CN112843041A - 迷迭香酸或其衍生物作为新型trpc1拮抗剂的药用制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了迷迭香酸或其衍生物作为新型TRPC1拮抗剂的药用制备及其应用。我们发现迷迭香酸对TRPC1通道具有拮抗作用，由此对心肌缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化形成有明显的抑制作用，可用于预防或治疗心肌缺血再灌注损伤疾病、动脉粥样硬化疾病、心房纤颤疾病、癫痫疾病、败血症疾病、动脉粥样硬化疾病、骨质疏松症疾病。所述药物以迷迭香酸、迷迭香酸衍生物及其盐或其溶剂化物为单一活性成分或作为活性成分之一，可采用片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、注射剂和粉针剂等药学上可接受的剂型。

Description

迷迭香酸或其衍生物作为新型TRPC1拮抗剂的药用制备及其 应用

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，涉及迷迭香酸作为TRPC1新型抑制剂在制备药物中的用途，属于化合物药理作用技术领域。

背景技术

经典瞬时受体电位通道(transient receptor potential channels,TRPCs)是存在于细胞膜上的一类Ca²⁺可渗透性的非选择性阳离子通道，具有多种跨膜信号转导功能。截至目前共发现了TRPC1-7共7种亚型，根据蛋白质氨基酸序列的相似性及蛋白功能，又将其分为4大类：TRPC1、TRPC2、TRPC3/6/7、TRPC4/5[Jiang Y,Huang HX,Liu P,etal.Expression and localization of TRPC proteins in rat ventricularmyocytes atvarious developmental stages[J].Cell Tissue Res,2014,355(1):201-212]，其中TRPC2在哺乳动物中不表达，因此被称为伪基因。研究发现TRPC1可与TRPC4/5形成异聚体，而TRPC3可与TRPC6/7形成异聚体[Cheng KT,Ong HL,Ambudkar IS.Contribution andregulation of TRPC channels in store operated Ca²⁺entry[J].Curr Top Membr,2013,71:149-179]。TRPC通道的激活可受到包括温度、pH、渗透压、机械力和一些内源性信号因子在内的多种因素调节，是组成细胞膜上钙库操纵性钙离子通道(SOCC)和受体操纵性钙离子通道(ROCC)的分子基础[Estacion M,Li S,Sinkins WG,et al.Activation ofhuman TRPC6 channels by receptor stimulation.J.Biol.Chem.,2004,279(21):22047-2056]。

TRPC1是第一个被发现的哺乳动物TRP通道蛋白，由6个跨膜结构片段(S1-S6)以及在胞质内的N端和C端组成。目前的研究发现，TRPC1蛋白广泛分布于平滑肌、脑、心脏、大肠、肝和肾上腺等组织中，主要参与细胞膜受体激活磷脂酶C后所介导的钙离子进入，被认为是钙库操纵性钙离子通道(SOC)的核心成分[Nilius B,Flockerzi V.Mammalian TransientReceptor Potential(TRP)Cation Channels.Springer Berlin Heidelberg.2014:105-117]。近年来研究表明，TRPC1蛋白作为组成细胞膜Ca²⁺通道的分子基础，主要参与介导SOCE，其异常表达或基因突变可引起细胞内Ca²⁺信号通路改变，参与众多疾病发生。

在心血管疾病中，TRPC1广泛分布在各种血管平滑肌细胞上，其激活开放时可致细胞外Ca²⁺内流，影响平滑肌细胞的收缩、舒张、增殖和迁移等基础功能，广泛参与血管形成、重构、调节血管张力、通透性，以及平滑肌细胞的增殖、分化和死亡等过程。研究表明，在血管损伤模型中，增生的内膜血管平滑肌细胞上TRPC1通道的表达明显上调，阻断TRPC1抑制了血管平滑肌细胞的过度增殖[Kumar B,Dreja K,Shah SS,et al.Upregulated TRPC1channel in vascular injury in vivo and its role in human neointimalhyperplasia.Circ Res.2006；98(4):557-580]。使用siRNA干扰TRPC1通道基因表达后，可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的人冠状动脉平滑肌细胞及肺主动脉平滑肌细胞的增殖[Takahashi Y,Watanabe H,Murakami M,et al.Upregulation of TRPC1 is involved inAngiotensin II-induced vascular smooth muscle cell hypertrophy.J Mol CellCardiol.2006；41(6):1057-1057]。TRPC1在心肌肥厚的发生发展过程中发挥重要作用[Houser SR,Molkentin JD.Does contractile Ca²⁺control calcineurin-NFATsignaling and pathological hypertrophy in cardiac myocytes Sci.Signal,2008,1(25):pe31]。TRPC1可能通过调节钙内流促进心肌肥厚，从而导致心衰的发生[陈俊冲,吴小燕,林文盛.心力衰竭患者血清TRPC1水平及其与心功能和预后的关系研究.重庆医学,2020,49(02):256-259]。在盐敏感高血压大鼠心肌组织中，TRPC1表达增高并与心肌纤维化密切相关[朱文芳.TRPC1在盐敏感高血压大鼠心肌中的高表达及其对心肌纤维化的影响[D].遵义医学院,2018]。此外，在缺氧导致的血管损伤性疾病中，TRPC1可通过调控细胞内的钙稳态，促进内皮源性舒血管物质(NO)的生成，增加血管通透性，影响血管功能。因此，TRPC1是心肌病、心衰、冠心病、冠状动脉术粥样硬化等心血管疾病，以及缺氧、血液循环障碍等病理过程所致的血管损伤等的潜在治疗靶点。

TRPC1在肿瘤发生发展中同样扮演重要角色，其在多种实体肿瘤组织中均有较高的表达，在肿瘤细胞增殖、凋亡及迁移中发挥作用[Shapovalov G,Ritaine A,Skryma R,Prevarskaya N.Role of TRP ion channels in cancer and tumorigenesis.Seminarsin immunopathology 2016,38(3):357-369]。研究发现：TRPC1在鼻咽癌细胞中减弱了肿瘤细胞的粘附和侵袭能力，抑制了鼻咽癌细胞增殖转移[He B,Liu F,Ruan J,Li A,Chen J,Li R,Shen J,Zheng D,Luo R.Silencing TRPC1 expression inhibits invasion ofCNE2 nasopharyngeal tumor cells.Oncology reports 2012,27(5):1548-1554]；在肺癌细胞中，siRNA干扰TRPC1表达可导致肺癌细胞周期阻滞(G0/G1)，抑制肺癌细胞增殖[Tajeddine N,Gailly P.TRPC1 protein channel is major regulator of epidermalgrowth factor receptor signaling.The Journal of biological chemistry 2012,287(20):16146-16157]；在人类甲状腺癌ML-1细胞中，TRPC1可调节S1P3和VEGFR2受体的表达参与癌细胞转移和血管形成[Asghar MY,Magnusson M,Kemppainen K,Sukumaran P,LofC,Pulli I,Kalhori V,Tornquist K.Transient Receptor Potential Canonical 1(TRPC1)Channels as Regulators of Sphingolipid and VEGF Receptor Expression:IMPLICATIONS FOR THYROID CANCER CELL MIGRATION AND PROLIFERATION.The Journalof biological chemistry 2015,290(26):16116-16131]；TRPC1在PTEN缺陷的MDA-MB-468和HCC1569乳腺癌细胞系中可调节HIF1-α水平，通过AKT依赖性途径促进其侵袭性[AzimiI,Milevskiy MJG,Kaemmerer E,Turner D,Yapa K,Brown MA,Thompson EW,Roberts-Thomson SJ,Monteith GR.TRPC1 is a differential regulator of hypoxia-mediatedevents and Akt signalling in PTEN-deficient breast cancer cells.Journal ofcell science 2017,130(14):2292-2305]；TRPC1通过调控U251胶质瘤母细胞中PDGF的趋化反应，促使其发生迁移[Lepannetier S,Zanou N,Yerna X,Emeriau N,Dufour I,Masquelier J,Muccioli G,Tajeddine N,Gailly P.Sphingosine-1-phosphate-activated TRPC1 channel controls chemotaxis of glioblastoma cells.Cellcalcium 2016,60(6):373-383]；在Huh7肝癌细胞中，TRPC1表达的沉默，影响MAPK信号转导而抑制细胞增殖[Selli C,Pearce DA,Sims AH,Tosun M.Differential expression ofstore-operated calcium-and proliferation-related genes in hepatocellularcarcinoma cells following TRPC1 ion channel silencing.Molecular and cellularbiochemistry 2016,420(1-2):129-140]。以上结果均表明TRPC1通路抑制剂可能成为治疗肿瘤的潜在药物。

在神经系统中，TRPC1广泛分布于大脑皮质、海马、小脑、丘脑等部位，在神经发育、疼痛、帕金森病和癫痫等多种生理功能和病理改变过程中发挥作用。研究表明，在神经元产生癫痫样放电中，TRPC1能介导由mGluR激活而引发的Ca²⁺依赖性的阳离子电流产生，引发神经元毒性，导致癫痫发生[Zang Z,Li S,Zhang W,et al.Expression patterns of Trpc1in cortical lesions from patients with focal cortical dysplasia.J MolNeurosci2015,57:265-27]。在亨廷顿病中，通过抑制剂或基因调控减少TRPC1介导的钙库操控性的Ca²⁺内流能有效保护神经元免受亨廷顿蛋白的毒性作用[Vigont V,Kolobkova Y,SkopinA,et al.Both orai1 and trpc1 are involved in excessive store-operated calciumentry in striatal neurons expressing mutant huntingtin exon 1.FrontPhysiol2015,6:33]。在糖尿病性痛和紫杉醇诱导的神经病理性痛模型中，利用特异性寡核苷酸同时降低小鼠DRG神经元中TRPC1的表达，能显著缓解小鼠的机械性痛敏和渗透压刺激引起的痛敏[Alessandri-Haber N,Dina OA,Chen X,et al.Trpc1 and trpc6 channelscooperate with trpv4 to mediate mechanical hyperalgesia and nociceptorsensitization.J Neurosci2009,29:6217-6228]。此外，TRPC1基因缺失可导致小鼠海马神经元数量显著减少，诱导神经细胞凋亡，影响学习记忆能力[幸仁忠,刘建军,许华,等.TRPC1缺失对小鼠脑神经细胞生存的影响[J].中国病理生理杂志,2016(4):686-690]。因此，抑制TRPC1可能缓解多种神经性疾病症状。

TRPC1也与炎症的发展密切相关。在小鼠慢性哮喘模型中，TRPC1蛋白在哮喘小鼠肺组织的支气管上皮细胞、血管平滑肌细胞及浸润的炎症细胞表达明显增强，表明TRPC1可能与哮喘发病机制密切相关[李建华,周丽芬,陈志勇,等.经典瞬时受体电位通道在哮喘小鼠肺组织中的表达[J].华中科技大学学报(医学版),2011,40(6):678-681]。在小鼠肺炎模型组织中，TRPC1的mRNA和蛋白表达水平均与支气管肺泡灌洗液中白细胞总数、巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞数量呈显著性正相关，因此TRPC1可能在肺炎的发生发展中发挥重要作用[扶招弟,周丽芬,黄建荣,等.瞬时感受器电位通道1在臭氧致小鼠肺组织炎症中的表达[J].南方医科大学学报,2015,35(2):284-287]。TRPC1的高水平表达与气道重塑和慢性气道炎症的发生发展密切关联。研究表明，TRPC1通过Ca²⁺-PKC信号途径上调炎性因子FGF-2、MMP-9、TGF-β1、IL-13等的生成，促进气道重塑，参与了慢阻肺的发生发展[Yu Q,LiM.Effects of transient receptor potential canonical 1(TRPC1)on the mechanicalstretch-induced expression of airway remodeling-associated factors in humanbronchial epithelioid cells.J Biomech 2016，51:89-96]。此外，TRPC1还参与了机体的免疫应答。TRPC1在体外水平可促进肥大细胞的脱颗粒化，促进大量组胺、花生四烯酸类和细胞因子等炎性介质的释放，由此产生过敏症状[Suzuki,R.,Liu,X.,Olivera,A.,et al.(2010)Loss of TRPC1-Mediated Ca²⁺Influx Contributes to Impaired Degranu lationin Fyn-Deficient Mouse Bone Marrow-Derived Mast Cells.Journal of LeukocyteBiology,88,863-875]。因此，抑制病理状态下的TRPC1高表达水平可能是控制慢性炎症以及哮喘等自身免疫性疾病的有效手段。

以上这些研究成果表明TRPC1过度激活是导致众多疾病的病理机制；TRPC1抑制剂已成为以上众多相关疾病的治疗靶点。但是，由于TRPC蛋白家族成员众多，氨基酸序列相似性较高，目前针对TRPC1抑制剂的研究较少，且缺乏TRPC1特异性小分子抑制剂。因此，TRPC1小分子抑制剂的研究已成为相关领域的研究热点。

在TRPC1小分子抑制剂的研究方面，天然化合物成为寻求解决办法的重要来源。迷迭香酸是一种酚酸类化合物，其分子式为：C₁₈H₁₆O₈，结构式见图1，分子量为360.31，化学名为：R(t)2-[3-(3,4-二羟基苯基)-1-氧代-2-丙烯基]氧基-3,4-二羟基苯丙酸。迷迭香酸分布较为广泛，目前已证明可从多种唇形科、紫草科和葫芦科植物中提取，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤的作用[张玉杰，徐文清，沈秀.迷迭香酸的提取分离及药理新发现[J].中国新药杂志.2013,(4)：433-437；陈立亚.迷迭香酸的研究概况[J].中国药事2007,21(11)]。

根据发明人的资料检索，至今未发现迷迭香酸作为TRPC1抑制剂用于制备治疗相关疾病药物的报道。

发明内容

本发明的目的是提供迷迭香酸或其衍生物作为新型TRPC1拮抗剂的药用制备及其应用。

本发明的第一目的在于将迷迭香酸作为一种新型的TRPC1蛋白抑制剂，用于制备预防或治疗相关疾病药物。

本发明的第二目的在于将迷迭香酸衍生物及其盐或溶剂化物作为一种新型的TRPC1蛋白抑制剂，用于制备预防或治疗相关疾病药物。

其中，所述迷迭香酸衍生物为迷迭香酸卤代、磺化、硝化、羟化、烷氧化、金属离子、酯化产物。

迷迭香酸衍生物可成盐或溶剂化物，其中所述的盐包括钠盐、钾盐等，所述的溶剂化物是指水合物、乙醇化物等。本领域技术人员可以预见，基于迷迭香酸衍生物具备与迷迭香酸相同的核心结构，因此，其盐或溶剂化物在制备治疗或预防相关疾病药物中同样具备理想的应用效果。

本发明涉及的疾病包括：①炎症性疾病，包括关节炎、气管炎、神经炎、败血症、肾炎等；②心血管系统疾病，包括高血压、心衰、心肌肥厚、心律失常、心房纤颤、心肌缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化等；③神经系统疾病，包括癫痫、亨廷顿病；⑤其它类型疾病，包括骨质疏松、痛风。

本发明所述的药物，以迷迭香酸、迷迭香酸衍生物及其盐或溶剂化物为单一活性成分或作为活性成分之一。除活性成分外，本发明所述的药物还包括药学上可接受的至少一种赋形剂(药物载体)。所述的赋形剂为本领域技术人员所理解，包括但并不局限于崩解剂、润滑剂、分散剂等，本领域技术人员可依据制剂的实际需求加以选择，本发明对此不作特别限定。

本发明所述的药物，可经由常规方法制备成药学上各种常见剂型，如片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、混悬剂、注射剂、粉针剂等。给药方式可选口服、静脉、皮下、透皮或局部给药等，以单位给药形式给予动物或人。

本发明所述的药物合适的单位给药形式包括口服剂型(例如片剂、胶囊、丸剂、散剂、颗粒剂或悬浮液)、静脉，皮下，透皮或肌内给药剂型(例如注射液、乳剂等)。此外，所述药物可以是普通制剂、缓释制剂、速释制剂及控释制剂。

上述药用制剂可按照各种制剂常规制备工艺制成。

附图说明

图1是迷迭香酸的结构式；

图2是迷迭香酸与TRPC1蛋白体外亲和力示意图；

图3是迷迭香酸抑制OGD/R后细胞中TRPC1 mRNA异常表达的作用示意图；

图4是迷迭香酸抑制OGD/R后细胞中TRPC1蛋白异常表达的作用示意图；

图5是迷迭香酸对TRPC1通道介导的Ca²⁺内流的抑制作用示意图；

图6是迷迭香酸对心肌缺血再灌注损伤的治疗作用示意图。

具体实施方式

下面列举典型实施例，对本发明进一步说明，但不以任何形式构成对本发明的限制。

实施例1

按下列配方制得迷迭香酸缓释片剂(所用含量均为重量百分含量)

制备方法如下：

(1)将迷迭香酸、乳糖、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮混合均匀，用无水乙醇制粒；

(2)将湿颗粒置于约50℃干燥箱内，控制水分为2％左右；

(3)干燥颗粒经20目筛整粒后，加入硬脂酸镁，混合均匀，按规格压片，即得。

实施例2

按下列配方制得迷迭香酸片剂(所用含量均为重量百分含量)

制备方法如下：

(1)将迷迭香酸、乳糖分别粉碎，过100目筛，淀粉直接过100目筛备用；

(2)取适量淀粉加水溶液配制成淀粉糊，备作黏合剂；

(3)将迷迭香酸、乳糖及剩余量的淀粉混匀，加入黏合剂制软材，过20目筛制粒；

(4)将湿颗粒置于约50℃干燥箱内，控制水分为2％左右；

(5)干燥颗粒经20目筛整粒后，加入硬脂酸镁，混合均匀，按规格压片，即得。

实施例3

按下列配方制得迷迭香酸胶囊(所用含量均为重量百分含量)

迷迭香酸 50％

淀粉 50％

制备方法如下：

(1)将迷迭香酸、淀粉分别粉碎，过100目筛，充分混匀，备用；

(2)将混匀的药粉按规格填充到2号空胶囊，即得。

实施例4

按下列配方制得迷迭香酸颗粒剂(所用含量均为重量百分含量)

制备方法如下：

(1)将迷迭香酸、淀粉、糖粉分别粉碎，过100目筛，备用；

(2)取全量的糊精，用40％的乙醇-水溶液制成浓度为2％的水溶液，搅拌至完全溶解，备作黏合剂；

(3)将迷迭香酸、淀粉、糖粉混合均匀，用黏合剂制软材，过20目筛制粒；

(4)将湿颗粒置于约50℃干燥箱内，控制水分为2％左右；

(5)干燥颗粒经20目筛整粒后，按规格分袋，即得。

实施例5

按下列配方制得迷迭香酸注射剂

制备方法如下：

(1)将迷迭香酸加入乙醇和丙二醇溶液中，超声使迷迭香酸溶解；

(2)用1％盐酸调pH至6-7.5；

(3)过0.22μm微孔滤膜；

(4)灌封于1000支安瓿瓶中，即得。

实施例6

按下列配方制得迷迭香酸注射用无菌粉末

制备方法如下：

将上述各成分用适量注射用水溶解后，无菌过滤后分装于安瓿瓶中，冷冻干燥后封口，即得。

以下通过试验例进一步阐明本发明所述迷迭香酸对相关疾病的治疗效果。

试验例1：迷迭香酸体外结合TRPC1蛋白的作用

采用MST方法测定迷迭香酸与TRPC1蛋白的结合能力。

实验步骤：

(1)蛋白溶液的准备：将40μg蛋白干粉离心3000rpm，5min，轻轻打开盖子向管中加入37.62μl PBS-Buffer，配制成浓度为10μM的蛋白母液，置于冰上。

(2)配体溶液的准备：将迷迭香酸用DMSO配制成浓度为10mM的储存液；取10μl储存液于0.2ml EP管中，加入90μl PBS混合均匀，配制成浓度为1mM的工作液100μl，编号待用。

(3)蛋白荧光标记：按蛋白荧光标记试剂盒(型号L001)要求，对TRPC1蛋白进行荧光标记，并测定蛋白标记效率。

(4)亲和作用测定：对配体进行浓度梯度稀释，稀释后与标记的蛋白溶液混匀，上样测试时蛋白及配体工作液浓度填写为μM单位，收集数据结果。

实验结果：平衡解离常数(KD)值是MST实验中评价化合物与蛋白互作的指标，KD值越小，亲和力越大。结果表明，迷迭香酸化合物与TRPC1蛋白的KD值为65μM，可以认为迷迭香酸与TRPC1蛋白具有高亲和力。结果可见图2。

试验例2：迷迭香酸(RosA)抑制OGD/R后细胞中TRPC1异常表达

实验材料：HL-1心肌细胞，购自上海沪震生物科技有限公司。迷迭香酸购自上海陶素生物科技有限公司，纯度＞98％。

实验分组：共分4组，即正常对照组，50μM迷迭香酸组，OGD/R组(刺激TRPC1过度表达)，OGD/R+50μM迷迭香酸组。

同一代HL-1细胞于37℃、5％CO₂孵箱中培养4天后取出，分别给予相应干预(OGD/R或50μM RosA)后，各组均放入孵箱中培养24h后，收集细胞进行检测。

实验步骤：

(1)qPCR法检测细胞Trpc1基因的变化。采用RNA提取试剂盒进行RNA提取。收集各组细胞，加入TRIzol裂解液，匀浆；加氯仿，室温5min，离心，转移上层水相；加异丙醇，室温10min；离心，去上清，加75％乙醇震荡混合。4℃离心，去上清，EP管放置干燥，加入DEPC水充分溶解RNA；检测RNA浓度；引物序列设计；逆转录合成cDNA；PCR反应、软件数据分析△Ct(循环数)值。检测TRPC1的mRNA表达水平。

(2)Western Blot法检测细胞TRPC1蛋白的表达。收集各组细胞，蛋白裂解液提取蛋白，BCA法进行蛋白定量，蛋白上样量为20～40μg，在12％分离胶、5％浓缩胶上进行SDS-PAGE电泳。将电泳分离后的蛋白转移至NC膜上。用10％脱脂奶粉封闭2h，按照常规滴加一抗(TRPC1,1:500稀释)，4℃孵育过夜。次日常温复温，TBST洗膜3次，每次5min。加对应的HRP标记的二抗，室温孵育1.5h。同上TBST洗膜3次，化学发光仪显影，灰度扫描。β-actin作为内参，结果以对β-actin比值做统计分析，检测各组细胞中TRPC1的蛋白表达水平。

统计学处理：实验数据以均数±标准误(Mean±SEM)表示，组间比较采用t检验或方差分析进行统计。P<0.05表示两组差别具有显著性意义。

实验结果：OGD/R造模后，细胞中TRPC1的mRNA和蛋白水平均显著上升；迷迭香酸(50μM)可显著抑制TRPC1的mRNA(150.6％±26.4％vs 226.4％±29.8％)和蛋白(401.7％±22.2％vs 818.8％±48.7％)水平。结果可见图3、图4。

试验例3：迷迭香酸(RosA)对TRPC1通道介导的Ca²⁺内流的抑制作用

实验材料：过表达Trpc1的HEK293细胞，由本课题组自行构建。迷迭香酸购自上海陶素生物科技有限公司，纯度＞98％。

实验分组：共分2组，即正常对照组和50μM迷迭香酸组。

实验步骤：

(1)液体的配制。

1)103台氏母液的配制：3.680g NaCl，1.192g HEPES，0.202g KCl，0.026gNaH2PO4·2H2O，0.102g MgCl2·6H2O溶于50ml蒸馏水中，混匀，4℃保存。

2)无钙台氏液的配制：50ml台氏母液加蒸馏水至500ml，加入1g葡萄糖，加入2mlEGTA溶液(10mM)，混匀，4℃保存。

3)Fura-2/AM荧光染料的配制：按照说明书用50μl DMSO溶解Fura-2/AM(1mM)，分装成2.5μl/管，冻存于-20℃，实验时取1管用无钙台氏液稀释100倍，锡纸包好，避光待用。

(2)细胞准备。取24孔板，无菌的盖玻片置于孔底，在铺好盖玻片的孔中加入适量细胞悬液，使细胞均匀分布，于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。

(3)荧光强度的测定。将细胞从培养箱中取出；取125μl新鲜培养基与125μl荧光染料Fura-2/AM混匀于另一新24孔板的一个孔中，将一片细胞爬片放入其中，室温避光静置20-30min使细胞负载荧光染料；将负载了荧光染料的细胞爬片从24孔板中取出置于浴槽中央，用无钙台氏液灌流5min，将细胞外多余的染料冲洗干净，关掉灌流蠕动泵，确保浴槽中有足够的无钙台氏液能够和显微镜物镜形成水膜；将浴槽固定在倒置荧光显微镜的载物台上，170s时加入1.5mM CPA(耗竭细胞内钙)，260s时灌流1.8mM Ca²⁺溶液，500s时停止灌流；通过监测380nm和340nm的激发光谱检测到荧光钙离子。

统计学处理：实验数据以均数±标准误(Mean±SEM)表示，组间比较采用t检验或方差分析进行统计。P<0.05表示两组差别具有显著性意义。

实验结果：HEK293细胞过表达Trpc1后，Ca²⁺内流显著增加，而RosA抑制了Trpc1过表达介导的Ca²⁺内流(0.14±0.05vs 0.21±0.06)(图5)。这表明本发明化合物对TRPC1通道的介导的Ca²⁺内流有显著抑制作用。

试验例4：迷迭香酸对心肌缺血再灌注损伤的治疗作用

实验动物：C57BL/6J小鼠，雄性，6-8周龄，体重18-22g，购于空军军医大学动物实验中心。

实验分组：动物随机分为4组，即假手术组(Sham)、假手术组+迷迭香酸(Sham+100mg/kg RosA)、心肌缺血/再灌注组(IR)、心肌缺血/再灌注组+迷迭香酸(IR+100mg/kgRosA)，每组10只。

实验步骤：手术前8h小鼠禁食，将小鼠左冠状动脉进行结扎，结扎30min，然后打开活结，血液回流24h。治疗组当天给予迷迭香酸灌胃，假手术组给予生理盐水灌胃给药。每天给药1次，连续给药7d，直至检查前12h停药。

小鼠心肌梗死面积的检测：自小鼠心脏原结扎部位再次结扎冠状动脉，止血钳夹紧主动脉，伊文氏兰溶液逆行注入心脏，2min后摘取心脏，置于干冰上定型，切片好的心肌组织置于2％TTC中，避光条件下，37℃孵育10min，至缺血区组织呈鲜红色，进行拍照并进行统计学分析各组小鼠的心肌梗死面积(infarct size，IS)、心肌危险区(area at risk，AAR)以及心肌梗死面积与受损区面积的百分比(IS/AAR)。

对小鼠血清CK-MB，cTnI水平的影响：小鼠造模结束后，小鼠眼眶采血，室温放置收集的血液2h，4℃，3,000rpm离心20min，取上清；按照所购试剂盒的说明书严格操作测定各组样品的CK-MB，cTnI的含量。

统计学处理：实验数据以均数±标准误(Mean±SEM)表示，组间比较采用t检验或方差分析进行统计。P<0.05表示两组差别具有显著性意义。

实验结果：模型组的IS显著高于假手术组，说明缺血/再灌注处理诱导了明显的心肌梗死，迷迭香酸给药组的IS均显著低于模型组(P<0.05)，表明迷迭香酸可显著性地缩小小鼠心肌梗死面积(图6)。

心肌酶是诊断心肌损伤的常用指标，其中CK-MB被认为是急性心肌梗死的诊断指标之一。cTnI是一种心肌收缩调节蛋白，关于心肌损伤比其他心肌酶类更具高敏感性和高特异性。与假手术组相比，模型组小鼠血清中CK-MB，cTnI水平明显升高，而迷迭香酸可明显降低缺血/再灌注所致的CK-MB，cTnI水平增高。见表1。

表1迷迭香酸对心肌缺血/再灌注小鼠心肌酶活性的影响

组别	CK-MB(ng/mL)	cTnI(ng/mL)
			Sham	28.6±9.3	5.2±5.4
Sham+RosA	23.4±7.9	4.8±5.8
			I/R	72.1±10.2<sup>#</sup>	16.2±3.1<sup>#</sup>
I/R+RosA	51.3±10.0*	8.5±2.0*

注:与Sham组比较，^#P＜0.05；与I/R组比较，*P＜0.05。

试验例5：迷迭香酸对动脉粥样硬化的治疗作用

实验动物：40只8周龄雄性载脂蛋白E基因敲除(ApoE^-/-)小鼠，10只同品系C57普通小鼠，平均体重(18.0±2.0)g，购自第四军医大学实验动物中心。

实验分组：将C57小鼠设为空白对照组；ApoE^-/-小鼠随机分为模型组、辛伐他汀组(阳性对照)、迷迭香酸高剂量组(100mg/kg)和迷迭香酸低剂量组(50mg/kg)，每组10只。

实验步骤：适应性饲养1周后，ApoE^-/-小鼠给予高脂饲料饲养，自由饮水，持续时间12周。12周末造模结束，ApoE^-/-小鼠持续高脂饮食，C57小鼠普通塑料喂养。按体质量灌胃给药，每日1次，连续10周。之后将各组小鼠麻醉后固定，剪开腹部，进行下腔静脉取血静置2h，3000r/min，低温高速离心15min，取上清，置于-80℃保存。采用全自动生化分析仪检测血脂(TC、TG、LDL-C、HDL-C)水平。

统计学处理：实验数据以均数±标准误(Mean±SEM)表示，组间比较采用t检验或方差分析进行统计。P<0.05表示两组差别具有显著性意义。

实验结果：AS的发生是由于脂质聚集在血管壁，伴随复合糖类积聚、纤维增生和钙质沉着，因此调节和减少脂质聚集对于抗AS有着重要意义。结果显示，与空白对照组比较，模型对照组血清中的TC、TG、LDL-C水平较正常对照组明显升高(P＜0.01)，HDL-C明显降低(P＜0.01)。与模型组相比，迷迭香酸高剂量组TC、LDL-C水平显著降低(P＜0.01)，TG有降低趋势(P＜0.05)，HDL-C水平有一定升高(P＜0.05)，见表2。

表2迷迭香酸对小鼠血脂水平的影响

组别	TC(mmol/L)	TG(mmol/L)	HDL-C(mmol/L)	LDL-C(mmol/L)
					空白组	5.07±0.48	5.76±0.85	7.17±1.02	1.18±0.35
模型组	27.08±1.82*	7.52±0.24*	2.71±0.87*	5.06±0.41*
					迷迭香酸低剂量组	21.14±2.64<sup>#</sup>	7.21±0.38	3.39±0.91	3.99±0.27<sup>#</sup>
迷迭香酸高剂量组	13.06±1.69<sup>#</sup>	6.19±0.40<sup>#</sup>	4.52±1.03<sup>#</sup>	3.19±0.38<sup>#</sup>
					辛伐他汀组	14.94±4.86<sup>#</sup>	5.53±0.75<sup>#</sup>	5.99±0.26<sup>#</sup>	2.65±0.88<sup>#</sup>

注:与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，^#P<0.05。

试验例6：迷迭香酸对心房纤颤模型大鼠的治疗作用

实验动物：SD大鼠40只，10～12周龄，体重230～270g，购自第四军医大学实验动物中心。实验动物饲养环境：室温为25±2℃，12h黑暗/光亮的环境培养，常规饲料喂养。

实验分组：将大鼠随机分为对照组、模型组、维拉帕米组(阳性对照)、迷迭香酸高剂量组(100mg/kg)，迷迭香酸低剂量组(50mg/kg)，每组8只。

实验步骤：除空白组外，其余各组大鼠建立心房纤颤(AF)模型。将质量浓度70mg/L的Ach与质量浓度为10g/L的CaCl₂充分混合，配置成Ach-CaCl₂混合液。建模大鼠尾静脉注射0.2mL的Ach-CaCl₂混合液，空白组大鼠尾静脉注射0.2mL的生理盐水。每天1次，连续注射7天。

给药时，模型组和空白组给予2mL生理盐水灌胃；阳性对照组以维拉帕米6.36mg溶于2mL生理盐水中灌胃；迷迭香酸高剂量组、迷迭香酸低剂量组分别以100mg/kg、50mg/kg溶于2mL生理盐水后灌胃。每天1次，持续灌胃28d。灌胃期间，仍保持使用Ach-CaCl₂尾静脉注射。持续给药28d后，监测大鼠AF持续时间，心房肌有效不应期。

AF持续时间检测：大鼠尾静脉注射Ach-CaCl₂后，通过RM240生物机能系统记录大鼠肢体Ⅱ导联心电图。当P波消失，f波出现时，为典型的AF出现标志。当P波出现，f波消失，恢复窦性心律时，为AF终止。据此，记录AF持续时间。

心房肌有效不应期时长检测：将大鼠麻醉后仰卧置于操作台上，打开胸腔，立刻将心脏联通主动脉一起取出，迅速置于预冷的生理盐水中，轻压心室以排除残血防止血凝。使用Langendorff灌流装置将主动脉和心脏插管固定，大鼠心脏使用恒温恒流持续灌流30min后，开始检测。通过s1s2程控刺激大鼠心房，先连续给予7～8个s1s1刺激后调整为s1s2刺激，当缩短s1s2刺激间期时，会最终使得s2刺激落在前一个s1刺激有效不应期内，从而s2刺激无法产生心跳。据此，测定心房肌有效不应期时长。

统计学处理：实验数据以均数±标准误(Mean±SEM)表示，组间比较采用重复测量的方差分析进行统计。P<0.05表示两组差别具有显著性意义。

实验结果：连续治疗给药28d后，模型组大鼠AF持续时间显著长于对照组(P＜0.01)，阳性对照组和迷迭香酸各剂量组短于模型组且长于对照组(P＜0.05)。模型组大鼠有效不应期显著短于对照组(P＜0.01)，阳性对照组、迷迭香酸各剂量组均长于模型组且短于对照组(P＜0.05)。见表3。

表3迷迭香酸对大鼠AF持续时间和有效不应期的影响

组别	例数	AF持续时间(t/s)	有效不应期(t/ms)
				对照组	8	0	88.41±5.02
模型组	8	10.6±1.1*	46.33±10.74*
				阳性对照组	8	2.29±0.43<sup>#</sup>	64.82±11.21<sup>#</sup>
迷迭香酸高剂量组	8	2.17±0.31<sup>#</sup>	73.65±8.17<sup>#</sup>
				迷迭香酸低剂量组	8	3.55±0.68<sup>#</sup>	63.21±9.94<sup>#</sup>

注:与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，^#P<0.05。

试验例7：迷迭香酸对大鼠废用性骨质疏松的预防作用

实验动物：SD大鼠40只，10～12周龄，体重230～270g，购自第四军医大学实验动物中心。实验动物饲养环境：室温为25±2℃，12h黑暗/光亮的环境培养，常规饲料喂养。

实验分组：将大鼠随机分为对照组、模型组、强骨胶囊组(250mg/kg)、迷迭香酸高剂量组(100mg/kg)、迷迭香酸低剂量组(50mg/kg)，每组8只。

实验步骤：模型组、强骨胶囊组、迷迭香酸低、高剂量组建立大鼠废用性骨质疏松模型，用70％异丙醇清洁大鼠尾部并涂上安息香酊连接到线束装置上，线束装置的另一端连接到笼子顶部的旋转装置，使大鼠的头部向下倾斜30°夹角，防止大鼠的后肢在实验期间的任何时间接触地面，持续4周。对照组无任何处理。从造模第1天开始，强骨胶囊组给予强骨胶囊250mg/kg灌胃，迷迭香酸低、高剂量组给予迷迭香酸50、100mg/kg灌胃，每日一次；对照组及模型组给予等体积生理盐水，每日一次；5组均给药4周。

在大鼠处死前1天，腹膜内注射水合氯醛(400mg/kg)麻醉大鼠并在标本平台上仰卧，使两后肢分别取弯曲和伸展姿势。通过双能X线吸收测定法测量体内股骨远端的骨密度。将大鼠股骨置于70％乙醇中，显微CT机扫描股骨远端松质骨，能量设置为500mA和80kV，分析骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分散度。

统计学处理：实验数据以均数±标准误(Mean±SEM)表示，组间比较采用重复测量的方差分析进行统计。P<0.05表示两组差别具有显著性意义。

实验结果：与对照组比较，模型组股骨骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度显著降低，骨小梁分散度显著升高(P<0.05)。与模型组比较，强骨胶囊组、迷迭香酸低、高量组股骨骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度显著升高，骨小梁分散度显著降低(P<0.05)。迷迭香酸高剂量组与强骨胶囊组股骨骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分散度比较差异无统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4迷迭香酸对大鼠股骨骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分散度的影响

组别	骨密度(g/cm<sup>3</sup>)	骨小梁数量(/mm)	骨小梁厚度(μm)	骨小梁分散度(μm)
					对照组	1.90±0.21	6.65±0.52	154.47±6.03	201.54±6.19
模型组	1.02±0.33*	2.37±0.34*	58.92±4.48*	654.22±8.13*
					强骨胶囊组	1.77±0.26<sup>#</sup>	5.89±0.50<sup>#</sup>	134.16±4.08<sup>#</sup>	311.04±5.38<sup>#</sup>
迷迭香酸低剂量组	1.52±0.24<sup>#</sup>	3.97±0.49<sup>#</sup>	85.33±6.02<sup>#</sup>	587.69±7.18<sup>#</sup>
					迷迭香酸高剂量组	1.79±0.21<sup>#</sup>	5.64±0.55<sup>#</sup>	136.17±7.15<sup>#</sup>	307.96±6.93<sup>#</sup>

注:与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，^#P<0.05。

试验例8：迷迭香酸对败血症模型动物生存时间的影响

实验动物：C57BL/6J小鼠32只，雄性，6～8周龄，购自第四军医大学实验动物中心。实验动物饲养环境：室温为25±2℃，12h黑暗/光亮的环境培养，常规饲料喂养。

实验分组：将小鼠随机分为对照组、败血症小鼠模型组(LPS组)、LPS+迷迭香酸高剂量组(100mg/kg)，LPS+迷迭香酸低剂量组(50mg/kg)，每组8只。

实验步骤：采用脂多糖(LPS)诱导小鼠败血症模型。适应性饲养1周后，对照组动物给予0.9％生理盐水；LPS组腹腔注射40mg/kg LPS；LPS+迷迭香酸高剂量组和LPS+迷迭香酸低剂量组腹腔注射相应剂量迷迭香酸30min后，腹腔注射40mg/kg LPS。观察各组小鼠存活情况，记录小鼠死亡时间，计算各组动物平均存活时间。

统计学处理：实验数据以均数±标准误(Mean±SEM)表示，组间比较采用重复测量的方差分析进行统计。P<0.05表示两组差别具有显著性意义。

实验结果：对照组动物长期存活；LPS组约13h后小鼠开始出现死亡，约18h小鼠死亡率达到90％以上；分别单次注射不同剂量的迷迭香酸后，低、高剂量组小鼠分别从16h和20h开始出现死亡。LPS组小鼠平均存活时间为14.9±2.5h，低、高剂量APG给药组小鼠平均存活时间为17.4±2.3h(P＞0.05)和21.7±1.8h(P＜0.01)。由此可见，高剂量迷迭香酸可显著延长败血症小鼠的生存时间。

试验例9：迷迭香酸对大鼠持续状态癫痫的抑制作用

实验动物：SD大鼠32只，10～12周龄，体重230～270g，购自第四军医大学实验动物中心。实验动物饲养环境：室温为25±2℃，12h黑暗/光亮的环境培养，常规饲料喂养。

实验分组：将大鼠随机分为对照组、模型组、迷迭香酸高剂量组(100mg/kg)、迷迭香酸低剂量组(50mg/kg)，每组8只。

实验步骤：除对照组外，其余各组大鼠均建立氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠模型，以127mg/kg的标准腹腔注射氯化锂注射液，20h后以1mg/kg的标准腹腔注射硫酸阿托品注射液，30min后以50mg/kg的标准腹腔注射氯化锂注射液。Racine评分分级标准，0分：无抽搐发作；1分：固定不动，嗅探，触须颤动；2分：节律性点头，面部阵挛；3分：单侧前肢阵挛；4分：双侧前肢阵挛，伴站立；5分：双侧前肢阵挛伴失去平衡、跌倒。≥4分判定为造模成功。

成功造模一周后，迷迭香酸高、低剂量组大鼠给予相应剂量RA灌胃处理，每日一次，持续2周。对照组、模型组给予等量生理盐水。治疗2周后再次进行Racine评分。

统计学处理：实验数据以均数±标准误(Mean±SEM)表示，组间比较采用重复测量的方差分析进行统计。P<0.05表示两组差别具有显著性意义。

实验结果：与对照组比较，模型组Racine评分显著升高(P<0.05)。迷迭香酸低剂量组与高剂量组大鼠治疗后2周Racine评分均低于模型组，且高剂量组大鼠低于低剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5迷迭香酸治疗大鼠持续癫痫状态2周后Racine评分比较

组别	例数	治疗2周后Racine评分
			对照组	8	0
模型组	8	3.32±1.07*
			迷迭香酸低剂量组	8	2.09±0.13<sup>#</sup>
迷迭香酸高剂量组	8	1.5±0.11<sup>#</sup>

注:与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，^#P<0.05。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.迷迭香酸在制备TRPC1抑制剂中的用途。

2.迷迭香酸衍生物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物在制备TRPC1抑制剂中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述迷迭香酸衍生物为迷迭香酸卤代、磺化、硝化、羟化、烷氧化、金属离子、酯化产物。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述迷迭香酸衍生物可成盐或溶剂化物，其中所述的盐包括钠盐、钾盐；所述的溶剂化物是指水合物、乙醇化物。

5.根据权利要求1和2所述的用途，其特征在于：迷迭香酸或其衍生物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物在制备用于预防或治疗心肌缺血再灌注损伤疾病、动脉粥样硬化疾病、心房纤颤疾病、癫痫疾病、败血症疾病、动脉粥样硬化疾病、骨质疏松症疾病药物中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述药物以迷迭香酸、迷迭香酸衍生物及其药学上可接受的盐或其溶剂化物作为药物使用时，可单独或与另一种或几种活性成分一起制成药物组合物。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：除活性成分外，所述的药物组合物还包括药学上可接受的至少一种赋形剂。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的药物组合物采用片剂、丸剂、散剂、胶囊剂、混悬剂、口服溶液、颗粒剂、粉针、注射剂、乳剂以及药学上可接受的剂型。

9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的药物组合物是普通制剂、缓释制剂、速释制剂及控释制剂。

10.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的赋形剂包括但并不局限于崩解剂、润滑剂、分散剂。

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