KR20070001927A

KR20070001927A - 분획 장치 및 분획 방법

Info

Publication number: KR20070001927A
Application number: KR1020067014624A
Authority: KR
Inventors: 가즈히로 다나하시; 이찌로 구모; 노부유끼 구로끼; 히로유끼 수가야; 사또꼬 야마다; 시게히사 와다; 기만 정; 도시히꼬 구로다; 슈지 세끼구찌
Original assignee: 도레이 가부시끼가이샤
Priority date: 2004-01-21
Filing date: 2005-01-20
Publication date: 2007-01-04
Also published as: US20070244306A1; EP1707573B1; CN1934129B; US7795010B2; EP1707573A4; CA2553234C; JP4655938B2; CA2553234A1; CN1934129A; EP1707573A1; JPWO2005070954A1; JP2011006466A; WO2005070954A1; ES2605406T3

Abstract

본 발명에서는 이하의 구성을 개시한다.

1. 여과부, 농축부, 회수부 및 송액 펌프를 구비하고, 여과부, 농축부 및 회수부를 접속하는 유로를 포함하는 회로가 폐색 회로인 막을 사용한 분획 장치.

2. 단백질을 흡착하는 항체가 없는 상태에서, 인간 α₁ 마이크로글로블린과 인간 알부민과의 투과 비율이 1.5 이상 1000 이하인 막 분리 시스템의 중반 또는 후반부에, 특정한 단백질을 흡착하는 항체를 내장한 항체 흡착 막 분리 시스템에 대하여, 생체 성분 유래의 시료를 공급하고, 생체 성분의 일부를 분리하는 것을 특징으로 하는 생체 성분의 분리 방법.

3. 복수종의 단백질 및 물을 함유하는 용액을 중공사 분리막에 접촉시키고, 단백질을 분획하는 방법이며, 분획에서의 용액이 유기 용매를 함유하는 것을 특징으로 하는 단백질의 분획 방법.

분획 장치

Description

분획 장치 및 분획 방법{FRACTIONATOR AND METHOD OF FRACTIONATION}

본 발명은 생체 성분 함유 용액, 특히 인간의 혈액, 혈장, 소변 등의 원액으로부터 단백질 등의 생체 분자를 분획하여, 원액으로부터 조성을 변화시킨 시료를 얻기 위한 방법 및 이를 위한 장치에 관한 것이다. 특히, 임상 프로테옴(proteome) 해석을 목적으로 하고, 미량 성분의 검출에 대하여 방해되는 성분, 특히 고분자량의 단백질을 제거하고, 생체 성분의 조성을 변화시킨 용액을 분획하는 방법 및 이를 위한 장치에 관한 것이다.

최근 포스트 게놈 연구로서, 프로테옴 해석 연구(프로테오믹스)가 주목받기 시작하였다. 유전자 산물인 단백질은 유전자보다도 질환의 증상에 직접 링크하고 있는 것으로 생각되기 때문에, 단백질을 망라적으로 조사하는 프로테옴 해석의 연구 성과는 진단과 치료에 널리 응용할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 또한, 게놈 해석에서는 발견할 수 없었던 병의 원인 단백질이나 질환 관련 인자를 많이 발견할 수 있을 가능성이 높다.

프로테옴 해석이 급속히 진전되기 시작한 것은, 기술적으로는 질량 분석 장치(Mass Spectrometer: MS)에 의한 고속 구조 분석이 가능하게 된 것이 크고, MALDI-ToF-MS(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry) 등의 실용화에 의해서, 폴리펩티드의 작업 처리량이 높은 초미량 분석이 가능해지고, 종래 검출할 수 없었던 미량 단백질까지 동정(同定) 가능해지며, 질환 관련 인자의 탐색에 강력한 수단이 되고 있다.

프로테옴 해석의 임상 응용의 제1 목적은, 질환에 의해서 유도 또는 소실되는 바이오 마커 단백질의 발견이다. 바이오 마커는, 병의 용태에 관련하여 활동하기 때문에, 진단의 표지가 될 수 있을 뿐만 아니라, 신약 개발의 목적이 될 가능성도 높다. 즉, 프로테옴 해석의 성과는, 특정 유전자보다도 진단의 표지나 신약 개발의 목적이 될 가능성이 높기 때문에, 포스트 게놈 시대의 진단과 치료의 증거 기술이 되고, 동정된 바이오 마커는 환자의 약제 응답성 평가나 부작용 발현 예측이라는 직접적으로 환자가 누릴 수 있는 이익에 연결되기 때문에, 소위 테일러메이드 의료(오더메이드 의료)의 추진에 큰 역할을 한다고 할 수 있다.

임상 연구에 프로테옴 해석(임상 프로테오믹스)을 도입하는 경우에는, 다량의 검체를 신속, 확실하게 해석하는 것이 요구되고 있으며, 임상 검체는 미량으로도 귀중하기 때문에 고분해능·고감도·고기능 측정을 신속히 행할 필요가 있다. 이렇게 추진력이 큰 것은 질량 분석(Mass Spectrometry)이고, 질량 분석 장치가 갖는 초고감도로 높은 작업 처리량의 특성에 기여하는 바가 크다. 그러나, 그 방법이나 기기가 급속히 개량되었지만, 프로테옴 해석이 임상 현장에서 간편하고 신속하게 실시할 수 있는 상황은 아직 아니다.

그 원인 중 하나로 임상 검체의 전처리를 들 수 있다. 질량 분석을 행하기 전의 처리로서 임상 검체의 단백질을 분획하여 정제할 필요가 있고, 이 처리에는 아직 며칠 걸리는 것이 실태이며, 전처리의 조작이 번잡하고 경험도 요구되는 것이 임상에의 응용의 큰 장해가 되고 있다. 소량의 혈액이나 체액으로부터 전신의 질환의 진단이나 병의 용태 관리가 가능하면, 그 유용성은 매우 크지만, 혈장 중에 포함되는 단백질의 다양성 때문에 많은 과제가 발생하고 있다.

인간·단백질은 10만종 이상으로도 추정되고 있지만, 혈청 중에 포함되는 단백질만도 약 1만 종류에 달하는 것으로 알려져 있고, 총량으로서의 혈청 중 농도는 약 60 내지 80 mg/㎖이다. 혈청 중 고함량의 단백질은 알부민(분자량 66 kDa), 면역 글로블린(150 내지 190 kDa), 트랜스페린(80 kDa), 헵토글로빈(>85 kDa), 리포단백질(수100 kDa) 등이고, 모두 다량(>mg/㎖)으로 존재한다. 한편, 병의 용태의 바이오 마커나 병의 원인 관련 인자라 생각되고 있는 펩티드 호르몬, 인터루킨, 사이토카인 등의 생리 활성 단백질의 대부분은 극미량(<ng/㎖) 밖에 존재하지 않는다. 그 함유량의 비는 고분자의 고함량 성분과 비교하여 실제로 나노(nano)에서 피코(pico) 수준이다. 단백질의 크기라는 점에서는, 단백질 전체 종류의 70 ％ 이하는 분자량 60 kDa 이하이고, 상기의 극미량인 바이오 마커 단백질은 모두 이 영역에 포함되는 경우가 대부분이다(예를 들면 비특허 문헌 1). 이들 단백질은 신장을 통과하여 소변 중에 일부 배설되기 때문에, 혈액 뿐만 아니라 소변을 검체로서 측정하는 것도 가능하다.

일반적인 혈청학적 검사에서 프로테옴 해석하기 위해서는, 1) 병의 원인과 관련된 미량 성분 검출의 방해가 되는 분자량 6만 이상의 고분자량 성분을 제외하는 것, 2) 분리된 분자량 6만 미만의 병의 원인과 관련된 미량 성분을 확실하게 회 수하는 것이 중요하다.

고분자량 단백질의 분리 수단으로서, 현실에서는 고속 액체 크로마토그래피(Liquid Chromatography: LC)나 이차원 전기 영동(2Dimensional-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis: 2D-PAGE)이 사용되고 있지만, LC나 2D-PAGE의 작업만으로도 1 내지 2일 소요되고 있다. 이 소요 시간은 MALDI-TOF-MS나 ESI-MS(ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry) 등의 몇분이라는 분석 시간에 비해 매우 길고, MS가 가진 높은 작업 처리량이라는 큰 이점이 임상 프로테옴 해석에서는 충분히 발휘되지 않고 있다. 이 때문에, 의료 현장에서 진단이나 치료를 위해 가능한 한 단시간에 분석 결과를 원한다는 목적에는, 현 시점에서는 실용성이 매우 떨어지며, 일상적인 임상 검사에 MS가 이용되기 어려운 하나의 큰 원인이 되고 있다. 이 점이 해결되면, 임상 프로테옴 해석에 의한 임상 검사의 진단의 신속성은 비약적으로 향상될 것으로 기대할 수 있다. 구체적으로는, LC나 2D-PAGE의 대체가 되는, 미량의 검체로 고속으로 목적 단백질군을 분획·분리할 수 있는 디바이스·장치가 요망되고 있다.

또한 LC나 2D-PAGE는 미량의 샘플밖에 처리할 수 없기 때문에, 얻어지는 샘플 중에 포함되는 바이오 마커의 양도 적고, 이제까지 개시된 시료의 조정 방법에서는 MS 분석, 2차원 전기 영동 분석 등의 단백질 분석을 행하여도 마커가 검출되지 않는 경우가 있다.

알부민을 주된 제거 대상 물질로 하여, 이미 실용화되어 있는 제품 또는 개시되어 있는 기술로는, 블루 색소 등의 친화성 배위자를 고정화시킨 담체, 고분자 량 성분을 원심 분리 여과에 의해서 분획하는 원심관 형식의 장치(비특허 문헌 2, 특허 문헌 1), 전기 영동 원리에 의해서 분획하는 방법, 콘(Cohn)의 에탄올 침전 등의 전통적인 침전법이나 크로마토그래피에 의해서 분획하는 방법(예를 들면 비특허 문헌 3) 등이 있다. 또한, 알부민과 면역 글로블린 G(IgG)를 동시에 제거하는 제품도 시판되고 있다. 그러나 이들은 모두 분리 분획 성능이 불충분하거나, 미량 샘플에는 부적당하거나, 분석의 대상이 되는 단백질이 희석되어 버리거나, 또는 질량 분석 등에 장해가 되는 약제가 혼입되거나, 재현성이 떨어지는 등의 문제점이 있었다.

2D-PAGE나 액체 크로마토그래피 등은 고분리능이다. 그러나 번잡하고 시간이 걸리는 방법보다도, 간편하고 단시간에 높은 분리능을 갖는 디바이스가 요구되고 있다. 최근에도 아피-겔 블루 겔 (Affi-Gel Blue)을 사용한 방법(비특허 문헌 4)이나 그라디플로우 (Gradiflow) 시스템을 사용한 방법(비특허 문헌 5) 등이 유효한 개량된 알부민 제거법으로서 발표되어 있지만, 더욱 간편하게 하여 고분리능을 갖는 방법은 보고되어 있지 않다. 또한, 블루 겔은 알부민과 같은 고분자량의 단백질을 특이적으로 제거하는 것은 아니고, 프로테옴 해석의 대상이 되는 단백질도 동시에 제거하는 가능성은 부정할 수 없다. 액체를 순환시킬 수 있는 여과 장치로는, 나선상으로 권취된 평막을 하우징 중에 장전한 여과 장치가 개시되어 있지만(특허 문헌 2), 그 상태로는 분리 성능이 불충분하였다. 또한, 극미량의 단백질을 정밀도 높게 검지하기 위해서는 이물질의 혼입을 방지할 필요가 있다. 이물질로는 단백질 이외의 것은 물론, 목적 이외의 세포나 미생물도 포함된다. 또한, 예를 들 면 특정 환자의 혈청 중 단백질의 분석에서, 다른 환자의 혈청 중의 단백질이 이물질이 된다. 이물질 혼입에 대한 대책이 실시되어 있는 장치는 없다.

단백질 용액으로부터 분리막을 사용하여 단백질을 분리·회수하는 방법에 대해서는, 예를 들면 특허 문헌 3, 4에 개시되어 있다. 특허 문헌 3은 방법만을 개시하고, 단백질 분리에 필수적인 구조를 갖는 구체적 장치까지는 개시되어 있지 않다. 또한 특허 문헌 4에서는, 필수 구성 부분을 모두 구비하여 이루어진 1대의 분리 장치에 대해서는 언급되어 있지 않다.

또한, 특허 문헌 4에 나타낸 바와 같이, 중공사막을 사용하여 목적 단백질을 분리·정제하는 기술이 알려져 있다. 특허 문헌 4에서는 직접 개시되어 있지 않지만, 이들 분리 기술에서는 막을 설치한 칼럼 또는 겔을 충전한 칼럼과, 송액 펌프를 실리콘 튜브 등으로 접속하고, 송액 펌프에 의해 이동상을 반송하고, 그 흐름 중에 목적 물질을 포함하는 원액을 투입하여 막 또는 칼럼에 접촉시킴으로써 목적 물질을 분리하는 방법이 일반적이다. 복수개의 다른 시료를 처리하는 경우에는, 분석간의 오염을 피하기 위해서 세정 조작이 필요하고, 그 결과 시간이 걸리며, 만일 시료 중에 병원체가 포함된 경우에는, 처리 조작 중에 병원체가 누출되어 작업자가 감염될 우려도 있었다.

이를 해결하는 방법이나 장치의 개발에 의해, 의학 연구 및 임상 현장에서 프로테옴 해석이 널리 행해지게 되고, 보다 신속하고 고정밀도의 검사나 진단이 가능해져, 유용한 치료법이 없는 난치성 질환의 원인 구명이나 조기 진단법의 개발에는 강력한 수단이 될 것으로 기대할 수 있다.

비특허 문헌 1: 앤더슨 NL(Anderson NL), 앤더슨 NG(Anderson NG) 저술, "인간 플라즈마 프로테옴: 유래, 특징과 진단 가능성(The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects)", 분자와 세포의 프로테오믹스(Molecular ＆ Cellular Proteomics), (미국), 미국 사회를 위한 생화학과 분자 생물학(The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.), 2002년, 제1권, p845-867

비특허 문헌 2: (Radhakrishna S. Tirumalai)외 저, "저분자량 인간 혈청 프로테옴의 특징(Characterization of the low molecular weight human serum proteome)", 분자와 세포의 프로테오믹스(Molecular ＆ Cellular Proteomics), (미국), 미국 사회를 위한 생화학과 분자 생물학(The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.), 2003년, 제2권, p1096-1103

비특허 문헌 3: 닛본 세이가가꾸가이 편저, "신생 화학 실험 강좌(제1권) 단백질 (1) 분리·정제·성질", 도쿄 가가꾸 도오진, 1990년

비특허 문헌 4: 아메드 엔(N. Ahmed)외 저, "(An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum)", 프로테오믹스(Proteomics), 2003년, 3권, p1980-1987

비특허 문헌 5: 로데문트(D.L. Rothemund)외 저, "(Depletion of the highly abundant protein albumin from human plasma using the 그라디플로우.)", 프로테오믹스(Proteomics), 2003년, 3권, p279-287

특허 문헌 1: 일본 특허 공표 2002-542163호 공보

특허 문헌 2: 일본 특허 공개 (평)04-330921공보

특허 문헌 3: 일본 특허 공개 (소)59-116223호 공보

특허 문헌 4: 일본 특허 공개 (평)7-133289호 공보

특허 문헌 5: 일본 특허 공개 제2003-130882호 공보

특허 문헌 6: 일본 특허 공개 (소)58-40323호 공보

특허 문헌 7: 일본 특허 제3297707호 공보

<발명의 개시>

본 발명에서는 복수개의 발명을 포함하지만, 각각의 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 이하와 같다.

1) 단백질 등의 생체 성분을 포함하는 용액을 원액으로 하고, 원액으로부터 얻어지는 용액에의 이물질의 혼입이 적으며, 계외에의 오염이 적고, 간편·신속하게 목적으로 하는 용질을 분리하는 분획 장치를 제공하는 것.

2) 생체 성분을 포함하는 용액에 포함되는 고분자량의 단백질을 효율적으로 제거하는 생체 성분의 분리 방법 및 분리 장치를 제공하는 것.

과제를 해결하기위한 수단은 크게 3가지로 분류하고, 이하와 같다. 본 발명에서는, 제1 발명으로서 이하를 개시한다.

(1) 원액 중 용질 또는 그 일부를 막을 사용하여 분리하는 분획 장치에서, 상기 분획 장치가 적어도

1) 원액을 투입하는 공급부와,

2) 공급부에서 보내진 원액 중 용질의 일부를 여과하는 여과부와,

3) 여과부에서의 여과액을 농축하는 농축부와,

4) 분획시에 장치 내에 도입되는 이동상을 송액하기 위한 송액 펌프를 구비하고, 상기 여과부, 상기 농축부 및 상기 여과부와 상기 농축부를 접속하는 유로가 형성하는 회로가 폐쇄 회로인 것을 특징으로 하는 분획 장치.

(2) 상기 분획 장치가 추가로

5) 농축부에서 얻어지는 농축액을 회수하는 회수부를 구비하여 공급부, 여과부, 및 공급부와 여과부를 접속하는 유로가 형성하는 회로 및 농축부, 회수부 및 농축부와 회수부를 접속하는 유로가 형성하는 회로가 각각 폐쇄 회로인 것을 특징으로 하는 상기 분획 장치.

(3) 상기 폐쇄한 회로의 총 내용적이 50 ㎖ 이하인 것을 특징으로 하는 상기 임의의 분획 장치.

(4) 여과부 및 농축부 각각에 여과기를 사용한 것을 특징으로 하는 상기 분획 장치

(5) 여과기가 중공사막을 내장한 모듈인 것을 특징으로 하는 상기 분획 장치.

(6) 공급부와 여과부 사이의 유로에는 원액을 수송하기 위한 펌프를 구비하는 것을 특징으로 하는 상기 임의의 분획 장치.

(7) 회수부는 농축액을 채취하는 용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 임의의 분획 장치.

(8) 상기 회로 중 임의의 위치에 원액을 투입했을 때의 부피 변화를 수용하는 완충부를 갖는 것을 특징으로 하는 상기 임의의 분획 장치.

(9) 공급부, 여과부, 농축부, 회수부와, 상기 각 부분을 접속하는 유로를 포함하는 회로의 적어도 일부가 카트리지에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 임의의 분획 장치.

(10) 송액 펌프가 회전 가능한 로터와 로터의 외주에 자유롭게 회전하도록 설치된 롤러를 구비한 튜브 펌프이고, 상기 카트리지의 외벽의 일부가 회로의 일부 유로를 압착하기 위한 압착 부재인 것을 특징으로 하는 상기 분획 장치.

(11) 상기 카트리지를 롤러형 튜브 펌프의 로터에 이접(離接)하는 방향으로 이동시켜서, 송액관을 압착할 수 있도록 하는 이동 기구를 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 상기 분획 장치.

(12) 원액이 체액 또는 생체 성분 함유액인 것을 특징으로 하는 상기 임의의 분획 장치.

(13) 카트리지 및 롤러형 튜브 펌프를 구비하고, 원액 중 용질 또는 그 일부를 막을 사용하여 분리하는 분획 장치이며, 카트리지가 원액을 공급하기 위한 공급부와, 상기 공급부에서 유로에 의해서 접속된 원액으로부터 용질을 막에 의해서 분획하는 수단과, 상기 용질을 분획하는 수단으로부터 유로에 의해서 접속된 분획된 용질을 회수하는 회수부를 적어도 갖는 회로의 적어도 일부를 내장하며, 상기 회로가 폐쇄 회로이고, 상기 카트리지 외벽의 일부가 롤러형 튜브 펌프로부터 튜브를 압착하기 위한 압착 부재이며, 상기 회로의 일부인 튜브가 상기 압착 부재의 외벽의 일부에 설치되어 있는 것을 특징으로 하는 분획 장치.

(14) 원액 중 용질 또는 그 일부를 막을 사용하여 분리하는 분획 장치용 회로이며, 카트리지 중에 원액을 공급하기 위한 공급부와, 상기 공급부에서 유로에 의해서 접속되고, 원액으로부터 용질을 막에 의해서 분획하는 수단과, 상기 용질을 분획하는 수단으로부터 유로에 의해서 접속되며, 분획된 용질을 회수하는 회수부를 포함하는 회로의 적어도 일부를 내장하고, 상기 회로가 폐쇄 회로이며, 상기 카트리지 외벽의 일부가 압착 부재이며, 상기 회로의 일부인 튜브가 상기 압착 부재의 외벽의 일부에 설치되는 것을 특징으로 하는 분획 장치용 회로.

또한 본 발명에서는, 제2 발명으로서 이하의 발명을 개시한다.

(1) 단백질을 흡착하는 항체가 없는 상태에서, 인간 α₁마이크로글로블린과 인간 알부민과의 투과 비율(인간 α₁ 마이크로글로블린 투과율/인간 알부민의 투과율)이 1.5 이상 1000 이하인 막 분리 시스템의 중반 또는 후반부에, 특정한 단백질을 흡착하는 항체를 내장한 항체 흡착 막 분리 시스템에 대하여, 생체 성분 유래의 시료를 공급하고, 생체 성분의 일부를 분리하는 것을 특징으로 하는 생체 성분의 분리 방법이며, 분리에 의해 얻어지는 상기 단백질의 농도가 항체가 없는 상태에서의 막 분리 시스템으로 얻어지는 농도의 10 ％ 이하인 생체 성분의 분리 방법.

(2) 특정한 단백질이 혈청 알부민, 면역 글로블린 G, 면역 글로블린 A, 면역 글로블린 M, 트랜스페린, 헵토글로빈, α₁안티트립신, α₂거대 글로블린, α₁산성글리코프로테인, 피브리노겐, 보체 C1q, 보체 C3, 보체 C4, 보체 C8, 보체 C9, 보체 인자 B, 아폴리포프로테인 A, 아폴리포프로테인 B, Lp(a), 콜라겐, 미오신, 액틴, 사이토케라틴, 케라틴 및 피브로넥틴 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 상기 생체 성분의 분리 방법.

(3) 항체가 폴리클론성 항체 또는 모노클로날 항체 또는 항원 인식 부위를 포함하는 이들의 일부분인 것을 특징으로 하는 상기 임의의 생체 성분의 분리 방법.

(4) 항체가 막 분리 시스템의 막 표면에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 임의의 생체 성분의 분리 방법.

(5) 막 분리 시스템이 분리막을 내장하는 칼럼을 다단 직렬로 조합한 것이며, 항체가 제1 단계째 칼럼의 분리막의 원액측의 표면에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 임의의 생체 성분의 분리 방법.

(6) 상기 (17)에 있어서, 막 분리 시스템이 분리막을 내장하는 칼럼을 다단 직렬로 조합한 것이며, 항체가 제1 단계째 칼럼의 분리막의 투과측의 표면에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 생체 성분의 분리 방법.

(7) 막 분리 시스템이 분리막을 내장하는 칼럼을 다단 직렬로 조합한 것이며, 항체가 전단의 칼럼의 막과 후단의 칼럼의 막 사이에 있는 유로 중의 이동상으로 존재하는 것을 특징으로 하는 상기 임의의 생체 성분의 분리 방법.

(8) 막 분리 시스템이 분리막을 다단 직렬로 조합한 것이며, 항체가 전단의 막과 후단의 막 사이의 유로에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 임의의 생체 성분 분리 방법.

(9) 인간 α₁마이크로글로블린과 분자량 6만 이상의 인간 알부민과의 투과 비율이 2 이상 1000 이하인 막 분리 장치, 및 막 분리 장치의 유로의 도중 또는 후방에, 항체를 내장하는 항체 처리 장치를 갖는 생체 성분 분리 장치.

또한 본 발명에서는, 제3 발명으로서 이하의 발명을 개시한다.

(1) 복수종의 단백질 및 물을 함유하는 용액을 중공사 분리막에 접촉시켜 단백질의 분자량의 크기에 따라서 단백질을 분획하는 방법이며, 분획에서의 용액이 유기 용매를 함유하는 것을 특징으로 하는 단백질의 분획 방법.

(2) 유기 용매의 함유량이 1 용량％ 이상 20 용량％ 미만인 것을 특징으로 하는 상기 단백질의 분획 방법.

(3) 유기 용매가 아세토니트릴인 것을 특징으로 하는 상기 임의의 단백질의 분획 방법.

(4) 분획이 30 ℃ 이하에서 행해지는 것을 특징으로 하는 상기 임의의 단백질 분획 방법.

<발명의 효과>

제1 발명으로서 개시된 분획 장치에서는, 폐쇄 회로의 장치를 사용함으로써, 소요 시간으로는 단시간에 분석 검체(분획 장치 회수액)의 콘터미네이션 및 바이오해져드를 방지하면서, 원액, 특히 혈장을 비롯한 체액으로부터 알부민 등의 고분자량 단백질을 간편하고 효율적으로 분획할 수 있다. 또한 본 발명의 장치에서, 장치의 일부를 카트리지에 포함시킴으로써, 간편하게 다음 시료의 분획 조작에 착수할 수 있다.

제2 발명에 따르면, 분자량이 다른 복수개의 단백질을 함유하는 용액으로부터 효율적으로 고분자량의 단백질을 제거하고, 미량의 저분자량 단백질이 풍부한 용액을 얻을 수 있으며, 질량 분석에서 이들 저분자량 단백질을 용이하게 검출하는 것을 가능하게 한다.

제3 발명에 의하면, 분자량이 다른 복수개의 단백질을 함유하는 용액으로부터 효율적으로 고분자량의 단백질을 제거하고, 미량의 저분자량 단백질을 고회수율로 얻을 수 있다.

[도 1] 실시예 1(제1 발명)에 사용한 장치의 사시도

[도 2] 실시예 1(제1 발명)에 사용한 장치의 정면도 및 좌측면도

[도 3] 제2 발명인 생체 성분의 분리 방법의 발명 중 한 양태를 나타내는 개념도

[도 4] 실시예 2(제2 발명)에서 얻어진 각 분획의 전기 영동(SDS-PAGE) 사진

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 간단한 설명>

1 시린지

2a 3방향 이음매

2b 고무 버튼(공급부)

2c 이음매

5a, 5b, 5c 분리부 중공사막 모듈

5d 농축부 중공사막 모듈

6a, 6b, 6c, 6d 하부 노즐

7a, 7b, 7c, 7d 동체 하부 노즐

8 압착 부재

8a, 8b 가이드축

9 다채널식 회전 롤러

9a, 9b, 9c 회전 롤러

10 회수 용기

11 회수 용기캡

12 튜브 부착백

14 카트리지

M 분획 장치 전체

15 3방향 밸브

16 용액 순환 유로

17a, 17b, 17c 송액 펌프

18 투과액 출구

19 막 분리 모듈

20, 22 여과액 출구

21 흡착 모듈

23 농축 모듈

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

우선 각 발명에 공통되는 사항에 대해서 설명한다.

본 발명에서 말하는 "분획"이란 용액 중의 용질을 분리하는 것이고, 용질이 복수종 포함되어 있는 경우에는, 그 전부 또는 일부를 분리하는 것을 가리킨다. 체액 성분을 MS 분석법에 의해서 프로테옴 해석하기 위한 시료를 제조하는 경우에는, 회수 목적의 단백질과 폐기 목적의 단백질을 변별하게 된다.

생체 성분으로는, 화합물로서 단백질, 핵산, 당, 지질, 비타민, 무기 염류가 예시되고, 생체 성분인 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 림프액, 뇌척수액 등의 체액의 성분이 예시된다.

본 발명에서 말하는 "농축"이란 용액 중으로부터 용매를 제거하는 것을 가리킨다. 본 발명의 목적으로는, 통상 물이 용매이다. 그 때 저분자량의 성분이 약간 제거될 수도 있다.

알부민으로는 인간, 소, 그 밖의 포유 동물 및 조류 유래의 알부민이 예시된다. 알부민보다 분자량이 크다는 것은(고분자량 성분), 주로 알부민(분자량 6 내지 7만) 이상의 고분자량의 단백질을 말한다. 알부민 이상의 고분자량인지의 여부는 SDS-PAGE(sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis: 도데실황산나트륨을 포함하는 폴리아크릴아미드겔 전기 영동)라는 방법에 의해 판별 가능하다. 알부민을 사용하여 본 발명을 특정하는 경우에는 인간 알부민에 의해 정의하는 것이 바람직하다.

우선 제1 발명의 그룹에 관해서 설명한다.

제1 발명의 분획 장치의 바람직한 양태로는,

1) 원액을 투입하는 공급부와,

2) 공급부로부터 송액된 원액 중 용질의 일부를 여과하는 여과부와,

3) 여과부에서의 여과액을 농축하는 농축부를 구비하고,

4) 분획시에 장치 내에 도입되는 이동상을 송액하기 위한 송액 펌프를 구비하고, 상기 여과부, 상기 농축부 및 상기 여과부와 상기 농축부를 접속하는 유로가 형성하는 회로가 폐쇄 회로의 구성이다.

폐쇄 회로란 회로의 내부가 장치 밖으로 개방되어 있지 않은 것을 의미한다. 폐쇄 회로를 취함으로써, 콘터미네이션 및 바이오해져드를 방지할 수 있다.

상기 장치의 바람직한 양태로서, 추가로

5) 농축부로부터 얻어진 농축액을 회수하는 회수부를 구비하여 공급부, 여과부, 및 공급부와 여과부를 접속하는 유로가 형성하는 회로, 및 농축부, 회수부 및 농축부와 회수부를 접속하는 유로가 형성하는 회로가 각각 폐쇄 회로가 되어 있는 것이 바람직하다.

상기 구성을 취함으로써, 목적으로 하는 용액을 콘터미네이션 없이 회수부에 얻을 수 있다.

제1 발명의 장치는 외부에서 원액을 투입하기 위한 공급부를 구비하고 있다. 공급부의 구조로는, 고무 버튼이나 3방향 밸브가 예시된다. 시린지 펌프, 주사기, 원액백으로부터 원액을 고무 버튼이나 3방향 밸브 등의 공급부에 공급한다. 이들 공급 수단은 밀폐성이 높고, 투입 속도를 제어할 수 있다는 점에서 바람직하다. 원액을 투입하는 속도는, 투입 속도가 지나치게 빠르면 폐쇄 회로의 압력이 상승되어 회로로부터의 누설이나 막의 파손을 야기한다. 또한, 지나치게 느리면 원액의 처리에 장시간이 소요된다.

원액을 폐쇄 회로의 외부로부터 공급부에 투여하는 경우에, 투여된 원액의 부피와 같은 부피 변화가 회로 내에서 일어난다. 이 변화를 흡수할 수 있는 부분이 없으면 회로나 막에 지나친 압력이 가해질 가능성이 있다. 그 때문에, 부피 변화를 흡수하는 완충부를 회로의 임의의 위치에 설치하는 것이 바람직하다. T자 커넥터를 개재시켜 기밀성 높게 접속된 백 또는 피스톤이 부착된 시린지 등의 기구가 바람직하게 사용된다.

공급부와 여과부란 유로를 개재시켜 접속되어 있다. 통상은 상기 유로에는 수송용 송액 펌프가 설치되어 있는 것이 바람직하다. 여과부에서는 용질의 일부가 여과된다.

본 발명의 장치의 여과부에서는, 여과기를 사용하는 것이 바람직하고, 추가로 중공사막 또는 평막을 내장한 여과 모듈이 바람직하게 사용된다. 막의 분자 분획 성능에 관해서는, 회수하고자 하는 용질의 분자량과 제거하고자 하는 용질의 분자량을 고려하여, 분자 분획능(차단값)을 갖는 막을 적절하게 선택할 수 있다.

또한, 여과 모듈에서는 막의 원액측에는 원액 입구와 원액 출구를 갖고, 또한 막의 여과측에는 여과 성분 출구를 갖고 있는 것이 바람직하다. 원액 입구와 원액 출구란 튜브 등에 유로를 구성하고, 그 유로에 대하여 송액 펌프가 설치되고, 펌프에 의해서 피처리액이 모듈 내의 막의 원액측을 순환하는 구조가 되어 있는 것 이 바람직하다. 이에 따라 피처리액은 여과 조작이 반복적으로 행해진다.

분리 효율을 높이기 위해서, 여과부에서 여과 모듈을 다단 또한 직렬로 접속할 수 있다. 다단의 경우, 공급부에 가까운 최초의 여과 모듈은 원액 입구와 원액 출구가 접속된 유로 도중에 공급부로부터의 유로가 접속된다. 최초의 여과 모듈의 여과 성분 출구로부터의 유로는, 다음 여과 모듈의 원액 입구와 원액 출구를 접속하는 회로의 도중에 접속된다. 그 다음 여과 모듈의 여과 성분 출구로부터의 유로도 마찬가지로, 추가로 그 다음 모듈의 원액측 유로에 접속된다. 마지막 여과 모듈로 여과부의 기능은 끝나지만, 여과 성분 출구로부터의 유로는 다음 농축부에 접속된다. 그 결과 여과부로부터의 여과액은 농축부에 송액된다.

여과 모듈이 다단인 경우, 여과 모듈의 원액 입구와 원액 출구와의 유로에 존재하는 펌프는 개별적인 구동으로 운전될 수도 있고, 동일한 구동으로 동축 운전될 수도 있다. 체류하지 않고 송액하여 최대 분리 효율을 얻기 위해서는, 동일한 유량이 유지되도록 운전하는 것이 바람직하다.

여과 모듈에서, 통상은 용질의 분자량에 따라서 용질이 분별된다. 여과 모듈에 사용되는 분리막은 셀룰로오스, 셀룰로오스 트리아세테이트 등의 셀룰로오스 아세테이트계 중합체, 폴리카르보네이트, 폴리술폰이나 폴리에테르술폰 등의 폴리술폰계 중합체, 폴리메틸메타크릴레이트 등의 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리아미드나일론, 폴리불화비닐리덴, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 이루어지는 군으로부터 1 종류 이상 선택되는 소재를 포함하는 필터 또는 중공사를 사용함으로써 보다 효율 적으로 목적으로 하는 용질 성분을 분리할 수 있다. 평면 필터, 카트리지식 필터 등의 평막형 분리막(필터), 중공사 등의 중공형 분리막(중공사) 모두 사용할 수 있다. 이들 필터 또는 중공사에 항체나 그 일부분, 폴리에틸렌이민, 아미노메틸피리딘, 폴리페놀, 블루 색소, 2가 금속 이온(Zn² ⁺, Ni² ⁺, Co² ⁺, Cu² ⁺ 등) 및 소수성 화합물(메틸기, 벤질기, 페닐기, 클로로메틸기, 옥틸기, 라우릴기 등)로 이루어지는 군으로부터 1 종류 이상 선택되는 물질(배위자)을 고정화함으로써, 필터 또는 중공사에 용질에의 친화성을 부여할 수 있다. MS 분석용 시료의 전처리에 사용하는 경우에는, 알부민을 비롯한 MS 분석에 불필요한 단백질을 흡착 제거하는 기능을 부여할 수 있다.

본 발명의 여과 모듈에 사용되는 분리막으로는, 처리액량 당 표면적이 크고, 조작 상의 압력 손실이 적다는 이유로 특히 중공사막이 바람직하게 사용된다. 중공사막을 구비한 여과기인 중공사막 모듈은 단백질 관계에서는 종래부터 인공 신장(투석 모듈)으로서 많이 이용되고 있지만, 모두 알부민 등의 단백질이 누설되지 않도록 유지되고, 크레아티닌이나 요소 등의 저분자 성분을 누출시켜 중공사 내의 강측(腔側)을 흐르는 혈액을 정화할 목적으로 사용된다. 한편, 제1 발명의 여과부에 사용되는 분리막에서는, 원액측에서 여과된 성분을 분석하기 위해 수집할 목적으로 사용된다. 구체적으로는 원액측에는 알부민 등의 고분자량 성분을 잔존시키면서, 저분자량, 예를 들면 분자량 5 kDa 이하의 단백질 성분을 누출시키는 것이 바람직하다.

이어서, 분리부에서의 마지막 여과 성분 출구에서의 유로는 농축부에 접속된다. 농축부에서도 여과기를 사용하는 것이 바람직하다. 여과기에 사용할 수 있는 분리막의 분자량 분획 성능에 관해서는, 생리적 식염수 중에서 펩티드를 통과시키지 않을 정도의 분자량 분획능(차단값: 0.05 내지 0.5 kDa 이하)을 갖는 막이나 한외 과막 (ultrafiltration membrane)을 사용한다. 농축부에서는, 중공사막 또는 평막 등의 분리막을 구비한 농축 모듈을 갖는 것이 바람직하다. 여과기에서도, 분리막을 내장한 모듈을 사용하는 것이 바람직하다. 농축 모듈에 사용하는 막으로는, 상술한 바와 마찬가지로 처리량이 높고, 압력 손실이 작다는 이유로 중공사막이 보다 바람직하게 사용된다. 또한 농축 모듈에서도, 막의 원액측에는 원액 입구와 원액 출구를 갖고, 또한 막의 여과측에는 여과 성분 출구를 갖고 있는 것이 바람직하다. 원액 입구와 원액 출구는 튜브 등에 의해 유로를 구성하고, 그 유로에 대하여 송액 펌프가 설치되고, 펌프에 의해서 피처리액이 모듈 내의 막의 원액측을 순환하는 구조로 되어 있는 것이 바람직하다. 이에 따라 피처리액은 여과 조작이 반복적으로 행해진다. 여과 성분 출구에서는, 분리를 목적으로 하지 않는 용매나 매우 저분자량의 성분이 나온다. 장치 내의 부피 변화를 가능한 한 피하고자 하기 때문에, 여과 성분 출구에서의 성분은 분획 장치 내에 유지시켜 둔다. 그래서 여과 성분 출구에는 유로가 접속되고, 그 유로의 한쪽은 공급부나 공급부 근방의 회로에 접속되어 있는 것이 바람직하다. 이 유로에서도 송액 펌프가 존재하고 있는 것이 바람직하다.

분리부의 분리 모듈의 원액 출구와 원액 입구를 접속하는 유로, 및 농축부의 농축 모듈의 원액 출구와 원액 입구를 접속하는 유로에는, 전단의 모듈로부터의 유로가 접속되지만, 접속되어 액이 합류된 후, 송액 펌프가 송액을 조작하도록 송액 펌프를 배치하는 것이 바람직하다. 그 결과, 분리·농축 효율이 더욱 향상된다.

제1 발명의 분획 장치에서, 농축부는 유로를 개재시켜 농축부에서 농축된 액을 회수하는 회수부에 접속된다. 회수부로는 통상 회수용 용기가 사용된다. 농축부에 농축 모듈을 사용하고, 원액 출구와 원액 입구를 유로에 의해서 접속하고 있는 경우, 그 유로를 순환하고 있는 액이 회수의 대상이 된다. 이 유로에서도 송액 펌프를 구비하는 것이 바람직하다. 또한 폐쇄 회로로 하기 위해서, 회수부에 2개의 유로가 존재하고 있는 것이 바람직하고, 그 중 하나가 상술한 바와 같이 농축부에서의 농축액이 공급되는 유로가 되고, 다른 하나의 송액관을 통해서 회수 용기 내부의 공기가 농축부의 원액측에 보내지도록 배치하는 것이 바람직하다.

본 발명의 분획 장치에서, 공급부와 분리부 사이, 분리부, 농축부, 회수부 또한 이들 사이에 필요에 따라서 설치되는 송액 펌프는 개별적인 구동으로 운전될 수도 있고, 동일한 구동으로 동축 운전될 수도 있다. 동축으로 운전하는 경우에는, 막의 분리·농축 효율에 따라서 각 부분의 운전 속도 및 시퀀스를 적절하게 선택할 수 있다.

본 발명의 분획 장치의 목적으로는, 회로에 설치된 유로는 각각 단독으로도 장착할 수 있지만, 장착의 편리성과 안정성의 확보를 위해, 공급부와 여과부 및 농축부와 같은 막에 의해서 분획하는 수단과, 회수부와, 상기 각 부분을 접속하는 유로의 적어도 일부가 카트리지에 포함되어, 분획 장치용 회로가 구성되어 있는 것이 바람직하다. 또한 카트리지의 외측의 일부가 롤러형 튜브 펌프에 대한 압착 부재로 되어 있는 것이 바람직하다. 카트리지는 송액 펌프의 로터 구동부 또는 그것을 지지하는 부재에 착탈 가능한 것이 바람직하다. 또한 카트리지 및 내용물은 일회용인 것이 보다 바람직하다. 공급부, 분리부, 농축부, 회수부 내의 송액 펌프를 설치하여야 할 유로의 일부를 카트리지 내로부터 카트리지 외벽에 노출시켜서, 노출된 유로인 튜브를 롤러형 튜브 펌프의 로터에 의해서 압착하는 것이 가장 바람직하다. 이 때 여과부, 농축부에 설치된 각 모듈의 원액측 입구와 원액측 출구의 위치 관계에 대해서는 압착 부재에 튜브를 부착하는 방향과 일치시킨다. 각 모듈의 포트에 접속된 유로인 튜브는 압착 부재를 개재시켜 액이 순환할 수 있도록 되어 있다. 압착의 정밀도를 유지하기 위해서 튜브는 로터 구동축의 근본에 의해 인접하여 위치하고 있는 것이 바람직하다. 정밀도가 떨어지면 튜브를 압입하지 못해 정량 송액이 어려워진다. 카트리지를 본체에 간편하고 정확하게 장착시키기 위해서는, 카트리지와 펌프 각각에 상호 감합(잘 들어맞음)하기 위한 수단을 설치하는 것이 바람직하다. 예를 들면 한쪽에 가이드 구멍을 구비하고, 다른쪽에 가이드축을 설치하고, 가이드 구멍을 가이드축에 관통시킴으로써 용이하게 감합이 행해진다. 계속해서, 압착 부재의 위치를 고정시킴으로써 복수개의 튜브로 이루어지는 유로가 롤러형 튜브 펌프의 회전 롤러와 적정한 거리를 유지할 수 있다. 롤러형 튜브 펌프를 작동시킴으로써, 복수개의 모듈 내의 원액은 차례로 송액된다. 미리 복수개의 모듈을 수납한 수납 상자와 압착 부재를 일체화하여, 유로의 일부인 튜브를 압착 부재에 올려놓은 것을 준비해두면, 롤러 펌프 부분에의 장착과 탈착은 보 다 간편하게 행할 수 있다.

카트리지의 소재는 특별히 한정되지 않지만, 취급성이 양호하고, 운반하기 쉬우며, 강도가 있다는 이유로 플라스틱제인 것이 바람직하다. 형상은 특별히 한정되지 않지만, 칼럼과 송액 회로를 수납할 수 있을 정도의 충분한 스페이스를 내부에 갖고, 송액 펌프의 구동 로터에서 압착을 받는 압착 부재의 압착면은 압착되는 방향에 호(弧)상으로 만곡된 곡면으로 되어 있는 것이 특히 바람직하다. 곡면으로 되어 있음으로써 구동 로터와의 접촉 면적이 증가되고, 결과적으로 안정적인 유량을 확보할 수 있다.

카트리지의 압착 부재의 표면과 롤러형 튜브 펌프의 구동 로터의 외주에 자유롭게 회전하도록 설치된 롤러에 이 튜브를 끼움으로써 송액 기능이 완성되고, 구동 로터가 주위 방향으로 회전함으로써 카트리지 내에 있는 각 부분에 존재하는 액체가 순환한다. 카트리지 외피의 압착면에 대하여 튜브는 압착되도록 설치되어 있지만, 반드시 압착면에 접하지 않을 수도 있다. 압착할 때에 튜브가 압착 방향과 수직 방향으로 진동하는 것을 방지하기 때문에, 튜브가 카트리지의 외피의 호상으로 만곡한 압착면에 대하여 호상으로 설치되어 있는 것이 특히 바람직하다.

카트리지는 수동으로 구동 로터에 압착되어 있을 수도 있지만, 작업자에 대한 안전성의 관점에서, 카트리지를 설치하면 이어서 카트리지가 이동하고, 카트리지에 설치된 튜브를 로터가 압착할 수 있는 위치까지 카트리지를 반송할 수 있는 기구를 구비하는 것이 바람직하다.

본 발명의 분획 장치를 사용하여 분획할 때, 그 이동상은 물 또는 수용액이 바람직하다. 특히 원액이 체액이고, 용질이 단백질인 경우에는 pH 완충액을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 본 장치에 의해 얻어지는 시료를 MS 분석 장치에 적용하는 경우에는, 분석을 저해하지 않는 휘발성의 물질로 구성되는 완충액을 사용하는 것이 바람직하고, 예를 들면 탄산암모늄, 아세트산암모늄, 포름산암모늄이 바람직하게 사용된다. 이동상의 수용액에는, 계면활성제, 유화제, 유기 용매, 알코올, 에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌이민, 아미노메틸피리딘, 황산프로타민, 황산암모늄, 폴리페놀, 블루 색소, 카오트로픽염 및 소수성 화합물로 이루어지는 군으로부터 1 종류 이상 선택되는 물질을 포함함으로써, 고분자 성분의 단백질의 응집에 의한 거대 분자화를 촉진시키고, 흡착의 촉진이나 분획막으로부터의 누출을 억제하며, 고분자 성분을 효율적으로 차단하여 최종적인 분리 성능을 향상시킬 수 있다. 계면활성제(양쪽성 계면활성제나 음이온성 계면활성제 등)는 단백질간의 상호 작용을 억제하는 효과가 있어, 분자 분획을 효율적으로 행할 수 있다.

상기한 배위자의 선택 및 수용액 용질의 선택은, 목적으로 하는 단백질군의 분리의 정도를 감안하면서 행할 수 있다.

본 발명의 분획 장치의 각 구성 요소를 접속하는 유로로는 튜브를 사용하는 것이 바람직하고, 추가로 유연한 탄성체를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 실리콘 수지, 폴리염화비닐, 폴리우레탄, 불소 수지, 천연 고무, 합성 고무가 바람직하게 사용되지만, 목적으로 하는 생체 성분의 흡착이 적다는 점에서 실리콘 수지, 불소 수지가 특히 바람직하다.

본 발명의 농축액을 채취하는 회수 용기는 목적으로 하는 생체 성분의 흡착이 적은 재질을 포함하는 것이 바람직하고, 폴리프로필렌, 실리콘 수지, 불소 수지가 바람직하게 사용된다. 그 밖에도 폴리스티렌, 유리 등이 사용되지만, 목적으로 하는 생체 성분의 흡착을 억제하기 위해서 내표면에 흡착을 억제하기 위한 처리가 실시되고 있는 것이 바람직하다. 흡착을 억제하기 위한 처리란, 예를 들면 친수성화 처리이고, 플라즈마 처리나, 친수성 중합체의 코팅이나 표면 그래프트가 이것에 상당한다.

본 발명의 분획 장치는 생체 성분을 함유하는 원액, 특히 인간의 혈장, 혈청, 소변, 타액, 누액, 뇌척수액, 복수, 흉수, 양수, 림프액 등으로부터의 생체 분자의 분리에 적합하다. 상기한 각 필터 및 중공사막 모듈의 크기 및 환류액의 유속은 각각 원료로 하는 혈장이나 소변 등의 생체 재료의 질과 양에 의존하여 적절하게 결정되지만, 일반적으로 모듈이 지나치게 크면 취급이 용이하지 않고, 또한 모듈 자체의 표면적이 커지기 때문에 미량 성분의 흡착 손실의 원인이 된다. 모듈이 작으면 다량의 검체량으로 대처할 수 없다. 특히 중공사막을 사용하여, 임상에서 현실적인 0.1 내지 100 ㎖의 검체를 처리하는 경우에는, 직경 0.2 내지 5 cm, 길이 3 내지 20 cm의 원통형의 모듈이 바람직하게 사용된다. 또한 폐색된 회로의 총 내용적이 50 ㎖ 이하인 것이 바람직하다. 소위 탁상 크기로 분획 처리를 실시하는 경우, 사용하는 검체의 양으로서 바람직한 것은 혈장으로는 1 내지 400 ㎖, 보다 바람직하게는 5 내지 100 ㎖에서 실시된다. 또한, 바람직한 유속은 0.1 내지 20 ㎖/분, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 10 ㎖/분으로 행해진다.

본 발명의 분획 장치에 대하여, 생체 성분을 함유하는 원액을 투입하고 운전함으로써 최종적으로는 회수부에 얻어진 시료는 액체 크로마토그래프, 전기 영동, MS 등의 각종 단백질 분석에 유용하지만, 특히 바람직하게는 전기 영동이나 MS를 사용한 프로테옴 해석에 유용하다.

본 장치의 분획 장치에서 얻어진 시료를 적용할 수 있는 MS는 특별히 한정되지 않지만, 이온화 부분으로서, 전자 분무 이온화형, 대기압 이온화형, 고속 원자 충돌형, 4중극형, 사이크로트론 공명형, 자기 섹터형, 매트릭스 지원 레이저 파괴 이온화형 등이 이온 보충형, 비행 시간형, 푸리에 변환형 등의 질량 분석부와 적절하게 조합하여 사용된다. 이 경우, MS/MS, MSⁿ 등의 탠덤 MS나 FT-MS로서 사용할 수도 있다. 탠덤 MS의 경우는, 모든 타입의 MS가 적용 가능하지만, 특히 이온 포착형, 4중극-비행 시간(Q-TOF)형, FT-MS 등의 조합으로 사용하는 것이 효율적이다.

본 장치와의 조합에 의한 분석에 의해, 각종 미량 단백질 성분의 구조 정보를 수집할 수 있지만, 이들은 펩티드-매스 핑거 프린트(peptide-mass fingerprint: PMF) 뿐만 아니라, 각 펩티드의 1차 구조 정보(아미노산 배열)도 포함된다.

이어서 제2 발명에 대해서 설명한다.

제2 발명에서는,

1) 단백질을 흡착하는 항체가 없는 상태에서 인간 α₁마이크로글로블린과 인간 알부민과의 여과 비율(인간 α₁마이크로글로블린 투과율/인간 알부민의 투과율)이 1.5 이상 1000 이하인 막 분리 시스템과,

2) 단백질을 흡착하는 항체가 필수 성분이고, 본 발명의 분리 방법에 의해 얻어지는 특정한 단백질의 농도가, 항체가 없는 상태에서의 막 분리 시스템에서 얻어지는 농도의 10 ％ 이하일 필요가 있다. 여기서 인간 α₁마이크로글로블린은 분자량 3만 이하의 단백질, 인간 알부민은 분자량 6만 이상의 단백질을 대표하는 단백질이다.

예를 들면 혈청을 검체로서 이용하는 경우에는, 알부민이나 면역 글로블린 등의 단백질이 혈청 중에 고농도로 존재하기 때문에, 막을 사용하여도 이들 단백질을 완전히 분리할 수는 없고 일부가 막으로부터 누출된다. 또한, 검체 중에는 단백질이 분해되어 발생한 분자량이 낮은 단편 펩티드도 존재하고, 이러한 펩티드는 막으로는 분리할 수 없으며 항체에 의해서 제거하는 것이 요망된다. 누출된 단백질이나 그 단편 펩티드는 여전히 질량 분석에서의 미량 성분의 검출을 저해한다. 본 발명의 분리에 의해서, 누출된 단백질량을 10 분의 1 이하로 줄일 수 있고, 질량 분석의 감도를 보다 향상시켜 미량 성분의 검출을 가능하게 할 수 있다. 제2 발명에서, 막 분리 시스템이 사용된다. 분리에 사용되는 막으로는, 통상 다공성인 것이 사용되고, 평면 필터, 카트리지식 필터 등의 평막형 분리막(평막), 중공사 등의 중공상 분리막(중공사막) 모두 사용할 수 있다. 일반적으로, 중공사는 처리액량 당 표면적이 크고, 압력 손실도 적기 때문에, 가장 효율적으로 사용할 수 있다. 또한, 평면 필터는 제막이 용이하고 저렴하게 제조할 수 있다는 이점이 있다. 막 소재로는, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리카르보네이트, 폴리술폰, 폴리 메틸메타크릴레이트 등의 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리아미드, 폴리불화비닐리덴, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 이루어지는 군으로부터 1 종류 이상 선택되는 소재를 예시할 수 있다. 이 중에서도 최근 투석기 등에 자주 사용되고 있는 폴리술폰은 분획 특성이 양호하기 때문에 바람직한 소재이다.

본 발명에 사용되는 막 분리 시스템의 분리 성능은, 항체가 없는 상태에서 인간 α₁마이크로글로블린과 인간 알부민과의 여과 비율(인간 α₁마이크로글로블린 투과율/인간 알부민의 투과율)이 1.5 이상 1000 이하이다. 바람직한 비율로는, 2 이상이다. 투과 비율이 1.5 미만이면, 막 공경이 매우 커서 어떤 분자량의 단백질도 투과하는 것, 또는 막 공경이 매우 작아서 어떤 분자량의 단백질도 투과할 수 없는 것을 의미하고, 이 범위에서는 실질적으로 막으로서 기능하지 않는다. 투과 계수는 높을수록 좋지만, 현실적으로 투과 계수 1000이면 충분하다.

본 발명에서의 막 분리 시스템은, 단백질을 포함하는 시료, 특히 혈청 등의 혈액 유래 시료로부터 목적으로 하는 단백질을 분획하는 것이다. 특히 인간 α₁마이크로글로블린으로 대표되는 분자량 3만 이하의 단백질을 분획하는 막에 의한 분획 공정을 단독으로 또는 연결된 다단으로 갖는 시스템이다.

본 발명의 막 분획 시스템에는 특히 중공사막 모듈을 사용하는 것이 바람직하다. 중공사는 단백질 관계에서는 종래부터 인공 신장(투석 모듈)으로서 많이 사용되고 있지만, 모두 알부민 등의 단백질이 누설되지 않도록 유지되며, 크레아티닌 이나 요소 등의 저분자 성분을 누출시켜 중공사 내의 강측을 흐르는 혈액을 정화할 목적으로 사용된다. 한편, 본 발명에서는 중공사 내의 강측으로부터 누출되는 분획을 분석하기 위해 수집하는 방법으로 이용하고, 중공사 내의 강측에는 알부민 등의 고분자량 성분을 유지하면서, 주로 α₁마이크로글로블린으로 대표되는 분자량 3만 이하의 단백질 성분을 누출시키는 방법을 취한다.

본 발명에서 항체에 흡착시키고자 하는 단백질은, 처리하는 검체 중에 적어도 1 ㎍/㎖ 이상의 고농도로 존재하는 단백질이고, 예를 들면 검체가 혈액, 혈청 또는 혈장인 경우에는, 혈청 알부민, 면역 글로블린 G, 면역 글로블린 A, 면역 글로블린 M, 트랜스페린, 헵토글로빈, α₁안티트립신, α₂거대 글로블린, α₁산성 글리코프로테인, 피브리노겐, 보체 C1q, 보체 C3, 보체 C4, 보체 C8, 보체 C9, 보체 인자 B, 아폴리포프로테인 A, 아폴리포프로테인 B, Lp(a), 케라틴, 콜라겐 등을 들 수 있다. 검체가 세포 추출액인 경우에는, 미오신, 액틴, 사이토케라틴, 케라틴, 피브로넥틴 등을 들 수 있다.

사용되는 항체는, 모노클로날 항체이거나 폴리클론성 항체일 수도 있다. 또한, Fab나 F(ab)'와 같은 항체 단편도 포함하고, 항원 인식 부위를 포함하고 있으면 어떤 형태를 하고 있을 수도 있다.

본 발명에서의 항체는, 막 분리 시스템의 유로의 중반 또는 후반부에 내장되어 있으면, 어떠한 형태로 내장되어 있을 수도 있다. 막 분리 시스템의 유로 중에서, 용액에 용해 또는 분산된 형태로 존재하고 있을 수도 있고, 막의 내표면 및(또 는) 외표면에 고정화되어 있을 수도 있다. 유로 중에 설치된 구상 비드, 직물, 또는 부직포에 고정화되어 있을 수도 있다. 항체가 고정화된 담체를 충전한 칼럼을 유로 중에 설치할 수도 있다.

막 분리 시스템이 분리막을 내장하는 칼럼을 다단 직렬로 조합한 경우에는, 제1 단계째 칼럼의 분리막의 원액측의 표면 및(또는) 투과측의 표면, 제2 단계째의 칼럼의 분리막의 원액측의 표면 및(또는) 투과측의 표면 등에 항체를 고정화할 수 있다. 또한, 항체가 전단의 칼럼의 막과 후단의 칼럼의 막 사이에 있는 유로 중의 이동상에 내장시킬 수도 있고, 항체가 전단의 막과 후단의 막 사이 유로에 고정시킬 수도 있다.

내장시키는 항체의 양은 임의일 수도 있지만, 막 분리 시스템에서 막으로부터 누출되는 단백질의 양에 의해서 정할 수 있다. 누출되는 단백질의 양은, 처리하는 검체에 포함되는 고농도 단백질의 함유량, 단백질의 막에 대한 체 계수 및 처리 시간에서 거의 결정된다. 항체의 양이 지나치게 적으면 단백질을 흡착 제거할 수 없고, 반대로 지나치게 많으면 항체가 막에 고정화되어 있는 경우나 항체가 막의 원액측에 자유롭게 존재하는 경우에는 막이 블로킹을 일으키기 때문에 양호한 분리 성능이 얻어지지 않는다.

제2 발명에서는, 본 발명의 분리 방법을 행하기 위한 장치도 포함되어 있다. 즉, 인간 α₁마이크로글로블린과 분자량 6만 이상의 인간 알부민과의 투과 비율이 1.5 이상 1000 이하인 막 분리 장치, 및 막 분리 장치의 유로의 중반 또는 후반부 에 항체를 내장하는 항체 처리 장치를 갖는 생체 성분 분리 장치이다.

본 발명의 막 분리 시스템을 사용하여 분리하는 방법에서 바람직한 양태는 이하와 같다. 막 분리 시스템의 기능은, 시료로부터 폐기 목적의 알부민으로 대표되는 분자량 6만 이상의 단백질과, 회수 목적인 α₁마이크로글로블린으로 대표되는 분자량 3만 이하의 단백질을 막을 사용하여 분리하고자 하는 것이다. 본 시스템은, 평면 필터 또는 중공사막 모듈의 막에 분자 체 효과를 갖는 다공성막을 사용하고, 분리 체에 의한 분자 분획을 행한다. 특히 중공사를 사용하는 것은 분획 막 표면적이 매우 커지기 때문에 유효하다.

본 발명에서 사용하는 막의 소재는 특별히 한정하지 않지만, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리카르보네이트, 폴리술폰, 폴리메틸메타크릴레이트 등의 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리아미드, 폴리불화비닐리덴, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 이루어지는 군으로부터 1 종류 이상 선택되는 고분자를 포함하는 소재가 사용된다. 막 구조에 관해서는, 균일한 구조에 가까운 스폰지 구조를 갖는 것이나, 치밀층과 공극률이 높아 막 강도를 유지하는 지지층의 2층 구조로 이루어지는 것을 모두 사용할 수 있다. 막의 표면 성질은 분리하는 단백질의 성질에 의해서 결정되고, 친수성이나 소수성일 수도 있다.

친수성막에서는, 친수성의 단량체와 소수성의 단량체를 공중합시킨 것이나, 친수성의 고분자와 소수성의 고분자를 블렌드 제막한 것, 또는 소수성의 고분자를 포함하는 막의 표면에 친수성 중합체를 결합, 부착시킨 것, 소수성의 고분자를 포함하는 막의 표면을 화학 처리, 플라즈마 처리, 방사선 처리한 것 등을 들 수 있지만, 친수화되어 있으면 그 방법은 특별히 한정되지 않는다. 친수성 성분은 특별히 한정되지 않지만, 폴리에틸렌글리콜 등의 폴리알킬렌옥시드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드 등의 친수성 고분자가 바람직하다. 이들 친수성막은 필요로 하는 단백질의 흡착을 억제하고, 낭비 없이 회수하는 효과가 있다.

또한, 폴리에틸렌이민, 아미노메틸피리딘, 폴리페놀, 블루 색소, 2가 금속 이온(Zn²⁺, Ni² ⁺, Co² ⁺, Cu² ⁺ 등), 소수성 화합물(메틸기, 벤질기, 페닐기, 클로로메틸기, 옥틸기, 라우릴기 등) 등 중, 적어도 어느 하나 이상을 고정화한 소재를 사용할 수도 있다.

막의 분자 분획 성능에 관해서는, 생리적 식염수 중에서 알부민을 50 ％ 이상 통과시키지 않는 정도의 분자 분획능(차단값: 30 내지 60 kDa 이하)을 사용할 수 있다.

본 발명의 막 분리 시스템에서는, 상술한 바와 같은 저분자량의 단백질을 여과하는 수단에 부가적으로 농축 공정을 위한 수단을 포함할 수 있다. 이 수단으로는, 평면 필터 또는 중공사막 모듈의 막에 분자 체 효과를 갖는 다공성막을 사용하고, 분리체에 의해서 농축을 행한다. 샘플이 소량인 경우에는, 원심형의 튜브에 평면 필터를 접착한 농축 디바이스를, 샘플이 다량인 경우에는 중공사를 사용하는 것이 유효하다.

바람직하게는 본 공정에서는, 평면 필터 또는 중공사 모듈의 막에 분자 체 효과를 갖는 다공성막을 사용하고, 분리 체에 의한 농축을 행한다. 샘플이 소량인 경우에는, 원심형의 튜브에 평면 필터를 접착한 농축 디바이스를, 샘플이 다량인 경우에는 중공사를 사용하는 것이 유효하다.

상기 목적으로 사용할 수 있는 막의 소재는 특별히 한정하지 않지만, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리카르보네이트, 폴리술폰, 폴리메틸메타크릴레이트 등의 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리아미드, 폴리불화비닐리덴, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 이루어지는 군으로부터 1 종류 이상 선택되는 고분자를 포함하는 소재가 사용된다. 막 구조에 관해서는, 균일한 구조에 가까운 스폰지 구조를 갖는 것이나, 치밀층과 공극률이 높아 막 강도를 유지하는 지지층의 2층 구조로 이루어지지만 모두 사용할 수 있다.

막의 분자 분획 성능에 관해서는, 생리적 식염수 중에서 펩티드를 통과시키지 않는 정도의 분자 분획능(차단값: 10 내지 1000 이하)을 갖는 막이나 한외 여과막을 사용하는 것이 바람직하다. 상술한 막 분리 시스템의 중반 또는 후반부에 특정한 단백질을 흡착하는 항체가 부여되는 경우, 항체는 막 분획 공정의 도중에 처리되거나, 막 분획 공정에서 얻어진 액이 접촉하는 부위이면 특별히 특정하지 않는다. 비드나 겔에 고정화한 항체를 회로의 일부 또는 전체에 충전하여 사용하는 것이 바람직하고, 예를 들면 회로의 일부에 항체를 고정화시킨 겔을 충전한 칼럼을 설치하는 방법이 일반적으로 행해진다. 또한, 평면 필터, 또는 중공사막 모듈의 막에 항체를 고정화시키는 것도 바람직하다.

항체를 지지체에 부여하는 방법으로는 특별히 한정하지 않지만, 항체의-NH₂ 말단을 사용하여 화학 반응에 의해 기재에 고정하는 방법, 산화당을 고정화하는 방법, 프로테인 A나 프로테인 G 등의 배위자에 고정화하는 방법이 효율적으로 항체를 고정화하는 방법으로서 사용할 수 있다. 사용하는 항체는 폴리클론성 항체이거나 모노클로날 항체여도 한정되지 않고 사용할 수 있다. 또한 항체를 구성하는 단백질은 면역 글로블린류가 바람직하고, 추가로 면역 글로블린 G가 바람직하다.

항체를 특히 지지체에 부착시키고, 그 지지체와 함께 시스템에 투입하는 경우, 지지체의 소재로는 특별히 한정하지 않지만, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리카르보네이트, 폴리술폰, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리아미드, 폴리불화비닐리덴, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 이루어지는 군으로부터 1 종류 이상 선택되는 고분자를 포함하는 소재가 사용되는 것이 바람직하다. 막 구조에 관해서는, 균일한 구조에 가까운 스폰지 구조를 갖는 것이나, 치밀층과 공극률이 높아 막 강도를 유지하는 지지층의 2층 구조로 이루어지는 것 중 모두 사용할 수 있다.

또한 소재 형태로는, 구상 비드, 섬유 등의 형태, 섬유를 직물, 부직포, 스테이플을 사용한 평면상의 형태, 중공사의 형태 등을 들 수 있고, 각각 표면의 요철이 큰 다공체 형상인 것이 흡착 표면적을 증대시키는 효과를 위해 바람직하다. 또한, 평막이나 중공사막 등의 분리막의 형태이면, 분리와 흡착을 동시에 달성할 수 있기 때문에 특히 바람직하다.

항체를 막에 부착시켜 사용하는 경우, 막 기재 자체의 특성으로는, 비특이적 단백질 흡착을 억제하기 위해서 친수성화된 것이나, 알부민 등의 고분자량 단백질을 선택적으로 흡착하기 위해서 소수성화된 것이 분획과 흡착의 각 공정에 따라서 적절하게 선택되어 사용된다.

친수성화된 기재를 포함하는 막에서는, 친수성의 단량체와 소수성의 단량체를 공중합시킨 것이나, 친수성의 고분자와 소수성의 고분자를 블렌드 제막한 것, 또는 소수성의 고분자를 포함하는 막의 표면에 친수성 중합체를 결합, 부착시킨 것, 소수성의 고분자를 포함하는 막의 표면을 화학 처리, 플라즈마 처리, 방사선 처리한 것 등을 들 수 있다. 친수성 성분은 특별히 한정하지 않지만, 폴리에틸렌글리콜 등의 폴리알킬렌옥시드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리히드록시에틸메타크릴레이트 등의 친수성 고분자가 바람직하다. 소수성막에서는, 소수성 성분을 혼입시키거나, 소수성 배위자를 막 표면에 도입한 것이 사용된다. 소수성 성분으로는 메타크릴산에스테르, 아크릴산에스테르, 에틸렌, 프로필렌 등의 올레핀, 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴 등의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 부가 중합성 화합물로 이루어지는 중합체나, 폴리술폰, 셀룰로오스 등의 중합체를 예시할 수 있지만, 막 소재로서 사용할 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니다.

또한, 폴리에틸렌이민, 아미노메틸피리딘, 폴리페놀, 블루 색소, 2가 금속 이온, 소수성 방향족 화합물 등 중, 적어도 어느 하나 이상을 고정화시킨 소재를 사용할 수도 있다.

본 발명의 생체 성분의 분리 방법에서는, 시스템 중에 전개하는 액으로는 완충액이 바람직하게 사용된다. 또한, 각종 약제를 첨가하여 흡착 또는 분획 성능을 향상시킬 수 있다. 구체적으로는, 공정에 사용하는 수용액 중에 계면활성제, 유화제, 유기 용매, 알코올, 에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌이민, 아미노메틸피리딘, 황산프로타민, 황산암모늄, 폴리페놀, 블루 색소, 카오트로픽염 및 소수성 화합물로 이루어지는 군으로부터 1 종류 이상 선택되는 물질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

예를 들면, 알부민의 응집을 촉진시키는 황산암모늄, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌이민, 카오트로픽염 등을 적절하게 첨가함으로써, 고분자 성분의 단백질의 응집에 의한 거대 분자화를 촉진하고, 흡착의 촉진이나 분획막으로부터의 누출을 억제하여, 고분자 성분을 효율적으로 차단할 수 있다. 한편, 분획 공정에서는 계면활성제(양쪽성 계면활성제나 음이온성 계면활성제 등)를 적절하게 첨가함으로써, 단백질간의 상호 작용을 억제하고, 분자량 분획을 효율적으로 행할 수 있다.

이 공정에서 얻어진 여과 분획은 다음 농축 공정에 제공된다. 흡착 공정이나 재 막 분리 공정에서 용액을 충분히 분리할 수 있는 경우에는, 본 공정은 생략된다.

본 발명의 생체 성분의 분리 방법에서는 복수개의 공정으로 이루어지는 경우 공정을 이루기 위한 각 장치가 유로로 직결되고, 연속하여 가동하면, 간편하고 자동적으로 연속 운전할 수 있다. 물론 각 공정을 독립적으로 가동시킬 수도 있다. 튜브에는 펌프가 장착되고, 펌프에 의해 송액되지만, 소규모인 경우에는 시린지에 의한 송액, 농축 공정에서는 원심 튜브형 장치에 의한 농축을 행할 수도 있다. 복수개의 공정을 행하는 장치 요소가 유로로 연결된 복수개의 장치에서 행해질 수도 있다. 바람직하게는 α₁마이크로글로블린 분자량 3만 이하의 분자량을 갖는 단백질을 여과에 의해 효율적으로 얻는 중공사막 모듈과, 특정한 단백질을 흡착하는 요소와 단백질 용액을 농축하는 공정을 동시에 행하는 제2 중공사막 모듈이 수용액 유로로 직결되어 있는 양태도 포함된다.

농축 공정을 도입함으로써, 보다 우수한 효과를 얻을 수 있다. 또한, 분리막에 의해 저분자량의 단백질을 투과시켜 분획하는 공정을 반복하는 것이나, 분리막에 의해 분획하는 공정, 흡착하는 공정 사이에 농축 공정을 포함시키는 것, 흡착 공정 후에 재차 분리막에 의해 단백질을 투과시킬 수도 있다.

본 발명의 생체 성분의 분리 방법은 혈액 유래 시료, 특히 인간의 혈장, 혈청 등으로부터의 생체 분자의 분리에 적합하다. 상기한 각 필터 및 중공사막 모듈의 크기 및 환류액의 유속은, 시료의 질과 양에 의존하여 적절하게 결정되지만, 소위 탁상 크기로 분획 처리를 실시하는 경우, 사용하는 검체의 양으로서 바람직한 것은 혈장에서는 1 내지 400 ㎖, 보다 바람직하게는 5 내지 100 ㎖로 실시된다. 또한, 바람직한 유속은 0.1 내지 20 ㎖/분, 보다 바람직하게는 0.2 내지 10 ㎖/분으로 행해진다.

또한, 제2 발명의 방법에 따르면 막 분리 시스템은 고속 처리가 가능하고, 소요 시간으로는 1회 처리 시간이 1 내지 6 시간 이내이며, 검체의 콘터미네이션 및 바이오해져드 방지의 관점에서, 일련의 디바이스는 1회 사용하는 장치를 제조하는 것이 가능하다. 전기 영동 시스템이나 액체 크로마토그래피를 사용하는 분석에서는, 기기를 재사용하여 사용하기 때문에, 검체에 의한 오염의 위험성이나 재생된 분석 칼럼에 의한 재현성에의 영향 등이 문제가 되는 경우가 있고, 조작이 번잡할 뿐만 아니라, 다수개의 검체가 빈번히 처리되고 있지는 않다.

본 발명의 생체 성분의 분리 방법에 의해서 얻어지는 분석 검체는 액체 크로마토그래프, 전기 영동, MS 등의 각종 단백질 분석에 유용하지만, 특히 바람직하게는 MS, 전기 영동을 사용한 프로테옴 해석에 유용하다. 본 장치가 직접 또는 간접적으로 연결할 수 있는 MS는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 전자 분무 이온화형, 대기압 이온화형, 4중극(QQQ)형, 자기 섹터형, 비행 시간형, MS/MS, MSn, FT-MS형, 이온 포착형 및 이들의 조합형이다. 또한, MS/MS 또는 MSn(예를 들면 MS3)과 같은 탠덤 MS를 포함한다. 탠덤 MS의 경우는, 모든 타입의 MS가 적용 가능하지만, 특히 이온 포착, 4중극-비행 시간(Q-TOF), FT-MS, 및 4중극 및 이온 포착과의 섹터 기기의 조합을 사용하는 것이 효율적이다. 이에 따라, MS/MS 및(또는) MSn 측정에서 발생하는 피크의 선택적인 검출이 가능해진다.

본 장치와의 조합에 의한 분석에 의해, 각종 미량 단백질 성분의 구조 정보를 수집할 수 있지만, 이들은 펩티드·매스 핑거프린트(peptide-mass fingerprint: PMF) 뿐만 아니라, 각 펩티드의 1차 구조 정보(아미노산 배열)도 포함된다. 이하, 제2 발명인 생체 성분의 분리 방법 중 한 양태에 대해서, 도면을 사용하면서 설명 한다.

도 3은, 본 발명의 항체 성분 흡착 막 분리 시스템의 개념도이고, 막 분리 요소, 흡착 요소, 농축 요소로 이루어진다. 액의 흐름을 화살표로 나타내고 있다. 혈청 등의 재료의 검체는 3방향 밸브 (15)로부터 제1 요소인 막 분리 모듈 (19)에 주입되고, 튜브를 포함하는 용액 순환 유로 (16) 중을 송액 펌프 (17a)에 의해서 송액되어 순환된다. 이 공정에서 발생된 여과액은, 투과액 출구 (18)로부터 얻어진다. 여과액 출구 (18)로부터 얻어진 투과액은 송액 펌프 (17b)에 의해서, 내표면에 항체를 고정시킨 분리막을 내장하는 흡착 모듈에 투입되어 순환된다. 흡착 모듈에 내장하는 분리막을 투과한 투과액이 여과액 출구 (20)으로부터 얻어진다. 이 투과액은, 추가로 송액 펌프 (17c)에 의해서 농축용 막이 내장된 농축 모듈 (23)으로 순환되고, 물 및 매우 낮은 분자량의 단백질은 막을 투과하고, 투과액 출구에서 배출된다. 농축 모듈 (23) 및 그 순환 유로에 잔존하고 있는 용액을 취출함으로써 원하는 시료가 얻어진다.

마지막으로 제3 발명에 대해서 설명한다.

본 발명은 복수종의 단백질 및 물을 함유하는 용액을 분리막에 접촉시키고, 단백질의 분자량의 크기에 의해서 분획하는 방법이며, 분획에서의 용액이 유기 용매를 함유하는 것을 특징으로 하는 단백질의 분획 방법이다. 단백질은 소수성의 상호 작용에 의해, 다른 단백질과 결합할 뿐만 아니라, 재료 표면에도 흡착한다. 용액이 유기 용제를 함유함으로써, 이 소수성 상호 작용을 저해하고, 고분자량의 단백질을 원액측에 남기고, 저분자량의 단백질을 효율적으로 투과시킬 수 있다.

본 발명의 분리 방법에서는, 유기 용매가 첨가되어 있는 것이 필수이다. 유기 용매를 첨가함으로써, 분리막, 튜브 등의 회로나 분획한 용액을 회수하는 용기에 단백질이 흡착되는 현상을 현저히 억제할 수 있다. 본 발명에서의 유기 용매의 농도는 1 용량％ 이상 20 용량％ 미만이 바람직하고, 3 용량％ 이상 19 용량％ 미만이 보다 바람직하다. 한층 더 바람직하게는, 5 용량％ 이상 18 용량％ 미만이다. 농후한 단백질 용액을 유기 용매를 첨가한 완충액으로 희석하는 경우, 완충액에 과잉량의 유기 용매가 혼입되면, 그 영향으로 단백질 용액이 응집하거나, 혈청 단백질의 프로테옴 해석의 전처리 용도에서 본 발명의 분리 방법에서 중공사막으로 단백질 분획을 행하는 경우, 유기 용매가 과잉량 혼입되면 단백질이 응집하는 경우가 있고, 이들은 여과되지 않기 때문에, 그 결과 분획 처리액에 포함되는 단백질의 수가 격감할 가능성이 있다.

따라서, 단백질이 응집하지 않을 정도로 유기 용매를 첨가할 필요가 있고, 그렇게 함으로써 중공사막, 회로, 회수 용기 등에 단백질이 흡착하는 것을 억제하면서, 단백질의 회수율을 각별히 향상시키는 것이 가능해진다.

본 발명에서 사용되는 유기 용매로는, 수계 완충액에 용해 가능할 필요가 있고, 예를 들면 아세토니트릴, 피리딘 등의 질소 함유 화합물, 1,4-디옥산, 프로필렌옥시드 등의 환상 에테르 화합물, 아세톤, 에틸메틸케톤 등의 케톤 화합물, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N,N'-디메틸-2-이미다졸리디논, N-메틸-2-피롤리돈 등의 아미드류, 술포란, 디메틸술폭시드 등의 황 함유 화합물, 메탄올, 에탄올, 2-프로판올 등의 1가 알코올류, 2-메톡시에탄올(메틸셀로솔브), 2-에 톡시에탄올(에틸셀로솔브) 등의 셀로솔브류, 2-아미노에탄올(모노에탄올아민),디에탄올아민, 트리에탄올아민 등의 에탄올아민류, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 글리세린 등의 다가 알코올류를 사용할 수 있지만, 이 중 비알코올계의 유기 용매를 사용하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 완충액 중에 포함되는 유기 용매는 1 종류일 수도 있고, 2종 이상일 수도 있다.

본 발명에서의 유기 용매의 비점은 100 ℃ 이하가 바람직하고, 80 ℃ 이하가 보다 바람직하다. 더욱 바람직하게는 60 ℃ 이하이다. 비점이 낮을수록 동결 건조나 증발기에 의한 용매 제거가 용이하고, 용매 제거시에 저온에서 조작할 수 있으면 단백질의 변성을 최소한으로 억제할 수 있기 때문에 바람직하다.

본 발명에서는 완충액에 수용성 유기 용매를 첨가한 것이 가장 바람직하다. 여기서 말하는 완충액이란, 완충 작용, 즉 단백질 용액과 혼합했을 때에 급격한 pH 변동을 일으키지 않는 성질의 용액이다. 따라서, 단순한 물은 완충 작용을 갖지 않기 때문에 완충액이라고는 할 수 없다. 본 발명에서의 완충액의 조성은 탄산염 완충액, 탄산수소염 완충액, 인산염 완충액, 아세트산염 완충액 등이 바람직하게 사용된다. 단백질을 분획한 후, 질량 분석으로 해석하는 경우, 동결 건조기나 증발기를 사용하여 용매 성분을 제거함으로써, 샘플을 농축하는 경우가 있는 것을 고려하면, 본 발명에서의 완충액은 샘플 중에 염류가 잔류하지 않는다는 점에서 휘발성인 것이 바람직하다. 그 조건을 만족하는 것으로는, 암모늄염을 사용하여 제조한 완충액을 들 수 있고, 그 조성은 예를 들면 탄산수소암모늄-탄산암모늄, 아세트산-아세트산암모늄, 포름산-포름산암모늄 등을 들 수 있다. 예를 들면 탄산수소암 모늄 완충액을 사용하여 분획하고, 얻어진 샘플을 동결 건조하면, 암모늄염은 암모니아와 이산화탄소, 물이 되어 휘발한다.

본 발명에서의 단백질 분획 디바이스용 완충액의 염 농도는 특별히 한정되지 않지만, 1 mM 내지 1 M가 바람직하고, 10 mM 내지 100 mM이 보다 바람직하다. 또한, 본 발명에서의 단백질 분획 디바이스용 완충액의 수소 이온 농도(pH)는 4.0 내지 8.0이 바람직하다. pH가 4.0 미만, 또는 8.0을 초과하면 단백질의 변성 작용이 강해지기 때문에 바람직하지 않다.

본 발명의 방법에서 분리막이 사용되지만, 바람직하게는 중공사막이 사용된다. 중공사막의 소재는 특별히 한정하지 않지만, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리카르보네이트, 폴리술폰, 폴리메틸메타크릴레이트 등의 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리아미드, 폴리불화비닐리덴, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 고분자를 포함하는 소재가 사용된다. 막 구조에 관해서는, 균일한 구조에 가까운 스폰지 구조를 갖는 것이나, 치밀층과 공극률이 높아 막 강도를 유지하는 지지층의 2층 구조로 이루어지는 것 중 모두 사용할 수 있다. 막의 표면 성질은 분리하는 단백질의 성질에 의해서 결정되고, 친수성이나 소수성일 수도 있다.

친수성막에서는, 친수성의 단량체와 소수성의 단량체를 공중합시킨 것이나, 친수성의 고분자와 소수성의 고분자를 블렌드 제막한 것, 또는 소수성의 고분자를 포함하는 막의 표면에 친수성 중합체를 결합, 부착시킨 것, 소수성의 고분자를 포 함하는 막의 표면을 화학 처리, 플라즈마 처리, 방사선 처리한 것 등을 들 수 있지만, 친수화되어 있으면 그 방법은 특별히 한정되지 않는다. 친수성 성분은 특별히 한정하지 않지만, 폴리에틸렌글리콜 등의 폴리알킬렌옥시드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드 등의 친수성 고분자가 바람직하다. 이들 친수성막은 필요로 하는 단백질의 흡착을 억제하고, 낭비 없이 회수하는 효과가 있다.

또한, 폴리에틸렌이민, 아미노메틸피리딘, 폴리페놀, 블루 색소, 2가 금속 이온(Zn²⁺, Ni² ⁺, Co² ⁺, Cu² ⁺ 등), 소수성 화합물(메틸기, 벤질기, 페닐기, 클로로메틸기, 옥틸기, 라우릴기 등), 항체 및 그 일부분 등 중 적어도 어느 하나 이상을 고정화시킨 소재를 사용할 수도 있다.

막의 분자 분획 성능에 관해서는, 생리적 식염수 중에서 알부민을 50 ％ 이상 통과시키지 않을 정도의 분자 분획능(차단값: 30 내지 60 kDa 이하)이 통상 사용된다.

본 발명에서는, 상기한 중공사막을 충전한 모듈을 사용하는 것이 바람직하고, 모듈에는 분리되는 용액이 유입되는 입구 및 유출하는 출구와 분리된 용액이 유출하는 분리액 유출구가 구비되어 있는 것이 바람직하다.

여기서 모듈의 하우징에 충전하는 막은, 충전했을 때에 이탈이 일어나지 않는 것, 또한 충전물 유래의 용출물이 없도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법으로 단백질 용액을 처리하는 경우, 모듈을 다단 조합하여 사 용하는 것도 바람직하다. 이와 같이 함으로써, 1개의 모듈로 제거되지 않았던 고분자량 단백질을 다음 단계의 모듈로 제거할 수 있고, 분획 처리 후 시료로부터 얻어지는 분석 데이터의 S/N 비를 향상시키는 것이 가능해진다. 이들 모듈은 직렬로 접속되어 있을 수도 있고, 병렬로 접속되어 있을 수도 있다.

본 발명의 방법으로 분획한 후, 이전 공정에서 얻어진 단백질 용액을 농축하는 것도 바람직하다. 이 때, 막을 사용하여 농축할 수도 있다. 막의 분획 분자량은, 회수 대상이 되는 단백질의 분자량에 따라서 선택하는 것이 바람직하다. 여기서 말하는 분획 분자량이란, 여과막의 성능을 평가하기 위해서 사용되는 지표이고, 그 막을 사용하여 여과를 행했을 때에, 외관의 저지율이 0.9가 되는 용액 중 용질의 분자량으로 표시된다. 막에는 공경의 분포가 있고, 실제로는 분획 분자량보다 큰 분자가 통과할 수 있는 경우가 많기 때문에, 사용하는 막의 분획 분자량은 회수 대상이 되는 단백질 군 중에서 가장 작은 분자량 1/2 내지 1/4인 것이 바람직하다. 막의 분획 분자량이 지나치게 크면 회수 대상이 되는 단백질이 누설되고, 회수율이 저하되는 원인이 되는 경우가 있고, 반대로 지나치게 작으면 투과 성능이 낮아져 압력 상승이나 처리 속도 저하의 원인이 되는 경우가 있다. 농축막의 형태는 특별히 한정되지 않지만, 평막과 비교하여 공경 분포가 날카롭고, 농축 효율이 높기 때문에 중공사막을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법으로 단백질 용액을 분획하는 경우, 저온에서 처리하는 것이 바람직하다. 저온으로 함으로써 단백질 용액 중 프로테아제의 활성이 저하되어 높은 효과가 얻어진다. 분획시의 처리 온도는 30 ℃ 미만, 또한 0 내지 20 ℃가 바 람직하고, 2 내지 10 ℃가 보다 바람직하다. 저온에서 처리함으로써, 혈청, 혈장 중에 포함되는 프로테아제의 활성을 억제하고, 단백질의 분해를 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 유기 용매의 휘발도 최대한 억제할 수 있다. 특히 본 발명과 같이 중공사막을 사용하여 분획 처리를 행하는 경우에는, 유기 용매가 휘발하여 발생된 기포에 의한 막 분리 성능에의 악영향을 방지하고자 하기 때문에, 저온에서 처리하는 것이 바람직하다.

우선 제1 발명의 실시예를 나타낸다.

(실시예 A) (제1 발명)

도 1, 2는, 본 발명의 분획 장치를 설명하는 도면이다. 도 1은 분리부가 3개의 모듈에 의해서 구성되어 있는 것을 나타낸다.

도 1을 참조한다. 공급부에 상당하는 고무 버튼 (2b)에 대하여 3방향 이음매 (2a)와 이음매 (2c)가 접속되어 있다. 연성인 튜브 (3)이 이음매 (2c)와 여과부 중공사막 모듈 (5a)의 하부 노즐 (6a)를 다채널식 압착 부재 (8)의 곡면으로 나아가도록 접속되어 있다. 또한, 3방향 이음매 (2a)에 튜브가 부착된 백 (12)가 접속되어 있다. 압착 부재 각 여과부 중공사막 모듈 (5a, 5b, 5c) 및 농축부 (5d)의 각 상단에 구비한 각 상부 노즐 (4a, 4b, 4c, 4d)에는 연성인 튜브가 접속되어 있다. 이들 튜브는, 다채널식의 압착 부재 (8)의 곡면으로 나아가도록 배치되어 하부 노즐 (6a, 6b, 6c, 6d)에 각각 접속되어 있다. 분리부 중공사막 모듈 (5a)의 동체 하부 노즐 (7a)와 중공사막 모듈 (5b)의 하부 노즐 (6b) 사이에, 또한 중공사 막 모듈 (5b)의 동체 하부 노즐 (7b)와 중공사막 모듈 (5c)의 하부 노즐 (6c) 사이에, 또한 중공사막 모듈 (5c)의 동체 하부 노즐 (7c)와 중공사막 모듈 (5d)의 하부 노즐 (6d) 사이에 각각 튜브가 접속되어 있다. 중공사막 모듈 (5d)의 동체 하부 노즐 (7d)와 3방향 이음매 (2a)가 튜브로 접속되어 있다. 또한 중공사막 모듈 (5d)의 하부 노즐 (6d)와 회수 용기 (10)의 상부에 있는 회수 용기캡 (11)이 튜브로 접속되어 있다. 중공사막 모듈 (5d)의 상부 노즐 (4d)와 회수 용기캡 (11)으로도 접속되어 있다. 상기한 모든 중공사막 모듈, 노즐, 튜브, 이음매, 튜브가 부착된 백, 회수 용기, 회수 용기캡은 폐쇄 회로로 되어 있다.

분획에 있어서는 이 폐쇄 회로 내에는 이동상으로서 수계의 완충액이 충전된다. 상기 회로를 카트리지에 수납하였다.

도 2는, 본 발명의 분획 장치의 전체도이고, (A)는 정면도, (B)는 좌측면도이다. 장치 (14)에는 다채널식의 회전 롤러 (9)가 장비되어 있다. 카트리지(14)에 존재하는 압착 부재 (8)의 측면에 설치된 가이드 구멍에 대하여, 장치 본체측으로부터 배치되어 있는 가이드축 (8a, 8b)를 관통하면서, 카트리지 (14)를 압입함으로써 장치에 고정되었다. 고정된 카트리지 (14)는 다채널식 회전 롤러 (9)의 측에 평행 이동하고, 다채널식 회전 롤러 (9) 및 로터와 압착 부재 (8)과 압착 부재 (8)의 곡면에 설치된 7개의 튜브에 의해 송액 시스템을 형성하였다.

또한 시린지 (1)이 부착되었다. 다채널식 회전 롤러 (9)의 각각의 회전 롤러에는 모터로부터의 구동 기구가 각각 부착되었다.

도 1로 돌아가서 설명한다. 액의 흐름을 화살표로 나타내고 있다. 혈청 등 의 원액을 봉입한 시린지 (1)의 바늘을 공급부의 고무 버튼 (2b)에 찌른 후, 검체는 시린지 펌프에 의해서 예정된 속도로 투입되었다. 투입 후 시린지 (1)은 고무 버튼 (2b)로부터 제거되었다. 투입된 원액은 이동상과 섞이면서, 모터에 의해서 구동되는 회전 롤러 (9a)의 회전에 의해서 반송되면서 분리부 중공사막 모듈 (5a)에 송액되었다. 모터에 의해서 구동되는 회전 롤러 (9b)의 회전에 의해서 중공사막 모듈 (5a)를 순환하는 사이에 생성된 여과액은 동체 하부 노즐 (7a)에서 나와, 후단의 분리부 중공사막 모듈 (5b)에 회전 롤러 (9b)의 회전에 의해서 반송되었다. 분리부 중공사막 모듈 (5b)의 여과액은, 추가로 후단의 분리부 중공사막 모듈 (5c)에 반송되었다.

이와 같이 원액의 용질은, 분리부를 구성하는 중공사막 모듈 (5a, 5b, 5c)에서 분획시켰다. 중공사막 모듈 (7c)에서의 여과액은, 농축부 중공사막 모듈 (7d)로 반송되었다. 중공사막 모듈 (7d)를 순환시키는 사이에 생성된 여과액은 동체 노즐 (7a)에서 나와 이음매 (2a)를 개재시켜 공급부에 반송되었다. 중공사막 모듈 (7c)의 여과액은, 농축부의 중공사막 (7d)에 반송되었다. 분리부와 농축부에서의 액의 순환과 송액은 회전 롤러 (9b)에 의해서 행해졌다. 지정된 시간이 경과한 후, 회전 롤러 (9a, 9b)는 정지하고, 모터에 의해서 구동되는 회전 롤러 (9c)가 시동하였다. 이에 따라 회수 용기 (10) 내에 있는 공기가 농축부 내의 회로에 있는 농축액을 압출하고, 농축액은 하부 노즐 (6d)를 통과하여 회수 용기 (10)에 회수되었다.

이어서 제2 발명에 관한 실시예를 설명한다.

(실시예 1)

폴리술폰 중공사 100개를 묶고, 중공사의 중공부가 폐색되지 않도록 에폭시계 포팅제로 양쪽 말단을 유리관 모듈 케이스에 고정하고, 미니 모듈을 제조하였다. 상기 미니 모듈은, 내부 직경이 약 7 mm, 길이가 약 17 cm이고, 일반적인 중공사막형 투석기와 마찬가지로 투석액 포트를 2개 갖고 있다. 상기 미니 모듈의 중공사 및 모듈 내부를 증류수로 세정하였다.

그 후, PBS(닛스이 세이야꾸사 제조의 둘베코 PBS(-)) 수용액을 충전하고, 중공사막 미니 모듈(이후, "미니 모듈 1"이라 약기함)을 얻었다. 인간 혈청(SIGMA사 H1388, Lot 28H8550)을 3000 rpm 15 분의 조건으로 원심 처리를 행하여 침전물을 제거한 후 0.45 ㎛의 필터 처리를 행하였다. 미니 모듈 1의 투석액측의 한쪽을 캡하고, 한쪽은 실리콘 튜브를 연결하여, 회전형 튜브 펌프인 페리-스타 펌프에 접속하였다. 중공사막 내측의 액에 대응하는 미니 모듈 입구와 미니 모듈 출구를 실리콘 튜브로 연결하고, 페리-스타 펌프를 이용하여 혈청을 포함하는 액을 순환할 수 있도록 하였다. 4 ㎖의 혈청을 순환 유량 5 ㎖/분, 여과 유량 0.2 ㎖/분의 유속으로 20 ℃, 4 시간 동안 여과를 실시하였다(본 공정은, 폐기 목적의 고분자량의 단백질과 회수 목적인 저분자량의 단백질을 분리하는 공정에 상당함).

시간 여과에 의해 순환 회로로부터 감소된 용량분은 PBS를 첨가함으로써, 순환하는 액량은 일정하게 유지하였다.

한편, 배위자 고정화용 커플링 칼럼인 HiTrap NHS-activated(아마샴 바이오 사이언스 제조)를 준비하고, 항체를 부착시키지 않고 칼럼으로 형성하였다. 여과 액을 0.2 ㎖ 넣고, 칼럼을 통과시켰다.

최초에 투입한 혈청 중의 알부민 농도를 인간 알부민 ELISA 정량화 키트 (Human Albumin ELISA Quantitation Kit, BETHYL사 제조)로 측정한 결과는 27800 ㎍/㎖이고, 4 시간의 여과 및 칼럼 통과로 얻은 액 중 알부민 농도는 61 ㎍/㎖였다. 분획 전의 혈청 중 α₁마이크로글로블린 농도를 SRL(주)에 주문하여 측정한 결과는 8.9 ㎍/㎖이고, 4 시간만에 얻은 여과액 중 α₁마이크로글로블린 농도는 0.45 ㎍/㎖였다. 따라서, α₁마이크로글로블린 투과 비율/알부민 투과 비율은 약 23이고, 1.5 이상 1000 이하의 범위에 있었다.

(실시예 2)

배위자 고정화용 커플링 칼럼인 하이트랩 NHS-활성화 (HiTrap NHS-activated, 아마샴 바이오 사이언스 제조)에 항 인간 알부민 항체를 고정화하고, 항체 칼럼을 제조하였다. 사용한 항체의 종류 및 양은 하기 표 1과 같고, 각 항 인간 알부민 항체를 고정화하여 제조한 칼럼의 번호는, 각 항 인간 알부민 항체에 부여한 번호를 그대로 사용하였다.

이 5 종류의 항체 칼럼에 실시예 1에서 얻어진 여과액을 각 0.2 ㎖ 넣고, 칼럼을 통과시킨 용액을 통과 분획의 시료로 하였다. 통과 분획의 알부민량을 Human Albumin ELISA Quantitation Kit에서 측정하였다. 결과를 하기 표 2에 나타낸다. 표 2의 칼럼 번호는, 표 1에서 사용한 항체의 번호에 대응한다.

각각의 칼럼에 흡착된 알부민을 0.1 M 글리신 염산 완충액(pH 2.7)으로 용출하고, 흡착 분획으로 하였다. 통과 분획, 흡착 분획을 원심 분리형 분리막(사토리움 아게 제조 vivaspin, 3000 MWCO)을 사용하여 각각 0.2 ㎖까지 농축하여 시료로 하고, 그 중 각 5 ㎕를 SDS-PAGE에서 분석하였다.

분석 결과를 도 4에 도시한다.

도 4는, 실시예 2에서 얻어진 각 분획의 전기 영동(SDS-PAGE) 사진이다. 도 4에서의 1 내지 13은 이하와 같다.

1 전기 영동용 분자량 마커인 레이보우 마커(아마샴 제조 RPN756)

2 실시예 1에서 얻은 여과액

3 칼럼 No.1 통과 분획

4 칼럼 No.2 통과 분획

5 칼럼 No.3 통과 분획

6 칼럼 No.4 통과 분획

7 칼럼 No.5 통과 분획

8 칼럼 No.1 흡착 분획

9 칼럼 No.2 흡착 분획

10 칼럼 No.3 흡착 분획

11 칼럼 No.4 흡착 분획

12 칼럼 No.5 흡착 분획

13 전기 영동용 분자량 마커인 멀티마크(MultiMark, 인비트로젠 제조 LC5725)

도 4로부터, 항체 칼럼 처리 전의 샘플에 다량으로 존재하고 있던 알부민이 항체 칼럼 통과 분획에서부터는 거의 소실되어 있는 것을 알 수 있었다. 따라서, 통과 분획에는 알부민 항체의 존재에 의해 단백질이 10 ％ 이하가 되어 있고, 또한 거의 없다는 것을 확인하였다.

(실시예 3)

실시예 1의 조작에서 얻어진 여과액의 절반을 원심 분리형 분리막(사토리움 아게 제조 vivaspin, 3000 MWCO)을 사용하여 1 ㎖까지 농축하고, 추가로 칼럼 전용 완충액(애질런트 제조 Buffer A No. 5185-5987) 4 ㎖를 혼합한 후, 0.22 ㎛의 원심 필터로 여과하고, 6종의 항체를 조합한 친화성 칼럼 멀티플 어피니티 리무벌 컬럼 (Multiple Affinity Removal Column, 애질런트 제조 No. 5185-5985)을 사용하여 분리하였다.

샘플을 넣은 후 5 ㎖ 이상 Buffer A를 흘려서 얻은, 칼럼에 친화성이 약한 성분을 포함하는 용액을 통과 분획으로 하였다. 이어서, 칼럼에 흡착한 단백질을 칼럼 전용 용출용 완충액(애질런트 제조 Buffer B No. 5185-5988)으로 용출하고, 흡착 분획으로 하였다. 통과 분획, 흡착 분획을 원심 분리형 분리막(사토리움 아게 제조 vivaspin, 3000 MWCO)을 사용하여 각각 1 ㎖까지 농축하고, 그 중 각 10 ㎕를 SDS-PAGE에서 분석하였다. 통과 분획으로부터 분리된 밴드와 흡착 분획으로부터 분리된 밴드 위치에는 중첩은 거의 인정되지 않고, 항체의 존재에 의해 단백질이 10 ％ 이하가 되어 있거나, 거의 없는 것을 확인하였다.

(비교예 1)

실시예 1에서 사용한 것과 동일한 로트의 인간 혈청(SIGMA사 H1388, Lot 28H8550) 40 ㎕를 실시예 3에서 사용한 항체 칼럼 전용 완충액으로 5배로 희석하여 분리하였다. 통과 분획, 흡착 분획을 원심 분리형 분리막(사토리움 아게 제 vivaspin, 3000 MWCO)을 사용하여 각각 1 ㎖까지 농축하고, 그 중 각 5 ㎕를 SDS-PAGE에서 분석하였다. 분석의 결과, 항체에 의해서 알부민을 비롯하여 몇개의밴드가 소실되었지만, 고분자량 물질부터 저분자량 물질까지 광범위하게 밴드가 존재하고 있었다.

이하에 제3 발명에 관한 실시예를 설명한다.

(실시예 4)

도레이가부시끼 가이샤 제조의 혈액 투석기(TS1.6 ML)의 양끝의 수지 접착 부분을 절단하고, 폴리술폰제 중공사막을 얻었다. 얻어진 중공사막의 치수는, 내부 직경 200 ㎛, 막 두께 40 ㎛이고, 액이 투과하는 곳의 단면을 관찰하였더니 비대칭 구조를 갖고 있었다. 이 중공사막을 100개 묶고, 중공사막의 중공부를 폐색하지 않도록 에폭시계 포팅제로 양쪽 말단을 유리관 모듈 케이스에 고정시키고, 미니 모듈을 제조하였다. 미니 모듈의 직경은 약 7 mm, 길이는 약 17 cm이고, 일반적인 중공사막형 투석기와 마찬가지로, 중공사 내에 액체를 순환시키기 위한 포트(순환포트)와 투석액 포트를 각각 2개 갖고 있다. 제조한 미니 모듈의 중공사막 및 모듈 내부를 증류수로 세정하였다.

탄산수소암모늄(시그마 알드리치 재팬 제조) 및 탄산암모늄(시그마 제조)을 각각 밀리-Q 물에 용해시키고, 양자를 혼합하여 pH를 8.0으로 맞추고, 50 mM 탄산수소암모늄 완충액(pH 8.0)(이하, 단순히 완충액 A라 함)을 제조하였다. 그 용액에 아세토니트릴 농도가 10 ％(v/v)가 되도록 아세토니트릴(시그마 알드리치 재팬 제조, 고속 액체 크로마토그래피용)을 첨가하여 잘 혼화하고, 본 발명의 단백질 분획용 완충액으로서 사용하였다(이하, 10 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A라 함).

이하의 조작은 4 ℃로 설정된 저온실에서 행하였다. 전체 길이가 65 cm인 1개의 실리콘 튜브(에즈원 제조, 내경 2 mm, 외경 4 mm)(실리콘 튜브 A)의 2개소에 T자관을 조립하고, 제1 T자관의 실리콘 튜브 A에 접속되어 있지 않은 개구부에는 실리콘 튜브(실리콘 튜브 B)를 개재시켜 압력계를 접속하였다. 제2 T자관의 실리콘 튜브 A에 접속되어 있지 않은 개구부에는 실리콘 튜브(전체 길이 15 cm, 내경 2 mm, 외경 4 mm)(실리콘 튜브 C)를 개재시켜 시린지를 설치하고, 액체의 주입구로 하였다. 시린지에는 10 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A를 충전하고, 시린지를 마이크로시린지 펌프(KD Scientific제, 이하, 시린지 펌프라 표기함)에 설치하고, 2개의 T자관 사이에 있는 실리콘 튜브의 도중에 회전형 마이크로 튜브 펌프(도쿄 리까 기까이(주) 제조, 이하, 송액 펌프라 표기함)를 설치하였다. 압력계에 접속한 실리콘 튜브 B, 및 시린지에 접속한 실리콘 튜브 C를 겸자로 고정시킨 후, 실리콘 튜브 A의 한쪽 끝을 10 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A가 포함된 용기에 부착하고, 송액 펌프를 작동시켜 실리콘 튜브 A 내를 10 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A로 채우고, 유속을 5 ㎖/분으로 조정하였다.

미니 모듈의 순환 포트의 한쪽 끝을 상기 실리콘 튜브 A의 한쪽 끝과 접속하고, 송액 펌프를 작동시켜 10 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A를 중공사막 내측에 송액하여 중공 부분의 기포를 제거하였다. 송액 펌프를 정지시킨 후, 다른 한쪽의 실리콘 튜브 A의 단부를 모듈의 단부와 접속하였다. 이와 같이 해서, 모듈, 시린지, 압력계가 접속된 순환 회로가 형성되었다. 10 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A로 4배 희석한 인간 혈청(시그마 제조)(이하, 희석 혈청 A라 표기함) 4.5 ㎖를 시린지(테루모(주) 제조)에 넣고, 시린지의 앞에 날개를 부착한 정맥 주사 바늘(테루모(주) 제조)을 부착하여, 마이크로시린지 펌프에 셋팅하였다. 희석 혈청 A를 바늘의 끝까지 충전하고, 기포가 없는 것을 확인한 후, 회로 상의 실리콘 튜브 B를 배치한 T자관 부근에 설치한 액체의 주입구에 상기 정맥 주사 바늘의 바늘끝을 찔러 회로와 접속하고, 단백질 분획 디바이스를 완성하였다.

송액 펌프를 작동시켜 5 ㎖/분으로 순환 회로에 10 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A를 순환시킨 후, 시린지 펌프를 작동시켜서 0.2 ㎖/분으로 희석 혈청 A를 압출하여 분획 처리를 개시하였다. 이 때, 모듈로부터 여과된 처리액을 50 ㎖의 폴리프로필렌제 원침관에 회수하였다. 20 분 후, 4 ㎖의 희석 혈청을 압출한 시점에 시린지 펌프를 고정시키고, 즉시 10 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A를 충전한 시린지를 부착한 시린지 펌프를 0.2 ㎖/분으로 작동시켜 처리를 계속하였다. 분획 개시로부터 120 분 후, 시린지 펌프, 송액 펌프를 함께 정지시켰다. 이 때, 막을 투과하고, 회수된 회수액의 용량은 약 24 ㎖였다. 회수액을 동결 건조하고, 완충액 A에 재용해시켰다. 이 용액의 인간 혈청 알부민(HSA), β₂마이크로글로블린(β₂MG), 인터루킨 8(IL-8)의 각 농도를 효소 면역 측정법(ELISA)으로 정량하였다. 그 결과, 하기 표 3과 같이 제거 대상인 HSA의 회수율은 희석 혈청 A 중에 포함되어 있던 양의 0.009 ％로 매우 낮았던 것에 반해, 회수 대상인 β₂MG, IL-8은 각각 51.2 ％, 17.4 ％ 회수되었다.

(실시예 5)

완충액 A에 아세토니트릴 농도가 12.5 ％(v/v)가 되도록 아세토니트릴(시그마 알드리치 재팬 제조, 고속 액체 크로마토그래피용)을 첨가하여 잘 혼화한 후, 탈기하고, 본 발명의 단백질 분획 디바이스용 완충액으로서 사용하였다(이하, 12.5 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A). 12.5 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A에서 4배 희석한 인간 혈청(시그마 제조)(이하, 희석 혈청 B라 표기함) 4 ㎖를 실시예 4와 동일한 방법에 의해 모듈로 처리하였다. 그 결과, 표 3과 같이 제거 대상인 HSA의 회수율은 희석 혈청 B 중에 포함되어 있던 양의 0.012 ％로 매우 낮았던 것에 반해, 회수 대상인 β₂MG, IL-8은 각각 52.3 ％, 19.7 ％ 회수되었다.

(실시예 6)

완충액 A에 아세토니트릴 농도가 15 ％(v/v)가 되도록 아세토니트릴(시그마 알드리치 재팬 제조, 고속 액체 크로마토그래피용)을 첨가하여 잘 혼화한 후, 탈기하고, 본 발명의 단백질 분획 디바이스용 완충액으로서 사용하였다(이하, 15 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A라 함). 15 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A에서 4배 희석한 인간 혈청(시그마 제조)(이하, 희석 혈청 C라 표기함) 4 ㎖를 실시예 4와 동일한 방법으로 처리하였다. 그 결과, 표 3과 같이 제거 대상인 HSA의 회수율은 희석 혈청 C 중에 포함되어 있던 양의 0.028 ％로 매우 낮은 것에 반해, 회수 대상인 β₂MG, IL-8은 각각 54.3 ％, 24.3 ％ 회수되었다.

(실시예 7)

완충액 A에 아세토니트릴 농도가 17.5 ％(v/v)가 되도록 아세토니트릴(시그마 알드리치 재팬 제조, 고속 액체 크로마토그래피용)을 첨가하여 잘 혼화한 후, 탈기하고, 본 발명의 단백질 분획 디바이스용 완충액으로서 사용하였다(이하, 17.5 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A). 17.5 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A에서 4배 희석한 인간 혈청(시그마 제조) 4 ㎖(이하, 희석 혈청 D라 표기함)를 실시예 4와 동일한 방법으로 처리하였다.

그 결과, 표 3과 같이 제거 대상인 HSA의 회수율은 희석 혈청 D 중에 포함되어 있던 양의 0.039 ％로 낮은 것에 반해, 회수 대상인 β₂MG, IL-8은 각각 55.9 ％, 25.1 ％ 회수되었다.

(실시예 8)

완충액 A에 아세토니트릴 농도가 7.5 ％(v/v)가 되도록 아세토니트릴(시그마 알드리치 재팬 제조, 고속 액체 크로마토그래피용)을 첨가하여 잘 혼화한 후, 탈기하고, 본 발명의 단백질 분획 디바이스용 완충액으로서 사용하였다(이하, 7.5 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A). 7.5 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A에서 4배 희석한 인간 혈청(시그마 제조)(이하, 희석 혈청 E와 표기함) 4 ㎖를 실시예 4와 동일한 방법으로 처리하였다. 그 결과, 표 3과 같이 제거 대상인 HSA의 회수율은 희석 혈청 E 중에 포함되어 있던 양의 0.008 ％로 매우 낮은 것에 반해, 회수 대상인 β₂MG, IL-8은 각각 41.9 ％, 17.1 ％ 회수되었다.

(실시예 9)

완충액 A에 아세토니트릴 농도가 5.0 ％(v/v)가 되도록 아세토니트릴(시그마 알드리치 재팬 제조, 고속 액체 크로마토그래피용)을 첨가하여 잘 혼화한 후, 탈기하고, 본 발명의 단백질 분획 디바이스용 완충액으로서 사용하였다(이하, 5.0 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A). 5.0 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A에서 4배 희석한 인간 혈청(시그마 제조)(이하, 희석 혈청 F라 표기함) 4 ㎖를 실시예 4와 동일한 방법으로 처리하였다. 그 결과, 표 3과 같이 제거 대상인 HSA의 회수율은 희석 혈청 F 중에 포함되어 있던 양의 0.007 ％로 매우 낮은 것에 반해, 회수 대상인 β₂MG, IL-8은 각각 34.1 ％, 16.2 ％ 회수되었다.

(실시예 10)

완충액 A에 아세토니트릴 농도가 2.5 ％(v/v)가 되도록 아세토니트릴(시그마 알드리치 재팬 제조, 고속 액체 크로마토그래피용)을 첨가하여 잘 혼화한 후, 탈기하고, 본 발명의 단백질 분획 디바이스용 완충액으로서 사용하였다(이하, 2.5 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A). 2.5 ％ 아세토니트릴 첨가 완충액 A에서 4배 희석한 인간 혈청(시그마 제조)(이하, 희석 혈청 G라 표기함) 4 ㎖를 실시예 4와 동일한 방법으로 처리하였다. 그 결과, 표 3과 같이 제거 대상인 HSA의 회수율은 희석 혈청 G 중에 포함되어 있던 양의 0.004％로 매우 낮은 것에 반해, 회수 대상인 β₂MG, IL-8은 각각 20.5 ％, 11.7 ％ 회수되었다.

(실시예 11)

50 mM 아세트산암모늄 완충액(pH 5.0)(이하, 완충액 B)을 제조하고, 아세토니트릴 농도가 10 ％(v/v)가 되도록 아세토니트릴(시그마 알드리치 재팬 제조, 고속 액체 크로마토그래피용)을 첨가하여 잘 혼화한 후, 탈기하고, 본 발명의 단백질 분획 디바이스용 완충액으로서 사용하였다(이하, 아세토니트릴 첨가 완충액 B). 아세토니트릴 첨가 완충액 B에서 4배 희석한 인간 혈청(시그마 제조)(이하, 희석 혈청 H라 표기함) 4 ㎖를 실시예 4와 동일한 방법으로 처리하였다. 그 결과, 표 3과 같이 제거 대상인 HSA의 회수율은 희석 혈청 H 중에 포함되어 있던 양의 0.035 ％로 매우 낮은 것에 반해, 회수 대상인 β₂MG, IL-8은 각각 9.4, 13.2 ％ 회수되었다.

(실시예 12)

완충액 A에 농도가 10 ％(v/v)가 되도록 1,4-디옥산(시그마 알드리치 재팬 제조)을 첨가하여 잘 혼화하였다(이하, 디옥산 첨가 완충액 A). 디옥산 첨가 완충액 A에서 4배 희석한 인간 혈청(시그마 제조)(이하, 희석 혈청 I라 표기함) 4 ㎖를 실시예 4와 동일한 방법으로 처리하였다. 그 결과, 표 3과 같이 제거 대상인 HSA의 회수율은 희석 혈청 I 중에 포함되어 있던 양의 0.022 ％로 매우 낮은 것에 반해, 회수 대상인 β₂MG, IL-8은 각각 58.7 ％, 20.5 ％ 회수되었다.

(실시예 13)

완충액 A에 농도가 10 ％(v/v)가 되도록 아세톤(시그마 알드리치 재팬 제조)을 첨가하여 잘 혼화하였다(이하, 아세톤 첨가 완충액 A). 아세톤 첨가 완충액 A에서 4배 희석한 인간 혈청(시그마 제조)(이하, 희석 혈청 J라 표기함) 4 ㎖를 실시예 4와 동일한 방법으로 처리하였다. 그 결과, 표 3과 같이 제거 대상인 HSA의 회수율은 희석 혈청 J 중에 포함되어 있던 양의 0.037 ％로 매우 낮은 것에 반해, 회수 대상인 β₂MG, IL-8은 각각 57.5 ％, 21.2 ％ 회수되었다.

(실시예 14)

완충액 A에 농도가 10 ％(v/v)가 되도록 에탄올(시그마 알드리치 재팬 제조)를 첨가하고 잘 혼화하였다(이하, 에탄올 첨가 완충액 A). 에탄올 첨가 완충액 A에서 4배 희석한 인간 혈청(시그마 제조)(이하, 희석 혈청 K라 표기함) 4 ㎖를 실시예 4와 동일한 방법으로 처리하였다. 그 결과, 표 3과 같이 제거 대상인 HSA의 회수율은 희석 혈청 K 중에 포함되어 있던 양의 0.023 ％로 매우 낮은 것에 반해, 회수 대상인 β₂MG, IL-8은 각각 46.8 ％, 18.9 ％ 회수되었다.

(비교예 2)

완충액 A를 회로 내에 충전하고, 완충액 A에서 4배 희석한 인간 혈청(시그마 제조)(이하, 희석 혈청 L라 표기함) 4 ㎖를 0.2 ㎖/분으로 회로 내에 주입하고 실시예 4와 동일하게 하여 분획 처리하였다. 그 결과, 표 3과 같이 제거 대상인 HSA의 회수율은 희석 혈청 L 중에 포함되어 있던 양에 대하여 검출 감도 이하로 매우 낮지만, 회수 대상인 β₂MG, IL-8도 각각 5.90 ％, 검출 감도 이하이고, 저회수율이었다.

(비교예 3)

완충액 B를 회로 내에 충전하고, 완충액 B에서 4배 희석한 인간 혈청(시그마 제조)(이하, 희석 혈청 M이라 표기함) 4 ㎖를 0.2 ㎖/분으로 회로 내에 주입하고 실시예 4와 동일하게 하여 분획 처리하였다. 그 결과, 표 3과 같이 제거 대상인 HSA의 회수율은 희석 혈청 M 중에 포함되어 있던 양에 대하여 검출 감도 이하로 매우 낮지만, 회수 대상인 β₂MG, IL-8도 각각 검출 감도 이하, 1.83 ％이고, 저회수율이었다.

(비교예 4)

완충액 A를 회로 내에 충전하고, 완충액 A에서 4배 희석한 인간 혈청(시그마 제조)(이하, 희석 혈청 N이라 표기함) 4 ㎖를 0.2 ㎖/분으로 회로 내에 주입하여, 처리중의 온도를 30 ℃로 설정하는 것 이외에는 실시예 4와 동일하게 하여 분획 처리하였다. 그 결과, 처리 중에 기포가 발생하여 평가가 불가능해졌다.

이들 발명은 프로테옴 해석을 행할 때의 시료의 제조에서 매우 유용한 것이 고, 의학, 특히 인간의 병의 발견에 대단히 이용 가능하다.

Claims

1) 원액을 투입하기 위한 공급부,

2) 공급부에서 보내진 원액 중의 용질의 일부를 여과하는 여과부,

3) 여과부에서의 여과액을 농축하는 농축부, 및

4) 분획시에 장치 내에 도입되는 이동상을 송액하기 위한 송액 펌프

를 적어도 구비하고, 상기 여과부, 상기 농축부 및 상기 여과부와 상기 농축부를 접속하는 유로가 형성하는 회로가 폐쇄 회로인 것을 특징으로 하는, 원액 중 용질 또는 그 일부를 막을 사용하여 분리하는 분획 장치.

제1항에 있어서, 상기 분획 장치가 추가로

5) 농축부에서 얻어지는 농축액을 회수하는 회수부

를 구비하고, 공급부, 여과부, 및 공급부와 여과부를 접속하는 유로가 형성하는 회로, 및 농축부, 회수부 및 농축부와 회수부를 접속하는 유로가 형성하는 회로가 각각 폐쇄 회로인 것을 특징으로 하는 분획 장치.

제2항에 있어서, 상기 폐쇄한 회로의 총 내용적이 50 ㎖ 이하인 것을 특징으로 하는 분획 장치.

제2항에 있어서, 여과부 및 농축부 각각에 여과기를 사용한 것을 특징으로 하는 분획 장치.

제4항에 있어서, 여과기가 중공사막을 내장한 모듈인 것을 특징으로 하는 분획 장치.

제5항에 있어서, 공급부와 여과부 사이의 유로에 원액을 수송하기 위한 송액 펌프를 구비하는 것을 특징으로 하는 분획 장치.

제6항에 있어서, 회수부는 농축액을 채취하는 용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 분획 장치.

제7항에 있어서, 상기 회로 중 임의의 위치에 원액을 투입했을 때의 부피 변화를 수용하는 완충부를 갖는 것을 특징으로 하는 분획 장치.

제7항에 있어서, 공급부, 여과부, 농축부, 회수부와 상기 각 부분을 접속하는 유로를 포함하는 회로의 적어도 일부가 카트리지에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 분획 장치.

제8항에 있어서, 송액 펌프가 회전 가능한 로터와 로터의 외주에 자유롭게 회전하도록 설치된 롤러를 구비한 롤러형 튜브 펌프이고, 상기 카트리지의 외벽의 일부가 회로의 일부 유로를 압착하기 위한 압착 부재인 것을 특징으로 하는 분획 장치.

제10항에 있어서, 상기 카트리지를 롤러형 튜브 펌프의 로터에 이접(離接)하는 방향으로 이동시켜서, 송액관을 압착할 수 있도록 하는 이동 기구를 구비하는 것을 특징으로 하는 분획 장치.

제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 원액이 체액 또는 생체 성분 함유액인 것을 특징으로 하는 분획 장치.

카트리지 및 롤러형 튜브 펌프를 구비하고,

카트리지가 원액을 공급하기 위한 공급부; 상기 공급부에서 유로에 의해서 접속된 원액으로부터 용질을 막에 의해서 분획하는 수단; 및 상기 용질을 분획하는 수단으로부터 유로에 의해서 접속된 분획된 용질을 회수하는 회수부를 적어도 갖는 회로의 적어도 일부를 내장하고, 상기 회로가 폐쇄 회로이고, 상기 카트리지 외벽의 일부가 롤러형 튜브 펌프로부터 튜브를 압착하기 위한 압착 부재이며, 상기 회로의 일부인 튜브가 상기 압착 부재의 외벽의 일부에 설치되어 있는 것을 특징으로 하는, 원액 중 용질 또는 그 일부를 막을 사용하여 분리하는 분획 장치.

카트리지 중에 원액을 공급하기 위한 공급부; 상기 공급부에서 유로에 의해 접속되고 원액으로부터 용질을 막에 의해서 분획하는 수단; 및 상기 용질을 분획하는 수단으로부터 유로에 의해서 접속되고 분획된 용질을 회수하는 회수부를 포함하는 회로의 적어도 일부를 내장하며, 상기 회로가 폐쇄 회로이고, 상기 카트리지 외벽의 일부가 압착 부재이며, 상기 회로의 일부인 튜브가 상기 압착 부재의 외벽의 일부에 설치되어 있는 것을 특징으로 하는, 원액 중의 용질 또는 그 일부를 막을 사용하여 분리하는 분획 장치용 회로.

단백질을 흡착하는 항체가 없는 상태에서 인간 α₁마이크로글로블린과 인간 알부민과의 투과 비율(인간 α₁마이크로글로블린 투과율/인간 알부민의 투과율)이 1.5 이상 1000 이하인 막 분리 시스템의 중반 또는 후반부에, 특정한 단백질을 흡착하는 항체를 내장한 항체 흡착 막 분리 시스템에 대하여 생체 성분 유래의 시료를 공급하고 생체 성분의 일부를 분리하는 것을 특징으로 하는,

분리에 의해 얻어지는 특정한 단백질의 농도가 항체가 없는 상태에서의 막 분리 시스템으로 얻어지는 농도의 10 ％ 이하인 생체 성분의 분리 방법.

제15항에 있어서, 특정한 단백질이 혈청 알부민, 면역 글로블린 G, 면역 글로블린 A, 면역 글로블린 M, 트랜스페린, 헵토글로빈, α₁안티트립신, α₂거대 글로블린, α₁산성 글리코프로테인, 피브리노겐, 보체 C1q, 보체 C3, 보체 C4, 보체 C8, 보체 C9, 보체 인자 B, 아폴리포프로테인 A, 아폴리포프로테인 B, Lp(a), 콜라겐, 미오신, 액틴, 사이토케라틴, 케라틴 및 피브로넥틴 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 생체 성분의 분리 방법.

제16항에 있어서, 항체가 폴리클론성 항체 또는 모노클로날 항체 또는 항원 인식 부위를 포함하는 이들의 일부분인 것을 특징으로 하는 생체 성분의 분리 방법.

제17항에 있어서, 항체가 막 분리 시스템의 막 표면에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 생체 성분의 분리 방법.

제18항에 있어서, 막 분리 시스템이 분리막을 내장하는 칼럼을 다단 직렬로 조합한 것이며, 항체가 제1 단계째 칼럼의 분리막의 원액측의 표면에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 생체 성분의 분리 방법.

제19항에 있어서, 막 분리 시스템이 분리막을 내장하는 칼럼을 다단 직렬로 조합한 것이며, 항체가 제1 단계째 칼럼의 분리막의 투과측의 표면에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 생체 성분의 분리 방법.

제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 막 분리 시스템이 분리막을 내장하는 칼럼을 다단 직렬로 조합한 것이며, 항체가 전단의 칼럼의 막과 후단의 칼 럼의 막의 사이에 있는 유로 내의 이동상에 존재하는 것을 특징으로 하는 생체 성분의 분리 방법.

제21항에 있어서, 막 분리 시스템이 분리막을 다단 직렬로 조합한 것이며, 항체가 전단의 막과 후단의 막 사이의 유로에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 생체 성분 분리 방법.

인간 α₁마이크로글로블린과 분자량 6만 이상의 인간 알부민과의 투과 비율이 2 이상 1000 이하인 막 분리 장치, 및 막 분리 장치의 유로의 중반 또는 후반부에 항체를 내장하는 항체 처리 장치를 갖는 생체 성분 분리 장치.

분획에서의 용액이 유기 용매를 함유하는 것을 특징으로 하는, 복수종의 단백질 및 물을 함유하는 용액을 분리막에 접촉시켜 단백질을 분획하는 방법.

제24항에 있어서, 유기 용매의 함유량이 1 용량％ 이상 20 용량％ 미만인 것을 특징으로 하는 단백질의 분획 방법.

제25항에 있어서, 유기 용매가 아세토니트릴인 것을 특징으로 하는 단백질의 분획 방법.

제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 분획이 30 ℃ 이하에서 행해지는 것을 특징으로 하는 단백질 분획 방법.