KR20060061228A

KR20060061228A - 건조물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20060061228A
Application number: KR1020050111145A
Authority: KR
Inventors: 마사하루 쿠로하시; 요지 시바야마
Original assignee: 니폰 조키 세야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2004-12-01
Filing date: 2005-11-21
Publication date: 2006-06-07
Also published as: US20060134139A1; EP1669082A1; EP1669082B1; DE602005019672D1; ES2341654T3; AU2005235903A1; US20140017311A1; AU2005235903B2; US8568789B2; US20120135083A1; KR101307999B1; ATE459363T1; CA2527750A1; CA2527750C

Abstract

본 발명의 목적은 백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액의 칼리크레인류 물질 생산 저해 활성을 갖는 건조물 및 그 제조방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명은 백시니아 바이러스를 접촉한 토끼의 염증 피부 추출액을 유효성분으로 하는 고형제제를 제조하기 위해 건조할 때, 건고되기 전에 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 첨가하여 혼합하고, 이것을 건조하는 것을 특징으로 하는 본 추출액의 건조물의 제조방법에 관한 것이다. 본 제조방법에 의해 본 추출액의 칼리크레인류 물질 생산 저해 활성을 갖는 건조물을 얻을 수 있고, 또한, 이것을 사용하여 정제 등의 경구용 고형제제를 제조하는 것이 가능하게 된다.

Description

건조물 및 그 제조방법{DRIED MATERIAL AND METHOD FOR THE MANUFACTURE THEREROF}

본 발명은 백시니아 바이러스(vaccinia virus)를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액의 건조물 및 상기 건조물의 제조방법에 관한 것이다.

백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액(이하, 본 추출액이라고도 함)은, 백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 조직으로부터 추출 분리된 비단백성의 활성 물질을 함유하는 것이다.

본 추출액을 유효성분으로서 함유하는 의약품인 백시니아 바이러스 접종 집 토끼 염증 피부 추출액 제제(제품명:노이로트로핀)은, 의료약 일본 의약품집[2004(제27판), 일본 의약정보센터 편, 주식회사 지호우 발행]의 2499-2501쪽에 기재되어 있는 바와 같이, 요통증, 경견완(頸肩腕) 증후군, 증후성 신경통, 견관절 주위염, 변형성 관절증, 피부질환(습진, 피부염, 두드러기)에 따르는 소양, 알레르기성 비염, SMON 후유증상의 냉감·이상지각·통증, 띠상 포진 후 신경통 등의 광범위한 적응이 확인되고 있는 매우 특이한 제제이며, 피하, 근육 주사, 정맥 주사용의 주사제 및 정제가 의료용 의약품으로서 제조 승인을 받아서 시판되고 있다.

본 추출액은 생체유래의 것으로서, 단일의 유효성분은 동정(同定)되어 있다. 따라서, 유효성분의 정량은, 그 생물 활성(역가)을 검정함으로써 행해지고, 구체적으로는, 동통 역치가 정상 동물보다 저하된 만성 스트레스 동물인 SART 스트레스(반복 한냉 부하) 마우스를 이용하여 진통 계수를 구하는 생물학적 시험법이 사용되고 있다(「일약리지」, 제72권, 제5호, 573-584쪽, 1976년). 즉, SART 스트레스 마우스를 이용하여 랜달-세리토(Randall-Selitto) 변법에 준해서 진통 시험을 행하여 진통 계수를 구하고, 표준품에 대해서 진통계수에서 구한 ED₅₀값을 취하여 노이로트로핀 단위(NU)를 규정하고 있다. 노이로트로핀 주사제는 1mL당 노이로트로핀 단위로서 1.2단위를, 노이로트로핀 정제는 1정당 4.0 노이로트로핀 단위를 함유한다.

본 추출액에 대해서는, 이것을 유효 성분으로 하는 의약품 제제가 판매되고 있는 일본 등에 있어서, 상기 진통 활성의 정량에 더하여, 칼리크레인류(kallikrein like) 물질 생산 저해 활성(이하, KPI활성이라고도 함)을 규정 레벨이상 갖는 것을 확인하는 역가 시험법을 행함으로써, 약제로서의 품질, 유효성을 보다 엄격하게 유지하고 있다.

칼리크레인은 각종 동물의 혈장 중 및 조직 중에 광범위하게 존재하는 단백질 분해 효소이고, 칼리크레인·키닌계인 효소계가 알려져 있다. 혈장 중에 있어서는, 혈액 응고 제 XII인자의 활성화를 통하여 불활성한 프리 칼리크레인이 활성형의 혈장 칼리크레인으로 변환되고, 이 생성된 혈장 칼리크레인이 혈장 중의 고분자 키니노겐(kininogen)에 작용하고, 노나 펩티드의 케미컬 메디에이터(chemical mediator)인 브래디키닌(bradykinin)이 유리된다. 브래디키닌은 지각 신경 자극에 의한 강력한 통증 발생, 혈관 확장에 의한 혈압 강하, 모세관의 투과성 상승에 의한 부종의 발현 등 각종 작용을 갖고, 통증 발생, 염증, 혈류 조절에 중요한 역활을 담당하고 있다고 생각된다. 따라서, 브래디키닌 유리 억제 작용을 갖는 약제는, 진통, 항염증, 항부종 등의 각종 약효를 발현하는 것이 알려져 있다.

본 추출액은, 브래디키닌 유리 억제 작용을 갖는 것이 밝혀졌고(Eur. J. Pharmacol., vol.157, No.1, p93-99,1988), 이 약리 활성은 칼리크레인류 물질의 생산 저해 작용에 기초한다는 것이 밝혀졌다. 그리고, 약제의 혈장 칼리크레인류 물질 생산 저해 능력을 in vitro에서 정량적으로 측정가능한 방법이 개발되었다(「기초와 임상」, 제20권, 제17호, 8889-8895쪽, 1986년).

본 발명은, 백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액을 유효성분으로 하는 경구제제의 규격 및 시험 방법에 규정되어 있는 KPI활성을 갖는 최종제품을 제조하는 중간 단계에서 얻어지는 건조물 및 상기 건조물을 제조하는 방법 에 관한 것이다. 본 추출액의 건조물에 관해서는, 하기 특허문헌 1에 있어서, 감압 하에 건고하는 등으로 기재되어 있을 뿐이고, 본 추출액으로부터 경구제제를 제조하는 점에서, KPI활성을 갖는 건조물을 제조하기 위한 구체적인 방법을 개시하고 있는 종래 기술은 존재하지 않는다.

[특허문헌 1] 일본특허공개 소53-101515호 공보

본 추출액을 정제 등의 경구용 고형제제로서 제제화할 때에는, 상기 추출액 을 건조할 필요가 있다. 그런데, 통상 행하여지는 농축 건조 등에 의하여 얻어지는 본 추출액의 건조물에 있어서는, KPI활성이 확인되지 않으므로, 최종 제제로서 KPI활성을 갖는 정제 등의 고형제제를 제조할 수는 없었다.

출원인 회사는, 그 제조 판매하고 있었던 노이로트로핀 주사제의 경구제제화에 대해 오랜 세월 동안 연구개발을 해왔지만, 그 때의 어려움 중 하나가 KPI활성을 갖는 최종제제를 얻는 것이었다. 경험적으로 일정한 방법으로 제조된 최종제제에 KPI활성이 존재하는 것이 확인되어 노이로트로핀 정제의 개발은 달성되었지만, 출원인은 이것을 노하우로서 보유하고 있었다. 본 발명자들은 본 추출액에 관해서 KPI활성을 갖는 건조물을 얻기 위한 건조 방법에 대해서 체계적으로 연구를 행한 결과, 본 추출액을 건고하기 전에 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 첨가하여 혼합하고, 이것을 건조함으로써, KPI활성을 갖는 본 추출액의 건조물이 얻어지는 것과 그 경우의 최적 pH 등을 찾아내고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은, 백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액의 칼리크레인류 물질 생산 저해 활성을 갖는 건조물 및 상기 건조물의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 추출액을 건조할 때, 건고되기 전에 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 첨가하여 혼합하고, 이것을 건조하는 것을 특징으로 하는 본 추출액의 건조물의 제조방법에 관한 것이다. 상기 제조방법에 의해, KPI활성을 갖는 본 추출액의 건조물을 얻을 수 있고, 이것을 이용하여 최종적으로 KPI활성을 유지한 정제등의 고형제제를 제조하는 것이 가능하다.

백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출액 등의 본 추출액은, 후술하는 방법에 의하여 제조될 수 있지만, 본 발명 방법은 얻어진 본 추출액을 건조할 때에, 본 추출액이 건고되기 전에 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 첨가하여 혼합하고, 이것을 건조시키는 것이 특징이다. 당류란, 포도당, 만노오스, 아라비노오스, 크실로오스, 갈락토오스, 소르보스 등의 단당류, 유당, 단순당(simple sugar), 맥아당, 라피노오스, 멜레지토오스(melezitose) 등의 올리고당류, 풀루란(pullulan), 덱스트린, β-덱스트린, 덱스트란 등의 다당류 등이 열거된다. 당알콜이란, 만니톨, 말티톨, 락티톨(lactitol), 파라티니트(palatinit) 및 소르비톨 등이 열거된다. 첨가되는 당류, 당알콜 및 아스코르빈산은 상기 중 1종류를 사용해도 좋고, 또는 2종 이상을 조합시켜서 사용할 수도 있다. 다당류에 관해서는 물에 불용인 것은 본 발명에는 부적당하고, 물에 가용인 다당류가 본 발명에 있어서 사용가능하다. 또한, 물에 불용인 다당류란, 일본약국방(제 14개정)의 통칙 23에 있어서의 「거의 녹지 않는다」에 해당하는 것이고, 예를 들면, 결정 셀룰로오스나 전분 등이 열거된다.

당류, 당알콜 또는 아스코르빈산의 첨가량은, 사용하는 당류나 당알콜의 종류, 추출액의 농도 등에 의하여 적당하게 설정 가능하지만, 하기 실시예 1의 피검추출액의 경우에는, 바람직하게는 0.1중량% 이상이 바람직하고, 재현성이 높은 KPI활성을 갖는 본 추출액의 건조물을 얻기 위해서는, 0.5중량% 이상의 첨가제를 첨가하는 것이 보다 바람직하다.

건조 수단으로서는, 통상의 제제 조제에 있어서 사용되고 있는, 농축 건조를 이용할 수 있다. 예를 들면, 온화한 조건으로 농축하는 수단으로서는, 그다지 고온으로 가열하지 않고, 온침 하(35∼45℃)에서 감압하여 수분을 증류 제거하는 감압 건조를 열거할 수 있다. 또한, 본 추출액 또는 그 농축액에 상기 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 함유하는 부형제 등을 첨가하여 혼합 후, 조립 건조해서 과립상의 본 발명 건조물을 얻을 수도 있다. 본 추출액의 농축에 있어서는, 용액의 pH를 10이하로 행하는 것이 바람직하고, 높은 KPI활성을 갖는 본 추출액의 건조물을 얻기 위해서는, pH를 8.5내지 9.7로 조정하여 행하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명에 있어서의 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산의 첨가는, 본 추출액에 처음부터 첨가하여도 좋고, 어느 정도 농축하고나서 첨가하여도 좋지만, 통상 고형제제 제조의 경우와 같이, 건고된 후에 첨가하는 것에 의해서는 최종적으로 제조되는 건조물에 KPI활성이 얻어지지 않는다. 본 발명에 근거하여 정제 등의 고형제제를 제조할 때는, 각종 첨가제를 이용하여 제제화할 수 있지만, 예를 들면 일본약국방(제 14개정)의 제제 총칙에 기재되어 있는 바와 같이, 상기 당류, 당알콜, 아스코르빈산을 첨가하여 농축 건조시킨 본 추출액의 건조물을 그대로, 또는 부형제, 결합제, 붕괴제 또는 그 밖의 적당한 첨가제를 첨가하여 균등하게 혼화한 것을, 적당한 방법으로 과립상으로 한 후, 활택제 등을 첨가하여 압축 성형하는 방법, 또는 혼화한 것을 직접 압축 성형하는 방법 등이 열거된다. 또한, 본 추출액을 어느 정도 농축한 시점에서, 상기 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산, 및 그 밖의 부형제, 결합제, 붕괴제 등의 첨가제를 첨가하여 균등하게 혼합하고, 적당한 방법으로 조립 건조한 건조물을 활택제 등을 첨가하여 압축 성형하는 방법이라도 본 추출액의 정 제화를 실시할 수 있다. 그리고, 필요에 따라서 착색제, 교미제(矯味劑) 등을 첨가할 수 있고, 적당한 코팅제로 정제를 코팅할 수도 있다.

본 발명 건조물의 제조에 사용되는 본 추출액은, 백시니아 바이러스를 토끼의 피부에 접종해서 발두(發痘)된 염증 피부 조직을 파쇄하고, 추출 용매를 첨가하여 조직편을 제거한 후, 제단백 처리를 행하고, 이것을 흡착제에 흡착시키고, 이어서, 유효성분을 용출시킴으로써 얻어질 수 있다.

여기서, 토끼는 토끼목에 속하는 것 모두를 포함하고 있다. 즉, 토끼는 예를 들면, 토끼(집토끼), 산토끼(일본 산토끼), 새앙토끼, 눈토끼 등 중 어느 하나이어도 좋고, 일본에서는 과거부터 사육되어 가축 또는 실험용 동물로서 번용되고 있는 집토끼라고 불리는 것이 사용되기 쉽다.

본 추출액은, 예를 들면, 이하의 공정으로 제조된다.

(a)백시니아 바이러스를 접종하여 발두된 토끼의 피부조직을 채취하고, 발두조직을 파쇄하고, 물, 페놀수, 생리 식염액 또는 페놀-글리세린수 등의 추출 용매를 첨가한 후, 여과 또는 원심분리함으로써 추출액(여과액 또는 상청)을 얻는다.

(b)상기 추출액을 산성의 pH로 조정하여 가열하고, 제단백 처리한다. 이어서 제단백된 용액을 알칼리성으로 조정하여 가열한 후에 여과 또는 원심분리한다.

(c)얻어진 여과액 또는 상청을 산성으로서 활성탄, 카올린 등의 흡착제에 흡착시킨다.

(d)상기 흡착제에 물 등의 추출 용매를 첨가하여, 알칼리성의 pH로 조정하고, 흡착 성분을 용출함으로써 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출액을 얻을 수 있다. 그 후에 적당하게 중성 부근의 pH로 조정하고, 제제용 원체(原體)로 할 수도 있다.

상기 각 공정을 더욱 상세하게 서술하면 다음과 같다.

(a)에 대해서

백시니아 바이러스를 집토끼 등의 토끼에 접종하여 발두시킨 염증 피부 조직을 채취하여 파쇄하고, 그 1내지 5배량의 추출 용매를 첨가하여 유화 현탁액으로 한다. 추출 용매로서는, 증류수, 생리 식염수, 약산성 내지 약염기성의 완충액 등을 사용할 수 있고, 글리세린 등의 안정화제, 페놀 등의 살균·방부제, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘 등의 염류 등을 적당하게 첨가하여도 좋다. 이 때, 동결 융해, 초음파, 세포막 용해 효소 또는 계면활성제 등의 처리에 의해 세포 조직을 파괴하여 추출을 용이하게 할 수도 있다.

(b)에 대해서

얻어진 유상 추출액을 여과 또는 원심분리 등에 의하여 조직편을 제거한 후, 제단백 처리를 행한다. 제단백 조작은, 통상 행해지는 공지의 방법에 의해 실시될 수 있고, 가열 처리, 단백질 변성제, 예를 들면, 산, 염기, 요소, 구아니딘, 아세톤 등의 유기 용매 등에 의한 처리, 등전점 침전, 염석 등의 방법을 적용할 수 있다. 이어서, 불용물을 제거하는 통상의 방법, 예를 들면, 여과지(셀룰로오스, 니트로셀룰로오스 등), 유리 필터, 세라이트, 자이츠 여과판 등을 사용한 여과, 한외 여과, 원심분리 등에 의해 석출된 불용 단백질을 제거한다.

(c)에 대해서

이와 같이 얻어진 유효 성분 함유 추출액을, 염산, 황산, 불화수소산 등의 산을 이용하여 산성, 바람직하게는 pH3.5 내지 5.5로 조정하고, 흡착제로의 흡착 조작을 행한다. 사용 가능한 흡착제로서는, 활성탄, 카올린 등을 열거할 수 있고, 추출액 중에 흡착제를 첨가하여 교반하거나, 추출액을 흡착제 충전 칼럼에 통과시켜서, 상기 흡착제에 유효성분을 흡착시킬 수 있다. 추출액 중에 흡착제를 첨가했을 경우에는, 여과나 원심분리 등에 의하여 용액을 제거하고, 유효성분을 흡착시킨 흡착제를 얻을 수 있다.

(d)에 대해서

흡착제에서 유효성분을 용출(탈리)시키는 데는, 상기 흡착제에 용출 용매를 첨가하고, 실온 또는 적당하게 가열하거나 또는 교반하여 용출시키고, 여과나 원심분리 등의 통상의 방법으로 흡착제를 제거하여 달성할 수 있다. 사용되는 용출 용매로서는, 염기성의 용매, 예를 들면 염기성의 pH로 조정한 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등 또는 이들의 적당한 혼합 용액을 사용할 수 있고, 바람직하게는 pH9 내지 12로 조정한 물을 사용할 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 추출액(용출액)은, 제제용 원체나 의약품 제제로서 바람직한 형태로 적당하게 조제될 수 있다. 예를 들면, 용액의 pH를 중성 부근 또는 적당한 pH로 조정하여 제제용 원체로 할 수도 있다.

(실시예)

이하에, 본 추출액의 제조방법의 실예를 나타낸다.

참고예 1

건강하게 성숙한 집토끼의 피부에 백시니아 바이러스를 접종하고, 발두한 피부를 떼어내고, 이것을 파쇄하여 페놀수를 첨가하였다. 이어서, 이것을 가압 여과하고, 얻어진 여과액을 염산으로 pH5로 조정한 후, 90∼100℃에서 30분간 가열 처리하였다. 여과하여 제단백한 후, 수산화나트륨으로 pH9로 하고, 또한 90∼100℃에서 15분간 가열 처리한 후 여과하였다. 여과액을 염산으로 약 pH4로 조정하고, 2% 의 활성탄을 첨가하여 2시간 교반한 후, 원심분리하였다. 채취한 활성탄에 물을 첨가하고, 수산화나트륨으로 pH10으로 하고, 60℃에서 1.5시간 교반한 후, 원심분리하여 상청을 얻었다. 원심분리로 침전된 활성탄에 다시 물을 첨가하고, 수산화나트륨으로 pH11로 하고, 60℃에서 1.5시간 교반한 후, 원심분리하여 상청을 얻었다. 이 둘의 상청을 합하고, 염산으로 중화하여 본 추출액을 얻었다.

참고예 2

건강하게 성숙한 집토끼의 피부에 백시니아 바이러스를 접종하여 감염시킨 후, 발두된 피부를 무균적으로 떼어내어 이것을 세절(細切)한 후 페놀-글리세린 수를 첨가하고, 호모게나이저로 마쇄(磨碎)하여 유상으로 하였다. 이어서, 이것을 여과하고, 얻은 여과액을 염산으로 약산성(pH4.5 내지 5.5)으로 조정한 후, 100℃에서 가열 처리하여 여과하였다. 여과액을 수산화 나트륨으로 약 알칼리성(pH8.5 내지 10.0)으로 하고, 또한 100℃에서 가열 처리한 후 여과하였다. 여과액을 염산으로 약 pH4.5로 하고, 약 1.5%의 활성탄을 첨가하여 1 내지 5시간 교반한 후 여과하였다. 여과하여 취한 활성탄에 물을 첨가하여 수산화 나트륨으로 pH9.4 내지 10으로 조정하고, 3 내지 5시간 교반한 후, 여과하였다. 여과액을 염산으로 중성 부근 으로 중화시켰다.

참고예 3

건강하게 성숙한 토끼의 피부에 백시니아 바이러스를 접종하고, 활성화시킨 후, 활성화된 피부를 무균적으로 떼어내고, 이것을 세절해서 물을 첨가하고, 호모게나이저로 마쇄하여 유상물로 하였다. 이어서, 이것을 가압 여과하고, 얻어진 여과액을 염산으로 pH5.0로 조정한 후, 유통 증기 하 100℃에서 가열 처리하였다. 여과하여 제단백한 후, 수산화 나트륨으로 pH9.1로 하고, 또한 100℃에서 가열 처리한 후 여과하였다. 여과액을 염산으로 pH4.1로 조정하고, 활성탄 2%를 첨가하여 2시간 교반한 후 여과하였다. 여과액은 활성탄 5.5%을 더 첨가하여 2시간 교반한 후 여과하였다. 최초에 여과하여 취한 활성탄에 물을 첨가하고, 수산화 나트륨으로 pH9.9로 하고, 60℃에서 1.5시간 교반한 후 여과하였다. 최초의 활성탄 및 다음의 활성탄에 물을 첨가하고, 수산화 나트륨으로 pH10.9로 하고, 60℃에서 1.5시간 교반한 후 여과하였다. 여과액을 합하여 염산으로 중화한 후, 분자량 100의 막을 사용한 전기 투석법으로 탈염 처리를 행하였다.

KPI 활성측정법

혈장 칼리크레인류 물질 생산에 대한 피검물질의 저해 활성(KPI활성)을, 문헌 기재의 방법을 따라서 측정하였다(「기초와 임상」, 제20권, 제17호, 8889-8895쪽, 1986년). 즉, 동 문헌 8890쪽에 상세하게 설명되어 있는 바와 같이, 피검용액과 생리 식염수로 희석한 인간 정상 혈장을 혼합하고, 이것에 카올린 현탁액을 첨가하여 혈장 칼리크레인의 생산 반응을 개시시키고, 일정 시간 후에 리마콩 트립신 인히비터(LBTI) 등의 활성형 혈액응고 제XII인자에 대한 특이적 저해제를 첨가하여 칼리크레인의 생산 반응을 정지시킨 후, 생산된 칼리크레인을 발색성 합성 기질(S-2302, chromogenix사 제작)을 이용하여 정량하였다. 합성 기질 S-2302은 칼리크레인에 의하여 발색성의 p-니트로아닐린을 유리하기 때문에, 유리되는 p-니트로아닐린양을 405nm에 있어서의 흡광도로 측정함으로써 생산된 칼리크레인의 양(활성량)을 측정할 수 있다. 피검물질의 KPI활성은, 피검물질을 첨가하지 않은 군(대조군)과 피검물질 첨가군의 흡광도 차를 구함으로써 판정할 수 있다.

또한, KPI활성을 갖는지의 여부의 판단 기준은 적당하게 설정할 수 있지만, 노이로트로핀 제제에 있어서는, 이 흡광도 차가 0.1이상인 것이 규격으로 되고 있고, 본 발명 건조물에 있어서도 해당 기준이 사용된다.

실시예 1

상기 참고예 1을 따라서 제조된 백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출액의 건고물 중량을 측정하고, 1mg/mL, pH9.5가 되도록 피검추출액을 조제하였다. 상기 피검추출액 100mL을 칭량하고, 약 40℃의 온침 하에서 감압하 농축 건조를 행하였다. 건조물에 물을 첨가하여 녹이고, 1mg/mL의 피검용액으로 하였다. 이 피검용액 0.2mL와 0.5M 염화나트륨 용액 0.2mL을 혼화하고, 이하, 상술한 KPI활성측정법의 시험 조작을 따라서 측정 시험을 실시하였다. 표 1은 피검추출액을 그대로 농축 건조하였을 경우와 유당을 1중량%가 되도록 첨가하여 조제된 피검추출액을 농축 건조하였을 경우의 시험 결과(n=2)의 일예를 나타내는 것이다. 또, 대조군은 물이다(이하, 동일).

피검용액	흡광도		흡광도차 (KPI활성)
	실측값	평균값
대조군	0.361	0.361	-
	0.361
유당 비첨가	0.352	0.363	-0.002
	0.373
유당 첨가	0.073	0.069	0.292
	0.065

상기 시험계는, 생산된 칼리크레인의 효소 활성에 의하여 발색성 합성 기질로부터 유리되는 p-니트로아닐린을 흡광도에 의하여 측정하는 계이다. 대조군에 있어서는 일정량의 칼리크레인이 생산되고 있고, 표 1상단과 같은 흡광도가 측정되지만, 반응계 중에 칼리크레인 생산을 저해하는 피검물질이 존재하면, 칼리크레인 생산의 저하에 따라, 측정되는 흡광도는 낮은 값을 나타낸다. 즉, 대조군과의 흡광도 차가 큰 쪽이 피검물질의 KPI활성이 높은 것을 나타낸다. 표 1에 나타나 있는 바와 같이, 유당을 첨가하지 않고 농축 건조한 피검용액의 흡광도는 대조군으로 바뀌지 않고, 전혀 KPI활성이 확인되지 않았다. 이에 반해 유당을 첨가하여 농축 건조한 피검용액에서는, 명확한 KPI활성이 측정되므로 유당의 첨가에 의하여 KPI활성을 갖는 본 추출액의 건조물을 제조할 수 있는 것이 확인되었다.

실시예 2

실시예 1과 마찬가지로 피검추출액에 유당을 첨가하여 농축 건조하였을 경우와 피검추출액의 농축 건조 후에 유당을 첨가하였을 경우를 비교하였다. 또한, 블랭크로서 유당용액에 관해서도 측정하였다. 결과의 일례를 표 2에 나타낸다. 표 2에 나타낸 결과와 같이, 유당을 첨가하여 농축 건조한 피검용액만이 KPI활성을 나타내고, 피검추출액을 농축 건조 후에 유당을 첨가하였을 경우와 유당만의 용액의 경우에는 KPI활성은 전혀 확인되지 않았다.

피검용액	흡광도		흡광도차 (KPI활성)
	실측값	평균값
대조군	0.356	0.364	-
	0.371
유당 첨가	0.066	0.063	0.301
	0.059
건조 후 유당 첨가	0.341	0.342	0.022
	0.342
1질량% 유당 용액	0.365	0.375	-0.011
	0.384

실시예 3

유당 이외의 첨가제를 실시예 1과 마찬가지로 피검추출액에 첨가하여 농축 건조한 결과를 이하에 나타낸다. 포도당(단당류)이나 풀루란(다당류) 등의 당류를 첨가(모두 1중량%)하여 건조한 것은 KPI활성을 나타내었지만, 인산수소칼슘 등의 당류 이외의 부형제나 물에 불용인 다당류인 결정 셀룰로오스나 옥수수 전분을 사용한 경우에는 KPI활성은 확인되지 않았다.

피검용액	흡광도		흡광도차 (KPI활성)
	실측값	평균값
대조군	0.330	0.323	-
	0.315
포도당 첨가	0.075	0.069	0.254
	0.063
인산수소칼슘 첨가	0.283	0.289	0.034
	0.294
대조군	0.322	0.325	-
	0.327
풀루란 첨가	0.095	0.094	0.231
	0.093
액정셀룰로오스 첨가	0.273	0.277	0.048
	0.280
대조군	0.330	0.324	-
	0.317
옥수수 전분 첨가	0.280	0.303	0.021
	0.326

또한, 상기와 동일하게(첨가량도 동일), 당알콜로서, 만니톨, 말티톨, 락티톨, 파라티니트(일수화물), 소르비톨 또는 아스코르빈산을 사용하여 시험을 행한 결과를 표 3b에 나타낸다. 만니톨, 말티톨, 소르비톨, 락티톨, 파라티니트, 아스코르빈산을 첨가하여 농축 건조한 피검용액에서는 명백한 KPI활성이 측정되므로, 적어도 육단당을 구성당으로서 1이상 함유하는 당류의 당알콜 또는 아스크로빈산의 첨가에 의하여 KPI활성을 갖는 본 추출액의 건조물을 제조할 수 있다는 것이 확인되었다.

피검용액	흡광도		흡광도차 (KPI활성)
	실측값	평균값
대조군	0.368	0.369	-
	0.370
소르비톨 첨가	0.207	0.223	0.146
	0.239
대조군	0.346	0.353	-
	0.359
만티톨 첨가	0.095	0.090	0.263
	0.084
아스코르빈산 첨가	0.039	0.039	0.314
	0.038
대조군	0.351	0.352	-
	0.352
락티톨 첨가	0.042	0.041	0.311
	0.040
파라티니트 첨가	0.114	0.115	0.237
	0.116
대조군	0.336	0.343	-
	0.350
말티톨 첨가	0.044	0.043	0.300
	0.041

실시예 4

상기 실시예에서 기재된 당류이외의 당류를 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 행한 결과를 표 4에 나타낸다(모두 피검추출액의 1중량%를 첨가). 또한, 유당을 0.5중량%, 0.1중량% 첨가하였을 경우의 결과도 동일한 표에 나타냈다. 표 4는 복수회의 시험 결과를 정리한 것이고(대조군의 흡광도값: 0.306∼0.363), 피검용액의 흡광도 및 그것과 대조군의 흡광도 차(KPI활성)를 나타낸다.

피검용액으로의 첨가제	흡광도 (실측값 2회의 평균값)	대조군과의 흡광도차 (KPI활성)
아라비노오스	0.056	0.268
크실로오스	0.053	0.271
만노오스	0.049	0.275
갈락토오스	0.072	0.252
소르보스	0.056	0.250
단순당	0.107	0.249
맥아당	0.060	0.290
라피노오스	0.084	0.264
멜레지토오스	0.097	0.251
덱스트린	0.104	0.242
β-덱스트린	0.240	0.121
덱스트란	0.186	0.177
유당(0.5질량%)	0.047	0.273
유당(0.1질량%)	0.143	0.177

실시예 5

실시예 1과 마찬가지로, 본 추출액의 건고물 중량을 측정하고, 1mg/mL, pH8.8 내지 9.3이 되도록 피검추출액을 조제하였다. 상기 피검추출액 10L를 칭량하고, 약 40℃의 농축액 온도로 유지되도록 온도 조절하면서 감압 하에 농축을 행하였다. 200mL(50mg/mL)까지 농축하고, 이것에 200g의 유당 및 그 밖의 부형제나 붕괴제 등 약 160g을 첨가하여 혼합 후, 조립 건조하였다. 이렇게 하여 얻어진 건조 과립은, 스테아린산 마그네슘 등의 활택제를 가하여 압축 성형하여 정제를 제조하는 등, 경구용 고형제제로 할 수 있다.

본 추출액의 건고물 중량 50mg을 함유하면, 계산되는 양의 상기 건조 과립을 나누어 취하고, 50mL의 트리스 염산 완충액(pH8.0)을 첨가하여 혼합하였다. 이어서, 멤브레인 필터를 이용하여 여과하고, 여과액을 피검용액으로서 실시예 1과 동일하게 KPI활성을 측정하였다. 또한, 상기에 있어서 유당 등의 부형제를 첨가하기 전의 50mg/mL 농축액을 나누어 취하고, 물로 1mg/mL의 농도로 희석한 피검용액에 관해서도 측정하였다. 결과의 일례를 표 5에 나타낸다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 본 추출액의 농축액 및 이 농축액에 유당 등의 부형제를 첨가하여 혼합 후에 조립 건조해서 제조한 건조 과립 모두 KPI활성을 갖고 있었다.

피검용액	흡광도		흡광도차 (KPI활성)
	실측값	평균값
대조군	0.332	0.334	-
	0.335
건조 과립액	0.054	0.054	0.280
	0.054
농축액	0.048	0.047	0.287
	0.046

실시예 6

실시예 1과 마찬가지로 피검추출액에 유당을 첨가하여 농축 건조할 때, 피검추출액을 각종 pH로 조정하여 시험을 행한 결과의 일례를 표 6에 나타낸다. 피검추출액의 pH가 10.5인 경우에는 KPI활성이 거의 확인되지 않고, pH9.5부터 산성이 되는데 따라서 건조물의 KPI활성은 서서히 저하되었다.

피검용액	흡광도		흡광도차 (KPI활성)
	실측값	평균값
대조	0.338	0.335	-
	0.332
pH6.0 농축액	0.178	0.174	0.161
	0.169
pH8.5 농축액	0.133	0.128	0.207
	0.122
pH9.5 농축액	0.053	0.050	0.285
	0.047
pH10.0 농축액	0.241	0.232	0.103
	0.223
ph10.5 농축액	0.272	0.272	0.063
	0.272

처방예 1

실시예 5기재의 방법과 동일하게 본 추출액의 건조 과립을 제조하고, 이것을 압축 성형하여 정제를 제조하였다. 즉, 1정중 백시니아 바이러스 접종 집토끼염증 피부 추출액의 건조물 4mg, 유당 104mg, 결정 셀룰로오스 40mg, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘 20mg의 성분량이 되도록 각 성분을 혼합 후, 조립 건조하였다. 이 건조 과립에 스테아린산 마그네슘(1정중 2mg의 함유량)을 첨가해서 혼합하고, 타정기로 압축 성형하여 정제를 제조하였다.

처방예 2

처방예 1과 동일하게, 1정중 백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출액의 건조물 5mg, 유당 80mg, 인산수소칼슘 20mg, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스 42mg, 히드록시프로필셀룰로오스 2mg, 스테아린산마그네슘 1mg을 함유하는 정제를 제조했다. 이 코팅되지 않은 정제를 코팅액(히드록시프로필셀룰로오스 40g, 10g의 마크로골(macrogol)6000, 산화티탄 3g, 탈크 5g, 레이크 색소 0.5g, 정제수 941.5g을 혼합한 것)으로 스프레이 코팅하여 필름 코팅정을 제조하였다. 상기 건조 과립 및 정제에 대하여 KPI활성을 측정한 결과, 건조 과립 및 정제 모두 KPI활성을 갖고 있었다. 또한, 유당 대신에 D·만니톨을 사용하여 동일하게 처방하여도 동일한 결과가 얻어졌다.

그 밖에, 본 발명 건조물은 적당하게 산제 과립제, 캅셀제 등의 경구용 고형제제로 가공될 수 있다.

본 발명은 백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액의 칼리크레인류 물질 생산 저해 활성을 갖는 건조물을 제공하는 것이고, 이 건조물은 최종적으로 KPI활성을 갖는 정제, 과립제, 산제, 세립 등의 고형제제의 제제화에 이용할 수 있다. KPI활성을 갖는 본 추출액의 건조물의 제조방법은, 본 추출액을 유효성분으로 하는 경구용 고형제제의 제조에 있어서 본질적으로 중요하다. 본 발명은, 본 추출액을 유효성분으로 하여 KPI활성을 갖는 경구용 고형제제의 제공을 가능하게 하는 획기적인 발명인 한편, 본 추출액을 건고시키기 전에 소정의 조건으로 당류를 첨가하여 혼합하고, 이것을 건조시킨다는 간편한 조작으로 실시가능하고, 특수한 첨가제 등이 필요로 되지 않는 경제적으로도 매우 유용한 방법이다.

Claims

백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액을 건조할 때, 상기 추출액이 건고되기 전에 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 첨가하여 혼합하고, 이것을 건조하는 것을 특징으로 하는 상기 추출액의 건조물의 제조방법.
백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액을 건조할 때, 상기 추출액이 건고되기 전에 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 첨가하여 혼합하고, 이것을 건조하는 것을 특징으로 하는 상기 추출액의 칼리크레인류 물질 생산 저해 활성을 갖는 건조물의 제조방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액에 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 첨가하여 혼합하고, 이것을 농축 건조하는 것을 특징으로 하는 건조물의 제조방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액을 농축하고, 상기 추출액이 건고되기 전에 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 첨가하여 혼합하고, 이것을 건조하는 것을 특징으로 하는 건조물의 제조방법.
제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 추출액의 농축 건조를 10이하의 pH로 행하는 것을 특징으로 하는 건조물의 제조방법.
제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 추출액의 농축 건조를 pH8.5 내지 9.7로 행하는 것을 특징으로 하는 건조물의 제조방법.
제 1항 또는 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 당류로서, 포도당, 만노오스, 아라비노오스, 크실로오스, 갈락토오스, 소르보스, 유당, 단순당, 맥아당, 라피노오스, 멜레지토오스, 풀루란, 덱스트린, β-시클로덱스트린 및 덱스트란 중 어느 하나를 1종 또는 2종 이상 사용하는 것을 특징으로 하는 건조물의 제조방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나에 있어서, 당알콜로서, 만니톨, 말티톨, 락티톨, 파라티니트 및 소르비톨 중 어느 하나를 1종 또는 2종 이상 병용하는 것을 특징으로 하는 건조물의 제조방법.
백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액을 건조할 때, 상기 추출액이 건고되기 전에 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 첨가하여 혼합하고, 이것을 건조하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 상기 추출액의 건조물.
백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액을 건조할 때, 상기 추 출액이 건고되기 전에 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 첨가하여 혼합하고, 이것을 건조하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 상기 추출액의 칼리크레인류 물질 생산 저해 활성을 갖는 건조물.
제 9항 또는 제 10항에 있어서, 백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액에 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 첨가하여 혼합하고, 이것을 농축 건조하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 건조물.
제 9항 또는 제 10항에 있어서, 백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액을 농축하고, 상기 추출액이 건고되기 전에 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 첨가하여 혼합하고, 이것을 건조하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 건조물.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 추출액의 농축 건조를 10이하의 pH로 행하는 것을 특징으로 하는 건조물.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 추출액의 농축 건조를 pH 8.5 내지 9.7로 행하는 것을 특징으로 하는 건조물.
제 9항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 당류로서, 포도당, 만노오스, 아라비노오스, 크실로오스, 갈락토오스, 소르보스, 유당, 단순당, 맥아당, 라피노 오스, 멜레지토오스, 풀루란, 덱스트린, β-시클로덱스트린 및 덱스트란 중 어느 하나를 1종 또는 2종 이상 사용하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 건조물.
제 9항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 당알콜로서, 만니톨, 말티톨, 락티톨, 파라티니트 및 소르비톨 중 어느 하나를 1종 또는 2종 이상 사용하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 건조물.
백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액을 농축하고, 상기 추출액이 건고되기 전에 1종 이상의 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 함유하는 부형제를 첨가하여 혼합하고, 이것을 조립 건조하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 상기 추출액의 건조 과립.
백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액을 농축하고, 상기 추출액이 건고되기 전에 1종 이상의 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 함유하는 부형제를 첨가하여 혼합하고, 이것을 조립 건조하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 상기 추출액의 칼리크레인류 물질 생산 저해 활성을 갖는 건조 과립.
백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액을 농축하고, 상기 추출액이 건고되기 전에 1종 이상의 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 함유하는 부형제를 첨가하여 혼합하고, 이것을 조립 건조해서 얻어지는 건조 과립을 이용하여 제조한 것을 특징으로 하는 상기 추출액을 유효성분으로서 함유하는 경구용 고형제제.
백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부 추출액을 농축하고, 상기 추출액이 건고되기 전에 1종 이상의 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 함유하는 부형제를 첨가하여 혼합하고, 이것을 조립 건조하여 얻어지는 건조 과립을 이용하여 제조한 것을 특징으로 하는 상기 추출액을 유효성분으로서 함유하는 칼리크레인류 물질 생산 저해 활성을 갖는 경구용 고형제제.
제 19항 또는 제 20항에 있어서, 정제인 것을 특징으로 하는 경구용 고형제제.
백시니아 바이러스를 접종한 집토끼의 염증 피부 추출액을 농축하고, 상기 추출액이 건고되기 전에 1종 이상의 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 함유하는 부형제를 첨가하여 혼합하고, 이것을 조립 건조하여 얻어지는 건조 과립을 사용하여 제조하는 것을 특징으로 하는 상기 추출액을 유효성분으로서 함유하는 경구용 고형제제의 제조방법.
백시니아 바이러스를 접종한 집토끼의 염증 피부 추출액을 농축하고, 상기 추출액이 건고되기 전에 1종 이상의 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 함유하는 부형제를 첨가하여 혼합하고, 이것을 조립 건조하여 얻어지는 건조 과립을 이용하여 제조하는 것을 특징으로 하는 상기 추출액을 유효성분으로서 함유하는 칼리크레인류 물질 생산 저해 활성을 갖는 경구용 고형제제의 제조방법.
백시니아 바이러스를 접종한 집토끼의 염증 피부 추출액을 농축하고, 상기 추출액이 건고되기 전에 1종 이상의 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 함유하는 부형제를 첨가하여 혼합하고, 이것을 조립 건조하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 건조물.
백시니아 바이러스를 접종한 집토끼의 염증 피부 추출액을 농축하고, 상기 추출액이 건고되기 전에 1종 이상의 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 함유하는 부형제를 첨가하여 혼합하고, 이것을 조립 건조하여 얻어지는 칼리크레인류 물질 생산 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 건조물.
백시니아 바이러스를 접종한 집토끼의 염증 피부 추출액을 농축하고, 상기 추출액이 건고되기 전에 1종 이상의 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 함유하는 부형제를 첨가하여 혼합하고, 이것을 조립 건조하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 건조 과립.
백시니아 바이러스를 접종한 집토끼의 염증 피부 추출액을 농축하고, 상기 추출액이 건고되기 전에 1종 이상의 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 함유하는 부형제를 첨가하여 혼합하고, 이것을 조립 건조하여 얻어지는 칼리크레인류 물질 생산 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 건조 과립.
백시니아 바이러스를 접종한 집토끼의 염증 피부 추출액을 농축하고, 상기 추출액이 건고되기 전에 1종 이상의 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 함유하는 부형제를 첨가하여 혼합하고, 이것을 조립 건조하여 얻어지는 건조 과립을 이용하여 제조한 것을 특징으로 하는 상기 추출액을 유효성분으로 경구용 고형제제.
백시니아 바이러스를 접종한 집토끼의 염증 피부 추출액을 농축하고, 상기 추출액이 건고되기 전에 1종 이상 당류, 당알콜 또는 아스코르빈산을 함유하는 부형제를 첨가하여 혼합하고, 이것을 조립 건조하여 얻어지는 건조 과립을 이용하여 제조하는 것을 특징으로 하는 상기 추출액을 유효성분으로서 함유하는 칼리크레인류 물질 생산 저해 활성을 갖는 경구용 고형제제.