CN114018844A - 吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法，涉及芍药苷制备技术领域。该萃取测定方法包括合成六氟磷酸‑N‑戊基吡啶离子液体或N‑戊基吡啶乙酸离子液体，赤芍药预处理以及赤芍药中芍药苷的固‑液萃取分离，最后实现赤芍药中芍药苷的含量测定，这种萃取测定方法能够从源头上克服传统溶剂挥发性强、毒性大等对环境产生的危害，使整个过程变得更加绿色环保，以无污染的方式对药品中的芍药苷含量进行测定比对，以判断目标药品的芍药苷含量是否符合标准。
Description
技术领域
本发明涉及芍药苷制备技术领域，特别是涉及一种吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法。
背景技术
赤芍药为毛茛科植物芍药或川赤芍的干燥根。多年生草本，主要分布于四川、云南、贵州、山西、西藏、甘肃等地。以其干燥根入药，味苦，微寒；归肝、脾经。具有清热凉血、散瘀止痛、敛阴止汗的功效。不同炮制方法药性有所不同。
炒赤芍药性缓和,可用于瘀滞疼痛；酒赤芍药则活血散瘀力强。赤芍药很早已有药用记载.临床用于温毒发斑、吐血租血、目赤肿痛、肝郁胁痛、经闭痛经、癥瘕腹痛、跌仆损伤及痈肿疮疡等。
芍药苷是从中药赤芍，白芍中分离的一种蒎烷单萜苦味甙，芍药苷具有抗自由基损伤，抑制细胞内钙超载和抗神经毒性等活性，实验证明其有降低血液黏度、抗血小板聚集、扩张血管、改善微循环、抗氧化、抗惊厥等多种生物学效应。
离子液体是指在室温或接近室温下呈现液态的、完全由阴阳离子所组成的盐，也称为低温熔融盐。离子液体作为离子化合物，其熔点较低的主要原因是因其结构中某些取代基的不对称性使离子不能规则地堆积成晶体所致。
它一般由有机阳离子和无机或有机阴离子构成，常见的阳离子有季铵盐离子、季鏻盐离子、咪唑盐离子和吡咯盐离子等，阴离子有卤素离子、四氟硼酸根离子、六氟磷酸根离子等。
与一般的有机溶剂相比，离子液体所具有的特性主要是以下5点：
(1)结构可以设计，从而改变其性质，根据试剂需要来调节；
(2)熔点低，在宽温度范围内呈液态，稳定性更好；
(3)蒸气压低，成分稳定，一般无色，没有特殊气味；
(4)有较高的电化学稳定电位窗口；
(5)有很好的溶解能力；
(6)可回收循环使用。
由于离子液体具有上述特性，因此在用于萃取分离金属离子、蛋白氨基酸、生物碱等分离学科时应用较多，使整个萃取过程更加绿色环保，然而离子液体尚并未用于分离萃取测定芍药苷。
发明内容
本发明针对上述技术问题，克服现有技术的缺点，提供一种吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法。
为了解决以上技术问题，本发明提供一种吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法。
技术效果：以吡啶类离子液体固-液萃取分离后测定芍药苷含量，能够从源头上克服传统溶剂挥发性强、毒性大等对环境产生的危害，使整个过程变得更加绿色环保，以无污染的方式对药品中的芍药苷含量进行测定比对，以判断目标药品的芍药苷含量是否符合标准。
本发明进一步限定的技术方案是：一种吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法，包括如下步骤：
S1，备料，取定量赤芍药饮片研磨成粉，过40目筛后得到赤芍药粉末备用；
取定量1-溴代戊烷、吡啶、六氟磷酸钾(KPF6)和乙腈，用于制备六氟磷酸-N-戊基吡啶([C5pyr][PF6])；
或取定量环己烷、吡啶、溴代正戊烷、丙酮、无水乙酸钠和二氯甲烷溶液，用于制备N-戊基吡啶乙酸([C5pyr][Ac])离子液体；
S2，赤芍药粉末处理，取10g上述赤芍药粉末置于250mL圆底烧瓶中，加入80％乙醇并以70℃的加热温度加热溶解1h得到溶解液，静置冷却后用移液管抽取10mL上清液并置于100mL容量瓶中，再以80％乙醇定容稀释，从稀释的提取液中移取3mL溶液并置于离心管内，以12000r/min的条件离心10min，静置后移取1mL上清液，得到赤芍药样品液备用；
S3，测定水相中芍药苷的工作曲线，取20mg芍药苷标准品并置于100mL容量瓶中，并通过80％的乙醇定容，得到浓度为0.2mg/mL芍药苷标准液，通过紫外分光光度法确定芍药苷标准液的最大吸收波长、最佳pH值、最佳缓冲剂用量、并得到工作曲线回归方程Y＝26.74381X-0.02274(相关系数R2＝0.99598)；
S4，赤芍药中芍药苷的固液萃取分离，在固液萃取瓶的内层中加入0.5g[C5pyr][PF6]和1mL赤芍药样品溶液，加入定量蒸馏水保持水相体积为10mL，通过橡皮管将固液萃取瓶的外层与超级恒温水浴槽连通，设定萃取温度为70℃，萃取时间为15min，萃取后断开连接，将萃取瓶静置冷却至室温，待萃取瓶中的物质自动分为固、液两相后，按上述工作曲线测定水相中的芍药苷含量，并以此计算萃取率，确定最佳萃取条件；
S5，芍药苷的反萃取，将萃取后萃取瓶中的水相倾出，与固态有机相分离，在固液萃取瓶内分别加入10mL不同浓度的盐酸、硝酸、硫酸、高氯酸，并连接超级恒温水浴槽，设定温度为70℃搅拌15min，静置冷却待固液萃取瓶内的物质分为固、液两相，移取3mL上层水相，通过紫外分光光度计测定反萃取后水相中的芍药苷含量，计算反萃取率，确定反萃取率最高的强酸种类和浓度；
S6，测定赤芍药中芍药苷的含量，取S2中制备的1mL赤芍药样品液、一定量的[n-C5pyr][PF6]或[C5pyr][Ac]离子液体置于萃取瓶内，加入蒸馏水，保持水相为10mL并进行萃取，萃取后静置并将水相清出，使之与固态的有机相分离；加入最佳浓度的强酸，以70℃在超级恒温槽内恒温萃取15min后静置冷却，待溶液自动分为固、液两相后移取一定体积的水相，并通过紫外分光光度计确定水相中芍药苷的含量。
进一步的，S3中芍药苷标准液的最大吸收波长为231nm、最佳pH为3.50(邻苯二甲酸氢钾—盐酸为缓冲剂)、缓冲剂用量为3mL。
前所述的吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法，S4和S6中芍药苷的最佳固-液萃取条件为：萃取温度70℃、[C5pyr][PF6]或[C5pyr][Ac]离子液体用量为0.5g、水相pH＝7.00、萃取时间15min。
前所述的吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法，S6中强酸为高氯酸，浓度为12mol/L。
前所述的吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法，六氟磷酸-N-戊基吡啶([C5pyr][PF6])的合成步骤为，称量30.8g1-溴代戊烷和17.6g吡啶置于250mL圆底烧瓶中，110℃油浴30h，然后每次用50mL无水乙醇洗涤3次，并旋转蒸发除去杂质；
随后置于真空干燥箱中干燥24h，取出后放置，冷却至室温；
称取28.9g上述步骤所得的产物和24.6gKPF6，加入无水乙醇进行水浴加热并搅拌，反应1h后得到目标离子液体，每次用50mL乙腈对其洗涤三次，随后进行抽滤，并通过旋转蒸发器对滤液进行减压蒸发，除去杂质；
将所得到的产物进行真空干燥24h，取出后静置冷却至室温，静置放置24h后，出现黄棕色针状型结晶，加入蒸馏水洗涤的同时抽滤获得淡黄色固体，真空干燥24h后取出放置，冷却至室温，最后用研钵将所得产物研碎、研细，即得[C5pyr][PF6]。
前所述的吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法，N-戊基吡啶乙酸([C5pyr][Ac])离子液体的合成步骤为，取39.2g吡啶、100mL环己烷和62.3g溴代正戊烷依次加入到250ml圆底烧瓶中，将混合物水浴加热并搅拌24h后得到的液体分为两层，上层为无色透明，下层为白色浑浊状；
将上层环己烷溶液倒出，下层溶液每次用20mL丙酮洗涤3次，静置分层后用分液漏斗将下层溶液放出，静置后，与无水乙酸钠按1:1比例加入到100mL圆底烧瓶中，并加入50mL丙酮，在25℃条件下搅拌24h；
将得到的溶液抽滤除去杂质，并将滤液通过减压蒸发除去丙酮；
向所得产物中加入60mL二氯甲烷溶液，置于冰箱内冷藏24h，温度环境为0℃；将所得产物进行旋转蒸发，随后真空干燥12h，取出后放置，冷却至室温，即得棕黑色油状的[C5pyr][Ac]离子液体。
本发明的有益效果是：
(1)本发明中，通过离子容易萃取测定芍药苷的含量，保证了萃取过程绿色环保，避免产生挥发性和毒性物质，防止污染环境，另外离子液体溶解能力强、稳定性好，能够回收利用，能够较为方便地萃取和测定药材中芍药苷的含量，以测定目标药材是否合格；
(2)本发明中，以吡啶类离子液体固-液萃取分离后测定芍药苷含量，能够从源头上克服传统溶剂挥发性强、毒性大等对环境产生的危害，使整个过程变得更加绿色环保，以无污染的方式对药品中的芍药苷含量进行测定比对，以判断目标药品的芍药苷含量是否符合标准。
附图说明
图1为六氟磷酸-N-戊基吡啶离子液体的反应过程；
图2为N-戊基吡啶乙酸离子液体的反应过程；
图3为两种吡啶类离子液体的质谱性质表征图；
图4为两种吡啶类离子液体的红外性质表征图；
图5为六氟磷酸-N-戊基吡啶离子液体的热分解温度图；
图6为固液萃取瓶的结构图。
其中：1、内层；2、外层；3、超级恒温水浴槽。
具体实施方式
本实施例提供的一种吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法，包括如下步骤：
S1，备料，取定量赤芍药饮片研磨成粉，过40目筛后得到赤芍药粉末备用；
取定量1-溴代戊烷、吡啶、六氟磷酸钾(KPF6)和乙腈，用于制备六氟磷酸-N-戊基吡啶([C5pyr][PF6])；
或取定量环己烷、吡啶、溴代正戊烷、丙酮、无水乙酸钠和二氯甲烷溶液，用于制备N-戊基吡啶乙酸([C5pyr][Ac])离子液体；
其中，六氟磷酸-N-戊基吡啶([C5pyr][PF6])的合成步骤为，称量30.8g1-溴代戊烷和17.6g吡啶置于250mL圆底烧瓶中，110℃油浴30h，然后每次用50mL无水乙醇洗涤3次，并旋转蒸发除去杂质；
随后置于真空干燥箱中干燥24h，取出后放置，冷却至室温；
称取28.9g上述步骤所得的产物和24.6gKPF6，加入无水乙醇进行水浴加热并搅拌，反应1h后得到目标离子液体，每次用50mL乙腈对其洗涤三次，随后进行抽滤，并通过旋转蒸发器对滤液进行减压蒸发，除去杂质；
将所得到的产物进行真空干燥24h，取出后静置冷却至室温，静置放置24h后，出现黄棕色针状型结晶，加入蒸馏水洗涤的同时抽滤获得淡黄色固体，真空干燥24h后取出放置，冷却至室温，最后用研钵将所得产物研碎、研细，即得[C5pyr][PF6]，反应过程如图1所示。
而N-戊基吡啶乙酸([C5pyr][Ac])离子液体的合成步骤为，取39.2g吡啶、100mL环己烷和62.3g溴代正戊烷依次加入到250ml圆底烧瓶中，将混合物水浴加热并搅拌24h后得到的液体分为两层，上层为无色透明，下层为白色浑浊状；
将上层环己烷溶液倒出，下层溶液每次用20mL丙酮洗涤3次，静置分层后用分液漏斗将下层溶液放出，静置后，与无水乙酸钠按1:1比例加入到100mL圆底烧瓶中，并加入50mL丙酮，在25℃条件下搅拌24h；
将得到的溶液抽滤除去杂质，并将滤液通过减压蒸发除去丙酮；
向所得产物中加入60mL二氯甲烷溶液，置于冰箱内冷藏24h，温度环境为0℃；将所得产物进行旋转蒸发，随后真空干燥12h，取出后放置，冷却至室温，即得棕黑色油状的[C5pyr][Ac]离子液体，反应过程如图2所示。
六氟磷酸-N-戊基吡啶([C5pyr][PF6])离子液体和N-戊基吡啶乙酸([C5pyr][Ac])离子液体的质谱性质表征图如图3所示。确认了所合成的离子液体分别为[C5pyr][PF6]离子液体和[C5pyr][Ac]离子液体，其红外性质表征图如图4所示，[C5pyr][PF6]离子液体的热分解温度图如图5所示。
S2，赤芍药粉末处理，取10g上述赤芍药粉末置于250mL圆底烧瓶中，加入80％乙醇并以70℃的加热温度加热溶解1h得到溶解液，静置冷却后用移液管抽取10mL上清液并置于100mL容量瓶中，再以80％乙醇定容稀释，从稀释的提取液中移取3mL溶液并置于离心管内，以12000r/min的条件离心10min，静置后移取1mL上清液，得到赤芍药样品液备用；
S3，测定水相中芍药苷的工作曲线，取20mg芍药苷标准品并置于100mL容量瓶中，并通过80％的乙醇定容，得到浓度为0.2mg/mL芍药苷标准液，通过紫外分光光度法确定芍药苷标准液的最大吸收波长为231nm、最佳pH为3.50(邻苯二甲酸氢钾—盐酸为缓冲剂)、缓冲剂用量为3mL，并得到工作曲线回归方程Y＝26.74381X-0.02274(相关系数R2＝0.99598)；
S4，赤芍药中芍药苷的固液萃取分离，在固液萃取瓶的内层中加入0.5g[C5pyr][PF6]和1mL赤芍药样品溶液，固液萃取瓶的结构如图6所示，加入定量蒸馏水保持水相体积为10mL，通过橡皮管将固液萃取瓶的外层与超级恒温水浴槽连通，设定萃取温度为70℃，萃取时间为15min，萃取后断开连接，将萃取瓶静置冷却至室温，待萃取瓶中的物质自动分为固、液两相后，按上述工作曲线测定水相中的芍药苷含量，并以此计算萃取率，确定最佳萃取条件为萃取温度70℃、[C5pyr][PF6]或[C5pyr][Ac]离子液体用量为0.5g、水相pH＝7.00、萃取时间15min；
S5，芍药苷的反萃取，将萃取后萃取瓶中的水相倾出，与固态有机相分离，在固液萃取瓶内分别加入10mL不同浓度的盐酸、硝酸、硫酸、高氯酸，并连接超级恒温水浴槽，设定温度为70℃搅拌15min，静置冷却待固液萃取瓶内的物质分为固、液两相，移取3mL上层水相，通过紫外分光光度计测定反萃取后水相中的芍药苷含量，计算反萃取率，确定反萃取率最高的强酸种类和浓度；
S6，测定赤芍药中芍药苷的含量，取S2中制备的1mL赤芍药样品液、一定量的[n-C5pyr][PF6]或[C5pyr][Ac]离子液体置于萃取瓶内，加入蒸馏水，保持水相为10mL并进行萃取，萃取后静置并将水相清出，使之与固态的有机相分离；加入浓度为12mol/L的高氯酸，以70℃在超级恒温槽内恒温萃取15min后静置冷却，待溶液自动分为固、液两相后移取一定体积的水相，并通过紫外分光光度计确定水相中芍药苷的含量。
最后得到测定结果为，赤芍药中芍药苷的含量为0.04034mg/mL，平行五次测定的相对标准偏差为2.12％。赤芍药中芍药苷的含量换算为质量分数为3.026％。
根据2015年版的《中国药典》规定，合格赤芍药药材要求是芍药苷含量不得低于1.5％，因此本实施例中使用的赤芍药饮片为合格药材。
而本实施例中采用的芍药苷的萃取测定方法能够较为准确测定芍药苷含量，证明采用吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定具有良好效果。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (6)
1.一种吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，备料，取定量赤芍药饮片研磨成粉，过40目筛后得到赤芍药粉末备用；
取定量1-溴代戊烷、吡啶、六氟磷酸钾(KPF6)和乙腈，用于制备六氟磷酸-N-戊基吡啶([C5pyr][PF6])；
或取定量环己烷、吡啶、溴代正戊烷、丙酮、无水乙酸钠和二氯甲烷溶液，用于制备N-戊基吡啶乙酸([C5pyr][Ac])离子液体；
S2，赤芍药粉末处理，取10g上述赤芍药粉末置于250mL圆底烧瓶中，加入80％乙醇并以70℃的加热温度加热溶解1h得到溶解液，静置冷却后用移液管抽取10mL上清液并置于100mL容量瓶中，再以80％乙醇定容稀释，从稀释的提取液中移取3mL溶液并置于离心管内，以12000r/min的条件离心10min，静置后移取1mL上清液，得到赤芍药样品液备用；
S3，测定水相中芍药苷的工作曲线，取20mg芍药苷标准品并置于100mL容量瓶中，并通过80％的乙醇定容，得到浓度为0.2mg/mL芍药苷标准液，通过紫外分光光度法确定芍药苷标准液的最大吸收波长、最佳pH值、最佳缓冲剂用量、并得到工作曲线回归方程Y＝26.74381X-0.02274(相关系数R2＝0.99598)；
S4，赤芍药中芍药苷的固液萃取分离，在固液萃取瓶的内层中加入0.5g[C5pyr][PF6]和1mL赤芍药样品溶液，加入定量蒸馏水保持水相体积为10mL，通过橡皮管将固液萃取瓶的外层与超级恒温水浴槽连通，设定萃取温度为70℃，萃取时间为15min，萃取后断开连接，将萃取瓶静置冷却至室温，待萃取瓶中的物质自动分为固、液两相后，按上述工作曲线测定水相中的芍药苷含量，并以此计算萃取率，确定最佳萃取条件；
S5，芍药苷的反萃取，将萃取后萃取瓶中的水相倾出，与固态有机相分离，在固液萃取瓶内分别加入10mL不同浓度的盐酸、硝酸、硫酸、高氯酸，并连接超级恒温水浴槽，设定温度为70℃搅拌15min，静置冷却待固液萃取瓶内的物质分为固、液两相，移取3mL上层水相，通过紫外分光光度计测定反萃取后水相中的芍药苷含量，计算反萃取率，确定反萃取率最高的强酸种类和浓度；
S6，测定赤芍药中芍药苷的含量，取S2中制备的1mL赤芍药样品液、一定量的[n-C5pyr][PF6]或[C5pyr][Ac]离子液体置于萃取瓶内，加入蒸馏水，保持水相为10mL并进行萃取，萃取后静置并将水相清出，使之与固态的有机相分离；加入最佳浓度的强酸，以70℃在超级恒温槽内恒温萃取15min后静置冷却，待溶液自动分为固、液两相后移取一定体积的水相，并通过紫外分光光度计确定水相中芍药苷的含量。
2.根据权利要求1所述的吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法，其特征在于：S3中所述芍药苷标准液的最大吸收波长为231nm、最佳pH为3.50(邻苯二甲酸氢钾—盐酸为缓冲剂)、缓冲剂用量为3mL。
3.根据权利要求1所述的吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法，其特征在于：S4和S6中所述芍药苷的最佳固-液萃取条件为：萃取温度70℃、[C5pyr][PF6]或[C5pyr][Ac]离子液体用量为0.5g、水相pH＝7.00、萃取时间15min。
4.根据权利要求3所述的吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法，其特征在于：S6中所述强酸为高氯酸，浓度为12mol/L。
5.根据权利要求1所述的吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法，其特征在于：所述六氟磷酸-N-戊基吡啶([C5pyr][PF6])的合成步骤为，称量30.8g1-溴代戊烷和17.6g吡啶置于250mL圆底烧瓶中，110℃油浴30h，然后每次用50mL无水乙醇洗涤3次，并旋转蒸发除去杂质；
随后置于真空干燥箱中干燥24h，取出后放置，冷却至室温；
称取28.9g上述步骤所得的产物和24.6gKPF6，加入无水乙醇进行水浴加热并搅拌，反应1h后得到目标离子液体，每次用50mL乙腈对其洗涤三次，随后进行抽滤，并通过旋转蒸发器对滤液进行减压蒸发，除去杂质；
将所得到的产物进行真空干燥24h，取出后静置冷却至室温，静置放置24h后，出现黄棕色针状型结晶，加入蒸馏水洗涤的同时抽滤获得淡黄色固体，真空干燥24h后取出放置，冷却至室温，最后用研钵将所得产物研碎、研细，即得[C5pyr][PF6]。
6.根据权利要求1所述的吡啶类离子液体对赤芍药中芍药苷的萃取测定方法，其特征在于：所述N-戊基吡啶乙酸([C5pyr][Ac])离子液体的合成步骤为，取39.2g吡啶、100mL环己烷和62.3g溴代正戊烷依次加入到250ml圆底烧瓶中，将混合物水浴加热并搅拌24h后得到的液体分为两层，上层为无色透明，下层为白色浑浊状；
将上层环己烷溶液倒出，下层溶液每次用20mL丙酮洗涤3次，静置分层后用分液漏斗将下层溶液放出，静置后，与无水乙酸钠按1:1比例加入到100mL圆底烧瓶中，并加入50mL丙酮，在25℃条件下搅拌24h；
将得到的溶液抽滤除去杂质，并将滤液通过减压蒸发除去丙酮；
向所得产物中加入60mL二氯甲烷溶液，置于冰箱内冷藏24h，温度环境为0℃；将所得产物进行旋转蒸发，随后真空干燥12h，取出后放置，冷却至室温，即得棕黑色油状的[C5pyr][Ac]离子液体。
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