CN102043051B - 一种筛选不同亚型单克隆抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于单克隆抗体的制备技术，具体涉及一种筛选不同亚型单克隆抗体的方法。该方法在细胞融合后，将分泌不同类型抗体的杂交瘤细胞随机分布于各培养孔内，使用截留分子量在150kD-900kD之间的滤膜将培养上清液中的IgG、IgM区分出来，从而判断该孔细胞内杂交瘤分泌抗体的类型，若该孔细胞分泌所期望的特定类型抗体，则对其进行克隆化培养。该方法减少了杂交瘤克隆化的工作量，避免了筛选的盲目性。
Description
技术领域
本发明属于单克隆抗体的制备技术，具体涉及一种筛选不同亚型单克隆抗体的方法。
背景技术
抗体主要分为IgM、IgG、IgA、IgD、IgE等五个类型，而通过生物技术制备杂交瘤细胞而获得的单克隆抗体主要为IgG或IgM类型的单克隆抗体，单克隆抗体被广泛应用于医学、生物学等领域。单克隆抗体主要由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞，被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体（简称单抗）。
单抗的制备过程较为复杂，试验周期较长，由于动物个体差异、免疫方案、试剂等原因影响，筛选出来的单抗类型往往是随机的。由于具有这种不确定性，经过大量的研究工作所获得的单抗往往与期望能够获得的单抗类型不同，导致重复性工作，造成实验时间、经费、资源等的浪费。
目前通常的单抗制备及鉴定方法流程如图1所示，首先，从注射了抗原的实验动物体内提取B淋巴细胞，并与骨髓瘤细胞进行细胞融合，形成杂交瘤细胞；然后，对所形成的杂交瘤细胞进行克隆化培养，使其大量培养增殖；最后，对细胞克隆化培养后的杂交瘤细胞分泌的抗体类型进行鉴定。杂交瘤细胞的克隆化培养是制备单抗过程中耗时较多的重要步骤。然而，目前的单抗制备过程只有在进行细胞克隆化培养后才可以对抗体类型进行鉴定，因此必须对所有融合细胞进行克隆化培养，并筛选阳性克隆，这就存在着一定的盲目性。当筛选的单抗其类型与预期不一致时，就必须再次从融合细胞中进行筛选或重新免疫动物再次获得融合细胞。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种能够减少杂交瘤克隆化的工作量，避免盲目性的筛选不同亚型单克隆抗体的方法。
本发明的技术方案如下：一种筛选不同亚型单克隆抗体的方法，所述的不同亚型单克隆抗体为IgG和IgM类型，该方法包括如下步骤：
（1）取细胞融合后所形成的杂交瘤细胞的培养上清液，离心去除悬浮的细胞及细胞碎片，获得培养上清液A；
（2）将适量上清液A加入带有滤膜的孔板，离心收集透过液B，置于一块收集板中；所述的板孔为可双面加入液体的圆柱形孔，中间设计一带有滤膜的夹层，收集板分为两块，分别同主板的两个面配套，滤膜能够截留的分子量在150kD～900kD之间；
（3）将孔板翻转后，加入洗脱液再次离心，使滤膜截留的组分充分洗脱，并收集截留组分溶液C，置于另一块收集板中；
（4）将孔板的各孔所对应的A、B、C液分别加入使用免疫原包被的抗原板孵育，根据免疫动物选择相应的酶标二抗，进行ELISA试验；
（5）根据试验结果以及期望获得的抗体类型，确定对哪一孔细胞进行克隆化培养。
进一步，如上所述的筛选不同亚型单克隆抗体的方法，在步骤（2）中，所使用的孔板规格为96孔、48孔或24孔。
进一步，如上所述的筛选不同亚型单克隆抗体的方法，在步骤（3）中，所用的洗脱液为0.01mol/L PBS溶液。
进一步，如上所述的筛选不同亚型单克隆抗体的方法，在步骤（4）中，ELISA试验的结果若A、B液呈现阳性，则该孔细胞分泌抗体类型为IgG；若A、C液呈现阳性，则该孔细胞分泌抗体类型为IgM；若A、B、C液均呈现阳性，则该孔细胞同时含有分泌IgG和IgM类型抗体的杂交瘤细胞。
本发明的有益效果如下：本发明对原有单抗制备（筛选）流程进行了改进，并结合膜过滤的方法，适当截留分子量，将融合后的杂交瘤细胞的培养上清进行过滤，培养上清中IgM型单克隆抗体将被截留于滤膜上，不会通过滤膜，而培养上清中IgG类型的单抗将同滤液一起通过滤膜；然后对滤膜上保留的组分和滤液分别进行检测，就可以判断所获得杂交瘤细胞分泌的单抗类型是否为期望获得的抗体类型，从而进行有目的的克隆化培养。
附图说明
图1为常用的单抗制备及鉴定方法流程示意图；
图2为本发明的方法流程图；
图3为增加了筛选步骤后的单抗制备及鉴定方法流程示意图。
具体实施方式
本发明调整了单抗制备过程中的主要步骤，采用膜过滤的方法确定融合细胞中是否包含分泌特定类型抗体的杂交瘤细胞，减少了杂交瘤克隆化的工作量，降低了筛选单抗的盲目性。
如图2所示，筛选不同亚型单克隆抗体的方法，包括如下步骤：
（1）取细胞融合后所形成的杂交瘤细胞的培养上清液，离心去除悬浮的细胞及细胞碎片，获得培养上清液A；
（2）将适量上清液A加入带有滤膜的孔板，滤膜能够截留的分子量在150kD～900kD之间，离心收集透过液B；
（3）将孔板翻转后，加入洗脱液再次离心，使滤膜截留的组分充分洗脱，并收集截留组分溶液C；
（4）将孔板的各孔所对应的A、B、C液分别加入使用免疫原包被的抗原板孵育，根据免疫动物选择相应的酶标二抗，进行ELISA试验；若A、B液呈现阳性，则该孔细胞分泌抗体类型为IgG；若A、C液呈现阳性，则该孔细胞分泌抗体类型为IgM；若A、B、C液均呈现阳性，则该孔细胞同时含有分泌IgG和IgM类型抗体的杂交瘤细胞；
（5）根据试验结果以及期望获得的抗体类型，确定对哪一孔细胞进行克隆化培养。
改良后的单抗制备流程如图3所示，增加了上述单克隆抗体类型鉴别的步骤。下面结合一个具体实施例，对本发明进行详细描述。
膜分离的原理，是在外界推动力(压力)作用下，利用溶液中组分的分子量差异，使溶液中不同分子量大小的组分达到分离的一种方法。IgG抗体其分子量为150kD，而IgM抗体分子量达到900kD，因此使用一定孔径的滤膜过滤杂交瘤细胞的培养上清，可使其中包含的IgG、IgM抗体达到分离。本发明利用膜过滤的方法（适当截留分子量），将适当孔径（截留分子量）的滤膜嵌合于孔板内，用于单抗制备过程中分离杂交瘤细胞培养上清液中IgG、IgM类型抗体，并配套相应的收集板便于收集相应的液体。
IgG、IgM抗体分离板主要由主板、收集板、试剂、附件等四部分组成。主板由板框、板条组成或为整体固定式主板，可为多种规格，如96孔、48孔、24孔等，板孔设计为可双面加入液体的圆柱形孔，中间设计一带有滤膜的夹层。收集板分为两块，分别同主板的两个面配套，使用颜色标识，使其不易混用。在使用过程中为避免污染，必须对主板孔内进行清洗，而且主板及收集板可以反复使用多次，因此配套清洗试剂。主板可以同市面通用的培养板配合使用，因此配套固定组件，由于需要离心操作，因此同时配套相同规格不带滤膜的模型板用于离心配平。
该实施例的具体实现步骤如下：
（1）取融合后细胞培养上清液150ul，离心弃去悬浮的细胞及细胞碎片，获得培养上清液A。
（2）取上清液A50ul加入带有滤膜的96孔板，本实施中滤膜使用能够截留分子量为150-200kD左右的滤膜，离心收集离心透过液B，置于一块收集板中；之所以使用截留分子量为150-200kD左右的滤膜，其主要原因是由于为了使离心穿透液B中的杂质成分更少。由于IgG抗体具有抗体分子量小，易于标记、使用等优点，在抗体制备过程中大多数研究期待筛选的抗体类型为IgG型单抗。因此，使用截留分子量较小的滤膜，可以避免大分量的杂质对离心透过液B的影响，使筛选IgG的假阳性降低。
（3）将该96孔板翻转后，加入洗脱液Ⅰ再次离心，使滤膜截留的组分充分洗脱，并收集截留组分溶液C，置于另一块收集板中；滤膜截留主要原理是依靠滤膜表面孔径大小进行筛分,其过程主要为物理过程，转孔板后的洗脱过程主要是利用溶液从滤膜背面穿透滤膜过程中，将沉积于滤膜正面的组分冲洗下来，因此洗脱液的主要组分为0.01mol/L PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液，pH7.4)。
由于滤膜材质不同，滤膜表面可能存在电荷，截留组分在滤膜表面的沉积也可能导致沉积层电荷的改变，因此洗脱液中可加入少量表面活性剂，如吐温-20等。
（4）将各孔所对应的A、B、C液分别加入使用免疫原包被的抗原板孵育，根据免疫动物选择相应的酶标二抗，进行ELISA试验；若A、B液呈现阳性，则该孔细胞分泌抗体类型为IgG；若A、C液呈现阳性，则该孔细胞分泌抗体类型为IgM；若A、B、C液均呈现阳性，则该孔细胞同时含有分泌IgG和IgM类型抗体的杂交瘤细胞。
（5）根据试验结果以及期望获得的抗体类型，从而确定对哪一培养孔细胞进行克隆化培养。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (4)
1.一种筛选不同亚型单克隆抗体的方法，所述的不同亚型单克隆抗体为IgG和IgM类型，该方法包括如下步骤：
（1）取细胞融合后所形成的杂交瘤细胞的培养上清液，离心去除悬浮的细胞及细胞碎片，获得培养上清液A；
（2）将适量上清液A加入带有滤膜的孔板，离心收集透过液B，置于一块收集板中；所述的板孔为可双面加入液体的圆柱形孔，中间设计一带有滤膜的夹层，收集板分为两块，分别同主板的两个面配套，滤膜能够截留的分子量在150kD～900kD之间；
（3）将孔板翻转后，加入洗脱液再次离心，使滤膜截留的组分充分洗脱，并收集截留组分溶液C，置于另一块收集板中；
（4）将孔板的各孔所对应的A、B、C液分别加入使用免疫原包被的抗原板孵育，根据免疫动物选择相应的酶标二抗，进行ELISA试验；
（5）根据试验结果以及期望获得的抗体类型，确定对哪一孔细胞进行克隆化培养。
2.如权利要求1所述的筛选不同亚型单克隆抗体的方法，其特征在于：在步骤（2）中，所使用的孔板规格为96孔、48孔或24孔。
3.如权利要求1所述的筛选不同亚型单克隆抗体的方法，其特征在于：在步骤（3）中，所用的洗脱液为0.01mol/L PBS溶液。
4.如权利要求1或2或3所述的筛选不同亚型单克隆抗体的方法，其特征在于：在步骤（4）中，ELISA试验的结果若A、B液呈现阳性，则该孔细胞分泌抗体类型为IgG；若A、C液呈现阳性，则该孔细胞分泌抗体类型为IgM；若A、B、C液均呈现阳性，则该孔细胞同时含有分泌IgG和IgM类型抗体的杂交瘤细胞。
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