RU2359692C2

RU2359692C2 - Лекарственный препарат для лечения заболеваний кардиоцеребральных кровеносных сосудов и способ его изготовления

Info

Publication number: RU2359692C2
Application number: RU2006136529/15A
Authority: RU
Inventors: Ийу ЧЕНГ (CN); Ийу ЧЕНГ; Хайджианг ЖАНГ (CN); Хайджианг ЖАНГ; Женглианг Е. (CN); Женглианг Е.
Original assignee: Тяньджин Тасли Фармасьютикел Ко., Лтд.
Priority date: 2004-03-17
Filing date: 2005-03-17
Publication date: 2009-06-27
Also published as: NO20064572L; PL1741439T3; US7396545B2; MXPA06010597A; CN1669573A; JP5567763B2; UA88162C2; KR20070027532A; EP1741439A1; CA2559826A1; WO2005087242A1; NO345093B1; US20070071834A1; ES2635869T3; AP2644A; AP2006003788A0; CN100450501C; HUE036016T2; AU2005221260A1; LT1741439T

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к лекарственному препарату для лечения кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваний. Лекарственный препарат для лечения кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваний, содержащий изолитоспермовые кислоты А и В, которые характеризуются в масс-спектрах определенными пиками. Способ изготовления лекарственного препарата, включающий взвешивание Radix Salviae Miltiorrhizae и Radix Notoginseng; добавление гидроокиси натрия, бикарбоната натрия, карбоната натрия, гидроокиси калия, бикарбоната калия, карбоната калия или их смеси в определенном количестве; кипячение смеси в 3-6-кратном количестве воды 2-4 раза; фильтрацию смеси и концентрирование объединенных фильтратов; добавление этанола, отстаивание смеси и отделение надосадочной жидкости; выделение этанола из надосадочной жидкости и концентрирование остатка с получением экстракта Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng', смешивание полученного экстракта с борнеолом или маслом Lignum Dalbergie Odoriferae (дальбергии пахучей); и добавление эксципиента. Вышеописанный препарат эффективен для лечения кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваний. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 6 ил., 7 табл.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к медицине и, в частности, к традиционному китайскому лекарственному препарату для лечения кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваний.

Предпосылки создания изобретения

Кардиоваскулярные и цереброваскулярные заболевания являются распространенными болезнями, которые причиняют большой вред здоровью людей. В последнее время такие болезни возникают все чаще вследствие изменения условий работы, жизни, питания, окружающей среды и т.п. с развитием общества. Традиционная китайская медицина (ТСМ), несмотря на низкую активность по отношению к одной мишени по сравнению с западной медициной, характеризуется множественными способами применения и мишенями, динамическим и холистическим лечением и незначительными побочными эффектами и значительно превосходит по действию западную медицину. Лекарственный препарат ТСМ с определенным терапевтическим действием обладает общим терапевтическим эффектом, превосходящим действие препаратов западной медицины. В настоящее время существует множество препаратов ТСМ для лечения кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваний, таких как таблетки Danshen и препараты ТСМ на его основе, капли и пилюли на основе Guanxin Danshen, таблетки Xinkeshu и др. Эти препараты ТСМ, все содержащие Radix Salviae Miltiorrhizae (известный также как danshen) и Radix Notoginseng, обладают различными терапевтическими эффектами благодаря разным составам, соотношению ингредиентов, способам экстракции и очистки или дозированным формам. Кроме того, качество этих препаратов трудно контролировать, так как в настоящее время не существует эффективных качественных методов для полной характеристики физических и химических свойств этих препаратов, и сложные биологически активные ингредиенты в этих препаратах характеризуются только одним или двумя соединениями, такими как Danshensu или Tanshinone IIA (таншинон IIA). Следовательно, существует необходимость в усовершенствовании способа экстракции и очистки таких препаратов ТСМ, а также способа контроля их качества.

Сущность изобретения

Цель данного изобретения состоит в создании более эффективного препарата ТСМ для лечения кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваний. Кроме того, предусмотрен способ, позволяющий довольно полно и точно определить физические и химические характеристики препарата.

Другая цель данного изобретения заключается в создании способа получения вышеуказанного препарата ТСМ.

Цели данного изобретения достигаются следующим образом.

Препарат ТСМ согласно данному изобретению может быть получен способом, включающим следующие стадии:

смешивание Radix Salviae Miltiorrhizae (шалфея многокорневищного) и Radix Notoginseng (женьшеня нотогинзенг) с гидроокисью натрия, бикарбонатом натрия, гидроокисью калия, бикарбонатом калия, карбонатом калия или их смесью в количестве 0,5 - 4% в расчете на общий вес указанных лекарственных веществ с получением смеси;

кипячение смеси в 3-6-кратном количестве воды 2-4 раза;

фильтрацию смеси и концентрирование объединенных фильтратов;

добавление этанола с высокой концентрацией (более 70%) в количестве, достаточном для получения содержания этанола, равного 65-70%;

отстаивание смеси и отделение надосадочной жидкости;

выделение этанола из надосадочной жидкости и концентрирование остатка до тех пор, пока его относительная плотность не станет равной 1,20-1,50 (55-60°С) с получением экстракта Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng;

смешивание полученного экстракта с борнеолом или маслом Lignum Dalbergie

Odori ferae (дальбергии пахучей); и

добавление одного или более фармакологических эксципиентов, таких как крахмал, декстрин, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза, гидроксипропил-метилцеллюлоза, полиэтиленгликоль, стеарат магния, микрогель силикона, ксилит, лактит, глюкоза, глицин, маннит, натриевая соль метилированного крахмала, сшитая натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, сшитый поливинилпирролидон и т.д., и получение из этой смеси различных дозированных форм, таких как таблетки, полученные литьем под давлением, таблетки с пролонгированным действием, капельные пилюли, гранулы, порошок для инъекций, капсулы, микрогранулы, оральные дезинтегранты. Предпочтительно вышеуказанный препарат ТСМ получать способом, включающим следующие стадии:

взвешивание Radix Salviae Miltiorrhizae и Radix Notoginseng;

добавление бикарбоната натрия в количестве 1,4-1,9% в расчете на общий вес лекарственных веществ с получением смеси;

кипячение смеси в 4-5-кратном количестве воды в течение 2-3 часов и затем в 3-4-кратном количестве воды в течение 1-2 часов;

фильтрацию смеси и концентрирование соединенных фильтратов до тех пор, пока не достигается величина удельного веса, равная 1,16-1,20 (80±5°С);

добавление этанола с высокой концентрацией (выше 70%) в количестве, достаточном для получения содержания этанола, равного 65-70% (20°С);

выдерживание смеси в течение 8-12 часов и отделение надосадочной жидкости;

выделение этанола из надосадочной жидкости и концентрирование остатка до получения величины относительной плотности, равной 1,32-1,40 (55-60°С) с образованием экстракта Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng;

смешивание указанного экстракта с борнеолом или маслом Lignum Dalbergie Odoriferae; и

добавление одного или более фармакологических эксципиентов, выбранных из группы, состоящей из крахмала, декстрина, лактозы, микрокристаллической целлюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, полиэтиленгликоля, стеарата магния, микрогеля силикона, ксилита, лактита, глюкозы, глицина, маннита, натриевой соли метилированного крахмала, сшитой натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, сшитого поливинилпирролидона и т.д., и получения из этой смеси таблеток, пилюль, порошка для инъекций, капсул, гранул, микрогранул или оральных дезинтегрантов.

Используемый борнеол может быть природным или синтетическим. Масло Lignum Dalbergie Odoriferae, используемое в данном изобретении, получают перегонкой Lignum Dalbergie Odoriferae.

Вышеуказанный препарат ТСМ, предпочтительно, получают в виде дозированной формы пилюль.

Препарат ТСМ по настоящему изобретению характеризуется следующими физическими и химическими параметрами:

на хроматограмме (ЖХВР) имеются 8 пиков, для которых характерно отношение площади единичного пика к общей площади пиков, превышающее 2%; среднее время удерживания для этих 8 пиков равно 6,04, 9,90, 16,89, 17,84, 20,31, 23,74, 27,73 и 31,02 соответственно, и RSD% (стандартное отклонение времени удерживания) составляет 0,31, 0,25, 0,61, 0,70, 0,96, 0,76, 0,50 и 1,18 соответственно; средняя величина площади пиков равна 1627,92, 2575,54, 366,89, 381,40, 186,08, 555,35, 281,91 и 1852,33 соответственно; и RSD% от величины площади пиков равно 5,91, 13,59, 10,92, 13,81, 12,04, 10,48, 18,08 и 14,84 соответственно; и отношение площади каждого единичного пика к общей площади пиков составляет 19,6-22,0%, 28,5-37,4%, 4,2-5,2%, 4,2-5,5%, 2,1-2,7%, 6,4-7,8%, 3,0-4,3% и 20,2-27,2% соответственно.

Указанные физические и химические параметры получали при следующих условиях.

(1) Жидкостная хроматография высокого разрешения

Как наполнитель для хроматографической колонки применяли октадецилсилил-силикагель, скорость истечения составляла 1,000 мл/мин при длине волны 280 нм. Элюирование осуществляли при следующих условиях: мобильной фазой А являлся 0,02% водный раствор фосфорной кислоты, мобильной фазой В - 80% ацетонитрила - 0,02% водный раствор фосфорной кислоты; мобильная фаза А менялась равномерно от 90 до 78% и мобильная фаза В менялась равномерно от 10 до 22% в течение 0-8 мин; мобильная фаза А менялась от 78 до 74%, а мобильная фаза В - от 22 до 26% в течение 8-15 мин; мобильная фаза А менялась от 74 до 48% и мобильная фаза В - от 26 до 52% в течение 15-55 мин.

(2) Приготовление и анализ образца раствора

Точно взвешивали 10 пилюль препарата ТСМ по изобретению, затем помещали их в сосуд объемом 10 мл. Добавляли дистиллированную воду в количестве, достаточном для растворения пилюль при встряхивании и действии ультразвука в течение 15 мин. Затем для достижения объема, равного 10 мл, добавляли снова дистиллированную воду. Полученный раствор центрифугировали или фильтровали для получения образца раствора. 10 мкл образца раствора впрыскивали в колонку для ЖХВР и затем осуществляли ЖХВР для получения спектров ЖХВР. При помощи сравнения со стандартным образцом и масс-спектрами были идентифицированы вышеописанные 8 пиков со средним временем удерживания 6,04, 9,90, 16,89, 17,84, 20,31, 23,74, 27,73 и 31,02, которые соответствуют Danshensu, протокатехиальдегиду, изолитоспермовой кислоте А, изолитоспермовой кислоте В, сальвианоловой кислоте D, розмариновой кислоте, сальвианоловой кислоте В и сальвианоловой кислоте А соответственно (см. Фиг.1).

При помощи метода ЖХВР-МС был определен состав препарата ТСМ согласно изобретению, он содержит Danshensu, протокатехиальдегид, изолитоспермовую кислоту А, изолитоспермовую кислоту В, сальвианоловую кислоту D, сальвианоловую кислоту Е, розмариновую кислоту, сальвианоловую кислоту В, сальвианоловую кислоту G, сальвианоловую кислоту А, таншинон I, таншинон II, нотогинсенозид R₁, гинсенозид Re, гинсенозид Rg 1, гинсенозид Rb 1, нотогинсенозид R2, нотогинсенозид R2-изо, гинсенозид Rg 2, гинсенозид Rh 1, гинсенозид Rh1-изо, гинсенозид Rd, гинсенозид Rd-изо, гинсенозид Rf-H-20, нотогинсенозид R2-H20, гинсенозид Rg6 или F4, гинсенозид Rk3, гинсенозид (Rh4), гинсенозид 20(R)-Rg3, гинсенозид 20(S)-Rg3, гинсенозид (Rk1), гинсенозид (Rg5) и т.п.

1. Danshensu	MB = 198
2. Протокатехиальдегид	MB = 138
3. Сальвианоловая кислота A	MB = 494
4. Сальвианоловая кислота В	MB = 718
5. Сальвианоловая кислота С	MB = 492
6. Сальвианоловая кислота D	MB = 418
7. Сальвианоловая кислота Е	MB = 718
8. Сальвианоловая кислота G	MB = 340
9. Изолитоспермовая кислота A	MB = 538
10. Изолитоспермовая кислота В	MB = 538
11. Розмариновая кислота	MB = 360

Структура типа А	Гинсенозид	R₁			R₂		Молекулярный вес (MB)
	Гинсенозид Rb₁	Glc-Glc			Glc-Glc		1108
	Гинсенозид Rd	Glc-Glc			Glc		946
	Гинсенозид Rg₃	Glc-Glc			H		784
	Гинсенозид F₂	Glc			Glc		784

Структура типа В	Гинсенозид		R₁	R₂		R₃		MB
	Гинсенозид Re		Н	Glc		O-Glc-Rham		946
	Гинсенозид Rf		Н	Н		O-Glc-Glc		800
	Гинсенозид Rg₁		Н	Glc		O-Glc		800
	Гинсенозид Rg₂		Н	Н		O-Glc-Rham		784
	Гинсенозид Rh₁		Н	Н		O-Glc		638
	Нотогинсенозид R₂		Н	Н		O-Glc-Xyl		770
	Нотогинсенозид R₁		Н	Glc		O-Glc-Xyl		932
	Гинсенозид F₁		Н	Glc		ОН		638

Структура типа С	Гинсенозид	R₁	R₂	MB
	Гинсенозид Rg₅	Glc-Glc-	Н	766
	Гинсенозид Rh₄	Н	Glc-O-	620
	Гинсенозид F₄	Н	Rham-Glc-O-	766

Структура типа D	Гинсенозид	R₁	R₂	MB
	Гинсенозид Rg₆	Н	Rham-Glc-O-	766
	Гинсенозид Rk₁	Glc-Glc	H	766
	Гинсенозид Rk₃	Н	Glc-O-	620
Glc = β-D-глюкоза Rham = α-L-рамноза Xyl = β-D-ксилоза

В процессе экстракции и при проведении анализа согласно изобретению для полной характеристики физических и химических свойств Radix Salviae Miltiorrhizae и Radix Notoginseng в препарате ТСМ применяли атлас фингерпринтинга. По сравнению с уровнем техники, когда сложные биологически активные ингредиенты в препаратах ТСМ характеризуются только одним или двумя соединениями, данный метод подходит гораздо больше для контроля качества препаратов ТСМ.

Биологически активные ингредиенты в препаратах ТСМ по изобретению обнаруживали методом ЖХВР-МС. В результате всего были идентифицированы 12 компонентов в Radix Salviae Miltiorrhizae и 21 компонент в Radix Notoginseng. Соединения были идентифицированы, в основном, анализом данных МСⁿ при сравнении этих данных с литературными. Наконец, структура большого количества компонентов была полностью подтверждена путем сравнения с контрольными образцами. При этом можно сделать вывод, что метод анализа химического состава препарата ТСМ по изобретению с применением ЖХВР-МС дает возможность получить обширную информацию о структуре биологически активных ингредиентов. Характеристика физических и химических свойств Radix Salviae Miltiorrhizae и Radix Notoginseng в препарате ТСМ по изобретению с использованием этой информации является гораздо более полной, чем с помощью известных методов.

Следующие опыты показывают, что препарат ТСМ по изобретению является эффективным для лечения кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваний.

1. Действие препарата ТСМ на ишемию миокарда и инфаркт миокарда у анестезированной собаки.

Для характеристики ишемии миокарда и степени ее развития применяли эпикардиальную электрограмму. Для определения области инфаркта миокарда использовали количественную гистологию (метод N-BT окраски). Определялись также изменения в протекании крови в коронарной артерии, поглощение кислорода миокардом и активности СК и LDH в сыворотке и ЕТ, ТХВ₂ и 6-кето-PGF_1a в плазме крови. Действие препарата ТСМ по изобретению изучали при его алиментарном введении в отношении его действия на ишемию миокарда, инфаркт миокарда и связанные с этим показатели у испытуемых собак.

Результаты испытаний показывают, что препарат ТСМ по изобретению оказывает значительное действие на ослабление острой ишемии миокарда и инфаркта миокарда у собак. Это может привести к уменьшению ишемии (Σ-ST), показанному на эпикардиальной электрограмме (Р<0,001 относительно контрольной группы, получавшей физиологический раствор), к значительному уменьшению области инфаркта, о чем свидетельствует метод N-ST окраски (Р<0,01 относительно контрольной группы, получавшей физиологический раствор) и значительному повышению потока крови в коронарной артерии в ишемическом сердце (Р<0,001 относительно контрольной группы, получавшей физиологический раствор). Препарат ингибирует высвобождение сывороточной лактат-дегидрогеназы (LDH), возникающее вследствие ишемической болезни и инфаркта миокарда (величина относительного изменения отношения значительно ниже соответствующей величины у контрольной группы, получавшей физиологический раствор Р<0,001), а также увеличение активности креатин-фосфокиназы (СК) (величина относительного изменения отношения значительно ниже соответствующей величины у контрольной группы, получавшей физиологический раствор Р<0,05). Препарат действует также на величину ЕТ в плазме крови, снижая ее (Р<0,001 относительно контрольной группы, получавшей физиологический раствор), и уровень TXB₂ (Р<0,001 относительно контрольной группы, получавшей физиологический раствор, Р<0,05 у группы, получавшей препарат ТСМ) в плазме крови и улучшает отношение 6-кето-PGF_1a/ТХВ₂ (Р<0,001 относительно контрольной группы, получавшей физиологический раствор, Р<0,05 у группы, получавшей препарат ТСМ).

2. Действие препарата ТСМ на инфаркт миокарда, вызванный ишемической реперфузией.

При наблюдении за моделью крысы с повреждением миокарда, вызванным реперфузией, было установлено, что препарат ТСМ по изобретению может значительно уменьшить поражение миокарда, величину области инфаркта миокарда (р<0,05-0,01 относительно модельной группы) и привести к меньшему весу области, пораженной инфарктом (р<0,05 относительно модельной группы). Препарат также значительно повышал активность супероксида дисмутазы (SOD) (р<0,01 относительно модельной группы).

3. Действие препарата ТСМ на динамику течения потока крови и поглощения кислорода миокардом у собак.

Препарат ТСМ по изобретению оценивали в отношении его действия на динамику течения крови в сердце и поглощение кислорода миокардом у анестезированных собак.

Результаты показывают, что препарат ТСМ по изобретению может привести к значительно ускоренному протеканию крови в коронарной артерии (р<0,01-0,001 у группы до введения препарата и контрольной группы, получавшей физиологический раствор), расширенному коронарному сосуду, повышенному содержанию кислорода в коронарном венечном синусе (р<0,05-0,001 у группы до введения препарата и контрольной группы, получавшей физиологический раствор), уменьшенной величине индикатора поглощения кислорода миокардом, увеличению снабжения сердечной мышцы кровью и кислородом и к увеличенным объему на сердечное сокращение и минутному сердечному выбросу (р<0,05-0,01 у группы до введения препарата и контрольной группы, получавшей физиологический раствор) без ускорения работы левого желудочка.

Препарат ТСМ по изобретению регулирует работу сердца и, таким образом, способствует адаптации и улучшению функционирования сердечно-сосудистой системы.

4. Действие препарата ТСМ на агглютинацию тромбоцитов у кроликов.

Препарат ТСМ по изобретению оценивали при помощи нефелометрии Борна в отношении его действия на агглютинацию тромбоцитов у кроликов.

Результаты показывают, что препарат ТСМ при его внутрижелудочном введении в течение 7 последовательных дней приводит к значительному уменьшению агглютинации тромбоцитов у кроликов, вызванной арахидоновой кислотой (АА) (р<0,05-0,01 относительно контрольной группы, получавшей дистиллированную воду) и коллагеном (р<0,01 относительно контрольной группы, получавшей дистиллированную воду). Это показывает, что препарат ТСМ по изобретению обладает ингибирующим действием на агглютинацию тромбоцитов.

5. Влияние препарата ТСМ на тромбогенез in vitro и вязкость крови у крыс.

Препарат ТСМ по изобретению оценивали в отношении его действия на тромбогенез in vitro и вязкость крови у крыс.

Результаты показывают, что препарат ТСМ при внутрижелудочном введении в течение 7 последовательных дней приводит к значительно меньшему тромбу (р<0,01 относительно контрольной группы, получавшей дистиллированную воду), снижению мокрого и сухого веса тромба (р<0,05 относительно контрольной группы, получавшей дистиллированную воду), к пониженной вязкости плазмы крови (р<0,001 относительно контрольной группы, получавшей дистиллированную воду) и пониженной вязкости всей крови при различных скоростях сдвига (р<0,05 относительно контрольной группы, получавшей дистиллированную воду). Это показывает, что препарат ТСМ по изобретению способен ингибировать тромбогенез и снижает вязкость плазмы крови и всей крови.

6. Действие препарата ТСМ на гиперлипидемию и атеросклероз у кроликов.

Модель для изучения гиперлипидемии и атеросклероза (AS) была получена при питании кролика кормом с высоким содержанием холестерина. Препарат ТСМ по изобретению оценивали по его действию на эту модель.

Результаты показывают, что препарат ТСМ по изобретению приводит к значительно пониженным концентрациям ТС, TG, LDL-C, VLDL-C в сыворотке и к пониженному отношению TC/HDL-C (р<0,05-0,001 относительно контрольной группы, страдающей от гиперлипидемии) у кроликов, к значительно увеличившейся концентрации HDL-C (р<0,05 относительно контрольной группы, страдающей от гиперлипидемии), к уменьшенному содержанию ТС в аорте (р<0,05 относительно контрольной группы, страдающей от гиперлипидемии), к уменьшенному содержанию TG в печени (р<0,05 относительно контрольной группы, страдающей от гиперлипидемии) и к уменьшенному содержанию MDA в печени (р<0,001 относительно контрольной группы, страдающей от гиперлипидемии). Препарат ТСМ по изобретению значительно превышает активность SOD в печени (р<0,01 относительно контрольной группы, страдающей от гиперлипидемии).

Кроме того, он значительно уменьшает толщину тромбоцитов аорты и количество вспененных клеток, образовавшихся в аорте (р<0,05 относительно контрольной группы, страдающей от гиперлипидемии). Он также приводит к уменьшению площади тромбоцитов в аорте. Это свидетельствует о том, что препарат ТСМ по изобретению регулирует содержание жира в крови и в то же самое время оказывает определенное действие на антиперокисление липида и предотвращение артериосклероза.

7. Действие препарата ТСМ на локализованную церебральную ишемию у крыс.

Оценивали препарат ТСМ по изобретению в отношении его действия на величину площади церебрального инфаркта у крыс МСАТ с применением модели крысы с умеренным тромбозом церебральной артерии (МСАТ).

Результаты показывают, что препарат ТСМ по изобретению действует на антицеребральную ишемию.

Краткое описание фигур

На Фиг.1 представлен атлас отпечатков компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae в пилюлях, являющихся одной из дозированных форм препарата ТСМ по изобретению. На этой Фигуре пик 1 соответствует Danshensu; пик 2 представляет протокахиальдегид, пик 3 представляет изолитоспермовую кислоту А, пик 4 соответствует изолитоспермовой кислоте В, пик 5 соответствует сальвианоловой кислоте D, пик 6 соответствует розмариновой кислоте, пик 7 представляет сальвианоловую кислоту В и пик 8 соответствует сальвианоловой кислоте А.

На Фиг.2 показан ЖХВР спектр водорастворимых компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ по изобретению. На этой Фигуре пик 1 соответствует Danshensu; пик 2 представляет протокахиальдегид, пик 3 представляет изолитоспермовую кислоту А, пик 4 соответствует изолитоспермовой кислоте В, пик 5 соответствует сальвианоловой кислоте D, пик 6 соответствует сальвианоловой кислоте Е, пик 7 представляет розмариновую кислоту, пик 8 соответствует сальвианоловой кислоте В, пик 9 соответствует сальвианоловой кислоте G и пик 10 соответствует сальвианоловой кислоте А.

На Фиг.3 представлен MS-TIC-спектр водорастворимых компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ по изобретению.

На Фиг.4 представлен ЖХВР спектр липорастворимых компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ по изобретению. На этой Фигуре пик 1 соответствует ташинону I, а пик 2 соответствует ташинону IIA.

На Фиг.5 представлен MS-TIC-спектр липорастворимых компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ по изобретению.

На Фиг.6 представлен MS-TIC-спектр компонентов и Radix Notoginseng по изобретению.

Подробное описание вариантов изобретения

Данное изобретение далее будет подробно описано со ссылкой на нижеследующие примеры. Эти примеры служат для иллюстрации и не ограничивают объем изобретения.

Примеры

Пример 1 (препаративный пример)

41,06 г Radix Salviae Miltiorrhizae и 8,03 г Radix Notoginseng взвешивали, к этой смеси добавляли бикарбонат натрия в количестве 1,8% от общего веса указанных лекарственных веществ. Полученную смесь кипятили в 4-кратном количестве воды в течение 2 ч и затем в 3-кратном количестве воды еще 1 ч. После фильтрации соединенные фильтраты концентрировали до получения удельного веса, равного 1,19-1,20 (75±1°С). Затем добавляли 95%-ный этанол в количестве, достаточном до получения содержания этанола, равного 65% (20°С). Затем смесь выдерживали 12 ч и отделяли надосадочную жидкость. Этанол выделяли из надосадочной жидкости, а остаток концентрировали до достижения относительной плотности, равной 1,37 (55-60°С), получали экстракт Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng.

Этот экстракт равномерно смешивали с 0,46 г борнеола и 18 г полиэтиленгликоля-6000. Смесь расплавляли при температуре 85°С в течение 80 мин. Затем расплавленную жидкость вводили в приемник машины для изготовления капельных пилюль, причем температура в приемнике поддерживалась равной 86°С, в машине жидкость капала в жидкий парафин при 8°С. Полученные «капельные пилюли» вынимали, удаляли с них масло и затем просеивали через сито с получением желаемого препарата.

Пример 2 (препаративный пример)

59,36 г Radix Salviae Miltiorrhizae и 6,38 г Radix Notoginseng взвешивали, к этой смеси добавляли бикарбонат калия в количестве 1,0% в расчете на общий вес указанных лекарственных веществ. Полученную смесь кипятили в 4-кратном количестве воды в течение 2,5 ч и затем в 3-кратном количестве воды еще 1,5 ч. После фильтрации соединенные фильтраты концентрировали до получения удельного веса, равного 1,19-1,20 (75±1°С). Затем добавляли 85%-ный этанол в количестве, обеспечивающем содержание этанола, равное 70% (20°С). Затем смесь выдерживали 10 ч и отделяли надосадочную жидкость. Этанол выделяли из надосадочной жидкости, а остаток концентрировали до достижения относительной плотности, равной 1,35 (55-60°С), получали экстракт Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng.

Этот экстракт равномерно смешивали с 0,34 г борнеола и 23 г полиэтиленгликоля-6000. Полученную смесь расплавляли при температуре 89°С в течение 100 мин. Затем расплав вводили в приемник машины для изготовления капельных пилюль, причем в приемнике поддерживали температуру, равную 85°С, жидкость капала в метилсиликоновое масло с температурой 8°С. Полученные «капельные пилюли» вынимали, удаляли с них масло и затем просеивали через сито с получением желаемого препарата.

Пример 3 (препаративный пример)

Взвешивали 12,6 г Radix Salviae Miltiorrhizae и 56,15 г Radix Notoginseng, добавляли бикарбонат калия в количестве 1,0% в расчете на общий вес указанных лекарственных веществ. Полученную смесь кипятили в 4-кратном количестве воды в течение 2,5 ч и затем в 3-кратном количестве воды еще 1,5 ч. После фильтрации соединенные фильтраты концентрировали до получения удельного веса, равного 1,19-1,20 (75±1°С). Затем добавляли 95%-ный этанол в количестве, достаточном для получения содержания этанола, равного 70% (20°С). Затем смесь выдерживали 10 ч и отделяли надосадочную жидкость. Этанол отделяли от надосадочной жидкости и остаток концентрировали до достижения относительной плотности, равной 1,35 (55-60°С), получали экстракт Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng.

Пример 4 (препаративный пример)

Взвешивали 31,12 г Radix Salviae Miltiorrhizae и 9,21 г Radix Notoginseng, добавляли гидроокись натрия в количестве 0,5% в расчете на общий вес указанных лекарственных веществ. Полученную смесь кипятили в 4-кратном количестве воды в течение 1,5 ч и затем в 3- кратном количестве воды еще 1,5 ч. После фильтрации соединенные фильтраты концентрировали до получения удельного веса, равного 1,19-1,20 (75±1°С). Затем добавляли 88%-ный этанол в количестве, достаточном для получения содержания этанола, равного 66% (20°С). Затем смесь выдерживали 10 ч и отделяли надосадочную жидкость. Этанол отделяли от надосадочной жидкости и остаток концентрировали до достижения относительной плотности, равной 1,40 (55-60°С), получали экстракт Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng.

Этот экстракт равномерно смешивали с 0,50 г борнеола, 90 г маннита, 15 г кальцийэдетата натрия и 15 мл дистиллированной воды. Полученную смесь подвергали лиофилизации и получали из нее порошок для инъекции.

Пример 5 (препаративный пример)

Взвешивали 116,35 г Radix Salviae Miltiorrhizae и 58,21 г Radix Notoginseng, добавляли бикарбонат натрия в количестве 2,0% в расчете на общий вес указанных лекарственных веществ. Полученную смесь кипятили в 4-кратном количестве воды в течение 2 ч и затем в 3- кратном количестве воды в течение 1,5 ч. После фильтрации соединенные фильтраты концентрировали до получения удельного веса, равного 1,19-1,20 (75±1°С). Затем добавляли 88%-ный этанол в количестве, достаточном для получения содержания этанола, равного 66% (20°С). Затем смесь выдерживали 10 ч и надосадочную жидкость отделяли. Этанол отделяли от надосадочной жидкости и остаток концентрировали до достижения относительной плотности, равной 1,40 (55-60°С), получали экстракт Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng.

Полученный экстракт равномерно смешивали с 1,80 г масла Lignum Dalbergie Odoriferae и 40 г микрокристаллической целлюлозы. Для умягчения массы добавляли 3%-ный раствор повидона в этаноле. Полученную массу продавливали через сито 18 меш с получением гранул. Гранулы сушили при температуре 60°С в течение 35 минут, удаляли заусенцы и затем равномерно смешивали с 4 г порошкообразного талька. Полученную смесь инкапсулировали с получением желаемого препарата.

Пример 6 (препаративный пример)

Взвешивали 116,35 г Radix Salviae Miltiorrhizae и 58,21 г Radix Notoginseng, добавляли бикарбонат натрия в количестве 2,0% в расчете на общий вес указанных лекарственных веществ. Полученную смесь кипятили в 4-кратном количестве воды в течение 2 ч и затем в 3- кратном количестве воды в течение 1,5 ч. После фильтрации соединенные фильтраты концентрировали до достижения удельного веса, равного 1,19-1,20 (75±1°С). Затем добавляли 88%-ный этанол в количестве, достаточном для получения содержания этанола, равного 66% (20°С). Затем смесь выдерживали 10 ч и отделяли надосадочную жидкость. Этанол отделяли от надосадочной жидкости, остаток концентрировали до достижения относительной плотности, равной 1,40 (55-60°С), получали экстракт Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng.

Полученный экстракт равномерно смешивали с 0,90 г борнеола, 120 г микрокристаллической целлюлозы, 40 г гидроксипропилметилцеллюлозы, 5 г ксилита и 2 г стеарата магния. Полученную смесь прессовали с получением таблеток желаемого препарата.

Пример 7 (препаративный пример)

Взвешивали 140,35 г Radix Salviae Miltiorrhizae и 36,42 г Radix Notoginseng, добавляли бикарбонат натрия в количестве 2,5% в расчете на общий вес указанных лекарственных веществ. Полученную смесь кипятили в 4-кратном количестве воды в течение 2 ч и затем в 3- кратном количестве воды в течение 1,5 ч. После фильтрации соединенные фильтраты концентрировали до достижения удельного веса, равного 1,19-1,20 (75±1°С). Затем добавляли 90%-ный этанол в количестве, достаточном для получения содержания этанола, равного 65% (20°С). Затем смесь выдерживали в течение 8 ч и отделяли надосадочную жидкость. Этанол отделяли от надосадочной жидкости, остаток концентрировали до достижения относительной плотности, равной 1,35 (55-60°С), получали экстракт Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng.

Этот экстракт равномерно смешивали с 1,00 г борнеола и 46 г микрокристаллической целлюлозы. Для умягчения массы добавляли 3%-ный раствор повидона в этаноле. Полученную массу продавливали через сито 18 меш с получением гранул. Гранулы сушили при температуре 60°С в течение 30 минут, удаляли заусенцы и затем равномерно смешивали с 4 г порошкообразного талька. Полученную смесь прессовали с получением таблеток желаемого препарата.

Пример 8 (пример обнаружения активного компонента)

1. Приготовление образца

(1) Водорастворимые компоненты Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ по изобретению

Взвешивали по 148,4 мг капельных пилюль ТСМ из Примеров 1, 2, 3, порошков ТСМ для инъекции из Примера 4, капсул ТСМ из Примера 5, оральных распадающихся таблеток ТСМ из Примера 7. Эти навески растворяли в 6 мл воды в течение 15 мин при воздействии ультразвука и затем фильтровали через найлоновую пленку толщиной 0,45 мкм с получением образцов раствора желтого цвета.

(2) Компоненты Radix Notoginseng и липорастворимые компоненты в Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ по изобретению

Взвешивали по 1003,8 мг капельных пилюль ТСМ из Примеров 1, 2, 3, порошков ТСМ для инъекции из Примера 4, капсул ТСМ из Примера 5, оральных распадающихся таблеток ТСМ из Примера 7. Эти препараты растворяли в 10 мл 4%-ного водного раствора аммиака в течение 15 мин при воздействии ультразвука и затем фильтровали через найлоновую пленку толщиной 0,45 мкм. Фильтраты подвергали предварительной обработка на колонке Extract-Clean C₁₈ (Alltech Associates, Inc., US). Образцы после загрузки в колонку промывали 10 мл воды и затем элюировали 2 мл метанола с получением испытуемого образца в виде элюента желтого цвета.

2. Анализ образца

(1) Приборы и агенты

Хроматограф для жидкостной хроматографии Agilent Series-1100 (Agilent); Детектор G 1315А Diode Array; Автоматический инжектор образцов G 1313А; Термостат G 1316A; Диаэратор и сдвоенный насос G 1322A; Рабочая хроматографическая установка HP Instrument.

Масс-спектрограф Type G2445A Series 1100 LC-MSD/Trap (Bruker); ионизацию осуществляли методом электронапыления; колонка Extract-Clean C₁₈ (100 мг/мл, Alltech Associates, Inc., US); ацетонитрил был хроматографически чистым (TEDIA), вода была подвергнута перегонке дважды, уксусная кислота была аналитически чистой.

(2) Условия обнаружения

Для проведения ЖХВР использовали хроматографическую колонку Agilent Zorbax SB-C18 (5 мкм, 4,6 мм × 25 см, Agilent, SN: USCL 009296). Градиентное элюирование и масс-спектральное определение каждого образца проводили при следующих условиях:

(а) Водорастворимые компоненты Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ из каждого примера.

Условия элюирования в ходе ЖХВР:

Время (мин)	Мобильная фаза А (%)	Мобильная фаза В(%)	Мобильная фаза А: уксусная кислота:вода = 0,01:100 Мобильная фаза В: уксусная кислота:ацетонитрил = 0,01: 100 Скорость истечения: 0,5 мл/мин Температура: 30°С Длина волны детекции множественная длина волны (280 нм от указанной длины волны)
0	95 0	5,0
15	78,3	21,7
33	78,3	21,7
38	65,0	35,0

Условия проведения МС (MS):

	ЖХВР-МС	ЖХВР-МСⁿ
Способ ионизации	Отрицательные ионы
Скорость потока сухого газа (л/мин)	10	10
Давление в небулайзере (ф/дюйм²)	60	60
Температура (°С)	350	350
Напряжение капиллярное (В)	3500	3500
Область сканирования (m/z)	100-1200	100-800
Амплитуда (эВ)		1,5-3,0

(б) Компоненты Radix Notoginseng в препарате ТСМ в каждом примере.

Условия элюирования при ЖХВР:

Время (мин)	Мобильная фаза А(%)	Мобильная фаза В(%)	Мобильная фаза А: уксусная кислота:вода = 0,01:100 Мобильная фаза В: уксусная кислота:ацетонитрил = 0,01:100 Скорость истечения: 0,8 мл/мин Температура: 30°С Длина волны детекции многократная длина волны (203 нм от указанной длины волны)
0	80	20
15	65	35
25	65	35
40	87	43
50	54	46
65	42	58
75	25	75

Условия проведения МС:

	ЖХВР-МС	ЖХВР-МСⁿ
Способ ионизации	Отрицательные ионы
Скорость потока сухого газа (л/мин)	10	10
Давление в небулайзере (ф/дюйм²)	60	60
Температура (°С)	350	350
Напряжение капиллярное (В)	3500	3500
Область сканирования (m/z)	400-1500	400-1200
Амплитуда (эВ)		1,2-1,5

3. Анализ результатов и идентификация пиков

Компоненты были идентифицированы по двум аспектам: (1) используя контрольные образцы; (2) используя абсорбцию УФ и информацию об ионном фрагменте на основе данных МСⁿ (MSⁿ) в комбинации с литературными данными.

4. Результаты идентификации

(1) Водорастворимые компоненты Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате Radix Salviae Miltiorrhizae no каждому примеру согласно данному изобретению (см. Таблицы 1 и 2 и Фигуры 2 и 3).

Таблица 1
Данные по ЖХВР-МС и результаты идентификации
Пик №	Время удерживания	Пик квазимолекулярного иона m/z [M-H]^-	Идентичность	Длина волны макс. абсорбции, λ_max
1	12,73	197	Danshensu	280
2	19,69	137	Протокатехиальдегид	231, 280, 310
3	22,99	537	Изолитоспермовая кислота А	327
4	23,83	537	Изолитоспермовая кислота В	327
5	24,89	417	Сальвианоловая кислота D	247, 321
6	26,70	717	Сальвианоловая кислота Е	330
7	28,51	359	Розмариновая кислота	329
8	31,93	717	Сальвианоловая кислота В	254, 286, 309
9	34,86	339	Сальвианоловая кислота G	395
10	44,64	493	Сальвианоловая кислота А	288

Таблица 2
Данные ЖХВР-МСⁿ
Пик №	Идентичность	Ионный фрагмент
3	Изолитоспермовая кислота А	Второй (537): 493 [М-Н-СО₂]^-, 295 [M-CO₂-R-H₂O]^-, Третий (295): 159, 109
4	Изолитоспермовая кислота В	Второй (537): 493 [М-Н-CO₂]^-, 295 [M-CO₂-R-H₂O]^-, Третий (295): 159, 109
5	Сальвианоловая кислота D	Второй (417): 175 [M-CO₂-R-H₂O]^-, 373 [M-H-CO₂]^-, Третий (175): 147, 157, 133
6	Сальвианоловая кислота Е	Второй (717): 519 [M-R-H₂O]^-, 321 [M-2R-2H₂O]^-, Третий (519): 321 [M-R-H₂O]^-, 339 [M-R]^-, Третий (321): 279, 293, 249,223,185
7	Розмариновая кислота	Второй (359): 161 [M-R-H₂O]^-, 179 [M-R]-, 195
8	Сальвианоловая кислота В	Второй (717): 519 [M-R-H₂O]^-, 321 [M-2R-2H₂O]^-, Третий (519): 321 [M-R-H₂O]^-, 339 [M-R]^-, Четвертый (321): 279, 293, 249, 233, 185
9	Сальвианоловая кислота G	Второй (339): 321 [M-H-H₂O]^-, 295 [M-H-CO₂]^-, Третий (295): 279, 267 Четвертый (279): 251
10	Сальвианоловая кислота А	Второй (493): 295 [M-R-H₂O]^-, Третий(295): 159, 109

Из результатов MSⁿ видно, что второй и третий пики имеют очень сходные структуры литоспермовой кислоты. Однако в случае УФ-абсорбции эти пики значительно отличаются от литоспермовой кислоты. Литоспермовая кислота характеризуется сравнительно большой абсорбцией при длине волны примерно 253 нм благодаря фенилкумарановой цепочке, а второй и третий пики не обладают этим свойством. Оба эти пика имеют УФ-абсорбцию, очень похожую на абсорбцию сальвианоловой кислоты Е, что свидетельствует о том, что два соединения, соответствующие этим двум пикам, вероятно, имеют ту же основную цепь, что и Сальвианоловая кислота Е, а именно карбоксилдифенилэтиленовую основную цепь. Поэтому можно сделать вывод, что они имеют структуры, такие как структура изолитоспермовых кислот А и В, показанные на вышеуказанных структурных формулах для компонентов. Эти две структуры не были никогда описаны и поэтому здесь называются изолитоспермовыми кислотами А и В.

(2) Липорастворимые компоненты Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ по изобретению (см. Таблицу 3 и Фигуры 4 и 5).

Таблица 3
Данные ЖХВР-МС и результаты идентификации
Пик №	Время удерживания	Пик квазимолекулярного иона m/z^-	Идентичность
1	24,36	277 [М+Н]⁺, 575 [2M+Na]⁺	Таншинон I
2	34,85	295[M+H]⁺,611[2M+Na]⁺	Таншинон IIA

(3) Компоненты Radix Notoginseng в Radix Salviae Miltiorrhizae капельных пилюлях по настоящему изобретению (см. Таблицы 4 и 5 и Фигуру 6).

Таблица 4
Данные ЖХВР-МС и результаты идентификации.
Пик №	Время удерживания	Пик квазимолекулярного иона m/z [M-H]^-	Идентичность
1	11,27	931	Нотогинсенозид R₁
2	12,38	945	Гинсенозид Re
2	12,53	799	Гинсенозид Rg₁
3	20,81	1107	Гинсенозид Rb₁
4	21,25	769	Нотогинсенозид R₂
5	22,53	769	Нотогинсенозид R₂-изо
6	22,85	783	Гинсенозид Rg₂
7	23,77	637	Гинсенозид Rh₁
8	25,00	637	Гинсенозид Rh₁ изо (F₁)
9	30,05	945	Гинсенозид Rd
10	34,81	945	Гинсенозид Rd изо
11	40,00	781	Гинсенозид Rf-H₂O
12	41,57	751	Нотогинсенозид R₂-H₂O
13	43,72	751	Нотогинсенозид R₂-Н₂О
14	44,89	765	Гинсенозид Rg₆/F₄
15	46,43	619	Гинсенозид Rk₃/Rh₄ (Rk₃)
16	48,68	619	Гинсенозид Rk₃/Rh₄ (Pk₄)
17	54,97	783	Гинсенозид 20(R)Rg₃
18	56,48	783	Гинсенозид 20(S)Rg₃
19	68,35	765	Гинсенозид Rk₁/Rg₅ (Rk₁)
20	69,53	765	Гинсенозид Rk₁/Rg₅ (Rg₅)

Таблица 5
Данные ЖХВР-МСⁿ
Время удерживания	Идентичность	Пик квазимолекулярного иона m/z^-
11,27	Нотогинсенозид R₁	799 [M-H-Xyl]^-; 637 [M-H-Xyl-Glcp; 475 [М-Н-Xyl-2Glc]^-
12,38	Гинсенозид Re	799 [M-H-Rham]^-; 783 [М-H-Glc]^-; 637 [M-H-Rham-Glc]^-; 475[M-H-Rham-2Glc]^-
12,53	Гинсенозид Rg₁	637 [М-H-Glc]^-; 475 [M-H-2Glc]^-
20,81	Гинсенозид Rb₁	945 [M-H-Glc]^-; 783 [M-H-2Glc]^-; 624 [M-H-3Glc]^-; 459 [М-H-4Glc]^-
21,25	Нотогинсенозид R₂	637 [M-H-Xyl]^-; 475 [М-H-Xyl-Glc]^-
22,53	Нотогинсенозид R₂-изо	637 [M-H-Xyl]^-; 475 [M-H-Xyl-Glc]^-
22,85	Гинсенозид Rg₂	637 [M-H-Rham]^-; 475 [М-H-Rham-Glc]^-
23,77	Гинсенозид Rh₁	475 [М-H-Glc]^-
25,00	Гинсенозид Rh₁ изо (F₁)	475 [M-H-Glc]^-
30,05	Гинсенозид Rd	783 [М-H-Glc]^-; 621 [M-H-2Glc]^-; 459 [M-H-3Glc]^-
34,81	Гинсенозид Rd изо	783 [М-H-Glc]^-; 621 [M-H-2Glc]^-; 459 [M-H-3Glc]^-
40,00	Гинсенозид Rf-H₂O	619 [М-H-Glc]^-; 457 [M-H-2Glc]^-
41,57	Нотогинсенозид R₂-H₂O	619 [M-H-Xyl]^-
43,72	Нотогинсенозид R₂-H₂O	619 [M-H-Xyl]^-
44,89	Гинсенозид Rg₆/F₄	619 [M-H-Rham]^-; 457 [М-H-Rham-Glc]^-
54,97	Гинсенозид 20(R)Rg₃	621 [M-H-Glc]^-; 459 [M-H-2Glc]^-
56,48	Гинсенозид 20(S)Rg₃	621 [М-H-Glc]^-; 459 [M-H-2Glc]^-
68,35	Гинсенозид Rk₁/Rg₅ (Rk₁)	603 [М-H-Glc]^-; 441 [M-H-2Glc]^-
69,53	Гинсенозид Rk₁/Rg₅ (Rg₅)	603 [М-H-Glc]^-; 441 [M-H-2Glc]^-

На основе вышеописанного исследования были разработаны способ экстракции и способ анализа препарата ТСМ по изобретению, которые включают:

(1) твердофазный способ экстракции липорастворимых компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae и компонентов Notoginsenoside (нотогинсенозида) из капельных пилюлей на основе Radix Salviae Miltiorrhizae;

(2) способ ЖХВР-МС анализа для каждого образца.

В целом были идентифицированы 12 компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae и 21 сапониновый компонент Radix Notoginseng. Среди них при сравнении с контрольными образцами были идентифицированы 4 водорастворимых компонента Radix Salviae Miltiorrhizae, 2 липорастворимых компонента Radix Salviae Miltiorrhizae и 9 компонентов сапонина, а другие соединения, в основном, были идентифицированы на основе данных MS^- и сравнения с литературными данными.

Пример 9 (Пример детекции атласа отпечатков для компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae в препарате ТСМ)

1. Приборы и агенты

Приборы: Хроматограф для жидкостной хроматографии Agilent 1100, содержащий четырехканальный насос, деаэрирующий систему on-line, автоматический инжектор образцов, детектор DAD, регулятор температуры колонки, рабочую станцию Chemstation; электронный баланс (1/10^-4 г) BS 210S (Beijing Sartorius Company), электронный баланс (1/10^-4 г или 1/10^-5 г) АЕ240 (Mettler-Toledo Corporation, Shanghai), центрифуга LD4-2 (4000 об/мин) (Beijing Medical Centrifuge Factory), водяная баня с цифровым термостатом (Tianging Changfeng Corporation), роторный испаритель RE-52AA (Shanghai Yarong Biochemical Instrumentation Factory), вакуумный насос с циркулирующей водой SHE-(III) (Gongyi Yingyuyuhua Instrumentation Factory), ультразвуковой очиститель KQ-250B (Kunshan Ultrasonic Instrumentation Corporation), фильтр HENGAO Tand D (HENGAO Tand D), мембранный фильтр на основе синтетического волокна (отверстия 0,45 мкм) (Shanghai Xingya Purifying Materials Factory).

Агенты: ацетонитрил (хроматографически чистый, Merck Company, US), фосфорная кислота (высшего качества), чистая вода Wahaha.

2. Получение испытуемого образца

10 пилюль препарата ТСМ из каждой партии в Примере 1 взвешивали и затем помещали в измерительную колбу объемом 10 мл. Добавляли дистиллированную воду в количестве, достаточном для растворения пилюлей при встряхивании при воздействии ультразвука в течение 15 минут. Затем снова добавляли дистиллированную воду до достижения объема, равного 10 мл. Полученный раствор центрифугировали или фильтровали с получением образца раствора.

3. Условия проведения ЖХВР

Хроматографическая колонка Agilent ZoRBAx SB-C18 (4,6 × 250 мм, 5 мкм; мобильная фаза: мобильная фаза А: 0,02% водный раствор фосфорной кислоты; мобильная фаза В: 80% ацетонитрила - 0,02% водного раствора фосфорной кислоты; скорость истечения: 1,000 мл/мин; длина волны детекции 280 нм; температура в колонке: 30°С; объем введенного образца: 10 мкл.

Таблица 6
Градиент элюирования мобильной фазы
Время удерживания	Мобильная фаза А, (об/об)	Мобильная фаза В, (об/об)
0 мин	90%	10%
8 мин	78%	22%
15 мин	74%	26%
55 мин	48%	52%

4. Результаты детекции (см. Таблицу 7)

Таблица 7
Результаты обнаружения компонентов Radix Salviae Miltiorrhizae в 200 партиях капельных пилюль препарата ТСМ
Пик №	Средняя величина времени удерживания	RSD% от времени удерживания	Средняя величина площади пиков	RSD% от площади пиков	Отношение площади отдельного пика к общей площади пиков	Отношение интервала величин площади отдельного пика к общей площади пиков
1	6,04	0,31	1627,92	5,91	20,80%	19,6%-22,0%
2	9,90	0,25	2575,54	13,53	32,90%	28,5%-37,4%
3	16,89	0,61	366,89	10,92	4,69%	4,2%-5,2%
4	17,84	0,70	381,40	13,81	4,87%	4,2%-5,5%
5	20,31	0,96	186,08	12,04	2,38%	2,1%-2,7%
6	23,74	0,76	555,35	10,48	7,09%	6,4%-7,8%
7	27,73	0,50	281,91	18,08	3,60%	3,0%-4,3%
8	31,02	1,18	1852,33	14,84	23,66%	20,2%-27,2%
Примечание: Пик 1 соответствует Danshensu; пик 2 соответствует протокатехиальдегиду; пик 3 соответствует изолитоспермовой кислоте А; пик 4 соответствует изолитоспермовой кислоте В; пик 5 соответствует сальвианоловой кислоте D; пик 6 соответствует розмариновой кислоте; пик 7 соответствует сальвианоловой кислоте В и пик 8 соответствует сальвианоловой кислоте А (см. Фиг.1).

В Таблице 7 показаны относительные положения и величины площадей (время удерживания и площадь пика) 8-ми пиков, причем для 3-х пиков отношение площади отдельного пика к общей площади пиков составляет более 10% и для всех 8-ми пиков отношение площади отдельного пика к общей площади пиков больше 2%.

Claims

1. Лекарственный препарат для лечения кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваний, содержащий изолитоспермовые кислоты А и В, которые характеризуются в масс-спектрах пиком квазимолекулярного иона с m/z 537 [М-Н]^-, вторым ионным осколком с m/z 493 [М-Н-CO₂]^- и 295 [M-CO₂-R-H₂O]^- и третьим ионным фрагментом с m/z 159 и 109 при максимальной длине волны абсорбции, равной 327 нм, при этом масс-спектроскопию осуществляют следующим образом:
(1) ЖХВР-МС проводится путем детектирования отрицательных ионов при следующих условиях: скорость потока сухого газа 10 л/мин, давление в небулайзере 60 ф/дюйм² (413,68 кПа), температура сухого газа 350°С, напряжение в капилляре 3500 В и диапазон сканирования m/z 100-1200 и
(2) ЖХВР-МСⁿ проводится путем детектирования отрицательных ионов при следующих условиях: скорость потока сухого газа 10 л/мин, давление в небулайзере 60 ф/дюйм² (413,68 кПа), температура сухого газа 350°С, напряжение в капилляре 3500 В и диапазон сканирования m/z 100-800; и амплитуда фрагментов 1,5-3,0 В.

2. Лекарственный препарат по п.1, отличающийся тем, что он содержит компоненты, характеризующиеся пиком квазимолекулярного иона с m/z 417, 717, 359, 717, 339 и 493 [М-Н]^- соответственно, причем компонент с массой 417 [М-Н]^- содержит второй ионный фрагмент с m/z 175 [М-CO₂-Р-Н₂O]^- и 373 [М-Н-СО₂]^- и третий ионный фрагмент с m/z 147, 157 и 133;
компонент с массой 717 [М-Н]^- содержит второй ионный фрагмент с m/z 519 [M-R-H₂O]^- и 321 [M-R-H₂O]^-, третий ионный фрагмент с m/z 339 [М-Н]^- и третий ионный фрагмент с m/z 279, 293, 249, 223 и 185;
компонент с массой 359 [М-Н]^- содержит второй ионный фрагмент с m/z 161 [M-R-H₂O]^-, 179 [M-R]^- и 195;
компонент с массой 717 [М-Н]^- содержит второй ионный фрагмент с m/z 519 [M-R-H₂O]^-, 321 [M-2R-2H₂O]^-; третий ионный фрагмент с m/z 321 [М-R-H₂O]^- и 339 [M-R]^- и четвертый ионный фрагмент с m/z 279, 293, 249, 223 и 185;
компонент с массой 339 [М-Н]^- содержит второй ионный фрагмент с m/z 321 [M-R-H₂O]^- и 295 [М-Н-CO₂]^-; третий ионный фрагмент с m/z 279 и 267 и четвертый ионный фрагмент с m/z 251 и
компонент с массой 493 [М-Н]^- содержит второй ионный фрагмент с m/z 295 [M-R-H₂O]^- и третий ионный фрагмент с m/z 159 и 109; причем масс-спектроскопию проводят следующим образом:
(1) ЖХВР-МС осуществляют путем детектирования отрицательных ионов при следующих условиях: скорость потока сухого газа 10 л/мин, давление в небулайзере 60 ф/дюйм² (413,68 кПа), температура сухого газа 350°С, напряжение в капилляре 3500 В и диапазон сканирования m/z 100-1200 и
(2) ЖХВР-МСⁿ проводится путем детектирования отрицательных ионов при следующих условиях: скорость потока сухого газа 10 л/мин, давление в небулайзере 60 ф/дюйм² (413,68 кПа), температура сухого газа 350°С, напряжение в капилляре 3500 В и диапазон сканирования m/z 100-800; и амплитуда фрагментов 1,5-3,0 В.

3. Лекарственный препарат по п.1, отличающийся тем, что он содержит компоненты, характеризующиеся пиком квазимолекулярного иона с m/z 931, 945, 799, 1107, 769, 769, 783, 637, 637, 945, 945, 781, 751, 751, 765, 619, 619, 783, 783, 765 и 765 [М-Н]^- соответственно, причем
компонент с массой 931 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 799 [М-Н-Xyl]^-, 637 [M-H-Xyl-Glc]^- и 475 [M-H-Xyl-2Glc]^-;
компонент с массой 945 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 799 [М-Н-Rham]^-, 783 [M-H-Glc]^-, 637 [M-H-Rham-Glc]^- и 475 [M-H-Rham-2Glc]^-; компонент с массой 799[М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 637 [М-Н-Glc]^- и 475 [M-H-2Glc]^-;
компонент с массой 1107 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 945 [М-H-Glc]^-, 783 [M-H-2Glc]^-, 621 [M-H-3Glc]^- и 459 [M-H-4Glc]^-; компонент с массой 769 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 637 [М-Н-Xyl]^- и 475 [M-H-Xyl-Glc]^-;
компонент с массой 769 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 637 [М-Н-Xyl] и 475 [M-H-Xyl-Glc]^-;
компонент с массой 783 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 637 [М-H-Rham]^- и 475 [M-H-Rham-Glc]^-;
компонент с массой 637 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 475 [М-H-Glc]^-;
компонент с массой 637 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 475 [М-H-Glc]^-;
компонент с массой 945 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 783 [М-H-Glc]^-, 621 [M-H-2Glc]^-, 459 [M-H-3Glc]^-;
компонент с массой 945 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 783 [М-H-Glc]^-, 621 [M-H-2Glc]^-, 459 [M-H-3Glc]^-;
компонент с массой 781 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 619 [М-H-Glc]^- и 457 [M-H-2Glc]^-;
компонент с массой 751 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 619 [М-Н-Xyl]^-;
компонент с массой 751 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 619 [М-Н-Xyl]^-;
компонент с массой 765 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 619 [М-H-Rham]^- и 457 [M-H-Rham-Glc]^-;
компонент с массой 783 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 621 [М-H-Glc]^- и 459 [M-H-2Glc]^-;
компонент с массой 783 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 621 [М-H-Glc]^- и 459 [M-H-2Glc]^-;
компонент с массой 765 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 603 [М-H-Glc]^- и 441 [M-H-2Glc]^-;
компонент с массой 765 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 603 [М-H-Glc]^- и 441 [M-H-2Glc]^-;
при этом масс-спектроскопию проводят следующим образом:
(1) ЖХВР-МС осуществляют путем детектирования отрицательных ионов при следующих условиях: скорость потока сухого газа 10 л/мин, давление в небулайзере 60 ф/дюйм² (413,68 кПа), температура сухого газа 350°С, напряжение в капилляре 3500 В и диапазон сканирования m/z 400-1500 и
(2) ЖХВР-МСⁿ проводится путем детектирования отрицательных ионов при следующих условиях: скорость потока сухого газа 10 л/мин, давление в небулайзере 60 ф/дюйм² (413,68 кПа), температура сухого газа 350°С, напряжение в капилляре 3500 В и диапазон сканирования m/z 400-1200; и амплитуда фрагментов 1,2-1,5 В.

4. Лекарственный препарат по п.1, отличающийся тем, что он содержит компоненты, характеризующиеся пиком квазимолекулярного иона с m/z 417, 717, 359, 717, 339 и 493 [М-Н]^- соответственно, причем компонент с массой 417 [М-Н]^- содержит второй ионный фрагмент с m/z 175 [M-CO₂-R-H₂O]^- и 373 [М-Н-CO₂]^- и третий ионный фрагмент с m/z 147, 157 и 133;
компонент с массой 717 [М-Н]^- содержит второй ионный фрагмент с m/z 519 [M-R-H₂O]^- и 321 [M-2R-2H₂O]^- , третий ионный фрагмент с m/z 321 [M-R-H₂O]^- и 339 [M-R]^- и четвертый ионный фрагмент с m/z 279, 293, 249, 223 и 185;
компонент с массой 359 [М-Н]^- содержит второй ионный фрагмент с m/z 161 [M-R-H₂O]^- 179 [M-R]^- и 195;
компонент с массой 717 [М-Н]^- содержит второй ионный фрагмент с m/z 519 [M-R-H₂O]^- и 321 [М-2Р-2Н₂O]^-, третий ионный фрагмент с m/z 321 [M-R-H₂O]^- и 339 [M-R]^- и четвертый ионный фрагмент с m/z 279, 293, 249, 223 и 185;
компонент с массой 339 [М-Н]^- содержит второй ионный фрагмент с m/z 321 [M-R-H₂O]^- и 295 [M-R-CO₂]^-, третий ионный фрагмент с m/z 279 и 267 и четвертый ионный фрагмент с m/z 251; и
компонент с массой 493 [М-Н]^- содержит второй ионный фрагмент с m/z 295 [M-R-H₂O]^- и третий ионный фрагмент с m/z 159 и 109; причем масс-спектроскопию осуществляют следующим образом:
(1) ЖХВР-МС осуществляют путем детектирования отрицательных ионов при следующих условиях: скорость потока сухого газа 10 л/мин, давление в небулайзере 60 ф/дюйм² (413,68 кПа), температура сухого газа 350°С, напряжение в капилляре 3500 В и диапазон сканирования m/z 100-1200 и
(2) ЖХВР-МСП проводится путем детектирования отрицательных ионов при следующих условиях: скорость потока сухого газа 10 л/мин, давление в небулайзере 60 ф/дюйм (413,68 кПа), температура сухого газа 350°С, напряжение в капилляре 3500 В и диапазон сканирования m/z 100-800; и амплитуда фрагментов 1,5-3,0 В.
и дополнительно содержит компоненты, характеризующиеся в масс-спектрах пиком квазимолекулярного иона с m/z 931, 945, 799, 1107, 769, 769, 783, 637, 637, 945, 945, 781, 751, 751, 765, 783, 783, 765 и 765 [М-Н]^-, при этом
компонент с массой 931 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 799 [М-Н-Xyl]^-, 637 [M-H-Xyl-Glc]^- и 475 [M-H-Xyl-2Glc]^-;
компонент с массой 945 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 799 [М-H-Rham]^-, 783 [M-H-Glc]^-, 637 [M-H-Rham-Glc]^- и 475 [M-H-Rham-2Glc]^-;
компонент с массой 799 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 637 [М-H-Glc]^- и 475 [M-H-2Glc]^-;
компонент с массой 1107 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 945 [М-H-Glc]^-, 783 [M-H-2Glc]^-, 621 [M-H-3Glc]^- и 459 [M-H-4Glc]^-; компонент с массой 769 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 637 [М-H-Xyl]^- и 475 [M-H-Xyl-Glc]^-;
компонент с массой 769 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 637 [М-H-Xyl]^- и 475 [M-H-Xyl-Glc]^-;
компонент с массой 783 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 637 [М-H-Rham]^- и 475 [M-H-Rham-Glc]^-;
компонент с массой 637 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 475 [М-H-Glc]^-;
компонент с массой 637 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 475 [М-H-Glc]^-;
компонент с массой 945 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 783 [М-H-Glc]^-, 621 [M-H-2Glc]^-, 459 [M-H-3Glc]^-;
компонент с массой 945 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 783 [М-H-Glc]^-, 621 [M-H-2Glc]^-, 459 [M-H-3Glc]^-;
компонент с массой 781 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 619 [М-H-Glc]^- и 457 [M-H-2Glc]^-;
компонент с массой 751 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 619 [М-Н-Xyl]^-;
компонент с массой 751 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 619 [М-Н-Xyl]^-;
компонент с массой 765 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 619 [М-H-Rham]^- и 457 [M-H-Rham-Glc]^-;
компонент с массой 783 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 621 [М-H-Glc]^- и 459 [M-H-2Glc]^-;
компонент с массой 783 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 621 [М-H-Glc]^- и 459 [M-H-2Glc]^-;
компонент с массой 765 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 603 [М-H-Glc]^- и 441 [M-H-2Glc]^-;
компонент с массой 765 [М-Н]^- содержит ионный фрагмент с m/z 603 [М-H-Glc]^- и 441 [M-H-2Glc]^-;
при этом масс-спектроскопию проводят следующим образом:
(1) ЖХВР-МС осуществляют путем детектирования отрицательных ионов при следующих условиях: скорость потока сухого газа 10 л/мин, давление в небулайзере 60 ф/дюйм² (413,68 кПа), температура сухого газа 350°С, напряжение в капилляре 3500 В и диапазон сканирования m/z 400-1500 и
(2) ЖХВР-МСⁿ проводится путем детектирования отрицательных ионов при следующих условиях: скорость потока сухого газа 10 л/мин, давление в небулайзере 60 ф/дюйм² (413,68 кПа), температура сухого газа 350°С, напряжение в капилляре 3500 В и диапазон сканирования m/z 400-1200; и амплитуда фрагментов 1,2-1,5 В.

5. Лекарственный препарат по п.1, отличающийся тем, что он содержит сальвианоловую кислоту D, сальвианоловую кислоту Е, розмариновую кислоту, сальвианоловую кислоту В, сальвианоловую кислоту G, сальвианоловую кислоту A, Danshensu, протокатехиальдегид, изолитоспермовую кислоту А, изолитоспермовую кислоту В, таншинон I, таншинон IIA, нотогинсенозид R₁, гинсенозид Re, гинсенозид Rg₁, гинсенозид Rb₁, нотогинсенозид R₂, нотогинсенозид R₂ изо, гинсенозид Rg₂, гинсенозид Rh₁, гинсенозид Rh₁-изо, гинсенозид Rd, гинсенозид Rd изо, гинсенозид Rf-H₂O, нотогинсенозид R₂-H₂O, гинсенозид Rg₆ или F₄, гинсенозид 20(R)-Rg₃, гинсенозид
20(S)-Rg₃, гинсенозид Rk₁, гинсенозид Rg₅, гинсенозид Rk₃ и гинсенозид Rh₄.

6. Лекарственный препарат по п.1, отличающийся тем, что он характеризуется следующими физическими и химическими параметрами:
в спектре ЖХВР имеется 8 пиков, у которых отношение площади отдельного пика к общей площади пиков более 2%; среднее время удерживания для этих 8 пиков составляет 6,04, 9,90, 16,89, 17,84, 20,31, 23,74, 27,73 и 31,02 соответственно; RSD% от времени удерживания равно 0,31, 0,25, 0,61, 0,70, 0,96, 0,76, 0,50 и 1,18 соответственно; средняя величина площади пиков составляет 1627,92, 2575,54, 366,89, 381,40, 186,08, 555,35, 281,91 и 1852,33 соответственно; RSD% от величины площади пика составляет 5,91, 13,53, 10,92, 13,81, 12,04, 10,48, 18,08 и 14,84 соответственно; и отношение площади отдельного пика к общей площади пиков составляет 19,6-22,0%, 28,5-37,4%, 4,2-5,2%, 4,2-5,5%, 2,1-2,7%, 6,4-7,8%, 3,0-4,3% и 20,2-27,2% соответственно;
причем вышеуказанные физические и химические параметры определены при следующих условиях:
(1) жидкостная хроматография высокого разрешения:
наполнитель: октадецилсилилсиликагель, скорость истечения 1,000 мл/мин; длина волны при детектировании 280 нм и
(2) элюирование:
мобильная фаза А: 0,02%-ный водный раствор фосфорной кислоты; мобильная фаза В: 80% ацетонитрила - 0,02%-ный водный раствор фосфорной кислоты; градиент элюирования: мобильная фаза А равномерно меняется от 90 до 78% и мобильная фаза В равномерно меняется от 10 до 22% в течение 0-8 мин, мобильная фаза А меняется от 78 до 74% и мобильная фаза В меняется от 22 до 26% в течение 8-15 мин и мобильная фаза А меняется от 74 до 48% и мобильная фаза В меняется от 26 до 52% в течение 15-55 мин;
при этом образец раствора приготавливается и анализируется при осуществлении следующих стадий: точного взвешивания 10 пилюль традиционного китайского лекарственного препарата и помещения их в измерительный сосуд объемом 10 мл; добавления дистиллированной воды в количестве, достаточном для растворения препарата при встряхивании и воздействии ультразвука в течение 15 мин; добавления дистиллированной воды до достижения объема, равного 10 мл; центрифугирования или фильтрования полученного раствора с получением образца раствора; введения точно 10 мкл образца раствора в систему ЖХВР и анализа образца раствора методом ЖХВР с получением спектров ЖХВР.

7. Лекарственный препарат по п.6, отличающийся тем, что 8 пиков со средней величиной времени удерживания 6,04, 9,90, 16,89, 17,84, 20,31, 23,74, 27,73 и 31,02 соответственно соответствуют Danshensu, протокатехиальдегиду, изолитоспермовой кислоте А, изолитоспермовой кислоте В, сальвианоловой кислоте D, розмариновой кислоте, сальвианоловой кислоте В и сальвианоловой кислоте А соответственно.

8. Способ изготовления лекарственного препарата для лечения кардиоваскулярных и цереброваскулярных заболеваний по любому из пп.1-7, включающий стадии:
взвешивания Radix Salviae Miltiorrhizae и Radix Notoginseng; добавления гидроокиси натрия, бикарбоната натрия, карбоната натрия, гидроокиси калия, бикарбоната калия, карбоната калия или их смеси в количестве 0,5-4% в расчете на общий вес указанных лекарственных веществ с получением смеси;
кипячения смеси в 3-6-кратном количестве воды 2-4 раза; фильтрации смеси и концентрирования объединенных фильтратов; добавления этанола с высокой концентрацией (более 70%) в количестве, достаточном для получения содержания этанола, равного 65-70%; отстаивания смеси и отделения надосадочной жидкости; выделения этанола из надосадочной жидкости и концентрирования остатка до тех пор, пока его относительная плотность не станет равной 1,20-1,50 с получением экстракта Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng', смешивания полученного экстракта с борнеолом или маслом Lignum Dalbergie Odoriferae (дальбергии пахучей) и добавления эксципиента с получением препарата.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный эксципиент представляет собой вещество, выбранное из крахмала, декстрина, лактозы, микрокристаллической целлюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, лактита, глюкозы, глицина, маннита, натриевой соли метилированного крахмала, сшитой натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, сшитого поливинилпирролидона, как таковое, или в воде или смесь более одного из указанных, а препарат получают в виде дозированной формы - таблеток, таблеток с пролонгированным действием, пилюль, гранул, порошка для инъекций, капсул, микрогранул или орального дезинтегранта.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что этот препарат находится в виде капельных пилюль.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что он включает стадии: взвешивания Radix Salviae Miltiorrhizae и Radix Notoginseng', добавления бикарбоната натрия в количестве 1,4-1,9% в расчете на общий вес лекарственных веществ с получением смеси;
кипячения смеси в 4-5-кратном количестве воды в течение 2-3 ч и затем в 3-4-кратном количестве воды в течение 1-2 ч; фильтрации смеси и концентрирования соединенных фильтратов до тех пор, пока не достигается величина удельного веса, равная 1,16-1,20; добавления этанола с высокой концентрацией (выше 70%) в количестве, достаточном для получения содержания этанола, равного 65-70%; выдерживания смеси в течение 8-12 ч и отделения надосадочной жидкости;
выделения этанола из надосадочной жидкости и концентрирования остатка до получения величины относительной плотности, равной 1,32-1,40, с образованием экстракта Radix Salviae Miltiorrhizae - Radix Notoginseng; смешивания указанного экстракта с борнеолом или маслом Lignum Dalbergie Odoriferae и полиэтиленгликолем-6000 с получением однородной смеси;
нагревания смеси до расплавления;
введения расплава по каплям в охладитель - жидкий парафин или метилсиликоновое масло при помощи устройства;
вынимания полученных пилюль и удаления с них масла и
просеивания этих пилюль с получением желаемого препарата.