KR20120105050A - 유리체 대용물로서 사용하기 위한 가교 산화된 히알우론산 - Google Patents

유리체 대용물로서 사용하기 위한 가교 산화된 히알우론산 Download PDF

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Abstract

히드로겔 중합체를 포함하는 조성물이 개시되어 있다. 이 히드로겔 중합체는 산화된 히알우론산 및 디히드라지드를 포함하며, 상기 디히드라지드는 산화된 히알우론산을 가교한다. 상기 히드로겔 중합체는 다음 특성을 나타낸다: a) 투명성 및 무색이고; 또 b) 37℃에서 액체 상태로부터 겔-매트릭스로 전환한다. 이들 특징은 유리체액 대용물로서 유용하게 만든다.

Description

유리체 대용물로서 사용하기 위한 가교 산화된 히알우론산{Cross-linked oxidated hyaluronic acid for use as a vitreous substitute}
본 발명은 일반적으로 유리체 대용물, 더욱 상세하게는 유리체액 대용물, 및 그의 제조 방법과 그를 사용하는 방법에 관한 것이다.
유리체는 수정체 후방이고 망막 전방에 있는 눈의 유리체강(vitreous cavity) 내의 맑고, 투명한 젤라틴성 물질이다. 유리체는 안구 부피의 2/3를 점유하며 또 약 4 g의 중량을 가지며 또 약 4 ml의 부피를 갖는다. 유리체의 주요 성분은 물(98%), 콜라겐 피브릴, 글리코사미노글리칸, 히알우론산(HA) 및 기타 나머지 용질을 포함한다. 특정 질병, 연령 관련된 퇴행 또는 상처는 HA 퇴행 및 콜라겐 석출을 비롯한 유리체에서 병리학적 변화를 초래할 수 있고, 이는 매트릭스의 액화를 초래한다. 퇴행되거나 또는 액화된 유리체는 부유물(floater) 형성을 초래할 것이고, 결국 후방 유리체 박리와 망막 박리를 초래할 것이다.
임상 치료 중에서, 평면부 유리체절제술(pars plana virectomy: PPV)은 당뇨망막병증, 복합 망막 박리(예를 들어, 상처로 인한) 및 황반원공(macular hole)을 비롯한 다수의 안질환을 치료하기 위한 가장 중요한 수술 중의 하나이다. PPV 동안, 유리체는 절단되어 흡입된 다음, 가스(공기, 퍼플루오로프로판 또는 육플루오르화황) 또는 실리콘오일과 같은 유리체 대용물에 의해 전형적으로 치환된다. 유리체 대용물은 유리체강을 충전하기 위해 사용되어 유리체절제술 이후 망막 재부착을 돕기 위한 것이이다. 수술 후에, 유리체 대용물은 망막을 제자리에 유지할 수 있는 한편 망막과 망막 색소 상피(RPE) 세포 사이에 접착을 형성한다. 물보다 더 가벼운 가스는 박리된 망막을 평탄화하고 또 치료를 실시하는 동안 부착한 채로 유지하는 데 유용하다. 그러나, 가스가 사용될 때 수술 후 1주 이상 동안 복와위(face-down position)를 유지할 필요가 흔하다. 복합 망막 박리에 대하여 또는 수술 후에 제자리 잡을 수 없는 환자(예컨대, 어린이)에서 1960년 이후로 수술 후에 부착된 망막을 유지하기 위하여 가스 대신 실리콘오일이 때때로 사용될 수 있지만, 실리콘 오일이 이후에 제거되지 않으면 장기간 복합증이 생길 수 있다. 게다가, 실리콘 오일은 또한 각막 내피세포와 같은 안구 조직에 대하여 세포 독성일 수 있다.
최근, 폴리(비닐 알코올), 폴리(1-비닐-2-피롤리돈), 폴리(아크릴아미드), 폴리(글리세릴 메타크릴레이트), 폴리(메틸-2-아크릴아미도-2-메톡시아세테이트) 및 폴리(2-히드록시에틸아크릴레이트)를 비롯한 천연, 반합성 또는 합성 중합체를 사용하는 다수의 유리체 대용물이 조사되고 있다. 이상적인 유리체 대용물에 대한 기준은 청명성, 투명성, 굴절률, 탐폰 대용물로서 작용할 충분한 강성, 대사물질 이동을 허용하는 능력, 비흡수성 특징, 친수성 조성물 및 소형 게이지 바늘을 통하여 주사될 수 있는 능력을 포함한다. 이들 기준은 유리체 대용물에 대한 적절한 물질을 발견하는 것이 용이한 작업이 아니라는 것을 제시한다.
따라서, 당해 분야에서 지금껏 해결되지 않은 사항은 유리체 대용물와 관련한 상술한 결점과 단점을 해결할 필요성이 여전히 존재한다.
일 양태에서, 본 발명은 a) 산화된 히알우론산; 및 b) 산화된 히알우론산을 가교하는 디히드라지드를 포함하는 히드로겔 중합체를 포함하는 조성물로서, 상기 히드로겔 중합체는 a) 투명성 및 무색이며; 또 b) 37℃에서 액체 상태로부터 겔-매트릭스로 전환하는 특성을 나타낸다.
다른 양태에서, 본 발명은 산화된 히알우론산을 포함하는 제1 용액을 디히드라지드를 포함하는 제2 용액과 혼합하여 a) 산화된 히알우론산; 및 b) 산화된 히알우론산을 가교할 수 있는 디히드라지드를 포함하는 히드로겔 중합체를 포함하는 조성물을 형성하며; 상기 히드로겔 중합체는 a) 투명성 및 무색이며; 또 b) 37℃에서 액체 상태로부터 겔-매트릭스로 전환하는 특성을 나타내는, 상술한 바와 같은 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 a) 산화된 히알우론산; b) 디히드라지드; c) 완충액; 및 d) 상술한 바와 같은 조성물 제제에 대한 지시사항이 있는 팩케이지 삽입물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
더 다른 양태에서, 본 발명은 눈의 유리체강으로부터 유리체를 제거하고; 유리체를 공기로 치환하며; 또 상술한 바와 같은 소정 양의 조성물을 눈의 유리체강에 주입하며, 상기 조성물의 양은 공기를 치환하기에 충분한, 눈의 유리체를 치환하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식(I)의 히드로겔 중합체를 포함하며, 상기 중합체는 a) 투명성 및 무색이며; 또 b) 37℃에서 5분내에 액체 상태로부터 겔-매트릭스로 전환하는 특성을 나타내는 히드로겔인, 조성물에 관한 것이다:
화학식 (I)
Figure pct00001
식 중에서, m, n은 m≤ 5, 100≤ n ≤ 2500의 정수임.
상술한 양태 및 기타 양태는 이하의 도면과 더불어 이하의 바람직한 실시양태의 기재로부터 분명할 것이지만, 본 발명의 신규 개념의 정신과 범위로부터 벗어남 없이 변형과 변화가 가능할 수 있을 것이다.
첨부한 도면은 본 발명의 하나 이상의 구체예를 예시하며, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명할 것이다. 일 양태의 동일 또는 유사 요소에 대해서는 도면 전체에서 동일 참조 부호를 사용한다.
도 1a는 히알우론산(HA)이 과요오드화산 나트륨(NaIO4)에 의해 산화되는 것을 도시한다.
도 1b는 상이한 산화도(DO)를 갖는 산화된 히알우론산(oxi-HA)의 FTIR 스펙트럼이다: (i) HA 분말(DO: 0%), (ii) 낮은 oxi-HA(DO: 27.3%), (iii) 중간정도의 oxi-HA(DO: 44.3%) 및 (iv) 높은 oxi-HA(DO: 60.4%). 화살표는 1725 cm-1 및 836 cm-1에서 oxi-HA의 알데히드 작용기 및 1147 cm-1 및 895 cm-1에서 C-O-C 및 C-H 밴드의 이동 피크를 나타낸다.
도 2a는 아디프산 디히드라지드(ADH)에 의해 공유적으로 가교된 oxi-HA를 도시하는 개략도이다.
도 2b는 oxi-HA/ADH 용액이 27-게이지 바늘(좌측 패널)을 통하여 주사되어 무색 투명한 히드로겔(우측 패널)을 형성할 수 있음을 도시한다.
도 2c는 다양한 농도의 ADH(2 w/v% 내지 8 w/v%)에 의해 가교된 6 w/v% oxi-HA (산화도: 44.3%)의 굴절률을 도시한다.
도 3a는 4℃에서 작용 시간에 대하여 oxi-HA/ADH 히드로겔의 탄성률(G', ○) 및 점탄성률(G", ●)을 도시하는 그래프이다. oxi-HA/ADH 히드로겔은 6%(wt/v) oxi-HA(DO 44.3%)를 가교제 ADH 2%(i), 4%(ii) 및 8%(wt/v)(iii)와 각각 반응시켜 제조하였다. oxi-HA/ADH 히드로겔의 탄성률(G', ○) 및 점탄성률(G", ●)은 시간에 대하여 0.1 Hz의 일정한 빈도로 측정하였다. 겔화점(gel point)은 G' 및 G"의 교차점(crossover point)으로서 정의된다. 겔화점이 생기는 데 필요한 시간을 겔화 시간으로 지칭한다.
도 3b는 37℃에서 작용 시간에 대하여 oxi-HA/ADH 히드로겔의 탄성률(G', ○) 및 점탄성률(G", ●)을 도시하는 그래프이다. oxi-HA/ADH 히드로겔은 도 3a에 기재한 와 같이 oxi-HA를 가교제 ADH와 반응시켜 제조하였다.
도 4a는 시간에 대하여 라이소자임 분해 후 히드로겔의 잔류 중량을 도시하는 그래프이다. oxi-HA/ADH 히드로겔은 6%(wt/v)의 oxi-HA(DO 44.3%)를 가교제 ADH 2%(◇), 4%(△) 및 8%(wt/v) (□)와 각각 반응시켜 제조하였다. 실린더 히드로겔(300㎕)은 10,000 단위/ml의 라이소자임을 함유하는 3 ml의 PBS에 침지시켰다.
도 4b는 시간에 대하여 라이소자임 분해 후 히드로겔의 팽윤 지수를 도시한다. oxi-HA/ADH 히드로겔은 6%(wt/v) oxi-HA(DO 44.3%)를 가교제 ADH 2%(◇), 4%(△) 및 8 %(wt/v)(□)와 각각 반응시켜 제조하였다.
도 5a는 oxi-HA/ADH 히드로겔이 세포 증식에 대하여 아무런 효과를 갖지 않는 것을 나타내는 그래프이다. WST-8 에세이에서 얻어진 광학 밀도 판독치는 세포 증식(n=6)과 관련된다.
도 5b는 oxi-HA/ADH 히드로겔이 세포 독성 효과를 갖지 않는 것을 나타내는 그래프이다. 상기 세포들은 oxi-HA/ADH2, oxi-HA/ADH4 및 oxi-HA/ADH8 히드로겔(n=6)의 추출 배지에서 배양하였다.
도 6은 형광 현미경을 이용하여 세포 배양액 중의 생존 세포와 치사 세포를 동시에 검출하기 위하여 색소로 염색된 세포의 현미경사진을 수집한 것이다. 배율: 40X, 스케일 바 200 ㎛.
도 7a는 관찰 기간 동안 안압(intraocular pressure; IOP)의 현저한 증가가 관찰되지 않았음을 도시하며, 또 수술된 눈과 대조용 눈 사이에는 현저한 차이가 나타나지 않음을 도시한다.
도 7b는 관찰 기간 동안 각막 두께의 현저한 변화를 나타내지 않음을 도시하고 또 수술된 눈과 대조용 눈 사이에는 현저한 차이가 관찰되지 않음을 도시한다. (n=3)
도 8a는 수술한지 3주 후의 oxi-HA/ADH8 주사된 눈(좌측)과 대조용 눈(우측)의 세극등(slit-lamp) 사진을 도시한다.
도 8b는 수술한 지 21일에 망막 조직 부분의 광학현미경 관찰한 것을 도시한다(HE 염색, 200x). 좌측: 수술된 눈; 우측: 대조용 눈(우측).
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 오직 예시적 목적으로 든 하기 실시예에서 더욱 자세하게 기재되며, 다수의 변형과 변이는 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 다양한 구체예를 이하에 자세하게 기재한다. 상세한 설명 및 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, "하나(a, an)" 및 상기(the)의 의미는 그 내용이 분명히 다르게 의미하는 경우를 제외하고는 복수도 포함하는 것이다. 또한 상세한 설명 및 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, "내에서(in)"의 의미는 그 내용이 분명히 다르게 의미하는 경우를 제외하고는 "내(in)" 및 "위(on)"의 의미를 포함한다. 또한, 표제 또는 기타 부제는 본 발명의 독자의 편의를 위하여 명세서에 사용되었을뿐, 본 발명의 범위에 어떠한 영향을 주지 않는다. 또한, 이하에서는 본 명세서에 사용된 일부 용어에 대하여 더욱 자세하게 정의한다.
정의
본 명세서에 사용된 용어는 일반적으로 본 발명의 내용에서 및 각 용어가 사용되는 특정 내용에서 당해 분야의 통상의 의미를 갖는다. 본 발명을 설명하기 위하여 사용된 특정 용어는 이하에 논의하거나, 또는 명세서에서 본 발명의 기재에 관한 당업자에게 부가적 안내를 제공하기 위한 것이다. 편의상, 특정 용어는 예를 들어 이탤릭체 및/또는 인용부호를 이용하여 눈에 띄게 할 수 있다. 이러한 눈에 띄게 하는 부호의 사용은 그 용어의 정의 및 의미에 대하여 어떠한 영향을 주지 않는다; 본 명세서를 통하여 눈에 띄게 하는 부호를 사용하든 사용하지 않든 어떤 용어의 범위와 의미는 동일하다. 동일 내용은 한 가지 이상의 방식으로 언급될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 논의된 하나 이상의 용어에 대하여 선택적 언어와 동의어가 사용될 수 있지만, 어떤 용어가 더 정교하거나 또는 더 논의되는지에 대한 여부에 대한 특별한 중요성은 존재하지 않는다. 특정 용어에 대한 동의어가 제공된다. 하나 이상의 동의어의 인용은 다른 동의어의 사용을 배제하는 것이 아니다. 논의된 용어의 예를 비롯한 본 명세서에 있는 실시예의 사용은 예시적 목적으로 든 것이며, 어떠한 의미로든 본 발명의 범위와 정의 또는 예시된 용어를 제한하지 않는다. 마찬가지로, 본 발명은 본 명세서에 예시된 다양한 구체예에 한정되지 않는다.
특별히 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명에 관련된 기술 분야의 통상의 지식을 가진 사람에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 정의를 비롯한 본 발명의 문서가 제어할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "대략", "약" 또는 "거의"는 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 20% 내, 바람직하게는 10% 이내, 및 더욱 바람직하게는 5% 이내를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 수치 값은 대략적인 것이며, 이는 상기 용어 "대략", "약" 또는 "거의"는 명시적으로 언급되지 않으면 유추될 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 수치 또는 범위를 말할 때, 당업자는 본 발명에 관련된 특정 분야에 대한 대략적, 합리적 범위를 포괄하는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "히드로겔"은 친수성 중합체의 가교된 네트워크에 관한 것이다.
디히드라지드는 활성 기로 표시된다:
Figure pct00002
식 중에서, R은 바람직하게는 카복시산으로부터 유도된 다가 유기 라디칼일 수 있다. 카복시산 에스테르는 촉매 및 물 추출 단계를 이용하여 알코올 용액 중의 히드라진 수화물과 반응한다. 가장 흔한 디히드라지드는 아디프산으로부터 유도된 아디프산 디히드라지드(ADH), 세바신산 디히드라지드(SDH), 아미노산 발린으로부터 유도된 발린 디히드라지드(VDH), 및 이소프탈산 디히드라지드(IDH)를 포함한다. 지방족 R기는 임의 길이일 수 있다. 예를 들어, R기가 탄소이면, 생성한 화합물은 카보디히드라지드(CDH)이며, 가장 빠른 디히드라지드이다. 또는 C-18 길이의 R은 이코산디오익산 디히드라지드(LDH)에서 보고된다. ADH의 안전성은 잘 확립된다.
본 발명은 산화된 HA(oxi-HA) 및 아디프산 디히드라지드(ADH)으로 구성된, 유리체 대용물인 주사가능한, 제자리에서 형성된 히드로겔에 관한 것이다. 앞서 기재한 바와 같이, 히알우론산(HA)은 유리체액의 주요 성분의 하나이다. 이것은 생체물질, 조직 엔지니어링 및 기타 관련된 분야에서 널리 사용되고 있다. 이들 글루코오스계 중합체는 고밀도의 히드록시 기를 함유하므로 중합체를 고도로 친수성으로 만들고 또 더욱 화학적으로 관능화되게 한다. 히알우론산은 1960년대에 유리체 대용물로서 최초로 사용되었다. 그러나, 히알우론산은 수술하는 동안 또는 그후, 그의 낮은 표면 장력 장력 및 그의 비중으로 인하여 망막에 대하여 적절한 탐폰삽입 효과(tamponading effect)를 제공하지 않는다. 게다가, HA 용액은 이들을 눈으로부터 비교적 급속하게 제거되기 때문에 장기간 유리체 대용물로서 유용하지 않은 것으로 밝혀져 있다. HA-계 유리체 대용물의 체류 시간을 향상시키기 위하여, 과요오드화산 나트륨(NaIO4)을 사용하여 HA를 산화시켜 알데히드 작용기를 생성하였다. 이어, oxi-HA는 ADH에 의해 가교되어 청정하고 무색 투명한 oxi-HA/ADH 히드로겔을 형성하였다.
oxi-HA의 알데히드 작용기는 푸리에 변환 적외선(FT-IR) 분석에 의해 특징화되었고 또 oxi-HA의 산화도는 트리니트로벤젠 설폰산(TNBS) 에세이에 의해 결정되었다. 굴절률(RI)은 유리체 대용물의 필수 특징이기 때문에, 다양한 조성을 갖는 oxi-HA/ADH 히드로겔의 RI는 굴절계에 의해 측정하였다. oxi-HA/ADH 히드로겔의 겔화 특성은 4℃ 및 37℃에서 유동학적 분석에 의해 평가하였다. 탄성률(G') 및 점탄성률(G")은 기록하여 겔화 시간을 결정하였다. 또한, oxi-HA/ADH의 시험관내 분해 시간, 팽윤 특성 및 세포독성을 조사하였다.
일 양태에서, 본 발명은 a) 산화된 히알우론산; 및 b) 산화된 히알우론산을 가교하는 디히드라지드를 포함하는 히드로겔 중합체를 포함하는 조성물로서, 상기 히드로겔 중합체는, a) 투명성 및 무색이며; 또 b) 37℃에서 액체 상태로부터 겔-매트릭스로 전환하는 특성을 나타낸다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 히드로겔은 37℃에서 5분 이내에 액체 상태에서 겔로 변한다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 디히드라지드는 아디프산 디히드라지드, 옥살릴디히드라지드, 숙신산 디히드라지드, 말론산 디히드라지드, 에틸말론산 디히드라지드, 세바신산 디히드라지드, 이소프탈산 디히드라지드, Ajicure LDH, Ajicure VDH, 말레산 디히드라지드 및 피멜산 디히드라지드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 상기 히드로겔 중합체는 아디프산 디히드라지드에 의해 가교된 산화된 히알우론산을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 히드로겔 중합체의 가교된, 산화된 히알우론산은 C2 또는 C3을 갖는 글루쿠론산을 포함하거나 또는 이들 모두는 알데히드기이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 디히드라지드는 산화된 히알우론산의 글루쿠론산의 C2 및 C3을 통하여 산화된 히알우론산의 2개 사슬을 가교한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 히드로겔 중합체 중의 상기 가교된, 산화된 히알우론산은 C2 또는 C3을 갖는 글루쿠론산을 포함하거나 또는 이들 모두는 산화될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 산화된 히알우론산 및 히드라지드 사이의 중량비는 12:1 내지 3:1 범위이다. 본 발명의 범위를 제한하지 않고, 산화된 히알우론산과 아디프산 디히드라지드 사이의 중량비의 예는 3:1이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 1.341 내지 1.345 범위의 굴절률을 갖는다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 1.3420 내지 1.3442 범위의 굴절률을 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 산화된 히알우론산을 포함하는 제1 용액을 디히드라지드를 포함하는 제2 용액과 혼합하여 a) 산화된 히알우론산; 및 b) 산화된 히알우론산을 가교할 수 있는 디히드라지드를 포함하는 히드로겔 중합체를 포함하는 조성물을 형성하는 방법으로서, 상기 히드로겔 중합체는 a) 투명성 및 무색이며; 또 b) 37℃에서 액체 상태로부터 겔-매트릭스로 전환하는 특성을 나타낸다.
본 발명의 일 양태에서, 제1 용액 중의 산화된 히알우론산의 농도는 4% 이상 8% 미만(w/v)이며, 또 제2 용액 중의 디히드라지드의 농도는 2 내지 8% 범위이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 조성물 중의 산화된 히알우론산과 디히드라지드의 중량비 또는 농도비는 3:1이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 조성물 중의 산화된 히알우론산과 아디프산 디히드라지드의 중량비 또는 농도비는 3:1 내지 12:1이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 혼합 단계는 5분 이상의 겔화 시간을 갖는 히드로겔 중합체를 형성하는 온도에서 실시된다. 상기 혼합 단계는 4℃에서 실시되어 적어도 5분 동안 용액 상태를 유지하는 히드로겔을 형성한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 산화된 히알우론산; (b) 디히드라지드; (c) 완충액; 및 (d) 상술한 바와 같은 조성물 제제에 대한 지시사항이 있는 팩케이지 삽입물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상술한 키트 중의 디히드라지드는 아디프산 디히드라지드이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 a) 눈의 유리체강으로부터 유리체를 제거하고; b) 유리체를 공기로 치환하며; 또 c) 상술한 바와 같은 소정 양의 조성물을 눈의 유리체강에 주입하며, 상기 조성물의 양은 공기를 치환하기에 충분한 양인, 눈의 유리체를 치환하는 방법에 관한 것이다.
더 다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식(I)의 히드로겔 중합체를 포함하는 조성물로서, 상기 히드로겔 중합체는 투명성 및 무색이며; 또 37℃에서 액체 상태로부터 겔-매트릭스로 전환하는 특성을 나타내며:
Figure pct00003
식 중에서, m, n은 m≤5, 100≤n≤2500의 정수임.
본 발명의 일 양태에서, m=4이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, n은 ≤2400, ≤2300, ≤2200, ≤2100, ≤2000, ≤1900, ≤1800, ≤1700, ≤1600, ≤1500, ≤1400, ≤1300, ≤1200, ≤1100, 또는 ≤1000이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, n≥200, ≥300, ≥400, ≥500, ≥600, ≥700, ≥800, 또는 ≥900이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 조성물의 중합체 중의 산화된 HA는 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 이론적 산화도를 갖는다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 조성물 중의 산화된 HA는 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 실험적 산화도를 갖는다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 산화된 HA는 100%의 이론적 산화도 및/또는 20% 내지 80% 범위의 실험적 산화도를 갖는다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 조성물의 중합체 중의 산화된 HA는 적어도 40%, 45%, 또는 50%의 산화도를 갖는다.
실시예
본 발명의 범위를 제한하지 않고, 본 발명의 실시양태에 따른 예시적 기구, 장치, 방법 및 이들의 관련된 결과는 이하에 나타낸다. 제목 또는 부제는 독자의 편의를 위해 실시예에서 사용될 수 있으나, 이들은 본 발명의 범위를 제한해서는 안된다. 또한 본 명세서에는 특정 이론이 제안되고 개시되어 있지만; 이들이 옳든 잘못됐건 본 발명이 특정 이론이나 작용 계획에 대하여 본 발명에 따라 실시되는 한 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
재료와 방법
2.1 재료
히알우론산(평균 분자량 3.2 x 105 Da)는 큐.피. 코포레이션(일본 도쿄 소재)으로부터 구입하였다. 사붕산나트륨 사수염(보락스), t-부틸 카르바잔 및 아디프산 디히드라지드는 시그마-알드리치(미국 미주리 세인트루이스 소재)로부터 구입하였다. 디에틸렌글리콜, 브롬화 칼륨(KBr), 및 과요오드산 나트륨(NaIO4)은 RDH 케미컬 컴패니(미국 캘리포니아 스프링 밸리 소재)로부터 구입하였다. 트리클로로아세트산은 JTB 코포레이션(일본 도쿄 소재)으로부터 구입하였다. 투석관(MWCO 6,000-8,000)은 멤브레인 필트레이션 프로덕츠 인코포레이티드(미국 텍사스 소재)로부터 구입하였다. 인간 망막 염색된 상피세포(RPE 세포, BCRC 60383)는 내셔날 센터 포 셀 사이언스(타이완 소재)로부터 구입하였다. 세포 배양 배지 DMDM/F-12, 트립신-EDTA, 소태아 혈청, 및 페니실린-스트렙토마이신은 깁코(미국 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재)로부터 구입하였다. 퀵 세포 증식 에세이 키트 II는 바이오비젼 인코포레이티드사(미국 캘리포니아 소재)로부터 구입하였다. CYTOTOX 96® 비-방사성 세포독성 에세이는 프로메가 코포레이션(미국 와이오밍 소재)으로부터 구입하였다. 포유류 세포에 대한 생존/치사 생존성/세포독성 키트는 몰리큘라 프로브(미국 오레건 유진 소재)로부터 구입하였다.
2.2. 산화된 히알우론산(oxi-HA)의 제조
히알우론산(HA)은 실온에서 수용액 중의 과요오드화산 나트륨(NaIO4)에 의해 24시간 동안 산화시켰다. 알루미늄 호일에 의해 포장된 300 ml 비이커에, 히알우론산(2.00 g)을 이중 증류수(200 ml)에 용해시킨 다음, 다양한 농도의 과요오드화산 나트륨 용액을 교반하면서 서서히 부가하였다. NaIO4 대 HA의 몰비는 1:2, 1:1 및 1:0.5이어서 다양한 산화도를 달성하였다(낮은, 중간 및 높은 oxi-HA). 24 시간 동안 교반한 후, 에틸렌 글리콜을 부가하여 반응을 중지시키면서 30분간 더 교반하였다. 생성한 용액은 MWCO 6,000-8,000 (CelluSep T2 Tubings, Uptima)을 갖는 투석관에 의해 이중 증류수에 의해 3일동안 투석하였다. 투석 과정 동안 적어도 3회 물을 교환하였다. 마지막으로, 투석된 용액은 동결 건조기(FDU-1100, EYELA Corp., Tokyo, Japan)에 의해 3일간 동결건조시켜 백색의 솜털상 생성물인 산화된 히알우론산(oxi-HA)을 수득하였다. 수득한 oxi-HA는 수동으로 압착하여 FT-IR 분석(ATR PRO450-S를 갖는 JASCO FTIR-4200)을 위한 소형 펠릿으로 만들었다.
2.3. 산화도의 결정
oxi-HA의 산화도는 t-부틸 카바제이트(t-BC)를 사용하여 oxi-HA 중의 알데히드 작용기의 수를 측정하여 정량하였다. 카바제이트는 알데히드와 반응하여 히드라존 형성과 유사한 방식으로 안정한 카바존을 형성하는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서, oxi-HA의 산화도는 과량의 t-BC(25 ㎕, 1% 수성 트리클로로아세트산 중의 30.0 mM)가 oxi-HA(25㎕, 0.6 w/v%)의 알데히드 작용기와 24시간 반응한 후 잔류하는 t-BC를 측정하는 것에 의해 결정하였다. 잔류하는 t-BC는 과량의 수성 트리니트로벤젠 설폰산(TNBS) 용액(500㎕, 6.0 mM)을 부가하여 340 nm에서 복합체(트리니트로페닐 유도체)의 흡수를 측정하는 것에 의해 결정하였다. 다양한 농도의 수성 t-BC 용액을 표준으로 사용하여 실험 샘플에서 미반응 카바제이트를 확인하기 위한 검량 곡선을 얻었다.
2.4. oxi - HA / ADH 히드로겔의 제조
다양한 산화도를 갖는 Oxi-HA 샘플을 포스페이트 완충액 용액(pH 7.4)에 별도로 용해시켜 실온에서 철야로 6w/v%의 최종 농도를 얻었다. 2, 4 및 8 w/v%의 아디프산 디히드라지드(ADH) 용액은 포스페이트 완충액 용액으로 제조하였다. Oxi-HA 용액(400 ㎕)을 에펜도르프 중에서 2, 4, 및 8 w/v%의 ADH 용액(100㎕)과 혼합하여 물과 얼음을 함유하는 조(bath) (0℃에 가까움)에 투입하여 히드로겔, oxi-HA/ADH2, oxi-HA/ADH4 및 oxi-HA/ADH8 히드로겔을 각각 형성하였다.
2.5. oxi - HA / ADH 히드로겔의 굴절률
굴절률계(DR-A1 ATAGO, 일본)를 사용하여 oxi-HA/ADH2, oxi-HA/ADH4 및 oxi-HA/ADH8 히드로겔의 굴절률(RI)을 측정하였다. 간단히, 액상 oxi-HA/ADH 용액의 분취 부피(aliquot volume)를 피펫 선단을 이용하여 굴절률계 프리즘으로 이동시켰다. 굴절계 프리즘은 등온 순환 수조에 의해 37℃에서 배양하였다. 겔화를 위해 10분 동안 기다린 후, 히드로겔의 굴절률(RI)은 디지털 스크린으로부터 판독하였다.
2.6. oxi - HA / ADH 히드로겔의 유동학적 평가
원추 및 평면 기하(1-C35/2 Ti)를 갖는 유동계(HAAKE Rheostress 600, 써모 피셔 사이언티픽 인코포레이션)를 사용하여 저장 온도 4℃ 및 체온 37℃에서 oxi-HA/ADH 히드로겔의 유동학적 특성을 평가하였다. 4℃ 온도를 사용하여 외과의가 혼합된 oxi-HA/ADH 용액에 대한 작업 시간을 평가하였고 또 37℃를 사용하여 oxi-HA/ADH 히드로겔의 겔화 시간을 평가하였다. 진동 시간 스윕 모드(sweep mode)는 0.1 Hz, 10 Pa에서 동작시키고 15분후 종료시켜 oxi-HA/ADH 히드로겔의 겔화 시간을 결정하였다. 탄성률 G' 및 점탄성률 G"은 RheoWin 3 소프트웨어에 의해 기록하여 분석하였다.
2.7. oxi - HA / ADH 히드로겔의 시험관내 분해 실험
oxi-HA/ADH2, oxi-HA/ADH4 및 oxi-HA/ADH8 히드로겔의 분해 특성은 예비형성된 히드로겔을 10000 단위/ml의 라이소자임을 함유하는 PBS에 침지시켜 평가하였다. 라이소자임은 분해 모델 시스템에 사용하기 위해 선택되며, 그로 인하여 다당류 잔기를 공격하는 것으로 알려진 안구 효소이다. 간단히 말해, 용액 중의 oxi-HA 및 ADH를 에펜도르프에서 혼합하였고, 또 300 ㎕의 혼합물(oxi-HA/ADH 용액)은 즉각 실린더 몰드로 이동시켰고 또 10분간 겔화시켜 직경 0.7 mm이고 높이 0.8 mm의 실린더 히드로겔을 형성하였다. 실린더 형상의 oxi-HA/ADH 히드로겔을 24-웰 배양 플레이트에 놓고 또 라이소자임을 함유하는 3 ml PBS를 각 웰에 부가하였다. 히드로겔이 형성된 직후 초기 히드로겔 건조 중량(Wid)을 결정하였다. 규칙적인 간격을 두고, 히드로겔을 제거하고 또 동결건조기에 의해 72시간 동안 동결건조시켰다. 상이한 시점에서 oxi-HA/ADH 히드로겔의 건조 중량(Wd)을 측정하고 또 분해 퍼센트를 [(Wid-Wd)/Wid]에 의해 산출하였다.
2.8. oxi - HA / ADH 히드로겔의 팽윤 실험
oxi-HA/ADH2, oxi-HA/ADH4 및 oxi-HA/ADH8 히드로겔의 팽윤 지수는 시험관내 분해 실험과 동일 조건하에서 평가하였다. 초기 히드로겔 중량(Wi)은 히드로겔이 형성된 직후 결정하였고 이어 24-웰 배양 플레이트에 위치시켰다. 일정한 간격을 두고, 히드로겔을 라이소자임을 함유하는 PBS로부터 제거하며, 필터 페이퍼에 블로팅하여 표면수를 제거하고, 중량측정(Wt)하고 또 동일 용기로 복귀시켰다(완충액 용액은 각 측정시에 교체하였다). 팽윤 지수는 Wt 과 Wi 사이의 비율로부터 산출하였다.
2.9. oxi - HA / ADH 히드로겔의 세포독성 평가
ox-HA/ADH 히드로겔의 세포독성 평가는 ISO 표준에 따라서 인간 망막 착색된 상피 세포(RPE 세포, BCRC 60383, 내셔널 센터 포 셀 사이언스, 타이완 소재)의 단층을 갖는 추출 배지를 시험하는 것에 의해 실시하였다. 상기 추출 배지는 oxi-HA/ADH2, oxi-HA/ADH4, 및 oxi-HA/ADH8 히드로겔을 표준 배양 배지(DMEM/F-12)와 함께 0.75 cm2/ml 추출 비율로 37℃에서 72시간 동안 배양하는 것에 의해 제조하였다. 200 마이크로리터의 추출 배지를 RPE 세포의 단층 상에서 시험하였다. RPE 세포는 5 x 103 세포/웰의 세포 밀도로 96웰 배양 플레이트 상에 씨딩(seed)하고 또 37℃에서 철야로 표준 배양 배지를 공급하였다. 상기 표준 배양 배지는 추출 배지로 치환하였다. 대조군(표준 배양 배지), 음성 대조군(Al2O3 추출 배지), 양성 대조군(0.1% Triton X-100-함유 배지), 및 실험군(oxi-HA/ADH2, oxi-HA/ADH4, 및 oxi-HA/ADH8 추출 배지)를 비롯한 실험 그룹은 6개 플레이트(n=6)에서 시험하였다. 37℃에서 1일 및 3일간 배양한 후, 세포 생존성 및 세포독성 평가는 퀵 세포 증식 에세이 키트 II(BioVision Inc.) 및 CYTOTOX 96® 비-방사능 세포독성 에세이(Promega Corporation)를 개별적으로 사용하여 정량적으로 평가하였다. 추출 배지로 처리된 RPE 세포는 LIVE/DEAD 염색 키트(Molecular Probes # L3224)에 의해 염색시켰다.
퀵 세포 증식 에세이 키트 II를 사용하여 세포 생존성을 평가하였다. 세포를 1일 및 3일 동안 배양하고 또 배양 배지를 제거한 다음 각 웰에서 0.2ml의 수용성 테트라졸륨-8 (WST-8) 작용 용액으로 치환하였다. 2시간의 배양 후, 450 nm에서 분광광도계 판독에 의해 100 ㎕의 작용 용액을 정량적으로 평가하였다. 기준 파장은 650 nm이었다.
CYTOTOX® 96 비-방사능 세포독성 에세이 키트를 사용하여 세포 독성을 평가하였다. 에세이 키트는 젖산 탈수소효소(LDH)를 정량적으로 측정하며, 이는 세포 용균시 방출되는 안정한 세포질성 효소이다. 배양한지 1일 및 3일 후, 배양 배지 및 전체 세포 용균은 에세이 매뉴얼에 따라 490 nm에서 흡수를 측정하였다. 추출배지(RPE 세포와 함께 배양되는 것 없음)는 바탕값으로 작용하도록 또한 평가하였다. 세포독성은 하기 방정식으로 산출하였다:
Figure pct00004
2.10. 예비적 동물 연구
3마리의 뉴질랜드 흰토끼(2.8-3.2 kg)의 6개 눈을 사용하였다. 케탈라/카나진 2%를 근육내 주사에 의한 전신 마취하에서 수술을 실시하였다. 수술 현미경하에서, 외과용 칼을 이용하여 좌측 눈에 약 3 mm를 공막절개술을 실시하였다. 가능한한 18 게이지 바늘을 사용하여 유리체를 통기시키고 또 공기로 치환하였다. 이어 oxi-HA/ADH 용액을 유리체강에 주사하였다. 수술 후, 항생물질 안약으로서 겐타마이신(겐티신, 로체 제조)으로 눈을 처리하고 하루에 3회씩 테트라사이클린 히드로클로라이드 안연고를 1주간 처리하였다. 우측 눈은 수술하지 않고 대조군으로 사용하였다. 전방 절편 및 안구 매질을 관찰하고 기록하기 위하여 안과 테이블 세극등(Topcon Medical Systems, Inc.)를 사용하였다. 안압(IOP)은 수술한지 1, 5, 8, 12, 15 및 3주 후에 schiotz형 안압계에 의해 측정하였다. 초음파 각막측정기 (DGH Technology, Inc)를 사용하여 중앙 각막 두께를 측정하였다. 수술한지 3주 후, 3마리 토끼를 희생시켰다. 이들 동물로부터 우측 눈(대조군) 및 좌측 눈(수술됨)을 수집하였다. 눈들을 10% 포름알데히드 용액으로 고정하고 또 이들을 파라핀에 매립하고 광학 현미경관찰을 위해 헤마톡실린 및 에오신(HE 염색)으로 염색시켰다.
2.11. 통계적 분석
모든 데이터는 평균± 표준 편차로서 표기하였다. 그룹 간의 통계적 차이는 일원 변량분석(ANOVA)을 이용하여 시험하였다. 통계적 유의성은 0.05 확률 수준으로 미리 설정하였다.
3. 결과
3.1. 산화된 히알우론산(oxi-HA)의 특징화
히알우론산(HA)은 실온에서 상이한 농도의 과요오드화산 나트륨에 의해 산화시켰다. 도 1a는 NaIO4에 의해 산화되어 2개 알데히드 작용기를 생성하는 HA의 화학 반응을 도시한다. HA 분말 (i) 및 다양한 산화도의 산화된 HA(oxi-HA) [낮은, 중간 및 높은 산화도의 oxi-HA; (ii), (iii) 및 (iv), 각각]의 FT-IR 스펙트럼을 도 1b에 도시하였다. 알데히드 작용기의 유의한 피이크는 1725 cm-1 및 836 cm-1에서 FT-IR 스펙트럼(ii, iii 및 iv)에서 찾을 수 있었고, 그의 세기는 산화도가 증가함에 따라서 증가하였다(ii에서 iv로). HA 분말의 스펙트럼(i) 중의 1147 cm-1 및 895 cm-1 에서 피이크는 C-O-C (에테르 결합) 및 C-H와 관련되었다. 이들 2개 피이크는 알데히드 작용기의 형성으로 인하여 스펙트럼 (ii), (iii) 및 (iv)에서 1112 cm-1 및 875 cm-1로 각각 이동하였다.
oxi-HA의 산화도는 상술한 바와 같이 t-BC 적정(TNBS 에세이)에 의해 더 측정하였다. 표 1은 NaIO4 및 HA의 몰비로부터 산출된 이론적 산화도, 및 TNBS 에세이에 의해 측정된 얻어진 산화도를 요약하였다. 예상된 바와 같이, oxi-HA의 산화도는 NaIO4의 양이 증가함에 따라서 27.3±2.3%에서 60.4±2.66%로 증가하였다. 중간 정도의 산화도(44.3±4.25%)를 갖는 oxi-HA는 하기 실험에서 다양한 농도의 ADH(2,4 및 8 w/v%)에 의해 가교되었다.
Figure pct00005
3.2. oxi - HA / ADH 히드로겔의 굴절률( RI )
oxi-HA는 이작용성 가교제인 ADH에 의해 가교되어 어떤 화학적 개시제를 사용하지 않고도 히드로겔을 형성할 수 있음이 밝혀졌다. 도 2a는 반응을 개시하기 위하여 화학제를 부가하지 않고도 자연적으로 생기는 가교 반응을 도시한다. oxi-HA의 알데히드 작용기는 ADH의 NH2 작용기와 신속하게 반응하여 무색의 투명한 oxi-HA/ADH 히드로겔을 형성하였다(도 2b, 좌측 및 우측 패널). oxi-HA/ADH 히드로겔의 굴절률은 ADH의 농도가 2%에서 8%로 증가함에 따라서 1.3420 내지 1.3442 범위이며 (도 2c), 이는 인간 유리체액의 값(1.3345~1.3348)과 유사하였다.
3.3. oxi - HA / ADH 히드로겔의 유동학적 특성
진동 시간 스윕을 실시하여 oxi-HA/ADH 히드로겔의 겔화 거동을 평가하였다. 도 3은 4℃ 및 37℃에서 oxi-HA/ADH2, oxi-HA/ADH4 및 oxi-HA/ADH8 히드로겔의 탄성률(G') 및 점탄성률(G")을 도시한다. G' 및 G"의 교차점은 겔 형성을 나타내는 겔화점으로 정의되었다. 겔화점이 생기는데 필요한 시간은 때때로 샘플에 대한 겔화 시간으로 지칭한다.
도 3a는 4℃에서 oxi-HA/ADH 히드로겔(oxi-HA/ADH2, oxi-HA/ADH4 및 oxi-HA/ADH8)의 유동학적 결과를 도시한다. 이들 결과는 모든 유형의 oxi-HA/ADH 히드로겔이 히드로겔 중의 ADH의 농도에 따라서 4℃에서 3 내지 8분 동안 액체 상태를 유지할 수 있음을 나타낸다. 도 3b는 37℃에서 oxi-HA/ADH 히드로겔의 유동학적 결과를 도시한다. 모든 히드로겔의 겔화점은 143 내지 175초인 것으로 보이며, 이는 oxi-HA/ADH 히드로겔이 37℃에서 3분 이내에 겔 매트릭스로 변환되기 시작함을 나타내었다. oxi-HA/ADH 히드로겔의 유동학적 결과는 표 2에 요약한다.
Figure pct00006
3.4. oxi - HA / ADH 히드로겔의 시험관내 분해 및 팽윤 지수
도 4a는 시간에 대하여 oxi-HA/ADH 히드로겔의 잔류 중량을 %로 도시한다. oxi-HA/ADH2(◇) 및 oxi-HA/ADH4(△) 히드로겔은 3일 및 14일에 각각 완전히 용해되었다. 3일에서, oxi-HA/ADH8 히드로겔(□)의 잔류하는 중량 %는 86.67±3.54%이었고, 이는 점점 감소하여 35일에 61.02±3.13%으로 되었다. 도 4b는 상이한 농도의 ADH에 의해 가교된 oxi-HA의 팽윤 지수를 도시한다. oxi-HA/ADH2 히드로겔의 팽윤 지수는 히드로겔이 완전히 용해될 때까지(3일 이내) 시간 경과에 따라 증가하였다. oxi-HA/ADH4 및 oxi-HA/ADH8의 팽윤 지수는 처음 3일 동안에는 약간 감소한 다음 히드로겔이 분해되기 시작할 때까지 일정한 값을 유지하였다.
3.5 oxi - HA / ADH 히드로겔의 세포독성
세포 생존성은 WST-8 에세이(도 5a)에 의해 평가하였다. 제1일에서 실험군 (oxi-HA/ADH2, oxi-HA/ADH4 및 oxi-HA/ADH8) 사이에는 유의한 차이가 없었다(p>0.5). 3일 동안 배양한 후, 대조군, oxi-HA/ADH2, oxi-HA/ADH4 및 oxi-HA/ADH8 군의 WST-8 OD450값은 각각 1.27±0.03, 1.20±0.05, 1.14±0.04 및 0.99±0.06이었다. oxi-HA/ADH2 및 oxi-HA/ADH4(p>0.5)의 추출 배지는 대조군 및 음성 대조군과 비교하여 RPE 세포의 세포 생존성에 유의한 영향을 주지 않았다. 그러나, oxi-HA/ADH8의 추출 배지는 대조군(p<0.001)과 비교하여 세포 생존성에서 작은 감소를 유발하였다. 세포독성은 LDH 에세이(도 5b)에 의해 더욱 조사하였고 또 oxi-HA/ADH2, oxi-HA/ADH4 및 oxi-HA/ADH8의 세포독성 %는 각각 6.1640±0.5805%, 6.0720±0.3872%, 및 5.3166±0.9590%를 나타내었다. 이들 결과는 대조군(6.9811±0.6663%, p>0.5)과 비교하여 oxi-HA/ADH 추출 배지 군 중에는 유의한 차이를 없음을 보여주었다.
도 6은 각각 oxi-HA/ADH2, oxi-HA/ADH4 및 oxi-HA/ADH8 히드로겔의 추출 배지에서 배양된 RPE 세포의 형광 현미경사진을 도시한다. 다중음이온 염료 칼세인-AM은 살아 있는 세포 내에 유지될 수 있고 또 살아 있는 세포 내에서 강력하고 균일한 녹색 형광을 생성한다. 한편, EthD-1는 손상된 막에 의해 세포에 들어가서 죽은 세포에서 밝은 적색 형광을 생성한다. 생존/치사 세포 염색의 결과는 상이한 추출 배지에서 배양된 대부분의 세포는 생존가능하다는 것을 나타내었다.
3.6 예비적 동물 연구
도 7a는 수술 후 안압(IOP) 변화를 도시하였다. 수술된 눈에서 IOP는 수술 후 제1일에는 약간 감소되었다. oxi-HA/ADH 히드로겔을 주사한지 제5일 및 제8일에 IOP에서 상향 경향이 있었다. 수술 후 제12일, 제15일 및 제21일에서, IOP는 안정 정체 수준에 도달하였다. 관찰 기간 동안 수술된 눈과 대조용 눈 사이의 OP에서는 유의한 차이가 없었다. 도 7b 수술된 눈과 대조용 눈의 각막 두께를 도시하며 또 이들 군 사이의 각막 두께에서 유의한 차이는 없었다. 도 8a는 oxi-HA/ADH8을 주사한 후 제21일에 눈의 세극등 조사의 사진을 도시하였다. 수술된 눈의 각막과 수정체는 아무런 결함을 나타내지 않았다. 이들 결과는 수술한 지 3주 후에 조사된 눈의 전방 절편에서 현저한 염증이나 기타 질환을 나타내지 않았다. 도 8b는 수술한 지 21일에 수술된 눈과 대조용 눈의 망막 부분을 도시하였다. 망막층은 용이하게 검출되었다. 염증 반응 또는 침윤 또는 대조용 눈으로부터 어떠한 차이도 나타내지 않았다.
4. 논의
환자가 유리체 절제수술을 받을 때, 많은 유리체액이 유리체강으로부터 제거된다. 천연 유리체는 재생될 수 없기 때문에, 유리체강은 망막을 제자리에 유지하고 다시 박리되지 않게 하기 위하여 유리체 대용물로 충전되어야 한다. 과거 수십년간, 유리체 대용물의 개발은 연구자에게 도전이었다. 많은 생체중합체 및 합성 화합물이 실험실에서 연구되어 왔다. 그러나, 영구적 유리체 대용물용으로 이상적인 물질은 지금까지 개발되어 있지 않고 있다.
본 발견은 27-게이지 바늘을 통하여 유리체강에 주사된 다음 겔-유사 물질로 변환될 수 있는 무색 투명한 oxi-HA/ADH 히드로겔에 관한 것이다. FT-IR(1725 cm-1 및 836 cm-1에서 피이크; 도 1b)에 의해 특징화되는 바와 같이, oxi-HA 상의 알데히드 작용기는 NaIO4에 의해 생성되고, 글루쿠론산의 C2-C3 히드록실 기를 절단하여 디알데히드를 형성한다. oxi-HA의 디알데히드는 ADH의 히드라지드 기와 반응하여 oxi-HA/ADH 히드로겔에서 분자간 네트워크를 형성할 수 있다.
굴절률은 유리체 대용물의 적용을 위한 중요한 광학 특징 중의 하나이다. 유리체 대용물의 비적절한 굴절률은 유리체 절제수술 후 환자의 시력에 영향을 줄 것이다. 가스 탐폰삽입은 광학 변화를 유도하며, 이는 안저검사경 조사 및 환자의 시력 모두를 일시적으로 제한하기에 충분하게 작용한다. 현재의 유리체 대용물(예컨대 실리콘오일, nD=1.40516; 중질 실리콘오일, nD=1.3008)의 굴절률 지수는 천연 유리체의 굴절률 지수(nD=1.336)과 상이하며, 이는 탐폰삽입된 눈에서 유도된 굴절률 이동이 예상되었다. oxi-HA/ADH8의 굴절률은 약 1.3342이며, 이는 인간 유리체의 굴절률과 매우 유사하다. oxi-HA/ADH8 히드로겔을 유리체 대용물로서 사용하는 것은 유리체절제술 이후 바람직하지 않은 굴절률 변화를 피할 수 있다.
임상적으로, 소형 게이지 바늘을 통한 주사는 유리체 대용물을 전달하기 위한 일반적인 과정이다. oxi-HA/ADH 히드로겔은 도 2B(좌측 패널)에 도시된 바와 같이 27-게이지 바늘을 통하여 용이하게 주사될 수 있었다. 주사가능성은 안과 수술의사와 환자에게는 중요한 인자이다. 수술 시간은 안과 수술의사가 액체 상태의 히드로겔을 유리체강에 주사하기에 충분해야 하며, 또 용액-겔 전환 시간은 히드로겔의 압출을 방지하기 위하여 가능한한 짧아야 한다. 유동학적 평가는 oxi-HA 용액 및 ADH 용액의 혼합물이 용액 형태로 약 8분간 유지할 수 있음을 나타내었다. 따라서, 안과 수술의사는 4℃에서 oxi-HA 및 ADH 용액을 혼합하기에 충분한 시간(8분)을 가진 다음 상기 혼합된 oxi-HA/ADH 용액을 주사를 위한 주사기로 전달한다. 이 액체 형태는 주사될 수 있고 또 따라서 겔 형태의 대용물을 도입함에 있어서 어려움을 극복하므로, 유리체 대용물에 대한 최소의 침습적 전달 시스템을 눈에 제공한다.
적게 가교된 히드로겔(예컨대, oxi-HA/ADH2)의 경우, 팽윤 지수는 즉각적으로 증가하였고 또 3일 이내에 완전히 용해되었다. 이 시간 동안, 상기 히드로겔은 가수분해를 거치며 또 히드라존 결합이 시간경과에 따라 거의 선형적으로 분해되었다. 고도로 가교된 히드로겔(예컨대, oxi-HA/ADH4 및 oxi-HA/ADH8)의 경우, 팽윤 지수는 처음 3일 동안 감소한 다음 일정한 값을 유지하고 이어 네트워크가 완전히 용해될 때까지 증가하였다. 시간 경과에 따른 팽윤 지수의 증가는 히드로겔 네트워크 중의 히드라존 결합의 가수분해의 결과이었다. 히드로겔 중의 히드라존 결합이 가수분해되면, 상기 네트워크는 팽윤하여 더 많은 물을 함유하고, 또 이어 완전히 용해된다. 질량 손실 연구에 따르면, oxi-HA/ADH4 및 oxi-HA/ADH8 히드로겔에서 발견된 분해 거동은 oxi-HA/ADH2 히드로겔에서 관찰된 분해 거동과는 상이하였다. 더 높은 ADH 함량을 갖고 또 따라서 더 많은 히드라존 결합을 갖는 히드로겔은 ADH 함량이 더 낮은 히드로겔과 비교하여 더 느리게 가수분해되는 경향이 있다. 고도로 가교된 히드로겔에서, 처음 3일 동안에는 낮은 가교 밀도 또는 비가교 히알우론산을 갖는 히드로겔 영역의 가수분해로 인하여 중량 손실(5-15%)에서 초기 감소가 있었다. 이 상은 고도로 가교된 영역의 분해로 인하여 다음 수일 또는 수주 동안 중량에서 약간의 감소에 의해 생겼다. 마지막으로, 히드로겔 중의 히드라존 결합이 가수분해되었고, 이는 용해 상을 초래하였다.
oxi-HA/ADH4 히드로겔은 8-12일에서 점진적인 팽윤을 나타내었고, 이는 히드라존 결합이 이때 가수분해되었고, 이어 14일에는 용해 상으로 됨을 의미한다. 이는 히드로겔 중량에서 감소를 초래하였고 또 결국 히드로겔의 완전한 용해를 초래하였다. 반면에, 고도로 가교된 oxi-HA/ADH8이 3일 동안 일정한 팽윤 지수에 도달하는 것으로 인하여, 히드로겔은 30-35일 동안 점진적인 팽윤을 나타내었다. 시험관내 분해 실험은 oxi-HA/ADH8 히드로겔의 30-40% 만이 효소 존재하에서(10,000 단위/ml의 라이소자임을 함유하는 PBS) 분해되었고 또 히드로겔은 5주 동안 안정함을 보여주었다. 임상적으로, 실리콘오일 및 가스는 안구내 부피를 재확립하고 또 망막 박리를 조작하기 위하여 망막 재부착 수술에서 일반적인 유리체 대용물이다. 이들은 망막 브레이크(retina breaks)를 통한 유체의 통과를 방지하고, 정상 망막-망막 색소 상피(RPE) 병치를 유지하며 또 망막 재부착을 유지하게 한다. 가스의 수명은 흔히 가스 유형, 기포 부피, 초기 농도 및 안구내압에 따라 수일 내지 2주 이내이다. 수주 이내에 재흡수하는 안구내 가스와 대조적으로, oxi-HA/ADH8 히드로겔은 시험관내 분해 시험에서 적어도 5주 동안 겔 매트릭스를 유지할 수 있다. 임상적 고려를 위하여, oxi-HA/ADH8 히드로겔의 수명은 망막 부착을 위해 효과적이어야 한다. 또한 히드로겔은 환자가 가스 탐폰삽입에 의해 유리체 절제술을 받을 때 복와위의 불편함을 극복한다.
망막 착색된 상피(REP) 세포를 세포독성 평가를 위한 표적 세포로서 선택하였는데, 이는 망막 박리 또는 국소적 망막절제술 이후에 안구를 충전하는 유리체 대용물에 직접 노출되기 때문이다. RPE 세포는 또한 실패한 망막 재부착 및 증식성 유리체망막병증(PVR)과 관련되어 있는 것으로 밝혀졌다. 세포 생존성 에세이(WST-8) 및 세포독성(LDH 에세이)은 oxi-HA/ADH 히드로겔이 시험관내 평가에서 RPE 세포에 생체적합성이며 또 비독성이라는 것을 나타낸다. 히드로겔의 분해 생성물은 임상적 적용에 있어서 다른 걱정거리이다. 분해 평가의 결과에 따르면, oxi-HA/ADH2 히드로겔은 수성 환경에서 3일 이내에 분해되었다. 이는 oxi-HA/ADH2 히드로겔이 추출 과정(37℃, 72 시간) 동안 추출 배지에서 완전히 분해되고 또 분해된 생성물은 세포독성 평가에서 RPE 세포와 함께 배양됨을 나타낸다. 세포독성 에세이 데이터(도 5a-5b)에 따르면, 이 군에서는 유의한 세포독성이 없었다. 이들 결과는 oxi-HA/ADH 히드로겔로부터의 분해 생성물이 WST-8 및 세포독성 에세이를 기초로 할 때 RPE 세포에 대하여 비독성이라는 것을 나타내었다. 또한, 생존/치사 염색은 상이한 추출 배지로부터 배양된 세포의 대부분이 생존가능한 것임을 또한 나타낸다.
oxi-HA/ADH8-주사된 눈의 세극등 조사는 관찰 기간 동안 전방 안구 절편에서 염증이나 불투명성을 전혀 나타내지 않았다. IOP에서 증가는 유리체 절제수술 이후에 흔히 생긴다. 그러나, 수술된 눈의 IOP는 관찰 기간 동안 정상 수준으로 유지되었다. 이는 아마도 oxi-HA/ADH 히드로겔의 팽윤 지수에서 약간의 감소에 기인한 것일 수 있다. 망막 조직의 조직학적 검사는 또한 구조적 변화 또는 분해를 나타내지 않았고, 또 대조용 눈으로부터 유의한 차이는 없었다.
5. 결론
현재, 이상적인 유리체 대용물은 임상적 적용을 위해 아직까지 개발되어 있지 않다. 많은 연구자들은 유리체 대용물용의 적절한 생체재료를 개발하기 위하여 노력하여 왔다. 본 발명은 신규의 주사가능한 히알우론산-계 히드로겔, oxi-HA/ADH의 합성 및 특징화에 관한 것이다. 상기 히드로겔은 적절한 굴절률, 주사가능 및 제자리 겔화 특성과 같은 유리체 대용물로서 사용하기 위한 몇가지 유리한 특성을 나타내며, 또 REP 세포에 대하여 세포독성을 나타내지 않는다. 부가적으로, oxi-HA/ADH8 히드로겔은 5주에 걸쳐 안구 효소(라이소자임)에 의해 시험관내에서 분해되지 않았다. 예비적 동물 연구에서, oxi-HA/ADH 히드로겔은 관찰 기간 동안 심각한 합병증을 유도하지 않았다.

Claims (15)

  1. 산화된 히알우론산; 및
    상기 산화된 히알우론산을 가교하는 디히드라지드를 포함하는 히드로겔 중합체를 포함하는 조성물로서,
    상기 히드로겔 중합체는,
    투명성 및 무색이며; 및
    37℃에서 액체 상태로부터 겔-매트릭스로 전환하는 특성을 나타내는, 히드로겔 중합체를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 디히드라지드는 아디프산 디히드라지드, 옥살릴디히드라지드, 숙신산 디히드라지드, 말론산 디히드라지드, 에틸말론산 디히드라지드, 세바신산 디히드라지드, 이소프탈산 디히드라지드, Ajicure LDH, Ajicure VDH, 말레산 디히드라지드 및 피멜산 디히드라지드로부터 선택된 적어도 하나인 히드로겔 중합체를 포함하는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 디히드라지드는 아디프산 디히드라지드인 히드로겔 중합체를 포함하는 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 히드로겔 중합체는 가교되고 산화된 히알우론산이고, 상기 가교되고 산화된 히알우론산은 C2 또는 C3을 갖는 글루쿠론산을 갖거나, 또는 이들 양자가 알데히드기인 히드로겔 중합체를 포함하는 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 디히드라지드는 산화된 히알우론산의 글루쿠론산의 C2 및 C3을 통하여 산화된 히알우론산의 2개 사슬을 가교하는 히드로겔 중합체를 포함하는 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 히드로겔 중합체 중의 산화된 히알우론산과 히드라지드 사이의 중량비가 12:1 내지 3:1 범위인 히드로겔 중합체를 포함하는 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 1.341 내지 1.345 범위의 굴절률을 갖는 히드로겔 중합체를 포함하는 조성물.
  8. 산화된 히알우론산을 포함하는 제1 용액을 디히드라지드를 포함하는 제2 용액과 혼합하여 제1항에 따른 히드로겔 중합체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로서,
    상기 조성물은,
    산화된 히알우론산; 및
    상기 산화된 히알우론산을 가교하는 디히드라지드를 포함하는 히드로겔 중합체를 포함하고,
    상기 히드로겔 중합체는,
    투명성 및 무색이며; 및
    37℃에서 액체 상태로부터 겔-매트릭스로 전환하는 특성을 나타내는, 조성물을 제조하는 방법
  9. 산화된 히알우론산;
    디히드라지드;
    완충액; 및
    제1항에 따른 조성물 제제에 대한 지시사항이 있는 팩케이지 삽입물
    을 포함하는 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 디히드라지드는 아디프산 디히드라지드, 옥살릴디히드라지드, 숙신산 디히드라지드, 말론산 디히드라지드, 에틸말론산, 디히드라지드, 세바신산 디히드라지드, 이소프탈산 디히드라지드, Ajicure LDH, Ajicure VDH, 말레산 디히드라지드 및 피멜산 디히드라지드로부터 선택된 적어도 하나인 키트.
  11. 제9항에 있어서, 상기 디히드라지드는 아디프산 디히드라지드인 키트.
  12. 눈의 유리체강으로부터 유리체를 제거하고;
    유리체를 공기로 치환하며; 및
    제1항에 따른 히드로겔 중합체를 포함하는 소정 양의 조성물을 눈의 유리체강에 주사하는 눈의 유리체를 치환하는 방법으로서,
    상기 조성물의 양은 공기를 치환하기에 충분한 양인, 눈의 유리체를 치환하는 방법.
  13. 눈의 유리체강으로부터 유리체를 제거하고;
    유리체를 공기로 치환하며; 및
    제7항에 따른 히드로겔 중합체를 포함하는 소정 양의 조성물을 눈의 유리체강에 주사하는 눈의 유리체를 치환하는 방법으로서,
    상기 조성물의 양은 공기를 치환하기에 충분한 양인, 눈의 유리체를 치환하는 방법.
  14. 하기 화학식(I)의 히드로겔 중합체를 포함하는 조성물로서,
    상기 히드로겔 중합체는
    투명성 및 무색이며; 및
    37℃에서 액체 상태로부터 겔-매트릭스로 전환하는 특성을 나타내며:
    Figure pct00007

    식 중에서, m, n은 m≤ 5, 100≤ n ≤ 2500의 정수임.
  15. 제14항에 있어서, 상기 히드로겔 중합체는 1.341 내지 1.345 범위의 굴절률을 갖는 조성물.
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