CN102000103B - 2’-氟-4’-叠氮-核苷类似物或其盐的药物应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了2’-氟-4’-叠氮-核苷类似物的药物应用，属药物化学领域。其具有如下结构

将其应用于制备治疗结肠癌、肝癌、胃癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病、淋巴瘤等肿瘤药物中，具有很好的活性及较低的毒副作用，开发应用前景良好。

Description

2’-氟-4’-叠氮-核苷类似物或其盐的药物应用

技术领域

本发明涉及核苷类似物的应用，尤其涉及2’-氟-4’-叠氮-核苷类似物或其盐的药物应用，属药物化学领域。

背景技术

核苷类似物是一类重要的具有抗HIV活性的化合物，已成为国内外研究热点。但这些药物均存在一定的缺陷，一方面是药效有限，另一方面是长期服用有严重的毒副作用，并且会产生耐药性。因此，新型核苷类似物的合成、研究依然是一个重要的研究方向，含有氟的核苷类似物即为其中的一类，国外也有相关研究报道(Clark，J.PCT Patent Appl.，WO 2005003174；Ismaili，H.M.A.PCT Patent Appl.，WO 0160315A22001)。本发明人长期从事核苷类似物的相关研究，于2007年8月申请了发明专利“2’-氟-4’-取代核苷类似物、其制备方法及其应用”(ZL200710137548.0)，目前已授权，该类化合物经证实有抗HIV和抗HBV及HCV活性，具有制备抗HIV和抗HBV及HCV病毒药物的开发应用前景，但未发现此类药物具有抗肿瘤活性。治疗肿瘤的药物种类繁多，普遍存在毒副作用较大、容易对患者产生耐药性的缺点，目前急需开发寻找活性高、毒副作用小、不易对患者产生耐药性的新型抗肿瘤药物。

发明内容

本发明目的在于提供一种活性高、毒副作用小、不易对患者产生耐药性的含2’-氟-4’-叠氮核苷类似物在制备肿瘤药物方面的应用，为含氟核苷类似物的研究开发奠定基础，同时对提升我国自主知识产权药物的开发具有重要意义。

为实现本发明目的，本发明研究人员在专利“2’-氟-4’-取代核苷类似物、其制备方法及其应用”(ZL200710137548.0)的基础上又进一步对此类化合物进行了大量的活性筛选试验，发现2’-氟-4’-叠氮核苷类似物具有较好的抗肿瘤活性，可以应用于抗肿瘤药物的制备。该2’-氟-4’-叠氮核苷类似物具有如下结构：

该化合物ESI-MS：287[M+H]，性质：浅黄色固体，熔点100-101℃。

该化合物或其5’-磷酸酯可以与有机酸或无机酸反应形成盐，以盐的形式存在。

本发明核苷类似物(FNC)或其盐在制备抗肿瘤药物中的应用，将其应用于制备治疗结肠癌(HT-29)，肝癌(HepG2、SMMC7721)，胃癌(SGC7901)、肺癌(A549)，乳腺癌(MCF-7)、宫颈癌(Hela)、食管癌(Eca-109)、急性白血病(HL60)、慢性白血病(K562)、B细胞淋巴瘤(G-519)、淋巴瘤(REN)等抗肿瘤药物中。通过初步动物体内外试验结果表明：FNC对多种人癌细胞及动物移植性肿瘤均具有明显的抑制作用。在相同条件下FNC的抗肿瘤作用与5-Fu、DDP相比疗效较好。FNC在有效剂量的情况下对动物骨髓造血功能无明显影响，而5-Fu及DDP则有明显的抑制作用，骨髓抑制是导致临床肿瘤化疗失败的最重要因素之一。本发明FNC属高效低毒的新型抗肿瘤药物，FNC水溶性较好，可制成注射剂，也可制成口服途径给药剂型。剂型包括：静脉用药小水针剂、大输液、冻干粉针、片剂、胶囊剂(普通胶囊、微型胶囊、软胶囊)、滴丸、缓释制剂及纳米制剂等剂型。

以本发明核苷类似物(FNC)或其盐为活性成分，与医学上可接受的药用辅料、赋形剂等混配、组合，制成上述各种剂型；也可以与其他抗肿瘤药物共同作为活性成份，与医学上可接受的药用辅料、赋形剂等混配、组合，制成上述各种剂型。

静脉用药小水针剂：将100g本发明核苷类似物(FNC)或其盐加碳酸氢钠、苯甲醇、亚硫酸氢钠与注射用水以1∶4比例混配，消毒分装成针剂，制成注射剂。规格：3mg/2ml。临床拟用量：6mg/日，2次/日。

大输液：将12mg本发明核苷类似物(FNC)或其盐与注射用水以4.8mg∶100ml比例混配，再加0.15％的活性炭脱色，过滤至澄明，灌装封口制成大输液，热压灭菌。规格：12mg/250ml，临床拟用量：12mg/日。

注射用冻干粉针：将100mg本发明核苷类似物(FNC)或其盐加水解明胶、甘露醇、葡萄糖酸钙、半胱氨酸等用注射用水溶解后，无菌过滤，分装于安瓿中，每支10ml，冷冻干燥后封口，临用前用氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液溶解后滴注。规格：100mg(含量12mg)。临床拟用量：12mg/日。

片剂：将本发明核苷类似物(FNC)或其盐与微晶纤维素、乳糖、硬脂酸镁等稀释剂、润滑剂混配，按公知的制片技术和装备，经过标准的凹冲压成片，制成片剂。规格：0.1g/片(含量10mg/片)。临床拟用量：20mg/日，2次/日。

胶囊剂(普通胶囊、软胶囊、微型胶囊)：

普通胶囊：将本发明核苷类似物(FNC)或其盐粉末与硬脂酸镁等以1∶9的比例混合均匀后，填入空胶囊中，即得。规格：0.1g/粒(含量10mg/粒)。临床拟用量：20mg/日，2次/日。

软胶囊：将本发明核苷类似物(FNC)或其盐水溶液与甘油、水、明胶加热熔化后混匀，加入滴丸机滴制，即得。规格：10mg/粒(含量5mg/粒)，临床拟用量：20mg/日，2次/日。

微型胶囊：将本发明核苷类似物(FNC)或其盐粉末分散在明胶材料中，加入硫酸钠水溶液，PEG甲醛以单凝聚法凝聚成囊。规格：0.2mg/粒(含量0.1mg/粒)，临床拟用量：20mg/日，2次/日。

滴丸：将1份本发明核苷类似物(FNC)或其盐与9份PEG6000以1∶9比例混合，以固体分散技术，制成滴丸剂。规格：10mg/粒(含量5mg/粒)，临床拟用量：20mg/日，2次/日。

缓释制剂：将本发明核苷类似物(FNC)或其盐与羟甲基纤维素混匀，枸橼酸钠溶于乙醇中作润湿剂制成软材，制粒，干燥，整粒，加硬脂酸，乳糖混匀，压片即得。规格：0.3g/片(含量60mg/片)，临床拟用量：60mg/3日。

纳米制剂：将本发明核苷类似物(FNC)或其盐与磷脂、助乳化剂和水以纳米乳化法制成纳米乳或亚微乳，再倒入冰水中冷却即得到纳米粒或亚微乳。规格：12mg/2ml，临床拟用量：12mg/日。

本发明2’-氟-4’-叠氮核苷类似物的制备反应路径如下：

B为

具体通过如下步骤：(也可以参考专利ZL200710137548.0中所描述方法)

化合物ii的合成：将化合物i(D-核糖或L-核糖)(8.66mmol)溶于31.2ml HCl/MeOH(0.2mmol/L)中，在27℃水浴下保温密闭搅拌3h，加入7.8ml吡啶终止反应，减压抽干，得浅黄色糖浆状物质化合物ii(96％)；

化合物iii的合成：将化合物ii(7.92mmol)溶于21ml干燥的吡啶中，冰盐浴下缓慢滴加5.2ml苯甲酰氯(0.0447mol)，室温下搅拌17h后将反应液倒入39ml冰水中，氯仿提取。有机层用冰水、预冷的3mol/L硫酸、饱和碳酸氢钠依次洗涤至水层呈弱碱性，再用冰水洗至水层呈中性，无水硫酸钠干燥4h以上，减压抽干得浅黄色糖浆状物质化合物iii(80.0％)。¹H NMR(CDCl₃)δppm：7.28～8.10(m，15H，OBz)，5.87(m，1H，H-3)，5.68(d，1H，H-2)，5.16(s，1H，H-1)，4.72(m，2H，H-5)，4.52(q，1H，H-4)，3.42(s，3H，OCH₃)。

化合物iv的合成：将苯甲酰化物化合物iii(0.0027mmol)溶于13mol氯仿中，加入红磷(390mg，0.0126mol)冰水浴搅拌下缓慢滴加溴(1.3ml，0.025mmol)，搅拌30min后，缓慢滴加冰水1.3ml，室温搅拌4h，然后加入7g碎冰搅融，再将反应液倒入14ml冰水中，氯仿提取。有机层饱和碳酸氢钠洗至水层呈弱碱性，冰水洗至水层呈中性，无水硫酸钠干燥4h以上，减压抽干得深黄色糖浆，用硅胶柱分离(石油醚：丙酮梯度洗脱)得白色干糖浆化合物iv(64.2％)。¹H NMR(CDCl₃)δppm：7.32～8.10(m，15H，OBz)，5.90(m，1H，H-3)，5.70(d，1H，H-2)，5.63(s，1H，H-1)，4.55～4.79(m，3H，H-5，H-4)。

化合物v的合成：将化合物iv(2.73mmol)溶解在5ml干燥的吡啶中，冰水浴下缓慢滴加醋酐(0.0276mol)，搅拌30min后，撤去冰水浴，室温搅拌7h，升温到40℃保持1h。加入6.5g碎冰搅融后，将反应液倒入13ml冰水中，氯仿提取。有机层用冰水、预冷的3mol/L硫酸、饱和碳酸氢钠依次洗至水层呈弱碱性，冰水洗至水层呈中性，无水硫酸钠干燥4h以上，减压抽干得浅黄色糖浆状化合物v(92.1％)。¹H NMR(CDCl₃)δppm：7.30～8.10(m，15H，OBz)，6.43(s，1H，H-1)，5.90(m，1H，H-3)，5.80(d，1H，H-2)，4.50～4.80(m，2H，H-5)，2.00(s，3H，CH₃COO-)。

化合物vi的合成：将化合物v(2.57mmol)溶于26ml干燥的二氯甲烷中，冰水浴下缓慢通入干燥的HCl气体2.5h，加入冰水19.5ml洗涤，分出有机层，用饱和碳酸氢钠洗至水层呈弱碱性，冰水洗至水层呈中性，无水硫酸钠干燥4h以上，减压抽干得浅黄色糖浆。用正己烷、二氯甲烷混合溶剂重结晶得白色固体化合物vi(65.1％)。¹H NMR(CDCl₃)δppm：7.36～8.14(m，15H，OBz)，6.68(d，J＝4.4Hz，1H，H-1)，5.59(dd，1H，H-3)，4.64～4.80(m，4H，H-2，H-4and H-5)。M.p.139～140℃。

化合物vii的合成：将化合物vi(2.81mmol)溶于13ml干燥的二氯甲烷中和3.5ml干燥的DMF中，-15℃搅拌下缓慢加入SO₂Cl₂(0.0079mmol)，-15℃搅拌30min后，自然升至室温，反应3h，在0℃下分3次加入咪唑(0.0407mmol)，混合液室温搅拌15h，反应液加入CH₂Cl₂(26ml)稀释，用冰水(35ml)洗涤，水层用CH₂Cl₂提取，有机层合并后用无水硫酸钠干燥4h以上，减压抽干溶剂得浅黄色糖浆。用硅胶柱分离纯化(石油醚：丙酮梯度洗脱)得白色固体化合物vii(76.0％)。¹H NMR(CDCl₃)δppm：7.00～8.10(m，15H，OBz)，6.71(d，J＝4.4Hz，1H，H-1)，5.59(dd，1H，H-3)，5.25(dd，1H，H-2)，4.56～4.81(m，3H，H-4，H-5)。M.p.128～129℃。

化合物viii的合成：将化合物vii(2.2mmol)溶于乙酸乙酯(54ml)中，搅拌下加入Et₃N·3HF(2.08ml，0.013mmol)，升温至60℃搅拌3h，70℃搅拌1.5h。加入冰盐水(10ml)终止反应，然后用二氯甲烷提取，有机层合并后依次用盐水、水、饱和碳酸氢钠洗涤，无水硫酸钠干燥4h以上，减压抽干溶剂得深黄色糖浆。用硅胶漏斗(5cm×5cm)纯化(二氯甲烷洗脱)得浅黄色糖浆(86.8％)，粗品在95％的乙醇溶液中结晶得白色晶体化合物viii(66.4％)。¹H NMR(CDCl₃)δppm：7.31～8.10(m，15H，OBz)，6.71(d，J＝9.0Hz，1H，H-1)，5.68(dd，J＝19.44Hz，1H，H-3)，5.32(d，J＝48.2Hz，1H，H-2)，4.65～4.77(m，3H，H-4，H-5)。M.p.80～82℃。

化合物ix的合成：将化合物viii(6.0mmol)溶解于无水二氯甲烷(20ml)中，加入HBr-AcOH(45％，V/V，4.6ml，25mmol)的混合溶液，室温搅拌反应20h。将混合物蒸干，用二氯甲烷(50ml)溶解剩余物，并用碳酸氢钠(3×30ml)洗涤二氯甲烷溶液，将二氯甲烷蒸去，得到糖浆状物。同时，将保护过的胞嘧啶(15mmol)和(NH₄)₂SO₄(0.1g)在HMDS(30ml)中氮气保护下回流反应17h，减压蒸去溶剂，得到甲硅烷基化的胞嘧啶。将上述反应中得到的糖浆状物溶于二氯乙烷(25ml)中，加入到甲硅烷基化的胞嘧啶中，混合物在N₂保护下回流反应15h。用冰终止反应，用二氯甲烷(3×45ml)萃取，二氯甲烷层依次用饱和碳酸氢钠和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。干燥后蒸除溶剂，得到白色固体，柱色谱分离(1％MeOH-CHCl₃)纯化，得到化合物ix(71％)。¹H NMR(CDCl₃)δppm：8.07(d，J＝9.86Hz，1H)，7.45(d，J＝9.82Hz，1H)，7.26～8.10(m，10H，OBz)，6.03(d，J＝9.0Hz，1H，H-1)，5.64(dd，J＝19.44Hz，1H，H-3)，5.26(d，J＝48.2Hz，1H，H-2)，4.65～4.77(m，3H，H-4，H-5)。

化合物x的合成：将化合物ix(3.60mmol)溶于饱和的NH₃-CH₃OH(30ml)室温搅拌反应15h。将溶剂蒸干，所得剩余物通过柱色谱(15∶1CHCl₃-MeOH)纯化，得到化合物x(80％)。¹H NMR(CDCl₃)δppm：8.10(d，J＝9.86Hz，1H)，7.40(d，J＝9.82Hz，1H)，6.03(d，J＝9.0Hz，1H，H-1)，5.64(dd，J＝19.44Hz，1H，H-3)，5.26(d，J＝48.2Hz，1H，H-2)，4.50(m，1H，H-4)，3.70～3.77(m，2H，H-5)。

化合物xi的合成：将化合物x(9.46mmol)，咪唑(18.93mmol)、三苯基膦(14.19mmol)，溶解在四氢呋喃(50ml)中，向其中缓慢加入溶解有碘(14.18mmol)的四氢呋喃溶液15ml。室温搅拌反应3h。蒸除溶剂，向剩余物中加入乙酸乙酯(100ml)，过滤。蒸除乙酸乙酯，剩余物柱色谱分离得到化合物xi(83.9％)。¹H NMR(CDCl₃)δppm：8.06(d，J＝9.86Hz，1H)，7.43(d，J＝9.82Hz，1H)，6.01(d，J＝9.0Hz，1H，H-1)，5.66(dd，J＝19.44Hz，1H，H-3)，5.22(d，J＝48.2Hz，1H，H-2)，4.57(m，1H，H-4)，3.58～3.69(m，2H，H-5)。

化合物xii的合成：将化合物xi(5.88mmol)溶解在四氢呋喃(50ml)中，向其中加入DBU(6.44mmol)。在60℃搅拌3h。蒸干溶剂，剩余物柱色谱分离得到化合物xii(75.1％)。直接用于下一步反应。

化合物xiii的合成：在0℃，将溶有ICl(13.9mmol)的15ml DMF溶液加入到溶有NaN₃(9.75mmol)的DMF(15ml)溶液中，0℃搅拌10分钟，将溶有化合物xii(6.8mmol)的DMF(20ml)缓慢加入到上述溶液。0℃反应1小时。向混合溶液中加入亚硫酸钠，直到碘的颜色完全消失。减压蒸除溶剂，剩余物用柱色谱分离纯化，得到化合物xii(77.6％)。直接用于下一步反应。

化合物xiv的合成：将化合物xiii(5mmol)溶于DMF(15ml)中，搅拌下加入醋酸银(6mmol)，室温反应8h，过滤。在减压下移除溶剂(50℃以下)，剩余物用柱色谱纯化，得到化合物xiv(71.3％)。¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ：8.12(d，1H)，7.40(d，1H)，7.26(br，2H)，6.12(dd，1H)，5.87(d，1H)，5.09(t，1H)，4.90(dt，1H)，4.18(dt，1H)，3.74-3.87(m，2H)，2.12(s，3H，CH₃)。

化合物xv的合成：将化合物xiv(5mmol)溶于5％的三乙胺甲醇溶液(100ml)中，室温搅拌12h，蒸除溶剂，剩余物用柱色谱纯化，得到化合物xv(89.0％)。ESI-MS：287[M+H]。¹H NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ：8.14(d，1H)，7.32(d，1H)，7.21(br，2H)，6.08(dd，1H)，5.82(d，1H)，5.11(t，1H)，4.92(dt，1H)，4.16(dt，1H)，3.62-3.69(m，2H)。

附图说明

图1本发明FNC作用72h对A549的增值抑制作用；

图2本发明FNC作用72h对HL60的增值抑制作用；

图3本发明FNC作用96h对REN、G519的增值抑制作用，横坐标表示药剂量(uM)，纵坐标表示肿瘤细胞的存活率；

图4本发明FNC对不同淋巴瘤细胞凋亡的影响；

图5本发明FNC作用72h对Granta-519PARP蛋白的影响。

具体实施方式

采用如下实验证实本发明2’-氟-4’-叠氮核苷类似物(FNC)抗肿瘤活性。

一、体外试验：

(一)本发明FNC对几种人癌细胞的增殖抑制试验

1.本发明FNC对HT-29、HepG2、SMMC7721、SGC7901、A549、MCF-7、Hela、Eca-109等细胞(均由中科院上海细胞所提供)的增殖抑制试验：MTT法。

取对数生长期的上述细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞浓度为2×10⁴个/孔，培养24小时后去除上清，每孔加入200μl含本发明FNC的新鲜培养基，FNC的浓度分别为0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM、每个浓度设6个复孔，并设调零孔和空白对照孔。放入细胞培养箱中(5％CO₂，37℃)孵育72h后，每孔加入20μl MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)溶液(5mg/ml，即浓度为0.5％MTT)，继续培养4h后，弃去上清液，每孔加入DMSO(二甲基亚砜)150μl，振荡10min，酶标仪(检测波长570nm)测定各孔OD值，用细胞存活率对剂量作图并按作图法求出IC₅₀值。

2.本发明FNC对REN、G519、HL60、K562细胞的增殖抑制试验：SRB法

取对数生长期的上述细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞浓度为2.5×10⁵个/孔，本发明FNC对REN、G519细胞的作用浓度分别为0.001μM、0.01μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2.5μM、5μM、7.5μM、10μM、20μM，本发明FNC对HL60、K562细胞的作用浓度分别为0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM，每个浓度设6个复孔，并设调零孔和空白对照孔。放入细胞培养箱中(5％CO₂，37℃)孵育72h(HL60、K562细胞)96h(REN、G519细胞)后，每孔加入预冷的80％三氯醋酸固定1h。96孔板以去离子水洗5遍，空气干燥。每孔加入100μl磺酰罗丹明染色法(SRB)工作液(0.4％SRB)，室温放置染色10min，以1％醋酸溶液洗5遍，洗去未与蛋白结合的SRB染液，空气干燥。每孔加入150μl 10mmol·L-1非缓冲Tris碱，溶解与蛋白结合的SRB，用酶标仪在490nm波长处测定各孔OD值，用细胞存活率对剂量作图并按作图法求出IC₅₀值。

试验结果表明：本发明FNC对人癌细胞HT-29、HepG2、SMMC7721、SGC7901、A549、MCF-7、Hela、Eca-109、REN、G519、HL60、K562等均具有明显的细胞毒作用。附图1本发明FNC作用72h后，随着药物浓度的增加，对A549细胞的抑制率明显增加，IC₅₀值为1.22μM。附图2本发明FNC作用72h后，随着药物浓度的增加，对HL60细胞的抑制率明显增加，IC₅₀值为3.30μM。附图3本发明FNC作用96h后，随着药物浓度的增加，REN和G519细胞的存活率明显下降，表明本发明FNC对REN和G519细胞的增殖有明显的抑制作用。

(二)流式细胞术检测本发明FNC对三种淋巴瘤细胞凋亡的影响

1.不同浓度的本发明FNC(0.5uM、1.0uM、2.0uM)作用24个小时。

2.细胞收集：将细胞收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为1×10⁶个/mL1000r/min离心5min，弃去培养液。

3.用孵育缓冲液洗涤1次，1000r/min离心5min。

4.用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育15min。

5.1000r/min离心5min，将沉淀细胞用孵育缓冲液洗涤1次。

6.加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。

7.流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。

从附图4可以看出，本发明FNC作用后，三种淋巴瘤细胞(Granta-519、HUDHL-6、RL)的凋亡率均较正常对照组明显增加。

(三)Western blotting检测本发明FNC对细胞PARP蛋白的影响：

1.取对数生长期的Granta-519细胞，以每孔7×10⁵的细胞浓度接种于6空培养板，培养过夜后，分别加入1uM、2uM、4uM、6uM、8uM和10uM的本发明FNC，作用72小时，同时设不加药的细胞对照组。

2.弃细胞上清液，用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤细胞2次，每空加入1ml胰酶消化细胞，将细胞制成细胞悬液，转移至1.5ml EP管中，12000rpm离心5分钟，收集上清，得总蛋白。

3.蛋白定量后，将蛋白质样品加入到SDS-PAGE胶(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)上进行电泳分离，进一步转移至硝酸纤维素膜上，并进行染色及脱色。

4.将蛋白膜放置于洗涤液中，洗去转膜液，加入封闭液，室温封闭60分钟。

5.分别加入一抗兔抗人PARP多克隆抗体和二抗辣根过氧化物酶标记羊抗人IgA进行孵育，并用洗涤液洗涤。

6.显色法检测PARP的含量。

从附图5可以看出，本发明FNC作用后，与正常对照相比，套细胞淋巴瘤细胞Granta-519内113kD的完整PARP(多聚ADP核糖聚合酶)减少，89kD的裂解片段增加。表明本发明FNC作用后，Granta-519细胞DNA修复功能降低，细胞发生凋亡。

二、体内试验：

(一)对小鼠移植性肿瘤的影响：S₁₈₀、H₂₂、Lewis、B₁₆

(二)对人癌裸小鼠移植瘤模型的影响：

1.试验材料：

1.1受试药：本发明合成的2’-氟-4’-叠氮核苷类似物(FNC)，纯度达98.5％以上，供试验用。

1.2阳性对照药：5-氟脲嘧啶，批号090904，由旭东海普药业有限公司生产，规格：250mg/10ml。

1.3阳性对照药：卡培他滨片，批号SH0246，上海罗氏制药有限公司生产，规格0.5g/片。

1.4人癌细胞株：肝癌(SMMC7721)、胃癌(SGC7901)、食管癌(Eca-109)、结肠癌(HT-29)、肺癌(A549)、乳腺癌(MCF-7)、宫颈癌(HeLa)、急性白血病(HL60)、慢性白血病(K562)，均由中科院上海细胞所提供。

1.5动物移植性肿瘤：肝癌(H₂₂)；肉瘤180(S₁₈₀)；Lewis肺癌，黑色素瘤(B₁₆)等，均由中科院上海细胞所提供。

1.6实验用动物：①昆明种小鼠、C57小鼠均为SPF级，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，体重20±2g，动物合格证号：0062355、0064494等，供动物移植性肿瘤实验用。②裸小鼠，SPF级，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，体重：20±2g，动物合格证号：0073254、0064462等，供人癌细胞试验用。

2.试验分组及用药剂量：

2.1空白对照组：灭菌生理盐水或蒸馏水0.2ml/10g，静脉(iv)或灌胃(ig)给药。

2.2阳性对照组：5-氟脲嘧啶，用量：15mg/kg，试验前用氯化钠注射液配成浓度为0.075％溶液，用药体积0.2ml/10g，iv。

2.3阳性对照组：卡培他滨片，用量：600mg/kg(裸鼠为400mg/kg)，试验前用蒸馏水配成浓度为3％(裸鼠为2％)的溶液，用药体积0.2ml/10g，ig。

2.4受试药：本发明合成的2’-氟-4’-叠氮核苷类似物(FNC)，用量：分为高、中、低三个剂量组：即2.0mg/kg、1.0mg/kg、0.5mg/kg，试验前用氯化钠注射液分别依次配成浓度为0.01％、0.005％、0.0025％溶液，用药体积0.2ml/10g，iv或ig。

3.试验方法：

3.1动物移植性肿瘤试验，取传代后7天的瘤细胞，给每只动物右前肢腋下接种1×10⁷个细胞，接种后随机分为不同剂量组，24h后开始iv或ig给药，每日一次，连用8天，停药后，处死动物，剖瘤称重，计算瘤重抑制率，评价其疗效。

3.2人癌细胞裸鼠体内试验；将人癌细胞在体外进行近20天的培养，扩增，配成浓度为1×10⁷个/ml的肿瘤单细胞悬液，给每只裸鼠背部右侧皮下接种0.2ml，待裸鼠瘤体形成约5-8mm平均直径时，随机分为不同的剂量组，每日iv或ig给药一次，连用20天，停药后，剖瘤称重，计算瘤重抑制率，评价其疗效。

3.3外周血白细胞计数：待以上体内试验停药后24h，自动物尾静脉取血20μl，按常规白细胞计数法进行计数，了解其受试药物对动物骨髓造血功能的影响情况。

4.试验结果：

4.1本发明FNC对动物移植性肿瘤生长的影响，试验结果表明，本发明FNC不同剂量对H₂₂、S₁₈₀、Leuis肺癌、黑色素瘤(B₁₆)等肿瘤的生长均具有明显的抑制作用，抑瘤率达50-70％。与5-Fu相比无明显差异，且对骨髓造血功能无明显影响。但5-Fu则有明显的抑制作用。

4.2本发明FNC对人癌裸鼠试验：试验结果表明，本发明FNC对上述人癌细胞均具有明显的抑制作用，抑制率均达60％以上；本发明FNC不同剂量组裸小鼠的外周血白细胞数虽较空白对照组低，但数值均在正常范围内，表明本发明FNC在治疗剂量下对裸小鼠的白细胞无明显影响。

本发明FNC(iv)对动物移植性肿瘤H₂₂、S₁₈₀生长的影响

本发明FNC(ig)对动物移植性肿瘤H₂₂、S₁₈₀生长的影响

本发明FNC(ig)对人癌裸小鼠移植瘤模型的影响

本发明FNC(ig)对人胃癌SGC7901裸小鼠移植瘤模型白细胞计数的影响

*与空白对照组相比P＜0.05

另外通过本发明FNC原料药给小鼠灌胃给药的急性毒性试验及本发明FNC原料药给大鼠单次灌胃给药的药代动力学试验，结果表明：

1、FNC原料药给小鼠灌胃给药的急性毒性试验：LD50＝574.46±21.35mg/kg；

2、FNC原料药给大鼠单次灌胃给药的药代动力学试验试验结果显示：给大鼠灌胃5mg/Kg的FNC后，血药浓度呈二房室模型，从药代参数可知，FNC的分布半衰期为0.829小时，在血浆中达峰时间为1.74小时，表明FNC在大鼠体内分布较缓慢，FNC的消除半衰期为1.856小时，清除率为1.169L·h-1，表明FNC在血中消除比较迅速。FNC在大鼠体内的表观分布容积为3.131mg/Kg，表明FNC分布广泛，组织渗透性强。总之FNC在大鼠体内的药代动力学特征是：吸收较缓慢，消除迅速，分布广泛，组织渗透性强。

Claims (5)

1.具有如下结构的2’-氟-4’-叠氮核苷类似物或其盐在制备药物方面的应用，

其特征在于，将其用于制备治疗肝癌、胃癌、肺癌、白血病或淋巴瘤药物中。

2.如权利要求1所述的2’-氟-4’-叠氮核苷类似物或其盐在制备药物方面的应用，其特征在于，将其制成注射剂、口服药剂。

3.如权利要求2所述的2’-氟-4’-叠氮核苷类似物或其盐在制备药物方面的应用，其特征在于，将其制成静脉用药小针注射剂、大输液注射剂、冻干粉针剂。

4.如权利要求2所述的2’-氟-4’-叠氮核苷类似物或其盐在制备药物方面的应用，其特征在于，将其制成片剂、胶囊剂或滴丸。

5.如权利要求4所述的2’-氟-4’-叠氮核苷类似物或其盐在制备药物方面的应用，其特征在于，将其制成缓释剂或纳米制剂。

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