CN101941996B

CN101941996B - 一类熊果酸皂苷及其制法与抗高致病h5n1流感病毒的应用

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Publication number: CN101941996B
Application number: CN200910084246.0A
Authority: CN
Inventors: 郭颖; 李英霞; 曹颖莉
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS; Ocean University of China
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS; Ocean University of China
Priority date: 2009-05-18
Filing date: 2009-05-18
Publication date: 2014-09-10
Anticipated expiration: 2029-05-18
Also published as: CN101941996A

Abstract

本发明公开了一类熊果酸皂苷及其制法与抗高致病H5N1流感病毒的应用。具体涉及如通式(I)所述的熊果酸皂苷累化合物，以天然产物熊果酸为原料，通过结构修饰首先在C-28位引入酯基，然后在C-3位引入β-葡萄糖基，利用BBTZ选择性的保护葡萄糖的3，6-OHs，再在葡萄糖的2，4-OHs引入糖基得到系列熊果酸皂苷。药理实验表明，它们对H5N1高致病流感病毒的侵入宿主细胞过程有明显的抑制作用，可以用作预防或治疗抗流感病毒的药物。本发明还包含它们的药物组合物以及本发明化合物与其它抗病毒药的联合用药。

Description

一类熊果酸皂苷及其制法与抗高致病H5N1流感病毒的应用

技术领域

本发明涉及一类新的熊果酸皂苷，制备这类熊果酸皂苷的方法，含有这类熊果酸皂苷的药物组合物，以及这类熊果酸皂苷在制备抗流感病毒药物，尤其是抗高致病H5N1流感病毒的药物中的应用；属于化学药物技术领域。

背景技术

甲型流感病毒属于正粘病毒科，基因组由8个单链节段式的负链RNA组成，编码至少10种蛋白：血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)、聚合酶(Polymerase basic protein 1，PB1；Polymerase basic protein 1，PB2；Polymerase acidic protein，PA)、核蛋白(Nucleoprotein，NP)、基质蛋白(Matrix protein 1，M1；Matrixprotein 2，M2)、非结构蛋白(Non-structural protein1，NS1；Non-structuralprotein 2，NS2)。野生水禽是甲型流感病毒的原生宿主，当经过变异，甲型流感病毒会感染其它物种(包括人类)。H5N1高致病流感病毒即是如此，1997年在中国香港首次证实了H5N1高致病流感病毒感染人类的病例，说明该病毒已具备以人为宿主的跨种属传播的能力。WHO的数据显示，截止至2008年2月22日，全世界共有368人感染H5N1高致病流感病毒，其中的234人死亡(死亡率63.6％)(http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2008_02_26/en/index.html，2008.)，并且传播速度和范围未见下降趋势。

目前，临床上针对甲型流感病毒的药物主要有两个靶点：M2离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂。前者包括有Amantadine和Rimantadine，后者包括Oseltamivir和Zanamivir等(J.Clin.Virol.30，(2004)：115-133)。但由于流感病毒的高变异性，目前已经对所有M2离子通道抑制剂产生耐药性(自2007年起，美国FDA已经禁止这类药物用作病毒性流感治疗药物)；因而神经氨酸酶抑制剂几乎是唯一一类临床用药，但自2006年起，在泰国和越南出现了对该类药物耐药的H5N1高致病流感病毒株(Nippon Rinsho.64，(2006)：1845-1852；Antiviral Res.73(2007)：228-231)。同时，还是由于流感病毒的高变异性，目前尚无一劳永逸的针对流感病毒的疫苗。

血凝素蛋白(HA)是流感病毒表面的糖蛋白，其主要功能是与宿主细胞表面的受体(唾液酸)相互识别、结合，并介导病毒进入宿主细胞，即病毒感染的第一步。因此，若能在这个环节上阻断流感病毒的入侵，则可以有效地进行预防和治疗流感病毒。

熊果酸(ursolic acid)又名乌苏酸、乌索酸，属于五环三萜类化合物。它在自然界中广泛分布，具有多种生物学效应，对多种致癌、促癌物有抵抗作用，对多种肿瘤细胞有抑制生长的作用；体外对G+和G-菌及酵母菌有抗菌活性；具有降血脂、抗动脉粥样硬化作用；还有保肝、抗肝炎的作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一类新的熊果酸皂苷化合物；

本发明要解决的另一个技术问题是提供这类熊果酸皂苷化合物的制备方法；

本发明要解决的又一个技术问题是提供含有这类熊果酸皂苷化合物的药物组合物；

本发明要解决的再一个技术问题是提供这类熊果酸皂苷化合物在制备抗流感病毒药物，尤其是抗高致病H5N1流感病毒药物中的应用。

具体而言，为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明涉及的熊果酸皂苷化合物如通式(I)所示

其中，R1、R2独立的选自氢、葡萄糖基、阿拉伯糖基、鼠李糖基、半乳糖基、木糖基、核糖基、甘露糖基、2-氨基葡萄糖基、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、山梨糖基、阿洛糖基、阿洛酮糖基，或由这些单糖2-3个组成的直链或支链寡糖基；

R3选自C1-C18直链或支链的烷基。

C_1-18直链或支链的烷基选自甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊烷基、己烷基、庚烷基、辛烷基、壬烷基、葵烷基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基。

优选的R1、R2独立的选自葡萄糖基、阿拉伯糖基、鼠李糖基、半乳糖基、木糖基、核糖基、甘露糖基、山梨糖基、阿洛糖基、阿洛酮糖基；

R3选自C1-C8直链或支链的烷基。

更优选的R1、R2独立的选自葡萄糖基、鼠李糖基；

R3选自C1-C4直链或支链的烷基。

本发明还提供了制备通式(I)所示化合物的方法，包括如下步骤：

其中，R1、R2和R3的定义同上；P1和Bz表示保护基；

(a)在熊果酸的C-28位引入酯基得到熊果酸酯；

(b)在熊果酸酯的C-3引入β--葡萄糖基；

(c)脱除葡萄糖上的保护基得到3β--O-葡萄糖熊果酸酯；

(d)选择性的保护葡萄糖上3，6-OHs得到3-β-O-(3，6-二-O-β-D-苯甲酰基葡萄糖)熊果酸酯；

(e)分别或同时在葡萄糖的2，4-OHs引入糖基；

(f)最后脱除糖环上保护基得到通式(I)所示的熊果酸皂苷。

步骤(a)在熊果酸的C-28位引入酯基得到熊果酸酯；

步骤(a)中在熊果酸的C-28位引入酯基的方法是将熊果酸与重氮甲烷反应，或与其他醇进行酯化反应。

(i)熊果酸与重氮甲烷反应

反应优选在混合溶剂存在的条件下进行，优选的混合溶剂是体积比1∶1的CH₂Cl₂-CH₃OH。

重氮甲烷优选在乙醚溶液中加入到反应体系中；通过反应体系的颜色观察反应的进程。

反应的温度是反应的温度是-10-10℃，优选是-5-5℃，优选在冰浴条件下进行。

反应的时间优选是0.5-4小时；优选是0.5-2小时；最优选是1小时；

反应结束后然后向反应液中加入酸以除去过量的CH₂N₂，所述的酸可以是无机酸或有机酸，优选的酸是有机酸，更优选的有机酸是醋酸。

(ii)熊果酸与其他醇的酯化反应。

优选在偶合剂和/或催化剂存在的条件下进行。优选的缩合试剂是包括1，3二环己基碳二亚胺(DCC)、二吡啶碳酸酯(2-DPC)、1-(3-二甲胺丙基)-3-乙基碳酰亚胺盐酸盐(EDCI)、1，3-二异丙基碳酰亚胺(DIPC)、4-吡咯烷基吡啶。更优选的缩合剂是1-(3-二甲胺丙基)-3-乙基碳酰亚胺盐酸盐(EDCI)。

优选的催化剂是三级胺。优选的三级胺选自4-二甲氨基吡啶(DMAP)，4-吡咯烷基吡啶。更优选的三级胺选自4-二甲氨基吡啶(DMAP)。

反应的温度在0℃～120℃之间，优选的温度是20℃～30℃，更优选的温度是室温。

反应在适宜的溶剂下进行，优选的溶剂是无水的非质子性溶剂，更优选的是卤代烷、四氢呋喃(THF)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等。最优选的是二氯甲烷，DMF。

反应产物可以通过重结晶或硅胶柱纯化，优选使用硅胶柱纯化，硅胶柱纯化时使用的洗脱剂是优选为石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物；优选的洗脱剂是乙酸乙酯-石油醚的混合洗脱剂，优选的体积比是1∶4。

步骤(b)：在熊果酸酯的C-3引入β--葡萄糖基；

步骤(b)中糖基供体保护基P1，优选是酰基保护基，优选的酰基保护基选自乙酰基、苯甲酰基、叔戊酰基；最优选是苯甲酰基。

葡萄糖C-1活化基团选自三氯乙酰亚胺酯、乙硫苷、苯硫苷或对-甲苯硫苷；最优选的活化基团是三氯乙酰亚胺酯。

糖苷化反应优选在路易斯酸催化剂存在的条件下进行，优选的路易斯酸催化剂选自C₃-C₉的卤代酰胺、C₁-C₆的氟代烃基磺酸、C₂-C₈的硅基氟代烃基磺酸酯、C₁-C₆的氟代烃基磺酸银、三氟化硼-乙醚络合物或三氟化硼-乙醚混合物；更优选的是三氟甲基磺酸三甲基硅酯(trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate，TMSOTf)；

所述糖苷化反应中的有机溶剂优选为C₁-C₄的氯代烷烃、甲苯或乙醚；优选的有机溶剂是CH₃Cl、CH₂Cl₂；更优选的是CH₂Cl₂；

所述淬灭剂优选为有机胺或硫代硫酸钠；优选的有机胺是三甲胺、三乙胺；更有选的淬灭剂选自三乙胺。

所述的分子筛优选为3-5型硅铝酸盐分子筛；更优选为4型硅铝酸盐分子筛；

反应产物可以通过重结晶或硅胶柱纯化，优选使用硅胶柱纯化，所述柱层析纯化中洗脱用的溶剂优选为石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物；优选的洗脱剂是是使用EtOAc-石油醚-CHCl₃的混合溶剂，EtOAc-石油醚-CHCl₃混合溶剂的优选体积比为1∶10∶1。

步骤(c)脱除葡萄糖上的酰基保护基得到3β--O-葡萄糖熊果酸酯；

脱除葡萄糖上的酰基保护基，优选使用碱，优选的碱是CH₃ONa；优选在CH₃ONa/CH₃OH存在的条件下进行。

脱保护基反应中极性溶剂优选为四氢呋喃、甲醇、乙醇、二氯甲烷、水中的一种或多种的混合物；优选的溶剂是CH₃OH-CHCl₃(1∶1，60ml)，

反应的温度是10-40℃，优选是20-30℃，更优选是在室温下进行；

反应的时间1-4小时；反应的时间1.5-2.5小时；反应的时间2小时；

反应完成后用酸将反应液中和到中性，优选使用阳离子树脂(H+)中和反应液至中性

产物可以重结晶或经过经硅胶柱纯化；硅胶柱纯化的洗脱剂优选为石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物；更优选的洗脱剂选自体积比20∶1→8∶1的CHCl₃-MeOH梯度洗脱剂。

步骤(d)选择性的保护葡萄糖上3，6-OHs得到3-β-O-(3，6-二-O-β-D-苯甲酰基葡萄糖)熊果酸酯；

优选利用位阻试剂1-(苯甲酰基)苯并三唑(BBTZ)选择性的保护葡萄糖上3，6-OHs得到3-β-O-(3，6-二-O-β-D-苯甲酰基葡萄糖)熊果酸酯；

有机溶剂优选为C₁-C₄的氯代烷烃、甲苯或乙醚；优选的有机溶剂是CH₃Cl、CH₂Cl₂；最优选的溶剂是CH₂Cl₂；；

反应优选在有机胺存在的条件下进行；优选的有机胺是三甲胺、三乙胺；

反应的温度反应的温度是10℃-40℃；优选20-30℃；更优选是室温；

反应的时间5-20小时；优选是10-14小时；更优选的时间是12小时；

所述柱层析纯化中洗脱用的溶剂优选为石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物；更优选的洗脱剂是乙酸乙酯-石油醚-三氯甲烷的混合溶剂，EtOAc-petroleumether-CHCl₃的优选的体积比为1∶4∶2。

步骤(e)分别或同时在葡萄糖的2，4-OHs引入糖基；

优选的糖基上带有保护基，优选的保护基是酰基保护基，优选的酰基保护基选自乙酰基、苯甲酰基、叔戊酰基；糖基上最优选的保护基是乙酰基；

所述糖苷化反应中的有机溶剂优选为C₁-C₄的氯代烷烃、甲苯或乙醚；优选的有机溶剂是CH₃Cl、CH₂Cl₂；最优选的溶剂是CH₂Cl₂；

在-40℃- -20℃反应0.5h，再在-5℃-5℃反应1h；优选在-30℃反应0.5h，再在0℃反应1h。

所述的分子筛优选为3-5型硅铝酸盐分子筛；更优选为4型硅铝酸盐分子筛；优选的分子筛为4分子筛；

可以使用重结晶或硅胶柱纯化，优选进行硅胶柱纯化，所述柱层析纯化中洗脱用的溶剂优选为石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物；更优选的洗脱剂是乙酸乙酯-石油醚，优选进行梯度洗脱，梯度洗脱剂为的体积比1∶3→1∶2的乙酸乙酯-石油醚。

步骤(f)最后脱除糖环上保护基得到本发明的系列熊果酸皂苷。脱去R2和R3上的保护基，

脱保护基反应中极性溶剂优选为四氢呋喃、甲醇、乙醇、二氯甲烷、水中的一种或多种的混合物；优选的溶剂选自CH₃OH-CHCl₃；优选的CH₃OH-CHCl₃混合溶剂的体积比1∶1。

脱去保护基优选在碱性条件下进行，优选的碱选自NaOMe。

反应温度是10-40℃；优选的反应温度是20-30℃；更优选的反应温度是室温。

反应的时间是8-16小时；优选的反应时间是10-14小时；更优选的反应时间是12小时。

使用酸中和反应液；最优选是的使用阳离子树脂。

可以使用重结晶或硅胶柱纯化，优选进行硅胶柱纯化，所述柱层析纯化中洗脱用的溶剂优选为石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中一种或多种的混合物；优选的体积洗脱剂是CHCl₃-MeOH；优选进行梯度洗脱，梯度洗脱剂的为体积比8∶1→6∶1的CHCl₃-MeOH。

反应的产物还可以使用重结晶纯化，所述重结晶纯化中的溶剂优选为三氯甲烷、C₁-C₄的烷基醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、石油醚、环己烷、二氯甲烷、水中一种或多种的混合物。

本发明再一方面还涉及以本发明化合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

本发明的发明人发现熊果酸皂苷能特异性的抑制H5N1高致病流感病毒侵入宿主细胞。

还可以和其他的抗病毒药物进行联合用药，其他的抗病毒药物包括但不限定于，M2离子通道抑制剂、神经氨酸酶抑制剂。优选的M2离子通道抑制剂选自Amantadine或Rimantadine，优选的神经氨酸酶抑制剂选自Oseltamivir或Zanamivir。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

本发明的优点：

制备中使用位阻试剂1-(苯甲酰基)苯并三唑(BBTZ)选择性的保护葡萄糖上3，6-OHs，有效缩短了合成路线，制备方法简便，条件易于控制，便于快速制备系列熊果酸皂苷。

化合物的毒性很低。

具体实施方式

下面用实施例进一步说明本专利，但这并不意味着对本发明的限制。本发明采用的合成原料熊果酸为市售商品。

实施例1：熊果酸甲酯的制备

将熊果酸(2.28g，5.0mmol)溶于90mL混合溶剂(体积比1∶1的CH₂Cl₂-CH₃OH，)中，冰浴下将重氮甲烷乙醚溶液(黄绿色)滴加到上述反应溶液中，直至黄色不消失，冰浴条件下继续反应1小时。然后向反应液中加入醋酸以除去过量的CH₂N₂，减压蒸馏，浓缩物经硅胶柱纯化(体积比1∶4的EtOAc-petroleum ether)得白色固体化合物(2.24g，95％)；R_f 0.50(体积比1∶2的EtOAc-petroleum ether)；¹H NMR(CDCl₃)：5.25(t，J＝3.7Hz，1H，H-12)，3.61(s，3H，-CH₃)，3.21(dd，J＝4.7，11.3Hz，1H，H-3)，2.23(d，J＝11.3Hz，1H，H-18)，2.00(td，J＝4.4，13.2Hz，1H)，1.91(dd，J＝3.7，8.8Hz，2H)，1.08，0.99，0.92，0.78，0.74(3H，each)，0.94(d，J＝6.2Hz，3H)，0.86(d，J＝6.6Hz，3H).

实施例2：3-β-O-(2，3，4，6-四-O-β--D-苯甲酰基葡萄糖)熊果酸甲酯

将熊果酸甲酯(1.65g，3.5mmol)、苯甲酰基保护的葡萄糖三氯亚胺酯(3.89g，5.25mmol)、4分子筛和新蒸CH₂Cl₂(40mL)混合，0℃下加入TMSOTf(64.5μL，0.37mmol)。0℃反应0.5h，室温反应1h后，用Et₃N终止反应。滤除分子筛，滤液浓缩后经硅胶柱纯化(体积比1∶10∶1的EtOAc-petroleum ether-CHCl₃)得白色固体化合物(3.67g，96.4％)，R_f0.38(体积比1∶3的EtOAc-petroleum ether)；¹H NMR(CDCl₃)：.8.03-7.26(m，20H，Ar-H)，5.91(t，J＝9.9Hz，1H，H-3’)，5.58-5.55(m，2H，H-2’，H-4’)，5.25(m，1H，H-12)，4.84(d，J＝8.1Hz，1H，H-1’)，4.57-4.56(m，2H，H-6’×2)，4.15-4.13(m，H-5’)，3.59(s，3H，-CH₃)，3.08(dd，J＝4.4，11.8Hz，1H，H-3)，2.23(d，J＝11.3Hz，1H，H-18)，1.04，0.83，0.61，(3H，each)，0.95(d，J＝6.2Hz，3H)，0.90(d，J＝6.6Hz，3H)，0.69(s，6H)；¹³CNMR(CDCl₃)：.178.0，166.0，165.8，165.3，165.0，(C＝O×5)，138.1，133.4，133.2，133.1，129.8～128.3，125.6，103.3，90.6，72.9，72.1，72.0，70.3，63.4，55.4，52.8，51.4，48.0，47.5，41.9，39.4，39.0，38.8，38.7，38.5，36.6，36.5，32.9，30.6，27.9，27.6，25.8，24.2，23.5，23.2，21.2，18.0，17.0，16.8，16.1，15.3。

实施例3：3-β--O-葡萄糖熊果酸甲酯

将3-β-O-(2，3，4，6-四-O-β-D-苯甲酰基葡萄糖)熊果酸甲酯(3.31g，3.15mmol)溶于CH₃OH-CHCl₃(体积比1∶1，60ml)，加入NaOMe(200mg)。室温搅拌2h后，用阳离子树脂(H+)中和反应液至中性，滤除固体颗粒，浓缩后经硅胶柱纯化(体积比20∶1→8∶1的CHCl₃-MeOH，)得白色固体化合物(1.814g，91.2％)，R_f 0.33(体积比8∶1的CHCl₃-MeOH)；¹H NMR(DMSO)：.5.15(t，J＝3.3Hz，1H，H-12)，4.87(d，J＝5.2Hz，2H，2’-OH，3’OH)，4.84(d，J＝4，7Hz，1H，4’-OH)，4.34(t，J＝5.5Hz，1H，6’-OH)，4.14(d，J＝7.7Hz，1H，H-1’)，3.65-3.62(m，1H，H-6’)，3.51(s，3H，-CH₃)，3.44-3.40(m，1H，H-6’)，3.12-3.09(m，1H，H-3’)，3.05-3.02(m，3H，H-3，H-4’，H-5’)，2.97-2.93(m，1H，H-2’)，2.14(d，J＝11.4Hz，1H，H-18)，1.04，0.98，0.87，0.75，0.67(s，3H，each)，0.91(d，J＝5.9Hz，3H)，0.82(d，J＝6.2Hz，3H)；¹³C NMR：.176.8(C＝O)，137.9，124.8，105.4，87.8，76.9，76.6，73.9，70.1，61.2，54.9，52.4，51.3，47.4，46.9，41.5，38.7，38.4，38.2，36.2，32.5，30.0，27.6，27.4，25.5，23.7，23.3，22.8，20.9，17.7，17.0，16.6，16.5，15.2。

实施例4：3-β-O-(3，6-二-O-β-D-苯甲酰基葡萄糖)熊果酸甲酯

将3-β-O-葡萄糖熊果酸甲酯(1.80g，2.84mmol)和1-(苯甲酰基)苯并三唑(BBTZ，1.71g，7.11mmol)溶于CH₂Cl₂(30mL)中，加入三乙胺(1.06mL，7.68mmol)后室温反应12h。浓缩后经硅胶柱纯化(体积比1∶4∶2的EtOAc-petroleum ether-CHCl₃)得浅黄色固体化合物(1.548g，64.8％)，R_f0.21(体积比1∶4∶2的EtOAc-petroleum ether-CHCl₃)；¹HNMR(CDCl₃)：.8.02-7.49(m，10H，Ar-H)，5.56(d，J＝6.2Hz，1H，4’-OH)，5.40(d，J＝5.9Hz，1H，2’-OH)，5.18(t，J＝3.7Hz，1H，H-12)，5.07(t，J＝9.2Hz，1H，H-3’)，4.53-4.48(m，2H，H-6’×2)，4.39(d，J＝7.7Hz，1H，H-1’)，3.73-3.71(m，1H，H-5’)，3.53-3.39(m，1H，H-4’)，3.39-3.37(m，1H，H-2’)，2.97-2.95(dd，J＝4.0，11.8Hz，1H，H-3)，2.17(d，J＝11.3Hz，1H，H-18)；¹³C NMR：.176.8，165.4，165.3，137.9，133.0，132.9，130.4，129.8，129.3，128.5，124.9，105.0，88.3，78.4，73.1，71.6，69.0，64.1，54.9，52.5，51.3，47.4，46.9，41.5，38.5，38.4，38.2，38.0，36.2，35.9，32.5，30.0，27.4，27.3，25.5，23.7，23.2，22.7，21.0，17.6，16.8，16.5，16.3，15.1.

实施例5：3-β-O-(2，4-二-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基-3，6-二-O-苯甲酰基-β-D-葡萄糖)熊果酸甲酯

将3-β-O-(3，6-二-O-β-D-苯甲酰基葡萄糖)熊果酸甲酯(1.43g，1.7mmol)、4分子筛、干燥的CH₂Cl₂(40mL)混合液冷至-30℃后，加入TMSOTf(59μL，0.34mmol)。5min后，加入2，3，4-三-O-乙酰基-α-L-鼠李糖三氯亚胺酯(3.70g，8.5mmol)的CH₂Cl₂(10mL)溶液。-30℃反应0.5h，0℃反应1h后，用Et₃N终止反应。滤除分子筛，滤液浓缩后经硅胶柱纯化(体积比1∶3→1∶2的EtOAc-petroleum ether)得化合物(2.263g，96.2％)；R_f0.47(体积比1∶1的EtOAc-petroleum ether)；¹HNMR(CDCl₃)：.8.05-7.42(m，5H，Ar-H)，5.52(t，J＝8.4Hz，1H，H-3’)，5.25(t，J＝3.3Hz，1H，H-12)，5.17(dd，J＝3.7，9.9Hz，1H，H-3”)，5.14(dd，J＝3.3，9.9Hz，1H，H-3”)，5.09(dd，J＝1.5，3.3Hz，1H，H-2”)，5.04(dd，J＝1.9，2.9Hz，1H，H-2”)，4.95(d，J＝1.5Hz，1H，Rha-1)，4.92-4.87(m，2H，H-4”×2)，4.81(d，J＝1.8Hz，1H，Rha-1)，4.64(d，J＝7.0Hz，1H，H-1’)，4.53(dd，J＝2.2，12.5Hz，1H，H-6’)，4.26-4.20(m，2H，H-6’，Rha-5)，4.00(t，J＝9.5Hz，1H，H-4’)，3.87(t，J＝8.0Hz，1H，H-2’)，3.74-3.68(m，2H，H-5’，Rha-5)，3.60(s，3H，-CH₃)，3.18(dd，J＝4.0，11.7Hz，1H，H-3)，2.23(d，J＝11.4Hz，1H，H-18)，2.11，2.08，1.97，1.96，1.94，1.84，1.80，(s，3H×7，-OAc×7)，1.09，1.02，0.92，0.81，0.74(s，3H×5)，1.14(d，J＝6.2Hz，3H，Rha-CH₃)，0.95(d，J＝6.2Hz，3H，-CH₃)，0.87(d，J＝6.6Hz，3H，-CH₃)，0.66(d，J＝6.2Hz，3H，Rha-CH₃)；¹³C NMR：.178.1，170.5，170.2，170.0，169.9(2C)，169.5，169.3，165.1，138.1，133.3，130.1，129.3，128.4，125.6，103.4，99.1，97.6，89.9，76.1，75.7，72.4，71.1，70.6，70.2，69.2，68.5，67.5，66.7，62.2，55.9，52.9，51.5，48.1，47.6，42.0，39.5，39.1，39.0，38.9，36.7(2C)，32.9，31.9，30.7，29.7，29.4，28.0，27.9，26.0，24.2，23.6，23.3，22.7，21.2，20.8，20.7，20.5，20.4，18.2，17.2，17.0，16.9，16.8，16.3，15.7.

实施例6：3β-O-(2，4-二-O-α-L-鼠李糖基-β-D-葡萄糖基)熊果酸甲酯

将3-β-O-(2，4-二-O-乙酰基-α-L-鼠李糖基-3，6-二-O-苯甲酰基-β-D-葡萄糖)熊果酸甲酯(2.163g，1.56mmol)溶于CH₃OH-CHCl₃(体积比1∶1，30mL)，加入NaOMe(200mg)。室温搅拌12h后，用阳离子树脂(H⁺)中和反应液，滤除树脂，浓缩后经硅胶柱纯化(体积比8∶1→6∶1的CHCl₃-MeOH)得白色固体(986mg，68.3％)；R_f0.36(体积比3∶1的CHCl₃-MeOH)；¹H NMR(CD₃OD)：.5.35(d，J＝1.4Hz，1H，Rha-H-1)，5.22(t，J＝3.7Hz，1H，H-12)，4.83(d，J＝1.8Hz，1H，Rha-H₁)，4.42(d，J＝8.1Hz，1H，H-1’)，3.99-3.95(m，2H)，3.92-3.87(m，1H)，3.82(dd，J＝1.8，3.3Hz，1H)，3.79(dd，J＝1.8，12.1Hz，1H，)，3.73(dd，J＝3.3，9.5Hz，1H)，3.65(dd，J＝4.0，12.1Hz，1H)，3.61(dd，J＝3.3，9.5Hz，1H)，3.59(s，3H，-CH₃)，3.57(t，J＝8.4Hz，1H)，3.53(t，J＝9.5Hz，1H)，3.43(t，J＝8.4，1H)，3.40(t，J＝9.5，1H)，3.38(t，J＝9.5，1H)，3.16(dd，J＝4.4，11.7，1H，H-3)，2.21(d，J＝11.0Hz，1H，H-18)，1.26(d，J＝6.2Hz，3H)，1.20(d，J＝6.2Hz，3H)，1.10，1.04，0.85，0.76(s×3H)，0.96-0.95(m，6H)，0.87(d，J＝6.6Hz，3H)；¹³C NMR(CD₃OD)：.179.8，139.5，127.1，105.5，103.1，102.0，90.3，80.5，79.2，78.2，76.5，74.0，73.7，72.5，72.2，72.0，70.8，70.0，62.0，57.3，54.4，52.1，43.2，40.8，40.4，40.3，40.2，37.9，37.8，34.2，31.6，29.1，28.5，27.2，25.3，24.4，24.2，21.5，19.3，18.0，17.9，17.7，17.6，17.2，16.2。

药理实验

试验例1.本发明化合物对H5N1高致病流感病毒感染宿主细胞的影响筛选模型的原理：

血凝素是流感病毒表面的糖蛋白，其主要作用是与宿主细胞表面受体结合和融合，在流感病毒对宿主细胞的分子识别和选择性结合起决定作用。基于血凝素特性，我们建立了以HIV为核心的流感病毒的重组病毒系统(HA/HIV)，具体方法如下。将HIV载体质粒(pNL4-3.Luc.R^-.E^-.，从NIH获得)和克隆至哺乳动物细胞表达载体pcDNA-3的HA的质粒共转染至293T细胞(人胚胎肾细胞)后，细胞可产生以HIV为核心并包裹有HA外壳蛋白的病毒颗粒。该病毒颗粒具有以下特点：1)病毒对宿主细胞的选择性取决于血凝素的特性；2)由于HIV载体上env、nef和vpr基因缺失，因此该病毒只能一次性进入宿主细胞并且不能复制，所以该病毒是安全的；3)该HIV载体上带有一个荧光素酶报告基因，因此被感染的细胞会表达荧光素酶，通过检测荧光素酶活性就可标示细胞被病毒感染的程度。

另外，我们采用水泡性口炎病毒外壳蛋白(VSV-G)包装HIV-1核心，构建VSVG/HIV-1重组病毒同时检测化合物，以排除HIV-1核心对实验的影响，即化合物可抑制HA/HIV-1的进入，而不抑制VSVG/HIV-1的进入时，认为化合物是流感病毒侵入宿主细胞的特异性抑制剂。

实验方法：

在本发明中应用了三株流感病毒对实施例进行药理活性评价：

1.H5N1，Goose/Qinghai/59/05，(简称：QH)

2.H5N1，InfluenzaA/Vietnam/1203/04(简称：Viet)

3.H5N2，CK/Michoacan/28159-530/95，(简称：USDA)

感染前一天，按每孔6×10⁴个细胞的密度将A549细胞接种到24孔板上。用DMSO溶解阳性对照化合物或待筛选化合物，感染前15分钟加入细胞培养液中，以DMSO溶剂作空白对照。加入适宜稀释度的病毒液(HA/HIV-1或VSV-G/HIV-1)感染细胞。感染48小时后，被感染的细胞每孔加入50μl细胞裂解液(Promega)裂解细胞，将30μl荧光素酶底物(Promega)与20μl细胞裂解液混合后用FB15荧光检测器(Sirius)仪器测定细胞荧光素酶的相对活性，其活性的强弱反映了病毒的感染的水平。结果显示，化合物可有效抑制H5N1高致病流感病毒和H5N2低致病流感病毒对宿主细胞的侵入，结果见表1。

表1化合物对HA(Viet)/HIV，HA(QH)/HIV and HA(USDA)/HIV感染作用的比较

注：化合物在10μM浓度下对VSV-G/HIV-1的抑制率小于10％。

试验例2.本发明化合物的细胞毒性试验

应用MTT法测定了化合物对A549和293ET细胞的细胞毒性，实施例6制备的化合物在10μM的终浓度下均无细胞毒性。

Claims

1.如通式（I）所示的熊果酸皂苷，

其中，R1、R2独立的选自鼠李糖基；

R3选自C1-C18直链或支链的烷基。

2.一种药物组合物，其特征在于，含有作为有效成分的如权利要求1所述通式（I）所示的熊果酸皂苷和药效学上可接受的载体。

3.根据权利要求2的药物组合物，其特征在于，还含有其它的抗病毒药。

4.权利要求1所述的熊果酸皂苷在制备预防或治疗抗流感病毒的药物中的应用。

5.根据权利要求4的应用，其特征在于，所述的流感病毒为H5N1、H5N2。