KR20070027532A - 심장-뇌 혈관성 질환용 한약 조제물 및 그의 제조 방법 - Google Patents

심장-뇌 혈관성 질환용 한약 조제물 및 그의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 심장-뇌 혈관성 질환용 한약 조제물에 관한 것으로, 상기 조제물은 단삼(danshen)과 삼칠(Notoginseng)을 알카리수(lye)로 추출하는 단계, 알코올로 침전시키는 단계, 농축시키는 단계 및 그외 약재 및 부형제를 첨가하는 단계에 의해 제조된다. 이후, HAPLY-MS 및 HAPLY 핑거프린트 아틀라스(fingerprint Atlas)로 상기 조제물의 물리화학적 특성을 확인한다. 본 발명의 핑거프린트 아틀라스를 이용하여, 생물학적으로 활성인 성분의 구조 및 상대적인 함량을 알 수 있다. 상기한 방법에 따른 단삼과 삼칠의 한약 조제물의 물리 화학적 특성은 종래 방법에 비해 우수하다.
단삼, 삼칠, 뇌, 심장, 혈관성 질환

Description

심장-뇌 혈관성 질환용 한약 조제물 및 그의 제조 방법{TRADITIONAL CHINESE MEDICINE PREPARATION FOR CARDIO-CEREBRAL BLOOD VESSEL DISEASES AND ITS PREPARING METHOD}
본 발명은 약, 특히 심혈관성 질환 및 뇌혈관성 질환 치료용 한약 조제물에 관한 것이다.
심혈관성 질환 및 뇌혈관성 질환은 공통적으로 인류의 건강에 매우 해로운 질병이다. 최근, 사회 발전과 함께 일, 생활, 식이 패턴, 환경 등의 변화로 인해 이러한 질환들이 증가하고 있다. 한약(traditional chinese medicine (TCM))은 서양 약제에 비해 단일 표적에 대한 활성은 낮지만, 이의 다중 경로 및 표적성, 동적이며 전신적인 치료 및 낮은 부작용을 특징으로 하여, 서양 약제의 효능을 능가한다. 일정한 치료 효과를 가지는 한약 조제물은 서양 약제의 효과에 비해 전반적으로 우수한 치료 효과를 가진다. 현재 컴파운드 단삼 정제 및 이의 한약 조제물, 관신 단삼 드롭 환제(Guanxin Danshen drop pill) 및 신케수 정제(Xinkeshu tablet) 등의 심혈관성 질환 및 뇌혈관성 질환 치료용 한약 조제물이 다수 있다. 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae) 및 삼칠(Radix Notoginseng)을 함유하는 이들 모든 한약 조제물들은 여러가지 제형, 성분비, 추출 및 정제 과정 또는 투여 형태 에 따라 다른 치료 효과를 갖는다. 또한, 이들 한약 조제물은 이들 약제의 물리 화학적 특성을 완전히 파악할 수 있는 유효한 품질 검사 방법이 없기 때문에 품질을 관리하기 어려울 수 있으며, 대신 단센수(Danshensu) 또는 탄시논(Tanshinone) IIA와 같이 1 또는 2개의 화합물을 이들 약제의 생물학적 활성 성분 복합체로 표시하고 있다. 따라서, 이러한 한약 조제물의 추출 및 정제 공정 뿐만 아니라 이의 품질 관리 방법 역시 개선이 필요한 실정이다.
발명의 개요
본 발명은 심혈관성 질환 및 뇌혈관성 질환의 치료를 위한 보다 효과적인 한약 조제물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 이의 물리 화학적 특성을 비교적 완전하고 정확하게 검사할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 한약 조제물의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 아래 구현예를 통해 실현된다.
본 발명의 한약 조제물은
단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae)과 삼칠(Radix Notoginseng)에, 상기 약재 총 무게에 대해 0.5 내지 4.0 중량%로, 소듐 하이드록사이드, 소듐 바이카보네이트, 소듐 카보네이트, 포타슘 하이드록사이드, 포타슘 바이카보네이트, 포타슘 카보네이트 또는 이들의 혼합물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
상기 혼합물을 3-6배의 물에서 2-4회 달이는 단계;
상기 혼합물을 여과하고, 모은 여과물을 농축하는 단계;
상기 제조되는 농축물에 에탄올 함량이 65-70%가 되도록 고농도(70% 이상)의 에탄올을 첨가하는 단계;
상기 제조되는 혼합물을 정치하여 상층액을 분리하는 단계;
상기 상층액으로부터 에탄올을 제거하고, 상대 밀도가 1.20 - 1.50이 될때까지 단삼-삼칠 추출물인 잔사를 농축하는 단계;
상기 추출물에 보르네올(또는 강진향(Lignum Dalbergiae Odoriferae) 오일)을 혼합하는 단계; 및
상기 제조되는 혼합물에 전분, 덱스트린, 락토스, 미세결정형 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 마그네슘 스테아레이트, 미세 실리콘 젤, 자일리톨, 락티톨, 글루코스, 글리신, 만니톨, 메틸 전분 소듐, 가교된 소듐 카르복실 메틸 셀룰로스, 가교된 폴리비닐피롤리돈 등의 하나 이상의 약학 부형제를 첨가하여, 주사제, 정제, 서방성 정제, 드롭 환제, 과립제, 주사용 분말, 캡슐제, 미세과립제 또는 경구 붕괴제와 같은 여러가지 투여 형태로 제형화하는 단계를 포함하는 제조 방법을 통해 제조할 수 있다.
바람직하게는, 상기 한약 조제물은
단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae)과 삼칠(Radix Notoginseng)의 무게를 측정하는 단계;
상기 약재 총 무게에 대해 1.4 내지 1.9 중량%로 소듐 바이카보네이를 첨가하여 혼합물을 수득하는 단계;
상기 혼합물을 4-5배의 물에서 2-3시간 동안 달인 후, 3-4배의 물에서 1-2시간 달이는 단계;
상기 혼합물을 여과하고, 비중이 1.16 - 1.20(80 + 5 ℃)이 될때까지 모은 여과물을 농축하는 단계;
상기 제조되는 농축물에 에탄올 함량이 65-70%가 되도록 고농도(70% 이상)의 에탄올을 첨가하는 단계(20 ℃);
상기 제조되는 혼합물을 8-12 시간 정치하여 상층액을 분리하는 단계;
상기 상층액으로부터 에탄올을 제거하고, 상대 밀도가 1.32 - 1.40(55 - 60 ℃)이 될때까지 단삼-삼칠 추출물인 잔사를 농축하는 단계;
상기 추출물에 보르네올(또는 강진향(Lignum Dalbergiae Odoriferae) 오일)을 혼합하는 단계; 및
상기 제조되는 혼합물에 전분, 덱스트린, 락토스, 미세결정형 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 마그네슘 스테아레이트, 미세 실리콘 젤, 자일리톨, 락티톨, 글루코스, 글리신, 만니톨, 메틸 전분 소듐, 가교된 소듐 카르복실 메틸 셀룰로스 및 가교된 폴리비닐피롤리돈으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 약학 부형제를 첨가하여, 주사제, 정제, 드롭 환제, 주사용 분말, 캡슐제, 과립제, 미세과립제 또는 경구 붕괴제로 제형화하는 단계를 포함하는 제조 방법을 통해 제조할 수 있다.
본 발명의 보르네올은 천연 또는 합성 보르네올일 수 있다. 강진향 오일은 강진향을 증류하여 수득한다.
본 발명의 한약 조제물은 드롭 환제의 투여 형태가 바람직하다.
본 발명에 따른 한약 조제물은 다음과 같은 물리 화학적 파라미터로 특정화된다:
HPLC 스펙트럼에서 총 피크 면적에 대한 단일 피크의 면적 비가 2% 보다 높은 8개의 피크가 있으며, 이들 8개의 피크의 평균 체류 시간은 각각 6.04, 9.90, 16.89, 17.84, 20.31, 23.74, 27.73 및 31.02이고, 체류 시간의 RSD%는 각각 0.31, 0.25, 0.61, 0.70, 0.96, 0.76, 0.50 및 1.18이고, 평균 피크 면적은 각각 1627.92, 2575.54. 366.89, 381.40, 186.08, 555.35, 281.91 및 1852.33이고, 피크 면적의 RSD%는 각각 5.91, 13.53, 10.92, 13.81, 12.04, 10.48, 18.08 및 14.84이고, 총 피크 면적에 대한 단일 피크 면적 비는 각각 19.6%-22.0%, 28.5-37.4%, 4.2%-5.2%, 4.2%-5.5%, 2.1%-2.7%, 6.4%-7.8%, 3.0%-4.3% 및 20.2%-27.2%이다.
상기 물리 화학적 파라미터는 다음과 같은 검출 조건하에서 구한다:
(1) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)
옥타데실실릴-실리카 겔을 크로마토그래피 컬럼의 필터로 사용하고, 유속 1.000 ml/min 및 검출 파장 280 nm이다. 0.02% 인산 수용액인 이동상 A와 80% 아세토니트릴-0.02% 인산 수용액인 이동상 B를 이용하여, 0에서 8분까지 이동상 A는 90%에서 78%로, 이동상 B는 10%에서 22%로 일정하게 농도를 변화시키고, 8분부터 15분까지 이동상 A는 78%에서 74%로, 이동상 B는 22%에서 26%로 농도를 변화시키고, 15분부터 55분까지 이동상 A는 74%에서 48%로, 이동상 B는 26%에서 52%로 변화시켜, 용출시킨다.
(2) 샘플 용액 제조 및 측정
본 발명에 따른 한약 조제물 10환의 무게를 정확하게 측정하여 10 ml의 측정 병에 넣는다. 상기 조제물을 용해시키기에 충분한 함량의 증류수를 첨가하여 15분간 초음파 처리하면서 교반한다. 증류수를 추가로 첨가하여 총 부피를 10 ml로 조절한다. 제조된 용액을 원심 분리 또는 여과하여 샘플 용액을 수득한다. 샘플 용액 10 ㎕을 HPLC 장치에 주입하고, HPLC 크로마토그래피를 수행하여 HPLC 스펙트럼을 수득한다.
표준 샘플과 질량 스펙트라 비교와 같은 분석 방법을 통해, 전술한 평균 체류 시간이 6.04, 9.90, 16.89, 17.84, 20.31, 23.74, 27.73 및 31.02인 8개의 피크는 각각 단센수(Danshensu), 프로토카테추알데하이드(Protocatechualdehyde), 이소리토스페름산(isolithospermic acid) A, 이소리토스페름산 B, 살비아놀산(Salvianolic acid) D, 로즈마린산, 살비아놀산 B 및 살비아놀산 A인 것으로 확인되었다(도 1).
특정 HPLC-MS 방법으로, 본 발명의 한약 조제물이 단센수, 프로토카테추알데하이드, 이소리토스페름산 A, 이소리토스페름산 B, 살비아놀산 D, 살비아놀산 E, 로즈마린산, 살비아놀산 B, 살비아놀산 G, 살비아놀산 A, 탄시논 I, 탄시논 IIA, 노토진세노사이드(Notoginsenoside) R1, 진세노사이드 Re, 진세노사이드 Rg1, 진세노사이드 Rb1, 노토진세노사이드 R2, 노토진세노사이드 R2 이소., 진세노사이드 Rg2, 진세노사이드 Rh1, 진세노사이드 Rh1 이소., 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 Rd 이소., 진세노사이드 Rf-H2O, 노토진세노사이드 R2-H2O, 진세노사이드 Rg6 또는 F4, 진세노사이드 Rk3, 진세노사이드 Rh4, 진세노사이드 20(R)-Rg3, 진세노사이드 20(S)-Rg3, 진세노사이드 Rk1, 진세노사이드 Rg5 등을 포함하고 있음을 확인하였다.
Figure 112006074814936-PCT00001
1. 단센수 MW=198
2. 프로토카테추알데하이드 MW=138
3. 살비아놀산 A MW=494
4. 살비아놀산 B MW=718
5. 살비아놀산 C MW=492
6. 살비아놀산 D MW=418
7. 살비아놀산 E MW=718
8. 살비아놀산 G MW=340
9. 이소리토스페름산 A MW=538
10. 이소리토스페름산 B MW=538
11. 로즈마린산 MW=360
Figure 112006074814936-PCT00002
구조 타입 A 진세노사이드 R1 R2 분자량(MW)
진세노사이드 Rb1 Glc-Glc Glc-Glc 1108
진세노사이드 Rd Glc-Glc Glc 946
진세노사이드 Rg3 Glc-Glc H 784
진세노사이드 F2 Glc Glc 784
구조 타입 B 진세노사이드 R1 R2 R3 MW
진세노사이드 Re H Glc O-Glc-Rham 946
진세노사이드 Rf H H O-Glc-Glc 800
진세노사이드 Rg1 H Glc O-Glc 800
진세노사이드 Rg2 H H O-Glc-Rham 784
진세노사이드 Rh1 H H O-Glc 638
노토진세노사이드 R2 H H O-Glc-Xyl 770
노토진세노사이드 R1 H Glc O-Glc-Xyl 932
진세노사이드 F1 H Glc OH 638
구조 타입 C 진세노사이드 R1 R2 MW
진세노사이드 Rg5 Glc-Glc- H 766
진세노사이드 Rh4 H Glc-O- 620
진세노사이드 F4 H Rham-Glc-O- 766
구조 타입 D 진세노사이드 R1 R2 MW
진세노사이드 Rg6 H Rham-Glc-O- 766
진세노사이드 Rk1 Glc-Glc H 766
진세노사이드 Rk3 H Glc-O- 620
Glc = β-D-글루코스
Rham = α-L-람노스
Xyl = β-D-자일로스
본 발명의 추출 공정 및 분석 방법에서, 핑거프린트 아틀라스(fingerprint atlas)를 한약 조제물내 단삼 및 삼칠의 물리 화학적 특성을 충분히 특정화하는데 이용하였다. 단지 하나 또는 2개의 화합물로 한약 조제물내 생리 활성 성분을 표현하는 종래 방법에 비해, 이러한 특정화 방법이 한약 조제물의 품질을 관리하는데 보다 적합하다.
본 발명의 한약 조제물내 생리 활성 성분은 본 발명에 따른 HPLC-MS 분석으로 검출하였다. 그 결과, 단삼에서 12가지의 성분과 삼칠에서 21가지의 성분들이 동정되었다. 화합물들은 주로 MSn 데이타 분석과 문헌에 기재된 데이타 비교를 토대로 동정하였다. 마지막으로, 다수의 성분들은 대조 샘플들과 비교하여 구조를 완전히 검증하였다. 이로써, 본 발명에 따른 HPLC-MS 분석 방법으로 본 발명의 한약 조제물의 화학적 조성을 분석함으로써 생리 활성 성분의 구조에 입각한 많은 정보를 산출할 수 있을 것으로 결론내릴 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 한약 조제물내 단삼 및 삼칠의 물리 화학적 특성에 대한 정보의 특정화는 종래 방법에 비해 매우 이로운 효과가 있다.
본 발명의 한약 조제물이 심혈관성 질환 및 뇌혈관성 질환 치료에 효과가 있음을 입증하는 테스트를 다음과 같이 나타낸다.
1. 마취한 개에서의 심근 허혈증 및 심근 경색에 대한 한약 조제물의 효과
심외막 전기도로 심근 허혈증 범위를 맵핑하고, 그 정도를 표시하였다. 정량적인 조직학(N-BT 염색법)을 사용하여, 심근 경색 부위를 확인하였다. 또한 관상 동맥의 혈류 변화, 심근의 산소 소비량 및 혈청 CK 및 LDH의 활성도 및 혈장 ET, TXB2, 및 6-케토-PGF1a를 측정하였다. 본 발명에 따른 한약 조제물의 급성 심근 허혈증, 심근 경색에 대한 이의 효과 및 테스트 개에서의 관련 증후에 대한 효과는 식이성 투여(alimentary administration)로 시험하였다.
테스트 결과, 본 발명에 따른 한약 조제물은 개의 급성 심근 허혈 및 심근 경색을 개선시키는데 현저한 효과가 있는 것으로 나타났다. 심외막 전기도로 나타난 심근 허혈(∑-ST) 정도 감소(정상적인 염수를 이용한 대조군 그룹에 비해 P<0.001), N-ST 염색으로 나타난 경색 부위의 현저한 감소(정상적인 염수를 이용한 대조군 그룹에 비해 P<0.001), 및 허혈성 심장에서의 관상 동맥 혈류의 현저한 개선(정상적인 염수를 이용한 대조군 그룹에 비해 P<0.001)을 유도할 수 있었다. 심근 허혈 및 심근 경색으로 초래된 혈청 락테이트 디하이드로게나제(LDH)의 분비에 대한 저해 작용(정상 염수를 이용한 대조군 보다 현저하게 낮은 상대적인 변이율을 가짐, P<0.001) 뿐만 아니라 크리아틴 포스포키나제(CK) 활성 상승에 대한 저해 작용(정상 염수를 이용한 대조군 보다 현저하게 낮은 상대적인 변이율을 가짐, P<0.05)이 있었다. 또한, 혈장 ET(정상적인 염수를 이용한 대조군 그룹에 비해 P<0.001) 및 TXB2 수준(정상적인 염수를 이용한 대조군 그룹에 비해 P<0.001, 한약 조제물을 이용한 그룹에 비해 P<0.05)의 감소 효과가 있었으며, 6-케토-PGF1a/TXB2 (정상적인 염수를 이용한 대조군 그룹에 비해 P<0.001, 한약 조제물을 이용한 그룹에 비해 P<0.05)의 비율 향상이 있었다.
2. 허혈 재관류에 의해 야기된 심근 경색증에 대한 한약 조제물의 효과
심근의 허혈 재관류 손상이 있는 랫 모델을 관찰하여, 본 발명에 따른 한약 조제물이 심근 손상 정도를 현저하게 경감시키고, 심근 경색 영역을 축소시키고(모델 그룹에 비해 p<0.05 - 0.01), 경색부의 무게를 감소시킬(모델 그룹에 비해 p<0.05) 수 있었다. 또한, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)의 활성을 현저하게 증가시키는데 효과적이었다(모델 그룹에 비해 p<0.01).
3. 개에서 심장 혈류 동역학 및 심근 산소 소모량에 대한 한약 조제물의 효과
본 발명의 한약 조제물은 마취시킨 정상적인 개에서 심장 혈류 동역학 및 심근 산소 소모량에 대한 효과 측면에 대해 평가하였다.
그 결과, 본 발명에 따른 한약 조제물은 좌심실 박출(left ventricular work) 증강없이, 관상 동맥 혈류의 현저한 개선(정상 염수를 이용한 대조군 및 투여전 그룹에 비해 p<0.01-0.001), 관상 혈관 확장, 심장 정맥 굴(coronary vein sinus)내 산소 함량 증가(투여전 그룹 및 정상 염수를 식이한 대조군에 비해 p<0.05-0.001), 심근 산소 소모량 표지자의 감소, 심근으로의 혈액과 산소의 공급 개선, 및 심장 박동과 심박출량 증가(투여전 그룹 및 정상 염수를 식이한 대조군에 비해 p<0.05-0.01)를 유도할 수 있었다. 또한, 본 발명의 한약 조제물은 심장 유순성(cardiac complaisance)을 조절하는 효과가 있어, 따라서 심혈관 시스템을 조절 및 개선시킨다.
4. 토끼에서의 혈소판 응집에 대한 한약 조제물의 효과
본 발명의 한약 조제물은 토끼에서 혈소판 응집 효과에 대해 본 네펠로미트리(Born nephelometry)로 평가하였다.
그 결과, 한약 조제물은 연속 7일간 위내 투여시 아라키돈산(AA)(증류수 투여한 대조군에 비해 p<0.05-0.01) 및 콜라겐(증류수 투여한 대조군에 비해 p<0.01)에 의해 유도된 토끼에서의 혈소판 응집에 대해 현저한 감소를 유도할 수 있는 것으로 확인되었다. 이는 본 발명에 따른 한약 조제물이 혈소판 응집의 저해 효과가 있음을 시사하는 것이다.
5. 랫에서의 시험관내 혈전형성 및 혈액 점도에 대한 한약 조제물의 효과
본 발명에 따른 한약 조제물의, 랫에서의 시험관내 혈전형성 및 혈액 점도에 대한 영향을 평가하였다.
한약 조제물은 7일간 연속 위내 투여시 현저한 혈전 단축(shortened thrombus)(증류수 투여한 대조군에 비해 p<0.01), 혈전의 습식 및 건조 중량 감소(증류수 투여한 대조군에 비해 p<0.05), 혈장의 점도 감소(증류수 투여한 대조군에 비해 p<0.001), 및 다양한 전단 속도로 혈액 전체의 점성 감소(증류수 투여한 대조군에 비해 p<0.05)를 유도할 수 있는 것으로 확인되었다. 이는, 본 발명에 따른 한약 조제물이 혈전형성을 저해하고, 혈구 및 전체 혈액의 점도를 낮추는 효과가 있음을 시사한다.
6. 토끼에서의 고지혈증 및 죽상동맥경화증에 대한 한약 조제물의 효과
테스트하기 위한 고지혈증 및 죽상동맥경화증(AS) 모델은, 토끼에 콜레스테롤 함량이 높은 사료를 먹여 확립하였다. 본 발명에 따른 한약 조제물의 상기 모델에 대한 효과를 시험하였다.
그 결과, 본 발명에 따른 한약 조제물은 토끼에서 혈청내 TC, TG, LDL-C, VLDL-C의 현저한 농도 감소, TC/HDL-C 비 감소(고지혈증이 있는 대조군에 비해 p<0.05-0.001), 유의적인 HDL-C 농도 증가(고지혈증이 있는 대조군에 비해 p<0.05), 대동맥내 TC 함량 감소(고지혈증이 있는 대조군에 비해 p<0.05), 간내 TG 함량 감소(고지혈증이 있는 대조군에 비해 p<0.05), 및 간내 MDA 함량 감소(고지혈증이 있는 대조군에 비해 p<0.001)를 유도할 수 있는 것으로 확인되었다. 본 발명의 한약 조제물은 간내 SOD 활성 향상에 유의적인 효과가 있다(고지혈증이 있는 대조군에 비해 p<0.01). 더욱이, 동맥 플라그의 두께와 동맥내에 형성된 거품세포(foam cell)의 양 감소에 유의한 효과가 있다(고지혈증이 있는 대조군에 비해 p<0.05). 또한, 동맥 플라그의 면적이 줄어드는 경향이 유도된다. 이러한 점들은, 본 발명에 따른 한약 조제물이 혈액내 지방을 조절하고, 동시에 지질의 과산화 억제 및 죽상동맥경화증 방지 효과가 있음을 시사한다.
7. 랫에서의 국소 뇌 허혈에 대한 한약 조제물의 효과
중간 대뇌 동맥 혈전증(middle cerebral artery thrombosis (MCAT))이 있는 랫 모델을 이용하여, 본 발명에 따른 한약 조제물의 MCAT 랫의 뇌 경색 부위에 대한 효과를 평가하였다.
그 결과, 본 발명에 따른 한약 조제물은 현저한 항-뇌 허혈증 효과를 가진다는 사실이 입증되었다.
도 1은 본 발명의 한약 조제물의 한가지 투여 형태로서 드롭 환제에서의 단삼 성분에 대한 핑거프린트 아틀라스이다. 도에서, 피크 1은 단센수이고, 피크 2는 프로토카테추알데하이드이고, 피크 3은 이소리토스페름산 A이고, 피크 4는 이소리토스페름산 B이고, 피크 5는 살비아놀산 D이고, 피크 6은 로즈마린산이고, 피크 7은 살비아놀산 B이고, 피크 8은 살비아놀산 A이다.
도 2는 본 발명의 한약 조제물에서의 수용성 단삼 성분에 대한 HPLC 스펙트 럼이다. 도에서, 피크 1은 단센수이고, 피크 2는 프로토카테추알데하이드이고, 피크 3은 이소리토스페름산 A이고, 피크 4는 이소리토스페름산 B이고, 피크 5는 살비아놀산 D이고, 피크 6은 살비아놀산 E이고, 피크 7은 로즈마린산이고, 피크 8은 살비아놀산 B이고, 피크 9는 살비아놀산 G이고, 피크 10은 살비아놀산 A이다.
도 3은 본 발명의 한약 조제물에서 수용성 단삼 성분에 대한 MS-TIC 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 한약 조제물에서 단삼의 지용성 성분에 대한 HPLC 스펙트럼이다. 도에서, 피크 1은 탄시논 I이고, 피크 2는 탄시논 IIA이다.
도 5는 본 발명의 한약 조제물에서 단삼의 지용성 성분에 대한 MS-TIC 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명의 한약 조제물에서 삼칠 성분에 대한 MS-TIC 스펙트럼이다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 보다 상세히 설명한다. 실시예는 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1(제조예)
단삼 41.06 g 및 삼칠 8.03 g을 측정하고, 여기에 약재 총 중량의 1.8 중량%로 소듐 바이카보네이트를 첨가하였다. 이를 2시간동안 4배수의 물에서 달인 다음, 다시 1시간동안 3배수의 물에서 달였다. 여과한 다음, 조합한 여과물은 비중이 1.19-1.20 (75 + 1 ℃)이 될때까지 농축하였다. 이후, 여기에 에탄올 함량이 65%가 되는 적량으로 95% 에탄올을 첨가하였다(20 ℃). 이후, 12시간동안 정치시 켜, 상층액을 분리하였다. 상층액에서 에탄올을 제거한 다음, 상대 밀도가 1.37(55-60 ℃)가 될 때까지 단삼-삼칠 추출물인 잔사를 농축하였다.
상기 추출물은 이후 보르네올 0.46 g 및 폴리에틸렌 글리콜-6000 18 g과 균일하게 혼합하였다. 이를 80분간 85 ℃에서 용해시켰다. 용해시킨 액체는 86 ℃로 유지되고 있는 탱크가 장착된 드롭-환제 장치의 드롭핑 탱크에 넣고, 상기 액체를 8 ℃의 파라핀 액체에 점적하였다. 수득되는 드롭 환제를 수거하여 오일을 제거한 다음 체질로 스크리닝하여, 목적한 조제물을 수득하였다.
실시예 2(제조예)
단삼 59.36 g 및 삼칠 6.38 g을 측정하고, 여기에 약재 총 중량의 1.0 중량%로 포타슘 카보네이트를 첨가하였다. 이를 2.5시간동안 4배수의 물에서 달인 다음, 다시 1.5시간동안 3배수의 물에서 달였다. 여과한 다음, 조합한 여과물은 비중이 1.19-1.20 (75 + 1 ℃)이 될때까지 농축하였다. 이후, 여기에 에탄올 함량이 70%가 되는 적량으로 85% 에탄올을 첨가하였다(20 ℃). 이후, 10시간동안 정치시켜, 상층액을 분리하였다. 상층액에서 에탄올을 제거한 다음, 상대 밀도가 1.35(55-60 ℃)가 될 때까지 단삼-삼칠 추출물인 잔사를 농축하였다.
상기 추출물은 이후 보르네올 0.34 g 및 폴리에틸렌 글리콜-6000 23 g과 균일하게 혼합하였다. 이를 100분간 89 ℃에서 용해시켰다. 용해시킨 액체는 85 ℃로 유지되고 있는 탱크가 장착된 드롭-환제 장치의 드롭핑 탱크에 넣고, 상기 액체를 8 ℃의 파라핀 액체에 점적하였다. 수득되는 드롭 환제를 수거하여 오일을 제거한 다음 체질로 스크리닝하여, 목적한 조제물을 수득하였다.
실시예 3(제조예)
단삼 12.60 g 및 삼칠 56.15 g을 측정하고, 여기에 약재 총 중량의 1.0 중량%로 포타슘 바이카보네이트를 첨가하였다. 이를 2.5시간동안 4배수의 물에서 달인 다음, 다시 1.5시간동안 3배수의 물에서 달였다. 여과한 다음, 조합한 여과물은 비중이 1.19-1.20(75 + 1 ℃)이 될때까지 농축하였다. 이후, 여기에 에탄올 함량이 70%가 되는 적량으로 95% 에탄올을 첨가하였다(20 ℃). 이후, 10시간동안 정치시켜, 상층액을 분리하였다. 상층액에서 에탄올을 제거한 다음, 상대 밀도가 1.35(55-60 ℃)가 될 때까지 단삼-삼칠 추출물인 잔사를 농축하였다.
상기 추출물은 이후 보르네올 0.34 g 및 폴리에틸렌 글리콜-6000 23 g과 균일하게 혼합하였다. 이를 100분간 89 ℃에서 용해시켰다. 용해시킨 액체는 85 ℃로 유지되고 있는 탱크가 장착된 드롭-환제 장치의 드롭핑 탱크에 넣고, 상기 액체를 8 ℃의 메틸 실리콘 오일에 점적하였다. 수득되는 드롭 환제를 수거하여 오일을 제거한 다음 체질로 스크리닝하여, 목적한 조제물을 수득하였다.
실시예 4(제조예)
단삼 31.12 g 및 삼칠 9.21 g을 측정하고, 여기에 약재 총 중량의 0.5 중량%로 소듐 하이드록사이드를 첨가하였다. 이를 1.5시간동안 4배수의 물에서 달인 다음, 다시 1.5시간동안 3배수의 물에서 달였다. 여과한 다음, 조합한 여과물은 비중이 1.19-1.20(75 + 1 ℃)이 될때까지 농축하였다. 이후, 여기에 에탄올 함량이 66%가 되는 적량으로 88% 에탄올을 첨가하였다(20 ℃). 이후, 10시간동안 정치시켜, 상층액을 분리하였다. 상층액에서 에탄올을 제거한 다음, 상대 밀도가 1.40(55-60 ℃)이 될 때까지 단삼-삼칠 추출물인 잔사를 농축하였다.
상기 추출물은 이후 보르네올 0.50 g, 만니톨 90 g, 칼슘에디테이트 소듐(calciumedetate sodium) 15 g 및 증류수 15 ml과 균일하게 혼합하였다. 제조되는 혼합물은 동결건조한 다음, 주사용 분말로 최종적으로 제형화하였다.
실시예 5(제조예)
단삼 116.35 g 및 삼칠 58.21 g을 측정하고, 여기에 약재 총 중량의 2.0 중량%로 소듐 바이카보네이트를 첨가하였다. 이를 2시간동안 4배수의 물에서 달인 다음, 다시 1.5시간동안 3배수의 물에서 달였다. 여과한 다음, 조합한 여과물은 비중이 1.19-1.20(75 + 1 ℃)이 될때까지 농축하였다. 이후, 여기에 에탄올 함량이 66%가 되는 적량으로 88% 에탄올을 첨가하였다(20 ℃). 이후, 10시간동안 정치시켜, 상층액을 분리하였다. 상층액에서 에탄올을 제거한 다음, 상대 밀도가 1.40(55-60 ℃)이 될 때까지 단삼-삼칠 추출물인 잔사를 농축하였다.
상기 추출물은 이후 강진향 오일 1.80 g 및 미세결정형 셀룰로스 40 g과 균질하게 혼합하였다. 에탄올중의 3% 폴리비돈 용액을 첨가하여 부드럽게 하였다. 연화된 덩어리를 18-메쉬로 체질하여 과립화하였다. 과립은 35분간 60 ℃에서 건조한 다음, 트리밍하고, 탈컴(talcum) 분말 4 g과 균일하게 혼합하였다. 수득되는 혼합물은 캡슐에 충진하여 목적한 조제물로 수득하였다.
실시예 6(제조예)
단삼 116.35 g 및 삼칠 58.21 g을 측정하고, 여기에 약재 총 중량의 2.0 중량%로 소듐 바이카보네이트를 첨가하였다. 이를 2시간동안 4배수의 물에서 달인 다음, 다시 1.5시간동안 3배수의 물에서 달였다. 여과한 다음, 조합한 여과물은 비중이 1.19-1.20(75 + 1 ℃)이 될때까지 농축하였다. 이후, 여기에 에탄올 함량이 66%가 되는 적량으로 88% 에탄올을 첨가하였다(20 ℃). 이후, 10시간동안 정치시켜, 상층액을 분리하였다. 상층액에서 에탄올을 제거한 다음, 상대 밀도가 1.40(55-60 ℃)이 될 때까지 단삼-삼칠 추출물인 잔사를 농축하였다.
상기 추출물은 이후 보르네올 0.90 g, 미세결정형 셀룰로스 120 g, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스 40 g, 자일리톨 5 g 및 마그네슘 스테아레이트 2 g과 균일하게 혼합하였다. 제조되는 혼합물은 정제로 압축하여 목적한 조제물을 수득하였다.
실시예 7(제조예)
단삼 140.35 g 및 삼칠 36.42 g을 측정하고, 여기에 약재 총 중량의 2.5 중량%로 소듐 바이카보네이트를 첨가하였다. 이를 2시간동안 4배수의 물에서 달인 다음, 다시 1.5시간동안 3배수의 물에서 달였다. 여과한 다음, 조합한 여과물은 비중이 1.19-1.20(75 + 1 ℃)이 될때까지 농축하였다. 이후, 여기에 에탄올 함량이 65%가 되는 적량으로 90% 에탄올을 첨가하였다(20 ℃). 이후, 8시간동안 정치시켜, 상층액을 분리하였다. 상층액에서 에탄올을 제거한 다음, 상대 밀도가 1.35(55-60 ℃)이 될 때까지 단삼-삼칠 추출물인 잔사를 농축하였다.
상기 추출물은 이후 보르네올 1.00 g 및 미세결정형 셀룰로스 46 g과 균일하게 혼합하였다. 에탄올중의 3% 폴리비돈 용액을 첨가하여 연화였다. 연화된 덩어리를 18-메쉬로 체질하여 과립화하였다. 과립은 30분간 60 ℃에서 건조한 다음, 트리밍하고, 탈컴 분말 4 g과 균일하게 혼합하였다. 수득되는 혼합물은 정제로 압착하여 목적한 조제물로 수득하였다.
실시예 8(활성 성분의 검출예)
1. 샘플 제조
(1) 한약 조제물내 단삼의 수용성 성분
실시예 1, 2 및 3의 한약 드롭 환제, 실시예 4의 주사용 분말, 실시예 5의 한약 캡슐, 실시예 6의 경구 붕괴성 한약 정제, 및 실시예 7의 한약 정제 각각 148.4 mg씩 회수하였다. 각 조제물들은 15분간 초음파 처리하여 물 6 ml에 녹인 다음, 0.45 ㎛의 나일론 필름으로 여과하여, 노란색의 샘플 용액을 각각 수득하였다.
(2) 한약 조제물내 삼칠 성분 및 단삼의 지용성 성분
실시예 1, 2 및 3의 한약 드롭 환제, 실시예 4의 주사용 분말, 실시예 5의 한약 캡슐, 실시예 6의 경구 붕괴성 한약 정제, 및 실시예 7의 한약 정제 각각 1003.8 mg씩 회수하였다. 상기 조제물들은 15분간 초음파 처리하여 4% 암모니아 수용액 10 ml에 녹인 다음, 0.45 ㎛의 나일론 필름으로 각각 여과하였다. 여과물은 Extract-Clean C18(Alltech Associates, Inc, U.S.) 컬럼에서 전처리하였다. 샘플을 컬럼에 주입하여 물 10 ml로 세척한 다음 메탄올 2 ml로 용출시켜, 테스트 샘플 각각은 노란색 용출물로서 수득하였다.
2. 샘플 분석
(1) 장치 및 물질
Agilent 시리즈-1100 액체 크로마토그래프(Agilent); G1315A 다이오드 어레이 검출기; G1313A 자동 샘플 주입기; G1316A 자동 온도 조절 장치(Thermostat); G1322A 공기제거장치(Deaerator) 및 이중 펌프(Duplex Pump); HP 장치 크로마토그래프 워크 스테이션
타입 G2445A 시리즈 1100 LC-MSD/Trap 질량 스펙트로그래프(Mass Spectrograph)(Bruker); 전자-분무로 이온화를 수행하였다; Extract-Clean C18 컬럼(100 mg/ml，Alltech Associates, Inc, U.S.)，크로마토그래피용 아세트니트릴(TEDIA)，재증류수, 및 분석용 순도의 아세트산
(2) 장치의 검출 조건
Agilent Zorbax SB-C18 크로마토그래프용 컬럼(5 ㎛，4.6 mm x 25 cm，Agilent, SN：USCL009296)을 HPLC 분석에 하용하였다. 각 샘플의 농도구배 용출 및 질량 스펙트럼 검출은 하기 조건하에서 수행하였다.
① 각 실시예의 한약 조제물내 수용성 단삼 성분
HPLC 용출 조건:
시간(분) 이동상 A(％) 이동상 B(％) 이동상 A: 아세트산: 물 = 0.01:100 이동상 B: 아세트산: 아세토니트릴 = 0.01:100 유속: 0.5 ml/min 온도: 30 ℃ 검출 파장: 다중 파장(표시 파장 280 nm)
0 95.0 5.0
15 78.3 21.7
33 78.3 21.7
38 65.0 35.0
MS 분석 조건:
HPLC-MS HPLC-MSn
이온 검출 방식 음이온 검출
건성 가스 유속 (L/min) 10 10
분무기 압력 (psi) 60 60
건조 온도 (℃) 350 350
모세관 전압 (v) 3500 3500
질량 스캔 범위 (m/z) 100-1200 100-800
분절 진폭 (ev) 1.5-3.0
② 각 실시예의 한약 조제물내 삼칠 성분
HPLC 용출 조건:
시간(분) 이동상 A (％) 이동상 B (％) 이동상 A: 아세트산: 물=0.01:100 이동상 B: 아세트산: 아세토니트릴 =0.01:100 유속: 0.8 ml/min 온도: 30 ℃ 검출 파장: 다중 파장 (표시 파장 203)
0 80 20
15 65 35
25 65 35
40 57 43
50 54 46
65 42 58
75 25 75
MS 분석 조건:
HPLC-MS HPLC-MSn
이온 검출 방식 음이온 검출
건성 가스 유속 (L/min) 10 10
분무기 압력(psi) 60 60
건조 온도 (℃) 350 350
모세관 전압 (v) 3500 3500
질량 스캔 범위 (m/z) 400-1500 400-1200
분절 진폭 (ev) 1.2-1.5
3. 분석 결과 및 피크 동정
다음의 두가지 측면으로 성분을 동정하였다: (1) 대조군 샘플 사용; (2) UV 흡광성 및 MSn으로부터의 이온 분절(ion fragment) 정보를 문헌 데이타와 함께 사용.
4. 동정 결과
(1) 본 발명의 각 실시예에 따른 단삼 조제물내 수용성 단삼 성분(표 1 및 2, 도 2 및 3).
표 1. HPLC-MS 데이타 및 동정 결과
피크 번호 체류 시간 준분자 이온 질량 피크 m/z [M-H]- 동정 최대 흡광 파장 λmax
1 12.73 197 단센수 280
2 19.69 137 프로토카테추알데하이드 231, 280, 310
3 22.99 537 이소리토스페름산 A 327
4 23.83 537 이소리토스페름산 B 327
5 24.89 417 살비아놀산 D 247, 321
6 26.70 717 살비아놀산 E 330
7 28.51 359 로즈마린산 329
8 31.93 717 살비아놀산 B 254, 286, 309
9 34.86 339 살비아놀산 G 395
10 44.64 493 살비아놀산 A 288
표 2. HPLC-MSn 데이타
피크 번호 동정 분절 이온 m/z
3 이소리토스페름산 A 제2(537): 493[M-H-CO2]-, 295[M-CO2-R-H2O]- 제3(295): 159, 109
4 이소리토스페름산 B 제2(537): 493[M-H-CO2]-, 295[M- CO2-R-H2O]- 제3(295): 159, 109
5 살비아놀산 D 제2(417): 175[M- CO2-R-H2O]-, 373[M-H-CO2]- 제3(175): 147, 157, 133
6 살비아놀산 E 제2(717): 519[M- R-H2O]-, 321[M-2R-2H2O]- 제3(519): 321[M-R-H2O]-, 339[M-R]- 제3(321): 279, 293, 249, 223, 185
7 로즈마린산 제2(359): 161[M-R-H2O]-, 179[M-R]-, 195
8 살비아놀산 B 제2(717): 519[M- R-H2O]-, 321[M- 2R-2H2O]- 제3(519): 321[M- R-H2O]-, 339[M-R]- 제4(321): 279, 293, 249, 233, 185
9 살비아놀산 G 제2(339): 321[M-H-H2O]-, 295[M-H-CO2]- 제3(295): 279, 267 제4(279): 251
10 살비아놀산 A 제2(493): 295[M- R-H2O]- 제3(295): 159, 109
제2 및 제3의 피크가 리토스페름산의 구조와 매우 유사한 MSn 결과를 볼 수 있었다. 그러나, 이들은 UV 흡광에서는 리토스페름산과 매우 상이하였다. 리토스페름산은 페닐 쿠마란 벡본 때문에 거의 253 nm에서 상대적으로 강한 흡광도를 가지지만, 제2 및 제3 피크는 그러한 흡광 특성을 나타내지 않았다. 이들 피크 모두 살비아놀산 E와 매우 유사한 UV 흡광 특성을 나타내어, 이들 두개의 피크에 해당되는 화합물 2종은 살비아놀산 E와 동일한 벡본, 즉 카르복실 디페닐 에틸렌 벡본 구조를 가질 것으로 보였다. 따라서, 이들은 전술한 구조식으로 나타낸 이소리토스 페름산 A 및 B의 구조를 갖는 것으로 결론내렸다. 이러한 두가지 구조는 보고된바 없으며, 따라서, 본원에서 이소리토스페름산 A 및 B로 명명하였다.
(2) 본 발명의 한약 조제물내 지용성 단삼 성분(표 3, 도4 및 5).
표 3. HPLC-MS 데이타 및 동정 결과
피크 번호 체류 시간 준분자 이온 질량 피크 m/z- 동정
1 24.36 277 [M+H]+, 575 [2M+Na]+ 탄시논 I
2 34.85 295 [M+H]+, 611[2M+Na]+ 탄시논 IIA
(3) 본 발명의 단삼 드롭 환제내 삼칠 성분(표 4, 표 5, 도 6)
표 4. HPLC-MS 데이타 및 동정 결과
피크 번호 체류 시간 준분자 이온 질량 피크 m/z [M-H]- 동정
1 11.27 931 노토진세노사이드 R1
2 12.38 945 진세노사이드 Re
2 12.53 799 진세노사이드 Rg1
3 20.81 1107 진세노사이드 Rb1
4 21.25 769 노토진세노사이드 R2
5 22.53 769 노토진세노사이드 R2 - iso.
6 22.85 783 진세노사이드 Rg2
7 23.77 637 진세노사이드 Rh1
8 25.00 637 진세노사이드 Rh1 iso. (F1)
9 30.05 945 진세노사이드 Rd
10 34.81 945 진세노사이드 Rd iso.
11 40.00 781 진세노사이드 Rf-H2O
12 41.57 751 노토진세노사이드 R2-H2O
13 43.72 751 노토진세노사이드 R2 --H2O
14 44.89 765 진세노사이드 Rg6/F4
15 46.43 619 진세노사이드 Rk3/Rh4 (Rk3)
16 48.68 619 진세노사이드 Rk3/Rh4 (Rh4)
17 54.97 783 진세노사이드 20(R)Rg3
18 56.48 783 진세노사이드 20(S)Rg3
19 68.35 765 진세노사이드 Rk1/Rg5 (Rk1)
20 69.53 765 진세노사이드 Rk1/Rg5 (Rg5)
표 5. HPLC-MSn 데이타
체류 시간 동정 준분자 이온 질량 피크 m/z-
11.27 노토진세노사이드 R1 799[M-H-Xyl]-; 637[M-H-Xyl-Glc]-; 475[M-H-Xyl-2Glc]-
12.38 진세노사이드 Re 799[M-H-Rham]-; 783[M-H-Glc]-; 637[M-H-Rham-Glc]-; 475[M-H-Rham-2Glc]-
12.53 진세노사이드 Rg1 637[M-H-Glc]-; 475[M-H-2Glc]-
20.81 진세노사이드 Rb1 945[M-H-Glc]-; 783[M-H-2Glc]-; 621[M-H-3Glc]-; 459[M-H-4Glc]-
21.25 노토진세노사이드 R2 637[M-H-Xyl]-; 475[M-H-Xyl-Glc]-
22.53 노토진세노사이드 R2 - iso. 637[M-H-Xyl]-; 475[M-H-Xyl-Glc]-
22.85 진세노사이드 Rg2 637[M-H-Rham]-; 475[M-H-Rham-Glc]-
23.77 진세노사이드 Rh1 475[M-H-Glc]-
25.00 진세노사이드 Rh1 iso.(F1) 475[M-H-Glc]-
30.05 진세노사이드 Rd 783[M-H-Glc]-; 621[M-H-2Glc]-; 459[M-H-3Glc]-
34.81 진세노사이드 Rd iso. 783[M-H-Glc]-; 621[M-H-2Glc]-; 459[M-H-3Glc]-
40.00 진세노사이드 Rf-H2O 619[M-H-Glc]-; 457[M-H-2Glc]-
41.57 노토진세노사이드 R2-H2O 619[M-H-Xyl]-
43.72 노토진세노사이드 R2 --H2O 619[M-H-Xyl]-
44.89 진세노사이드 Rg6/F4 619[M-H-Rham]-; 457[M-H-Rham-Glc]-
54.97 진세노사이드 20(R)Rg3 621[M-H-Glc]-; 459[M-H-2Glc]-
56.48 진세노사이드 20(S)Rg3 621[M-H-Glc]-; 459[M-H-2Glc]-
68.35 진세노사이드 Rk1/Rg5 (Rk1) 603[M-H-Glc]-; 441[M-H-2Glc]-
69.53 진세노사이드 Rk1/Rg5 (Rg5) 603[M-H-Glc]-; 441[M-H-2Glc]-
전술한 방법을 토대로, 한약 조제물의 추출 및 분석 방법을 확립하였으며, 하기를 포함한다:
(1) 지용성 단삼 성분과 단삼 드롭 환제로부터 삼칠 성분을 추출하기 위한 고상 공정
(2) 각 샘플에 대한 HPLC-MS 분석
단삼으로부터 12종의 성분을, 삼칠로부터 21종의 사포닌 성분을 동정하였다. 이들중에서, 수용성 단삼 성분 4종, 지용성 단삼 성분 2종과 사포닌 9종은 대조군 샘플과의 비교를 통해 동정하였으며, 그외 성분들은 MSn 데이타 분석 및 문헌에 기재된 데이타와의 비교를 통해 주로 동정하였다.
실시예 9(한약 조제물내 단삼 성분에 대한 핑거프린트 아틀라스 검출예)
1. 장치 및 물질
장치: Agilent 1100 액체 크로마토그래피, 하기 포함: quad-pump, 온라인 탈기 시스템, 자동 샘플 주입기, DAD 검출기, 컬럼 온도 탱크, 자동온도 조절 워크 스테이션; BS210S 전자 저울(1/10-4 g)(Beijing Sartorius Company), METTLER AE240 전자 저울(1/10-4 g 또는 1/10-5 g)(Mettler-Toledo Corporation, Shanghai), LD4-2 원심분리기(4000 r/min)(Beijing Medical Centrifuge Factory), 디지탈 자동 온도 조절기능의 수조 케틀(Tianjing Changfeng Corporation), RE-52AA 회전 증발기(Shanghai Yarong Biochemical Instrumentation Factory), SHE-(III) 물-순환성 진공 펌프(Gongyi Yingyuyuhua Instrumentation Factory), KQ-250B 초음파 세척기(Kunshan Ultrasonic Instrumentation Corporation), HENGAO T&D 필터(HENGGAO T&D), 합성 섬유 멤브레인 필터(aperture 0.45 ㎛)(Shanghai Xingya Purifying Materials Factory).
물질: 아세토니트릴(크로마토그래피 등급의 순도, Merck Company, US), 인산(상등급), Wahaha 순수 물.
2. 테스트 샘플 제조
실시예 1의 각각의 배치에 따른 한약 조제물 10환의 무게를 정확하게 측정하여 10 ml의 측정 병에 넣는다. 상기 환제를 용해시키기에 충분한 함량의 증류수를 첨가하여 15분간 초음파 처리하면서 교반한다. 증류수를 추가로 첨가하여 총 부피를 10 ml로 조절한다. 제조된 용액을 원심 분리 또는 여과하여 샘플 용액을 수득한다.
3. HPLC 분석 조건
Agilent ZoRBAx SB-C18 (4.6 x 250 mm, 5 ㎛) 크로마토그래피 컬럼; 이동상：0.02% 인산 수용액인 이동상 A, 80% 아세토니트릴-0.02% 인산 수용액인 이동상 B; 유속: 1.000 ml/min; 검출 파장: 280 nm, 컬럼 온도: 30 ℃; 샘플 주입량: 10 ㎕.
이동상의 용출 구배
체류 시간 이동상 A(v/v) 이동상 B(v/v)
0분 90% 10%
8분 78% 22%
15분 74% 26%
55분 48% 52%
4. 검출 결과(표 7)
표 7. 상기 한약 드롭 환제의 200개 배치에서의 단삼 성분의 검출 결과
피크 번호 평균 체류 시간 체류 시간 RSD% 평균 피크 면적 피크 면적의 RSD% 피크 총 면적 대비 단일 피크의 면적 % 피크 총 면적 대비 단일 피크의 면적 % 범위
1 6.04 0.31 1627.92 5.91 20.80% 19.6%-22.0%
2 9.90 0.25 2575.54 13.53 32.90% 28.5%-37.4%
3 16.89 0.61 366.89 10.92 4.69% 4.2%-5.2%
4 17.84 0.70 381.40 13.81 4.87% 4.2%-5.5%
5 20.31 0.96 186.08 12.04 2.38% 2.1%-2.7%
6 23.74 0.76 555.35 10.48 7.09% 6.4%-7.8%
7 27.73 0.50 281.91 18.08 3.60% 3.0%-4.3%
8 31.02 1.18 1852.33 14.84 23.66% 20.2%-27.2%
참조:
피크 1은 단센수이고, 피크 2는 프로토카테추알데하이드이고, 피크 3은 이소리토스페름산 A이고, 피크 4는 이소리토스페름산 B이고, 피크 5는 살비아놀산 D이고, 피크 6은 로즈마린산이고, 피크 7은 살비아놀산 B이고, 피크 8은 살비아놀산 A이다(도 1 참조).
표 7은 피크 8개의 상대적인 위치 및 면적 비율(체류 시간 및 피크 면적)을 나타낸 것으로, 피크 3개는 피크 총 면적 대비 단일 피크 면적비가 10% 보다 높고, 8개의 피크 모두 피크 총 면적 대비 단일 피크 면적 비가 2% 보다 높다.

Claims (12)

  1. 심혈관성 질환 및 뇌혈관성 질환 치료용 한약 조제물로서,
    (1) 건성 가스 유속 10 L/min, 분무기 압력 60 psi, 건성 가스 온도 350 ℃, 모세관 전압 3500 v 및 m/z 스캔 범위 100-1200의 조건하에서 음이온 검출을 통한 HPLC-MS; 및
    (2) 건성 가스 유속 10 L/min, 분무기 압력 60 psi, 건성 가스 온도 350 ℃, 모세관 전압 3500 v, m/z 스캔 범위 100-800 및 분절 진폭(fragment amplitude) 1.5-3.0 v에서 음이온 검출을 통한 HPLC-MSn로 질량 분광 분석시,
    상기 조제물은 2개의 성분을 포함하며, 상기 성분은 각각 준분자 이온 질량 피크(m/z) 537[M-H]-, 제2 분절 이온(second fragment ion) 질량(m/z) 493[M-H-CO2]- 및 295[M-CO2-R-H2O]-, 및 제3 분절 이온(m/z) 159 및 109를 나타내며, 파장 327 nm에서 최대 흡광도를 가지는 것을 특징으로 하는, 한약 조제물.
  2. 제 1항에 있어서, 이소리토스페름산(isolithospermic acid) A 및 B를 포함하는 것을 특징으로 하는 한약 조제물.
  3. 제 1항에 있어서, 한약 조제물은
    (1) 건성 가스 유속 10 L/min, 분무기 압력 60 psi, 건성 가스 온도 350 ℃, 모세관 전압 3500 v 및 m/z 스캔 범위 100-1200의 조건하에서 음이온 검출을 통한 HPLC-MS; 및
    (2) 건성 가스 유속 10 L/min, 분무기 압력 60 psi, 건성 가스 온도 350 ℃, 모세관 전압 3500 v, m/z 스캔 범위 100-800 및 분절 진폭(fragment amplitude) 1.5-3.0 v에서 음이온 검출을 통한 HPLC-MSn를 포함하는 질량 분광 분석시,
    417, 717, 359, 717, 339 및 493 [M-H]-의 준분자 이온 질량 피크(m/z)를 가지는 성분들을 포함하며;
    417 [M-H]-의 성분은 175[M-CO2-R-H2O]- 및 373[M-H-CO2]-의 제2 분절 이온(m/z), 및 147, 157 및 133의 제3 분절 이온(m/z)을 가지며;
    717 [M-H]-의 성분은 519[M-R-H2O]- 및 321[M-2R-2H2O]-의 제2 분절 이온(m/z), 321[M-R-H2O]- 및 339[M-R]-의 제3 분절 이온(m/z), 및 279, 293, 249, 223 및 185의 제3 분절 이온(m/z)을 가지며;
    359 [M-H]-의 성분은 161[M-R-H2O]-, 179[M-R]-, 및 195의 제2 분절 이온(m/z)을 가지며;
    717 [M-H]-의 성분은 519[M-R-H2O]- 및 321[M-2R-2H2O]-의 제2 분절 이 온(m/z), 321[M-R-H2O]- 및 339[M-R]-의 제3 분절 이온(m/z), 및 279, 293, 249, 223 및 185의 제4 분절 이온(m/z)을 가지며;
    339 [M-H]-의 성분은 321[M-H-H2O]- 및 295[M-H-CO2]-의 제2 분절 이온(m/z), 279 및 267의 제3 분절 이온(m/z), 및 251의 제4 분절 이온(m/z)을 가지며;
    493 [M-H]-의 성분은 295[M-R-H2O]-의 제2 분절 이온(m/z), 및 159 및 109의 제3 분절 이온(m/z)을 가지는 것을 특징으로 하는, 한약 조제물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 한약 조제물은
    (1) 건성 가스 유속 10 L/min, 분무기 압력 60 psi, 건성 가스 온도 350 ℃, 모세관 전압 3500 v 및 m/z 스캔 범위 400-1500의 조건하에서 음이온 검출을 통한 HPLC-MS; 및
    (2) 건성 가스 유속 10 L/min, 분무기 압력 60 psi, 건성 가스 온도 350 ℃, 모세관 전압 3500 v, m/z 스캔 범위 400-1200 및 분절 진폭(fragment amplitude) 1.2-1.5 v에서 음이온 검출을 통한 HPLC-MSn을 포함하는 질량 분광 분석시,
    931, 945, 799, 1107, 769, 769, 783, 637, 637, 945, 945, 781, 751, 751, 765, 783, 783, 765 및 765 [M-H]-의 준분자 이온 질량 피크(m/z)를 가지는 성분들을 포함하며,
    931 [M-H]-의 성분은 799[M-H-Xyl]-, 637[M-H-Xyl-Glc]-, 및 475[M-H-Xyl-2Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    945 [M-H]-의 성분은 799[M-H-Rham]-, 783[M-H-Glc]-, 637[M-H-Rham-Glc]-, 및 475[M-H-Rham-2Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    799 [M-H]-의 성분은 637[M-H-Glc]-, 및 475[M-H-2Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    1107 [M-H]-의 성분은 945[M-H-Glc]-, 783[M-H-2Glc]-, 621[M-H-3Glc]-, 및 459[M-H-4Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    769 [M-H]-의 성분은 637[M-H-Xyl]-, 및 475[M-H-Xyl-Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    769 [M-H]-의 성분은 637[M-H-Xyl]-, 및 475[M-H-Xyl-Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    783 [M-H]-의 성분은 637[M-H-Rham]-, 및 475[M-H-Rham-Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    637 [M-H]-의 성분은 475[M-H-Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    637 [M-H]-의 성분은 475[M-H-Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    945 [M-H]-의 성분은 783[M-H-Glc]-, 621[M-H-2Glc]-, 및 459[M-H-3Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    945 [M-H]-의 성분은 783[M-H-Glc]-, 621[M-H-2Glc]-, 및 459[M-H-3Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    781 [M-H]-의 성분은 619[M-H-Glc]-, 및 457[M-H-2Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    751 [M-H]-의 성분은 619[M-H-Xyl]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    751 [M-H]-의 성분은 619[M-H-Xyl]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    765 [M-H]-의 성분은 619[M-H-Rham]-, 및 457[M-H-Rham-Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    783 [M-H]-의 성분은 621[M-H-Glc]-, 및 459[M-H-2Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    783 [M-H]-의 성분은 621[M-H-Glc]-, 및 459[M-H-2Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    765 [M-H]-의 성분은 603[M-H-Glc]-, 및 441[M-H-2Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    765 [M-H]-의 성분은 603[M-H-Glc]-, 및 441[M-H-2Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지는 것을 특징으로 하는, 한약 조제물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 한약 조제물은
    (1) 건성 가스 유속 10 L/min, 분무기 압력 60 psi, 건성 가스 온도 350 ℃, 모세관 전압 3500 v 및 m/z 스캔 범위 100-1200의 조건하에서 음이온 검출을 통한 HPLC-MS; 및
    (2) 건성 가스 유속 10 L/min, 분무기 압력 60 psi, 건성 가스 온도 350 ℃, 모세관 전압 3500 v, m/z 스캔 범위 100-800 및 분절 진폭(fragment amplitude) 1.5-3.0 v에서 음이온 검출을 통한 HPLC-MSn를 포함하는 질량 분광 분석시,
    417, 717, 359, 717, 339 및 493 [M-H]-의 준분자 이온 질량 피크(m/z)를 가지는 성분들을 포함하며,
    417 [M-H]-의 성분은 175[M-CO2-R-H2O]- 및 373[M-H-CO2]-의 제2 분절 이온(m/z), 및 147, 157 및 133의 제3 분절 이온(m/z)을 가지며;
    717 [M-H]-의 성분은 519[M-R-H2O]- 및 321[M-2R-2H2O]-의 제2 분절 이온(m/z), 321[M-R-H2O]- 및 339[M-R]-의 제3 분절 이온(m/z), 및 279, 293, 249, 223 및 185의 제3 분절 이온(m/z)을 가지며;
    359 [M-H]-의 성분은 161[M-R-H2O]-, 179[M-R]-, 및 195의 제2 분절 이온(m/z)을 가지며;
    717 [M-H]-의 성분은 519[M-R-H2O]- 및 321[M-2R-2H2O]-의 제2 분절 이온(m/z), 321[M-R-H2O]- 및 339[M-R]-의 제3 분절 이온(m/z), 및 279, 293, 249, 223 및 185의 제4 분절 이온(m/z)을 가지며;
    339 [M-H]-의 성분은 321[M-H-H2O]- 및 295[M-H-CO2]-의 제2 분절 이온(m/z), 279 및 267의 제3 분절 이온(m/z), 및 251의 제4 분절 이온(m/z)을 가지며;
    493 [M-H]-의 성분은 295[M-R-H2O]-의 제2 분절 이온(m/z), 및 159 및 109의 제3 분절 이온(m/z)을 가지며,
    상기 한약 조제물은
    (1) 건성 가스 유속 10 L/min, 분무기 압력 60 psi, 건성 가스 온도 350 ℃, 모세관 전압 3500 v 및 m/z 스캔 범위 400-1500의 조건하에서 음이온 검출을 통한 HPLC-MS 및
    (2) 건성 가스 유속 10 L/min, 분무기 압력 60 psi, 건성 가스 온도 350 ℃, 모세관 전압 3500 v, m/z 스캔 범위 400-1200 및 분절 진폭(fragment amplitude) 1.2-1.5 v에서 음이온 검출을 통한 HPLC-MSn 수행을 포함하는 질량 분광 분석시,
    931, 945, 799, 1107, 769, 769, 783, 637, 637, 945, 945, 781, 751, 751, 765, 783, 783, 765 및 765 [M-H]-의 준분자 이온 질량 피크(m/z)를 가지는 성분들을 더 포함하며,
    931 [M-H]-의 성분은 799[M-H-Xyl]-, 637[M-H-Xyl-Glc]-, 및 475[M-H-Xyl-2Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    945 [M-H]-의 성분은 799[M-H-Rham]-, 783[M-H-Glc]-, 637[M-H-Rham-Glc]-, 및 475[M-H-Rham-2Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    799 [M-H]-의 성분은 637[M-H-Glc]-, 및 475[M-H-2Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    1107 [M-H]-의 성분은 945[M-H-Glc]-, 783[M-H-2Glc]-, 621[M-H-3Glc]-, 및 459[M-H-4Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    769 [M-H]-의 성분은 637[M-H-Xyl]-, 및 475[M-H-Xyl-Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    769 [M-H]-의 성분은 637[M-H-Xyl]-, 및 475[M-H-Xyl-Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    783 [M-H]-의 성분은 637[M-H-Rham]-, 및 475[M-H-Rham-Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    637 [M-H]-의 성분은 475[M-H-Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    637 [M-H]-의 성분은 475[M-H-Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    945 [M-H]-의 성분은 783[M-H-Glc]-, 621[M-H-2Glc]-, 및 459[M-H-3Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    945 [M-H]-의 성분은 783[M-H-Glc]-, 621[M-H-2Glc]-, 및 459[M-H-3Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    781 [M-H]-의 성분은 619[M-H-Glc]-, 및 457[M-H-2Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    751 [M-H]-의 성분은 619[M-H-Xyl]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    751 [M-H]-의 성분은 619[M-H-Xyl]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    765 [M-H]-의 성분은 619[M-H-Rham]-, 및 457[M-H-Rham-Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    783 [M-H]-의 성분은 621[M-H-Glc]-, 및 459[M-H-2Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    783 [M-H]-의 성분은 621[M-H-Glc]-, 및 459[M-H-2Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    765 [M-H]-의 성분은 603[M-H-Glc]-, 및 441[M-H-2Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지며;
    765 [M-H]-의 성분은 603[M-H-Glc]-, 및 441[M-H-2Glc]-의 분절 이온(m/z)을 가지는 것을 특징으로 하는, 한약 조제물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 조제물은 살비아놀산(Salvianolic acid) D, 살비아놀산 E, 로즈마린산, 살비아놀산 B, 살비아놀산 G, 살비아놀산 A, 단센수(Danshensu), 프로토카테추알데하이드(Protocatechualdehyde), 이소리토스페름산(isolithospermic acid) A, 이소리토스페름산 B, 탄시논(Tanshinone) I, 탄시논 IIA, 노토진세노사이드(Notoginsenoside) R1, 진세노사이드 Re, 진세노사이드 Rg1, 진세노사이드 Rb1, 노토진세노사이드 R2, 노토진세노사이드 R2 이소., 진세노사이드 Rg2, 진세노사이드 Rh1, 진세노사이드 Rh1 이소., 진세노사이드 Rd, 진세노사이드 Rd 이소., 진세노사이드 Rf-H2O, 노토진세노사이드 R2-H2O, 진세노사이드 Rg6 또는 F4, 진세노사이드 20(R)-Rg3, 진세노사이드 20(S)-Rg3, 진세노사이드 Rk1, 진세노사이드 Rg5, 진세노사이드 Rk3, 및 진세노사이드 Rh4를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 한약 조제물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 조제물은 HPLC 스펙트럼에서 총 피크 면적에 대한 단일 피크의 면적 비가 2% 보다 높은 8개의 피크를 가지며, 이들 8개의 피크의 평균 체류 시간은 각각 6.04, 9.90, 16.89, 17.84, 20.31, 23.74, 27.73 및 31.02이고, 체류 시간의 RSD%는 각각 0.31, 0.25, 0.61, 0.70, 0.96, 0.76, 0.50 및 1.18이고, 평균 피크 면적은 각각 1627.92, 2575.54. 366.89, 381.40, 186.08, 555.35, 281.91 및 1852.33이고, 피크 면적의 RSD%는 각각 5.91, 13.53, 10.92, 13.81, 12.04, 10.48, 18.08 및14.84이고, 총 피크 면적에 대한 단일 피크 면적 비는 각각 19.6%-22.0%, 28.5-37.4%, 4.2%-5.2%, 4.2%-5.5%, 2.1%-2.7%, 6.4%-7.8%, 3.0%-4.3% 및 20.2%-27.2%인, 물리 화학적 파라미터를 가지며,
    상기 물리 화학적 파라미터는
    (1) 필터: 옥타데실실릴-실리카 겔, 유속: 1.000 ml/min 및 검출 파장: 280 nm의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에서
    (2) 이동상 A: 0.02% 인산 수용액, 이동상 B: 80% 아세토니트릴-0.02% 인산 수용액, 및 농도 구배 용출: 0에서 8분까지 이동상 A는 90%에서 78%로, 이동상 B는 10%에서 22%로 일정하게 농도를 변화시키고, 8분부터 15분까지 이동상 A는 78%에서 74%로, 이동상 B는 22%에서 26%로 농도를 변화시키고, 15분부터 55분까지 이동상 A는 74%에서 48%로, 이동상 B는 26%에서 52%로 변화시킴으로써 용출시켜 결정하며, 및
    상기 고성능 액체 크로마토그래피에서 샘플 용액은 한약 조제물 10환의 무게 를 정확하게 측정하여 10 ml의 측정 병에 넣는 단계, 상기 조제물을 용해시키기에 충분한 함량의 증류수를 첨가하여 15분간 초음파 처리하면서 교반하는 단계, 증류수를 추가로 첨가하여 총 부피를 10 ml로 조절하는 단계, 제조된 용액을 원심 분리 또는 여과하여 샘플 용액을 수득하는 단계, 샘플 용액 10 ㎕을 HPLC 시스템에 주입하는 단계, 및 샘플 용액을 HPLC하여 HPLC 스펙트럼을 수득하는 단계를 따라 제조 및 분석되는 것을 특징으로 하는, 한약 조제물.
  8. 제 7항에 있어서, 평균 체류 시간이 6.04, 9.90, 16.89, 17.84, 20.31, 23.74, 27.73 및 31.02인 상기 8개의 피크는 각각 단센수, 프로토카테추알데하이드, 이소리토스페름산 A, 이소리토스페름산 B, 살비아놀산 D, 로즈마린산, 살비아놀산 B 및 살비아놀산 A인 것을 특징으로 하는, 한약 조제물.
  9. 단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae)과 삼칠(Radix Notoginseng)의 무게를 측정하는 단계;
    상기 약재 총 무게에 대해 0.5 내지 4.0 중량%로, 소듐 하이드록사이드, 소듐 바이카보네이트, 소듐 카보네이트, 포타슘 하이드록사이드, 포타슘 바이카보네이트, 포타슘 카보네이트 또는 이들의 혼합물을 첨가하는 단계;
    상기 제조되는 혼합물을 3-6배의 물에서 2-4회 달이는 단계;
    상기 혼합물을 여과하고, 모은 여과물을 농축하는 단계;
    상기 제조되는 농축물에 에탄올 함량이 65-70%가 되도록 70% 이상의 에탄올 을 첨가하는 단계;
    상기 제조되는 혼합물을 정치하여 상층액을 분리하는 단계;
    상기 상층액으로부터 에탄올을 제거하고, 상대 밀도가 1.20 - 1.50이 될때까지 단삼-삼칠 추출물인 잔사를 농축하는 단계;
    상기 추출물에 보르네올 또는 강진향(Lignum Dalbergiae Odoriferae) 오일을 혼합하는 단계; 및
    상기 제조되는 혼합물에 부형제를 첨가하여 조제물을 수득하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제 1항 내지 8항중 어느 한항에 따른 한약 조제물의 제조 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 부형제는 전분, 덱스트린, 락토스, 미세결정형 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 마그네슘 스테아레이트, 미세 실리콘 젤, 자일리톨, 락티톨, 글루코스, 글리신, 만니톨, 메틸 전분 소듐, 가교된 소듐 카르복실 메틸 셀룰로스, 가교된 폴리비닐피롤리돈 또는 수중의 가교된 폴리비닐피롤리돈, 또는 이들 두가지 이상으로 이루어진 혼합물이고,
    상기 조제물은 주사제, 정제, 서방성 정제, 드롭 환제, 과립제, 주사용 분말, 캡슐제, 미세과립제 또는 경구 붕괴제의 투여 형태인 것을 특징으로 하는, 한약 조제물의 제조 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 조제물은 드롭 환제의 투여 형태인 것을 특징으로 하는, 한약 조제물의 제조 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    단삼(Radix Salviae Miltiorrhizae)과 삼칠(Radix Notoginseng)의 무게를 측정하는 단계;
    상기 약재의 총 무게에 대해 0.5 내지 4.0 중량%의 소듐 바이카보네이트를 첨가하는 단계;
    제조되는 혼합물을 4-5배의 물에서 2-3시간 동안 달인 후, 3-4배의 물에서 1-2시간 달이는 단계;
    상기 혼합물을 여과하고, 비중이 1.16 - 1.20이 될때까지 모은 여과물을 농축하는 단계;
    상기 제조되는 농축물에 에탄올 함량이 65-70%가 되도록 70% 이상의 에탄올을 첨가하는 단계;
    상기 혼합물을 8-12시간 동안 정치시켜 상층액을 분리하는 단계;
    상기 상층액으로부터 에탄올을 제거하고, 단삼-삼칠 추출물인 잔사의 상대 밀도가 1.32 - 1.40이 될때까지 농축시키는 단계;
    상기 잔사에 보르네올 또는 강진향(Lignum Dalbergiae Odoriferae) 오일, 및 폴리에틸렌 글리콜 6000을 균일하게 혼합하는 단계;
    상기 제조되는 혼합물에 열을 가하여 용해시키는 단계;
    상기 제조되는 용해물을 차가운 액체 파라핀 또는 메틸 실리콘 오일에 드롭- 환 장치를 이용하여 점적하는 단계;
    제조되는 드롭 환제를 수거하고 오일 잔류물을 제거하는 단계; 및
    환제를 체질하여 원하는 조제물을 수득하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 한약 조제물의 제조 방법.
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