CN113004364A - 一种高纯度人参皂苷Re的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种高纯度人参皂苷Re的制备方法，包括以下步骤：（1）醇提：采用乙醇对人参原料进行提取，得到提取液；（2）吸附洗脱：利用树脂对所述提取液进行吸附，吸附后用乙醇洗脱，得到粗提物Ⅰ；（3）精处理：对所述粗提物Ⅰ进行洗涤过滤；（4）干燥，得到人参皂苷Re。本发明实现了提取与纯化于一体，且只采用一种有机溶剂，采用简单的工艺便可得到含量≥98%的人参皂苷Re，同时单一有机溶剂方便回收重复利用，降低了生产成本，有良好的工业应用前景。

Description

一种高纯度人参皂苷Re的制备方法

技术领域

本发明属于中药提取技术领域，具体涉及一种高纯度人参皂苷Re的制备方法。

背景技术

人参盛产于中国东北，朝鲜，韩国，日本及俄罗斯等地的一种多年生草本植物，是中国重要的宝藏，人参皂苷是人参的主要化学成分，人参皂苷Re是四环三萜类衍生物，无色针状结晶。人参皂苷都具有相似的基本结构，都含有由30个碳原子排列成四个环的甾烷类固醇核。

人参皂苷Re分布：人参中的Re主要分布在存在于五加科植物人参的根、花蕾、叶、芦头、茎，在人参侧根中含量较为丰富，尤其在西洋参的茎叶中最为丰富。

人参皂苷Re药用价值：（1）人参皂苷Re能够刺激生物机体内的血管舒张以及血管的生成，增强心机收缩功能；（2）人参皂苷Re可以增强抗氧化酶的活性，减少因自由基而造成的心肌的进一步氧化损伤，同时能够调节心肌缺血而导致的代谢紊乱，降低血液粘度，有对心肌保护的作用；（3）人参皂苷Re可以阻碍心室肌细胞对纳盐及钾盐的依赖性，从而具有抗心律失常的作用；（4）人参皂苷Re对由于自然衰老引发的记忆所得障碍有明显的对抗，有一定改善记忆力作用；（5）人参皂苷Re具有维护血清剥夺损害的神经细胞，提高神经细胞成活的数量，抑制其损伤凋亡作用。

授权号为CN108383890B的文件公开了一种高含量人参皂苷Re提取物的制备方法，主要包括用有机溶剂对人参原料进行提取，树脂吸附解析后加入脱色剂、弱碱性无机盐，析出的晶体在通过洗涤干燥得到提取物成品。但是该方法采用的溶剂种类较多，采用的工艺相对复杂，不利于工业化生产的大规模应用。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明的目的是提供一种高纯度人参皂苷Re的制备方法，实现了提取与纯化于一体，且只采用一种有机溶剂，采用简单的工艺便可得到含量≥98%的人参皂苷Re，同时单一有机溶剂方便回收重复利用，降低了生产成本，有良好的工业应用前景。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种高纯度人参皂苷Re的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：（1）醇提：采用乙醇对人参原料进行提取，得到提取液；（2）吸附洗脱：利用树脂对所述提取液进行吸附，吸附后用乙醇洗脱，得到粗提物Ⅰ；（3）精处理：对所述粗提物Ⅰ进行洗涤过滤；（4）干燥，得到人参皂苷Re。

在本方案设计中，制备方法通过步骤合理的加工配合，实现了提取和纯化为一体，得到的皂苷Re含量可达98%以上，且在本方案中，全程只使用了乙醇作为有机溶剂，可有效简化后续的纯化工艺，并且方便回收重复利用，降低了生产成本，从而可应用于大规模的工业化生产。

作为本发明的进一步优选，所述步骤（2）中吸附步骤采用大孔树脂吸附，洗脱步骤采用70%的乙醇进行洗脱，得到人参皂苷Re含量≥20%的粗提物Ⅰ。进一步优选地，大孔树脂为D101、AB-8、LX-1、LX-60中的一种。

作为本发明的进一步优选，所述步骤（3）精处理具体包括以下步骤：

a.将所述粗提物Ⅰ在-4~4℃下静置40~50h，过滤后得到沉淀a；

b.将所述沉淀a用2~8%乙醇，以质体比为1:3~6的用量洗涤，然后离心，得到沉淀b；

c.用32~38%乙醇，以质体比为1:3~6的用量，在75~85℃下使所述沉淀b溶解，完全溶解后趁热过滤，滤液冷却静置，过滤后得到产物c。

在本方案设计中，制备方法通过步骤合理的加工配合，实现了提取和纯化为一体，得到的皂苷Re含量可达98%以上，且在本方案中，全程只使用了乙醇作为有机溶剂，可有效简化后续的纯化工艺，并且方便回收重复利用，降低了生产成本，从而可应用于大规模的工业化生产。

作为本发明的进一步优选，步骤b中沉淀a与乙醇的质体比为1:5，乙醇浓度为5%。

作为本发明的进一步优选，所述步骤c中沉淀b与乙醇的质体比为1:5，乙醇浓度为35%。

在本方案设计中，作为唯一溶剂的乙醇在各阶段的使用量及使用浓度直接影响Re的收率，在各个阶段中，乙醇浓度与质体比过高会导致Re收率降低，乙醇浓度与质体比过低则会导致杂质去除不干净，不满足Re的纯度要求，经本发明人的多次实验证实，采用上述乙醇用量及浓度收率最好，纯度可到98%以上。

作为本发明的进一步优选，所述预处理包括以下步骤：

步骤一：将人参原料进行破碎，取破碎后的人参原料与水混合，接入活化的松针孔菌种子液；

步骤二：将混合体系于25~35℃、pH5.5~6.5条件下培养2~4d，过滤后得到预处理液。

作为本发明的进一步优选，所述破碎后的人参原料与水的质体比为1:20~30。

作为本发明的进一步优选，所述松针孔菌种子液的接种量为10~20%

作为本发明的进一步优选，所述松针孔菌种子液的制备包括以下步骤：

S1：取松针孔菌菌种放入75%乙醇中浸泡，转入无菌水中清洗，再转入2%次氯酸钠溶液中浸泡，转入无菌水中清洗，重复上述步骤2~4次，然后转入固体PDA培养基中培养。

S2：将步骤一得到的松针孔菌转移到液体PDA培养基中，在25~35℃、100~200r/min条件下振荡培养，培养2~3d后，取菌丝体转移至新的液体PDA培养基中扩大培养，得到松针孔菌种子液。

在本方案设计中，为了进一步提高人参皂苷Re的提取率，本发明人采用了松针孔菌种子液对人参原料进行预处理，本发明采用松针孔菌的优势在于：松针孔菌分别广泛，方便得到，制备成本较低；松针孔菌对生长环境的营养物要求较低，易于扩大培养；松针孔菌可生成多种胞外酶，可对人参原料中的木质素、纤维素、半纤维素有效降解，促进Re等活性成分释放，大幅度提高提取速率及提取率；松针孔菌可生成多种胞外酶，使提取过程中产生的色素物质发生氧化还原反应，使其脱色，因此不需要额外加入脱色剂，降低了成本；松针孔菌菌体本身可以吸附多种不同种类的重金属离子，如人参原料中因种植等因素富集的重金属离子在提取过程中可被除去，最终得到的产品中不含重金属，进一步提高了产品的品质；松针孔菌有较强的竞争优势，在同一环境下可抑制其他微生物的生长，因此可直接与提取原料进行混合培养；松针孔菌本身无害，特别是其含有的齿孔酸活性成分经学者证实还具有抗炎、缓解高尿酸血症、防治通风等作用，增强了本发明最终产品的有益效果，可提高产品的竞争力。

本发明具有以下有益效果：

本发明采用了提取和纯化为一体的工艺，且只使用一种有机溶剂，得到的皂苷Re含量可达98%以上，方便回收重复利用，降低了生产成本，有良好的工业应用前景。

本发明采用了预处理工艺，通过松针孔菌种子液与提取原料混合提取，加快了有效成分的释放，提高了皂苷Re的提取率；加入松针孔菌培养对产品进行了品质提升，有利于提高产品的竞争力；预处理工艺简单易操作，生产成本不高，有利于工业化生产。

附图说明

附图1为本发明实施例1提取工艺流程图。

附图2为本发明实施例4提取工艺流程图。

具体实施方式

实施例1

提取过程如附图1所示，具体步骤如下：1.取人参茎叶（直接购买得到）进行粉碎，用60%乙醇，95℃提取，质体比1：10，得到粗提液；2.将粗提液脱除乙醇后利用大孔树脂D101吸附后并70%乙醇洗脱，得到20%人参Re粗品，减压蒸馏除去乙醇后，4℃静置48h；3.将得到的20%人参Re粗品用5%乙醇+95%水溶液清洗，质体比1：5，清洗3次，进而得到70%人参Re粗品；4.将得到的70%人参Re粗品用35%乙醇+65%水溶液，质体比1：5，水浴80℃，冷却回流1h，趁热过滤，滤液放置4℃，冷却静置12h，产生结晶，再用精密滤纸过滤，最后将过滤好的结晶干燥，即得到人参皂苷Re提取物。

实施例2

提取过程具体步骤如下：1.取人参茎叶（直接购买得到）进行粉碎，用60%乙醇，95℃提取，质体比1：10，得到粗提液；2.将粗提液脱除乙醇后利用大孔树脂AB-8吸附后并70%乙醇洗脱，得到20%人参Re粗品，减压蒸馏除去乙醇后，0℃静置40h；3.将得到的20%人参Re粗品用5%乙醇+95%水溶液清洗，质体比1：5，清洗3次，进而得到70%人参Re粗品；4.将得到的70%人参Re粗品用35%乙醇+65%水溶液，质体比1：5，水浴85℃，冷却回流1.5h，趁热过滤，滤液放置4℃，冷却静置12h，产生结晶，再用精密滤纸过滤，最后将过滤好的结晶干燥，即得到人参皂苷Re提取物。

实施例3

提取过程具体步骤如下：1.取人参茎叶（直接购买得到）进行粉碎，用60%乙醇，95℃提取，质体比1：10，得到粗提液；2.将粗提液脱除乙醇后利用大孔树脂LX-1吸附后并70%乙醇洗脱，得到20%人参Re粗品，减压蒸馏除去乙醇后，-4℃静置50h；3.将得到的20%人参Re粗品用5%乙醇+95%水溶液清洗，质体比1：5，清洗3次，进而得到70%人参Re粗品；4.将得到的70%人参Re粗品用35%乙醇+65%水溶液，质体比1：5，水浴75℃，冷却回流2h，趁热过滤，滤液放置4℃，冷却静置12h，产生结晶，再用精密滤纸过滤，最后将过滤好的结晶干燥，即得到人参皂苷Re提取物。

实施例4

本实施例与实施例1的不同之处在于，取人参茎叶（直接购买得到）粉碎后先进行预处理步骤。

在预处理步骤中采用的松针孔菌种子液制备如下：

松针孔菌初筛培养：取菌种切成1cm见方的小块，放入75%乙醇中浸泡60s，然后无菌水清洗；转入2%次氯酸钠溶液中浸泡5min，然后无菌水清洗；如此反复操作3次，将其转入固体PDA培养基中，每个培养皿中放入4块菌种，将培养皿倒置放入培养箱中30℃恒温培养。

松针孔菌纯化培养：将初筛培养后的松针孔菌转移到新的PDA培养基中，置于30℃恒温培养，直至平板上的菌丝长到培养皿边缘时，将其放入4℃冰箱中保存。

松针孔菌种子液培养：将保存的松针孔菌进行活化，然后转移到装有100ml液体PDA培养基的锥形瓶中，在30℃、150r/min条件下振荡培养3d，然后转移至100ml液体PDA培养基中，同等条件下扩大培养，作为种子液。

预处理步骤具体如下：

1.取破碎后的人参茎叶，以质体比1:20加入纯化水，然后加入松针孔菌种子培养液，松针孔菌的接种量为10%，然后在温度30℃、pH为5.5的条件下进行培养；

2.培养3d后，对混合体系进行过滤去除固体杂质，得到预处理液。

将得到的预处理液按照实施例1中的醇提、吸附洗脱等后续工艺处理得到人参皂苷Re提取物。

实施例5

本实施例与实施例4的不同之处在于，松针孔菌的接种量为15%。

实施例6

本实施例与实施例4的不同之处在于，松针孔菌的接种量为20%。

实施例7

本实施例与实施例4的不同之处在于，将纯化后的松针孔菌接种到产酶培养基中培养5d，然后置于摇床中振荡培养（温度25℃，120rpm，时间10d）；取培养后的发酵液于4000rpm/min下离心15min，取上清液为酶提取液。

取破碎后的人参茎叶，以质体比1:10加入纯化水，然后加入15%的酶提取液，在温度30℃、pH为5.5的条件下进行酶解，酶解时间为8h，过滤除杂后得到酶解液；

用0.45μm微孔滤膜对酶解液进行过滤，除去其他杂质，然后按照实施例1中的醇提、吸附洗脱等后续工艺处理得到人参皂苷Re提取物。

对上述实施例1~7进行人参皂苷Re的检测：

一、色谱条件：流动相为乙腈(A)-水（B）二元洗脱系统，采用梯度洗脱方式，Agilent technology 1200 series HPLC 紫外检测器，色谱柱Agilent Eclipse XDB-C185μm 250mm*4.6mm，柱温25℃，检测波长203nm，流速0.7mL/min，进样体积10μL，洗脱程序见表：

二、溶液的制备

1.标准品溶液的配制：精密称取人参皂苷Re标准品约12.1mg于50mL容量瓶中，加入大约40mL的甲醇溶解，等完全溶解用甲醇定容至刻度，摇匀待用。

2.供试品溶液的配制：固体试样：精密称取供试品10mg粉碎试样，加入30mL甲醇，等完全溶解加甲醇定容至50mL，摇匀待用。

3.含量的测定

取标准品和供试品溶液分别经0.45μm膜过滤后注入液相色谱仪，记录色谱图；结果按外标法计算人参Re的含量。

人参Re计算公式如下：

式中：

X表示供试品中人参皂苷Re的百分含量（%）

Ax表示供试品中人参Re的峰面积

Cx表示供试品浓度（mg/mL）

As表示对照品中人参皂苷Re的峰面积

Cs表示对照品浓度（mg/mL）

4.回收率测定

三、结果分析

对上述实施例1~7测定实验数据如下表：

如上表所示，实施例1~3得到的皂苷Re提取物含量均高于98%，回收率大于70%，证明了本发明采用单一有机溶剂、集提取与纯化于一体的方案具有良好的实践意义；实施例4~6证明经本发明采用的松针孔菌种子液预处理后，含量得到了提高，回收率大大提高，证明了本发明采用的预处理工艺具有促进Re溶出的效果（在10%~20%接种范围内，20%的提升不明显，从成本考虑15%为最佳）；实施例7采用了进一步对松针孔菌进行酶提取，得到的提取物含量及回收率较高，但基于酶提取工艺成本较高，因此在实际工业化生产中采用松针孔菌活化液处理更好。

通过实验人员肉眼观察，实施例1~3的提取物略微偏黄，实施例4~6、与实施例7得到的提取物颜色接近白色，相差不大，原因可能是松针孔菌产生的胞外酶具有脱色效果。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (9)

1.一种高纯度人参皂苷Re的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）醇提：采用乙醇对人参原料进行提取，得到提取液；（2）吸附洗脱：利用树脂对所述提取液进行吸附，吸附后用乙醇洗脱，得到粗提物Ⅰ；（3）精处理：对所述粗提物Ⅰ进行洗涤过滤；（4）干燥，得到人参皂苷Re。

2.根据权利要求1所述的一种高纯度人参皂苷Re的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中吸附步骤采用大孔树脂吸附，洗脱步骤采用70%的乙醇进行洗脱，得到的所述粗提物Ⅰ中人参皂苷Re含量≥20%。

3.根据权利要求2所述的一种高纯度人参皂苷Re的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）具体包括以下步骤：

a.将所述粗提物Ⅰ在-4~4℃下静置40~50h，过滤后得到沉淀a；

b.将所述沉淀a用2~8%乙醇，以质体比为1:3~6的用量洗涤，然后离心，得到沉淀b；

c.用32~38%乙醇，以质体比为1:3~6的用量，在75~85℃下使所述沉淀b溶解，完全溶解后趁热过滤，滤液冷却静置，过滤后得到产物c。

4.根据权利要求3所述的一种高纯度人参皂苷Re的制备方法，其特征在于，所述步骤b中沉淀a与乙醇的质体比为1:5，乙醇浓度为5%。

5.根据权利要求4所述的一种高纯度人参皂苷Re的制备方法，其特征在于，所述步骤c中沉淀b与乙醇的质体比为1:5，乙醇浓度为35%。

6.根据权利要求1所述的一种高纯度人参皂苷Re的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）前设置有预处理步骤，具体包括：

步骤一：将人参原料进行破碎，取破碎后的人参原料与水混合，接入活化的松针孔菌种子液；

步骤二：将步骤一得到的混合体系于25~35℃、pH5.5~6.5条件下培养2~4d，过滤后得到预处理液。

7.根据权利要求6所述的一种高纯度人参皂苷Re的制备方法，其特征在于，所述步骤一中破碎后的人参原料与水的质体比为1:20~30。

8.根据权利要求6所述的一种高纯度人参皂苷Re的制备方法，其特征在于，所述步骤一种松针孔菌种子液的接种量为10~20%。

9.根据权利要求6所述的一种高纯度人参皂苷Re的制备方法，所述松针孔菌种子液的制备包括以下步骤：S1：取松针孔菌菌种放入75%乙醇中浸泡，转入无菌水中清洗，再转入2%次氯酸钠溶液中浸泡，转入无菌水中清洗，重复上述步骤2~4次，然后转入固体PDA培养基中培养；

S2：将S1得到的松针孔菌转移到液体PDA培养基中，在25~35℃、100~200r/min条件下振荡培养，培养2~3d后，取菌丝体转移至新的液体PDA培养基中扩大培养，得到松针孔菌种子液。

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