KR20100102089A

KR20100102089A - 2'-불소-4'-치환-뉴클레오시드, 제조 방법 및 용도

Info

Publication number: KR20100102089A
Application number: KR1020107003396A
Authority: KR
Inventors: 준비아오 창
Original assignee: 젱조우 유니버시티; 어날리스 테스팅 앤드 리서치 센터 오브 헤난 프로빈스
Priority date: 2007-07-16
Filing date: 2008-06-27
Publication date: 2010-09-20
Also published as: EP2177527A1; WO2009009951A1; CN101177442A; JP2010533659A; US8835615B2; CN100532388C; EP2177527B1; EP2177527A4; US20100234584A1

Abstract

본 발명은 2'-불소-4'-치환-뉴클레오시드 유사체 또는 이의 프로드러그 또는 이의 5'-인산염 에스테르(5'-인산염 에스테르의 프로드러그를 포함), 이의 제조 방법 및 용도를 제공한다. 이 화합물은 다음과 같은 구조식을 갖는다:

상기 식에서,

상기 화합물은 바이러스 감염의 치료, 특히 HBV, HCV 또는 HIV 감염의 치료를 위한 약물의 합성에 사용된다.

Description

2'-불소-4'-치환-뉴클레오시드, 제조 방법 및 용도{2'-FLUORO-4'-SUBSTITUTED NUCLEOSIDES, THE PREPARATION AND USE}

본 발명은 뉴클레오시드 유사체, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 2'-불소-4'-치환-뉴클레오시드 유사체, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

1981년 미국에서 첫번째 사례의 AIDS 환자가 발견된 후, 1983년까지 과학자들이 AIDS 바이러스(HIV)를 분리 및 동정한 결과, 9749 개의 뉴클레오티드로 이루어진 HIV 만이 Retroviridae 과의 Lentivirinae 아과로 분류되었다. 관련 연구 결과에 따라, HIV 바이러스의 복제 과정은 하기의 단계들로 나누어질 수 있다: 바이러스 흡착, 침입 및 피막제거, 역전사, 바이러스 융합, 바이러스 RNA와 단백질의 합성, 융합, 방출 및 성숙. 이러한 단계들은 각각 항-HIV약물을 스크리닝하기 위한 표적으로 사용될 수 있 있으며, 단백질의 합성과 바이러스 게놈 DNA 복제는 가장 중요한 단계이다. 현재, 항-HIV약물의 스크리닝은 역전사효소(RT) 억제제, 단백질 합성 억제제 및 역전사효소 작용 억제제를 포함한 특이성 효소의 억제제를 찾는데 집중되어 있다. HIV의 역전사효소는 일종의 다기능 효소인 동시에 RNA 의존성 DNA 폴리머라아제, DNA 의존성 DNA 폴리머라아제 및 Rhase H의 활성이 있다. 우선, 바이러스 게놈 RNA를 주형으로 하고 숙주세포 RNA를 프라이머로 이용하여 HIV의 DNA 사슬(-) 합성을 진행한후, 같은 방식으로 DNA 사슬(+)를 합성한다. 역전사를 마친후, HIV가 가진 모든 유전 정보는 단일 가닥 RNA로부터 이중 가닥 mDNA로 전환된다. 역전사효소 억제제는 mDNA의 신장을 억제할 수 있고 HIV의 역전사 과정을 방해할 수 있어 AIDS의 화학치료를 위한 약물로 사용되고 있다. 억제제의 작용 원리가 다름에 따라, 이들 약물은 다음과 같이 두 가지로 분류할 수 있다: 1)뉴클레오시드 역전사효소 억제제. 이는 바이러스 DNA에 십입되어 상기 바이러스 DNA가 결함 DNA로 되는 것을 촉진하여 HIV DNA 역전사 과정에서 HIV가 숙주 세포와의 융합후 다시 복제될 수 없도록 함으로써 항-HIV 작용을 달성한다. 오늘날 입수가능한 약물로는 지도부딘(AZT), 디다노신(ddI), 잘시타빈(ddC), 스타부딘(d4T), 라미부딘(3TC), 아배카비어(Abacavir) 등이 있다. 2) 비뉴클레오시드 역전사효소 억제제. 이는 HIV RNA가 역전사효소(RT)에 직접 결합하는 것을 방지하여 DNA로 암호화되는 것을 방지하는 작용을 한다. 현재 입수가능한 약물로는 네비라핀(Nevirapine), 델라비리딘(Delavirdine) 및 에파비렌즈(Efavirenz) 등이 있다.

1987년에 최초로 시장에 출시된 상업적인 항-HIV 약물인 지도부딘은 뉴클레오시드 역전사효소 억제제이다. 이 약물은 독성이 아주 높고 어떤 환자는 완전히 치료할 수 없었지만 증상을 약화시킬 수 있고 환자들의 생명을 연장시킬 수 있다. 그후 몇가지 항-HIV 뉴클레오시드 유사체 약물이 시중에서 입수가능하게 되었다. 따라서, 뉴클레오시드 유사체는 HIV 활성이 있는 화합물들의 중요한 부류로서 간주되고 있다. 그러나, 현재 이런 약물은 일부의 결점이 있는데, 한편으로는 약물의 효과가 제한적이고, 다른 한편으로는 장기 복용시 심각한 독성과 부작용 및 약물 내성이 발생하게 된다. 따라서, 신규 뉴클레오시드 유사체의 합성은 여전히 중요한 연구 방향이다. 더욱더 효과적인 뉴클레오시드 항바이러스 약물을 발견하기 위해, 불소-함유 뉴클레오시드 유사체를 포함한 뉴클레오시드에 대한 다양한 화학적 변형이 이루어져 왔다(Clark, J. PCT Patent Appl., WO 2005003174; Ismaili, H.M.A. PCT Patent Appl., WO 0160315A22001). 연구 결과, 이러한 화합물들은 상이한 수준의 항바이러스 활성이 있으며, 항바이러스활성이 있는 신규한 형태의 화합물들인 것으로 확인되었다. 그러나, 오늘날 이용가능한 문헌에서, 본 발명의 2-플루오로-4'-치환-D- 및 L-뉴클레오시드 유사체의 합성, 및 항-HIV, 항-HBV 및 항-HCV 약물의 제조에서 상기 유사체들의 이용에 관한 관련 보고는 전혀 찾을 수 없다.

본 발명의 주요 목적은 2'-플루오로-4'-치환-뉴클레오시드 유사체를 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 이러한 화합물의 합성 방법을 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 약학 분야에서 이러한 화합물의 용도를 제공함에 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 기술적 해결 방안은 다음과 같다:

본 발명의 2'-플루오로-4'-치환 뉴클레오시드 유사체는 하기 화학식 1의 구조를 갖는다:

상기 식에서,

상기 화합물은 화학식 1의 화합물 또는 이의 프로드러그 또는 이의 5'-인산염 에스테르와 무기 또는 유기 산의 반응을 통해 얻어지는 염의 형태로 존재할 수 있다.

상기 화합물은 하기의 화합물들중 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:

또한, 본 발명은 HBV, HCV 또는 HIV에 대한 항바이러스 약물과 같은 약물의 제조에서 2'-플루오로-4'-치환 뉴클레오시드 유사체의 용도에 관한 것인데, 상기 항-HBV 바이러스 약물은 B형 간염 항바이러스 약물이고, 상기 항-HIV 바이러스 약물은 항-AIDS 약물이며, 상기 항-HCV 바이러스 약물은 C형 간염 항바이러스 약물이다. 또한, 본 발명은 2'-플루오로-4'-치환-뉴클레오시드 유사체의 제조 반응에 관한 것이다. R=N₃일때, 반응 경로는 다음과 같다:

화합물 ii의 합성: 화합물 i (D-리보오스 또는 L-리보오스)를 HCl/MeOH에 용해한다. 그 용액을 밀폐 및 따뜻한 상태로 유지하면서 물중탕에서 교반한다. 그 용액에 피리딘을 첨가하여 반응을 중지한 다음, 감압하에 증발시켜, 밝은 황색의 시럽상태의 화합물 ii를 얻는다.

화합물 iii의 합성: 상기 화합물 ii를 건조 피리딘에 용해시키고, 그 용액에 얼음 소금 중탕에서 염화벤조일을 서서히 적가한 다음, 실온에서 교반하여 반응시킨다. 반응이 끝난 다음, 반응액을 얼음물에 부어 클로로포름으로 추출한다. 유기층을, 수층이 약알칼리성을 나타낼 때까지 얼음물, 미리 냉각한 황산 및 포화 중탄산나트륨으로 순차적으로 세척한 후, 다시 수층이 중성이 될 때까지 얼음물로 세척한다. 그 용액을 무수황산나트륨으로 건조시킨후, 감압하에 증발시켜서, 담황색의 시럽상태의 화합물 iii를 얻는다.

화합물 iv의 합성: 상기 벤조일 화합물 iii을 클로로포름에 용해시키고, 적인을 첨가하고, 그 용액을 얼음물 중탕에서 교반하면서 브롬을 서서히 적가한다. 그 용액을 약 30 분간 교반한 후, 얼음물을 서서히 적가하면서 실온에서 교반한다. 다음에, 그 용액에 얼음 부스러기를 첨가하고 얼음이 녹을 때까지 교반한 다음, 그 반응 용액을 얼음물에 부어 클로로포름으로 추출한다. 유기층을 수층이 약알칼리성을 나타낼 때까지 포화 중탄산나트륨으로 세척한 후, 다시 수층이 중성이 될 때까지 얼음물로 세척한다. 그 용액을 무수황산나트륨으로 건조시킨후, 감압하에 증발시켜, 어두운 황색의 시럽을 얻는다. 끝으로, 그 시럽을 실리카 겔 컬럼으로 분리시켜, 백색의 건조한 시럽상태의 화합물 iv를 얻는다.

화합물 v의 합성: 화합물iv를 건조한 피리딘중에 용해시키고, 그 용액에 얼음 중탕에서 초산 무수물을 서서히 적가한 다음, 30 분간 교반한다. 다음에, 얼음물 중탕을 제거하고, 그 용액을 실온에서 7 시간 교반하고,40 ℃ 까지 가열하고, 이 온도에서 1 시간 유지한다. 얼음 부스러기를 그 용액에 첨가하고, 얼음이 녹을 때까지 교반한다. 다음에, 그 반응 용액을 얼음물에 부어 클로로포름으로 추출한다. 유기층을 수층이 약알칼리성을 나타낼 때까지 얼음물, 미리 냉각한 황산 및 포화 중탄산나트륨으로 순차적으로 세척한 후, 수층이 중성을 나타낼 때까지 얼음물로 세척하고, 무수황산나트륨으로 건조시킨후, 감압하에 증발시켜서, 담황색의 시럽상태의 화합물 v를 얻는다.

화합물 vi의 합성: 상기 화합물 v를 건조한 디클로로메탄에 용해하고, 건조한 HCl기체를 얼음물 중탕에 서서히 첨가한다. 그 용액을 얼음물로 세척하여 유기층을 분리한다. 그 유기층을 수층이 약알칼리성을 나타낼 때까지 포화 중탄산나트륨으로 세척한 후, 수층이 중성을 나타낼 때까지 얼음물로 세척한 다음, 무수황산나트륨으로 건조시킨후, 감압하에 증발시켜 담황색 시럽을 얻는다. 상기 시럽을 재결정화하여 백색 고체 화합물 vi를 얻는다.

화합물 vii의 합성: 화합물 vi를 건조 디클로로메탄과 건조 DMF에 용해시키고, 그 용액을 약 -15℃ 에서 교반하면서 SO₂Cl₂를 서서히 적가한다. 그 용액을 -15 ℃에서 약 30 분간 교반하고 자연적으로 실온까지 가온하여 반응시킨다. 다음에, 그 용액에 이미다졸을 0 ℃에서 3 차례에 걸쳐 첨가하고, 그 혼합액을 실온에서 교반한다. 반응이 끝난후, 그 반응액에 CH₂Cl₂를 첨가하여 희석한 다음, 얼음물로 세척한다. 수층은 CH₂Cl₂로 추출한다. 유기층들을 합친후 무수황산나트륨으로 건조시킨 다음, 감압하에 증발시켜 담황색 시럽을 얻는다. 상기 시럽을 실리카 겔 컬럼으로 분리 및 정제하여 백색 고체 화합물 vii를 얻는다.

화합물 viii의 합성: 상기 화합물 vii를 아세트산에틸에 용해시키고, 교반하면서 Et₃N·3HF를 첨가한다. 그 용액을 약 60 ℃까지 가열하고, 약 3 시간 교반한 다음, 70 ℃까지 가열하고 약 1.5 시간 교반한다. 얼음소금물을 첨가하여 반응을 중지시킨후, 디클로로메탄으로 추출한다. 다음에, 유기층들을 합친후, 소금물, 물 및 포화 중탄산나트륨으로 순차적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압하에 증발시켜 어두운 황색 시럽을 얻는다. 상기 시럽을 정제하여 담황색 시럽을 얻는다. 끝으로, 상기 조생성물을 재결정화하여 백색의 결정질 화합물 viii를 얻는다.

화합물 ix의 합성: 상기 화합물 viii를 무수 디클로로메탄에 용해시키고, HBr-AcOH의 혼합용액을 첨가한다. 그 용액을 실온에서 교반하여 반응시킨다. 반응이 끝난후, 그 혼합물을 건조상태까지 증발시키고, 그 잔류물을 디클로로메탄으로 용해시킨다. 상기 디클로로메탄 용액을 중탄산나트륨 용액으로 세척하고, 디클로로메탄을 증발 제거하여 시럽상태의 생성물을 얻는다. 한편, 보호된 시토신과 (NH₄)₂SO₄를 HMDS에서 질소 분위기에서 환류시킨다. 반응이 끝난후, 용매를 감압하에 증발 제거하여 실릴화 시토신을 얻는다. 상기 반응에서 얻은 시럽상태의 물질을 디클로로에탄에 용해한 다음, 상기 실릴화 시토신에 첨가한다. 다음에, 그 혼합물을 N₂분위기에서 환류시키고, 얼음으로 반응을 중지시킨다. 다음에, 그 용액을 디클로로메탄 및 소금물로 추출하고, 디클로로메탄 층을 차례로 포화 중탄산나트륨과 소금물로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시킨다. 건조후, 용매를 증발 제거하여 백색 고체를 얻는다. 상기 백색 고체를 컬럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 ix를 얻는다.

화합물 x의 합성: 상기 화합물 ix를 포화된 NH₃-CH₃OH에 용해시키고 실온에서 교반하여 반응시킨다. 반응이 끝난후, 용매를 건조상태까지 증발시키고, 남아있는 물질을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 x를 얻는다.

화합물 xi의 합성: 상기 화합물 x，이미다졸 및 트리페닐포스핀을 테트라하이드로퓨란에 용해하고, 그 용액에 요오드 함유 테트라하이드로퓨란 용액을 서서히 적가하고, 실온에서 교반하여 반응시킨다. 반응이 끝난후, 용매를 증발 제거하고, 그 잔류물에 아세트산에틸을 첨가하고 여과한다. 아세트산에틸을 증발, 제거한후, 그 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 xi를 얻는다.

화합물 xii의 합성: 상기 화합물 xi를 테트라하이드로퓨란에 용해시키고, DBU를 첨가한후, 약 60 ℃ 온도에서 교반하여 반응시킨다. 반응이 끝난후, 용매를 건조상태까지 증발시키고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 xii를 얻는다.

화합물 xiii의 합성: ICI가 용해된 DMF 용액을 약 0 ℃에서 NaN₃가 용해되어 있는 DMF용액에 첨가한다. 그 용액을 동결온도에서 약 10분간 교반한 후, 상기 화합물 xii가 용해되어 있는 DMF용액을 천천히 상기 용액에 적가하여 반응시킨다. 반응이 끝난후, 혼합액에, 요오드의 컬러가 완전히 없어질 때까지 아황산나트륨을 첨가한다. 용매를 감압하에 증발 제거하고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 xiii를 얻는다.

화합물 xiv의 합성: 상기 화합물 xiii를 DMF에 용해하고, 교반하면서 초산은을 첨가하고, 실온에서 반응시킨다. 반응이 끝난후, 그 용액을 여과한다. 용매를 감압하에 제거하고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 xiv를 얻는다.

화합물 xv의 합성: 상기 화합물 xiv를 메탄올-트리에틸아민의 용액에 용해하고, 실온에서 교반하여 반응시킨다. 반응이 끝난후, 용매를 증발, 제거하고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 xv를 얻는다.

또한, 본 발명은 2'-플루오로-4'-치환 뉴클레오시드 유사체의 제조 반응에 관한 것이다. R=CH₃, CN 또는 C≡CH인 경우, 반응 경로는 다음과 같다:

화합물 b의 합성: 화합물 a를 아세톤에 첨가하고, 실온에서 교반하면서 진한 황산을 첨가하고, 그 용액을 교반하여 반응시킨다. TLC로 분석하여 반응이 끝난 것으로 확인된후, 그 용액에 진한 암모니아수를 첨가하여 pH값을 조절하고, 여과하고, 감압하에 증발시켜 대부분의 아세톤을 제거한다. 다음에, 0.4% 묽은 염산을 교반하면서 첨가하고, 화합물 a 가 화합물 b로 완전히 가수분해될 때까지 아세톤 환류 조건하에서 반응을 수행한다. 다음에, 그 반응 용액을 고체 NaHCO₃로 중화한 다음, 여과하고, 그 여과액을 감압하에 증발시켜 용매를 제거한다. 그 잔류물을 디클로로메탄으로 용해하고, 무수 Na₂SO₄로 건조킨 후 여과한 다음, 증발시켜 용매를 제거하여, 황색의 점착성 유상 화합물 b를 얻는다.

화합물 c의 합성: 상기 화합물 b와 트리에틸아민을 디클로로메탄으로 용해시킨다. 그 용액에 얼음소금 중탕에서 파라클로로벤조일 클로라이드를 서서히 적가하고, 0 ℃ 이하의 온도에서 기계적으로로 교반하여 반응시킨다. 반응이 끝난후, 그 용액에 포화 NaHCO₃용액을 첨가한다. 디클로로메탄층을 물 및 포화 식염수로 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조시키고, 여과한 다음, 감압하에 증발시켜 용매를 제거한다. 그 잔류물을 재결정화하여 백색 결정질 화합물 c를 얻는다.

화합물 d의 합성: 상기 화합물 c를 무수 디클로로메탄에 용해시키고, 질소 분위기에서 이미다졸과 3차-부틸클로디메틸실란 (TBDMSCl)을 첨가하여 실온에서 반응시킨다. 반응이 끝난후, 그 반응액을 염산으로 중화시켜, 두 층을 얻는다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨후, 증발시켜 용매를 제거한다. 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 d를 얻는다.

화합물 e의 합성: 상기 화합물 d를 메톡시화나트륨-메탄올의 혼합용액에 용해하여 실온에서 반응시킨다. 반응이 끝난후, 그 용액을 묽은 초산으로 중화하고, 여과하고, 메탄올로 세척한 다음, 감압하에 증발시켜 용매를 제거한다. 끝으로, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 e를 얻는다.

화합물 f의 합성: 약 -60℃의 온도에서 옥살릴 클로라이드의 디클로로메탄 용액에 천천히 DMSO를 적가한 후, 그 용액을 같은 온도에서 15분간 교반한 후, 상기 화합물 e의 디클로로메탄 용액을 적가한다. 그 용액을 약 -65 ℃의 온도에서 약 30 분간 교반하여 반응시킨후, 트리에틸아민을 첨가하고, 실온에서 교반하여 반응시킨다. 반응이 끝난후, 반응액에 물을 첨가하여 유기층을 분리하고, 그 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 증발 제거하고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 f를 얻는다.

화합물 g의 합성: 반응 용기에 수산화나트륨과 물을 넣어 교반한 후, 포르말린 용액과 95% 에틸 알코올을 첨가한후, 상기 화합물 f를 첨가하여 약 35 ℃의 온도에서 교반하여 반응시킨다. 반응이 끝난후, 생성물이 완전히 침전될 때까지 교반하는 동시에, 얼음물로 반응 용기를 냉각시킨다. 흡인 여과한 후, 고체 생성물을 물로 중성이 될 때까지 세척한 후, 건조시키고, 얻은 고체를 무수 메틸 알코올에 용해한 후, 수소화붕소 나트륨을 첨가하여 환류반응시킨다. 반응이 끝난후, 그 반응액을 묽은 염산으로 중화시키고, 디클로로메탄으로 추출하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨후, 용매를 증발 제거하여 화합물 g를 얻는다.

화합물 h의 합성: 상기 화합물 g를 메틸 알코올에 용해하고, Dowex H⁺(메틸 알코올로 미리 세척됨)를 첨가하여 실온에서 반응시킨다. 반응이 끝난후, 수지를 여과하여 제거하고 메틸 알코올로 반복적으로 세척한다. 그 용액을 증발시켜 고체를 얻는다. 얻은 고체를 아세톤에 용해시킨후, 실온에서 교반하면서 진한 황산(촉매량)을 서서히 첨가하여 반응시킨다. 진한 암모니아수를 반응액에 첨가하여 pH값을 조절하고, 여과하고 감압하에 증발시켜 아세톤을 제거하여 화합물 h를 얻는다.

화합물 i의 합성: -60℃의 온도에서 옥살릴 클로라이드의 디클로로메탄용액에 DMSO를 적가한후, 그 용액을 약 15분간 교반하고 화합물 h의 디클로로메탄 용액을 첨가한다. 약 -60℃의 온도에서 약 30분간 반응시킨 후, 트리에틸아민을 상기 용액에 첨가하여 실온에서 약 30분간 반응시킨다. 다음에, 물을 첨가하여 반응을 중지시킨다. 유기층을 분리하고 무수 Na₂SO₄로 건조시킨다. 용매를 증발 제거한후, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 고체 생성물을 얻는다. ClCH₂P(C₆H₅)₃Cl을 무수 테트라하이드로퓨란에 첨가하고, 약 -78 ℃까지 냉각시킨후, n-BuLi의 핵산 용액을 첨가하여 약 1 시간 교반한 후, 상기 고체 생성물의 건조 테트라하이드로퓨란 용액을 첨가한다. 상기 용액의 온도를 약 0 ℃까지 점차적으로 증가시켜 계속 반응시킨다. 반응이 끝난후, 포화된 NH₄Cl 용액을 상기 반응액에 조심스럽게 첨가하고, 그 용액을 아세트산에틸로 추출한다. 유기층을 소금물로 두번 세척한 후, 무수 MgSO₄로 건조하고, 감압하에 증발시켜 용매를 제거한다. 얻어지는 잔류물을 무수 테트라하이드로퓨란에 용해하고, 약 -78 ℃까지 냉각시킨후, n-BuLi핵산 용액을 천천히 적가한다. 그 용액을 약 2 시간 교반하여 반응시킨후, 조심스럽게 포화 NH₄Cl 용액으로 반응을 중지시킨다. 유기층을 포화 식염수로 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조시키고, 감압하에 증발시켜 용매를 제거한다. 끝으로, 그 잔류물을 급속 실리카 겔 컬럼으로 분리 및 정제하여 화합물 i를 얻는다.

화합물 j의 합성: 상기 화합물 i를 묽은 염산 용액에 첨가하고 실온에서 교반하여 반응시킨다. 반응이 끝난후, 그 반응액을 고체 NaHCO₃로 중화한후 여과한다. 그 여액을 감압하에 증발시켜 용매를 제거한다. 그 잔류물을 디클로로메탄으로 용해시킨후, 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과한 후 증발시켜 용매를 제거하여 화합물 j를 얻는다.

화합물 k의 합성: 상기 화합물 j를 피리딘에 용해하고, BzCl를 적가하여 실온에서 반응시킨다. 반응이 끝난후, 용매를 건조상태까지 증발시키고, 그 잔류물을 정제하여 화합물 k를 얻는다.

화합물 l의 합성: 상기 화합물 k와 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-N-옥사이드를 디클로로메탄에 용해하고, 그 용액을 약 0℃까지 냉각시키고, 차아염소산 나트륨 용액, NaHCO₃및 물의 혼합 용액을 상기 반응액에 첨가하여, 약 0 ℃의 온도에서 약 30분간 반응시킨후, 그 반응액에 이소프로파놀을 첨가하여 실온에서 교반한다. 분리한 디클로로메탄층을 물로 두번 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조시킨후 여과한다. 그 여액을 증발시켜 용매를 제거하고, 그 잔류물을 재결정화하여 화합물 l를 얻는다.

화합물 m의 합성: 상기 화합물 l를 무수 에틸 알코올과 아세트산에틸의 혼합액에 용해하고, 그 용액을 약 0℃까지 냉각시킨후, 수소화붕소나트륨을 몇번으로 나누어 첨가하고 교반하여 반응시킨다. 반응이 끝난후, 그 반응액을 묽은 초산으로 중화하, 여과한후, 그 여과액을 증발시킨다. 그 잔류물을 디클로로메탄으로 용해하고 물로 세척한다. 디클로로메탄층은 무수 MgSO₄로 건조시킨후 여과하고, 감압하에 증발시켜 용매를 제거한후, 그 잔류물을 디클로로메탄과 석유 에테르의 혼합용액으로 재결정화하여 고체 생성물을 얻는다. 다음에, 얻은 고체 생성물을 피리딘에 용해하고, 약 0 ℃의 온도에서 BzCl을 적가한후 실온에서 반응시킨다. 반응이 끝난후, 용매를 증발 제거하고, 그 잔류물을 아세트산에틸로 추출하고, 포화 NaHCO₃용액으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨후 여과하고, 증발시켜 용매를 제거하고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 m을 얻는다.

화합물 n의 합성: 상기 화합물 m을 메틸 알코올에 용해시킨후, 진한 염산/디옥산의 혼합용액을 첨가하여 실온에서 반응시킨다. 반응이 끝난후, 그 반응액을 NaHCO₃로 중화하고, 여과한다. 그 여액을 진공 증류하여 용매를 제거한 다음, 그 잔류물을 적당량의 디클로로메탄에 용해시키고, 무수 Na₂SO₄로 밤새 건조시키고, 여과하고, 건조상태까지 증발시키고, 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 n을 얻는다.

화합물 o의 합성: 상기 화합물 n을 디클로로메탄에 용해시킨후, 실온에서 DAST를 첨가하고 교반하여 반응시킨다. 반응이 끝난후, 그 반응액을 포화 NaHCO₃용액에 첨가하여 유기층을 분리하고, 그 유기층을 포화 NaHCO₃용액으로 세척한 후 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 o를 얻는다.

화합물 p의 합성: 상기 화합물 o를 포름산 용액에 첨가하고, 실온에서 교반하여 반응시킨다. 반응이 끝난후, 그 용액을 감압하에 증발시켜 용매를 제거하고, 그 잔류물을 톨루엔과 함께 증발시켜 고체 생성물을 얻는다. 얻은 고체 생성물을 건조한 피리딘과 초산 무수물의 용액에 용해시키고 실온에서 반응시킨다. 반응이 끝난후, 반응액을 농축시킨후 톨루엔과 함께 증발시켜 화합물 p를 얻는다.

화합물 q의 합성: 상기 화합물 p를 무수 디클로로메탄에 용해시키고 약 0℃까지 냉각시킨후 HCl 기체를 서서히 첨가하여 포화시킨다. 그 용액을 실온에서 진공 증발시켜 용매를 제거하고, 그 잔류물을 진공 건조하여 화합물 q를 얻는다.

화합물 r의 합성: 2,6-아미노퓨린과 헥사메틸디실라잔(HMDS)을 (NH₄)₂SO₄의 존재하에서 가열 및 환류시켜 투명 용액을 얻는다. 상기 용매를 진공하에 제거하여 백색 고체를 얻은후, 그 고체 생성물을 1,2-디클로로에탄에 용해시킨다. 다음에, 상기 화합물 q의 1,2-디클로로에탄 용액 및 분자체를 첨가하고, 그 용액을 질소 분위기에서 실온에서 교반하여 반응시킨다. TLC로 분석하여 완전히 반응한 것으로 확인된 후, 반응액에 디클로로메탄을 첨가하고, 규조토로 여과한다. 그 여과액을 포화 NaHCO₃과 식염수로 각각 세척한 후, 유기층을 무수 Na₂SO₄로 밤새 건조시키고, 용매를 증발, 제거하여 잔류물을 얻는다. 그 잔류물을 감압하에 실리카 겔 컬럼으로 분리하여 화합물 r을 얻는다.

화합물 s의 합성: 상기 화합물 r을 NH₃-CH₃OH 포화 용액에 용해시킨후, 실온에서 교반하여 반응시킨다. 반응이 끝난후, 용매를 증발시켜 제거하고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 s를 얻는다.

본 발명의 유익한 효과는 글리코실 및 염기에 대한 화학적 변형을 통해, D- 및 L-뉴클레오시드 유사체가 플루오로기, 알키닐, 아지드, 시아노 등과 같은 특수구조를 함유함으로써, 더욱 독성의 부작용 및 작은 활성과 같은, 오늘날의 D- 및 L-뉴클레오시드 유사체의 결점을 극복할 수 있다는 것이다. 또한, 이러한 합성 방법이 항-HBV, 항-HCV 또는 항-HIV 약물의 제조에 사용되는 때 간편하고 고수율로 실시될 수 있어서, 우수한 가치를 갖는다.

이하, 본 발명을 바람직한 실시예를 참조로 화학식 1에서 나타낸 화합물의 합성 경로에 따라 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 이들 바람직한 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1: 염기가 시토신인 경우의 화합물 15의 합성

화합물 ii의 합성: 화합물 i(D-리보오스 또는 L-리보오스)(8.66mmol)를 31.2 ml HCl/MeOH(0.02mmol/L)에 용해시키고, 그 용액을 밀폐 및 따뜻한 상태로 유지하면서 27 ℃의 물중탕에서 3 시간 교반한 후, 7.8 ml 피리딘을 첨가하여 반응을 중지시킨후, 감압하에 증발시켜 황색 시럽상태의 화합물 ii(96%)를 얻었다.

화합물 iii의 합성: 상기 화합물 ii(7.92mmol)를 21 ml의 건조한 피리딘에 용해하고 얼음소금 중탕에서 5.2 ml의 염화 벤조일(0.0447 mol)을 서서히 적가한후, 그 용액을 실온에서 17 시간 교반했다. 그 반응액을 39 ml의 얼음물에 첨가하고, 클로로포름으로 추출했다. 유기층을 수층이 약알칼리성을 나타낼 때까지 얼음물, 3 mol/L의 황산 및 포화 중탄산나트륨 용액으로 순차적으로 세척한 후, 수층이 중성을 나타낼 때까지 얼음물로 세척하고, 무수황산나트륨으로 4 시간이상 건조시킨후, 감압하에 증발시켜 담황색의 시럽상태의 화합물 iii(80.0%)를 얻었다. ¹H NMR(CDCl₃) δppm: 7.28~8.10(m, 15H, OBz), 5.87(m, 1H, H-3), 5.68(d, 1H, H-2), 5.16(s, 1H, H-1), 4.72(m, 2H, H-5), 4.52(q, 1H, H-4), 3.42(s, 3H, OCH₃).

화합물 iv의 합성: 상기 벤조일 화합물 iii(0.0027 mol)을 13 mol 클로로포름에 용해하고 적인(390 mg，0.0126 mol)을 첨가하고, 얼음 중탕에서 교반하면서 브롬(1.3 ml，0.025 mmol)을 서서히 적가하였다. 30분 동안 교반한 후, 실온에서 1.3ml의 얼음물을 서서히 적가하고 그 용액을 실온에서 4 시간 교반하고, 7g의 얼음 부스러기를 첨가하고 얼음이 녹을 때까지 교반했다. 다음에, 상기 반응액을 14 ml의 얼음물에 넣어 클로로포름으로 추출했다. 유기층을 포화 중탄산나트륨으로 수층이 약알칼리성이 될 때까지 세척한 후, 얼음물로 수층이 중성이 될 때까지 세척한 다음, 무수 황산나트륨으로 4 시간 건조시킨후, 감압하에 증발시켜 어두운 황색 시럽을 얻었다. 그 황색 시럽을 실리카 겔 컬럼으로 분리(석유 에테르: 아세톤 기울기 용리)시켜 백색의 건조한 시럽상태의 화합물 iv(64.2%)를 얻었다.¹H NMR(CDCl₃) δppm: 7.32~8.10(m, 15H, OBz), 5.90(m, 1H, H-3), 5.70(d, 1H, H-2), 5.63(s, 1H, H-1), 4.55~4.79(m, 3H, H-5, H-4).

화합물 v의 합성: 화합물 iv (2.73 mmol)를 5 ml의 건조한 피리딘에 용해하고, 얼음소금중탕에서 무수초산(0.0276 mol)을 천천히 적가하고 30 분간 교반했다. 다음에, 상기 얼음물 중탕을 제거한후, 그 용액을 실온에서 약 7 시간 교반한 다음, 40 ℃ 까지 가열하고, 이 온도에서 1 시간 유지했다. 그 용액에 6.5g의 얼음 부스러기를 첨가한 다음, 그 얼음 부스러기가 녹을 때까지 교반했다. 그 반응액을 13ml의 얼음물에 넣어 클로로포름으로 추출했다. 유기층을 수층이 약알칼리성을 나타낼 때까지 얼음물, 3mol/L 황산 및 포화 중탄산나트륨으로 순차적으로 세척한 후, 수층이 중성이 될 때까지 얼음물로 세척한 다음, 무수 황산나트륨으로 4 시간이상 건조시킨후, 감압하에 증발시켜 담황색의 시럽상태의 화합물 v(92.1%)를 얻었다.¹H NMR(CDCl₃) δppm: 7.30~8.10(m, 15H, OBz), 6.43(s, 1H, H-1), 5.90(m, 1H, H-3), 5.80(d, 1H, H-2), 4.50~4.80(m, 2H, H-5), 2.00(s, 3H, CH₃COO-).

화합물 vi의 합성: 상기 화합물 v (2.57mmol)를 26 ml의 건조한 디클로로메탄에 용해하고 얼음물 중탕에서 건조 HCl기체를 2.5 시간 동안 서서히 첨가했다. 그 용액을 19.5ml의 얼음물로 세척하고 유기층을 분리했다. 유기층을 수층이 약알칼리성을 나타낼 때까지 포화 중탄산나트륨으로 세척한 다음, 수층이 중성을 나타낼 때까지 얼을물로 세척한 후, 무수황산나트륨으로 4 시간 이상 건조시킨후, 감압하에 증발시켜 담황색 시럽을 얻었다. 상기 시럽을 N-핵산 및 디클로로메탄의 혼합용액으로 재결정화하여 백색 고체 화합물 vi(65.1%)를 얻었다.¹H NMR(CDCl₃) δppm: 7.36~8.14(m, 15H, OBz), 6.68(d, J=4.4Hz, 1H, H-1), 5.59(dd, 1H, H-3), 4.64~4.80(m, 4H, H-2, H-4 and H-5). M.p.139~140℃.

화합물 vii의 합성: 상기 화합물 vi(2.81 mmol)를 13ml의 건조한 디클로로메탄과 3.5 ml 건조한 DMF에 용해하고, 약 -15℃ 에서 교반하면서 SO₂Cl₂(0.0079 mmol)를 상기 용액에 적가했다. -15℃에서 약 30분 교반한 후, 그 용액을 3 시간동안 상온까지 자연적으로 가온시켰다. 그 용액에 0 ℃에서 이미다졸(0.0407mmol)을 세 번에 걸쳐 첨가하고, 그 혼합액을 실온에서 15 시간 교반했다. 반응이 끝난후, 반응액에 CH₂Cl₂(26ml)를 첨가하여 희석시킨후, 얼음물(35ml)로 세척했다. 수층은 CH₂Cl₂로 추출했다. 다음에, 유기층들을 합친 후, 무수황산나트륨으로 4 시간이상 건조시킨후, 감압하에 증발시켜서 담황색 시럽을 얻었다. 상기 시럽을 실리카 켈 컬럼으로 분리 및 정제(석유 에테르: 아세톤 기울기 용리)하여 백색 고체 화합물 vii(76.0%)를 얻었다.¹H NMR(CDCl₃) δppm: 7.00~8.10(m, 15H, OBz), 6.71(d, J=4.4Hz, 1H, H-1), 5.59(dd, 1H, H-3), 5.25(dd, 1H, H-2), 4.56~4.81(m, 3H, H-4, H-5). M.p.128~129℃.

화합물 viii의 합성: 상기 화합물 vii (2.2 mmol)를 아세트산에틸(54 ml)에 용해시킨후 교반하면서 Et₃N·3HF(2.08 ml，0.013 mmol)를 첨가했다. 그 용액을 60℃까지 가열하여 약 3 시간 교반한다음, 70 ℃ 까지 가열하여 약 1.5 시간 교반하였다. 얼음소금물(10 ml)을 첨가하여 반응을 중지시킨후 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층들을 합친 후 소금물, 물 및 포화 중탄산나트륨으로 순차적으로 세척한 다음, 무수 황산나트륨으로 4 시간이상 건조시켰다. 용매를 감압하에 증발시켜 어두운 황색 시럽을 얻은후, 상기 시럽을 실리카 겔 깔때기(5cm×5cm)를 이용하여 정제(디클로로메탄으로 용리)시켜 담황색 시럽(86.8%)을 얻었다. 끝으로, 상기 조생성물을 95%의 에틸 알코올 용액중에서 결정화시켜 백색 고체인 화합물 viii(66.4%)를 얻었다.¹H NMR(CDCl₃) δppm: 7.31~8.10(m, 15H, OBz), 6.71(d, J=9.0Hz, 1H, H-1), 5.68(dd, J=19.44Hz, 1H, H-3), 5.32(d, J=48.2Hz, 1H, H-2), 4.65~4.77(m, 3H, H-4, H-5). M.p.80~82℃.

화합물 ix의 합성: 상기 화합물 viii (6.0 mmol)를 무수 디클로로메탄(20 ml)에 용해하고 HBr-AcOH(45%，V/V，4.6 ml，25 mmol)의 혼합용액을 첨가했다. 그 용액을 실온에서 20 시간 교반하여 반응시켰다. 반응이 끝난후, 그 혼합물을 건조상태까지 증발시키고, 그 잔류물을 디클로로메탄(50ml)으로 용해시키고, 중탄산나트륨 용액(3×30ml)으로 디클로로메탄 용액을 세척했다. 디클로로메탄을 증발 제거하여 시럽상태의 생성물을 얻었다. 한편, 보호된 시토신(15mmol)과 (NH₄)₂SO₄(0.1g)을 질소 분위기에서 HMDS (30 ml)에서 17 시간 환류시켰다. 반응이 끝난후, 용매를 감압하에 증발 제거하여 실릴화 시토신을 얻었다. 상기 반응에서 얻은 시럽상태의 생성물을 디클로로에탄(25 ml)에 용해하고 상기 실릴화 시토신에 첨가하고, 그 혼합물을 N₂ 분위기에서 15 시간 환류시키고, 얼음으로 반응을 중지시켰다. 다음에, 상기 용액을 디클로로메탄(3×45ml)을 추출하고, 그 디클로로메탄 층을 차례로 포화 중탄산나트륨과 소금물로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조후, 용매를 증발을 통해 제거하여 백색 고체를 얻었다. 상기 고체를 칼럼 크로마토그래피 (1% MeOH-CHCl₃)로 분리 및 정제하여 화합물 ix(71%)를 얻었다.¹H NMR(CDCl₃) δppm: 8.07(d, J=9.86Hz, 1H), 7.45(d, J=9.82Hz, 1H), 7.26~8.10(m, 10H, OBz), 6.03(d, J=9.0Hz, 1H, H-1), 5.64(dd, J=19.44Hz, 1H, H-3), 5.26(d, J=48.2Hz, 1H, H-2), 4.65~4.77(m, 3H, H-4, H-5).

화합물 x의 합성: 상기 화합물 ix (3.60 mmol)를 포화된 NH₃-CH₃OH(30 ml)에 용해하고, 실온에서 15 시간 교반하여 반응시킨다. 반응이 끝난후, 용매를 건조상태까지 증발시키고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(15: 1 CHCl₃- MeOH)로 정제하여 화합물 x(80%)를 얻었다.¹H NMR(CDCl₃) δppm: 8.10(d, J=9.86Hz, 1H), 7.40(d, J=9.82Hz, 1H), 6.03(d, J=9.0Hz, 1H, H-1), 5.64(dd, J=19.44Hz, 1H, H-3), 5.26(d, J=48.2Hz, 1H, H-2), 4.50(m, 1H, H-4), 3.70~3.77(m, 2H, H-5).

화합물 xi의 합성: 상기 화합물 x (9.46 mmol)，이미다졸(18.93 mmol) 및 트리페닐포스핀(14.19 mmol)을 테트라하이드로퓨란중(50 ml)에 용해하고, 요오드(14.18mmol)가 함유되어 있는 테트라하이드로퓨란 용액 15ml를 서서히 적가하여 실온에서 3 시간 교반하여 반응시켜다. 반응이 끝난후, 용매를 증발 제거하고, 그 잔류물에 아세트산에틸(100 ml)을 첨가하고 여과했다. 아세트산에틸을 증발 제거한후, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 xi(83.9%)를 얻었다.¹H NMR(CDCl₃) δppm: 8.06 (d, J=9.86Hz, 1H), 7.43(d, J=9.82Hz, 1H), 6.01(d, J=9.0Hz, 1H, H-1), 5.66(dd, J=19.44Hz, 1H, H-3), 5.22(d, J=48.2Hz, 1H, H-2), 4.57(m, 1H, H-4), 3.58~3.69(m, 2H, H-5).

화합물 xii의 합성: 상기 화합물 xi (5.88mmol)를 테트라하이드로퓨란(50ml)에 용해시키고 DBU(6.44mmol)를 첨가한후 약 60℃ 에서 3 시간 교반한 후, 용매를 건조상태까지 증발시키고, 그 잔류물을 칼럼크로마토그래피로 분리하여 화합물 xii(75.1%)를 얻었다. 이 화합물은 다음 반응에 직접 사용한다.

화합물 xiii의 합성: 0℃ 에서 Icl(13.9mmol)가 용해되어 있는 15ml의 DMF용액을 NaN₃(9.75mmol)가 용해되어 있는 DMF(15ml)용액에 첨가하고, 그 용액을 0℃에서 약 10분간 교반한 후, 상기 화합물 xii(6.8mmol)가 용해되어 있는 DMF(20ml)를 천천히 적가하여 0 ℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난후, 그 혼합액에 요오드의 컬러가 없어질 때까지 아황산나트륨을 첨가했다. 감압하에 용매를 증발 제거한후, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 xiii(77.6%)를 얻었다. 이 화합물은 다음 반응에 직접 사용된다.

화합물 xiv의 합성: 상기 화합물 xiii(5mmol)를 DMF(15ml)에 용해하고, 그 용액에 교반하면서 초산은(6mmol)을 첨가하여 실온에서 8 시간 반응시켰다. 반응이 끝난후, 반응액을 여과하고, 50℃이하에서 감압하에 용매를 증발 제거하고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 xiv(71.3%)를 얻었다.¹H NMR(DMSO-d ₆，300 MHz)δ: 8.12(d, 1H), 7.40(d, 1H), 7.26(br, 2H), 6.12(dd, 1H), 5.87(d, 1H), 5.09(t, 1H), 4.90(dt, 1H), 4.18(dt, 1H), 3.74-3.87(m, 2H), 2.12(s, 3H, CH₃).

화합물 xv의 합성: 상기 화합물 xiv (5mmol)를 5%의 메탄올-트리에틸아민 용액(100ml)에 용해하고 실온에서 12 시간 교반하여 반응시켰다. 반응이 끝난후, 용매를 증발 제거하고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 xv(89.0%)를 얻었다. ESI-MS: 287[M+H]. ¹H NMR(DMSO-d ₆，300 MHz)δ: 8.14(d, 1H), 7.32(d, 1H), 7.21(br, 2H), 6.08(dd, 1H), 5.82(d, 1H), 5.11(t, 1H), 4.92(dt, 1H), 4.16(dt, 1H), 3.62-3.69(m, 2H).

실시예2: 4'-위치 치환기가 알키닐이고 염기가 1,6-디아미노퓨린인 경우의 화합물 25의 합성

화합물 b의 합성: 화합물 a (60g)을 아세톤(2L)에 첨가하고, 진한 황산(40ml)을 교반하면서 서서히 첨가했다. 그 용액을 실온에서 40 분간 교반하여 반응시킨후, TLC로 분석하여 반응이 완료된 것으로 확인된 후, 진한 암모니아수를 첨가하여 pH=7~8로 조절하고, 여과하고, 감압하에 증발시켜 대부분의 아세톤을 제거했다. 남아있는 아세톤 및 물은 약 150ml였다. 다음에, 상기 용액에 교반하면서 0.4%의 묽은 염산(150ml)을 첨가하고, 상기 화합물 a가 화합물 b로 완전히 가수분해될 때까지 아세톤 환류 조건하에서 반응을 수행했다. 반응의 종료 후, 반응액을 고체NaHCO₃로 pH=7~8로 중화시키고, 여과시킨후, 그 여과액을 감압하에 증발시켜 용매를 제거했다. 그 잔류물을 디클로로메탄(200ml)으로 용해하고, 무수 Na₂SO₄로 밤새 건조시킨 후, 여과했다. 끝으로, 용매를 증발 제거하여 황색의 점착성 유상 화합물 b(73g，95%)를 얻었다. ESI-MS: 191[M+H].

화합물 c의 합성: 상기 화합물 b (154g，0.81mol)와 트리에틸아민(339ml，2.43mol)을 디클로로메탄(1.50L)에 용해시킨후, 그 용액을 얼음소금 중탕에서 0℃ 까지 냉각하고, 파라클로로벤조일 클로라이드(113ml，0.891mol)을 첨가하고, 0℃ 이하에서 4 시간동안 기계적으로 교반하여 반응시켰다. 반응이 끝난후, 포화 NaHCO₃ 용액(500ml)을 첨가하고, 디클로로메탄층을 물 및 포화 식염수로 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조시키고, 여과한 후 감압하에 증발시켜 용매를 제거했다. 그 잔류물을 재결정화하여 백색 결정질 화합물 c(196g，74.6%)를 얻었다. ESI-MS: 330[M+H].

화합물 d의 합성: 상기 화합물 c(0.114mol)를 무수 디클로로메탄(600ml)에 용해시키고, 질소 분위기에서 이미다졸(15.5g，0.228mol)과 3차-부틸클로로디메틸실란 (TBDMSCl) (18.9g，0.125mol)을 첨가하여 실온에서 3 시간 반응시켰다. 반응이 끝난후, 1N 염산을 첨가하여 반응액을 중화시키고, 두 층을 얻었다. 유기층을 물과 포화 식염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨후, 증발시켜 용매를 제거했다. 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 d(69.2%)를 얻었다. ESI-MS: 444[M+H].

화합물 e의 합성: 상기 화합물 d (0.64mmol)를 0.2N 메톡시화나트륨-메틸 알코올)의 혼합용액(0.2N, 15 ml)에 용해시켜 실온에서 4 시간 반응시켰다. 반응이 끝난후, 그 반응액을 묽은 초산으로 중화시키고, 여과하고, 메틸 알코올로 세척하고, 감압하에 증발시켜 용매를 제거했다. 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 e(75%)를 얻었다. ESI-MS: 305[M+H].

화합물 f의 합성: 약 -60 ℃의 온도에서 옥살릴클로라이드(3.4ml，38.7mmol)의 디클로로메탄(80.0ml) 용액에 DMSO(5.5ml，77.5mmol)를 서서히 적가하고, 그 용액을 같은 온도에서 15분간 교반한 후, 화합물 e(25.7mmol)의 디클로로메탄(100ml) 용액을 첨가했다. 그 용액을 약 -65℃의 온도에서 30분간 교반하여 반응시킨후, 트리에틸아민(10.9ml，78.2mmol)을 첨가하여 실온에서 30 분간 교반하여 반응시켰다. 반응이 끝난후, 반응 혼합물에에 물을 첨가하여 유기층을 분리했다. 그 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨후, 감압하에 증발시켜 용매를 제거했다. 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물f(94.6%)를 얻었다. ESI-MS: 303[M+H].

화합물 g의 합성: 반응 용기에 수산화나트륨(1.3g)과 물(11.5ml)을 넣고, 그 용액을 골고루 교반한 후, 30%의 포르말린 용액과 95%에틸 알코올(7.2ml)을 첨가한후, 화합물 f(25mmol)를 첨가했다. 다음에, 그 용액을 30~35℃의 온도에서 2 시간 교반하여 반응시켰다. 반응이 끝난후, 생성물이 완전히 침전될 때까지 교반하면서 얼음물로 반응 용기를 냉각시켰다. 흡인 여과 후, 고체 생성물을 물로 중성이 될때까지 세척한 후, 건조시키고, 무수 메틸 알코올에 용해한후, 수소화붕소 나트륨(0.925g，25mmol)을 첨가하고, 1 시간 환류반응시킨다. 반응이 끝난후, 묽은 염산으로 반응액을 중화시키고 디클로로메탄 (3×50ml)으로 추출하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨후, 용매를 증발 제거하여 화합물 g(90.5%)를 얻었다. ESI-MS: 335[M+H].

화합물 h의 합성: 상기 화합물 g(9.7mmol)을 메틸 알코올(260ml)에 용해하고, Dowex H⁺(40ml, 메틸 알코올로 미리 세척됨)를 첨가하여 실온에서 4 시간반응시켰다. 반응이 끝난후, 수지를 여과제거하고 메틸 알코올로 반복적으로 수지를 세척한 후, 용매를 건조시켜 고체를 얻었다. 얻은 고체를 아세톤(200ml)에 용해시킨후, 진한 황산(촉매량, 2ml)을 서서히 적가하여 실온에서 0.5 시간 반응시켰다. 그 용액에 진한 암모니아수를 첨가하여 pH를 7~8로 조절하고, 여과시킨후, 감압하에 증발시켜 대부분의 아세톤을 제거했다. 다음에, 반응 용액에 0.4%의 묽은 염산(40ml)을 첨가하고, 아세톤 환류하에서 20분간 반응시킨후, 그 반응 용액을 NaHCO₃로 중화하여 pH=7~8로 조절하고, 여과하고, 감압하에 증발시켜 용매를 제거했다. 그 잔류물을 적당량의 디클로로메탄으로 용해하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨후, 증발시켜 용매를 제거하여 화합물 h(80.2%)를 얻었다. ESI-MS: 261[M+H].

화합물 i의 합성: -60℃의 온도에서 옥살릴클로라이드(3.4ml，38.7mmol)의 디클로로메탄(80ml)용액에 DMSO(5.5ml，77.5mmol)를 적가한후, 약 15분간 교반하고, 화합물 h(25.7mmol)의 디클로로메탄(100ml) 용액을 적가한후, 약 -60℃의 온도에서 약 30분간 반응시켰다. 다음에, 트리에틸아민(10.9ml，78.2mmol)을 첨가하여 실온에서 약 30분간 반응시킨후 물을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 유기층을 분리하고 무수 Na₂SO₄로 건조시켰다. 용매를 증발 제거한후, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 고체를 얻었다. ClCH₂P(C₆H₅)₃Cl(2.15g，6.19mmol)을 무수 테트라하이드로퓨란(50ml)에 첨가하여 약 -78℃까지 냉각시킨후, n-BuLi의 핵산 용액(1.6M，4.0ml)을 첨가하여 약 1 시간 교반한 후, 상기에서 얻은 고체 생성물(1.51mmol)의 건조 테트라하이드로퓨란 용액(50ml)을 첨가했다. 냉각 온도를 약 0℃까지 점차적으로 증가시켜서 3 시간동안 계속 반응시켰다. 반응이 끝난후, 포화된 NH₄Cl용액(10ml)을 조심스럽게 첨가하고, 아세트산에틸(2×100ml)로 추출했다. 유기층을 소금물로 두번 (2×75ml) 세척한 후 무수 MgSO₄로 건조하고, 감압하에 증발시켜 용매를 제거했다. 그 잔류물을 무수 테트라하이드로퓨란(40ml)에 용해시키고, 약 -78℃까지 냉각시킨후, n-BuLi의 핵산 용액(1.6M，20ml)을 서서히 적가했다. 그 용액을 약 2 시간 교반하여 반응시킨후, 포화 NH₄Cl 용액(20ml)을 조심스럽게 첨가하여 반응을 중지시켰다. 유기층을 포화식염수로 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조시키고, 감압하에 증발시켜 용매를 제거했다. 그 잔류물을 실리카 겔 컬럼으로 분리 및 정제하여 화합물 i(48.5%)를 얻었다. ESI-MS: 255[M+H].

화합물 j의 합성: 상기 화합물 i (10mmol)를 0.2%의 묽은 염산 용액(50ml)에 첨가하고 실온에서 6 시간 교반하여 반응시켰다. 반응이 끝난후, 그 용액을 고체 NaHCO₃으로 중화반응시켜 pH=7~8로 조절하고, 여과했다. 그 여액을 감압하에 증발시켜 용매를 제거하고, 그 잔류물을 디클로로메탄으로 용해시킨후 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 다음, 여과 및 증발시켜 용매를 제거함으로써, 화합물 j(99.0%)를 얻었다. ESI-MS: 215[M+H].

화합물 k의 합성: 상기 화합물 j (5mmol)를 피리딘(20ml)에 용해시키고 BzCl(5mmol)를 적가하여 실온에서 6 시간 반응시켰다. 반응이 끝난후, 용매를 증발 제거하고, 그 잔류물을 정제하여 화합물 k(85.3%)를 얻었다. ESI-MS: 319[M+H].

화합물 l의 합성: 화합물k (59.3mmol)와 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-N-옥사이드(0.059mmol)를 디클로로메탄(99ml)에 용해시키고 약 0℃까지 냉각시키고, 차아염소산나트륨 용액(33.6ml，8.5~13.5% 활성염소), NaHCO₃(11.2g)와 물(190ml)의 혼합 용액을 상기 용액에 첨가하여 약 0℃의 온도에서 약 30분간 반응시켰다. 다음에, 이소프로파놀(1.95ml)을 첨가하여 실온에서 10분간 교반하여 반응시켰다. 분리한 디클로로메탄층을 물로 두번 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조시킨후 여과한 다음, 증발시켜 용매를 제거했다. 얻어지는 잔류물을 재결정화하여 화합물 l(87.8%)를 얻었다. ESI-MS: 317[M+H].

화합물 m의 합성: 상기 화합물 l (0.05mol)를 무수 에틸 알코올(60ml)과 아세트산에틸(30ml)의 혼합액에 첨가하고, 약 0℃까지 냉각시킨후, 수소화붕소 나트륨(23.3g，612mmol)을 몇 번으로 나누어 첨가하고 0℃에서 1 시간 교반하여 반응시켰다. 반응이 끝난후, 그 반응액을 묽은 초산으로 중화시켜 pH=7~8로 조절하고, 여과한후, 그 여과액을 증발시켰다. 그 잔류물을 디클로로메탄으로 용해하고 물로 세척했다. 디클로로메탄층은 무수 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 증발시켜 디클로로메탄을 제거했다. 그 잔류물을 디클로로메탄과 석유 에테르의 혼합용매로 재결정화하여 고체 생성물을 얻었다. 얻은 고체 생성물을 피리딘에 용해하고, 약 0℃의 온도에서 BzCl(50mmol)을 적가한후, 실온에서 3 시간 반응시켰다. 반응이 끝난후, 용매를 증발 제거하고, 그 잔류물을 아세트산에틸로 추출하고, 포화 NaHCO₃용액으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨후, 여과하고, 증발시켜 용매를 제거했다. 그 잔류물을 칼럼크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 m(89.7%)을 얻었다. ESI-MS: 423[M+H].

화합물 n의 합성: 상기 화합물 m (4mmol)을 메틸 알코올(22ml)에 용해시킨후, 진한 염산/디옥산의 혼합용액(4.0 M, 20ml)을 첨가하여 실온하에서 10 시간 반응시켰다. 반응이 끝난후, NaHCO₃로 반응액을 중화시켜 pH=7~8로 조절하고 여과했다. 그 여액을 감압하에 증류하여 용매를 제거한 후, 그 잔류물을 적당량의 디클로로메탄에 용해시키고, 무수 Na₂SO₄로 밤새 건조시키고, 여과했다. 그 여과액을 건조상태까지 증발시킨후, 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 n(89.5%)을 얻었다. ESI-MS: 397[M+H].

화합물 o의 합성: 상기 화합물 n (1.76mmol)을 디클로로메탄에 용해시킨후, 실온에서 DAST(0.4ml，3.03mmol)를 첨가하고 12 시간 교반했다. 반응이 끝난후, 그 반응액을 10ml의 포화 NaHCO₃용액에 첨가하고, 유기층을 분리했다. 상기 유기층을 포화NaHCO₃용액으로 세척한 후, 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 o(11.5%)를 얻었다. ESI-MS: 399[M+H].

화합물 p의 합성: 상기 화합물 o (10mmol)를 20ml의 포름산(80%) 용액에 첨가하고, 실온에서 12 시간 교반하여 반응시켰다. 반응이 끝난후, 그 용액을 감압하에 증발시켜 용매를 제거하고, 그 잔류물을 톨루엔과 함께 증발시켜 고체 생성물을 얻는다. 얻은 고체 생성물을 건조 피리딘과 초산 무수물의 용액에 용해시켜 실온에서 4 시간 반응시켰다. 반응이 끝난후, 반응액을 농축시킨후, 톨루엔과 함께 증발시켜 화합물 p(90.3%)를 얻었다. ESI-MS: 427[M+H]. ¹H NMR(CDCl₃，300 MHz)δ: 2.07(s, 3H)，2.85(s, 1H)，4.62-4.77(m, 2H)，4.89-5.07(m, 3H)， 7.32-8.17(m, 10H).

화합물 q의 합성: 화합물 p (4.76mmol)를 무수 디클로로메탄(40ml)에 용해시키고 약 0℃까지 냉각한후, HCl기체를 서서히 첨가하여 약 3 시간 포화시켰다. 실온에서 진공 증발시켜 용매를 제거한 후, 그 잔류물을 2 시간동안 진공 건조시켜 화합물 q(87.1%)를 얻었다. 화합물 q를 직접 다음 반응에 사용한다.

화합물 r의 합성: 2,6-아미노퓨린(4.78mmol)과 헥사메틸디실라잔(HMDS, 9ml)을 (NH₄)₂SO₄(50mg)의 존재하에서 가열 및 환류시켜 투명용액을 얻었다(약 5 시간). 진공하에서 용매를 제거하여 백색고체 생성물을 얻은후, 그 고체를 1,2-디클로로에탄(35ml)에 용해시켰다. 다음에, 화합물 q의 1,2-디클로로에탄 용액(4.56mmol，30ml) 및 0.4nm의 분자체(2.6g)를 첨가하고 질소 분위기에서 실온에서 6일간 교반하여 반응시켰다. TLC로 분석하여 완전히 반응한 것으로 확인되는 때, 그 반응액에 디클로로메탄(80ml)을 첨가하고, 규조토로 여과했다. 그 여과액을 포화 NaHCO₃과 식염수로 각각 세척한 후, 유기층을 무수 Na₂SO₄로 밤새 건조시키고, 용매를 증발 제거하고, 그 잔류물을 감압하에 실리카 겔 컬럼으로 분리하여 화합물 r(78.5%)을 얻었다. ESI-MS: 517[M+H]. ¹H NMR(CDCl₃，300 MHz)δ: 2.85(s, 1H), 4.67-4.79(m, 2H), 4.92-5.13(m, 3H), 5.79(br, 1H), 7.32-8.17(m, 9H), 8.35(s, 1H).

화합물 25의 합성: 화합물 r(3.60mmol)을 포화 NH₃-CH₃OH 용액(30ml)에 용해시킨후 실온에서 15 시간 교반하여 반응시켰다. 반응이 끝난후, 용매를 증발 제거하고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 25(78.9%)를 얻었다. ESI-MS: 309[M+H]. ¹H NMR(CDCl₃，300 MHz)δ: 2.85(s, 1H), 3.69-3.79(m, 2H), 4.79-5.07(m, 3H), 5.60(br, 1H), 5.79(br, 1H), 7.32-8.17(m, 4H), 8.35(s, 1H).

본 발명의 항-HIV활성에 관한 시험관내 실험: 세포 배양에서 화합물 1, 9, 15, 19, 36, 39, 46, 50 및 52의 항-HIV-1활성.

실험을 진행할 약물: 화합물 1, 9, 15, 19, 36, 39, 46, 50 및 52는 배치 번호가 없으며, 수불용성이고 DMSO로 용해할 수 있다. 실험 동안, 약물을 DMSO를 사용하여 적당한 농도로 용해한후, 배지로 희석한 다음, 즉시 세포 배지에 첨가했다.

양성대조약물:

(1) 지도부딘(Zidovudine，AZT)은 임상용으로 이미 적용된 공지의 뉴클레오시드 HIV-1 역전사효소 억제제로서, 백색 분말의 형태이다. 이는 상하이 DESANO 화학제양유한회사(Shanghai Desano Chemical & Pharmaceutical Co., Ltd.)에서 구입했다. 제품 번호: 040201b.

(2) 네비라핀(nevirapine，NVP)은 남경 ZEZHONG 의화전보연구센터(Nanjing Zezhong Medical & Chemical Information Research Center)에서 구입한 것으로(제품 번호: 0301001), 임상분야에서 공지된 비뉴클레오시드 역전사효소 억제제이다.

실험용 HIV-1 IIIB 바이러스 균주는 미국 미나이 시나이 매디컬 센터(Mount Sinai Medical Center)의 장건동박사가 증여한 것이다. H9 세포에서 증폭 및 -196 ℃에서 냉동보존.

인간 T-림프세포 MT-4，미국 콜로라도대학교 의학연구센터 장흥권교수 증여. 본 발명자들의 실험실에서 계대배양. -196 ℃에서 냉동 보존. 세포배지: RPMI Medium 1640 배지(10% 우태혈청, 100 IU/ml페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신과 카나마이신 및 L-글루타민 함유). 이 세포들은 37 ℃，5% CO₂배양기에서 배양됨. 3일 마다 한번 계대.

주요 시약: RPMI Medium 1640 배지는 미국 GIBCO 회사의 제품, 우태혈청(Fetal Bovine Serum)은 천진시 CHUANYE 생물화학제품유한회사(Tianjin Chuanye Biochemical Products Co., Ltd.)의 제품, 페니실린과 스트렙토마이신은 화북제약회사(North China Pharmaceuttical Compnay)의 제품, 카나마이신은 상하이 XUDONGHAIPU약업유한회사(Shanghai Xudong Haipu Pharmaceutical Co., Ltd.)의 제품. 테트라졸륨 (MTT, Thiazolyl blue) 및 시트르산은 미국 Sigma회사의 제품; Triton X-100는 스웨덴 KEBO AB STOCKHOLM회사의 제품; N,N-디메틸 포름아미드는 베이징화학공장(Beijing Chemical Plant)의 제품; HIV-1 P24항원 키트는 네덜란드 BioMerieux회사의 제품을 사용하였다.

주요 기기: Emax^TMMicroplate Reader는 미국 MolICular Devices회사의 제품이다.

실험 방법:

96-웰 배양판을 이용하여, 약물 억제 바이러스의 약물 및 양성대조약물군에 대한 실험을 수행했다. 각 웰에, 약물, 양성 대조 약물 AZT과 NVP 또는 쥐에 경구투여를 위한 약물을 상이한 농도로 함유하는 DMSO 용액 100ul를 첨가한 다음, 혈액을 샘플링하고, 상이한 희석군을 만들었는데, 웰당 100 ul 이었다. 동시에, 세포 대조군, 바이러스 대조군, 양성 약물 AZT 및 NVP 대조군에 대하여 실험을 수행했다. MT-4세포를 100TCID₅₀ HIV-1 IIIB로 1.5시간 감염시키고 배지로 1회 세척후 2 x 10⁵개 세포/ml의 용액으로 제조하여 약물 억제바이러스 실험군과 양성대조 약물군 및 바이러스 대조군의 96-웰 배양판에 접종했다. 세포 대조군은 동등한 배지에 첨가하여 4일간 배양한후, 현미경으로 세포병변을 관찰하고, MTT염색 방법으로 독성을 측정하였다. 상청액의 P24 항원을 키트의 설명서의 방법에 따라 측정했다. 따라서, 억제률, 반수 독성 농도(CC₅₀)와 반수 유효농도(IC₅₀) 및 SI를 계산했다.

MT-4 세포 배양에서 HIV-1에 대한 화합물1, 9, 15, 19, 36, 39, 46, 50 및 52의 억제 효과

MTT법으로 화합물 1, 9, 15, 19, 36, 39, 46, 50 및 52의 세포 독성 및 항-HIV-1활성을 측정하고, CC₅₀와 SI에 대한 이들의 세포 독성을 HIV-1 감염세포와 미감염세포를 이용하여 비교하고, 그 결과를 하기 표 1에서 나타낸다.

MT-4 세포 배양에서 화합물 1, 9, 15, 19, 36, 39, 46, 50, 52 및 양성약물AZT와 NVP의 항-HIV-1활성

약물	CC₅₀(μg/ml)*		IC₅₀(μg/ml)*	SI
약물	HIV 감염	HIV 미감염	IC₅₀(μg/ml)*	HIV 감염	HIV 미감염
AZT	>0.625	>0.625	0.000182	>3434	>3434
NVP	>12.5	>12.5	0.00364	>3434	>3434
1	43.6	40.9	0.101	432	405
9	31.23	30.05	0.162	298	291
15	>100	>100	0.00001	>100000	>100000
19	43.8	39.8	0.09	487	422
36	35.12	37.54	0.127	276	296
39	38.26	36.77	1.49	26	25
46	48.52	55.35	0.131	370	423
50	28.3	27.9	2.30	12	12
52	41.3	38.6	0.133	311	290

*: 세포독성: MTT법

야생형 HIV-1 복제의 약리학적 모델에 의해 얻은 화합물1, 15 및 19의 약리 스크리닝 결과

화합물	약리 모델	세포	투여 절차	투여량(mol/L)	억제율(%)	용매	비고 IC₅₀(μM)
1	VSVG/HIV-luc	293 세포	감염전	1x10^-5	99.4±0.3	DMSO
				1x10^-6	90±0	DMSO	0.5 μM
				1x10^-7	28±0	DMSO
				1x10^-8	0±3	DMSO
15	VSVG/HIV-luc	293 세포	감염전	1x10^-5	100	DMSO
				1x10^-6	100	DMSO	1.5 nM
				1x10^-7	100	DMSO
				1x10^-8	72±6	DMSO
19	VSVG/HIV-luc	293 세포	감염전	1x10^-5	92.7±0.9	DMSO
				1x10^-6	48±0	DMSO	1.0 μM
				1x10^-7	4±1	DMSO
				1x10^-8	0±2	DMSO
AZT	VSVG/HIV-luc	293 세포	감염전	1x10^-7	97.2±1.1	DMSO
AZT	VSVG/HIV-luc	293 세포	감염전	1x10^-8	54.1±2.0	DMSO
3TC	VSVG/HIV-luc	293 세포	감염전	1x10^-6	86.3±4.3	DMSO
3TC	VSVG/HIV-luc	293 세포	감염전	1x10^-7	50.9±2.4	DMSO
d4T	VSVG/HIV-luc	293 세포	감염전	1x10^-6	92.9±1.6	DMSO
d4T	VSVG/HIV-luc	293 세포	감염전	1x10^-7	24.0±1.1	DMSO
EFV	VSVG/HIV-luc	293 세포	감염전	1x10^-8	100	DMSO
EFV	VSVG/HIV-luc	293 세포	감염전	1x10^-9	55.2±0.6	DMSO
NVP	VSVG/HIV-luc	293 세포	감염전	1x10^-7	73.1±5.2	DMSO
NVP	VSVG/HIV-luc	293 세포	감염전	1x10^-8	18.8±2.8	DMSO

표 1 및 표 2에서 볼수 있는 바와 같이, 신규 2'-플루오로-4'-치환-뉴클레오시드 유사체들은 전부 우수한 항-HIV 활성을 갖고 있으며 특히 화합물 1, 화합물 15 및 화합물 19는 응용 및 개발의 측면에서 전망이 좋다. 따라서, 이런 화합물의 개발은 에이즈 환자에게 좋은 소식을 가져다 줄 것이다.

본 발명의 B형 간염 항바이러스 약물의 시험관내 스크리닝

목적: HBV 게놈이 형질감염된 Hep G2.2.15세포를 이용하여 B형 간염 항바이러스 약물을 스크리닝하여 신규 항-HBDB 약물의 연구와 개발에 이론 및 실험적 근거를 제공하려는데 있다.

방법: 라미부딘 및 화합물 15 및 17을 선택하여 TC₅₀이하의 약물농도로 세포를 처리했다. 각각 144 시간 및 216 시간에서 세포배양 상청액을 수집한후 형광 정량 PCR법을 이용하여 HBV DNA의 함량을 검출했다.

결과: 라미부딘 및 화합물 15는 모두 투여후 HBV DNA복제수를 현저하게 감소시킬 수 있다.

결론: 화합물 15는 시험관내 실험에서 HBV DNA의 활성을 현저하게 낮추며 독성이 비교적 낮다. 본 실험은 상기 화합물의 항-HBV 작용을 더 상세히 연구하기 위한 근거를 제공하였다.

세포주: HBV DNA 클론 전염자 감암세포 HepG2의 Hep G2.2.15세포주는 미국 마운트 시나이 메디컬 센터(Mount Sinai Medical Center)에서 1986년에 만들어낸 것이며 안정하게 e 항원과 표면항원을 발현하는 특징이 있다. 중국과학원 무한바이러스연구소에서 증여하였다. 본 연구실에서는 계대 및 G418 스크리닝을 세포 배양 과정 동안 수행했다.

실험 약물: 본 발명의 화합물 15 및 17의 합성약물.

대조약물: 라미부딘(3TC)，중국 소주의 GlaxoSmithKline (GSK) 유한회사 제품.

주요 시약 및 기기: DMEM 배지, Hyclone; 우태혈청, 항주4계청(Hangzhou Sijiqing); 24-웰 배양판 및 배양병, 미국 Corning; HPV PCR 형광 정량 검출 키트, 심천필기(Shenzhen PG Biotech); G418, Introvegen.

항-HBV의 생체외 시험연구:

Hep G2.2.15 세포의 배양: 10% 우태혈청 및 500mg/L G418를 함유한 DMEM배지로 세포를 배양하고 0.25% 트립신과 0.02% EDTA으로 소화함; 1: 3 계대 배양; 3일에 한번 계대한다.

약물의 항-HBV 작용의 연구:

성장상태가 양호한 세포를 취하여 세포농도를 2x10⁴세포/ml로 조정하여, 24-웰 배양판의 각 웰에 1ml씩 접종했다. 다음에, 그 세포를 37 ℃에서 5% CO₂배양기에서 48시간 배양하고 세포가 벽에 붙어 잘 성장할 때 시험을 진행했다. 3 종의 약물을 농도 따라 군들로 나눈후(표1)，각 농도마다 두개의 웰을 지정하고, 약물을 가하지 않는 세포배양 대조군을 공백 대조군(blank control)으로 하였다. 약물을 사용한지 3일, 6일 및 9일째에, 동일농도의 약물 함유 배지 및 공백 배지를 한번씩 교환한다. 각 웰의 배양상청액을 EP관으로 흡입하여 -20 ℃ 에서 보존하여 검사했다.

라미부딘 및 화합물 15 및 17 의 농도

약물	농도(μg/L)
라미부딘(3TC)	20,000	2000	200	20	2
화합물15	10	2	0.4	0.08	0.016
화합물17	1000	500	100

HBV PCR을 위한 약물의 형광 정량 검출:

HBV DNA억제률(%)=(공백군의 HBV DNA 복제수-실험군의 HBV DNA 복제수)/공백군의 HBV DNA 복제수 x 100%.

결과: Hep G2.2.15 세포상청액에서 HBV DNA에 대한 약물의 억제 효과가 하기 표 4 및 5에서 보여진다.

세포 상청액에서 HBV DNA의 복제수에 대한 라미부딘의 영향(복제수는 x×10⁵)

군	농도(μg/ml)	HBV DNA 농도	억제율
정상	/	99.79	/
3TC	20 μg/ml	12.15	87.82
	2 μg/ml	25.32	74.63
	0.2 μg/ml	39.59	60.33
	0.02 μg/ml	55.98	43.9

3TC E₅₀은 38.78 μg/ml 이다.

세포 상청액에서 HBV DNA의 복제수에 대한 화합물 15 및 17의 영향(복제수는 x×10⁵)

군	투여량	HBV DNA 복제수(*10⁵⁾	억제율(%)
정상	/	32.1	/
3TC	10,000 μg/L	5.49	82.8
화합물 15	2 μg/L	5.21	83.7
	0.4 μg/L	10.3	67.8
	0.08 μg/L	13.5	57.8
	0.016 μg/L	18.9	41.0
화합물 17	1000 μg/L	10.2	67.9
	500 μg/L	14.3	52.2
	100 μg/L	19.2	40.6

화합물 15의 경우, EC50은 0.19 μg/L 이다.

Hep G2.2.15에 대한 화합물 15의 세포독성(MTT)

군	투여량	OD 값	세포 생존율
정상	/	0.644	/
	1000 μg/ml	0.520	82.6
	200 μg/ml	0.552	85.5
	40 μg/ml	0.606	96.7
	8 μg/ml	0.626	98.7

본 발명의 항-HPV 활성에 관한 시험관내 실험

1. 재료 및 방법

HPV 복제 세포(Avva. 5)를, 10% 우태혈청 및 1 mg/ml G418을 함유하는 Dulbecco's improved Eagle 배지에서 배양하고, 293-Sip-L 세포를, 10% 우태혈청, 250 μg/ml G 418 및 150 μg/ml 하이그로마이신 B를 함유하는 Dulbecco's improved Eagle 배지에서 배양했다.

1.2. HCV 감염을 측정하기 위한 방법(RT-PCR 방법)

직경이 60 mm인 페트리 배양 접시를 이용하여, 세포를 100 μl의 HCV를 함유하는 양성 배지에서 12 시간 동안 배양했다. 다음에, 상기 세포를 HCV를 함유하는 새로운 배지에서 배양하고, 그 배지를 하루에 한번 교환했다. 상기 세포가 HCV로 감염된 후 7 일째 HCV-RNA를 검출할 때, 트립신화 및 원심분리 방법으로 Dulbecco's improved Eagle 배지를 이용하여 세포를 세척할 필요가 있다. 두 번째 세척한 상층 부분(비교용) 및 세척한 세포를 수집하여 RNA 추출하고 RT-PCR 검출했다. 동시에, 비교 목적을 위하여 β-악틴 mRNA를 측정했다.

1.3. HCV-RNA의 정량적 측정

HCV-RNA의 정량적 측정을, 자동 PCR 효소 면역 측정법(ELISA)으로 수행했다.(Edition 2.0, Roche Diagnostics, Branchburg, NJ).

2. 결과

화합물 17은 그 농도가 6 μg/ml, 0.6 μg/ml 또는 0.06 μg/ml인 경우 억제 효과를 나타냈다 (하기 표 참조). HCV-RNA를 자동 PCR ELISA로 측정했다.

세포 상청액에서 화합물 17의 농도	억제 효과
세포 상청액에서 화합물 17의 농도	실험 1	실험 2
0 μg/ml	5.1 x 10 ²	4.4 x 10 ²
0.06 μg/ml	4.9 x 10 ²	4.1 x 10 ²
0.6 μg/ml	0.92 x 10 ²	0.78 x 10 ²
6 μg/ml	1.1 x 10 ²	0.81 x 10 ²

상기 표에서 나타낸 바와 같이, 화합물 17은 HCV에 대하여 비교적 강한 억제 효과를 나타냈다.

Claims

2'-플루오로-4'-치환-뉴클레오시드 유사체로서, 상기 화합물이 하기 화학식 1 :
[화학식 1]

상기 식에서,

로 나타낸 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 2'-플루오로-4'-치환-뉴클레오시드 유사체.
청구항 1에 있어서, 상기 화합물이 화학식 1의 활성 화합물과 유기 또는 무기산 사이의 반응을 통해 생성되는 염의 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 2'-플루오로-4'-치환-뉴클레오시드 유사체 또는 이의 프로드러그 또는 5'-인산염 에스테르.
청구항 1에 있어서, 상기 화합물이 하기의 화합물들로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 2'-플루오로-4'-치환-뉴클레오시드 유사체.
청구항 1에 기재된 뉴클레오시드 유사체의 제조 방법으로서,
하기의 단계들 :

화합물 ii의 합성: 화합물i (D-리보오스 또는 L-리보오스)를 HCl/MeOH에 용해하고, 그 용액을 밀폐 및 따뜻하게 유지하면서 물중탕에서 교반하고, 그 용액에 피리딘을 첨가하여 반응을 중지한 다음, 감압하에 증발시켜, 밝은 황색의 시럽상태의 화합물ii를 얻는 단계;
화합물 iii의 합성: 상기 화합물 ii를 건조한 피리딘에 용해시키고, 그 용액에 얼음 소금 중탕에서 염화벤조일을 서서히 적가한 다음, 실온에서 교반하여 반응시키고, 반응이 끝난 다음, 반응액을 얼음물에 부어 클로로포름을 추출하고, 유기층을, 수층이 약알칼리성을 나타낼 때까지 얼음물, 미리 냉각한 황산 및 포화 중탄산나트륨으로 순차적으로 세척한 후, 다시 수층이 중성이 될 때까지 얼음물로 세척하고, 그 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시킨후, 감압하에 증발시켜서, 담황색의 시럽상태의 화합물 iii를 얻는 단계;
화합물 iv의 합성: 상기 벤조일 화합물 iii을 클로로포름에 용해시키고, 적인을 첨가하고, 그 용액에 얼음물 중탕에서 교반하면서 브롬을 서서히 적가하고, 그 용액을 약 30 분간 교반한 후, 얼음물을 서서히 적가하면서 실온에서 교반한 다음에, 그 용액에 얼음 부스러기를 첨가하고 얼음이 녹을 때까지 교반한 다음, 그 반응 용액을 얼음물에 부어 클로로포름으로 추출하고, 유기층을 수층이 약알칼리성을 나타낼 때까지 포화 중탄산나트륨으로 세척한 후, 다시 수층이 중성이 될 때까지 얼음물로 세척하고, 그 용액을 무수황산나트륨으로 건조시킨 후, 감압하에 증발시켜, 어두운 황색의 시럽을 얻고, 끝으로, 그 시럽을 실리카 겔 컬럼으로 분리시켜, 백색의 건조한 시럽상태의 화합물iv를 얻는 단계;
화합물 v의 합성: 상기 화합물iv를 건조한 피리딘중에 용해시키고, 그 용액에 얼음 중탕에서 초산 무수물을 서서히 적가한 다음, 30 분간 교반한 다음에, 얼음물 중탕을 제거하고, 그 용액을 실온에서 7 시간 교반하고, 40 ℃ 까지 가열하고, 이 온도에서 1 시간 유지하고, 얼음 부스러기를 그 용액에 첨가하고, 얼음이 녹을 때까지 교반한 다음에, 그 반응 용액을 얼음물에 부어 클로로포름으로 추출하고, 유기층을 수층이 약알칼리성을 나타낼 때까지 얼음물, 미리 냉각한 황산 및 포화 중탄산나트륨으로 순차적으로 세척한 후, 수층이 중성을 나타낼 때까지 얼음물로 세척하고, 무수황산나트륨으로 건조시킨후, 감압하에 증발시켜서, 담황색의 시럽상태의 화합물 v를 얻는 단계;
화합물 vi의 합성: 상기 화합물 v를 건조한 디클로로메탄중에 용해하고, 건조한 HCl기체를 얼음물 중탕에 서서히 첨가하고, 그 용액을 얼음물로 세척하여 유기층을 분리하고, 유기층을 수층이 약알칼리성을 나타낼 때까지 포화 중탄산나트륨으로 세척한 후, 수층이 중성을 나타낼 때까지 얼음물로 세척한 다음, 무수황산나트륨으로 건조시킨후, 감압하에 증발시켜 담황색 시럽을 얻고, 상기 시럽을 재결정화하여 백색 고체화합물 vi를 얻는 단계;
화합물 vii의 합성: 상기 화합물 vi를 건조한 디클로로메탄과 건조한 DMF에 용해시키고, 그 용액을 약 -15℃ 에서 교반하면서 SO₂Cl₂를 서서히 적가하고, 그 용액을 -15 ℃에서 약 30 분간 교반하고 자연적으로 실온으로 가온하여 반응시킨 다음에, 그 용액에 이미다졸을 0 ℃에서 3차례에 걸쳐 첨가하고, 그 혼합액을 실온에서 교반하고, 반응이 끝난 후, 그 반응액에 CH₂Cl₂를 첨가하여 희석한 다음, 얼음물로 세척하고, 수층은 CH₂Cl₂로 추출하고, 유기층들을 합친후 무수황산나트륨으로 건조시킨 다음, 감압하에 증발시켜 담황색 시럽을 얻고, 상기 시럽을 실리카 겔 컬럼으로 분리 및 정제하여 백색 고체 화합물 vii를 얻는 단계;
화합물 viii의 합성: 상기 화합물 vii를 아세트산에틸에 용해시키고, 교반하면서 Et₃N·3HF를 첨가하고, 그 용액을 약 60 ℃까지 가열하고, 약 3 시간 교반한 다음, 70 ℃ 까지 가열하고 약 1.5 시간 교반하고, 얼음소금물을 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 디클로로메탄으로 추출한 다음에, 유기층들을 합친 후, 소금물, 물 및 포화 중탄산나트륨으로 순차적으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압하에 증발시켜 어두운 황색 시럽을 얻고, 상기 시럽을 정제하여 담황색 시럽을 얻고, 끝으로, 상기 조생성물을 재결정화하여 백색의 결정질 화합물 viii를 얻는 단계;
화합물 ix의 합성: 상기 화합물 viii를 무수 디클로로메탄에 용해시키고, HBr-AcOH의 혼합용액을 첨가하고, 그 용액을 실온에서 교반하여 반응시키고, 반응이 끝난 후, 그 혼합물을 건조상태까지 증발시키고, 그 잔류물을 디클로로메탄으로 용해시키고, 상기 디클로로메탄 용액을 중탄산나트륨 용액으로 세척하고, 디클로로메탄을 증발 제거하여 시럽상태의 생성물을 얻고, 한편, 보호된 시토신과 (NH₄)₂SO₄를 HMDS에서 질소 분위기에서 환류시키고, 반응이 끝난후, 용매를 감압하에 증발 제거하여 실릴화 시토신을 얻고, 상기 반응에서 얻은 시럽상태의 물질을 디클로로에탄에 용해한 다음, 상기 실릴화 시토신에 첨가한 다음에, 그 혼합물을 N₂분위기에서 환류시키고, 얼음으로 반응을 중지시킨 다음에, 그 용액을 디클로로메탄 및 소금물로 추출하고, 디클로로메탄 층을 차례로 포화 중탄산나트륨과 소금물로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시킨후, 용매를 증발 제거하여 백색 고체를 얻고, 상기 백색 고체를 컬럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 ix를 얻는 단계;
화합물 x의 합성: 상기 화합물 ix를 포화된 NH₃-CH₃OH에 용해시키고 실온에서 교반하여 반응시키고, 반응이 끝난후, 용매를 건조상태까지 증발시키고, 남아있는 물질을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 x를 얻는 단계;
화합물 xi의 합성: 상기 화합물x，이미다졸 및 트리페닐포스핀을 테트라하이드로퓨란에 용해하고, 그 용액에 요오드 함유 테트라하이드로퓨란을 서서히 적가하고, 실온에서 교반하여 반응시키고, 반응이 끝난후, 용매를 증발 제거하고, 그 잔류물에 아세트산에틸을 첨가하고 여과하고, 아세트산에틸을 증발, 제거한후, 그 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 xi를 얻는 단계;
화합물 xii의 합성: 상기 화합물 xi를 테트라하이드로퓨란에 용해시키고, DBU를 첨가한후, 약 60 ℃ 온도에서 교반하여 반응시키고, 반응이 끝난후, 용매를 건조상태까지 증발시키고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 화합물 xii를 얻는 단계;
화합물 xiii의 합성: ICI가 용해된 DMF 용액을 0 ℃에서 NaN₃가 용해되어 있는 DMF용액에 첨가하고, 그 용액을 동결온도에서 약 10분간 교반한 후, 화합물 xii가 용해되어 있는 DMF용액을 천천히 상기 용액에 적가하여 반응시키고, 반응이 끝난후, 혼합액에, 요오드의 컬러가 완전히 없어질 때까지 아황산나트륨을 첨가하고, 용매를 감압하에 증발 제거하고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 xiii를 얻는 단계;
화합물 xiv의 합성: 상기 화합물 xiii를 DMF에 용해하고, 교반하면서 초산은을 첨가하고, 실온에서 반응시키고, 반응이 끝난 후, 그 용액을 여과하고, 용매를 감압하에 제거하고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 xiv를 얻는 단계;
화합물 xv의 합성: 상기 화합물 xiv를 메탄올-트리에틸아민의 용액에 용해하고, 실온에서 교반하여 반응시키고, 반응이 끝난후, 용매를 증발, 제거하고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 xv를 얻는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 유사체의 제조 방법.
청구항 1에 기재된 뉴클레오시드 유사체의 제조 방법으로서,
하기의 단계들 :

화합물 b의 합성: 화합물a를 아세톤에 첨가하고, 실온에서 교반하면서 진한 황산을 첨가하고, 그 용액을 교반하여 반응시키고, TLC로 분석하여 반응이 끝난것으로 확인된 후, 그 용액에 진한 암모니아수를 첨가하여 pH값을 7~8로 조절하고, 여과하고, 감압하에 증발시켜 대부분의 아세톤을 제거한 다음에, 0.4% 묽은 염산을 교반하면서 첨가하고, 화합물 a 가 화합물 b로 완전히 가수분해될 때까지 아세톤 환류 조건하에서 반응을 수행한 다음에, 그 반응 용액을 고체NaHCO₃로 중화한 다음, 여과하고, 그 여과액을 감압하에 증발시켜 용매를 제거하고, 그 잔류물을 디클로로메탄으로 용해하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨 후 여과한 다음, 증발시켜 용매를 제거하여, 황색의 점착성 유상 화합물 b를 얻는 단계;
화합물 c의 합성: 상기 화합물b 및 트리에틸아민을 디클로로메탄으로 용해시키고, 그 용액에 얼음소금 중탕에서 파라클로로벤조일 클로라이드를 서서히 적가하고, 0 ℃ 이하의 온도에서 기계적으로로 교반하여 반응시키고, 반응이 끝난후, 그 용액에 포화NaHCO₃용액을 첨가하고, 디클로로메탄층을 물 및 포화 식염수로 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조시키고, 여과한 다음, 감압하에 증발시켜 용매를 제거하고, 그 잔류물을 재결정화하여 백색 결정질 화합물 c를 얻는 단계;
화합물 d의 합성: 상기 화합물 c를 무수 디클로로메탄에 용해시키고, 질소 분위기에 이미다졸과 3차-부틸클로디메틸실란 (TBDMSCl)을 첨가하여 실온에서 반응시키고, 반응이 끝난후, 그 반응액을 염산으로 중화시켜, 두 층을 얻고, 유기층을 물 및 포화 식염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨후, 증발시켜 용매를 제거하고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 d를 얻는 단계;
화합물 e의 합성: 상기 화합물 d를 메톡시화나트륨-메탄올의 혼합용액에 용해하여 실온에서 반응시키고, 반응이 끝난후, 그 용액을 묽은 초산으로 중화하고, 여과하고, 메탄올로 세척한 다음, 감압하에 증발시켜 용매를 제거하고, 끝으로, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 e를 얻는 단계;
화합물 f의 합성: 약 -60℃의 온도에서 옥살릴 클로라이드의 디클로로메탄 용액에 천천히 DMSO를 적가한 후, 그 용액을 같은 온도에서 15분간 교반한 후, 상기 화합물 e의 디클로로메탄 용액을 적가하고, 그 용액을 약 -65 ℃의 온도에서 약 30 분간 교반하여 반응시킨후, 트리에틸아민을 첨가하고, 실온에서 교반하여 반응시키고, 반응이 끝낟후, 반응액에 물을 첨가하여 유기층을 분리하고, 그 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 용매를 증발 제거하고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물f를 얻는 단계;
화합물 g의 합성: 반응 용기에 수산화나트륨과 물을 넣어 교반한 후, 포르말린 용액과 95% 에틸 알코올을 첨가한후, 상기 화합물 f를 첨가하여 약 35 ℃의 온도에서 교반하여 반응시키고, 반응이 끝난후, 생성물이 완전히 침전될 때까지 교반하는 동시에, 얼음물로 반응 용기를 냉각시키고, 흡인 여과한 후, 고체 생성물을 물로 중성이 될때까지 세척한 후, 건조시키고, 얻은 고체를 무수 메틸 알코올에 용해한후, 수소화붕소 나트륨을 첨가하여 환류반응시키고, 반응이 끝난후, 반응액을 묽은 염산으로 중화시키고, 디클로로메탄으로 추출하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨후, 용매를 증발 제거하여 화합물 g를 얻는 단계;
화합물 h의 합성: 상기 화합물 g를 메틸 알코올에 용해하고, Dowex H⁺(메틸 알코올로 미리 세척됨)를 첨가하여 실온에서 반응시키고, 반응이 끝난후, 얻어지는 수지를 여과하여 제거하고 메틸 알코올로 반복적으로 세척하고, 그 용액을 증발시켜 고체를 얻고, 얻은 고체를 아세톤에 용해시킨후, 실온에서 교반하면서 진한 황산(촉매량)을 서서히 첨가하여 반응시키고, 진한 암모니아수를 반응액에 첨가하여 pH값을 조절하고, 여과하고 감압하에 증발시켜 아세톤을 제거하여 화합물 h를 얻는 단계;
화합물 i의 합성: 약 -60℃의 온도에서 옥살릴 클로라이드의 디클로로메탄용액에 DMSO를 적가한후, 그 용액을 약 15분간 교반하고, 상기 화합물 h의 디클로로메탄 용액을 첨가하고, 약 -60℃의 온도에서 약 30분간 반응시킨 후, 트리에틸아민을 상기 용액에 첨가하여 실온에서 약 30분간 반응시킨 다음에, 물을 첨가하여 반응을 중지시키고, 유기층을 분리하여 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 용매를 증발 제거한 후, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 고체 생성물을 얻고, ClCH₂P(C₆H₅)₃Cl을 무수 테트라하이드로퓨란에 첨가하고, 약 -78 ℃까지 냉각시킨후, n-BuLi의 핵산 용액을 첨가하여 약 1 시간 교반한 후, 상기 고체 생성물의 건조 테트라하이드로퓨란 용액을 첨가하고, 상기 용액의 온도를 약 0 ℃까지 점차적으로 증가시켜 계속 반응시키고, 반응이 끝난후, 포화된 NH₄Cl용액을 상기 반응액에 조심스럽게 첨가하고, 그 용액을 아세트산에틸로 추출하고, 유기층을 소금물로 두 번 세척한 후, 무수 MgSO₄로 건조하고, 감압하에 증발시켜 용매를 제거하고, 얻어지는 잔류물을 무수 테트라하이드로퓨란에 용해하고, 약 -78 ℃까지 냉각시킨후, n-BuLi핵산 용액을 천천히 적가하고, 그 용액을 2 시간 교반하여 반응시킨후, 조심스럽게 포화NH₄Cl 용액으로 반응을 중지시키고, 유기층을 포화 식염수로 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조시키고, 감압하에 증발시켜 용매를 제거하고, 끝으로, 그 잔류물을 급속 실리카 겔 컬럼으로 분리 및 정제하여 화합물 i를 얻는 단계;
화합물 j의 합성: 상기 화합물 i를 묽은 염산 용액에 첨가하고 실온하에서 교반하여 반응시키고, 반응이 끝난후, 반응액을 고체 NaHCO₃로 중화시킨후 여과하고, 그 여액을 감압하에 증발시켜 용매를 제거하고, 그 잔류물을 디클로로메탄으로 용해시킨후, 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과한후 증발시켜 용매를 제거하여 화합물 j를 얻는 단계;
화합물 k의 합성: 화합물 j를 피리딘에 용해하고, BzCl를 적가하여 실온에서 반응시키고, 반응이 끝난후, 용매를 건조상태까지 증발시키고, 그 잔류물을 정제하여 화합물 k를 얻는 단계;
화합물 l의 합성: 상기 화합물k와 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-N-옥사이드를 디클로로메탄에 용해하고, 그 용액을 0 ℃까지 냉각하고, 차아염소산나트륨 용액, NaHCO₃및 물의 혼합 용액을 상기 반응액에 첨가하여, 0 ℃의 온도에서 약 30분간 반응시킨후, 그 반응액에 이소프로파놀을 첨가하여 실온에서 교반하고, 분리한 디클로로메탄층을 물로 두번 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조시킨후 여과하고, 그 여액을 증발 시켜 용매를 제거하고, 그 잔류물을 재결정화하여 화합물 l를 얻는 단계;
화합물 m의 합성: 상기 화합물 l를 무수 에틸 알코올과 아세트산에틸의 혼합액에 용해하고, 그 용액을 약 0℃까지 냉각시킨후, 수소화붕소나트륨을 몇 번으로 나누어 첨가하고 교반하여 반응시키고, 반응이 끝난후, 반응액을 묽은 초산으로 중화시키고, 여과한후, 그 여과액을 증발시키고, 그 잔류물을 디클로로메탄으로 용해하고 물로 세척하고, 디클로로메탄층은 무수 MgSO₄로 건조시킨후 여과하고, 감압하에 증발시켜 용매를 제거한후, 그 잔류물을 디클로로메탄과 석유 에테르의 혼합용액으로 재결정화하여 고체물질을 얻은 다음에, 그 고체 생성물을 피리딘에 용해하고, 약 0 ℃의 온도에서 BzCl을 적가한후 실온에서 반응시키고, 반응이 끝난후, 용매를 증발 제거하고, 그 잔류물을 아세트산에틸로 추출하고, 포화 NaHCO₃용액으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시킨후 여과하고, 증발시켜 용매를 제거하여 화합물 m을 얻는 단계;
화합물 n의 합성: 상기 화합물 m을 메틸 알코올에 용해시킨후, 진한 염산/디옥산의 혼합용액을 첨가하여 실온에서 반응시키고, 반응이 끝난후, 반응액을 NaHCO₃로 중화하고, 여과하고, 그 여액을 진공 증류하여 용매를 제거한 다음, 그 잔류물을 적당량의 디클로로메탄에 용해시키고, 무수 Na₂SO₄로 밤새 건조시키고, 여과하고, 건조상태까지 증발시키고, 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 n을 얻는 단계;
화합물 o의 합성: 상기 화합물 n을 디클로로메탄에 용해시킨후, 실온에서 DAST를 첨가하고 교반하여 반응시키고, 반응이 끝난후, 반응액을 포화 NaHCO₃용액에 첨가하고, 유기층을 분리하고, 유기층을 포화NaHCO₃용액으로 세척한 후 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 o를 얻는 단계;
화합물 p의 합성: 상기 화합물 o를 포름산 용액에 첨가하고, 실온에서 교반하여 반응시키고, 반응이 끝난후, 그 용액을 감압하에 증발시켜 용매를 제거하고, 그 잔류물을 톨루엔과 함께 증발시켜 고체 생성물을 얻고, 얻은 고체 생성물을 건조 피리딘과 초산 무수물의 용액에 용해시키고 실온에서 반응시키고, 반응이 끝난후, 반응액을 농축시킨후 톨루엔과 함께 증발시켜 화합물 p를 얻는 단계;
화합물 q의 합성: 상기 화합물 p를 무수 디클로로메탄에 용해시키고 0℃ 까지 냉각시킨후 HCl기체를 서서히 첨가하여 포화시키고, 그 용액을 실온에서 진공 증발시켜 용매를 제거하고, 그 잔류물을 진공 건조하여 화합물 q를 얻는 단계;
화합물 r의 합성: 2,6-아미노퓨린과 헥사메틸디실라잔(HMDS)을 (NH₄)₂SO₄의 존재하에서 가열 및 환류시켜 투명 용액을 얻고. 상기 용매를 진공하에 제거하여 백색 고체 생성물을 얻은후, 그 고체 생성물을 1,2-디클로로에탄에 용해시킨 다음에, 상기 화합물q의 1,2-디클로로에탄 용액 및 분자체를 첨가하고, 그 용액을 질소 분위기에서 실온에서 교반하여 반응시키고, TLC로 분석하여 완전히 반응한 것으로 확인된 후, 반응액에 디클로로메탄을 첨가하고, 규조토로 여과하고, 그 여과액을 포화NaHCO₃과 식염수로 각각 세척한 후, 유기층을 무수 Na₂SO₄로 밤새 건조시키고, 용매를 증발, 제거하여 잔류물을 얻고. 그 잔류물을 감압하에 실리카 겔 컬럼을 통해 분리하여 화합물 r을 얻는 단계;
화합물 s의 합성: 상기 화합물 r을 NH₃-CH₃OH 포화 용액에 용해시킨 후, 실온에서 교반하여 반응시키고, 반응이 끝난 후, 용매를 증발시켜 제거하고, 그 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 분리 및 정제하여 화합물 s를 얻는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 유사체의 제조 방법.
약학적 제제에서 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항 기재의 2'-플루오로-4'-치환-뉴클레오시드 유사체의 용도로서, 상기 화합물이 항-HBV 약물, 항-HCV 약물 또는 항-HIV 약물의 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
청구항 6에 있어서, 상기 항-HBV 약물은 HBV 항바이러스 약물이고; 상기 항-HIV 약물은 HIV 항바이러스 약물이고; 상기 항-HCV 약물은 HCV 항바이러스 약물인 것을 특징으로 하는 용도.