 240 Thr Val Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr 260 265 270 Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ala Asp Ser Ser Tyr Phe Leu Tyr 275 280 285 Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr 290 295 300 Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 305 310 315 320 Ser Thr Ser Lys Ser Ala Gly Lys 325 <210> 5 <211> 393 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 5 atgaaagtgc ctggtaggct gctggtgctg ttgttttgga ttccagcttc caggagtgat 60 gttgtgttga cacaaactcc agtttccctg tctgtcacac ttggagatca agcttctata 120 tcttgcaggt ctagtcagag cctggaatat agtgatggat acacttattt ggaatggtac 180 ctacagaagc caggccagtc tccacagctc ctcatctatg gagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcat tggcagtggg tcagggacag atttcaccct caagatcagc 300 agagtagagc ctgaggactt gggagtttat tactgcttcc aagctacaca tgatccggac 360 acgtttggag ctgggaccaa gctggaactg aaa 393 <210> 6 <211> 414 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 6 atggctatcc tggtgctgct tctctgcctg gtgaccattc cacactctgt cttgtcccag 60 gtgcagctga aggagacagg acctggcctg gtgcaaccaa cacagaccct gtccatcaca 120 tgtactgttt ctgggttctc attaaccagc tattatatac agtgggttcg ccagactcca 180 ggaaagggac tagaatggat gggatttata cggagtggtg gaagcacaga gtataattca 240 gagttcaaat cccgacttag catcaacagg gacacctcca agaaccaagt tttcttaaaa 300 atgaacagtc tgaaaacaga ggacacaggc gtgtactact gtgccagaac ctcttcgggg 360 tacgaagggg gttttgatta ctggggccaa ggagtcatgg tcacagtctc ctca 414 <210> 7 <211> 318 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 7 cagcccaagt ccccaccctc ggtcaccctg ttcccgccct ccacggagga gctcaacggc 60 aacaaggcca ccctggtgtg tctcatcagc gacttctacc cgggtagcgt gaccgtggtc 120 tggaaggcag acggcagcac catcacccgc aacgtggaga ccacccgggc ctccaaacag 180 agcaacagca agtacgcggc cagcagctac ctgagcctga cgagcagcga ctggaaatcg 240 aaaggcagtt acagctgcga ggtcacgcac gaggggagca ccgtgacgaa gacagtgaag 300 ccctcagagt gttcttag 318 <210> 8 <211> 987 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized sequence <400> 8 gctagcacca cagcacctaa agtttaccct ctgtcttcct gctgcggcga caagtcttca 60 tcaactgtta ctcttggatg cctggtctca agttacatgc ccgagcccgt gacagtgacc 120 tggaactcag gcgctctgaa gtctggagtg cacacatttc cagctgtgct tcagtctagc 180 ggcctgtatt ccctcagctc tatggttact gtacctggta gcaccagcgg acagactttc 240 acctgtaatg ttgcccatcc cgcatcttct accaaggtcg ataaagccgt tgaccccact 300 tgcaaaccat ccccttgtga ttgttgtcca ccccctccag tggctggccc ttccgtcttc 360 attttccctc ctaaacctaa ggatactctg accatctcag ggacacccga ggtcacctgt 420 gtcgtcgtgg acgtgggaca tgacgaccca gaagtcaagt tctcatggtt cgtggacgat 480 gtggaggtga acacagcaac aacaaagccc agagaagaac agtttaacag cacatatcgg 540 gtggtcagcg ccttgcgtat tcagcaccag gactggactg gtggcaagga gtttaagtgc 600 aaggtgcata acgaaggtct gccctcttct atagtgagaa ctatctcccg aactaagggc 660 cccgctcggg agccccaggt ttacgtcctt gctccccctc aggaggaact gagtaaatca 720 accgtgagtc tcacctgtat ggttacctca ttttacccag actacatcgc cgtagagtgg 780 cagaggaatg gacagccaga gtctgaggac aaatacggca ctactcctcc ccaactggat 840 gccgactctt cctacttcct ctactccaaa ttgcgagttg accggaactc atggcaggag 900 ggggacacat acacatgcgt cgttatgcac gaggccctgc acaaccatta cacccagaag 960 tccacatcta aaagtgcagg taagtaa 987 <210> 9 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric L chain <400> 9 Met Lys Val Pro Gly Arg Leu Leu Val Leu Leu Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Ser Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Val Ser Leu Ser Val 20 25 30 Thr Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Glu Tyr Ser Asp Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser 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gatacttcca agaatcaggt gttcttgaag 300 atgaactccc tcaagaccga agatacaggg gtctattact gcgccaggac ctccagtgga 360 tatgaaggag gctttgatta ttgggggcag ggcgtcatgg taactgtgag ctcagctagc 420 accacagcac ctaaagttta ccctctgtct tcctgctgcg gcgacaagtc ttcatcaact 480 gttactcttg gatgcctggt ctcaagttac atgcccgagc ccgtgacagt gacctggaac 540 tcaggcgctc tgaagtctgg agtgcacaca tttccagctg tgcttcagtc tagcggcctg 600 tattccctca gctctatggt tactgtacct ggtagcacca gcggacagac tttcacctgt 660 aatgttgccc atcccgcatc ttctaccaag gtcgataaag ccgttgaccc cacttgcaaa 720 ccatcccctt gtgattgttg tccaccccct ccagtggctg gcccttccgt cttcattttc 780 cctcctaaac ctaaggatac tctgaccatc tcagggacac ccgaggtcac ctgtgtcgtc 840 gtggacgtgg gacatgacga cccagaagtc aagttctcat ggttcgtgga cgatgtggag 900 gtgaacacag caacaacaaa gcccagagaa gaacagttta acagcacata tcgggtggtc 960 agcgccttgc gtattcagca ccaggactgg actggtggca aggagtttaa gtgcaaggtg 1020 cataacgaag gtctgccctc ttctatagtg agaactatct cccgaactaa gggccccgct 1080 cgggagcccc aggtttacgt ccttgctccc cctcaggagg 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110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 54 <211> 690 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 60 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 120 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 180 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 240 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 300 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 360 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 420 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 480 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 540 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 600 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 660 aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 690 <210> 55 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 56 <211> 690 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 gagtccaaat atggtccccc gtgcccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 60 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 120 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 180 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 240 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc gtgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 300 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 360 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 420 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 480 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 540 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 600 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 660 aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 690 <210> 57 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 <210> 58 <211> 654 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 60 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 120 cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180 ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240 caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 300 tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 360 ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540 accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa atga 654 <210> 59 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 60 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120 aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240 cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300 ttcaacaggg gagagtgtta g 321 <210> 61 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 atatgcggcc gcatggggac cccgcgggcg ct 32 <210> 62 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 gcgcaagctt tcagaggggc caggagcagt 30 <210> 63 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 ctagctagca ccatgaggat atatagtgtc ttaac 35 <210> 64 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 caatctcgag ttacagacag aagatgactg c 31 <210> 65 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 ataagaatgc ggccgccacc atggggaccc cgcgggcgct 40 <210> 66 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 gccctcgagt taatggtgat ggtgatggtg gatgaccagg ctctgcatct 50 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 atggggaccc cgcgggcgcc 20 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 tcagaggggc caggagcagt gtcca 25 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 atggggaccc cgcgggcgct 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 gatgaccagg ctctgcatct 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 aatgacagcg gcgtctactt 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 tcagaggggc caggagcagt 20 <210> 73 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 gaagatctat ggggaccccg cgggcgccg 29 <210> 74 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 gacccgggga ggggccagga gcagtgtcc 29 <210> 75 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding chimeric H chain <400> 75 atggcaatcc tcgtgttgct tctgtgcttg gtgaccattc cacactctgt gctttcccag 60 gtgcagctca aggaaacagg gccaggactc gtccaaccta cacaaaccct gtcaatcacc 120 tgtaccgtat ccggttttag cctcaccagc tattatatac aatgggtgag gcagaccccc 180 gggaaaggac tggaatggat gggcttcatt cgcagcggtg ggagtaccga gtacaatagc 240 gagtttaaaa gtcgcttgag tatcaataga gatacttcca agaatcaggt gttcttgaag 300 atgaactccc tcaagaccga agatacaggg gtctattact gcgccaggac ctccagtgga 360 tatgaaggag gctttgatta ttgggggcag ggcgtcatgg taactgtgag ctcagcctcc 420 accacagccc cgaaagtcta ccctctgagt tcttgctgcg gggacaagtc cagctccacc 480 gtgaccctgg gctgcctggt ctccagctac atgcccgagc cggtgaccgt gacctggaac 540 tcgggtgccc tgaagagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tccttcagtc ctccgggctg 600 tactctctca gcagcatggt gaccgtgccc ggcagcacct caggacagac cttcacctgc 660 aacgtagccc acccggccag cagcaccaag gtggacaagg ctgttgatcc cacatgcaaa 720 ccatcaccct gtgactgttg cccaccccct gagctccccg gaggaccctc tgtcttcatc 780 ttcccaccga aacccaagga caccctcaca atctcgggaa cgcccgaggt cacgtgtgtg 840 gtggtggacg tgggccacga tgaccccgag gtgaagttct cctggttcgt ggacgacgtg 900 gaggtaaaca cagccacgac gaagccgaga gaggagcagt tcaacagcac ctaccgcgtg 960 gtcagcgccc tgcgcatcca gcaccaggac tggactggag gaaaggagtt caagtgcaag 1020 gtccacaacg aaggcctccc ggcccccatc gtgaggacca tctccaggac caaagggccg 1080 gcccgggagc cgcaggtgta tgtcctggcc ccaccccagg aagagctcag caaaagcacg 1140 gtcagcctca cctgcatggt caccagcttc tacccagact acatcgccgt ggagtggcag 1200 agaaacgggc agcctgagtc ggaggacaag tacggcacga ccccgcccca gctggacgcc 1260 gacagctcct acttcctgta cagcaagctc agggtggaca ggaacagctg gcaggaagga 1320 gacacctaca cgtgtgtggt gatgcacgag gccctgcaca atcactacac gcagaagtcc 1380 acctctaagt ctgcgggtaa ataa 1404 <210> 76 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric H chain <400> 76 Met Ala Ile Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Ile Pro His Ser 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Thr Gly Pro Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Thr Gln Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Thr Ser Tyr Tyr Ile Gln Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Phe Ile Arg Ser Gly Gly Ser Thr Glu Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Glu Phe Lys Ser Arg Leu Ser Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Thr Ser Ser Gly Tyr Glu Gly Gly Phe Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro 130 135 140 Lys Val Tyr Pro Leu Ser Ser Cys Cys Gly Asp Lys Ser Ser Ser Thr 145 150 155 160 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr Met Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr 195 200 205 Val Pro Gly Ser Thr Ser Gly Gln Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala His 210 215 220 Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Ala Val Asp Pro Thr Cys Lys 225 230 235 240 Pro Ser Pro Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser 260 265 270 Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly His Asp Asp 275 280 285 Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val Asn Thr 290 295 300 Ala Thr Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu 325 330 335 Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg 340 345 350 Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Pro Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val 355 360 365 Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Val Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Met Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln 385 390 395 400 Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Gln Leu Asp Ala Asp Ser Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Arg Val 420 425 430 Asp Arg Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr Thr Cys Val Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Thr Ser Lys Ser 450 455 460 Ala Gly Lys 465 <210> 77 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 ctagctagca ccacagcccc gaaagtct 28 <210> 78 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 tgctctagat tatttacccg cagacttaga 30 <210> 79 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 ataagaatgc ggccgccacc atgtggctca taatagctct 40 <210> 80 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 gccctcgagt taatggtgat ggtgatggtg aggagttgtt gactggaggc 50 <210> 81 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 ataagaatgc tagccaccat ggggatcccc tcattcct 38 <210> 82 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 gccgatatct taatggtgat ggtgatggtg cgatgagggg ccgctcgagc 50 <210> 83 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 ataagaatgc ggccgccacc atgtggcaac tgctaccacc 40 <210> 84 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 gccctcgagt taatggtgat ggtgatggtg gtgccaaggt agaaagaatg 50 <210> 85 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 ataagaatgc ggccgccacc atggccccca ccctccctgc cttgctct 48 <210> 86 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 gccctcgagt taatggtgat ggtgatggtg attctgcatc gtgtagtctg 50

Claims (18)

  1. (a) QSLEYSDGYTY (서열 번호 16) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, GVS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 FQATHDPDT (서열 번호 17) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 정상 영역을 갖는 L 사슬과, (b) GFSLTSYY (서열 번호 18) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IRSGGST (서열 번호 19) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARTSSGYEGGFDY (서열 번호 20) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 정상 영역을 갖는 H 사슬을 포함하는 항 PD-1 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    L 사슬 가변 영역과 H 사슬 가변 영역이 래트에서 유래하는, 항 PD-1 항체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    L 사슬 가변 영역이 래트 항소 PD-1 항체의 L 사슬 가변 영역이고, H 사슬 가변 영역이 래트 항소 PD-1 항체의 H 사슬 가변 영역인, 항 PD-1 항체.
  4. 제 3 항에 있어서,
    L 사슬 가변 영역이 서열 번호 1 의 아미노산 서열을 갖고, H 사슬 가변 영역이 서열 번호 2 의 아미노산 서열을 갖는, 항 PD-1 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 정상 영역이, Lambda 사슬 또는 Kappa 사슬의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖는, 항 PD-1 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 정상 영역이, 인간의 IgG4 에 상당하는 면역 글로불린의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖거나, 혹은 ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 저하시키는 변이가 도입된 것인, 항 PD-1 항체.
  7. 제 6 항에 있어서,
    래트 이외의 동물이 소이고, 소 항체의 L 사슬 정상 영역이, Lambda 사슬의 정상 영역의 아미노산 서열을 갖고, 또한 소 항체의 H 사슬 정상 영역이, ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 저하시키는 변이가 도입된 것인, 항 PD-1 항체.
  8. 제 7 항에 있어서,
    소 항체의 L 사슬 정상 영역이 서열 번호 3 의 아미노산 서열을 갖고, 소 항체의 H 사슬 정상 영역이 서열 번호 4 의 아미노산 서열을 갖는, 항 PD-1 항체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    L 사슬 2 개와 H 사슬 2 개의 4 개 사슬 구조를 갖는, 항 PD-1 항체.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    암 및/또는 감염증의 예방 및/또는 치료를 위한, 의약 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    암 및/또는 감염증이, 종양성 질환, 백혈병, 요네병, 아나플라스마병, 세균성 유방염, 진균성 유방염, 마이코플라스마 감염증 (예를 들어, 마이코플라스마성 유방염, 마이코플라스마성 폐렴 등), 결핵, 소형 파이로플라스마병, 크립토스포리듐증, 콕시듐증, 트리파노소마병 및 리슈마니아증으로 이루어지는 군에서 선택되는, 의약 조성물.
  13. (a') QSLEYSDGYTY (서열 번호 16) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, GVS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 FQATHDPDT (서열 번호 17) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 정상 영역을 갖는 L 사슬을 코드하는 DNA 와, (b') GFSLTSYY (서열 번호 18) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IRSGGST (서열 번호 19) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARTSSGYEGGFDY (서열 번호 20) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 정상 영역을 갖는 H 사슬을 코드하는 DNA 를 포함하는 인공 유전자 DNA.
  14. 제 13 항에 기재된 인공 유전자 DNA 를 포함하는 벡터.
  15. 제 14 항에 기재된 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
  16. 제 15 항에 기재된 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 항 PD-1 항체를 채취하는 것을 포함하는 항체의 제조 방법.
  17. QSLEYSDGYTY (서열 번호 16) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, GVS 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 FQATHDPDT (서열 번호 17) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 L 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 L 사슬 정상 영역을 갖는 L 사슬을 코드하는 DNA.
  18. GFSLTSYY (서열 번호 18) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, IRSGGST (서열 번호 19) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 ARTSSGYEGGFDY (서열 번호 20) 의 아미노산 서열을 갖는 CDR3 을 포함하는 H 사슬 가변 영역과, 래트 이외의 동물 항체의 H 사슬 정상 영역을 갖는 H 사슬을 코드하는 DNA.
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