KR20070116608A

KR20070116608A - 바이오센서

Info

Publication number: KR20070116608A
Application number: KR1020077021705A
Authority: KR
Inventors: 히로노부 무라세; 모토아키 구와하라; 마사유키 야마다
Original assignee: 씨씨아이 가부시키가이샤; 유겐가이샤 얼티자임 인터내셔널
Priority date: 2005-03-29
Filing date: 2006-03-27
Publication date: 2007-12-10
Also published as: CA2603123C; DE602006010048D1; JP4700687B2; EP1873516A1; US20090236222A1; ES2331533T3; KR101226264B1; EP1873516A4; CA2603123A1; CN101151526A; CN101151526B; JPWO2006104077A1; EP1873516B1; WO2006104077A1; US9957542B2; US20170101661A1

Abstract

본 발명은 시료의 전처리를 수행하지 않고, 생체시료 등의 시료로부터 신속하고 정밀하게 중성 지방의 농도를 측정할 수 있는 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다. 해당 목적은 절연성 기판과, 상기 절연성 기판 상에 형성된 작용전극 및 상대전극을 포함하는 전극계와, 상기 전극계의 상부 또는 근처에 형성된 리포프로틴 리파아제, 글리세롤 데히드로게나아제 및 전자 수용체를 포함하는 반응층을 구비하는 상기 전극계에 흐르는 전류값에 기초하여 중성 지방의 농도를 측정하기 위한 바이오센서에 의해 달성된다.

Description

바이오센서{Biosensor}

본 발명은 생체시료 등에 포함되는 중성 지방을 신속하고 정밀하게 정량할 수 있는 바이오센서에 관한 것이다.

일반적으로 중성 지방의 측정 방법으로, (1) 크로모트로프산을 이용하는 방법, (2) 아세틸아세톤법, (3) 효소법, (4) 네펠로측정기(Nephelometer)를 이용하는 방법 등이 있는데, 이러한 방법은 모두 복잡한 분석 조작과 긴 분석 시간을 필요로 한다. 그 때문에, 시료에 포함되는 특정 성분을 측정할 때, 시료액의 희석이나 교반 등을 하지 않고 간단하고 신속하게 목적물을 정량하는 것으로 바이오센서가 개발되어 있다.

이와 같은 중성 지방 측정용 바이오센서로 pH 감응성 이온선택적 전계효과 트랜지스터의 게이트 절연막 상에 피복된 다공질 고분자막 또는 친수성 균질고분자막에 글리세롤 에스테르 가수분해효소를 고정화한 것을 특징으로 하는 트리글리세라이드 센서가 있다(일본특허공개 소화 59-210356호 공보).

또, 지단백 리파아제와 글리세롤 옥시다아제를 이용한 중성 지방 센서도 알려져 있다(일본특허공개 소화 59-228158호 공보). 해당 센서는 제1 전극과 제2 전극을 가지고, 한쪽 전극 근처에 고정화 효소를 배치하고, 막전극 사이에 흐르는 전 류에 기초하여 피측정 용액 중에 포함되는 중성 지방을 측정하도록 한 센서로, 고정화 효소로서 리포프로틴 리파아제와 글리세롤 옥시다아제를 이용하는 것이다. 그렇지만, 해당 장치는 유리(glass)제 내관과 유리제 외관으로 이루어지며, 상기 내관의 저부에 제 1 전극이 마련되고, 상기 내관과 상기 외관 사이에 내부액을 넣고, 이 내부액에 제 2 전극이 배치되는 것이며, 이 전극을 30℃로 유지된 수조에 넣고, 측정시료를 이 수조에 주입하는 것으로 장치가 복잡하다.

더욱 간편한 장치로, 절연성 기판상에 적어도 측정전극과 상대전극을 가진 전극계를 형성하고, 효소, 전자 수용체 및 시료액의 반응시 물질 농도의 변화를 전기화학적으로 전극계로 검지하고, 시료액의 기질 농도를 측정하는 센서가 제안되고 있다(일본특허공개 2001-343349호 공보). 해당 센서는 측정전극 상에 리포프로틴 리파아제, 글리세롤키나아제, 글리세로린산 옥시다아제 및 계면활성제를 유지시키고, 또한 시료액이 통과할 수 있는 유지체를 베치시켜 제1 층을 형성시키고, 상대전극 상에 계면활성제를 유지시키고, 시료액이 통과할 수 있는 유지체를 배치시켜 제2 층을 형성시킨 중성 지방 측정용 센서이다.

그렇지만, 상기 일본특허공개 소화 59-210356호 공보에 기재된 트리글리세라이드 센서에서는 글리세롤 에스테르 가수분해 효소에 의해 유리된 지방산을 pH 감응성 이온선택적 전계효과 트랜지스터를 이용하여 측정하는 것으로, 응답값이 시료 농도의 대수(log)에 비례하기 때문에 측정 정밀도가 충분하지 않다. 또한, 장치가 복잡해지는 문제점도 있다.

또, 상기 일본특허공개 소화 59-228158호 공보에 기재된 중성 지방 센서에서 는 정확하게 측정하기 위해 온도를 일정하게 하는 가온 장치가 필요하며, 측정시료도 센서 밖에서 공급할 필요가 있기 때문에, 시료량도 많이 필요해지며, 소량의 시료로부터 측정하는 것은 곤란하다.

더불어, 일본특허공개 2001-343349호 공보에 기재된 센서에서는 효소와 전자 수용체가 서로 다른 층을 구성하기 때문에, 장치가 매우 복잡하고, 리포프로틴 리파아제와 더불어, 글리세롤키나제, 글리세로린산 옥시다아제라고 하는 값비싼 효소를 2종이나 사용할 필요가 있다.

최근 생활 습관병인 고지혈증 환자의 수가 증가하고 있으며, 혈액 등의 시료중의 중성 지방의 농도를 신속하고 정밀하게 측정할 수 있는 센서의 개발이 강하게 요구되고 있다.

발명의 개시

따라서, 본 발명은 시료의 전처리를 하지 않고 생체시료 등의 시료로부터 신속하고 정밀하게 중성 지방의 농도를 측정할 수 있는 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 절연성 기판과, 상기 절연성 기판상에 형성된 작용전극(working electrode) 및 상대전극(counter electrode)을 포함하는 전극계와, 상기 전극계의 상부 또는 근처에 형성된 반응층을 구비한 상기 전극계에 흐르는 전류값에 기초하여 중성 지방의 농도를 측정하기 위한 바이오센서에 있어서, 상기 반응층에 리포프로틴 리파아제, 글리세롤 데히드로게나아제(glycerol dehydrogenase) 및 전자 수용체를 포함함으로써 시료 중의 글리세롤 농도가 신속하고 정밀하게 측정될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 일 형태는 절연성 기판과, 상기 절연성 기판상에 형성된 작용전극 및 상대전극을 포함하는 전극계와, 상기 전극계의 상부 또는 근처에 형성된 리포프로틴 리파아제, 글리세롤 데히드로게나아제 및 전자 수용체를 포함하는 반응층을 구비하는 상기 전극계에 흐르는 전류값에 기초하여 중성 지방의 농도를 측정하기 위한 바이오센서에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적, 특징 및 특질은 이후의 설명 및 첨부 도면에 예시되는 바람직한 실시형태를 참조함으로써 명확해질 것이다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

이하, 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 일 실시형태에 대해 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 하기의 형태에만 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 형태는 절연성 기판과, 상기 절연성 기판상에 형성된 작용전극 및 상대전극을 포함하는 전극계와, 상기 전극계의 상부 또는 근처에 형성된 리포프로틴 리파아제, 글리세롤 데히드로게나아제 및 전자 수용체를 포함하는 반응층을 구비하는 상기 전극계에 흐르는 전류값에 기초하여 중성 지방의 농도를 측정하기 위한 바이오센서에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 바이오센서(10)의 각 구성 요소의 형성 패턴을 나타내는 평면도이다. 또한, 도 1의 각 도면에 있어서는, 각 도면에 의해 설명하기 위한 구성 요소와 더불어 절연성 기판(20)의 외형을 나타내는 가상선이 도시되어 있다. 도 1(a)는 절연성 기판(20)상에서의 리드부(30) 및 커넥터부(32)의 형성 패턴을 나타내는 평면도이다. 도 1(b)는 전극계(40)를 구성하는 참조전극(42)의 형성 패턴을 나타내는 평면도이다. 도 1(c)는 전극계(40)를 구성하는 작용전극(44) 및 상대전극(46)의 형성 패턴을 나타내는 평면도이다. 도 1(d)는 절연층(50)의 형성 패턴을 나타내는 평면도이다. 도 1(e)는 스페이서(60) 및 반응층(70)의 형성 패턴을 나타내는 평면도이다. 게다가, 도 1의 각 도면에 있어서는, 각 도면에 의해 설명하기 위한 구성 요소와, 절연성 기판(20)이 도시되어 있다. 도 2는 도 1의 각 도면에 나타내는 각 구성 요소가 형성되어 이루어진 바이오센서(10)를 나타내는 평면도이다. 도 2에 나타내는 바이오센서(10)에 있어서는 절연성 기판(20)상에 일체화된 리드부(30) 및 커넥터부(32), 전극계(40), 절연층(50), 스페이서(60) 및 반응층(70)이 절연층 기판(20) 측에서부터 이 순서대로 적층되어 있다. 또한, 바이오센서(10)는 커버에 의해 더 덮힌 상태에서 사용 및 저장되는 경우가 있는데, 도 1 및 도 2에서는 이와 같은 커버의 도시는 생략되어 있다. 또한, 설명의 편의상 도면의 치수 비율은 과장되어 있으며, 도시하는 형태가 실제와는 다른 경우가 있다.

바이오센서(10)는 체액 등의 시료 속의 중성 지방의 농도를 측정하기 위한 장치이다. 이하, 바이오센서(10)를 구성하는 각 부재에 대해 상세히 설명한다.

바이오센서(10)는 그 기체(基體)로서 절연성 기판(20)을 구비한다. 절연성 기판(20)은 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)나 폴리에틸렌 등의 수지, 유리, 세라믹, 종이 등의 종래 공지된 절연성 재료에 의해 구성될 수 있다. 절연성 기판(20)의 형상이나 사이즈에 관해서는 특별히 제한되지 않는다.

절연성 기판(20)상에는 도 1 및 도 2에 나타내는 바와 같이, 리드부(30a, 30b, 30c) 및 커넥터부(32a, 32b, 32c)가 형성되어 있다. 커넥터부(32a, 32b, 32c)는 후술하는 전극계(40)와 바이오센서(10)의 외부를 전기적으로 접속하기 위한 수단으로서 기능하며, 리드부(30a, 30b, 30c)를 통해 전극계(40)와 전기적으로 접속되어 있다. 리드부(30a, 30b, 30c)는 도 2에 나타내는 바와 같이, 커넥터부(32a, 32b, 32c)로부터 전극계(40)의 위치까지 연장되어 있으며, 전극계(40)의 각 전극(42, 44, 46)의 기저층을 구성한다. 리드부(30a, 30b, 30c) 및 커넥터부(32a, 32b, 32c)를 구성하는 재료는 특별히 제한되지 않고, 바이오센서의 리드부 및 커넥터부의 형성에 종래 이용되고 있는 재료가 적절히 사용될 수 있다. 단, 바이오센서(10)의 응답감도를 더욱 향상시킨다는 관점에서 리드부(30a, 30b, 30c) 및 커넥터부(32a, 32b, 32c)는 표면 저항값이 보다 작은 재료로 구성되는 것이 바람직하다.구체적으로는 10μm의 두께에 있어서, 50mΩ/□이하, 더욱 바람직하게는 40mΩ/□이하의 표면 저항값을 가진 재료로 구성되는 것이 바람직하다. 표면 저항값이 상기한 범위보다도 큰 재료를 이용하여 리드부 및 커넥터부를 구성하면, 기질 농도와 응답값 사이의 선형성이 저하되고, 본 발명에 의한 측정 감도의 향상 효과를 충분히 얻지 못할 우려가 있다. 한편, 해당 재료의 표면 저항값의 하한에 관해서는 특별히 제한은 없지만, 리드부(30) 및 커넥터부(32)와 기판과의 접착성을 확보하기 위해 바인더를 첨가하는 것을 고려하면, 리드부(30) 및 커넥터부(32)의 표면 저항값은 10μm의 두께에 있어서 약 0.1mΩ/□ 이상이 되는 것으로 예상된다. 단, 리드부(30) 및 커넥터부(32)가 이러한 범위를 벗어나는 표면 저항값을 가진 재료로 구성될 수도 있다. 상술한 바람직한 표면 저항값을 가진 재료로는, 예를 들어, 은, 금, 백금, 및 팔라듐 등의 금속을 주성분으로 하는 것을 들 수 있다. 각 리드부(30a, 30b, 30c) 및 각 커넥터부(32a, 32b, 32c)를 구성하는 재료는 각각 동일할 수도 있고, 다를 수도 있다. 단, 저비용이라는 관점에서, 리드부 및 커넥터부는 모두 은으로 구성되는 것이 바람직하다. 리드부 및 커넥터부의 형성 방법은 특별히 제한되지 않고, 스크린 인쇄법이나 스퍼터링법 등의 종래 공지된 방법에 의해 형성될 수 있다. 이 때, 리드부 및 커넥터부를 구성하는 재료는 폴리에스테르 등의 수지 바인더를 포함하는 페이스트 형태로 제공될 수 있다. 상기한 방법에 의해 도막을 형성한 후에는 도막을 경화시킬 목적으로 50∼200℃ 정도의 온도에서 가열처리하면 된다.

도 1 및 도 2에 나타내는 바와 같이, 리드부(30a, 30b, 30c)가 연장되어 이루어진 기저층의 상층에는 전극계(40)가 형성되어 있다. 이 전극계(40)는 바이오센서(10)의 사용시에 후술하는 반응층(70) 속의 시료에 전압을 인가하기 위한 전압인가수단 및 시료 속에 흐르는 전류를 검출하기 위한 전류 검출 수단으로 기능한다.

도시하는 형태에 있어서, 전극계(40)는 참조전극(42), 작용전극(44), 및 상대전극(46)의 3극으로 이루어진다. 즉, 도시하는 형태의 바이오센서(10)는 3 전극식 센서이다. 단, 본 발명의 바이오센서는 3 전극식에 제한되지 않고, 참조전극을 포함하지 않는 전극계를 구비한 2전극식 센서일 수도 있다. 또한, 전극계(40)에서의 전압의 제어가 더 고감도로 이루어진다는 관점에서는 2전극식보다 3전극식이 더 바람직하게 이용될 수 있다.

작용전극(44) 및 상대전극(46)은 바이오센서(10)의 사용시에 한 쌍이 되고, 후술하는 반응층(70) 중의 시료에 전압을 인가했을 경우 흐르는 산화 전류(응답 전류)를 측정하기 위한 전류 측정 수단으로 기능한다. 바이오센서(10)의 사용시에는 참조전극(42)과 작용전극(46) 사이에 소정의 전압이 인가된다. 각 전극을 구성하는 재료는 특별히 제한되지 않고, 바이오센서의 전극계의 형성에 지금까지 이용되고 있는 재료가 적절히 사용될 수 있다. 단, 바이오센서(10)의 응답감도를 더욱 향상시킨다는 관점에서, 전극계(40)는 10μm의 두께에 있어서 100Ω/□이하, 더욱 바람직하게는 80Ω/□이하의 표면 저항값을 가진 재료로 구성되는 것이 바람직하다. 표면 저항값이 상기한 범위보다도 큰 재료를 이용하여 전극계(40)을 구성하면, 기질 농도와 응답값 사이의 선형성이 저하되고, 본 발명에 의한 측정 감도의 향상 효과를 충분하게 얻지 못할 우려가 있다. 한편, 해당 재료의 표면 저항값의 하한에 관해서는 특별히 제한은 없다. 각 전극(42, 44, 46)을 구성하는 재료는 각각 동일할 수도 있고, 서로 다를 수도 있다. 단, 내부식성 및 비용의 관점에서 각 전극(42, 44, 46)은 모두 카본을 주성분으로 구성되는 것이 바람직하다. 단, 경우에 따라서는 복수의 금속 등의 카본 이외의 재료로 전극계(40)가 구성될 수도 있다. 전극계의 형성 방법은 특별히 제한되지 않으며, 스크린 인쇄법이나 스퍼터링법 등의 종래 주지의 방법에 의해 형성될 수 있다. 이 때 전극계를 구성하는 재료는 폴리에스테르 등의 수지 바인더를 포함하는 페이스트 형태로 제공될 수 있다. 상기한 방법에 의해 도막을 형성한 후에는 도막을 경화시킬 목적으로 가열처리를 하면 된다.

본 형태의 바이오센서(10)에 있어서, 전극계(40)를 구성하는 각 전극(42, 44, 46)은 도 3에 나타내는 바와 같이, 전극계(40)의 상층에 형성된 절연층(50)이 갖는 거의 직사각형의 개구부로부터 노출되어 있다. 여기서, 상기 개구부로부터의 작용전극(44) 및 상대전극(46)의 노출 면적의 비는 소정의 범위 내에 제어되는 것이 바람직하다. 구체적으로는 상대전극(46)의 상기 개구부로부터의 노출 면적은 작용전극(44)의 상기 개구부로부터의 노출 면적의 1.2∼3.0배이다. 상대전극(46)의 노출 면적이 작용전극(44)의 노출 면적의 1.2배 미만이면, 산화 전류값의 측정에 있어서 상대전극(46)에서의 산화환원반응의 포화가 충분히 억제되지 않고, 바이오센서(10)의 측정 감도를 향상시킨다는 본 발명의 효과를 충분히 얻지 못할 우려가 있다. 한편, 상대전극(46)의 노출 면적이 작용전극(44)의 노출 면적의 3.0배를 넘으면, 바이오센서(10)의 소형화가 어려워질 우려가 있다.

절연성 기판(20)상에 형성된 리드부(30a, 30b, 30c) 및 커넥터부(32a, 32b, 32c), 그리고 전극계(40)의 상층에는 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 전극계(40)가 노출되도록 절연층(50)이 형성되어 있다. 절연층(50)은 전극계(40)를 구성하는 각 전극간의 합선을 방지하기 위한 절연 수단으로 기능한다. 절연층(50)을 구성하는 재료는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 레지스트 잉크, PET나 폴리에틸렌 등의 수지, 유리, 세라믹, 종이 등에 의해 구성될 수 있다. 절연층(50)의 형성 방법에 대해서도 특별히 제한은 없고, 스크린 인쇄법이나 접착법 등의 종래 공지된 방법에 의해 형성될 수 있다.

전극계(40) 및 절연층(50)의 상층에는 도 1 및 도 2에 나타내는 바와 같이,스페이서(60) 및 반응층(70)이 형성되어 있다. 바이오센서(10)의 사용시에는 반응층(70)에 있어서, 후술하는 효소 반응이 진행된다. 또, 스페이서(60)를 마련함으로써 바이오센서(10)의 사용시 반응층(70) 및 시료용액의 누출이 방지된다. 도시하는 형태에 있어서, 스페이서(60)는 전극계(40)에 대응하는 부위에 직사각형의 개구부를 갖고 있고, 이 개구부에 반응층(70)이 마련되어 있다. 단, 스페이서(60)가 갖는 개구부의 형상은 직사각형에 제한되지 않고 임의의 형상이 사용될 수 있다. 스페이서(60)를 구성하는 재료는 특별히 제한되지 않는데, 예를 들어, PET나 폴리에틸렌 등의 수지, 유리, 세라믹, 종이 등으로 구성될 수 있다. 스페이서(60) 및 반응층(70)의 형성 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 소정 부위에 개구부를 가진 스페이서(60)을 배치시키고, 이 개구부에 반응층(70)을 형성하기 위한 용액을 적하하고 건조시키는 방법이 이용될 수 있다.

본 형태의 바이오센서에 있어서, 반응층(70)은 리포프로틴 리파아제, 글리세롤 데히드로게나아제 및 전자 수용체를 포함한다.

종래 절연성 기판상에 작용전극과 상대전극을 가진 전극계가 형성되고, 상기 전극계상 또는 전극계의 근처에 반응층이 형성되는 바이오센서가 있고, 반응층에 리포프로틴 리파아제와 다른 효소를 조합하는 센서도 존재했다. 그렇지만, 본 발명에서는 리포프로틴 리파아제와 함께 글리세롤 데히드로게나아제를 배합함으로써 간단하면서도 저렴하게 중성 지방을 측정할 수 있다. 게다가, 반응층은 전자 수용체를 더 포함하기 때문에, 효소를 포함하는 반응층과 전자 수용체를 포함하는 층을 별개로 설치할 필요가 없어 구조를 간단하게 할 수 있다. 본 형태의 바이오센서에 리포 단백질을 포함하는 시료를 첨가하면, 반응층에 포함되는 리포프로틴 리파아제가 리포단백질 중의 중성 지방을 분해함으로써 글리세롤 및 지방산이 유리된다. 그리고,반응층에 글리세롤 데히드로게나아제 및 전자 수용체가 존재하면, 글리세롤이 산화되는 동시에 전자 수용체가 환원된다. 그 때문에, 얻어지는 전자 수용체의 산화 전류값으로부터 기질의 농도를 정확하게 정량할 수 있다. 이하, 본 발명의 특징적인 구성에 대해 상세히 설명한다.

본 형태의 바이오센서에 있어서 사용되는 리포프로틴 리파아제로는 리포단백질을 분해하여 글리세롤을 유리할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없으며, 종래 공지된 리포프로틴 리파아제라도 더욱 이것을 개질하여 안정성이나 반응성을 향상시킨 것 등 모두 유효하게 사용될 수 있다. 반응층에서의 이와 같은 리포프로틴 리파아제의 함유량도 이용되는 생체시료의 종류나 그 첨가량 등에 의해 적절히 선택할 수 있다. 일반적으로는 반응층에 포함되는 리포프로틴 리파아제량은 0.001∼1000 활성 단위, 더욱 바람직하게는 0.1∼500 활성 단위, 특히 바람직하게는 0.1∼300 활성 단위이다. 또한, 리포프로틴 리파아제의 활성 단위의 정의 및 측정 방법은 이하와 같다.

[리포프로틴 리파아제 활성의 측정 방법]

20mM 인산 완충액(pH7) 1mL에 대두유 에멀젼 2mL를 첨가하고 충분히 교반한 후, 리포프로틴 리파아제 함유 용액을 1mL 첨가하고 37℃에서 20분간 진탕시킨다. 진탕 후 반응 정지액을 10mL 첨가하고, 다시 n-헵탄 6mL 및 이온 교환물 4mL를 첨가하여 충분히 교반한다. 또한, 「대두유 에멀젼」이란, 20mM 인산 완충액(pH7)으로 제조한 10%의 소(牛) 혈청알부민 용액 16mL에 대두유 24mL를 첨가하고 충분히 교반한 것이다. 또, 「반응 정지액」이란, n-헵탄/2-프로판올/2N 황산(10/40/1, w/w/w) 혼합액이다.

이어, 상층(n-헵탄층)을 6mL로 하고, 이에 크레졸 레드 지시약을 2방울 적하하고, 에탄올로 제조한 0.01M 수산화 칼륨 용액으로 적정(滴定)을 수행하고, 액이 보라색으로 변화한 시점을 적정의 종말점으로 하여 유리된 지방산량을 구한다. 블랭크(blank)로는, 리포프로틴 리파아제 함유 용액 대신에 20mM 인산 완충액 1mL를 이용하여 똑같은 조작을 하고, 유리된 지방산량을 구한다.

상기 조건에 있어서, 1분 동안에 1μmol의 지방산을 유리시키는 리포프로틴 리파아제량을 1 활성단위로 정의한다.

또한, 글리세롤 데히드로게나아제라고 해도, 마찬가지로 글리세롤을 산화하여 전자 수용체를 환원할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없으며, 종래 공지된 글리세롤 데히드로게나아제라도 이것을 더욱 개질하여 안정성이나 반응성을 향상시킨 것 등 모두 유효하게 사용할 수 있다. 특히, 글리세롤 데히드로게나아제가 조효소 의존형인 것이 바람직하다.

이와 같은 조효소로는, 피롤로퀴놀린퀴논(PQQ), CoQ 등의 퀴논 조효소, 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD), FMN, NAD, NADP, 비오틴 등의 비타민 조효소 등을 유효하게 사용할 수 있다. 이들 중에서도 조효소는 PQQ 또는 FAD인 것이 바람직하고, PQQ인 것이 더욱 바람직하다. 여기서, 예를 들어, 글리세롤 옥시다아제를 효소로서 반응층에 포함시키면, 용액 중의 용존 산소를 사용하여 반응이 진행하기 때문에, 정확한 중성 지방을 측정하기 어렵다. 이에 반해, 상술한 형태의 바이오센서에 의하면, 조효소 의존형 글리세롤 데히드로게나아제는 용액 중의 전자 수용체만을 반응에 사용하기 때문에, 용존 산소의 영향을 받지 않는다. 따라서, 환원된 전자 수용체를 산화하여 얻어지는 산화 전류를 측정하면, 글리세롤의 농도를 정확하게 측정할 수 있다. 반응층에서의 글리세롤 데히드로게나아제의 함량도 이용되는 생체시료의 종류나 그 첨가량 등에 의해 적절히 선택할 수 있다. 일반적으로는, 반응층에 포함되는 글리세롤 데히드로게나아제량은 0.01∼200 활성단위, 더욱 바람직하게는 0.05∼100 활성단위, 특히 바람직하게는 0.1∼80 활성단위이다. 또한, 글리세롤 데히드로게나아제의 활성 단위의 정의 및 측정 방법에 관해서는 후술하는 실시예의 기재가 참조될 수 있다.

본 형태에 있어서 사용되는 글리세롤 데히드로게나아제는 시판 상품을 구입하여 이용할 수도 있고, 스스로 제조한 것을 이용할 수도 있다. 해당 효소를 스스로 제조하는 방법으로는, 예를 들어, 해당 효소를 생산하는 세균을 이용하는 방법이 있다. 해당 효소를 생산하는 세균으로는, 예를 들어, 글루코노박터속, 슈도모나스(Pseudomonas)속 등 다양한 속에 속하는 세균을 들 수 있다. 본 실시형태에서는 특히 글루코노박터속에 속하는 세균의 막분획에 존재하는 PQQ 의존성 글리세롤 데히드로게나아제가 바람직하게 이용될 수 있다. 나아가, 입수의 용이성 때문에, 글루코노박터속, 특히 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans) NBRC 3171, 3253, 3258, 3285, 3289, 3290, 3291, 글루코노박터 프라테우리(Gluconobacter frateurii) NBRC 3251, 3260, 3264, 3265, 3268, 3286, 글루코노박터 세리너스(Gluconobacter Cerinus) NBRC 3262 등이 이용될 수 있다. 이와 같은 미생물의 대표균주로는 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans) NBRC 3291을 들 수 있다.

이들 세균으로부터 PQQ 의존성 글리세롤 데히드로게나아제를 얻는 방법에 관해서는 특별히 제한되는 것은 아니며, 종래 공지된 방법을 적절히 참조할 수 있다.

본 형태의 바이오센서에 있어서, 글리세롤 데히드로게나아제가 PQQ 의존성인 경우, 해당 글리세롤 데히드로게나아제는 계면활성제의 존재 하에 2 가성 가교시약으로 화학적으로 변형되어 얻어지는 변형 글리세롤 데히드로게나아제인 것이 바람직하다. 이와 같은 변형 글리세롤 데히드로게나아제에 있어서는, 소수성 효소가 응집하지 않고 가교 구조가 도입되어 구조가 단단해지며, 열안정성이 향상될 수 있다. 따라서, 상술한 실시 형태의 바이오센서에 의하면, 시료 중의 중성 지방 농도를 더욱 정밀하게 측정하는 것이 가능해진다.

2가성 가교시약은 PQQ 의존성 글리세롤 데히드로게나아제에 포함되는 아미노기 등과 반응하여 가교 구조를 도입할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없고, 고정화 효소의 분야에서 효소의 가교제로서 사용할 수 있는 디알데히드 화합물, 디카본산 화합물, 디이소시아네이트계 화합물, 이미데이트 화합물 등을 유효하게 사용할 수 있다. 디알데히드 화합물로는 글루탈 알데히드, 숙신 디알데히드, 아디핀 알데히드 등이 있고, 디카본산 화합물로는 아디핀산, 디메틸 아디핀산 등이 있으며, 디이소시아네이트계 화합물로는 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 톨루엔 디이소시아네이트 등이 있고, 이미데이트 화합물로는 디메틸수베르 이미데이트, 디메틸피멜 이미데이트 등이 있다. 본 발명에서는 상기 2가성 가교시약 중에서도 글루탈 알데히드가 특히 바람직하다.

한편, 계면활성제로는 일반적으로 막단백질의 가용화에 이용되는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 종래 공지된 식견이 적절히 참조할 수 있다. 예를 들어, 트리톤 X-100, 옥틸글루코시드, 콜산나트륨 등을 들 수 있다.

가교 반응시 반응 온도는 이용하는 2가성 가교시약에 의해 적절히 선택할 수 있는데, 일반적으로는 0∼40℃ 정도에서 수행하는 것이 바람직하고, 반응 시간은 1 분∼4시간, 바람직하게는 5분∼2시간 정도, 특히 바람직하게는 5분∼1시간이다. 1분이 안되면 가교가 충분하지 않아 미가교 효소량이 많아지고, 반면, 4시간을 넘으면 가교율이 너무 올라 효소의 활성이 소실되는 경우가 있다.

가교 반응은,글리신 용액 또는 트리스염산 완충액과 같은 정지제를 가하여 반응시킴으로써 정지시킬 수 있다. 상기 가교 처리 후, 미반응 글리신, 2가성 가교 시약, 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올, 및 정지제와 2가성 가교시약과의 반응물은 투석법, 크로마토그래피법, 한외 여과법 등을 수행함으로써 제거할 수 있다. 본 발명에서는 특히 투석법을 수행하는 것이 바람직하다. 그 이유는 조작이 간편하고 비용이 들지 않기 때문이다.

전자 수용체는 바이오센서(10)의 사용시 산화환원효소의 작용으로 생성된 전자를 받는다, 즉 환원된다. 그리고, 환원된 전자 수용체는 효소 반응 종료 후에 전극계(40)로 흘려지는 전류에 의해 전기화학적으로 산화된다. 이 때 흐르는 전류(산화 전류라고 함)의 크기로부터 시료용액 중의 원하는 성분의 농도가 산출될 수 있다.

본 형태의 바이오센서에서 사용되는 전자 수용체에 관해서도 특별히 제한은 없으며, 글리세롤 데히드로게나아제에 의한 글리세롤의 산화에 따라 환원되고, 전극계로의 전압의 인가에 의해 산화되는 것이면 된다. 구체적으로는, 예를 들어, 페리시안이온, p-벤조퀴논, p-벤조퀴논 유도체, 페나딘메타설페이트, 페나딘메타설페이트 유도체, 메틸렌블루, 티오닌, 인디고카민, 갈로시아닌, 사프라닌, 페로센 및 그 유도체, α-나프토퀴논 및 α-나프토퀴논 유도체 등이 예시된다. 여기서, p-벤조퀴논 유도체, 페나딘메타설페이트 유도체, α-나프토퀴논 유도체로는 p-벤조퀴논, 페나딘메타설페이트, α-나프토퀴논에 탄소수 1 또는 2의 알킬기가 결합한 것,탄소수 1 또는 2의 알콕시기 결합한 것, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 등의 할로겐 원자가 결합한 것 등을 들 수 있다. 또한, 글리세롤 데히드로게나아제로서 상술한 PQQ 의존형 글리세롤 데히드로게나아제가 반응층에 포함되는 경우에는, 전자 수용체로서 페나딘메타설페이트, 페나딘메타설페이트 유도체인 1-메톡시-5-메틸페나디늄메틸 설페이트, p-벤조퀴논, p-벤조퀴논 유도체인 2-메틸-1,4-벤조퀴논, α-나프토퀴논을 이용하는 것이 바람직하다.

또, 이들 전자 수용체는 1종만 단독으로 이용될 수도 있고, 예를 들어, 1-메톡시-5-메틸페나디늄메틸 설페이트와 페리시안이온을 조합하는 등 2종 이상이 병용 될 수도 있다.

반응층에서의 전자 수용체의 반응층 중의 농도는 사용하는 산화 환원 효소나 대상으로 하는 시료의 종류나 첨가량 등에 의해 적절히 선택할 수 있는데, 일반적으로는 0.5∼10μL의 시료를 첨가하는 경우에는, 1센서당 바람직하게는 0.01∼1000μg이고, 더욱 바람직하게는 0.1∼100μg이며, 특히 바람직하게는 1∼50μg이다.

반응층은 계면활성제 및 pH 완충제를 더 포함하는 것이 바람직하다. 이것은 이하의 이유 때문이다. 즉, 본 형태의 바이오센서는 시료 중의 중성 지방 농도를 측정할 목적으로 사용된다. 따라서, 센서에 적하되는 시료는 지용성 물질인 중성 지방을 포함한다. 여기서, 반응층이 계면활성제 및 pH 완충제를 더 포함하는 본 실시형태에 의하면, 시료 중의 중성 지방의 지용성에 기인하는 측정 감도의 저하가 억제될 수 있다. 이하, 상술한 실시 형태에 대해 상세히 설명한다.

본 실시 형태의 바이오센서에 있어서, 반응층(70)은 계면활성제를 포함한다. 반응층(70)에 계면활성제가 포함됨으로써 시료 중에 포함되는 중성 지방의 반응층(70)에의 용해가 촉진될 수 있다. 그 결과, 측정 감도가 뛰어난 바이오센서가 제공될 수 있다.

반응층(70)에 포함되는 계면활성제의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 종래 공지된 계면활성제가 이용될 수 있다. 여기서, 계면활성제는 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 및 비이온성 계면활성제로 크게 분류되는데, 이들 중 어느 것이든 이용될 수 있다. 여기서, 양이온성 계면활성제로는 세틸 트리메틸 암모늄염, 도데실 트리메틸 암모늄염 등을 들 수 있다. 음이온성 계면활성제로는 알킬 황산 나트륨, 알킬 벤젠 술폰산염, 콜산염 등을 들 수 있다. 양쪽성 계면활성제로는 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리조레시틴 등을 들 수 있다.비이온성 계면활성제로는 아실솔비탄, 알킬글루코시드, 트윈(Tween)계 계면활성제, 트리톤(Triton)계 계면활성제, Brij계 계면활성제 등을 들 수 있다. 단, 물론 이들 이외의 계면활성제가 이용될 수도 있다. 그 중에서도 바람직하게는 비이온성 계면활성제가, 더욱 바람직하게는 트윈계나 트리톤계 계면활성제가 사용된다.

반응층(70)에서의 계면활성제의 함량에 관해서는 특별히 제한은 없으며, 시료용액 중의 지용성 물질의 분량 등에 따라 적절히 조절될 수 있다. 일 예를 들면, 0.5∼10μL의 시료용액을 첨가하여 이용하는 바이오센서(10)의 반응층(70)에는, 통상은 0.1∼500μg, 바람직하게는 1∼100μg, 더욱 바람직하게는 1∼50μg의 계면활성제가 포함된다.

또, 본 실시형태의 바이오센서(10)에 있어서, 반응층(70)은 pH 완충제를 포함한다. 반응층(70)이 pH 완충제를 포함하면, 바이오센서(10)의 감도가 더욱 향상될 수 있다. 이 이유는 이하와 같다고 추측된다. 즉, 시료용액의 첨가에 의해 반응층(70)이 용해할 때, 시료용액의 조성에 따라서는 반응층(70)의 pH가 변동하는 경우가 있다. pH 변동의 일 예로는 반응층(70)에 있어서 시료 중의 중성 지방이 분해함으로써 지방산이 유리되는 것에 따른 pH의 저하를 들 수 있다. 여기서, 바이오센서(10)의 메카니즘은 산화 환원 효소에 의해 산화되는 기질의 분량을 간접적으로 정량한다고 하는 것이므로, 반응층(70)의 pH가 변동하면, 해당 효소의 종류에 따라서는 반응층(70)의 pH와 효소의 최적 pH가 어긋나고, 센서의 측정 감도의 저하로 이어지는 경우가 있다. 이에 대해, 반응층(70)이 pH 완충제를 포함하면, 이와 같은 pH 변동이 억제되고, pH 변동에 수반되는 센서의 측정 감도의 저하가 방지된다.

반응층(70)에 포함되는 pH 완충제의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 이용하는 효소의 최적 pH에 따라 적절히 선택될 수 있는데, 일 예로는 글리신-HCl, 글리신-NaOH, 구연산-구연산 나트륨, MES-NaOH, MOPS-NaOH, 인산, Tris-HCl, 아세트산 등을 들 수 있다. 또한, pH 완충제의 pH는 6∼9인 것이 바람직하다. 또, 이러한 pH 완충제는 1종만 단독으로 반응층(70)에 포함될 수도 있고, 2종 이상이 함께 반응층(70)에 포함될 수도 있다. 또, 상기 이외의 pH 완충제가 반응층(70)에 포함될 수도 있다.

나아가, 반응층은 다른 성분을 포함할 수 있다. 다른 성분으로는, 예를 들어, 친수성 고분자나 효소 안정화제 등을 들 수 있다.

반응층이 친수성 고분자를 포함함으로써 전극계 표면으로부터의 반응층의 박리가 방지될 수 있다. 또, 친수성 고분자는 반응층의 표면의 갈라짐을 막는 효과도 갖고 있고, 바이오센서의 신뢰성을 높이는데 효과적이다. 또, 단백질 등의 흡착성 성분의 전극계(40)에 대한 흡착도 억제될 수 있다. 이와 같은 친수성 고분자로는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 셀룰로오스, 구아검, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸에틸 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리리신 등의 폴리아미노산, 폴리스틸렌 술폰산, 젤라틴, 아크릴산 및 그 염, 메타크릴산 및 그 염, 전분, 무수말레인산 및 그 염, 아가로오스겔, 탄닌산, 펙틴, 카제인, 카라기난, 퍼셀레란, 플루란, 콜라겐, 키틴, 키토산, 콘드로이친 황산 나트륨, 리그닌 술폰산, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌글리콜, 및 이들 유도체를 들 수 있다. 이들 중에서도 탄닌산, 펙틴, 카제인, 카라기난, 퍼셀레란, 플루란, 콜라겐, 키틴, 키토산, 콘드로이탄 황산 나트륨, 리그닌 술폰산, 및 이들 유도체가 반응층(70)에 포함되면, 흡착성 성분의 전극에의 흡착이 더욱 억제되고, 탄닌산, 펙틴, 카제인, 및 이들 유도체가 특히 바람직하게 이용될 수 있다. 또한, 상기한 친수성 고분자는 1종만 단독으로 반응층(70)에 포함될 수도 있고, 2종 이상이 함께 반응층(70)에 포함될 수도 있다. 나아가, 이와 같은 친수성 고분자의 배합량은 일반적으로는 1 센서당 바람직하게는 0.1∼1000μg이고, 더욱 바람직하게는 1∼500μg이고, 특히 바람직하게는 5∼100μg이다.

반응층(70)은 1층만으로 이루어지는 층일 수도 있고, 2층 이상으로 이루어지는 층일 수도 있다. 반응층(70)이 2층으로 이루어지는 형태로는, 예를 들어, 전자 수용체 및 친수성 고분자를 포함하고, 글리세롤 데히드로게나아제를 실질적으로 포함하지 않는 제1 반응층과, 상기 제1 반응층의 상층에 형성된 글리세롤 데히드로게나아제 및 친수성 고분자를 포함하고, 전자 수용체를 실질적으로 포함하지 않는 제2 반응층으로 반응층(70)이 구성되는 형태를 들 수 있다. 또, 반응층(70)이 3층으로 이루어지는 형태로는, 예를 들어, 전자 수용체 및 친수성 고분자를 포함하고, 글리세롤 데히드로게나아제를 실질적으로 포함하지 않는 제1 반응층과, 상기 제1 반응층의 상층에 형성된 친수성 고분자를 포함하고, 글리세롤 데히드로게나아제 및 전자 수용체를 실질적으로 포함하지 않는 제2 반응층과, 상기 제2 반응층의 상층에 형성된 글리세롤 데히드로게나아제 및 친수성 고분자를 포함하고, 전자 수용체를 실질적으로 포함하지 않는 제3 반응층으로 반응층(70)이 구성되는 형태를 들 수 있다.

또, 도시하는 형태에 있어서, 반응층(70)은 전극계(40)의 상층에 형성되어 있는데, 경우에 따라서는 도시하는 형태와는 달리 전극계(40) 근처에 반응층(70)을 형성하고, 전극계(40)와 반응층(70)이 직접 접촉하지 않는 형태로 할 수도 있다. 또한, 반응층(70)이 전극계(40)의 「근처」에 형성되는 형태로는, 전극계(40)와 반응층(70) 사이에 공간이나 필터가 개재하는 형태나, 시료 공급구와 전극계(40) 사이에 반응층(70)이 형성되는 형태 등이 예시된다.

이상, 본 발명의 바이오센서(10)의 구성에 대해 상세히 설명했지만, 상기한 형태에만 제한되지 않고, 종래 공지된 기술을 적절히 참조하여 다양한 개량을 시행할 수도 있다. 종래 공지된 기술로는, 예를 들어, 일본특허공개 평성 2-062952호 공보, 일본특허공개 평성 5-87768호 공보, 일본특허공개 평성 11-201932호 공보 등을 들 수 있다.

이어, 본 발명의 바이오센서(10)의 작동에 대해 설명한다.

우선, 농도의 측정을 원하는 성분을 포함하는 시료의 소정량을 바이오센서(10)의 반응층(70)에 공급한다. 시료의 구체적인 형태는 특별히 제한되지 않고 바이오센서(10)에 이용되는 글리세롤 데히드로게나아제의 기질인 중성 지방을 포함하는 용액이 적절히 이용될 수 있다. 시료로는, 예를 들어, 혈액, 소변, 타액 등의 생체시료, 과일, 야채, 가공식품 원료 등의 식품 등이 이용될 수 있다. 단, 기타 용액이 시료로 사용될 수도 있다. 또, 특히 중성 지방의 함량이 더 높은 시료용액을 사용하면, 본 발명의 효과가 더욱 두드러질 수 있다. 또한, 시료는 원액이 그대로 이용될 수도 있고, 점도 등을 조절할 목적으로 적절한 용매로 희석된 용액이 이용될 수도 있다. 시료를 반응층(70)에 공급하는 형태는 특별히 제한되는 것은 아니며, 소정량의 시료를 반응층(70)에 대해 수직으로 직접 적하함으로써 공급할 수도 있고, 별도로 마련한 시료공급 수단에 의해 반응층(70)에 대해 수평방향으로 시료를 공급할 수도 있다.

반응층(70)으로 시료가 공급되면, 시료 중의 기질인 중성 지방은 반응층(70)에 포함되는 리포프로틴 리파아제의 작용에 의해 글리세롤 및 지방산으로 분해된다. 이어, 유리된 글리세롤은 글리세롤 데히드로게나아제의 작용에 의해 산화되고, 자신의 산화와 동시에 전자를 방출한다. 기질로부터 방출된 전자는 전자 수용체에 포착되고, 이에 따라 전자 수용체는 산화형에서 환원형으로 변화한다. 시료의 첨가 후, 바이오센서(10)를 소정 시간 방치함으로써 리포프로틴 리파아제 및 글리세롤 데히드로게나아제의 작용에 의해 시료 중의 중성 지방이 완전히 산화되고, 일정량의 전자 수용체가 산화형에서 환원형으로 변환된다. 시료 중의 중성 지방과 효소와의 반응을 완결시키기 위한 방치 시간에 대해서는 특별히 제한은 없지만, 시료첨가 후 통상 0∼5분간, 바람직하게는 0∼3분간 바이오센서(10)를 방치하면 된다.

그 후, 환원형 전자 수용체를 산화할 목적으로 전극계(40)을 통해 작용전극(44)과 상대전극(46) 사이에 소정의 전압을 인가한다. 이로써, 반응층(70) 중에 전류(이하, 「산화 전류」 라고도 함)가 흐르고, 이 전류에 의해 환원형 전자 수용체가 전기 화학적으로 산화되며, 산화형으로 변환된다. 이 때 측정되는 산화 전류의 값으로부터 전압 인가전의 환원형 전자 수용체의 분량이 산출되고, 나아가 글리세롤 데히드로게나아제와 반응한 글리세롤의 분량이 정량될 수 있다. 그리고, 최종적으로는 시료 중의 중성 지방 농도가 산출될 수 있다. 산화 전류를 흘려 보낼 때 인가되는 전압의 값은 특별히 제한되지 않으며, 종래 공지된 기술을 참조하여 적절히 조절될 수 있다. 일 예를 들면, -200∼700mV 정도, 바람직하게는 0∼600mV의 전압을 참조전극(42)과 작용전극(44) 사이에 인가하면 된다. 전압을 인가하기 위한 전압 인가 수단에 대해서도 특별히 제한은 없으며, 종래 공지된 전압 인가 수단이 적절히 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 형태에 따르면, 상술한 바이오센서(10)를 이용한 시료 중의 중성 지방 농도의 측정 방법을 제공한다.

산화 전류값의 측정, 및 해당 전류값에서 기질 농도로의 환산 방법으로는 소정의 전압을 인가하고나서 일정 시간 후의 전류값을 측정하는 크로노암페로메트리법이 사용될 수도 있고, 크로노암페로메트리법에 의한 전류 응답을 시간으로 적분하여 얻어지는 전하량을 측정하는 크로노크로메트리법이 사용될 수도 있다. 간단한 장치계에 의해 측정된다는 점에서 크로노암페로메트리법이 바람직하게 이용될 수 있다.

이상, 환원형 전자 수용체를 산화할 때의 전류(산화 전류)를 측정함으로써 중성 지방의 농도를 산출하는 형태를 예로 들어 설명했는데, 경우에 따라서는 환원되지 않고 잔존해 있는 산화형 전자 수용체를 환원할 때의 전류(환원 전류)를 측정함으로써 중성 지방의 농도를 산출하는 형태가 채용될 수도 있다.

도 1은 본 발명의 바이오센서의 각 구성 요소의 형성 패턴을 나타내는 평면도로, (a)는 절연성 기판상에서의 리드부 및 커넥터부의 형성 패턴을 나타내는 평 면도이고, (b)는 전극계를 구성하는 참조전극의 형성 패턴을 나타내는 평면도이며, (c)는 전극계를 구성하는 작용전극 및 상대전극의 형성 패턴을 나타내는 평면도이고, (d)는 절연층의 형성 패턴을 나타내는 평면도이고, 도 1E는 스페이서 및 반응층의 형성 패턴을 나타내는 평면도이다.

도 2는 도 1의 각 도면이 나타내는 각 구성 요소의 적층순서를 나타내는 분해 사시도이다.

도 3은 도 1 및 도 2의 각 도면이 나타내는 각 구성요소가 형성되어 이루어진 바이오센서를 나타내는 평면도이다.

도 4는 실시예 1-1의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5는 실시예 1-2의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6은 실시예 2-1∼2-3의 결과를 나타내는 그래프이다.

이어, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 이러한 실시예는 본 발명을 전혀 제한하는 것이 아니다.

(효소 활성)

50μM DCIP, 0.2mM PMS, 400mM 글리세롤을 포함한 0.2% 트리톤 X-100을 포함하는 10mM 인산 완충액(pH7.0) 중에 PQQ 의존성 글리세롤 데히드로게나아제를 용해하여 PQQ 의존성 글리세롤 데히드로게나아제 용액을 제조했다. 해당 용액에 포함되는 효소와 기질과의 반응을 DCIP의 600nm의 흡광도 변화에 의해 추적하고, 그 흡광도의 감소 속도를 효소의 반응 속도로 했다. 1분 동안에 1μmol의 DCIP가 환원되는 효소 활성을 1단위(U)로 했다. 또한, DCIP의 pH 7.0에서의 몰 흡광계수는 16.3mM^-1로 했다.

(참고예 1)

솔비톨(2질량%), 효모 엑기스(0.3질량%), 고기 엑기스(0.3질량%), 콘·스티프·리커(0.3질량%), 폴리펩톤(1질량%), 요소(0.1질량%), KH₂PO₄(0.1질량%),MgSO₄·7H₂O(0.02질량%), CaCl₂(0.1질량%), pH 7.0로 이뤄진 배지 400mL를 500mL용 진탕 플라스크에 1개당 100mL씩 옮기고, 121℃, 20분간 오토크레이브를 수행했다.

종균으로서 글루코노박터·옥시단스(Gluconobacter oxydans) NBRC 3291주를 1백금이(一白金耳) 식균하고, 30℃에 24시간 배양하여 종배양액으로 만들었다.

다음에 상기와 같은 조성으로 제조한 배지 6.6L를 10L용 병 배양기(Jar fermentor)로 옮기고, 121℃에서 20분간 오토클레이브를 수행하고, 방냉후 종배양액 400mL을 옮겼다. 이것을 750rpm, 환기량 7L/분, 30℃에서 24시간 배양했다.

배양액을 원심분리하여 집균하고, 증류수로 현탁한 후 프렌치 프레스에 의해 균체를 파쇄했다. 파쇄액을 원심분리하고, 얻어진 상청액을 초원심분리하여 막분획을 침전물로 얻었다. 이 막분획을 10mM 트리스염산 완충액(pH 8.0)에 현탁한 후, 최종 농도가 1%가 되도록 트리톤 X-100을 가하고, 4℃에서 2시간 교반했다. 초원심분리하고, 상청액을 0.2질량% 트리톤 X-100을 포함하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 하룻밤 투석하고, 이것을 가용화 막분획으로 하였다. 이 가용화 막분획을 FPLC에서 ResourceQ(6mL)으로 분획하고, 얻어진 활성분획을 0.2 질량% 트리톤 X- 100을 포함하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 하룻밤 투석한 후 동결 건조함으로써 비활성 3U/mg 단백질의 효소표품을 얻었다. 이 글루코노박터·옥시단스에서 유래한 글리세롤 데히드로게나아제를 이하, 간단히 「GlyDH」라고도 부른다.

(실시예 1-1)

전극계가 형성된 센서 기판으로서 시판되는 센서 전극(BVT사 제품; AC1.W5.R1)을 준비했다. 이 센서 기판에 있어서, 전극계는 직경 약 6mm의 거의 원형이다. 또, 상기에서 준비한 전극계의 상부에 직경 6mm의 구멍을 뚫은 두께 0.2mm의 PET 시트를 붙여 스페이서를 형성했다. 전극계상의 스페이서의 구멍 내부에 상기한 참고예 1에서 얻은 GlyDH(20U/mL)와, 리포프로틴 리파아제(아마노(天野)엔자임제, 10,000U/mL)와, 전자 수용체로서 1-메톡시-5-메틸페나디늄메틸 설페이트(도진(同人)화학연구소제품: 10mmol/L; 이하,「m-PMS」라고도 함)를 혼합한 인산 완충 생리식염수를 10μL 적하하고, 실온에서 건조시켜 반응층을 형성했다.

이 반응층 상에 트리올레인을 50mg/dL 함유하는 시료액 10μL를 적하했다. 시료에 포함되는 트리올레인이 리포프로틴 리파아제에 의해 지방산 및 글리세롤에 가수분해되고, 이 글리세롤이 GlyDH에 의해 산화되는 동시에, 반응층 중의 전자 수용체가 환원되었다.

시료를 적하하고 나서 5분 후에 참조전극에 대해 +150mV의 전위를 작용전극에 인가하고, 전자 수용체의 산화 전류값을 측정했다. 측정에는 전기화학 측정 시스템(HZ- 5000 호쿠토덴코(北斗電工)제품, HAG 1512m/BP)을 사용했다. 이 전류값(응답 전류)은 전자 수용체의 환원체의 농도, 즉 시료 중의 트리올레인의 농도에 비례한다. 이 전류값을 측정함으로써 시료 중의 트리올레인의 농도를 평가했다.

또한, 시료는 10질량%의 트리톤 X-100을 포함하는 인산 완충 생리식염수에 트리올레인(토교(東京)화성공업제품)을 용해시킨 것이다.

이어, 시료에 포함되는 트리올레인의 양을 0mg/dL, 100mg/dL, 150mg/dL 및 200mg/dL으로 대신한 것 이외에는, 상기와 똑같이 하여 응답 전류를 측정했다. 각 농도의 트리올레인을 포함하는 시료에 대해 전위 인가후 1초후의 전류량을 도시한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 응답 전류값과 트리올레인 농도 사이에 양호한 선형성이 인정되었다.

(실시예 1-2)

실시예 1-1에서 사용한 전극계 상에 0.5%(w/v)의 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨(와코(和光)순약제; 이하,「CMC」라고도 함) 수용액을 적하건조한 후, 실시예 1과 똑같이 하여 얻어진 GlyDH(20U/mL), 리포프로틴 리파아제(10,000u/mL) 및 m- PMS(10mmmol/L)를 포함하는 0.5% CMC 용액을 적하하고, 건조시켜 반응층을 형성했다.

이 바이오센서를 사용하여 실시예 1-1과 마찬가지로 응답 전류값과 트리올레인 농도의 상관성을 조사했다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 얻어진 응답 전류값은 CMC의 영향에 의해 약간 저하되어 있는데, 응답 전류값과 중성 지방의 농도에는 실시예 1보다도 더 높은 상관성이 인정되었다.

(실시예 2-1)

전극계가 형성된 센서 기판으로서, 시판중인 센서 전극(BVT사제품; AC1.W5.R1)을 준비했다. 이 센서 기판에 있어서, 전극계는 직경 약 6mm의 거의 원형이다. 또, 상기에서 준비한 전극의 상부에 직경 6mm의 구멍을 뚫은 두께 0.2mm의 PET 시트를 붙여 스페이서를 형성했다.

한편, pH 7.0의 인산 완충 생리식염수(PBS)에 상기한 참고예에서 얻은 산화 환원 효소인 GlyDH(30U/mL), 리포프로틴 리파아제((주)아마노엔자임제품, 10,000U/mL), 전자 수용체인 1-메톡시-5-메틸페나디늄메틸 설페이트(이하,「m-PMS」라고도 함)((주)도진화학연구소제품, 10mM), 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC)(0.5질량%), 및 계면활성제인 트리톤 X-100(2질량%)을 첨가하여 반응층 형성용 조성물을 제조했다.

상기에서 제조한 반응층 형성용 조성물 10μL을 스페이서를 가진 구멍 내부에 적하하고, 실온에서 건조시켜 반응층을 형성했다.

나아가, 트리톤 X-100을 10질량% 함유하는 pH 7.0의 인산 완충 생리식염수(PBS)에 트리올레인((주)토교화성공업제품)을 100mg/dL의 농도가 되도록 용해시켜 시료용액을 제조했다.

제조한 시료용액을 상기한 반응층에 10μL 적하했다. 시료용액 중의 트리올레인이 리포프로틴 리파아제에 의해 지방산(올레인산)과 글리세롤로 가수분해되고, 이 글리세롤이 GlyDH에 의해 산화된다. 이 때에 글리세롤의 산화와 동시에, 반응층 중의 전자 수용체(m-PMS)가 환원된다.

시료를 적하하고 나서 30초 후에 참조전극에 대해 +150mV의 전위를 작용전극에 인가하고, 전자 수용체의 산화 전류값을 측정했다. 측정에는 전기화학 측정 시스템(HZ-5000 호쿠토덴코제품, HAG 1512m/BP)을 사용했다. 이 산화 전류(응답 전류)의 값은 환원형 전자 수용체의 농도, 즉 시료 중의 트리올레인 농도에 비례한다.

나아가, 시료 용액 중의 트리올레인 농도를 300mg/dL 및 500mg/dL로 한 것 이외에는, 상기와 똑같은 방법에 의해 산화 전류값을 측정했다. 또 대조군 시료로서 트리올레인을 포함하지 않는 시료용액을 제조하고, 마찬가지로 산화 전류값을 측정했다. 측정한 산화 전류값을 그래프에 도시하였다. 이 그래프를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 그래프는 그 경사가 클수록 센서의 측정 감도가 높은 것을 의미한다. 본 실시예에 있어서는, 도 6에 나타낸 바와 같이 경사가 비교적 큰 그래프를 얻을 수 있었다. 따라서, 본 실시예에 의하면, 측정 감도가 뛰어난 센서가 제공되는 것을 알 수 있다.

(실시예 2-2)

반응층 형성용 조성물을 제조할 때 계면활성제인 트리톤 X-100을 첨가하지 않은 것 이외에는, 상기한 실시예 2-1과 같은 방법에 의해 센서 기판상에 스페이서 및 반응층을 형성하고, 시료용액의 첨가 후의 산화 전류(응답 전류)값을 측정했다.얻어진 결과를 도시한 그래프를 도 6에 나타내었다. 본 실시예에 있어서는, 도 6에 나타낸 바와 같이, 얻어지는 그래프의 경사가 작지만, 어느 정도의 선형성은 인정되었다.

(실시예 2-3)

반응층 형성용 조성물을 제조할 때 인산 완충 생리식염수를 대신하여 증류수를 사용한 것 이외에는, 상기한 실시예 2-1과 동일한 방법에 의해 센서 기판상에 스페이서 및 반응층을 형성하고, 시료용액의 첨가 후에 산화 전류(응답 전류)값을 측정했다. 얻어진 결과를 도시한 그래프를 도 6에 나타내었다. 본 실시예에 있어서는, 도 6에 나타낸 바와 같이 얻어지는 그래프의 경사는 작지만, 어느 정도의 선형성은 인정되었다.

또한, 본 출원은 2005년 3월 29일에 출원된 일본특허출원 제2005-095169호 및 일본특허출원 제2005-096427호에 기초하고 있으며, 그 개시 내용은 참조에 의해 전체적으로 인용되고 있다.

Claims

절연성 기판과,

상기 절연성 기판 상에 형성된 작용전극 및 상대전극을 포함하는 전극계와,

상기 전극계의 상부 또는 근처에 형성된 리포프로틴 리파아제, 글리세롤 데히드로게나아제 및 전자 수용체를 포함하는 반응층을 구비하는, 상기 전극계에 흐르는 전류값에 기초하여 중성 지방의 농도를 측정하기 위한 바이오센서.
제1항에 있어서,

상기 전극계가 참조전극을 더 포함하는 바이오센서.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 글리세롤 데히드로게나아제가 조효소 의존형인 바이오센서.
제3항에 있어서,

상기 조효소가 피롤로퀴놀린퀴논 또는 플라빈아데닌 디뉴클레오티드인 바이오센서.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 전자 수용체가 페리시안이온, p-벤조퀴논, p-벤조퀴논 유도체, 페나딘 메타설페이트, 페나딘메타설페이트 유도체, 메틸렌블루, 티오닌, 인디고카민, 갈로시아닌, 사프라닌, 페로센 및 그 유도체, α-나프토퀴논 및 α-나프토퀴논 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인 바이오센서.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 반응층이 계면활성제 및 pH 완충제를 더 포함하는 바이오센서.
제6항에 있어서,

상기 계면활성제가 비이온성 계면활성제인 바이오센서.
제6항 또는 제7항에 있어서,

상기 pH 완충제의 pH가 6∼9인 바이오센서.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 반응층이 친수성 고분자를 더 포함하는 바이오센서.
제9항에 있어서,

상기 친수성 고분자가 탄닌산, 펙틴, 카제인, 카라기난, 퍼셀레란, 플루란, 콜라겐, 키틴, 키토산, 콘드로이친 황산나트륨, 리그닌 술폰산, 및 이들 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인 바이오센서.
제9항 또는 제10항에 있어서,

상기 반응층이,

상기 전자 수용체 및 상기 친수성 고분자를 포함하고, 상기 글리세롤 데히드로게나아제를 실질적으로 포함하지 않는 제 1 반응층과,

상기 제1 반응층의 상층에 형성된, 상기 글리세롤 데히드로게나아제 및 상기 친수성 고분자를 포함하고, 상기 전자 수용체를 실질적으로 포함하지 않는 제 2 반응층으로 이루어진 바이오센서.
제11항에 있어서,

상기 제 1 반응층과 상기 제 2 반응층 사이에 실질적으로 상기 친수성 고분자로 이루어지는 제 3 반응층이 형성된 바이오센서.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 전극계의 상층에 거의 직사각형의 개구부를 가진 절연층이 형성되고, 상기 상대전극의 상기 개구부로부터의 노출 면적이 상기 작용전극의 상기 개구부로부터의 노출 면적의 1.2∼3.0 배인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 전극계를 바이오센서 외부로 전기적으로 통하게 하기 위한 리드부 및 커넥터부를 더 구비하고,

상기 전극계를 구성하는 재료가 10μm의 두께에서 100Ω/□이하의 표면 저항값을 갖는 카본을 주성분으로 하는 재료이고, 상기 리드부 및 상기 커넥터부를 구성하는 재료가 10μm의 두께에서 50mΩ/□이하의 표면 저항값을 갖는 금속을 주성분으로 하는 재료인 바이오센서.
제14항에 있어서,

상기 금속이 은, 금, 백금, 및 팔라듐으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 금속인 바이오센서.
제3항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 글리세롤 데히드로게나아제가 계면활성제의 존재 하에 2 가성 가교시약으로 화학적으로 변형되어 이루어진 변형 글리세롤 데히드로게나아제인 바이오센서.
제16항에 있어서,

상기 글리세롤 데히드로게나아제가 글루코노박터속에 속하는 세균에서 유래한 바이오센서.