KR20060039003A - 제어된 상 분리에 의해 제조된 작은 구형 입자의 제조방법, 이용 방법 및 조성물 - Google Patents

제어된 상 분리에 의해 제조된 작은 구형 입자의 제조방법, 이용 방법 및 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20060039003A
KR20060039003A KR1020067001079A KR20067001079A KR20060039003A KR 20060039003 A KR20060039003 A KR 20060039003A KR 1020067001079 A KR1020067001079 A KR 1020067001079A KR 20067001079 A KR20067001079 A KR 20067001079A KR 20060039003 A KR20060039003 A KR 20060039003A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
small spherical
particles
spherical particles
insulin
solution
Prior art date
Application number
KR1020067001079A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101137785B1 (ko
Inventor
래리 브라운
존 케이. 맥 기한
쥴리아 라쉬바-스텝
테렌스 엘. 스콧
Original Assignee
백스터 인터내셔널 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 filed Critical 백스터 인터내셔널 인코포레이티드
Publication of KR20060039003A publication Critical patent/KR20060039003A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101137785B1 publication Critical patent/KR101137785B1/ko

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/06—Making microcapsules or microballoons by phase separation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5031—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poly(lactide-co-glycolide)
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2/00—Processes or devices for granulating materials, e.g. fertilisers in general; Rendering particulate materials free flowing in general, e.g. making them hydrophobic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5026—Organic macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyvinyl pyrrolidone, poly(meth)acrylates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Silicon Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 단일 액상의 용액을 제공하여 활성제의 작은 구형 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 단일 액상은 활성제, 상 분리 개선제 및 제1 용매를 포함한다. 상 변화는 용액에서 활성제의 액체-고체 상 분리를 일으키고 고상과 액상을 형성하도록 제어된 속도로 유도된다. 고상은 활성제의 고체의 작은 구형 입자를 포함한다. 액상은 상 분리 개선제 및 용매를 포함한다. 작은 구형 입자는 실질적으로 구형이고 약 0.01 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 크기를 갖는다.
액상, 고상, 상 분리, 활성제, 작은 구형 입자, 용매

Description

제어된 상 분리에 의해 제조된 작은 구형 입자의 제조 방법, 이용 방법 및 조성물{Methods for Fabrication, Uses and Compositions of Small Spherical Particles Prepared by Controlled Phase Separation}
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 본원에 그의 전문이 참고로 포함되고 본원의 일부가 되는, 2003년 7월 18일자로 출원된 미국 가출원 제60/488,712호의 우선권을 주장한다.
정부 지원 연구 또는 개발
적용되지 않음.
본 발명은 활성제의 작은 구형 입자의 제조 방법, 이용 방법 및 조성물에 관한 것이다. 제조 방법에 따라서, 활성제는 용해된 상-분리 개선제(PSEA)를 함유하는 수성 또는 수혼화성 용매에 용해되어 단일 액상 용액을 형성한다. 그후에, 용액은 액체-고체 상 분리되어 활성제를 포함하는 고상 및 PSEA와 용매를 포함하는 액상을 형성한다. 액체-고체 상 분리는 용액의 온도를 시스템의 상 전이 온도 아래로 변화시키는 것과 같은 많은 방식으로 유도될 수 있다. 이 방법은 치료제 필요 대상에게 전달될 수 있는 치료제의 작은 구형 입자를 형성하는데 가장 적합하다. 이 방법은 또한 거대분자, 특히 단백질과 같은 열불안정한 거대분자의 고체인 작은 구형 입자를 형성하는데 가장 적합하다.
과거에 바이오폴리머 나노- 및 마이크로입자의 제조를 위한 몇가지 기술이 사용되어 왔다. 종래의 기술로는 입자 형성을 위한 분무 건조 및 밀링이 있으며, 이를 이용하여 크기가 5 ㎛ 이하인 입자를 생산할 수 있다.
미국 특허 제5,654,010호 및 동 제5,667,808호는 아연과의 착화를 통해 비정질 착물을 형성하고, 다음에 이 착물을 초음파 노즐을 통해 미세화하고 액체 질소 중 분무에 의해 액적 동결시키는, 고체 형태의 재조합 인간 성장 호르몬, hGH 생산을 개시하고 있다. 다음에, 액체 질소는 -80 ℃의 온도에서 증발되고 잔류 재료는 동결 건조된다.
마이크로입자, 미세구 및 마이크로캡슐은 단백질, 합성 폴리머, 다당류 및 그들의 조합을 비롯한 각종 재료로 형성될 수 있는, 1 밀리미터 미만, 더욱 바람직하게는 100 미크론 미만, 가장 바람직하게는 10 미크론 미만의 직경을 갖는 고체 또는 반고체 입자이다. 미세구는 다른 여러 분야, 주로 분리, 진단 및 약물 전달에 사용되어 왔다.
분리 기술에 이용되는 미세구의 가장 잘 알려진 예는 합성 또는 천연 폴리머, 예를 들면 폴리아크릴아미드, 히드록시아파타이트 또는 아가로스로 형성된 것이다. 제어된 약물 전달 분야에서, 분자는 종종 작은 구형 입자 내로 혼입되거나 입자 내에 캡슐화되거나 또는 계속적인 방출을 위해 모노리틱 기질 내로 혼입된다. 상 분리, 용매 증발, 코아세르베이션, 유화 및 분무 건조를 비롯한 많은 다른 기술 들이 합성 폴리머, 천연 폴리머, 단백질 및 다당류로부터 이들 미세구를 제조하는데 통용된다. 일반적으로, 폴리머는 이들 미세구의 지지 구조를 형성하며 당해 약물은 폴리머 구조 내로 혼입된다.
표적 약물을 캡슐화하기 위해 지질을 이용하여 제조한 입자가 현재 통용되고 있다. 리포좀은 단일 또는 다중 인지질 및(또는) 콜레스테롤 이중층으로 구성된 구형 입자이다. 리포좀은 크기가 100 나노미터 이상이며 각종 수용성 또는 지용성 약물을 운반할 수 있다. 예를 들면, 입자를 형성하기 위해 다중 수성 격벽을 둘러싸는 이중층 막 내에 배열된 지질을 이용하여, 미국 특허 제5,422,120호(Sinil Kim)에 기재된 바와 같이 계속적인 전달을 위해 수용성 약물을 캡슐화할 수 있다.
구형 비드는 수년간 생화학자들의 도구로서 상업적으로 이용되어 왔다. 예를 들면, 비드에 접합된 항체는 특정 리간드에 대해 결합 특이성을 갖는 비교적 큰 입자를 형성한다. 항체는 일반적으로 세포 활성화를 위해 세포 표면 상의 수용체에 결합하는데 이용되며, 고체상에 결합되어 면역친화성 정제를 위한 항체-코팅 입자를 형성하고, 치료제를 목적하는 부위에 표적화하기 위해 입자에 접합된 조직 또는 종양 특이적 항체를 이용하여 일정 시간에 걸쳐 서서히 방출되는 치료제를 전달하는데 이용될 수 있다.
특히 약물 전달, 분리 및 진단 분야에 사용하기에 적합할 수 있는 입자의 새로운 제조 방법의 개발이 계속적으로 요망된다. 유용성 관점에서 가장 바람직한 입자는 다음 특징: 좁은 크기 분포, 실질적으로 구형, 실질적으로 활성제 만으로 구성됨, 활성제의 생화학적 완전성 및 생물학적 활성의 유지 특징을 가진 작은 구 형 입자일 것이다. 입자는 코팅에 의해 또는 마이크로캡슐화에 의해 입자의 추가의 안정화를 가능하게 하는 적합한 고체를 제공해야 한다. 또한, 작은 구형 입자의 제조 방법은 다음의 바람직한 특징: 간단한 제작, 본질적으로 수성 방법, 고수율 및 이후의 체질을 필요로 하지 않는 특징을 가질 것이다.
발명의 요약
본 발명은 활성제의 작은 구형 입자의 제조 방법 및 이용 방법에 관한 것이다. 방법에 따라서, 활성제는 용해된 상-분리 개선제를 함유하는 용매에 용해되어 단일 액상 용액을 형성한다. 용매는 바람직하게는 수성 또는 수혼화성 용매이다. 그후에, 용액은 액체-고체 상 분리되어 활성제를 포함하는 고상 및 PSEA와 용매를 포함하는 액상을 형성한다. 액체-고체 상 분리는 용액의 온도를 용액의 상 전이 온도 아래로 변화시키는 것과 같은 많은 방식으로 유도될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 용액을 액체-고체 상 분리시키는 방법은 그 용액을 용액 중의 활성제의 상 전이 온도 아래로 냉각시키는 것이다. 온도는 용액의 비점 이상 또는 그 아래일 수 있다. 빙점이 상 전이 온도 이상인 용액의 경우, 용액은 용액에서의 상 분리가 용액의 동결없이 일어나도록 용액의 빙점을 낮추기 위해 폴리에틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜과 같은 빙점강하제를 포함할 수 있다.
본 발명의 상-분리 개선제는 용액이 상 변화 단계를 거칠 때 용액 중의 활성제의 액체-고체 상 분리를 개선시키거나 유도하여 활성제는 고화되어 불연속상으로서 작은 구형 입자의 현탁액을 형성하는 반면 상-분리 개선제는 연속상에 용해된 채로 남는다. 즉, 상 분리 개선제는 상 변화를 겪지 않지만, 활성제는 상 변화를 겪는다.
본 발명에서 입자의 제조 방법은 또한 형성된 입자의 크기 및 형태를 조절하기 위해 입자의 액체-고체 상 분리를 제어하는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 상-분리 제어 방법은 이온 강도, pH, 상-분리 개선제 농도, 용액 중의 활성제 농도의 조절 또는 용액 온도 변화의 속도 조절을 포함하며, 이들 조절은 상 분리 전 또는 상 분리를 유도하기 위한 이들 중 어느 것 또는 몇가지의 변화 전에 이루어진다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 작은 구형 입자는 입자 형성 후에 연속 상 중의 PSEA로부터 분리된다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 분리 방법은 활성제는 용해되지 않지만 상 분리 개선제는 용해되는 액체 매질로 입자 함유 용액을 세척하는 것이다. 액체 세척 매질은 액체 매질 내의 활성제의 용해도를 감소시키는 제제를 함유할 수 있다. 액체 세척 매질은 또한 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 부형제는 작은 구형 입자를 위한 또는 활성제 또는 운반체 제제를 위한 안정화제로서 작용할 수 있다. 부형제는 또한 입자로부터의 활성제의 제어된 방출 또는 생물 조직을 통한 활성제의 변형된 투과와 같은 추가의 특징을 활성제 또는 입자에 제공할 수 있다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 작은 입자는 PSEA를 포함하지 않지만, 그들은 PSEA 상으로부터의 분리 전에 이후의 가공 단계를 위해 PSEA 상의 존재하에 수확될 수 있다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 용액은 수성 또는 수-혼화성 용매를 포함하 는 수용액이다.
본 발명의 활성제는 바람직하게는 치료제, 진단제, 화장품, 영양 보충제 또는 농약일 수 있는 제약 활성제이다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 활성제는 거대분자, 예를 들면 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산이다. 또다른 실시태양에서, 활성제 함유 입자는 비경구 주사, 국소, 경구, 직장, 비강, 폐, 질, 협측, 설하, 경피, 경점막, 안구, 안내 또는 귀와 같은 적당한 경로에 의해 활성제 필요 대상에게 생체내 전달하는데 적합하다.
도 1은 온도에 대한 활성제 농도를 플롯팅하는 2차원적 상 도표이다.
도 2는 냉각 온도 프로파일이다.
도 3a는 출발 인슐린 물질의 주사 전자 현미경사진(SEM)이다.
도 3b는 인슐린 작은 구형 입자의 SEM이다(실시예 4).
도 4는 작은 구형 입자로 제조될 때 인슐린의 전체적인 화학 안정성 유지를 나타내는 HPLC 분석이다.
도 5a 및 5b는 배치-대-배치 재현성을 입증하는 개략도이다.
도 6은 배치-대-배치 재현성을 입증하는 개략도이다.
도 7은 실시예 3에서의 인슐린 작은 구형 입자의 연속 유통(continuous flow through) 제조 방법의 개략도이다.
도 8은 실시예 3에서의 연속 유통 방법에 의해 생산된 인슐린 작은 구형 입자의 주사 전자 현미경사진(10 Kv 및 6260X 배율)이다.
도 9는 실시예 3에서의 연속 유통 방법에 의해 제조된 용해된 인슐린 작은 구형 입자의 HPLC 크로마토그래프이다.
도 10a-10d는 인슐린 용해도에 대한 염화 나트륨 효과를 입증한다.
도 10e-10h는 인슐린 용해도에 대한 다른 염 효과를 입증한다.
도 10i는 원료 인슐린, 작은 구형 입자로부터 방출된 인슐린 및 작은 구형 입자 내의 인슐린의 라만 스펙트럼이다.
도 11은 실시예 10의 방사표지된 인슐린에 대한 앤더슨 캐스케이드 임팩터(Andersen Cascade Impactor) 결과이다.
도 12는 실시예 8에 대한 P/I 비의 막대 그래프이다.
도 13은 실시예 8로부터 폐의 신티그래프 영상이다.
도 14a는 알파-1-안티트립신(AAT)에 대한 원 이색성(CD) 플롯이다.
도 14b는 실시예 17에서의 실온 저장 시간에 대한 활성의 플롯이다.
도 14c는 실시예 17에서의 4 ℃ 저장 시간에 대한 활성의 플롯이다.
도 15-25b는 DSC 플롯이다.
도 26은 TSI 코포레이션 에어로사이저 입자 크기 데이타의 플롯이다.
도 27은 인간 성장 호르몬(hGH) 작은 구형 입자의 SEM이다.
도 28은 HFA-134a에서의 인슐린 안정성 데이타를 나타내는 챠트이다.
도 29는 3개의 흡입 장치를 이용하여 인슐린의 공기역학적 성능을 비교한 챠트이다.
도 30은 25 ℃에서 저장된 인슐린 출발 물질과 비교한 인슐린 작은 구형 입 자의 안정성 데이타의 챠트이다.
도 31은 37 ℃에서 저장된 인슐린 출발 물질과 비교한 인슐린 작은 구형 입자의 안정성 데이타의 챠트이다.
도 32는 25 ℃에서 저장된 인슐린 출발 물질과 비교한 인슐린 작은 구형 입자의 안정성 데이타의 챠트이다.
도 33은 37 ℃에서 저장된 인슐린 출발 물질과 비교한 인슐린 작은 구형 입자의 안정성 데이타의 챠트이다.
도 34는 25 ℃에서 저장된 인슐린 출발 물질과 비교한 인슐린 작은 구형 입자의 안정성 데이타의 챠트이다.
도 35는 37 ℃에서 저장된 인슐린 출발 물질과 비교한 인슐린 작은 구형 입자의 안정성 데이타의 챠트이다.
도 36은 사이클로할러 DPI를 이용한 인슐린 동역학적 안정성의 막대 그래프이다.
도 37은 DNase 작은 구형 입자의 광 현미경사진이다.
도 38은 DNase의 효소 활성의 챠트이다.
도 39는 SOD 작은 구형 입자의 광 현미경사진이다.
도 40은 SOD 작은 구형 입자에 대한 효소적 데이타의 챠트이다.
도 41A-B는 연속 유화 반응기의 개략도이며, 도 41A는 표면활성 화합물이 유화 전에 연속상 또는 분산상에 첨가될 때 연속 유화 반응기의 개략도이며, 도 41B는 표면활성 화합물이 유화 후에 첨가될 때 연속 유화 반응기의 개략도이다.
도 42는 PLLA 캡슐화된 HSA 입자의 IVR 프로파일에 대한 PEG의 효과를 예시한다(실시예 32).
도 43은 PLGA 캡슐화된 LDS 작은 구형 입자의 IVR 프로파일을 예시한다(실시예 33).
도 44는 PLGA 캡슐화된 인슐린 작은 구형 입자의 IVR 프로파일에 대한 연속상의 pH의 효과를 예시한다(실시예 31).
도 45는 PLGA 캡슐화된 hGH 작은 구형 입자의 IVR 프로파일을 예시한다(실시예 34).
도 46은 캡슐화 INSms에서의 INS 다이머 형성에 대한 마이크로캡슐화 변수(연속상 및 기질 물질의 pH)의 효과를 예시한다(실시예 35).
도 47은 캡슐화 INSms에서의 HMW 종의 형성에 대한 마이크로캡슐화 변수(연속상 및 기질 물질의 pH)의 효과를 예시한다(실시예 35).
도 48은 래트에서 비캡슐화 및 캡슐화된 미리제조된 인슐린 작은 구형 입자로부터의 재조합 인간 인슐린의 생체내 방출을 예시한다(실시예 36).
도 49는 실시예 27의 입자의 SEM이다.
본 발명은 여러 다른 형태의 실시태양을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시태양이 개시되어 있으며, 본 발명의 개시가 본 발명의 원리의 예시로서 고려되어야 하며 본 발명의 광범위한 면을 예시된 실시태양으로 제한하려는 것이 아님을 이해하여야 한다.
본 발명은 활성제의 작은 구형 입자의 제조 방법 및 이용 방법 및 조성물에 관한 것이다. 제조 방법에 따라서, 활성제는 용해된 상 분리 개선제를 함유하는 용매에 용해되어 단일 액체 연속상인 용액을 형성한다. 용매는 바람직하게는 수성 또는 수혼화성 용매이다. 그후에, 용액은 그 용액의 온도를 활성제의 상 전이 온도 아래로 낮춤으로써 상 변화되어, 활성제는 액체-고체 상 분리되어 불연속상을 구성하는 작은 구형 입자의 현탁액을 형성하는 반면 상 분리 개선제는 연속상에 남아있게 된다.
상:
연속상
본 발명의 활성제의 작은 구형 입자의 제조 방법은 제1 용매에 용해된 상 분리 개선제 및 활성제를 갖는 용액을 단일 액상으로 제공하는 것으로 시작된다. 용액은 유기 용매 또는 혼화성 유기 용매 혼합물을 포함하는 유기 시스템일 수 있다. 용액은 또한 수성 매질 또는 수혼화성 유기 용매 또는 수혼화성 유기 용매의 혼합물 또는 그들의 조합을 포함하는 수용액일 수도 있다. 수성 매질은 물, 생리 식염수, 완충 용액, 완충 염수 등일 수 있다. 적합한 수혼화성 유기 용매는 N-메틸-2-피롤리디논(N-메틸-2-피롤리돈), 2-피롤리디논(2-피롤리돈), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논(DMI), 디메틸술폭시드, 디메틸아세트아미드, 아세트산, 락트산, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 3-펜탄올, n-프로판올, 벤질 알콜, 글리세롤, 테트라히드로푸란(THF), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG-4, PEG-8, PEG-9, PEG-12, PEG-14, PEG-16, PEG-120, PEG-75, PEG-150, 폴리에틸렌 글리콜 에스테르, PEG-4 디라우레이트, PEG-20 디라우레이트, PEG-6 이소스테아레이트, PEG-8 팔미토스테아레이트, PEG-150 팔미토스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄, PEG-20 소르비탄 이소스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜 모노알킬 에테르, PEG-3 디메틸 에테르, PEG-4 디메틸 에테르, 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 폴리프로필렌 알기네이트, PPG-10 부탄디올, PPG-10 메틸 글루코스 에테르, PPG-20 메틸 글루코스 에테르, PPG-15 스테아릴 에테르, 프로필렌 글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트, 프로필렌 글리콜 라우레이트 및 글리코푸롤(테트라히드로푸르푸릴 알콜 폴리에틸렌 글리콜 에테르), 알칸, 예를 들면 프로판, 부탄, 펜탄, 헥산, 헵탄, 옥탄, 노난, 데칸 또는 그들의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
단일 연속상은 처음에 제1 용매에 가용성이거나 용매와 혼화성인 상 분리 개선제의 용액을 제공함으로써 제조될 수 있다. 이후에 용액에 활성제를 첨가한다. 활성제는 용액에 직접 첨가되거나, 또는 활성제는 먼저 제2 용매에 용해되고 나중에 용액에 함께 첨가될 수 있다. 제2 용매는 제1 용매와 동일한 용매일 수 있거나, 또는 그것은 상기 나열된 용매들로부터 선택되며 용액과 혼화성인 또다른 용매일 수 있다. 활성제는 상온 또는 그 아래의 온도에서 용액에 첨가되는 것이 바람직하며, 이는 특정 단백질과 같은 열불안정성 분자에 대해 특히 중요하다. "상온"은 약 20 ℃ 내지 약 40 ℃의 실온 주위의 온도를 의미한다. 그러나, 시스템은 또한 가열이 활성제의 상당한 활성 감소를 야기시키지 않는 한 시스템 내의 활성제의 용해도를 증가시키도록 가열될 수 있다.
상 분리 개선제
본 발명의 상 분리 개선제(PSEA)는 용액이 상 변화 단계를 거칠 때 용액으로부터의 활성제의 액체-고체 상 분리를 개선시키거나 유도하여 활성제는 고체 또는 반고체가 되어 불연속상으로서 작은 구형 입자의 현탁액을 형성하는 반면 상-분리 개선제는 연속상에 용해된 채로 남는다. 상 분리 개선제는 용액이 상 분리 조건에 있을 때 활성제의 용해도를 감소시킨다. 적합한 상 분리 개선제는 용액에 가용성이거나 용액과 혼화성인 폴리머 또는 폴리머 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적당한 폴리머의 예는 선형 또는 분지 폴리머를 포함한다. 이들 폴리머는 수용성, 반-수용성, 수혼화성 또는 불용성일 수 있다.
본 발명의 바람직한 형태에서, 상 분리 개선제는 수용성 또는 수혼화성이다. 사용될 수 있는 폴리머 유형은 탄수화물계 폴리머, 폴리지방족 알콜, 폴리(비닐) 폴리머, 폴리아크릴산, 폴리유기산, 폴리아미노산, 코폴리머 및 블록 코폴리머(예를 들면, 플루로닉스 F127 또는 F68과 같은 폴록사머), tert-폴리머, 폴리에테르, 천연 폴리머, 폴리이미드, 계면활성제, 폴리에스테르, 분지 및 시클로-폴리머, 및 폴리알데히드를 포함한다.
바람직한 폴리머는 활성제 입자의 의도된 투여 경로를 위한 제약 첨가제로서 적합한 것이다. 바람직한 폴리머는 제약학상 허용되는 첨가제, 예를 들면 PEG 200, PEG 300, PEG 3350, PEG 8000, PEG 10000, PEG 20000 등과 같은 각종 분자량의 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 플루로닉스 F127 또는 플루로닉스 F68과 같은 폴록사머이다. 또다른 바람직한 폴리머는 폴리비닐피롤리돈(PVP)이다. 또다른 바람직한 폴리머는 히드록시에틸스타치이다. 다른 양친매성 폴리머는 또한 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상 분리 개선제는 또한 프로필렌 글리콜과 에탄올의 혼합물과 같은 비-폴리머일 수 있다.
액체- 고체 상 분리
용액 중 활성제의 액체-고체 상 분리는 온도 변화, 압력 변화, pH 변화, 용액의 이온 강도 변화, 활성제의 농도 변화, 상 분리 개선제의 농도 변화, 용액의 삼투질 농도 변화, 이들의 조합 등과 같은 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 유도될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상 변화는 온도를 용액 중 활성제의 상 전이 온도 아래로 낮춤으로써 온도-유도되는 상 변화이다.
도 1은 용매, PSEA 및 활성제를 함유하는 용액에 대한 2차원적 상 도표(10)이다. 도표는 활성제 농도를 용액의 온도에 대해 플롯팅한다. PSEA의 농도는 일정하게 유지된다.
도표는 포화 곡선(12); 과포화 곡선(14); 그 사이의 준안정 영역(16); 시스템이 균질 단일 액상(모든 성분들이 액상임)인 포화 곡선 아래의 제1 영역(18); 및 시스템이 활성제의 고상 및 PSEA과 용매의 액상을 갖는 2상 시스템인 과포화 곡선 위의 제2 영역(20)을 갖는다. 상 도표는 시스템의 온도 및 순수한 액상 내의 성분의 상대 농도, 액체-고체 상 및 이들 두 상 사이의 전이에 대한 조건을 결정하는데 도움이 된다.
본원에 개시된 바와 같이, 활성제의 작은 구형 입자의 제조는 원리적으로 불포화 용액(점 A')으로부터 냉각시켜 존재할 수 있는 임의의 고상과 용액이 평형인 점 A의 포화에 도달하게 하는 것을 포함한다. 추가의 냉각시에, 용액이 일정 온도에서 평형 용해도에 해당하는 것보다 더 많은 활성제를 함유하는 상태에 도달하며; 따라서 용액은 과포화된다. 고상의 자발적인 형성은 점 B에 도달할 때까지 일어나지 않는다. 점 B는 준안정 대역의 경계위의 점이다. 준안정 대역 폭은 최대 실현가능 과냉 ΔTmax=T2-T1에 의해 또는 과포화 ΔCmax=C*2-C*1에 의해 표시될 수 있다. 이들 두 표시는 열역학적으로 동등하다:
Figure 112006003194883-PCT00001
경로 A'-A-B는 준안정 용액을 제조하는 다중 온도 방법을 나타낸다. 등온 방법에서, 출발점은 A"일 것이다. 일정 온도에서 농도를 증가시킴으로써, 다시 점 A에서 포화가 이루어질 것이다. 점 C로의 농도의 등온 증가(용매 증발에 의해 및(또는) 활성제의 접종/첨가에 의해)는 용액이 준안정성 한계에 다시 도달할 때까지 용액이 준안정 영역으로 이동하도록 할 것이다. 준안정 한계를 넘을 때, 용액은 불안정하게 되고 고상의 자발적인 형성이 즉시 일어난다.
등온식으로 얻어진 값(ΔCmax)T=C*2-C*2는 다중 온도식으로 얻어진 ΔTmax=T3-T2의 상응하는 값과 상이할 수 있다. 준안정 대역의 경계에 가까워질수록, 준안정 한계에 도달할 때까지 고체 입자 형성에 필요한 시간이 줄어든다.
다중 온도 방법에서, 냉각 속도는 입자의 크기 및 형태를 조절하기 위해 제어된 속도로 행해진다. 제어된 속도란 약 0.2 ℃/분 내지 약 50 ℃/분, 더욱 바람직하게는 0.2 ℃/분 내지 30 ℃/분을 의미한다. 변화 속도는 일정 또는 선속도, 비-선속도, 불연속 속도 또는 프로그래밍된 속도(다중 상 주기를 가짐)일 수 있다.
입자는 용액 중의 PSEA로부터 분리되며 아래에 논의된 바와 같이 세척함으로써 정제될 수 있다.
본 발명은 활성제의 농도, PSEA의 농도, 온도 또는 이들의 조합을 조정하여 상 변화를 야기시켜 활성제는 액체 상태에서 고체 상태로 되는 반면 PSEA 및 용매는 상 변화를 겪지 않으며 액체로서 남게 되는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 pH, 이온 강도, 삼투질 농도 등을 변화시켜 상 변화를 개선, 촉진, 조절 또는 억제하는 것을 포함한다. 빙점이 비교적 높거나 빙점이 상 전이 온도 이상인 경우, 용액은 시스템에서의 상 변화가 시스템의 동결없이 일어나도록 시스템의 빙점을 낮추기 위해 폴리프로필렌 글리콜, 수크로스, 에틸렌 글리콜, 알콜(예를 들면, 에탄올, 메탄올)과 같은 빙점강하제 또는 빙점강하제의 수성 혼합물을 포함할 수 있다. 본 방법은 또한 온도가 시스템의 빙점 아래로 감소되도록 수행될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 열불안정성인 분자(예를 들면, 단백질)에 특히 적합하다.
선택적 부형제
본 발명의 입자는 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 부형제는 입자 또는 활성제 또는 운반체 제제의 증가된 안정성, 입자로부터의 활성제의 제어된 방출, 또는 생물 조직을 통한 활성제의 변형된 투과와 같은 추가의 특징을 활성제 또는 입자에 제공할 수 있다. 적합한 부형제는 탄수화물(예를 들면, 트레할로스, 수크로스, 만니톨), 양이온(예를 들면, Zn2 +, Mg2 +, Ca2 +), 음이온(예를 들면, SO4 2 -), 아미노산(예를 들면, 글리신), 지질, 인지질, 지방산, 계면활성제, 트리글리세리드, 담즙산 또는 그들의 염(예를 들면, 콜레이트 또는 그의 염, 예를 들면 소듐 콜레이트; 데옥시콜린산 또는 그의 염), 지방산 에스테르, 및 PSEA로서의 그들의 기능보다 낮은 수준으로 존재하는 폴리머를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 부형제가 사용될 때, 부형제는 용액의 상 도표에 의미있는 영향을 미치지 않는다.
입자의 분리 및 세척
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 작은 구형 입자는 용액 중의 상 분리 개선제로부터 그것을 분리함으로써 수확된다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 분리 방법은 작은 구형 입자를 함유하는 용액을, 활성제는 가용성이 아니고 상 분리 개선제는 가용성인 액상 매질로 세척하는 것이다. 일부 세척 방법은 투석여과 또는 원심분리일 수 있다. 액상 매질은 수성 매질 또는 유기 용매일 수 있다. 낮은 수용해도를 가진 활성제의 경우, 액상 매질은 수성 매질 또는 이가 양이온과 같은, 활성제의 수용해도를 감소시키는 제제를 함유하는 수성 매질일 수 있다. 많은 단백질과 같은, 높은 수용해도를 갖는 활성제의 경우, 황산 암모늄과 같은 단백질 침전제를 함유하는 수성 용매 또는 유기 용매가 사용될 수 있다.
액상 매질로서 사용하기에 적합한 유기 용매의 예는 연속상에 대해 적합한 것으로 상기 명시된 유기 용매를 포함하며, 더욱 바람직한 예로는 염화 메틸렌, 클로로포름, 아세토니트릴, 에틸 아세테이트, 메탄올, 에탄올, 펜탄 등이 있다.
또한, 이들 용매의 혼합물을 사용할 수도 있다. 바람직한 블렌드 중 하나는 염화 메틸렌 또는 염화 메틸렌과 아세톤의 1:1 혼합물이다. 액상 매질은 예를 들어, 동결건조, 증발 또는 건조에 의한 용이한 제거를 위해 낮은 비점을 갖는 것이 바람직하다.
액상 매질은 또한 초임계 유체, 예를 들면 액체 이산화 탄소 또는 그의 초임계점 부근의 유체일 수도 있다. 초임계 유체는 상 분리 개선제, 특히 일부 폴리머에 적합한 용매일 수 있지만, 단백질 입자에 대해서는 용매가 아니다. 초임계 유체는 그 자체만으로 또는 보조용매와 함께 사용될 수 있다. 다음 초임계 유체: 액체 CO2, 에탄 또는 제논일 수 있다. 가능한 보조용매는 아세토니트릴, 디클로로메탄, 에탄올, 메탄올, 물 또는 2-프로판올일 수 있다.
본원에 기재된 PSEA로부터 작은 구형 입자를 분리하는데 사용되는 액상 매질은 액상 매질 내의 활성제의 용해도를 감소시키는 제제를 함유할 수 있다. 입자가 그 입자의 수율을 최대화하기 위해 액상 매질 내에 최소 용해도를 나타내는 것이 가장 바람직하다. 인슐린 및 인간 성장 호르몬과 같은 일부 단백질의 경우, 용해도의 감소는 Zn2 +와 같은 이가 양이온을 단백질에 첨가함으로써 이루어질 수 있다. 착물을 형성하기 위해 사용될 수 있는 다른 이온은 Ca2 +, Cu2 +, Fe2 +, Fe3 + 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
인슐린-Zn 또는 성장 호르몬-Zn 착물의 용해도는 수용액에서 착물을 투석여과시키기에 충분히 낮다.
액상 매질은 또한 이미 논의된 바와 같이 입자 및(또는) 활성제 또는 운반체 제제의 증가된 안정성, 입자로부터의 활성제의 제어된 방출, 또는 생물 조직을 통한 활성제의 변형된 투과와 같은 추가의 특징을 활성제 또는 입자에 제공할 수 있는 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다.
본 발명의 또다른 형태에서, 작은 구형 입자는 PSEA 함유 용액으로부터 분리되지 않는다.
수성 방법
또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 시스템의 제조 방법은 수성 또는 수혼화성 용매를 포함한 수성 시스템을 이용한다. 적합한 수혼화성 용매의 예는 연속상에 대해 상기한 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 수성 방법을 이용하는 하나의 이점은 용액이 완충 처리될 수 있고 단백질과 같은 활성제를 보호하기 위해 생화학적 안정화를 제공하는 부형제를 함유할 수 있다는 점이다.
활성제
본 발명의 활성제는 바람직하게는 치료제, 진단제, 화장품, 영양 보충제 또는 농약일 수 있는 제약 활성제이다.
치료제는 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드 및 핵산을 포함한 생물제제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 단백질은 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 치료제는 저분자량 분자일 수 있다. 또한, 치료제는 예를 들면, 진통제, 마취제, 강장제, 아드레날린제, 아드레날린 차단제, 항아드레날린제, 아드레노코르티코이드, 아드레날린 유사제, 항콜린제, 항콜린 에스테라제, 항경련제, 알킬화제, 알칼로이드, 알로스테릭 저해제, 아나볼릭 스테로이드, 식욕억제제, 제산제, 지사제, 해독제, 항엽산, 해열제, 항류마티스제, 정신병치료제, 신경차단제, 항염증제, 항기생충제, 항부정맥제, 항생물질, 항응고제, 항우울제, 항당뇨병제, 항간질제, 항진균제, 항히스타민제, 항고혈압제, 항무스카린제, 항마이코박테리아제, 항말라리아제, 방부제, 항신생물제, 항원충제, 면역억제제, 면역자극제, 항갑상선제, 항바이러스제, 불안해소 진정제, 수렴제, 베타-아드레날린수용체 차단제, 조영제, 코르티코스테로이드, 기침 완화제, 진단제, 진단용 영상제제, 이뇨제, 도파민제, 지혈제, 혈액작용제, 헤모글로빈 변형제, 호르몬, 최면제, 면역제제, 고지혈증 치료제 및 기타 지질 조절제, 무스카린제, 근육 이완제, 부교감신경작용제, 부갑상선 호르몬, 칼시토닌, 프로스타글란딘, 방사선약물, 진정제, 성 호르몬, 항알레르기약, 자극제, 교감신경작용제, 갑상선 제제, 혈관확장제, 백신, 비타민 및 잔틴을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 공지된 각종 제약제제로부터 선택될 수 있다. 항신생물제 또는 항암제는 파클리탁셀 및 유도체 화합물,및 알칼로이드, 항대사물질, 효소 억제제, 알킬화제 및 항생물질로 이루어진 군에서 선택된 기타 항신생물제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
화장품 제제는 화장품 작용을 할 수 있는 임의의 활성 성분이다. 이들 활성 성분의 예는 특히, 연화제, 습윤제, 유리 라디칼 억제제, 항염증제, 비타민, 탈색소제, 항여드름제, 항지루제, 각질용해제, 슬리밍제, 피부 착색제 및 자외선차단제, 특히 리놀렌산, 레티놀, 레틴산, 아스코르브산 알킬 에스테르, 다중불포화 지방산, 니코틴산 에스테르, 토코페롤 니코티네이트, 벼, 대두 또는 쉬어(shea)의 불검화물, 세라마이드, 히드록시산, 예를 들면 글리콜산, 셀레늄 유도체, 항산화제, 베타-카로틴, 감마-오리자놀 및 스테아릴 글리세레이트일 수 있다. 화장품은 시판되고(되거나) 당업계에 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 실시에 이용되는 영양 보충제의 예는 단백질, 탄수화물, 수용성 비타민(예를 들면, 비타민 C, B-착물 비타민 등), 지용성 비타민(예를 들면, 비타민 A, D, E, K 등) 및 허브 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 영양 보충제는 시판되고(되거나) 당업계에 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다.
농약이란 용어는 제초제, 살충제, 살비제, 살선충제, 외부구충제 및 살진균제를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명에서 농약이 속할 수 있는 화합물류의 예로는 우레아, 트리아진, 트리아졸, 카르바메이트, 인산 에스테르, 디니트로아닐린, 모르폴린, 아실알라닌, 피르에트로이드, 벤질산 에스테르, 디페닐에테르 및 다환식 할로겐화 탄화수소가 있다. 이들 각 화합물류의 농약의 특정 예는 문헌 [Pesticide Manual, 9th Edition, British Crop Protection Council]에 나열되어 있다. 농약은 시판되고(되거나) 당업계에 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 활성제는 거대분자, 예를 들면 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 또는 핵산이다. 핵산은 DNA, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압티머, RNA 및 SiRNA를 포함한다. 거대분자는 천연 또는 합성일 수 있다. 단백질은 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 단백질은 또한 천연원으로부터 분리된 임의의 공지된 치료 단백질이거나 또는 합성 또는 재조합 방법에 의해 생산될 수 있다. 치료 단백질의 예로는 혈액응고 기전의 단백질(예를 들면, 팩터 VII, 팩터 VIII, 팩터 IX 등), 서브틸리신, 오브알부민, 알파-1-안티트립신(AAT), DNase, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 리소자임, 리보뉴클레아제, 히아루로니다제, 콜라게나제, 성장 호르몬, 에리트로포에틴, 인슐린유사 성장 인자 또는 그들의 유사체, 인터페론, 글라티라머, 과립세포-대식세포 집락형성 촉진 인자, 과립세포 집락형성 촉진 인자, 항체, PEG화 단백질, 당화 또는 초당화 단백질, 데스모프레신, LHRH 작용제, 예를 들면 류프롤리드, 고세렐린, 나파렐린, 부세렐린, LHRH 길항제, 바소프레신, 시클로스포린, 칼시토닌, 부갑상선 호르몬, 부갑상선 호르몬 펩티드 및 인슐린을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 치료 단백질은 인슐린, 알파-1 안티트립신, LHRH 작용제 및 성장 호르몬이다.
저분자량 치료 분자의 예로는 스테로이드, 베타-작용제, 항미생물제, 항진균제, 탁산(항유사분열제 및 항마이크로튜블제), 아미노산, 지방족 화합물, 방향족 화합물 및 우레아 화합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 실시태양에서, 활성제는 폐 질환의 치료를 위한 치료제이다. 그러한 제제의 예는 스테로이드, 베타-작용제, 항진균제, 항미생물 화합물, 기관제 확장제, 항천식약, 비-스테로이드성 항염증제(NSAIDS), 알파-1-안티트립신 및 낭포성 섬유증 치료제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 스테로이드의 예로는 베클로메타손(베클로메타손 디프로피오네이트 포함), 플루티카손(플루티카손 프로피오네이트 포함), 부데소니드, 에스트라디올, 플루드로코르티손, 플루시노니드, 트리암시놀론(트리암시놀론 아세토니드 포함) 및 플루니솔리드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 베타-작용제의 예로는 살메테롤 시나포에이트, 포르모테롤 푸마레이트, 레보-알부테롤, 밤부테롤 및 툴로부테롤을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
항진균제의 예는 이트라코나졸, 플루코나졸 및 암포테리신 B를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
진단제는 x-선 영상화제 및 조영제를 포함한다. x-선 영상화제의 예로는 디아트라조산의 에틸 에스테르(EEDA)로서 알려지기도 한 WIN-8883(에틸 3,5-디아세트아미도-2,4,6-트리요오도벤조에이트), WIN 67722, 즉 (6-에톡시-6-옥소헥실-3,5-비스(아세트아미도)-2,4,6-트리요오도벤조에이트; 에틸-2-(3,5-비스(아세트아미도)-2,4,6-트리요오도벤조일옥시)부티레이트(WIN 16318); 에틸 디아트리족시아세테이트(WIN 12901); 에틸 2-(3,5-비스(아세트아미도)-2,4,6-트리요오도벤조일옥시)프로피오네이트(WIN 16923); N-에틸 2-(3,5-비스(아세트아미도)-2,4,6-트리요오도벤조일옥시 아세트아미드(WIN 65312); 이소프로필 2-(3,5-비스(아세트아미도)-2,4,6-트리요오도벤조일옥시) 아세트아미드(WIN 12855); 디에틸 2-(3,5-비스(아세트아미도)-2,4,6-트리요오도벤조일옥시 말로네이트(WIN 67721); 에틸 2-(3,5-비스(아세트아미도)-2,4,6-트리요오도벤조일옥시) 페닐아세테이트(WIN 67585); 프로판디온산, [[3,5-비스(아세틸아미노)-2,4,5-트리요오도벤조일]옥시]비스(1-메틸)에스테르(WIN 68165); 및 벤조산, 3,5-비스(아세틸아미노)-2,4,6-트리요오도-4-(에틸-3-에톡시-2-부테노에이트) 에스테르(WIN 68209)를 포함한다. 바람직한 조영제는 생리학적 조건하에서 비교적 신속하게 붕해되어, 임의의 입자 관련된 염증 반응을 최소화한다. 붕해는 효소적 가수분해, 생리학적 pH에서 카르복실산의 가용화 또는 다른 기전으로부터 야기될 수 있다. 따라서, WIN 67721, WIN 12901, WIN 68165 및 WIN 68209와 같은 가수분해적으로 불안정한 요오드화 종과, 요오디파미드, 디아트리조산 및 메트리조산과 같은 난용성 요오드화 카르복실산이 바람직할 수 있다.
예를 들어, 스테로이드 및 베타-작용제, 예를 들면 플루티카손 프로피오네이트 및 살메테롤, 부데소니드 및 포르메테롤 등의 조합을 포함한 활성제의 많은 조합이 바람직할 수 있다.
탄수화물의 예로는 덱스트란, 헤타스타치, 시클로덱스트린, 알기네이트, 키토산, 콘드로이틴, 헤파린 등이 있다.
작은 구형 입자
본 발명의 입자 및 작은 구형 입자는 동적 광산란법(예를 들면, 광자상관 분광법, 레이저 회절, 낮은 각도의 레이저 광산란(LALLS), 중간 각도의 레이저 광산란(MALLS))에 의해, 광 감쇄 방법(예를 들면, 코울터 분석법)에 의해, 또는 레올로지 또는 현미경(광 또는 전자)과 같은 기타 방법에 의해 측정되는 바와 같이, 바람직하게는 약 0.01 ㎛ 내지 약 200 ㎛, 더욱 바람직하게는 0.1 ㎛ 내지 10 ㎛, 더욱 더 바람직하게는 약 0.5 ㎛ 내지 약 5 ㎛, 가장 바람직하게는 약 0.5 ㎛ 내지 약 3 ㎛의 평균 기하 입자 크기를 갖는다. 폐 전달을 위한 입자는 비행 시간 측정(예를 들면, 에어로졸라이저) 또는 앤더슨 캐스케이드 임팩터(Andersen Cascade Impactor) 측정에 의해 결정된 공기역학적 입자 크기를 가질 것이다.
작은 구형 입자는 실질적으로 구형이다. "실질적으로 구형"이란 의미는 입자 단면의 최장 대 최단 수직축 길이의 비가 약 1.5 이하인 것을 의미한다. 실질적으로 구형은 대칭 중심선을 필요로 하지 않는다. 또한, 입자들은 입자의 전체 크기에 비해 규모가 작은 선 또는 톱니모양 또는 융기와 같은 표면 텍스쳐를 가질 수 있으며 여전히 실질적으로 구형일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 입자의 최장 축과 최단 축 사이의 길이의 비는 약 1.33 이하이다. 가장 바람직하게는, 입자의 최장 축과 최단 축 사이의 길이의 비는 약 1.25 이하이다. 표면 접촉은 저장 시에 입자의 불필요한 응집을 최소화하는, 실질적으로 구형인 미세구에서 최소이다. 많은 결정 또는 플레이크는 이온성 또는 비이온성 상호작용에 의해 응집이 일어날 수 있는 큰 표면 접촉 면을 형성할 수 있는 편평한 표면을 갖는다. 구는 훨씬 더 작은 면에 걸쳐 접촉한다.
입자는 또한 바람직하게는 실질적으로 동일한 입자 크기를 갖는다. 상대적으로 크고 작은 입자 둘다가 존재하는 광범위한 크기 분포를 갖는 입자는 더 큰 입자들 사이의 간격 내에 더 작은 입자가 채워지도록 함으로써 새로운 접촉 표면이 생기게 된다. 광범위한 크기 분포를 갖는 경우에는 응집 결합을 위한 많은 접촉 기회가 생김으로써 더 큰 구가 형성될 수 있다. 본 발명은 좁은 크기 분포를 가진 구형 입자를 형성함으로써, 접촉 응집 기회를 최소화한다. "좁은 크기 분포"란 의미에서, 바람직한 입자 크기 분포는 작은 구형 입자의 90분위의 체적 직경 대 10분위의 체적 직경의 비가 5 이하인 것이다. 더욱 바람직하게는, 입자 크기 분포는 작은 구형 입자의 90분위의 체적 직경 대 10분위의 체적 직경의 비가 3 이하인 것이다. 가장 바람직하게는, 입자 크기 분포는 작은 구형 입자의 90분위의 체적 직경 대 10분위의 체적 직경의 비가 2 이하인 것이다.
또한, 기하 표준 편차(GSD)를 이용하여 좁은 크기 분포를 나타낼 수 있다. GSD 계산은 15.9% 및 84.1%의 백분율 미만의 누적으로 유효 절단 직경(ECD)을 결정하는 것을 포함한다. GSD는 84.17% 미만의 ECD 대 15.9% 미만의 ECD 비의 제곱근과 동일하다. GSD는 GSD<2.5, 더욱 바람직하게는 1.8 미만일 때 좁은 크기 분포를 갖는다.
본 발명의 바람직한 형태에서, 작은 구형 입자 내의 활성제는 반-결정질 또는 비-결정질이다.
전형적으로, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 작은 구형 입자는 실질적으로 비-다공질이며 0.5 g/㎤ 초과, 더욱 바람직하게는 0.75 g/㎤ 초과, 가장 바람직하게는 약 0.85 g/㎤ 초과의 밀도를 갖는다. 바람직한 밀도 범위는 약 0.5 내지 약 2 g/㎤, 더욱 바람직하게는 약 0.75 내지 약 1.75 g/㎤, 더욱 더 바람직하게는 약 0.85 내지 약 1.5 g/㎤이다.
본 발명의 입자는 고함량의 활성제를 나타낼 수 있다. 입자를 제조하는 많은 다른 방법에 의해 요구되는 상당량의 팽화제 또는 유사한 부형제를 필요로 하지 않는다. 예를 들면, 인슐린 작은 구형 입자는 입자의 95 중량% 이상을 구성한다. 그러나, 팽화제 또는 부형제가 입자 내에 포함될 수도 있다. 바람직하게는, 활성제는 입자의 약 0.1 내지 95 중량% 초과, 더욱 바람직하게는 약 30 내지 약 100 중량%, 더욱 더 바람직하게는 약 50 내지 약 100 중량%, 더욱 더 바람직하게는 약 75 내지 약 100 중량%, 가장 바람직하게는 90 중량%를 초과하는 양으로 존재한다. 본원에서 범위를 명시할 때, 그 안의 임의의 범위 또는 범위들의 조합을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 또다른 면은 작은 구형 입자가 부형제를 포함하거나 포함하지 않고 활성제의 생화학적 완전성 및 생물학적 활성을 유지하는 것이다.
입자의 생체내 전달
본 발명에서 활성제를 함유하는 입자는 활성제 필요 대상에게 적합한 경로, 예를 들면 주사, 국소, 경구, 직장, 비강, 폐, 질, 협측, 설하, 경피, 경점막, 귀, 안내 또는 안구와 같은 적당한 경로에 의해 생체내 전달하는데 적합하다. 입자는 안정한 액체 현탁액으로서 전달되거나 또는 정제, 캐플렛, 캡슐 등과 같은 고체 투여 형태로서 제제화될 수 있다. 바람직한 전달 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 지주막하, 경막외, 동맥내, 관절내 경로 등을 포함하는 주사용이다. 또다른 바람직한 전달 경로는 폐 흡입이다. 이러한 전달 경로에서, 입자는 심부 폐에, 상기도 내에 또는 기도 내의 어느 곳에나 침착될 수 있다. 입자는 건조 분말 흡입기에 의해 건조 분말로서 전달되거나 또는 정량식 분무 흡입기 또는 연무기에 의해 전달될 수 있다.
인슐린과 같은 전신 기능 약물은 바람직하게는 혈류 내 흡수에 이용가능한 표면적이 아주 큰 폐포 내에 침착된다. 약물 침착이 폐 내의 특정 영역으로 표적화될 때, 입자의 공기역학적 직경은 형태, 밀도 및 입자 크기와 같은 입자의 기본적인 물리적 특징을 조정함으로써 최적 범위로 조정될 수 있다.
흡입 약물 입자의 적합한 호흡성 분율은 부형제를 입자 조성물에 혼입 상태로 또는 약물 입자와의 혼합물로서 제제에 첨가함으로써 얻어진다. 예를 들면, 미세화된 약물 입자(약 5 ㎛)의 분산을 개선시키기 위해서 트레할로스, 락토스 또는 말토덱스트린과 같은 불활성 담체 입자 중 더 큰(30-90 ㎛) 입자와 혼합한다. 더 큰 부형제 입자는 개선된 약물동력학적 효과와 상관있는 분말 유동 특성을 개선시킨다. 또다른 면에서, 작은 구형 입자 내로 직접 혼입된 부형제는 단백질 약물의 안정성을 잠재적으로 개선시킬 뿐만 아니라 에어로졸 성능을 얻게 한다. 일반적으로, 이미 흡입용으로 FDA 승인된 부형제, 예를 들면 락토스, 또는 폐에 대해 내인성인 유기 분자, 예를 들면 알부민 및 DL-α-포스파티딜콜린 디팔미토일(DPPC)이 선택된다. 목적하는 물리적 및 화학적 특징을 가진 입자를 가공하기 위해 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA)과 같은 기타 부형제가 이용되어 왔다. 그러나, FDA 승인된 부형제에 의한 많은 흡입 사례는 바람직하게는 기관기관지 부분에 침착되고 심부 폐에는 두드러지게 침투되지 않는 큰 공기역학적 입자 크기를 갖는 천식 약물에 의해 이루어졌다. 심부 폐로 전달되는 흡입 단백질 또는 펩티드 치료제의 경우, 면역 반응에 기인하거나 그들이 폐포 부분에 전달될 때 부형제에 의해 야기될 수 있는 염증 및 자극과 같은 바람직하지 않은 장기간의 부작용이 일어날 수 있다는 것이 염려된다.
심부 폐로 흡입된 치료제의 잠재적으로 유해한 부작용을 최소화하기 위해, 실질적으로 전달될 약물로 구성되는 흡입가능한 입자를 제조하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 방법은 부형제에 대한 폐포 노출을 최소화하며 각 용량에 의해 폐포 표면 상에 침착되는 입자의 전체 용량을 감소시켜 흡입된 치료제의 만성 사용 중의 자극을 최소화할 수 있게 된다. 본질적으로 전체적으로 치료 단백질 또는 펩티드로 이루어지는, 심부 폐의 침착에 적합한 공기역학적 특성을 가진 작은 구형 입자는 폐의 폐포 막에 대한 만성 치료제 투여 효과에 대한 단독의 연구에 특히 유용하다. 흡입에 의한 작은 구형 입자 형태의 단백질 또는 펩티드의 전신 전달 효과는 결합된 부형제에 의해 도입되는 복합 인자없이 연구될 수 있다.
흡입에 의해 입자를 심부 폐로 전달하기 위한 요건은 입자가 0.5-10 ㎛의 작은 평균 공기역학적 직경 및 좁은 크기 분포를 갖는 것이다. 본 발명은 또한 다른 입자 크기 범위를 갖는 입자의 각종 배치를 함께 혼합하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 상기 특징을 가진 작은 구형 입자의 제조를 가능하게 한다.
0.5 내지 3 ㎛의 공기역학적 직경을 가진 입자를 형성하기 위한 2가지 근본적인 방법이 있다. 첫번째 방법은 비교적 크지만 아주 다공성인(또는 천공된) 마이크로입자를 생산하는 것이다. 공기역학적 직경(D공기역학적)과 기하학적 직경(D기하학적) 사이의 관계가, D공기역학적이 D기하학적에 입자의 밀도의 제곱근을 곱한 것과 같으므로, 아주 작은 질량 밀도(약 0.1 g/㎤)를 갖는 경우, 상대적으로 높은 기하학적 직경(5 내지 10 ㎛)을 가지면서 작은 공기역학적 직경(0.5 내지 3 ㎛)을 나타낼 수 있다.
대안적 방법은 비교적 낮은 다공성을 가진 입자를 생산하는 것이며, 본 발명의 경우에서 입자는 상기 범위로 정해진 밀도, 더욱 일반적으로는 1 g/㎤에 가까운 밀도를 갖는다. 따라서, 그러한 비-다공성인 조밀한 입자의 공기역학적 직경은 그들의 기하학적 직경에 가깝다.
상기 설명한 본 발명의 입자 형성 방법은 부형제를 사용하거나 사용하지 않고 입자를 형성한다.
첨가제없이 단백질 자체로부터 단백질 작은 구형 입자의 제조는, 더 큰 약물 부하량에 대한 선택권을 제공하고, 안전성을 증가시키고 필요한 흡입 횟수를 감소시키므로 폐 전달 이용시에 탁월한 이점을 제공한다.
미리제조된 작은 구형 입자의 마이크로캡슐화
본 발명의 작은 구형 입자 또는 다른 방법으로부터 제조된 작은 입자(마이크로입자, 미세구, 나노구, 나노입자 등을 포함)는 마이크로캡슐화 입자를 형성하기 위해 벽-형성 물질의 기질 내에 더 캡슐화될 수 있다. 마이크로캡슐화는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 실시될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 작은 구형 입자 또는 임의의 다른 작은 입자의 마이크로캡슐화는 아래에 기재된 바와 같은 유화/용매 추출 방법에 의해 이루어진다. 기질은 활성제에 지속 방출 특성을 부여하여 목적하는 치료 용도에 따라서 방출 속도가 수분 내지 수시간, 수일 또는 수주 동안 지속되게 한다. 마이크로캡슐화 입자는 또한 미리제조된 작은 구형 입자의 지연 방출 제제를 생산할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 미리-제작된 작은 구형 입자는 거대분자의 입자이다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 거대분자는 단백질 또는 폴리펩티드이다.
유화/용매 추출 방법에서, 2개의 혼화성 상, 연속상 및 불연속상(분산상으로도 알려짐)을 혼합하여 유탁액을 형성함으로써 유화가 이루어진다. 바람직한 실시태양에서, 수중유(O/W) 유탁액을 형성하기 위한 연속상은 수성상(또는 수상)이고 불연속상은 유기상(또는 오일상)이다. 불연속상은 유중고체(S/O) 상을 형성하는 미세 현탁액으로서 또는 미세 분산액으로서 존재하는 고체 입자의 분산액을 더 포함할 수 있다. 유기상은 바람직하게는 수불혼화성 또는 부분 수혼화성 유기 용매이다. 유기상 대 수성상의 중량비는 약 1:99 내지 약 99:1, 더욱 바람직하게는 1:99 내지 약 40:60, 가장 바람직하게는 약 2:98 내지 약 1:3, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 범위들의 조합이다. 바람직한 실시태양에서, 유기상 대 수성상의 비는 약 1:3이다. 본 발명은 또한 오일상이 연속상을 형성하고 수상이 불연속상을 형성하는 역 유탁액 또는 유중수 유탁액(W/O)을 이용하는 것을 더 포함한다. 본 발명은 유중수중유 유탁액(O/W/O) 또는 수중유중수 유탁액(W/O/W)과 같은 2개를 넘는 상을 갖는 유탁액을 이용하는 것을 더 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 유화/용매 추출 방법을 이용하는 마이크로캡슐화 방법은 이전에 설명한 방법에 의해 미리제조된 작은 구형 입자 및 벽-형성 물질을 함유하는 유기상을 제조하는 것으로 시작된다. 미리제조된 작은 구형 입자는 벽-형성 물질의 유기상 내에 분산되어 오일 상 중에 미리제조된 작은 구형 입자의 분산액을 함유하는 유중고체(S/O) 상을 형성한다. 바람직한 실시태양에서, 분산액은 작은 구형 입자와 유기상의 혼합물을 균질화함으로써 얻어진다. 수성 매질은 연속상을 형성할 것이다. 이 경우에, S/O 상을 수성상으로 유화함으로써 형성되는 유탁액 시스템은 수중유중고체(S/O/W) 유탁액 시스템이다.
벽-형성 물질은 개개로 또는 조합하여 기질의 구조적 개체를 형성할 수 있는 재료를 의미한다. 생분해성 벽-형성 물질은 특히 주사 용도에 바람직하다. 그러한 물질의 예는 폴리-락티드/폴리-글리콜리드 폴리머(PLGA's), 폴리에틸렌 글리콜 접합된 PLGA's(PLGA-PEG's) 및 트리글리세리드류를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. PLGA 또는 PLGA-PEG를 이용하는 실시태양에서, PLGA는 바람직하게는 100:0 내지 0:100, 더욱 바람직하게는 약 90:10 내지 약 15:85, 가장 바람직하게는 약 50:50의 폴리-락티드 대 폴리-글리콜리드 비를 갖는다. 일반적으로, 폴리머 내의 폴리-글리콜리드 대 폴리-락티드 비가 높을수록, 마이크로캡슐화 입자는 더욱 친수성이 되어 수화 및 분해가 더 빨라지게 된다. 각종 분자량의 PLGA가 또한 이용될 수 있다. 일반적으로, 폴리머 내의 폴리-글리콜리드 대 폴리-락티드 비가 동일한 경우, PLGA의 분자량이 높을수록 활성제의 방출이 느려지고 마이크로캡슐화 입자의 크기 분포가 더 넓어진다.
수중유(O/W) 또는 수중유중고체(S/O/W) 유탁액의 유기상(오일상)의 유기 용매는 수불혼화성 또는 부분 수불혼화성일 수 있다. 용어 "수불혼화성 용매"는 수용액과 1:1 비(O/W)로 배합될 때 계면 메니스커스를 형성하는 용매를 의미한다. 적당한 수불혼화성 용매는 탄소수 5 이상의 치환 또는 비치환, 선형, 분지 또는 환식 알칸, 탄소수 5 이상의 치환 또는 비치환, 선형, 분지 또는 환식 알켄, 탄소수 5 이상의 치환 또는 비치환, 선형, 분지 또는 환식 알킨, 방향족 탄화수소, 완전 또는 부분 할로겐화 탄화수소, 에테르, 에스테르, 케톤, 모노-, 디- 또는 트리-글리세리드, 천연 오일, 알콜, 알데히드, 산, 아민, 선형 또는 환식 실리콘, 헥사메틸디실록산 또는 이들 용매의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 할로겐화 용매는 사염화 탄소, 염화 메틸렌, 클로로포름, 테트라클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 트리클로로에탄, 히드로플루오로카본, 염소화 벤젠(모노, 디, 트리), 트리클로로플루오로메탄을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 적당한 용매는 염화 메틸렌, 클로로포름, 디에틸 에테르, 톨루엔, 자일렌 및 에틸 아세테이트이다. "부분 수혼화성 용매"는 한 농도에서 수불혼화성이고 더 낮은 다른 농도에서 수혼화성인 용매를 의미한다. 이들 용매는 제한된 수혼화성을 가지며 자발적으로 유탁액을 형성할 수 있다. 부분 수혼화성 용매의 예는 테트라히드로푸란(THF), 프로필렌 카보네이트, 벤질 알콜 및 에틸 아세테이트이다.
표면활성 화합물은 예를 들면, 유기상의 습윤 특성을 증가시키기 위해 첨가될 수 있다. 표면활성 화합물은 유화 과정 전에 수성상에, 유기상에, 수성 매질과 유기 용액 둘다에, 또는 유화 과정 후에 유탁액에 첨가될 수 있다. 표면활성 화합물을 이용하여 캡슐화되지 않은 또는 부분 캡슐화된 작은 구형 입자의 수를 감소시켜 방출 중 활성제의 초기 파열을 감소시킬 수 있다. 표면활성 화합물은 화합물의 용해도에 따라서 유기상에, 수성상에, 또는 유기상과 수성상 둘다에 첨가될 수 있다.
용어 "표면활성 화합물"은 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 또는 생물 표면활성 분자와 같은 화합물을 의미한다. 표면활성 화합물은 수성상 또는 유기상 또는 유탁액 중량 기준으로 일정량으로 존재해야 하며, 그 경우 약 0.01% 미만 내지 약 30%, 더욱 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 10%, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 범위들의 조합일 수 있다.
적합한 음이온성 계면활성제는 포타슘 라우레이트, 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 도데실설페이트, 알킬 폴리옥시에틸렌 설페이트, 소듐 알기네이트, 디옥틸 소듐 술포숙시네이트, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 이노신, 포스파티딜 세린, 포스파티딘산 및 그들의 염, 글리세릴 에스테르, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 콜린산 및 기타 담즙산(예를 들면, 콜린산, 데옥시콜린산, 글리코콜린산, 타우로콜린산, 글리코데옥시콜린산) 및 그들의 염(예를 들면, 소듐 데옥시콜레이트 등)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
적당한 양이온성 계면활성제는 4차 암모늄 화합물, 예를 들면 벤잘코늄 클로라이드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 라우릴디메틸벤질암모늄 클로라이드, 아실 카르니틴 히드로클로라이드, 또는 알킬 피리디늄 할라이드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 음이온성 계면활성제로서, 인지질이 사용될 수 있다. 적당한 인지질의 예로는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딘산, 리소포스포리피드, 계란 또는 대두 인지질 또는 그들의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 인지질은 가염 또는 탈염되거나, 수소화 또는 부분 수소화되거나, 또는 천연, 반합성 또는 합성일 수 있다.
적당한 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에테르(Macrogol 및 Brij), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(Polysorbates), 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르(Myrj), 소르비탄 에스테르(Span), 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 세틸 알콜, 세토스테아릴 알콜, 스테아릴 알콜, 아릴 알킬 폴리에테르 알콜, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머(poloxomers), 폴락사민, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈 및 다당류(전분 및 전분 유도체, 예를 들면 히드록시에틸전분(HES), 메틸셀룰로스, 히드록시셀룰로스, 히드록시 프로필셀룰로스, 히드록시 프로필메틸셀룰로스 및 비결정질 셀룰로스)를 포함한다. 본 발명의 바람직한 형태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시프로필렌 코폴리머이며, 바람직하게는 프로필렌 글리콜과 에틸렌 글리콜의 블록 코폴리머이다. 그러한 폴리머는 때로는 플루로닉(PLURONIC)®으로 불리우기도 하는 상품명 POLOXAMER로 판매되며, 스펙트럼 케미칼 앤 루거(Spectrum Chemical and Ruger)를 포함한 몇개의 공급처에 의해 판매된다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 중에는 단쇄 알킬을 갖는 것이 포함된다. 그러한 계면활성제의 일례는 바스프 악티엔게젤샤프트에 의해 제조되는 폴리에틸렌-660-히드록시스테아레이트인 SOLUTOL® HS 15이다.
표면활성 생물 분자는 알부민, 카제인, 헤파린, 히루딘, 헤타스타치 또는 기타 적절한 생체적합 제제와 같은 분자를 포함한다.
본 발명의 바람직한 형태에서, 수성상은 표면활성 화합물로서 단백질을 포함한다. 바람직한 단백질은 알부민이다. 단백질은 또한 부형제로서 기능할 수 있다. 단백질이 표면활성 화합물이 아닌 실시태양에서, 다른 부형제는 유화 과정 전에 또는 후에 첨가되어 유탁액에 포함될 수 있다. 적당한 부형제는 당류, 이당류 및 당 알콜을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 이당류는 수크로스이며, 바람직한 당 알콜은 만니톨이다.
또한, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 채널링제를 사용하여 최종 제품의 투수 속도를 증가시킬 수 있으며, 그 결과 기질로부터 활성제의 초기 방출 역학 뿐만 아니라 수화 속도 변형에 의한 기질의 분해 속도 및 분해 의존성 방출 역학이 변형된다. 캡슐화 중 채널링제로서의 PEG 사용은 PEG가 상 분리 개선제로서 사용되는 작은 구형 입자의 제조 중 세척 과정을 없애는 면에서 유리할 수 있다. 또한, 완충제 사용을 통한 연속상의 pH 변화는 입자 표면과 유기상 사이의 습윤 과정을 상당히 증가시킬 수 있으며, 그 결과 마이크로캡슐화 입자의 기질로부터 캡슐화된 치료제의 초기 파열이 상당히 감소된다. 연속상의 특성은 NaCl과 같은 염을 첨가하여 그의 염도를 증가시킴으로써 두 상의 혼화성이 감소되도록 변형될 수 있다.
유기상(오일상) 내에 작은 구형 입자를 분산시킨 후에, 수성 매질(수상)의 연속상을 예를 들어, 균질화 또는 음파 처리에 의해 유기상의 불연속상과 격렬하게 혼합하여 초기 마이크로캡슐화 입자의 유화된 액적을 함유하는 유탁액을 형성한다. 유화된 액적으로부터 유기 용매의 신속한 추출을 최소화하기 위해 수성상과 유기상의 혼합 전에 연속 수성상을 유기상에 이용되는 유기 용매로 포화시킬 수 있다. 유화 과정은 혼합물이 그의 액체 특성을 유지하는 임의의 온도에서 수행될 수 있다. 유탁액 안정성은 유기상 또는 수성상 내의 표면활성 화합물의 농도, 또는 표면활성 화합물이 유화 과정 후에 유탁액에 첨가된다면 유탁액 내의 표면활성 화합물의 농도의 함수이다. 이는 유탁 시스템(초기 마이크로캡슐화 입자)의 액적 크기 및 마이크로캡슐화 입자의 크기 및 크기 분포를 결정하는 인자 중의 하나이다. 마이크로캡슐화 입자의 크기 분포에 영향을 미치는 다른 인자는 연속상의 점도, 불연속상의 점도, 유화 중의 전단력, 표면활성 화합물의 유형 및 농도, 및 오일/물 비이다.
유화 후에, 유탁액은 경화 매질 내로 전달된다. 경화 매질은 초기 마이크로캡슐화 입자로부터 불연속상 내의 용매를 추출하여 유화된 액적 부근 내의 미리제조된 작은 구형 입자 주위에 고체 폴리머 기질을 갖는 고체 마이크로캡슐화 입자가 형성된다. O/W 또는 S/O/W 시스템의 실시태양에서, 경화 매질은 수성 매질이며, 그것은 표면활성 화합물, 또는 증점제 또는 기타 부형제를 함유할 수 있다. 마이크로캡슐화 입자는 바람직하게는 구형이며 약 0.6 내지 약 300 ㎛, 더욱 바람직하게는 약 0.8 내지 약 60 ㎛의 입자 크기를 갖는다. 추가로, 마이크로캡슐화 입자는 바람직하게는 좁은 입자 크기 분포를 갖는다. 불연속상의 추출 시간을 줄이기 위해, 경화 매질에 열 또는 감압을 가할 수 있다. 불연속상의, 예를 들면 증발(비등 효과)에 의한 신속한 제거가 기질의 연속성 파괴의 원인이 되므로 초기 마이크로캡슐화 입자로부터 불연속상의 추출 속도는 최종 고체 마이크로캡슐화 입자 내의 다공도에서 중요한 인자이다.
바람직한 실시태양에서, 유화 과정은 배치 공정 대신 연속 방식으로 수행된다. 도 41은 연속 유화 반응기의 디자인을 도시한다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 활성제의 작은 구형 입자를 캡슐화하는 경화된 벽-형성 폴리머 기질은 원심분리 및(또는) 여과(투석여과)에 의해 더 수확되고 물로 세척된다. 잔류 액상은 동결건조 또는 증발과 같은 방법에 의해 더 제거될 수 있다.
A. 인슐린 작은 구형 입자
실시예 1: 인슐린 작은 구형 입자의 일반적인 제조 방법
16.67% PEG 3350을 함유하는 pH 5.65(0.033M 아세트산 나트륨 완충액)로 완충된 용액을 제조하였다. 이 용액에 아연 결정성 인슐린의 농축 슬러리를 교반시키면서 첨가하였다. 최종 용액 중의 인슐린 농도는 0.83 ㎎/mL였다. 용액을 약 85 내지 90 ℃로 가열하였다. 인슐린 결정은 5분 내에 이 온도 범위에서 완전히 용해되었다. 용액의 온도를 제어 속도로 저하시켰을 때 약 60 ℃에서 인슐린 작은 구형 입자가 형성되기 시작하였다. PEG 농도가 증가될수록 수율은 증가되었다. 이 방법에 의해 평균 1.4 ㎛인 각종 크기 분포를 가진 작은 구형 입자가 생산되었다.
형성된 인슐린 작은 구형 입자를 그러한 작은 구형 입자가 용해되지 않는 조건하에서 투석여과를 통해 미세구를 세척하여 PEG로부터 분리하였다. Zn2 +를 함유하는 수용액을 이용하여 인슐린 작은 구형 입자를 현탁액에서 세척해내었다. Zn2 + 이온은 인슐린의 용해도를 감소시키며, 수율을 감소시키고 작은 구형 입자 응집을 야기시키는 용해를 방지한다.
실시예 2: 인슐린 작은 구형 입자의 비- 교반 배치 제조방법
아연 결정성 인슐린 20.2 ㎎을 실온에서 탈이온수 1 mL에 현탁시켰다. 50 μL의 0.5N HCl을 인슐린에 첨가하였다. 탈이온수 1 mL를 첨가하여 아연 결정성 인슐린의 10 ㎎/mL 용액을 형성하였다. 폴리에틸렌 글리콜 3350(Sigma) 12.5 g 및 폴리비닐피롤리돈(Sigma) 12.5 g을 50 mL의 100 밀리몰 아세트산 나트륨 완충액, pH 5.7에 용해시켰다. 폴리머 용액 부피를 아세트산 나트륨 완충액으로 100 mL까지 조정하였다. 에펜도르프 관 내의 폴리머 용액 800 μL에 10 ㎎/mL 인슐린 용액 400 μL를 첨가하였다. 인슐린/폴리머 용액은 혼합 시에 탁해졌다. 대조군은 폴리머 용액 대신 물을 사용하여 제조하였다. 에펜도로프 관을 90 ℃ 수조에서 혼합 또는 교반하지 않고 30 분 동안 가열하고나서 꺼내어 얼음 위에 10 분 동안 두었다. 인슐린/폴리머 용액은 90 ℃ 수조에서 꺼낼 때 맑았지만, 냉각시에 탁해지기 시작했다. 폴리머를 사용하지 않은 대조군은 실험 내내 맑은 상태로 유지되었다. 입자를 원심분리에 의해 인슐린/폴리머 관으로부터 모으고, 이어서 2번 세척하여 폴리머를 제거하였다. 최종 수현탁액을 동결건조시켜 건조 분말을 얻었다. 인슐린/폴리머 관으로부터 얻은 동결건조 입자의 SEM 분석 결과 직경이 약 1 ㎛인 작은 구형 입자의 균일한 분포를 나타내었다. 입자의 코울터 광산란 입자 크기 분석 결과 1.413 ㎛의 평균 입자 크기, 0.941-1.88 ㎛의 95% 신뢰 한계 및 0.241 ㎛의 표준 편차를 가진 좁은 크기 분포를 나타내었다. 폴리머 또는 세척 단계를 포함하지 않지만 동일한 방식으로 가공되고 동결건조되는 인슐린 대조군은 단백질 동결건조 후에 전형적으로 얻어지는 모양과 유사한 플레이크(입자 아님)(SEM) 만을 나타내었다.
실시예 3: 인슐린 작은 구형 입자의 연속 유통 제조 방법
인슐린 36.5 ㎎을 칭량하여 탈이온수 3 mL에 현탁시켰다. 30 μL의 1N HCl을 첨가하여 인슐린을 용해시켰다. 탈이온수를 이용하여 용액의 최종 부피를 3.65 mL로 조정하였다. PEG/PVP 용액 7.3 mL (100 mM NaOAc 완충액 중 25% PEG/PVP, pH 5.6)를 인슐린 용액에 첨가하여 인슐린 용액의 최종 총 부피를 10.95 mL로 만들었다. 그후에, 용액을 와동시켜 인슐린과 PEG/PVP의 균질 현탁액을 생산하였다.
인슐린 현탁액을 바이오래드(BioRad) 정량 펌프에 연결하여 테플론® 관 (TFE 1/32" 내경 연질 관)을 통해 0.4 mL/분의 속도로 전개되도록 하였다. 펌프에서 나온 관을 얼음에 잠긴 수집관에 삽입하기 전에 90 ℃로 유지되는 수조에 담그었다. 인슐린 용액의 온도가 수조 내의 약 90 ℃에서 얼음 내 수집관에서 약 4 ℃로 저하되었을 때 인슐린 작은 구형 입자가 형성되었다. 도 7은 이 공정의 개략도이다. 공정의 총 운전 시간은 10.95 mL 부피의 경우 35 분이었다. 작은 구형 입자의 수집 후에, 수집관을 벡크만(Beckman) J6B 원심분리기에서 3000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하였다. 두번째 수 세척을 완결하고 작은 구형 입자 펠릿을 2600 rpm으로 15 분 동안 원심분리하였다. 최종 수 세척물을 1500 rpm으로 15 분 동안 원심분리하였다. 입자 크기 분석하기 위해 분취량을 빼내었다. 작은 구형 입자를 -80 ℃에서 냉동시키고 2일 동안 동결건조시켰다.
입자 크기는 부피 기준 1.397 ㎛, 표면적 기준 1.119 ㎛ 및 수 기준 0.691 ㎛ (벡크만 코울터 LS 230 입자 계수기에 의해 확인됨)인 것으로 확인되었다. 주사 전자 현미경사진은 균일한 크기의 비응집 인슐린 작은 구형 입자를 나타내었다(도 8).
인슐린 용액을 단기간 동안 90 ℃에 노출시키는 연속 유통 방법을 이용하여 작은 구형 입자를 생산하였다. 이 방법으로 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의 해 확인되는 바와 같이 90% 단백질인 최종 조성물이 생산되었다 (도 9). HPLC 분석 결과는 또한 용해된 인슐린 작은 구형 입자의 용출 시간이 인슐린 표준 또는 천연 인슐린 출발 물질의 것과 크게 다르지 않은 약 4.74분임을 나타내었으며, 이는 작은 구형 입자로의 제조 후에 인슐린의 생화학적 완전성의 보존을 나타내는 것이다.
실시예 4: 인슐린 작은 구형 입자의 열 교환기 배치 제조 방법
인간 아연 결정성 인슐린을 최소량의 탈이온수에 음파 처리에 의해 현탁시켜 완전히 분산시켰다. 인슐린 현탁액을 77 ℃로 예열된 교반 완충된 폴리머 용액 (25 ℃에서 pH 5.65)에 첨가한 결과 최종 용질 농도가 0.1M 아세트산 나트륨 완충액 중, 0.83% 아연 결정성 인슐린, 18.5% 폴리에틸렌 글리콜 3350, 0.7% 염화 나트륨이 되었다. 초기에 탁한 혼합물은 결정성 인슐린이 용해되었을 때 3분 내에 맑아졌다. 맑아진 직후에, 용액을 열 교환기로서 사용된 된 수-재킷 유리 크로마토그래피 컬럼에 옮겼다 (컬럼 내경: 25 ㎜, 길이: 600 ㎜; Ace Glass Incorporated, Vineland, NJ). 유리 컬럼을 수직으로 위치시키고, 열 교환액을 컬럼의 저부에서 수 재킷에 유입시키고 상부에서 배출시켰다. 시스템의 열 교환 특성을 입증하기 위해, 열전대 (타입 J, Cole Parmer)를 컬럼의 상부와 저부에서 인슐린 배합액의 중심에 위치시키고 예비 시험 운전 중에 냉각 온도 프로파일을 얻었다. 외부 표면 변수가 도입되지 않도록 이 실험에 대해 수행된 6 배치에서 열전대를 제거하였다.
열 교환기를 65 ℃로 예열하고, 인슐린-완충 폴리머 용액을, 용액 온도가 65 ℃ 아래로 저하되지 않고 기포가 용액 내로 도입되지 않도록 옮겼다. 맑은 용액을 열 교환기에서 4분 동안 65 ℃로 평형되게 한 후에, 열 교환액을 65 ℃ 공급액에서 15 ℃ 공급액으로 바꾸었다. 열 교환기 내의 인슐린 배합액을 20분에 걸쳐 15 ℃로 평형되게 하였다. 온도가 60 ℃에서 55 ℃까지 저하되었을 때 인슐린 작은 구형 입자가 형성되어 균일한 안정한 크림백색 현탁액을 얻게 되었다.
인슐린 작은 구형 입자를 5 부피의 0.16% 아세트산 나트륨 - 0.026% 염화 아연 완충액, pH 7.0에 대해 투석여과 (A/G Technologies, 750,000 MWCO 한외여과 카트리지)하여 폴리에틸렌 글리콜로부터 분리하고, 이어서 원래 부피의 1/5로 농축하였다. 인슐린 작은 구형 입자 현탁액을 5 부피의 탈이온수에 대한 투석여과에 의해 더 세척하고, 이어서 동결건조시켜 물을 제거하였다. 투석여과 중에 (막 표면 상의 입자의 분극 충전으로부터) 또한 동결건조 중에 (동결 전에 작은 구형 입자의 침강으로부터) 작은 구형 입자의 응집을 방지하기 위해 주의를 기울여야 한다. 건조된 작은 구형 입자는 탈응집이나 체질이 필요하지 않은, 자유 유동 상태이고 사용될 준비가 된 것이었다.
인슐린의 작은 구형 입자
상기 방법으로 추가의 부형제없이 아연 결정성 인슐린으로부터 균일한 크기의 구형 입자를 생산한다. 이 방법에 의해 제조된 작은 구형 입자는 비행시간(AerosizerTM) 및 앤더슨 캐스케이드 임팩터 측정에 의해 확인되는 우수한 공기역학적 특성을 나타내며, 높은 호흡성 분율은 널리 사용되는 간단한 건조 분말 흡입기(CyclohalerTM)로부터 전달될 때 심부 폐로의 전달을 나타내는 것이다. 본 발명자 는 또한 모델 단백질로서 인슐린을 사용하여 확립된 U.S.P. 방법을 이용하여 단백질의 화학적 완전성에 대한 방법의 효과를 검사할 수가 있다.
건조 분말 인슐린 작은 구형 입자는 편광 현미경 (Leica EPISTAR®, Buffalo, NY) 및 주사 전자 현미경 (AMRAY 1000, Bedford, MA)에 의해 영상화되었다. 기기 (TSI Incorporated, St. Paul, MN)에 분말을 도입하기 위해 모델 3230 에어로-디스퍼서® 건조 분말 디스퍼서를 포함한 에어로사이저® 모델 3292 파티클 사이징 시스템을 이용하여 입자 크기 분석을 실시하였다. 개개의 입자 크기는 에어로사이저 결과를 전자 현미경사진과 비교하여 확인하였다.
이 과정 전과 후에 인슐린의 화학적 완전성을 USP 26 (인간 인슐린에 대한 USP 논문)에 따라서 HPLC로 확인하였다. 인슐린 및 고분자량 단백질 함량은 276 ㎚에서 UV 검출하는 등용매 SEC HPLC 방법을 이용하여 측정하였다. 인슐린, A-21 데사미도 인슐린 및 기타 인슐린 관련 물질을 측정하기 위해, 시료를 USP 구배 역상 HPLC 방법을 이용하여 분석하였다. 인슐린 함량은 214 ㎚에서의 UV 검출을 이용하여 측정하였다. 고분자량 단백질, 데사미도 인슐린 및 기타 인슐린 관련 물질을 상기 방법에 의해 야기되는 임의의 화학적 분해를 정량화하도록 분석하였다.
인슐린 작은 구형 입자의 공기역학적 특징은 에어로사이저® 기기를 사용하여 검사하였다. 인슐린 건조 분말의 크기 분포는 저전단력, 중간 공급 속도 및 일반적인 탈응집 장치를 갖춘 에어로디스퍼서를 이용하여 측정하였다. 기기의 소프트웨어는 비행시간 데이타를 크기로 변환시키며 그것을 대수 크기 범위에 넣는다. 각 크기 저장소에서 검출되는 입자의 수 뿐만 아니라 각 크기 저장소에서 검출되는 입자의 총 부피를 통계적 분석에 이용하였다. 부피 분포는 수 분포보다 큰 입자를 더 많이 강조하며, 따라서 큰 입자 뿐만 아니라 비-분산 입자의 응집물의 검출에 더 민감하다.
앤더슨 캐스케이드 임팩터 어셈블리는 예비분리기, 9개의 스테이지, 8개의 수집판 및 백업 필터로 이루어진다. 그 스테이지들은 -1, -0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 F로 번호매겨진다. 스테이지 -1은 단지 오리피스 스테이지이다. 스테이지 F는 백업 필터 및 스테이지 6에 대한 수집판을 함유한다. 스테인레스 스틸 수집판은 입자의 "바운스"를 방지하기 위해 식용등급 실리콘 박층으로 코팅하였다. 시료주입기를 통한 60 LPM의 시료 흐름 공기 유속을 분석에 이용하였다. 정확히 칭량된 약 10 ㎎의 시료 크기를 각 전분 캡슐 (Vendor) 내로 칭량 첨가하였으며, 분말을 4초 안에 사이클로할러로부터 에어로졸로서 전달되게 하였다. 각 판 상에 침착된 인슐린 분말의 양은 인간 인슐린에 대한 USP 26 검정에 따라서 214 ㎚에서 역상 HPLC 검출에 의해 확인하였다.
공기역학적 질량 중간 직경 (MMAD)을 유효 절단 직경 (ECD)에 대한 질량 백분율 미만의 누적 프로빗 적합을 이용하여 시그마 플롯 소프트웨어에 의해 계산하였다. 방출 용량 (ED)은 캐스케이드 임팩터 내에 침착된 인슐린의 총 관찰량으로 확인되었다. 이는 사이클로할러 캡슐 내에 부하된 인슐린 작은 구형 입자의 질량 백분율로서 표시된다.
이 결과는 상 변화 제제와 관련하여 공정 파라메터를 주의깊게 조절하여 1) 약 2 ㎛의 직경을 가진 주로 구형인 입자; 2) 좁은 크기 분포; 3) 배치에서 배치까 지의 재현가능한 공기역학적 특성; 및 4) 잔류 수분을 배제한 95% 이상의 활성 약물 (인간 인슐린)로 구성된 작은 구형 입자를 생산할 수 있음을 입증한다. 본 발명자는 아연 결정성 인슐린의 용해도가 용액 온도, pH, 폴리머 농도 및 이온 강도에 의해 제어될 수 있음을 확인하였다. 본 발명자는 또한 상 변화 기간 중의 냉각 속도 제어가 좁은 크기 범위 내의 주로 구형인 입자의 형성을 가능하게 하는 중요한 파라메터임을 발견하였다.
도 2는 이 실시예에 해당하는 공정에 대한 냉각 온도 프로파일이다. 이 프로파일은 수직으로 위치된 수-재킷 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 측정하였으며 열 교환액은 컬럼의 바닥에서 수 재킷에 유입되고 상부에서 배출되었다. 2개의 열전대를 컬럼 내에 용액과 접촉되게 위치시켰다. 하나의 열전대를 컬럼 상부에 놓고 두번째 열전대를 컬럼 저부에 놓았다. 온도 곡선은 시간-온도 플롯을 분리 영역으로 나누며, 이전의 최적화 실험으로 최적 온도 변화 속도 위 또는 아래에서 유도된 상 변화가 더 넓은 입자 크기 범위 및 구형이 아닌 형태를 갖게 하는 경향이 있음을 확인하였다. 60 ℃를 넘는 온도에서, 인슐린은 완충 폴리머 용액에 가용성으로 남아있다(영역 A; 도 2). 온도가 약 8.6 ℃/분 내지 26.5 ℃/분의 속도로 저하될 때, 균일한 크기의 구형 입자의 최적 형성이 촉진된다(영역 B; 도 2). 제제의 냉각 속도가 26.5 ℃/분보다 빠른 경우, 쉽게 응집되는 인슐린의 매우 미세한 (0.5 미크론 미만) 비-구형 입자를 생산하는 경향이 있다(영역 C; 도 2). 8.6 ℃/분보다 느린 냉각 속도는 인슐린 작은 구형 입자와 구형이 아닌 형태 및 비정질인 응집 침전물의 넓은 크기 분포를 나타내는 경향이 있다(영역 D; 도 2).
열 교환기 내의 인슐린 완충 폴리머 용액의 온도가 도 2의 영역 B 내에 속하므로, 인슐린 작은 구형 입자의 우유백색의 안정한 현탁액이 형성되게 하는 상 변화가 일어난다. 미세구 형성을 나타내는 상 분리는 온도가 60 ℃ 아래로 저하될 때 일어나기 시작하며 온도가 40 ℃에 도달할 때 완결되는 것으로 보인다. PEG 폴리머를 제거하기 위해 투석여과에 의해 세척하기 전에 제제를 15 ℃로 냉각하였을 때 현탁액에서 추가의 변화가 관찰되지 않았다.
출발 인간 아연 결정성 인슐린 원료의 SEM이 약 5 내지 40 ㎛의 입자 크기를 가진 비-균질 크기 및 결정 형태를 나타내는 반면, 이 실시예로부터의 배치 중의 하나에서 취한 SEM 사진은 인슐린 작은 구형 입자의 구 형태 및 균일한 크기를 나타낸다 (도 3b). SEM에 의해 예시되는 입자 형태 및 크기는 이 실시예에 대해 제조되는 다른 5개 배치를 대표하는 것이다.
탈이온수 현탁액으로부터의 투석여과 세척 및 동결건조에 의해 완충 폴리머로부터 분리한 이후에, 건조 분말 인슐린 작은 구형 입자는 자유 유동되고 쉽게 칭량되고 취급되었다. 인슐린 작은 구형 입자의 수분 함량 범위는 출발 아연 결정성 인슐린 원료 경우의 12%와 비교되는 2.1 내지 4.4% 수분이었다. HPLC에 의한 인슐린 작은 구형 입자의 화학 분석 결과 이 방법으로 인한 인슐린의 화학적 분해가 거의 없고 (도 4), 고분자량 화합물이 증가되지 않은 것으로 밝혀졌다. 다이머%, A21 데사미도 인슐린%, 후기 용출 피크% 및 기타 화합물%가 (출발 인슐린 원료에 비해) 증가되었지만, 6개 배치 모두에 대한 결과는 USP 한계 범위내에 들었다. 인슐린 보유 효력은 출발 원료의 경우에서 28.7 IU/㎎인 것에 비해 28.3 내지 29.9 IU/㎎이었다. 이 방법에 사용된 폴리머 (폴리에틸렌 글리콜)의 잔류 농도는 0.13% 미만 내지 검출가능하지 않은 정도이며, 이는 폴리머가 인슐린 작은 구형 입자의 중요한 성분이 아님을 나타낸다.
인슐린 작은 구형 입자에 대한 공기역학적 특성의 배치간 재현성
에어로사이저 및 앤더슨 캐스케이드 임팩터 데이타에 의해 입증되는 바와 같이 생산된 인슐린 작은 구형 입자의 6개 분리 배치에서는 공기역학적 특성에 대한 재현성이 탁월하였다. 모든 6개 배치의 경우, 에어로사이저 데이타는 입자의 99.5% 이상이 0.63 내지 3.4 ㎛의 크기 범위 내에 속하며, 작은 구형 입자의 최소 60%가 1.6 내지 2.5 ㎛의 좁은 크기 범위 내에 속한다 (도 5). 통계적으로, 데이타는 생산된 인슐린 작은 구형 입자 배치의 99% 이상이 0.63 내지 3.4 ㎛ 크기 범위 내의 입자(2 ㎛의 표적 직경의 68.5 내지 70%)의 96.52% 이상을 갖는 95% 신뢰도를 가질 수 있음을 나타낸다.
앤더슨 캐스케이드 임팩터 데이타는 사이클로할러로부터 전달된 용량의 평균 17.6%가 장치의 입구 및 예비분리기/목 부분에 침착되는 것을 제외하고는 에어로사이저 데이타에 잘 부합된다 (도 6). 데이타는 에어로사이저의 분말 분산 효율이 사이클로할러 장치의 것보다 크다는 것을 제시한다. 그러나, 6개 배치에 대한 평균 방출 용량은 사이클로할러로부터 71.4%였으며, 임팩터의 스테이지 3 상에 침착된 방출 용량은 72.8%였다. 심부 폐로의 전달을 위한 호흡성 분율이 1.1 내지 3.3 ㎛의 ECD를 가진 분율인 것으로 평가된다면, 흡입된 인슐린 작은 구형 입자의 평균 60.1%가 심부 폐로의 전달 및 이후의 전신 흡수에 이용가능할 수 있다. 방법에 대 한 탁월한 재현성이 표 1에 나타내어져 있으며, 6개 분리 배치에 대한 MMAD 및 GSD 평균의 표준 편차 값은 아주 낮다. 이는 공정 변수가 엄격히 제어된 결과 공기역학적 특성에 대한 배치 대 배치 균일성을 갖게 됨을 나타낸다.
인슐린 작은 구형 입자의 공기역학적 특성
파라메터 MMAD (㎛) GSD (㎛) 스테이지 2-F % (ECD 3.3 ㎛) 스테이지 3-F % (ECD 2.0 ㎛) 방출 용량 (%)
평균 2.48 1.51 88.8 72.8 71.4
SD 0.100 0.064 4.58 4.07 5.37
표 1은 인슐린 작은 구형 입자의 공기역학적 특성을 나타낸다. 결과 (평균 +/- SD)는 앤더슨 캐스케이드 임팩터 상에서 분리 인슐린 작은 구형 입자 배치 (N=6)를 분석하여 계산하였다. MMAD 및 GSD에 대한 아주 낮은 표준 편차에 의해 공정에 대한 아주 양호한 재현성이 입증되었다.
이러한 냉각 공정에 의해 생산된 인슐린 작은 구형 입자는 표 1의 공기역학적 데이타에 의해 입증되는 바와 같이 응집되는 경향이 거의 없음을 나타내었다.
실시예 5: 인슐린 작은 구형 입자의 교반 용기 제조 방법
완충 폴리머 용액 2880 mL (0.1M 아세트산 나트륨 완충액, pH 5.65 중 0.7% 염화 나트륨, 18.5% 폴리에틸렌 글리콜 3350, 2 ℃)를 3 리터 수-재킷 유리 교반 용기에 첨가하고 75 ℃로 예열하였다. 인간 아연 결정성 인슐린 2.4 g을 80 mL의 완충 폴리머 용액에 음파 처리에 의해 현탁시켜 완전히 분산시켰다. 인슐린 현탁액을 예열된 교반 완충 폴리머 용액에 첨가하고 추가로 5분 동안 교반시켰다. 이 시간 중에 맑아진 혼합물은 아연 결정성 인슐린이 용해되었음을 나타낸다. 인슐린 폴리머 용액의 온도가 15-20 ℃로 저하될 때까지 10 ℃로 설정된 냉각기로부터의 물을 용기의 재킷을 통해 펌핑하였다. 결과 현탁액을 5 부피의 0.16% 아세트산 나트륨-0.026% 염화 아연 완충액, pH 7.0에 대해 투석여과하고, 이어서 5 부피의 탈이온수로 투석여과하고, 이어서 동결건조하여 물을 제거하였다. 동결건조된 분말의 SEM 분석 결과는 TSI 에어로사이저 비행시간 분석에 의해 1.433 ㎛의 평균 공기역학적 직경을 가진 균일한 작은 구형 입자를 나타내었다. 앤더슨 캐스케이드 임팩터 분석 결과 방출 용량의 73%가 스테이지 3 내지 필터 상에 침착되고, MMAD가 2.2이고 GSD가 1.6이었으며, 이들은 모두 분말의 탁월한 공기역학적 특성을 나타내는 것이다.
실시예 6: 제제를 생산하는 작은 구형 입자의 이온 강도 조정에 의한 인슐린 분해 생성물 형성의 감소
인슐린을 또한 장시간 또는 산성 환경없이, 더 낮은 초기 온도, 예를 들면 75 ℃에서 용액에 용해시킬 수 있지만, NaCl을 용액에 첨가함으로서 상당한 응집이 일어나게 된다.
개선된 인슐린 작은 구형 입자 제조 공정은 다음 기술을 이용하여 실시되었다. 아연 결정성 인슐린의 농축 슬러리(실온)를 약 85 내지 90 ℃로 예열된, 0.1M 아세트산 나트륨, pH 5.65 중 16.7% 폴리에틸렌 글리콜 용액에 (교반시키면서) 첨가하였다. 인슐린 결정은 이 온도 범위에서 5분 내에 완전히 용해되었다. 용액의 온도가 더 낮아질 때 인슐린 작은 구형 입자가 형성되었다.
85-90 ℃의 초기 온도에서 승온에 의한 화학 반응으로 인해 상당량의 A21 데사미도 인슐린 및 인슐린 다이머가 형성되었다. 그러나, 이러한 형성은 75 ℃에서 장시간을 필요로 하였다. 이러한 장시간은 또한 상당한 인슐린 분해를 야기시켰다. 인슐린이 산성 환경에 미리 용해되었으므로 또한 많은 비율의 인슐린이 A21 데사미도 인슐린 분해 생성물로 불필요하게 전환되었다.
실험에서, 화학적 수단에 의해 인슐린 다이머의 형성을 감소시키기 위해 염화 나트륨을 완충 폴리머 반응 혼합물에 첨가하였다. 첨가된 염화 나트륨이 데사미도 또는 다이머 인슐린 분해 생성물의 형성을 크게 감소시키지는 못하였지만, 염화 나트륨의 첨가로 인해 올리고머(고분자량 인슐린 생성물)의 형성은 크게 감소되었다 (표 2).
인슐린-수 현탁액에 첨가된 NaCl
시료 설명 다이머% HMWt% 데사미도% 기타 관련 조성물%
NaCl 첨가되지 않은 대조군 0.94 0.23 0.78 1.52
NaCl, 0.7% 최종 농도 0.83 0.05 0.82 1.43
폴리머 용액에 첨가된 NaCl
시료 설명 다이머% HMWt% 데사미도% 기타 관련 조성물%
NaCl, 0.7% 최종 농도 0.85 0.07 0.93 1.47
또한, Zn 결정성 인슐린은 NaCl없는 대조군보다 NaCl 존재하에 훨씬 더 빨리 용해되었다. 이는 염화 나트륨의 첨가가 인슐린의 용해 속도를 개선시키고 아연 인슐린 결정의 초기 용해 온도의 감소를 가능하게 함을 암시한다. 이러한 가정은, 제제에 0.7% NaCl을 첨가하면 아연 결정성 인슐린 원료가 이전에 NaCl을 첨가하지 않은 경우의 87 ℃보다 훨씬 더 낮은 온도인 75 ℃에서 5분내에 용해됨을 입증한 실험에서 확인되었다. 75 ℃에서, NaCl의 부재하에 인슐린은 13분 후에 완전히 용해되지 않았다.
일련의 실험은 염화 나트륨의 농도 증가 (2.5 ㎎/㎖, 5.0 ㎎/㎖, 10.0 ㎎/㎖ 및 20.0 ㎎/㎖)로 인해 인슐린 결정이 용해되는 온도가 더 감소되고 또한 작은 구형 입자가 형성되기 시작하는 온도가 감소됨을 입증하였다 (도 10a-d). 또한, 제제 중의 NaCl 농도 증가로 인해 더 높은 농도의 Zn 결정성 인슐린이 신속히 용해되었음이 확인되었다. 그러므로, 일정 온도에서 인슐린의 용해도가 초기 연속상의 염화 나트륨 농도를 조정함으로써 주의깊게 조절될 수 있음이 확인되었다. 이로써 분해 생성물의 형성에 영향을 적게 미치는 온도에서 공정이 수행된다.
염화 나트륨이 인슐린을 용해시키는 온도를 감소시키는 독특한 화학적 특성을 갖는지 확인하기 위해, 등몰량 농도의 염화 암모늄 및 황산 나트륨을 염화 나트륨을 이용한 대조군과 비교하였다. NH4Cl 및 Na2SO4는 마찬가지로 아연 결정성 인슐린 원료를 용해하는데 필요한 온도를 감소시켰다. 더 높은 이온 강도는 용액 온도가 감소될 때 작은 구형 입자의 형성 능력에 영향을 미치지 않고 제제를 생산하는 미세구 내의 인슐린의 용해도를 증가시키는 것으로 보인다.
실시예 7: 인슐린 작은 구형 입자의 수율 및 인슐린 농도 및 크기에 대한 PEG 농도 효과의 연구
폴리에틸렌 글리콜 (3350) 적정 데이타는 PEG-3350의 증가가 또한 작은 구형 입자의 수율을 증가시킴을 나타낸다. 그러나, PEG 농도가 너무 높을 때에는, 입자는 그의 구 형태를 잃어버려 수율의 약간의 개선을 개선시킨다.
인슐린 농도 데이타는 PEG와 반대 경향을 나타내며, 인슐린 농도가 증가되면 작은 구형 입자의 수율이 감소된다.
본 발명자는 인슐린 농도가 높을수록 더 큰 직경의 작은 구형 입자를 생산하는 일반적인 경향을 관찰하였다. 이 실험에서, 농도가 더 높아지면 또한 작은 구형 입자와 비-구형 입자의 혼합물이 형성된다.
실시예 8: 개에 의한 인슐린 작은 구형 입자 연구
이 실험 연구의 목적은 비글(beagle) 개의 폐 내의 분무화된 인슐린 분말 침착에 대한 정량화 및 가시화 실험을 수행하는 것이었다. 본원에 개시된 방법에 따라서 99 mTc 표지된 인슐린 입자를 제조하였다. 분무화된 인슐린의 폐 침착을 감마 신티그래피를 이용하여 평가하였다.
5마리의 비글 개를 이 연구에 이용하였으며 각 동물에 99 mTc 방사표지된 인슐린 입자 에어로졸을 투여하였다. 개 식별 번호는 101, 102, 103, 104 및 105였다.
에어로졸 투여 전에, 동물을 마취용 주입관을 통해 프로포폴(propofol)로 마취시키고 에어로졸 전달을 위해 기관내 튜브를 각 동물에 넣었다.
각 개를 방사표지된 에어로졸의 흡입을 위해 "스팽글러 (Spangler) 박스" 챔버에 넣었다. 방사표지된 에어로졸 투여 직후에, 전방과 후방 흉곽 영역 부분에서 감마 카메라 컴퓨터 영상을 얻었다.
99 mTc 방사표지된 인슐린 분말의 안정성을 얻기 위해 2번의 시험관내 캐스케이드 임팩터 수집을 평가하였으며, 그 중 하나는 첫번째 동물 (101) 에어로졸 투여 전에, 또하나는 마지막 동물(105) 노출 이후에 평가하였다.
결과는 도 11에 예시되어 있다. 캐스케이드 임팩터 수집은 두 경우 모두에서 단일 모드 분포를 나타내었다.
도 12는 모든 동물에 대한 P/I 비 계산 결과를 나타낸다. P/I 비는 폐의 말초 부위, 즉 심부 폐에 침착되는 99 mTc 인슐린 분말의 비율의 척도이다. 전형적인 P/I 비는 약 0.7일 것이다. 0.7 이상의 P/I 비는 중심 폐 또는 기관지 부위에 비해 말초 폐에서 상당한 침착을 나타낸다.
도 13에서의 신티그래프 영상은 호흡계 내의 인슐린 침착 위치를 나타내며 그것은 P/I 데이타와 일치한다(도 12). 개(101)에 대한 신티그래프 영상은 이 연구에서 5마리의 개 모두를 대표하는 것이다.
개(101)에 대한 신티그래프 영상은 기관 또는 기관지 침착은 거의 없지만 말초 폐 침착은 명백히 증가됨을 나타낸다. 폐 외부의 방사성은 분무 분말의 심부 폐 침착에서 99 mTc가 신속히 흡수됨으로 인한 것이다.
P/I 비 및 영상 데이타는 99 mTc 방사표지된 인슐린이 심부 폐 내에 주로 침착되었음을 나타낸다. 말포 폐 내에 침착된 방사표지된 인슐린의 양은 입자의 낮은 수준의 응집을 나타내는 것이다.
실시예 9: 인슐린 작은 구형 입자로부터 폴리머를 제거하기 위한 아연 함유 완충액에 대한 투석여과
PSEA 용액에서 인슐린 작은 구형 입자를 제조한 이후에, 동결건조 전에 현탁액으로부터 모든 PSEA를 제거하는 것이 바람직하다. 잔류 PSEA는 몇 %라도 결합제로서 작용하여 작은 구형 입자의 비산되지 않는 응집체를 형성할 수 있다. 이러한 응집은 DPI 장치로부터 전달되는 분말의 방출 용량 및 공기역학적 특성에 역효과를 나타낼 것이다. 또한, PSEA의 반복 투여에 대한 폐 조직 노출은 독성 문제를 야기시킬 수 있다.
동결건조 전에 PSEA로부터 작은 구형 입자를 분리하기 위해 3가지 기술이 고려된다. 여과를 이용하여 소량의 입자를 수집할 수 있다. 그러나, 다량의 작은 구형 입자는 여과 매질의 공극을 빠르게 봉쇄하여 비실용적인 수 ㎎ 이상의 입자를 세척 및 회수하게 된다.
입자를 수집하기 위한 원심분리에 이어서, 세척 용매에서의 재-현탁 및 재-원심분리를 포함한 수회의 세척 주기를 이용하여 PSEA를 성공적으로 제거하였다. 탈이온수를 세척 용매로서 이용하였는데, 인슐린 작은 구형 입자는 쉽게 용해되지 않고 PSEA는 용액에 잔류하기 때문이다. 원심분리의 한가지 단점은 작은 구형 입자가 입자를 스핀다운시키는데 필요한 높은 중력에 의해 펠릿 내로 압축된다는 것이다. 일련의 각 세척에서, 펠릿을 분리 입자내에 재현탁하는 것은 점점 더 어려워졌다. 인슐린 입자의 응집은 종종 원심분리 과정의 불필요한 부작용이다.
중공 섬유 카트리지를 이용한 투석여과는 인슐린 작은 구형 입자를 세척하기 위한 원심분리에 대한 대안으로서 사용되었다. 투석여과 장치의 통상의 셋업에서, 완충된 PSEA/인슐린 입자 현탁액은 밀폐 용기 내에 놓여지며 현탁액은 여액이 중공 섬유 막을 가로질러 통과하도록 하기에 충분한 역압에 의해 섬유를 통해 재순환되었다. 재순환 속도 및 역압은 막의 공극의 봉쇄(분극화)를 방지하도록 최적화되었다. 현탁액으로부터 제거된 여액의 부피는 세척 용매를 교반 밀폐 용기 내에 사이포닝하여 연속적으로 다시 보충하였다. 투석여과 과정 중에, 현탁액 중의 PSEA의 농도는 점차적으로 감소되었으며, 인슐린 작은 구형 입자 현탁액에는 현탁액의 원래 부피의 5 내지 7배가 1시간에 걸쳐 세척 용매로 교체된 후에 본질적으로 PSEA가 존재하지 않았다.
투석여과 과정은 폴리머를 제거하는데 매우 효율적이고 상업적인 규모로 대규모화하기에 아주 적당하긴 하지만, 인슐린 작은 구형 입자는 세척 용매로서 원래 사용된 탈이온수에 서서히 용해되었다. 실험은 인슐린이 여액에서 점차적으로 손실되었고 현탁액의 원래 부피의 20배에 해당하는 탈이온수가 교체된 후에 인슐린 입자가 완전히 용해되는지를 확인하였다. 인슐린 작은 구형 입자가 탈이온수에 거의 용해되지 않는 것으로 밝혀졌지만, 투석여과 과정의 고효율은 현탁액으로부터 연속적으로 가용성 인슐린 및 아마도 아연 이온을 제거하였다. 그러므로, 일정 부피의 탈이온수 중의 불용성 인슐린 농도와 가용성 인슐린 농도 사이의 평형은 인슐린의 용해를 유리하게 하는 상태인 투석여과에 의해 일어나지 않았다.
표 3은 잠재적 세척 매질로서 평가된 각종 용액을 나타낸다. 10 ㎎의 건조 인슐린 작은 구형 입자를 각 용액 1 mL에 현탁시키고 실온에서 48시간 동안 서서히 혼합하였다. 가용성 인슐린의 백분율은 24시간 및 48시간에 측정하였다. 인슐린은 탈이온수에 난용성인 것으로 밝혀졌으며, 24시간 미만 내에 가용성 인슐린의 총 중량의 1% 바로 아래에서 평형에 도달하였다. 그러나, 이미 언급된 바와 같이 투석여과의 고효율은 가용성 인슐린 (및 아연)을 연속적으로 제거하므로 이러한 평형은 결코 이루어지지 않고 인슐린 작은 구형 입자는 계속 용해된다. 그러므로, 이상적인 세척 용액 중의 인슐린 용해도는 물의 용해도 아래일 것이다. 인슐린이 그의 등전점 부근에서 적어도 가용성이므로, 두 몰농도 및 pH 5.65에서 아세테이트 완충액을 검사하였다. 인슐린의 용해도는 완충액의 몰농도에 좌우되는 것으로 알려졌으며 낮은 몰농도에서 물과 동등하다. 에탄올은 무수 농도 부근에서만 인슐린의 용해도를 크게 감소시켰다. 인슐린 용해도는, 수용액과 혼합된 에탄올이 투석여과의 초기 단계에서 PSEA/인슐린 작은 구형 입자 현탁액에 사용되었을 때 실제로 증가할 것이다.
각종 세척 용액 중의 인슐린 작은 구형 입자 용해도
세척 용액 24시간 후에 용해된 인슐린% 48시간 후에 용해된 인슐린%
탈이온수 0.91 0.80
0.1M 아세트산 나트륨, pH 5.65 2.48 2.92
0.001M 아세트산 나트륨, pH 5.65 0.54 0.80
0.16% 아세트산 나트륨-0.016% ZnO, pH 5.3 0.14 0.11
0.16% 아세트산 나트륨-0.027% ZnCl2, pH 7.0 0.09 0.06
50% 에탄올/탈이온수 (v/v) 9.47 9.86
100% 무수 에탄올 0.05 0.04
주사용 시판 아연 결정성 인슐린 현탁액에 사용되는 완충액도 또한 용액 중에 아연을 함유한다. 이들 2가지 용액을 인슐린 작은 구형 입자와 함께 시험하여 그 용액들이 탈이온수에 비해 인슐린 용해도를 크게 감소시킴을 밝혀냈다. 문헌에 따라서, 아연 결정성 인슐린은 각 인슐린 헥사머에 결합된 2 내지 4개의 Zn 이온을 가져야 한다. 인슐린 작은 구형 입자를 제조하기 위해 원료로서 사용되는 각종 아연 결정성 인슐린 제제의 경우 헥사머 당 아연 이온 범위는 1.93 내지 2.46이었다. 이는 원료 아연 결정성 인슐린의 일정 중량 당 0.36 내지 0.46% 아연에 해당하였다. 인슐린 작은 구형 입자의 형성 및 탈이온수에 대한 투석여과 후에, 58 내지 74%의 아연이 공정 중에 손실되었다. 인슐린 입자로부터 아연의 손실은 인슐린의 용해도 증가 및 투석여과 중의 손실 증가를 야기시켰다.
0.16% 아세트산 나트륨-0.027% ZnCl2, pH 7.0에 대한 인슐린 작은 구형 입자의 투석여과는 실제로 여액 중의 인슐린 손실을 해소하였다. 그러나, 놀랍게도, 인슐린 작은 구형 입자의 아연 함량은 거의 2%로 증가되었고, 이는 출발 아연 결정성 인슐린 원료에 대해 측정된 0.46%보다 꽤 높은 것이다. 아연 함유 완충액에 대한 투석여과의 또다른 예기치 못한 결과는 사이클로할러 DPI 장치로부터 관찰된 방출 용량이 현저히 개선되고 (탈이온수에 대해 투석여과된 68% 대 아연 완충액 투석여과 후의 84 내지 90%) 앤더슨 캐스케이드 임팩터의 목 부분에 침착된 인슐린 입자의 양의 감소된 것이었다. 아연 완충액 투석여과에 의해 인슐린 작은 구형 입자 건조 분말의 분산성이 개선되고 입자의 응집이 감소되어 임팩터의 더 낮은 스테이지 상에서 침착이 많아지고 MMAD가 더 낮아졌다. 이는 아연 완충액 투석여과 및 인슐린 작은 구형 입자 내의 더 높은 아연 함량이 심부 폐 내에 침착된 용량%를 증강시킬 수 있음을 암시한다.
MDI 분야에 사용하기 위한 부형제 첨가없이 추진제 HFA-134a에 현탁될 때, 아연 완충액 세척된 인슐린 작은 구형 입자의 분명한 비가역적인 응집이 없었다. 인슐린 입자들은 1분 내에 현탁액에서 응집되었지만, 사용 직전에 흔들 때 쉽게 재현탁되었다. 사용 직전에 MDI 용기를 흔드는 것은 일반적으로 임의의 MDI 제품의 사용 설명의 일부이다. 사실상, MDI 용기 저부에 침강된 느슨한 응집 입자들은 실제로 인슐린 입자의 장기간 응집 (그들의 구 형태로 인한 최소 접촉 이외에)을 억제할 수 있는데, 그 이유는 입자들이 MDI 가압 용기 저부에 조밀하게 채워진 층으로 침강되지 않기 때문이다. 그러므로, 인슐린 작은 입자의 아연 완충액 투석여과에 의해 부여되는 특성들은 장기간 저장 수명 및 인슐린과 다른 아연 결합 화합물에 대한 MDI 제제의 분산성을 개선시킬 수 있다.
인슐린 작은 구형 입자가 XRPD 분석에 의해 비결정성인 것으로 밝혀졌으므로, 아연 결합은 헥사머를 형성하도록 인슐린 모노머의 아연 이온 배위와 결합되지 않는다. 그러므로, 이온의 비-특이적 결합 및 결과적인 잠재적 이점은 아연 이외 이온의 결합에도 확대될 수 있다. 아연과 결합하지 않는 다른 단백질들은 투석여과 과정에서 용해도를 감소시키고 유사한 유익한 효과를 제공하는 다른 이온과 결합할 수 있다.
작은 구형 입자를 하이드로 플루로 알칸 (HFA) 134a 추진제에 10 ㎎/mL의 농도로 현탁시켰다. HFA 134a에 보관한 후의 인슐린의 화학 안정성을 0시간 및 1개월에 평가하였다. 도 28에 나타낸 데이타는 인슐린 모노머, 인슐린 다이머, 인슐린 올리고머, 인슐린 메인 피크 및 A21-데사미도 인슐린에 대해서 인슐린 미세구의 보존을 나타낸다.
다음 연구에서, 실시예 4의 방법에 따라서 제조된 인슐린 작은 구형 입자들을 앤더슨 캐스케이드 임팩터 방법을 이용하는 3개의 다른 흡입 장치에서의 그들의 성능에 대해 비교하였다. 사이클로할러(Cyclohaler) 장치는 시판되는 건조 분말 흡입기 (DPI)이며, 디스팔러(Disphaler)는 또다른 건조 분말 흡입기이고 정량식 흡입기 (MDI)는 이 실시예에 기재된 바와 같이 미세구를 HFA134a에 현탁시키고 100 ㎕ 또는 다른 크기의 정량 밸브를 통해 추진시키는 장치이다. 도 29에서의 결과는 앤더슨 캐스케이드 임팩터 장치의 스테이지에 충돌하는 작은 구형 입자들이 스테이지 3 및 4에 침착됨을 분명하게 나타낸다. 이는 흡입기로서 사용된 장치에 상관없이 작은 구형 입자의 아주 재현성있는 성능을 나타내는 것이다. DPI와 MDI 장치 사이의 유일한 주요 차이점은 상당량의 작은 구형 입자가 MDI를 이용하는 앤더슨 캐스케이드 임팩터의 목 부분에 침착된다는 것이다. MDI 장치가 앤더슨 캐스케이드 임팩터의 목 부분에 대해 작은 구형 입자들을 고속 추진시키는 것은 DPI 장치에 비해 더 높은 비율의 인슐린 미세구가 침착된다는 것을 설명한다. 감소된 또는 변형된 배출 속도를 가진 MDI 장치를 이용하여 목 부분에 침착되는 작은 구형 입자의 수를 감소시킬 수 있음은 당업자에 의해 추정될 수 있다. 추가의 측정 수단으로 MDI의 말단에 스페이서 장치를 사용할 수 있다.
이 실시예에 기재된 방법에 따라서 동결건조된 인슐린 출발 물질로부터 인슐린 작은 구형 입자(로트 번호 YQ010302)를 제조하였다. 인슐린 작은 구형 입자에 대한 25 ℃ 및 37 ℃에서의 1년 저장 안정성을 동결건조된 인슐린 출발 물질과 비교하였다. 인슐린 안정성을 총 관련 인슐린 화합물, 인슐린 다이머 및 올리고머, 및 A21-데사미도 인슐린을 검사하여 비교하였다.
도 30-35는 1년 기간에 걸쳐 인슐린 작은 구형 입자가 동일한 조건하에서 저장된 인슐린 출발 물질에 비해 상당히 적은 양의 인슐린 다이머 및 올리고머, A21-데사미도 인슐린 및 총 관련 인슐린 화합물을 나타내었음을 보여준다. 이는 인슐린의 미세구 형태가 출발 물질보다 화학적 변화에 대해 더욱 안정적임을 나타낸다.
인슐린 작은 구형 입자를 제조 후 0시간 및 10개월에 앤더슨 캐스케이드 임팩터 연구에서 시험하였다. 사이클로할러 DPI 장치를 이용하여 장기간 저장 후의 공기역학적 안정성을 확인하였다. 도 36은 공기역학적 성능이 10개월 저장 후에 두드러지게 일정하게 유지됨을 나타낸다.
비가공 인슐린 시료와 이 실시예에서 제조된 작은 구형 입자 내의 인슐린 사이의 구조적 차이를 밝히기 위해 라만 분광 연구를 실시하였다. 작은 구형 입자 내의 인슐린이 그들의 원래 비가공 인슐린 시료보다 실질적으로 더 높은 β-시트 함량 및 이후에 더 낮은 α-나선 함량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견은 작은 구형 입자 내의 응집된 마이크로피브릴 구조의 형성과 일치한다. 그러나, 수성 매질에 용해될 때, 스펙트럼은 비가공 미세구 또는 인슐린으로부터 형성되는 본질적으로 동일한 단백질 구조를 나타내며, 이는 미세구의 임의의 구조 변화가 용해시에 완전히 가역적임을 나타낸다.
라만 분광법을 이용하여 인슐린의 두 배치: A) 비가공 인슐린 USP(Intergen, Cat N. 4502-10, Lot#; XDH 1350110) 및 B) 작은 구형 입자 내의 인슐린(JKPL072502-2 NB 32: P.64). 분말상 시료 또는 인슐린 용액(0.01M HC1 중 약 15 ㎎/mL)을 표준 유리 모세관에 채우고 라만 분석을 위해 12 ℃에서 온조조절하였다. 전형적으로, 2-15 μL의 분취량이 레이저 조사에 노출되는 시료 모관 부분을 채우기에 충분하였다. 스펙트럼을 아르곤 레이저(Coherent Innova 70-4 Argon Ion Laser, Coherent Inc., Santa Clara, CA)로 514.5 ㎚에서 여기시키고 광자-계수 검출기(모델 R928P, Hamamatsu, Middlesex, NJ)를 갖춘 스캐닝 이중 분광계(Ramalog V/VI, Spex Industries, Edison, NJ) 상에 기록하였다. 1.0 ㎝-1 간격의 데이타를 1.5초의 적분 시간 및 8 ㎝-1의 스펙트럼 슬릿 폭으로 수집하였다. 시료를 반복적으로 스캐닝하고, 개개의 스캔을 표시하고 평균하기 전에 검사하였다. 전형적으로, 4 스캔 이상의 각 시료를 수집하였다. 분광계를 인덴 및 사염화탄소로 보정하였다. 스펙트럼을 스펙트라칼크(SpectraCalc) 및 GRAMS/AI 버전 7 소프트웨어(Thermo Galactic, Salem, NH)를 이용하여 디지탈 상이 방법으로 비교하였다. 스펙트럼을 용매(있다면) 및 배경에 대해 수정하였다. 용액의 스펙트럼을 동일한 조건하에서 0.01M HCl 스펙트럼을 얻어서 보정하고 슬로핑 배경 위에 위치된 일련의 5개의 중복 가우스-로렌츠(Gaussian-Lorentzian) 함수로 적합하였다 [S.-D. Yeo, P.G. Debenedetti, S.Y. Patro, T.M. Przybycien, J. Pharm. Sci., 1994, 83, 1651-1656]. 적합을 1500-1800 ㎝-1 영역에서 수행하였다.
라만 스펙트럼을 분말상 인슐린 시료 및 그들의 각각의 용액 둘다에 대해 얻었다(도 10i). 비가공 시료의 스펙트럼은 이미 기재된 시판 인슐린 시료의 스펙트럼에 아주 잘 해당한다 [S.-D. Yeo, P.G. Debenedetti, S.Y. Patro, T.M. Przybycien, J. Pharm. Sci., 1994, 83, 1651-1656; J.L. Lippert, D. Tyminski, P.J. Desmueles, J. Amer. Chem. Soc., 1976, 98, 7075-7080]. 작은 구형 입자 시료는 단백질의 이차 구조에서의 상당한 동요를 나타내는, 아미드 I 모드의 뚜렷한 (약 +10 내지 +15 ㎝-1) 전이를 나타내었다. 그러나, 시판 분말 및 작은 구형 입자의 스펙트럼은 시료가 수성 매질에 용해될 때 실제로 동일하였으며, 이는 가공시의 이차 구조의 변화가 완전히 가역적이었음을 나타내는 것이다.
형광 및 방향족 배경의 평활 감산, 및 아미드 I 밴드 역상승적분을 포함한 연산 알고리즘을 이용하여 이차 구조 변수를 평가하였다. 지수적 감쇠 형광은 본질적으로 그밖에 설명한 바와 같이 감산하였다 [S.-D. Yeo, P.G. Debenedetti, S.Y. Patro, T.M. Przybycien, J. Pharm. Sci., 1994, 83, 1651-1656]. 평가된 구조적 파라메터를 하기 표 4에 나타내었다.
라만 스펙트럼으로부터 평가된 인슐린 시료의 구조적 파라메터
시료 총 α-나선 함량, % 총 β-시트 함량, % β-리버스 턴, % 랜덤 코일, %
비가공, 분말 44 31 14 11
용액 중 비가공 인슐린 44 28 11 17
작은 구형 입자, 분말 11 67 15 7
용액 중 작은 구형 입자 44 30 11 15
실시예 10: 등온 방법에 의한 인간 인슐린의 작은 구형 입자의 제조
인간 인슐린 USP(Intergen)를 NaCl 및 PEG(MW 3350, 스펙트럼 Lot# RP0741) 용액에 분산시켜 0.86 ㎎/mL의 최종 인슐린 농도, 0.7 wt% NaCl 및 8.3 wt% PEG 농도를 갖게 하였다. 미소량의 빙초산 및 1M NaOH 용액을 첨가하여 pH를 5.65로 조정하였다. T1=77 ℃로 가열한 후에, 맑은 단백질 용액을 얻은 결과 인슐린 농도가 Ceq가 되었다. 그후에, 용액을 일정 속도로 온도 T2=37 ℃로 냉각하였다. T2에서, 단백질 침전을 관찰하였다. 침전물을 37 ℃에서 다시 원심분리시켜 (13,000 x g, 3 분) 제거하여 BCA (bicinchoninic) 단백질 검정법에 의해 결과 상등액 중의 인슐린 농도 (C*)를 0.45 ㎎/mL로 확인하였다. 37 ℃로 유지되는 제조된 인슐린 용액은 용액 A로 칭해진다.
인간 인슐린을 0.7 wt% NaCl/8.3 wt% PEG (HCl 첨가에 의해 pH를 약 2.1로 조정함)에 용해시켜 인슐린 농도가 2 ㎎/mL가 되는 용액 B를 제조하였다. 용액을 7시간 동안 교반시키며 37 ℃에서 인큐베이션하고 이어서 2분 동안 음파처리하였다. 분취량의 결과 용액 B를 용액 A에 첨가하여 총 인슐린 농도가 1 ㎎/mL가 되도록 하였다. 결과 혼합물을 밤새 격렬하게 교반시키며 37 ℃에서 유지한 결과 인슐린 침전물이 생겼으며, 그것을 멤브레인 필터 (유효 공극 직경, 0.22 ㎛)를 이용하여 액체로부터 서서히 제거하였다. 결과 단백질 마이크로입자를 액체 질소에서 급속 냉동시키고 동결건조하였다.
B. 알파-1- 항트립신 ( AAT )의 작은 구형 입자
본 발명은 또한 특히 폐 전달에 적합한 AAT의 작은 구형 입자를 제조하는데 이용될 수 있다.
실시예 11: AAT 작은 구형 입자 (10-300 ㎎ 규모)의 재킷 컬럼 배치 제조
0.02% 플루로닉 F-68 및 16% PEG 3350을 함유하는 lOmM 아세트산 암모늄에 의해 pH 6.0으로 완충된 용액을 재킷 비이커에서 자석식 교반막대로 혼합하고 30 ℃로 가열하였다. 비이커 온도를 순환 수조를 이용하여 조절하였다. 재조합 AAT (rAAT)의 농축 용액을 교반시키면서 이 용액에 첨가하고 pH를 6.0으로 조정하였다. 최종 용액 중 rAAT 농도는 2 ㎎/mL였다. rAAT는 이 온도에서 이 용액 조성물에 완전히 용해되었다. 용기의 전체 내용물을 재킷 컬럼에 옮기고 25-30 ℃로 가열하였다. 컬럼에 대한 순환 수조를 -5 ℃ 구배식으로 셋팅하였다. 컬럼 및 내용물을 약 1 ℃/분의 속도로 약 4 ℃의 온도까지 냉각시켰다. 냉각 단계 중에 rAAT 작은 구형 입자가 형성되었다. 미세구 현탁액을 유리 결정화 접시에서 냉동시키고 동결건조시켜 물 및 완충액을 제거하였다.
동결건조후에 단백질 작은 구형 입자로부터 PEG를 추출하기 위해, PEG/단백질 케이크를 염화 메틸렌 (MeCl2)으로 세척하였다. 이용된 또다른 세척 매질은 염화 메틸렌:아세톤 1:1, 또는 염화 메틸렌:펜탄 1:1이었다. 세척 절차를 원부피 세척액으로 총 3회 반복하였다. 최종 펠릿을 작은 부피의 아세톤 또는 펜탄에 재현탁시키고 질소 가스에 대한 직접 노출에 의해 또는 회전 증발에 의해 건조시켰다.
실시예 12: AAT 작은 구형 입자 (200-2000 ㎎ 규모)의 재킷 용기 배치 제조
이러한 유형의 제조는 재킷 컬럼과 동일한 제제 조성물을 이용하지만 더 큰 부피를 수용하여 실시될 수 있고 대규모화하기에 더욱 적합하다. 이러한 규모에서, 제제를 일반적으로 500-1000 ㎖의 재킷 용기에서 A-형 패들 스타일 임펠러를 이용하여 75 rpm으로 혼합하고 30 ℃로 가열하였다. 용기 온도는 순환 수조를 이용하여 조절하였다. 동일한 용기에서 용액을 유지하고, 수조를 30 ℃ 조에서 2 ℃조로 바꾸었다. 용기 및 내용물을 약 1 ℃/분의 속도로 4 ℃의 온도까지 냉각시켰다. 냉각 단계 중에 rAAT 작은 구형 입자가 형성되었다. 열전대를 이용하여 온도를 모니터링하고, 현탁액이 4 ℃에 도달하였을 때 이 온도에 가깝게 추가로 30분 동안 유지하였다. 유지 단계 후에, 작은 구형 입자 현탁액을 약 4 ℃에서 투석여과를 통해 농축시켜 폴리머 부피의 약 75%를 제거하였다. 남아있는 작은 구형 입자 현탁액을 예비냉각 동결건조 트레이에서 박층으로서 냉동시키고 동결건조시켜 물 및 잔류 완충액을 제거하였다.
유기 용매 (실시예 10에 기재됨)에 의한 원심분리에 의해 또는 초임계 유체 (SCF) 추출에 의해 잔류 건조 폴리머로부터 단백질 작은 구형 입자를 분리하였다. SCF 추출의 경우, 건조된 물질을 고압 추출 챔버에 옮기고, 그것을 CO2에 의해 2500 psi로 (실온에서) 가압하였다. 작동 압력에 도달하면, 에탄올을 70:30 CO2:에탄올 믹스로서 유입 유체 흐름에 도입하였다. 이러한 초임계 유체에 폴리머가 용해되어 작은 구형 입자가 남게 되었다. 공정 말기에 시스템을 에탄올로 세정하고 서서히 감압하였다.
실시예 13: 공정 수율 - rAAT 의 작은 구형 입자로의 전환%
실시예 10 및 11에 기재된 바와 같이 작은 구형 입자를 제조하였다. 냉각 과정을 완결한 후에, 작은 분취량의 현탁액을 제거하고 0.2 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하여 고체 작은 구형 입자를 제거하였다. 용액 중에 남아있는 rAAT인 여액의 흡광도를 UV 분광계를 이용하여 280 ㎚에서 확인하였다. 그후에, rAAT 농도를 표준 곡선에서 계산하였다. 전환%를 다음과 같이 계산하였다:
Figure 112006003194883-PCT00002
* 100% = 전환%
규모 작은 구형 입자로의 전환%
100-200 ㎎ (n=9, 컬럼) 91.7±4.4
300 ㎎ (n=4, 컬럼) 93.4±1.6
2 g (n=5, 용기) 90.4±1.8
상기 표에 나타낸 바와 같이, 고비율의 AAT 단백질을 공정 규모에 상관없이 작은 구형 입자로 전환하였다.
실시예 14: 다른 공정 규모에서 AAT 입자의 입자 크기 분포
에어로사이저 데이타
최종 AAT 건조 분말 작은 구형 입자의 시료를 비행시간 측정에 의해 입자 크기를 측정하는 TSI 에어로사이저 3225에서 분석하였다. 이들 측정으로부터, 다른 비의 체적 직경을 계산하여 AAT 작은 구형 입자의 입자 크기 분포를 증명하고 본 발명과 다른 방법에 의해 제조된 입자와 비교하였다.
규모 d90/d10 (부피) d80/d20 (부피) (d90-d10)/d50 (부피)
5-10 ㎎ (n=12, 컬럼) 1.88±0.20 1.49±0.10 0.67±0.14
100-200 ㎎ (n=5, 컬럼) 1.83±0.05 1.41±0.05 0.66±0.05
300 ㎎ (n=3, 컬럼) 2.05±0.17 1.61±0.11 0.77±0.06
1-2 g (n=4, 용기) 2.21±0.30 1.60±0.11 0.86±0.19
앤더슨 데이타
5-10 ㎎의 시료를 칭량하여 겔 캡슐 내에 넣고 사이클로할러 건조 분말 흡입기를 이용하여 60 리터/분 (LPM)의 유속으로 앤더슨 캐스케이드 임팩터에 투여하였다. 작은 구형 입자를 모든 임팩터 스테이지에서 모으고, 0.2M 트리스-HCl 완충액, pH 8.0에 용해시키고 역상 HPLC를 이용하여 정량화하였다. 미국 약전(USP)에 기재된 바와 같이 데이타를 분석하고 기하학적 표준 편차(GSD)를 계산하였다. 그 데이타는 좁은 크기 분포를 입증하였다.
규모 GSD
100-200 ㎎ (n=5, 컬럼) 1.74±0.22
300 ㎎ (n=3, 컬럼) 1.77±0.40
2 g (n=5, 용기) 1.70±0.09
상기 표에 나타낸 모든 분포 파라메터는 본 발명의 제조 방법으로부터 형성된 우수한 입자 크기 분포를 입증하였다.
실시예 15: AAT 생체활성의 유지
비활성을 측정하기 위해, rAAT 작은 구형 입자를 실온에서 0.2M 트리스-HCl pH 8.0에 용해시켰다. 돼지 췌장 엘라스타제 (PPE)의, C-말단에서 p-니트로아닐리드 기를 함유하는 합성 펩티드 가수분해능을 억제하기 위해 rAAT 용량을 측정하는 검정법에 의해 결과 용액을 분석하였다. rAAT 작은 구형 입자의 동일한 용액을 BCA (Bicinchoninic Acid) 검정법을 이용하여 단백질 농도에 대해 분석하였다. 대조군 rAAT 출발 물질 용액을 또한 두 검정법으로 분석하였다. 활성 검정법이 시료 당 1 ㎎/㎖ 단백질 농도 기준의 활성을 측정하도록 개발되었으므로, 활성 값을 BCA에 의해 결정되는 실제 단백질 농도 기준으로 보정하여 비활성 값을 제공하게 된다.
Figure 112006003194883-PCT00003
= 시료에 대한 비활성
rATT에 의한 돼지 췌장 엘라스타제의 억제
규모 IU/㎎ 작은 구형 입자 IU/㎎ 대조군
100-300 ㎎ (n=12, 컬럼) 64.19±5.01 64.34±4.95
200-300 ㎎ (n=8, 용기) 62.53±5.29 65.87±0.98
따라서 비활성은 AAT를 작은 구형 입자로 제조한 후 생체활성의 유지를 입증하였다.
실시예 16: AAT 구조적 완전성의 유지
제어된 상 분리 (CPS) 기술의 핵심적인 구별점 중의 하나는 입자 형성 중에 수성계를 이용하고 증가된 온도, 전단력 등과 같은 다른 응력 유도 조건을 피하는 온화한 조건하에서 입자를 형성하는 것이다. 입자 가공 분야에서, 주요 관심점은 제조 중의 단백질 안정성 및 저장 안정성이다. 단백질의 산화, 탈아미드화 및 특히 응집과 같은 주요 분해 경로는 면역원성을 비롯한 단백질 제제 부작용의 원인이 되는 것으로 생각된다. 그러므로, 최종 입자 제제 내의 분해 생성물은 아주 적어야 한다. HPLC, 물리 화학적 특징화, 예를 들면 CD 및 DSC를 이용하여 형성 중에 단백질 변형이 일어났는지 확인하였다.
원 편광이색성(CD)는 동요되는 단백질의 구조적 변화의 평가, 또는 가공 단백질과 모 단백질의 구조의 비교에 가장 통상적으로 사용되는 방법이다. CD 방법은 단백질 폴딩, 및 단백질 이차 및 삼차 구조를 평가하는 것이다.
이차 구조는 "원-UV" 스펙트럼 영역(190-250 ㎚)에서의 CD 분광에 의해 확인될 수 있다. 이러한 파장에서, 발색단은 정상적인 폴딩 환경에 놓여질 때의 펩티드 결합이다. 알파-나선, 베타-시트 및 랜덤 코일 구조는 각각 CD 스펙트럼의 특징적인 형태 및 크기를 야기시킨다. 따라서, 임의의 단백질에 존재하는 각각의 이차 구조 유형의 대략의 분율은 그의 원-UV CD 스펙트럼을 각 구조 유형에 대한 그러한 기준 스펙트럼의 분수 배율의 합계로서 분석하여 결정할 수 있다.
"근-UV" 스펙트럼 영역(250-350 ㎚)에서의 단백질의 CD 스펙트럼은 삼차 구조의 특정 면에 대해 민감할 수 있다. 이러한 파장에서, 발색단은 방향족 아미노산 및 이황화 결합이며, 그들이 생산하는 CD 신호는 단백질의 전체 삼차 구조에 대해 민감하다. 250-270 ㎚ 영역에서의 신호는 페닐알라닌 잔기에 대한 것이며, 270-290 ㎚ 영역에서의 신호는 티로신에 대한 것이고, 280-300 ㎚ 영역에서의 신호는 트립토판에 대한 것이다. 이황화 결합은 근-UV 스펙트럼 전체에 대해 광범위한 약한 신호를 발생시킨다.
인산염 완충액 (pH 7.4, T=25 ℃, 단백질 농도 0.05 ㎎/mL) 중의 작은 구형 입자로부터 방출된 AAT 및 rAAT 저장 용액의 원-UV CD 스펙트럼을 도 13에 나타내었다. 각 스펙트럼은 10 스캔의 평균을 나타낸다.
원-UV CD 스펙트럼은 구별되지 않으며, 이는 AAT를 작은 구형 입자로 제조하여 이후 방출 시에 출발 AAT 물질과 동일한 구조를 가진 AAT 분자를 형성함을 입증하는 것이다.
RP - HPLC
작은 구형 입자를 0.2M 트리스-HCl, pH 8.0에 용해시키고 역상 HPLC로 분석하였다. 출발 rAAT 단백질의 대조 용액과 비교할 때, 크로마토그램에서 분명한 차이는 보이지 않았다.
HPLC 시스템:
HPLC 컬럼-페노메넥스 쥬피터(Pheomenex Jupiter), 5 미크론, C4, 300A, 250x4.6 ㎜
워터스 알리앙스(Waters Alliance) 2965 펌프/자동시료주입기
파장 - 280 nm
주입 부피 - 75 μl
농도 구배
이동상 1: 물 중 0.1% TFA
이동상 2: 물 중 90%(c/v) 아세토니트릴 중 0.085% TFA
운전 시간 - 60 분
유속 - 1.0 ㎖/분
DSC
DSC 다이아그램을 얻었다. 도 15-25b 참조.
실시예 17: AAT 출발 물질과 비교한 AAT 작은 구형 입자의 저장 안정성
작은 구형 입자를 실온 및 4 ℃에서 1주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월 및 12개월 동안 저장한 후 생체활성의 유지에 대해 분석하였다(실시예 15에 기재된 검정법을 이용)(도 14b 및 14c). 벌크 재료는 투석되고 그후에 동결건조된 rAAT 출발 용액이다. 각 시점 및 저장 조건에 대해서, 각각 중복 분석된 복제 시료가 존재하였다.
C. 인간 성장 호르몬( hGH )의 작은 구형 입자
본 발명은 또한 hGH의 작은 구형 입자를 제조하는데 이용될 수 있다.
실시예 18: hGH 의 작은 구형 입자의 시험관 배치 제조 (20-50 ㎎ 규모)
용액 중 hGH의 최종 농도가 1 ㎎/㎖인, 18% PEG 3350을 함유하는 pH 5.6으로 완충된 용액(50 mM 아세트산 암모늄/5O mM 중탄산 암모늄)을 50 ㎖ 원추관에서 혼합하고 고정 수조에서 58 ℃로 가열하였다. 이러한 조건하에서 hGH는 용액에 용해되었다. 그후에, 수조에서 관을 꺼내어 용액이 10 ℃에 도달할 때까지 얼음조에서 냉각시켰다. 냉각 속도는 4-6 ℃/분으로 유지되었다. hGH 단백질 작은 구형 입자는 냉각 단계 중에 형성된다. 용액의 온도가 약 40 ℃에 도달하였을 때 작은 구형 입자가 형성되기 시작하였다. 입자 형성후에, 아래에 설명되는 2가지 방법 중의 하나에 의해 hGH 단백질 작은 구형 입자를 PEG로부터 분리하였다.
유기 용매 세척은, 냉각 단계 및 입자 형성후에 작은 구형 입자 현탁액을 액체 질소로 순간 냉동시키고 동결건조시켜 물 및 완충액을 제거하는 것을 필요로 한다. 동결건조 후에 단백질 작은 구형 입자를 PEG로부터 분리하기 위해, PEG/단백질 케이크를 염화 메틸렌(MeCl2)에 현탁시켰다. PEG는 MeCl2에 가용성이지만, 단백질 작은 구형 입자는 불용성이다. 현탁액을 실온에서 5분 동안 혼합하였다. hGH 작은 구형 입자가 MeCl2의 밀도(d=1.335 g/㎖)에 가까우므로, 원심분리를 용이하게 하기 위해 액체 밀도를 더 낮추는 제2 용매가 필요하다. MeCl2와 혼화성인 아세톤을 MeCl2와 동일한 부피로 첨가하였다. 그후에, 작은 구형 입자 현탁액을 실온에서 5분 동안 3300 rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 따라내고, 펠릿을 MeCl2에 재현탁시키고 실온에서 5분 동안 다시 혼합하였다. 이러한 세척 절차는 총 5 세척액으로 반복하였다. 최종 세척후에, 펠릿을 작은 부피의 MeCl2에 재현탁시키고 회전 증발에 의해 건조시킨 결과 hGH 작은 구형 입자의 최종 분말이 남게 되었다.
아연 완충액 세척은, 냉각 단계 및 입자 형성후에 작은 구형 입자 현탁액을 4 ℃에서 10분 동안 4000 rpm으로 원심분리하여 PEG로부터 작은 구형 입자를 분리하는 것을 필요로 하였다. 상등액을 제거하고, 펠릿을 제거된 상등액과 부피가 동일한, 50 mM 아세트산 아연을 함유하는 냉각 완충액에 재현탁시켰다. Zn2 + 이온은 hGH의 용해도를 감소시키고 세척 중의 용해를 방지하였다. 세척 완충액은 얼음 위에서 유지되었다. 그후에, 현탁액을 4 ℃에서 5분 동안 3000 rpm으로 즉시 원심분리시켰다. 상등액을 제거하고 아연 완충액 세척을 총 3회 반복하였다. 3회 아연 완충액 세척 이후에, 펠릿을 물에서 2회 세척하고 4 ℃에서 5분 동안 3000 rpm으로 원심분리시켜 과량의 아연을 제거하였다. 최종 수 세척 이후에, 펠릿을 작은 부피의 물에 재현탁시키고 액체 질소를 이용하여 순간 냉동시켰다. 그후에, 냉동 펠릿을 동결건조시켜 물을 제거한 결과 hGH 작은 구형 입자의 최종 분말이 남게 되었다.
실시예 19: hGH 의 작은 구형 입자의 재킷 용기 배치 제조(100 ㎎ 규모)
이러한 유형의 제조는 실시예 18과 유사한 제제 조성물을 이용하지만 더 큰 부피를 수용하여 실시될 수 있고 대규모화하기에 더욱 적합하다.
0.02% 플루로닉 F-68 및 18% PEG 3350을 함유하는 pH 6.1로 완충된 용액(80 mM 아세트산 암모늄/1O mM 중탄산 암모늄)을 재킷 비이커에서 오버헤드 임펠러를 이용하여 혼합하고 58 ℃로 가열하였다. 순환 수조를 이용하여 혼합물 온도를 조절하였다. hGH의 농축 용액을 교반시키면서 이 용액에 첨가하였다. 용액 중 hGH의 최종 농도는 1 ㎎/mL였다. hGH는 이 온도에서 이 용액 조성물에 완전히 용해되었다. 그후에, 용기 및 내용물을 8 ℃/분의 속도로 약 10 ℃의 온도까지 냉각시켰다. 냉각 단계 중에 hGH 작은 구형 입자가 형성되었다. 약 40 ℃에서 작은 구형 입자가 형성되기 시작하고, 현탁액이 더 냉각될 때 공정을 계속하였다. 냉각 단계 후에, 실시예 20a에 설명되는 2가지 방법 중의 하나에 의해 작은 구형 입자를 PEG로부터 분리하였다.
실시예 20: hGH 의 완전성의 유지
작은 구형 입자 중의 hGH의 단백질 완전성을 공정의 다음 단계에서, 즉, 입자 형성후, PEG 추출후, 및 용매 제거후 또는 건조후에 평가하였다. 작은 구형 입자로 제조한 후의 hGH의 화학적 완전성은 HPLC 분석(크기 배제 크로마토그래피(SEC), 역상(RP))을 이용하여 측정하여 응집 및 분해 생성물을 정량화하였다. 결과는 작은 구형 입자 제조 과정 중에 응집물 또는 기타 관련 물질의 의미있는 축적이 없었음을 입증하였다.
a. 유기 용매 세척
크기 배제에 의한 hGH 응집 : 출발 물질과 비교한 응집 증가
공정 단계 다이머의 증가% HMW 종의 증가%
입자 형성후 1.17 0
PEG 추출 및 건조후 2.67 0.43
역상에 의한 hGH 관련 물질 : 출발 물질과 비교한 분해 증가
공정 단계 초기 용출 종의 증가% 데사미도의 증가% 후기 용출 종의 증가%
입자 형성후 0.22 0.66 0
PEG 추출 및 건조후 1.29 2.93 0
b. 아연 완충액 세척
크기 배제에 의한 hGH 응집 : 출발 물질과 비교한 응집 증가
공정 단계 다이머의 증가% HMW 종의 증가%
입자 형성후 0.88 0
PEG 추출 후 2.25 0
입자 건조후 2.51 0
역상에 의한 hGH 관련 물질 : 출발 물질과 비교한 분해 증가
공정 단계 초기 용출 종의 증가% 데사미도의 증가% 후기 용출 종의 증가%
입자 형성후 0.38 1.91 0.26
PEG 추출후 0.19 1.34 0.26
입자 건조후 0.34 1.58 0.37
실시예 21: hGH 의 작은 구형 입자의 입자 크기 분포
작은 구형 입자의 입자 크기 분포를 TSI 에어로사이저를 이용한 공기역학적 비행시간 측정에 의해 (도 26) 또한 주사 전자 현미경에 의해 (도 27) 특징화하였다.
실시예 22: hGH 작은 구형 입자의 용해 역학
2가지의 다른 추출 절차에 노출된 hGH 작은 구형 입자의 용해 역학을 비교하였다.
유기 용매로 세척된 hGH 작은 구형 입자는 hGH 출발 물질과 유사한 수성 매질에 바로 용해되었다.
hGH 작은 구형 입자를 아연 완충액으로 세척하였을 때, 용해도가 감소하였다 (도 28). hGH 작은 구형 입자의 용해는 37 ℃에서 10 mM 트리스, 154 mM NaCl, 0.05% Brij 35, pH 7.5에서 수행하였다. 시험관내 다른 매질에서 단백질의 더욱 완전한 방출이 이루어졌다. 용해 역학은 총 hGH의 약 30%가 처음 15분 내에 방출되고, 약 50%가 처음 24시간 내에 방출되었음을 입증하였다. 단백질 방출은 1개월에 완결되었다. 작은 구형 입자 용해가 2상 방식으로 진행됨으로써 생체내에서 약간의 지연 방출이 이루어질 수 있다.
D. 리소자임 작은 구형 입자
실시예 23: 리소자임의 작은 구형 입자의 제조
1.6 ㎎/㎖ 리소자임, 13.2% PEG 3350, 55 mM 아세트산 암모늄 pH 9.5, 53 mM 황산 암모늄, 263 mM 염화 나트륨, 26 mM 염화 칼슘의 용액.
PEG 및 완충액을 40 ℃로 가열하였다(pH 9.55). 형성된 현탁액을 액체 질소로 순간 냉동시키고 매니폴드 동결건조기에서 동결건조시켰다. 작은 구형 입자를 형성하였다.
E. DNase 작은 구형 입자
실시예 24: DNase 의 작은 구형 입자의 제조
배합예: 0.18 ㎎/㎖ DNase(저장 용액 1 ㎎/㎖로부터), 18.2% PEG 3350(저장 용액 25%로부터), 9 mM 아세트산 암모늄, pH 5.15(저장 용액 1 M로부터).
이 현탁액을 -80 ℃ 냉동기에서 냉각시키고, 일단 냉동되면 매니폴드 동결건조기에서 동결건조시키고, 이후에 MeCl2/아세톤으로 원심분리시켜 세척하였다.
시험된 초기 농도는 0.1 ㎎/㎖ DNase 및 20% PEG 3350이었다. 침전물을 얻지 않고 37 ℃에서 0 ℃로 냉각시킨 후에, 또다른 양의 DNase를 첨가하여 상기 농도를 얻었다. 이 용액을 -80 ℃ 냉동기에서 냉각시키고, 일단 냉동되면 매니폴드 동결건조기에서 동결건조시켰다. MeCl2/아세톤으로 원심분리시켜 세척하였다. 시험된 초기 농도는 0.1 ㎎/㎖ DNase 및 20% PEG 3350이었다. 침전물을 얻지 않고 37 ℃에서 0 ℃로 냉각시킨 후에, 또다른 양의 DNase를 첨가하여 상기 농도를 얻었다. 이 용액을 -80 ℃ 냉동기에서 냉각시키고, 일단 냉동되면 매니폴드 동결건조기에서 동결건조시켰다. MeCl2/아세톤으로 원심분리시켜 세척하였다 (도 37, 38).
활성 (Sigma로부터 구입한 DNA-메틸 그린을 이용한 DNase-I에 대한 분석).
출발 물질에 대한 이론적 활성은 775 Ku/㎎ 단백질로서 기록된다. 저장 용액은 0.145 ㎎/㎖ 단백질인 것으로 확인되었다. 이 농도는 5 ㎖로 희석되어 최종 농도가 0.0199 ㎎/㎖가 되었다. 활성은 775 Ku/㎎ * 0.0199 ㎎/㎖ = 15.46 Ku/㎖이어야 한다.
쿠니츠(Kunitz) 단위/용액 ㎖
= 미지의 X40X 희석 인자의 분 당 ΔA640 / 기지의 인자의 분 당 ΔA640
Ku/㎖ = -0.0004 x 40 x 1/-0.0011 = 14.55 Ku/㎖
이론치에 대한 비교:
작은 구형 입자/이론치*100% = 활성%
14.55 Ku/㎖ / 15.46 Ku/㎖ * 100% = 94.1%
F. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 작은 구형 입자
실시예 25: 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 작은 구형 입자의 제조
수산화 암모늄 및 아세트산으로 조정된, 0.68 ㎎/㎖ SOD(저장 용액 5 ㎎/㎖로부터), 24.15% PEG 3350(저장 용액 31.25%로부터), 9.1 mM 아세트산 암모늄(저장 용액 1 M로부터), 최종 pH =4.99의 용액. 이 용액을 50분에 걸쳐 40 ℃에서 0 ℃로 냉각시키고 (~0.8 ℃/분) 25 ℃ 부근에서 침전이 시작되었다. 현탁액을 액체 질소로 순간 냉동시키고 매니폴드 동결건조기에서 동결건조시키고, 이후에 MeCl2/아세톤으로 원심분리시켜 세척하였다 (도 39, 40).
50분에 걸쳐 40 ℃에서 0 ℃로 냉각시켰다(~0.8 ℃/분). 25 ℃ 부근에서 침전이 시작되었다. 액체 질소로 순간 냉동시키고 매니폴드 동결건조기에서 동결건조시켰다. MeCl2/아세톤으로 원심분리시켜 세척하였다. 작은 구형 입자를 형성하고 대부분의 아세톤은 보유되었다.
G. 서브틸리신 작은 구형 입자
실시예 26: 비- 폴리머 상 분리 개선제를 이용한 서브틸리신 작은 구형 입자
초기 시스템의 연속상은 냉각 중 단백질의 상 분리를 유도하기 위해 비-폴리머 상 분리 개선제를 함유할 수 있다. 서브틸리신 작은 구형 입자는 임의의 폴리머를 사용하지 않고 프로필렌 글리콜과 에탄올의 혼합물을 이용하여 본 발명에 따라서 형성될 수 있다. 이 시스템에서 프로필렌 글리콜은 빙점강하제로서 작용하며 에탄올은 상 분리 개선제로서 작용한다. 프로필렌 글리콜은 또한 작은 구형 입자의 구 형태의 형성을 돕는다.
35% 프로필렌 글리콜 - 10% 포르메이트 - 0.02% CaCl2 중 20 ㎎/㎖ 서브틸리신 용액을 제조하였다. 그후에, 35% 프로필렌 글리콜 - 서브틸리신 용액을 혼합하면서 67% 에탄올에 넣었다. 용액은 실온에서 맑은 상태로 남았다. 그러나, 1시간 동안 -20 ℃로 냉각될 때, 입자 현탁액이 형성되었다. 원심분리하여 입자를 수집하고 90% 에탄올로 세척한 후에, 현탁 유체로서 무수 에탄올을 사용하여 코울터 입자 크기 분석을 실시하였다. 입자는 2.2 미크론의 평균 직경을 가진 분리 입자와 일치하는 코울터 결과를 나타내었으며 입자의 95%는 0.46 내지 3.94 미크론이었다. 광 현미경 평가에 의해 이들 결과가 실질적으로 구형 입자를 나타냄을 확인하였다. 입자의 SEM 분석으로 코울터 결과를 확인하였다.
작은 구형 입자의 형성 후 서브틸리신 효소 활성의 유지
용액 중의 서브틸리신을 서브틸리신 작은 구형 입자로 전환시킨 후 효소 활성의 유지를 비색분석법에 의해 확인하였다. 작은 구형 입자에 대한 활성의 이론적 총 단위는 냉각 전 에탄올-서브틸리신-프로필렌 글리콜 용액에서 분석되는 서브틸리신의 총 단위로부터 상등액에 존재하는 총 단위(서브틸리신 입자의 분리후)를 감하여 계산하였다. 서브틸리신 작은 구형 입자에 대해 존재하는 실제 총 단위를 이론적 단위로 나누어 백분율로 표시한 것은 입자 형성후 서브틸리신 활성의 유지를 나타낸다. 이러한 계산에 의해, 서브틸리신 작은 구형 입자의 형성후에 107%의 이론적 서브틸리신 활성이 유지되었다.
H. 탄수화물 작은 구형 입자
실시예 27: 탄수화물 작은 구형 입자의 형성
본 발명은 탄수화물 작은 구형 입자의 제조에 적용될 수 있다. 시스템 냉각 중 PEG 상과 덱스트란 상 사이에 상 분리가 유도될 수 있다. 각종 분자량, 예를 들면 5K, 40K, 144K 및 500K의 덱스트란이 사용될 수 있다. 30% PEG 300 중의 5 ㎎/㎖ 덱스트란 40K의 혼합물을 35 ℃에서 평형화하고, 그후에 혼합물을 0 ℃로 냉각하고 동결건조하였다. 혼합물을 염화 메틸렌:아세톤(1:1)으로 세척하고 원심분리하여 입자를 수확하였다. 도 49에서 알 수 있는 바와 같이, 작은 구형 입자가 형성되었다. 이 방법을 이용하여 다른 탄수화물, 예를 들면 전분, 히드록시에틸 전분, 트레할로스, 락토스, 만니톨, 소르비톨, 히알로스, 덱스트란 설페이트 등을 작은 구형 입자로 제조할 수 있다.
I. 미리제조된 작은 구형 입자의 마이크로캡슐화
실시예 28: PLGA -캡슐화된 미리제조된 인슐린 작은 구형 입자의 제조
a) 폴리락티드-코-글리콜리드(PLGA, MW 35k) 1600 ㎎을 염화 메틸렌에 용해시켜 20%(w/v) 폴리머 용액(8 ㎖)을 제조하였다. 이 용액에 인슐린 작은 구형 입자(INSms) 100 ㎎을 첨가하고, 회전자/고정자 균질화기를 이용하여 11k rpm으로 매질을 격렬하게 혼합하여 균질 현탁액을 얻었다. 연속상은 염화 메틸렌으로 포화된 0.02% 메틸셀룰로스 수용액 (24 ㎖)으로 이루어졌다. 연속상은 동일한 균질화기를 이용하여 11k rpm으로 혼합하고, 기재된 현탁액을 매질에 서서히 주입하여 유기상의 초기 마이크로캡슐화 입자를 형성하였다. 이 유탁액은 1:3의 O/W 비를 갖는다. 유화는 5분 동안 계속되었다. 다음에, 유탁액을 150 ㎖ 탈이온 (DI) 수로 이루어진 경화 매질에 바로 옮기고, 그동안 매질을 400 rpm에서 교반시켰다. 유기 용매를 -0.7 bar에서 감압하에 1시간에 걸쳐 추출하였다. 경화된 마이크로캡슐화 입자를 여과시켜 수집하고 물로 세척하였다. 세척된 마이크로캡슐화 입자를 동결건조시켜 과량의 물을 제거하였다. 형성된 마이크로캡슐화 입자는 약 30 ㎛의 평균 입자 크기를 가지며, 입자의 대부분은 90 ㎛ 미만이고, 5.7%(w/w) 인슐린을 함유하였다.
b) 50:50 폴리락티드-코-글리콜리드(PLGA, MW 35k) 1200 ㎎을 염화 메틸렌에 용해시켜 30%(w/v) 폴리머 용액(4 ㎖)을 제조하였다. 다음에, 기재된 폴리머 용액 중의 100 ㎎ INSms의 현탁액을 균질화기를 이용하여 제조하였다. 이 현탁액을 이용하여 실시예 28에 기재된 바와 같은 메틸셀룰로스의 0.02% 수용액 12 ㎖ 중의 O/W 유탁액을 형성하였다 (W/O 비 = 1:3). 실시예 28과 동일한 절차에 따라서 최종 마이크로캡슐화 입자를 제조하였다. 형성된 마이크로캡슐화 입자는 25 ㎛의 평균 입자 크기를 가지며, 입자 크기 범위는 0.8 내지 60 ㎛였다. 이들 마이크로캡슐화 입자의 인슐린 함량은 8.8%(w/w)였다.
다르게는, 폴리머의 10%(w/v) 용액을 이용하여 기재된 동일한 조건하에서 마이크로캡슐화 공정을 수행하였다. 이 방법에 의해 약 12 ㎛의 평균 입자 크기를 가지며, 입자의 대부분이 50 ㎛ 미만이고, 21.1%(w/w) 인슐린을 함유하는 마이크로캡슐화 입자가 형성되었다.
시험관내 방출 방법
37 ℃에서 인큐베이션된, 3 ㎎ 당량의 캡슐화 인슐린을 함유하는 유리 바이알에 방출 완충액 10 ㎖(10 mM 트리스, 0.05% Brij 35, 0.9% NaCl, pH 7.4)를 첨가하여 마이크로캡슐화 입자로부터 인슐린의 시험관내 방출(IVR)을 실시하였다. 정해진 시간 간격으로, 400 μL의 IVR 매질을 미세원침관에 옮기고 13k rpm에서 2분 동안 원심분리시켰다. 상부 300 μL의 상등액을 제거하고 분석할 때까지 -80 ℃에서 저장하였다. 취해진 부피를 새로운 매질 300 μL로 대체하고, 그것을 나머지 상등액 (100 μL)과 함께 사용하여 팰릿을 재구성하였다. 현탁액을 해당하는 시험관내 방출 매질로 다시 옮겼다.
실시예 29: PLGA / PLA 알로이 기질 시스템 내의 미리제조된 인슐린 작은 구형 입자의 마이크로캡슐화 절차
PLGA/PLA 알로이의 30%(w/v) 용액을 염화 메틸렌(4 ㎖)에서 제조하였다. 알로이는 각각 40, 54 및 6%(0.48, 0.68 및 0.07g)의 50:50 PLGA(MW 35k), D,L-폴리락트산(PLA, MW 19k) 및 폴리 L-PLA(PLLA, MW 180k)로 이루어졌다. 실시예 28b와 동일한 절차에 따라서 최종 마이크로캡슐화 입자를 제조하였다. 마이크로캡슐화 입자의 예는 0.8 내지 120 ㎛의 입자 크기 범위를 가지며, 평균이 40 ㎛이고 입자의 대부분은 90 ㎛보다 작다.
실시예 30: 연속 및 불연속 상에 PEG 를 사용하는, PLGA 기질 시스템 내의 미리제조된 인슐린 작은 구형 입자의 마이크로캡슐화 절차
4 ㎖의 10% 50:50 PLGA(0.4 g) 및 25% 폴리에틸렌 글리콜(PEG, MW 8k)의 용액을 염화 메틸렌에서 제조하였다. 회전자/고정자 균질화기를 이용하여, INSms 100 ㎎을 이 용액에 11k rpm으로 현탁시켰다. 연속상은 염화 메틸렌으로 포화된 0.02%(w/v) 메틸셀룰로스 및 25% PEG(MK 8k)의 수용액 (12 ㎖)으로 이루어졌다. 연속상은 동일한 균질화기를 이용하여 11k rpm으로 혼합하고, 기재된 현탁액을 매질에 서서히 주입하여 유기상의 초기 마이크로캡슐화 입자를 형성하였다. 이 유탁액은 1:3의 O/W 비를 갖는다. 유화는 5분 동안 계속되었다. 다음에, 유탁액을 150 ㎖ DI 수로 이루어진 경화 매질에 바로 옮기고, 그동안 매질을 400 rpm에서 교반시켰다. 유기 용매를 -0.7 bar에서 감압하에 1시간에 걸쳐 추출하였다. 경화된 마이크로캡슐화 입자를 여과시켜 모으고 물로 세척하였다. 세척된 마이크로캡슐화 입자를 동결건조시켜 과량의 물을 제거하였다. 이 실시예의 마이크로캡슐화 입자는 약 30 ㎛의 평균 입자 크기를 가지며, 입자 크기 범위는 2 내지 90 ㎛이고, 입자의 대부분은 70 ㎛ 미만이었다. 이들 미세구의 인슐린 함량은 16.0%(w/w)였다.
실시예 31: 인산염 완충액을 이용하는, 연속상의 각종 pH 에서 PLGA 기질 시스템 내의 미리제조된 인슐린 작은 구형 입자의 마이크로캡슐화 절차
4 ㎖의 20% 50:50 35 kD PLGA(0.8 g)의 용액을 염화 메틸렌에서 제조하였다. 회전자/고정자 균질화기를 이용하여, INSms 100 ㎎을 이 용액에 11k rpm으로 현탁시켰다. 연속상은 0.1%(w/v) 메틸셀룰로스 및 pH 2.5, 5.4 및 7.8의 50mM 인산염 완충액으로 이루어졌다. 연속 셋업을 이용하여 마이크로캡슐화를 실시하였다 (도 41A). 연속상은 11k rpm으로 혼합하고, 12 ㎖/분으로 유화 챔버내에 공급하였다. 분산된 상을 2.7 ㎖/분으로 챔버에 주입하여 초기 마이크로캡슐화 입자를 형성하였다. 생성된 유탁액을 챔버로부터 회수하여 연속 방식으로 경화 조에 옮겼다. 경화 매질을 400 rpm에서 교반시켰다. 유기 용매를 -0.4 bar에서 감압하에 1시간에 걸쳐 추출하였다. 경화된 마이크로캡슐화 입자를 여과시켜 모으고 물로 세척하였다. 세척된 마이크로캡슐화 입자를 동결건조시켜 과량의 물을 제거하였다.
pH 2.5, 5.4 및 7.8에서 제조된 결과 마이크로캡슐화 입자의 인슐린 함량은 각각 12.5, 11.5 및 10.9로 평가되었다. 마이크로캡슐화 입자의 크기 분포 분석의 결과는 표 5에 요약하였다.
연속 상의 각종 pH에서 제조된 인슐린 함유 PLGA 마이크로캡슐화 입자의 크기 분포
입자 크기(㎛)
연속상의 pH 범위 평균 95% 아래 5% 아래
2.5 1.4-54 24 35.9 13.8
5.4 0.9-46 23 33.8 11.8
7.8 0.8-25 11 16.0 5.7
시험관내 방출 방법
37 ℃에서 인큐베이션된, 3 ㎎ 당량의 캡슐화 인슐린을 함유하는 유리 바이알에 방출 완충액 10 ㎖(10 mM 트리스, 0.05% Brij 35, 0.9% NaCl, pH 7.4)를 첨가하여 마이크로캡슐화 입자로부터 인슐린의 시험관내 방출을 실시하였다. 정해진 시간 간격으로, 400 μL의 IVR 매질을 미세원침관에 옮기고 13k rpm에서 2분 동안 원심분리시켰다. 상부 300 μL의 상등액을 제거하고 분석할 때까지 -80 ℃에서 저장하였다. 취해진 부피를 새로운 매질 300 μL로 대체하고, 그것을 나머지 상등액 (100 μL)과 함께 사용하여 팰릿을 재구성하였다. 현탁액을 해당하는 시험관내 방출 매질로 다시 옮겼다.
상기 제조의 시험관내 방출 (IVR) 결과를 도 44에 나타내고, 이는 제제로부터 인슐린의 방출 역학에 대한 연속 상의 pH의 의미있는 효과를 나타낸다.
실시예 32: PLLA 또는 PLLA / PEG 기질 시스템 내의 미리제조된 인간 혈청 알부민(HSA) 작은 구형 입자의 마이크로캡슐화 절차
2 ㎖의 25%(w/v, 500 ㎎) PEG (MW 3k 또는 8k)의 용액을 염화 메틸렌에서 제조하였다. 회전자/고정자 균질화기를 11k rpm으로 이용하고 PEG 용액 또는 2 ㎖의 염화 메틸렌을 이용하여 50 ㎎ 미리제조된 인간 혈청 알부민 작은 구형 입자(HSAms)의 현탁액을 얻었다. 이 현탁액에 염화 메틸렌 중의 4% PLLA(80 ㎎, MW 180k) 2 ㎖를 첨가하고, 매질을 11-27k rpm에서 균질화하여 유기상을 형성하였다. 연속상은 염화 메틸렌으로 포화된 메틸셀룰로스의 0.02% 수용액 12 ㎖로 이루어졌다. 연속상을 11k rpm으로 격렬하게 혼합하여 유화를 개시하고, 이어서 유기상을 점차적으로 주입하였다. 매질을 5분 동안 유화시키고, 그후에 유탁액을 400 rpm에서 혼합시키며 150 ㎖ DI 수에 옮겼다. 기재된 절차 모두를 4 ℃에서 수행하였다. 그후에, 경화 매질을 실온으로 옮기고 유기 용매를 -0.7 bar에서 감압하에 1시간에 걸쳐 추출하였다. 경화된 마이크로캡슐화 입자를 여과시켜 모으고 물로 세척하였다. 세척된 마이크로캡슐화 입자를 동결건조시켜 과량의 물을 제거하였다. 상기 제제로부터 HSA의 IVR에 대한 PEG의 채널링 효과는 도 42에 나타내어져 있다.
시험관내 방출 방법
37 ℃에서 인큐베이션된, 2.5 ㎎ 당량의 캡슐화 HSA를 함유하는 15 ㎖ 폴리프로필렌 원심분리관에 방출 완충액 10 ㎖(20 mM HEPES, 0.01% Tween-80, 0.1M NaCl, 1mM CaCl2, pH 7.4)를 첨가하여 캡슐화된 마이크로캡슐화 입자로부터 HSA의 시험관내 방출(IVR)을 실시하였다. 시료 채취 절차를 실시예 31에 기재하였다.
실시예 33: PLGA -캡슐화된 미리제조된 류프롤리드 / 덱스트란 설페이트 작은 구형 입자의 제조
50:50 폴리락티드-코-글리콜리드(PLGA, MW 35k) 1200 ㎎을 염화 메틸렌에 용해시켜 30%(w/v) 폴리머 용액(4 ㎖)을 제조하였다. 다음에, 50 ㎎의 류프롤리드를 함유하는 미리제조된 류프릴리드/덱스트란 설페이트 작은 구형 입자(LDS) 65.9 ㎎을 균질화기를 사용하여 기재된 폴리머 용액에 현탁시켰다. 이 현탁액을 이용하여 실시예 28에 기재된 바와 같은 메틸셀룰로스의 0.02% 수용액 12 ㎖ 중의 O/W 유탁액을 형성하였다 (W/O 비 = 1:3). 실시예 28b와 동일한 절차에 따라서 최종 마이크로캡슐화 입자를 제조하였다.
마이크로캡슐화 입자는 20 ㎛의 평균 입자 크기를 가지며, 그의 대부분은 50 ㎛ 미만이었다. 마이크로캡슐화 입자로부터 류프롤리드의 IVR의 결과는 도 43에 예시되어 있다.
시험관내 방출 방법
37 ℃에서 인큐베이션된, 2.5 ㎎ 당량의 캡슐화 류프롤리드를 함유하는 15 ㎖ 폴리프로필렌 원심분리관에 방출 완충액 15 ㎖(10 mM Na-인산염 완충액, 0.01% Tween-80, 0.9% NaCl, 0.04% NaN3, pH 7.4)를 첨가하여 마이크로캡슐화 입자로부터 류프롤리드의 시험관내 방출(IVR)을 실시하였다. 시료 채취 절차는 실시예 28에 기재되어 있다.
실시예 34: PLGA -캡슐화된 미리제조된 재조합 인간 성장 호르몬 작은 구형 입자의 제조
PLGA-PEG 0.4 g을 염화 메틸렌에 용해시켜 10%(w/v) 폴리머 용액(4 ㎖)을 제조하였다. 다음에, 100 ㎎의 미리제조된 재조합 인간 성장 호르몬 작은 구형 입자(hGHms)를 균질화기를 사용하여 기재된 폴리머 용액에 현탁시켰다. 연속상은 0.1%(w/v) 메틸셀룰로스 및 pH 7.0의 50mM 인산염 완충액의 수용액으로 이루어졌다. 실시예 31에 기재된 바와 같이 연속 셋업을 이용하여 마이크로캡슐화를 실시하였다 (도 41A). 이들 마이크로캡슐화 입자의 평균 입자 크기는 25 ㎛이며, 입자 크기 범위는 1 내지 60 ㎛였다. 폴리머 기질로부터의 hGH의 IVR 프로파일은 도 45에 예시되어 있다.
시험관내 방출 방법
마이크로캡슐화 입자로부터의 hGH의 IVR은 실시예 28에 기재된 바와 같이 이루어진다.
실시예 35: 마이크로캡슐화된 미리제조된 인슐린 작은 구형 입자의 완전성의 측정
캡슐화된 미리제조된 인슐린 작은 구형 입자의 완전성에 대한 마이크로캡슐화 방법의 효과를 평가하기 위해, 미리제조된 INSms를 함유하는 폴리머 마이크로캡슐화 입자를 2상 이중 추출법을 이용하여 추출제거하였다. 캡슐화 INSms의 칭량된 시료를 염화 메틸렌에 현탁시키고 서서히 혼합하여 폴리머 기질을 용해시켰다. 단백질을 추출하기 위해, 0.01N HCl을 첨가하고 두 상을 혼합하여 유탁액을 형성하였다. 그후에, 두 상을 분리하고, 수성상을 제거하고 동일한 용액으로 보충하고 추출법을 반복하였다. 추출된 인슐린의 완전성을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 측정하였다. 이 방법은 추출 매질 내의 INS의 모노머, 다이머 및 고분자량(HMW) 종의 확대를 확인한다. 적절한 대조군을 이용하여 INS의 완전성에 대한 추출제거 방법의 효과를 확인하였다. 그 결과는 INS 완전성에 대한 이 방법의 의미있는 효과를 나타내지 않았다.
캡슐화된 INSms는 원 INSms(비캡슐화) 내의 99.13% 모노머 함량과 비교하여 마이크로캡슐화 방법의 조건 및 내용물에 따라서 단백질의 97.5-98.94% 모노머를 함유하였다. 캡슐화 INSms 내의 다이머 종의 함량은 원 INSms 내의 0.85%에 비해 1.04% 내지 1.99%의 범위였다. 캡슐화 INSms의 HMW 함량 범위는 원 INSms 내의 0.02%에 비해 0.02% 내지 0.06%였다. 결과는 표 6에 요약되어 있다. 폴리머 기질의 효과는 도 46 및 47에 도시되어 있다.
캡슐화된 미리제조된 인슐린 작은 구형 입자의 완전성에 대한 마이크로캡슐화 방법의 효과
모노머(%) 다이머(%) HMW(%)
비캡슐화 INSms 99.13 0.85 0.02
캡슐화 INSms 97.5-98.94 1.04-1.99 0.02-0.06
실시예 36: 마이크로캡슐화된 미리제조된 인슐린 작은 구형 입자로부터의 생체내 인슐린 방출
미리제조된 인슐린 작은 구형 입자의 마이크로캡슐화 입자로부터의 인슐린의 생체내 방출을 스프라그 다울리(SD) 래트에서 연구하였다. 동물에게 비캡슐화 또는 캡슐화된 미리제조된 인슐린 작은 구형 입자를 1 IU/㎏의 초기 피하 용량으로 투여하였다. ELISA를 이용하여 수집된 시료에서의 재조합 인간 인슐린(rhINS) 혈청 농도를 확인하였다. 그 결과를 도 48에 예시하였다.
특정 실시태양이 예시되고 설명되어 있지만, 수많은 변형이 본 발명의 취지에서 벗어나지 않고 이루어지며 보호 범위는 첨부된 청구 범위의 영역에 의해서만 제한된다.

Claims (77)

  1. 활성제, 상 분리 개선제 및 제1 용매를 포함하는 단일 액상 용액을 제공하고;
    활성제의 액체-고체 상 분리를 야기시켜, 실질적으로 구형인 고체의 작은 구형 활성제 입자를 포함하는 고상 및 상 분리 개선제와 용매를 포함하는 액상을 형성하도록, 용액에서 제어된 속도로 상 변화를 유도하는
    것을 포함하는, 활성제의 작은 구형 입자의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 유도 단계가 용액의 온도를 조정하고, 활성제의 농도를 조정하고, 상 분리 개선제의 농도를 조정하고, 용액의 이온 강도를 조정하고, pH를 조정하고 용액의 삼투질 농도를 조정하는 것으로 이루어진 군에서 선택되는 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상 변화가 활성제의 농도 변화에 의해 유도되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상 변화가 상 분리 개선제의 농도 변화에 의해 유도되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 용액이 상 전이 온도, 제1 온도 및 제2 온도를 가지며, 용 액을 상 변화되게 하는 단계가 용액을 그 용액의 상 전이 온도 이상인 제1 온도에서 용액의 상 전이 온도 아래인 제2 온도로 냉각시키는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 제2 온도가 용액의 빙점 이상인 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 제2 온도가 용액의 빙점 아래인 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 냉각 단계가 제어 속도에서 이루어지는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 제어 속도가 약 0.2 ℃/분 내지 약 50 ℃/분을 포함하는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 제어 속도가 약 0.2 ℃/분 내지 약 30 ℃/분을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 용액을 제공하는 단계가
    상 분리 개선제를 제1 용매에 용해시켜 혼합물을 형성하고;
    활성제를 혼합물에 첨가하여 용액을 형성하는
    것을 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 활성제를 혼합물에 첨가하기 전에 제1 용매 또는 제1 용매와 혼화성인 제2 용매에 활성제를 용해시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  13. 제6항에 있어서, 용액이 그 용액의 빙점을 더 낮추기 위해 빙점강하제를 더 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 빙점강하제가 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상 분리 개선제가 수용성 또는 수혼화성 제제인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상 분리 개선제가 선형 또는 분지 폴리머, 탄수화물계 폴리머, 폴리지방족 알콜, 폴리(비닐) 폴리머, 폴리아크릴산, 폴리유기산, 폴리아미노산, 코폴리머 및 블록 코폴리머, tert-폴리머, 폴리에테르, 천연 폴리머, 폴리이미드, 계면활성제, 폴리에스테르, 분지 및 시클로-폴리머, 및 폴리알데히드, 전분, 치환 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴록사머, 에탄올, 아세톤 및 이소프로판올로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, PSEA가 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 작은 구형 입자의 안정성을 향상시키거나 작은 구형 입자에 제어된 방출을 제공하거나 또는 생물 조직을 통한 작은 구형 입자의 투과를 향상시키기 위해, 작은 구형 입자가 부형제를 더 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 부형제가 탄수화물, 양이온, 음이온, 아미노산, 지질, 지방산, 계면활성제, 트리글리세리드, 담즙산 또는 그들의 염, 지방산 에스테르 및 폴리머로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 양이온이 Zn2 +, Mg2 + 및 Ca2 +로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 담즙산이 콜레이트 또는 그의 염인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 작은 구형 입자를 수확하는 단계를 더 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 작은 구형 입자를 수확하는 단계가 활성제가 액상 매질에 가용성이 아니고 상 분리 개선제가 액상 매질에 가용성인 온도에서 입자를 액상 매질로 세척하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 세척 단계가 투석여과 또는 원심분리에 의한 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 액상 매질이 수성 또는 유기 매질인 방법.
  26. 제23항에 있어서, 액상 매질이 초임계 유체 또는 초임계 유체와 초임계 유체 혼화성 용매의 혼합물인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 유기 액상 매질이 염화 메틸렌, 클로로포름, 아세토니트레이트, 에틸아세테이트, 에탄올 및 펜탄으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  28. 제23항에 있어서, 액상 매질이 액상 매질 내의 활성제의 용해도를 감소시키는 제제를 더 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 액상 매질 내의 활성제의 용해도를 감소시키는 제제가 착화 이온을 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 양이온이 Zn2 +, Ca2 +, Fe2 +, Mg2 +, Mn2 +, Na+ 및 NH4 +로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  31. 제23항에 있어서, 액상 매질을 제거하는 단계를 더 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 액상 매질을 제거하는 단계가 동결건조, 건조 또는 증발에 의한 것인 방법.
  33. 제23항에 있어서, 액상 매질이 부형제를 더 포함하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 부형제가 작은 구형 입자의 안정성을 향상시키거나 작은 구형 입자에 제어된 방출을 제공하거나 또는 생물 조직을 통한 작은 구형 입자의 투과를 향상시키는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 부형제가 탄수화물, 양이온, 음이온, 아미노산, 지질, 지방산, 계면활성제, 트리글리세리드, 담즙산 또는 그들의 염, 지방산 에스테르 및 폴리머로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 양이온이 Zn2 +, Mg2 + 및 Ca2 +로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 부형제가 콜레이트 또는 그의 염인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 폴리머가 폴리에틸렌 글리콜인 방법.
  39. 제1항에 있어서, 용액이 수성 또는 수혼화성 용매를 포함하는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 수혼화성 용매가 N-메틸-2-피롤리디논(N-메틸-2-피롤리돈), 2-피롤리디논(2-피롤리돈), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논(DMI), 디메틸술폭시드, 디메틸아세트아미드, 아세트산, 락트산, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 3-펜탄올, n-프로판올, 벤질 알콜, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG-4, PEG-8, PEG-9, PEG-12, PEG-14, PEG-16, PEG-120, PEG-75, PEG-150, 폴리에틸렌 글리콜 에스테르, PEG-4 디라우레이트, PEG-20 디라우레이트, PEG-6 이소스테아레이트, PEG-8 팔미토스테아레이트, PEG-150 팔미토스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄, PEG-20 소르비탄 이소스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜 모노알킬 에테르, PEG-3 디메틸 에테르, PEG-4 디메틸 에테르, 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 폴리프로필렌 알기네이트, PPG-10 부탄디올, PPG-10 메틸 글루코스 에테르, PPG-20 메틸 글루코스 에테르, PPG-15 스테아릴 에테르, 프로필렌 글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트, 프로필렌 글리콜 라우레이트 및 글리코푸롤(테트라히드로푸르푸릴 알콜 폴리에틸렌 글리콜 에테르) 또는 그들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  41. 제1항에 있어서, 활성제가 제약 활성제인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 제약 활성제 화합물이 치료제, 진단제, 화장품, 영양 보충제 및 농약으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  43. 제1항에 있어서, 활성제가 거대분자인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 거대분자가 단백질, 폴리펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 및 핵산으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 단백질이 혈액응고 기전의 단백질, 팩터 VII, 팩터 VIII, 팩터 IX, 서브틸리신, 오브알부민, 알파-1-안티트립신, DNAse, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 리소자임, 리보뉴클레아제, 히아루로니다제, 콜라게나제, 성장 호르몬, 에리트로포에틴, 인슐린유사 성장 인자 또는 그들의 유사체, 인터페론, 글라티라머, 과립세포-대식세포 집락형성 촉진 인자, 과립세포 집락형성 촉진 인자, 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, Fab 단편, 단쇄 항체, PEG화 단백질, 당화 또는 초당화 단백질, 데스모프레신, LHRH 작용제, 예를 들면 류프롤리드, 고세렐린, 나파렐린, 부세렐린, LHRH 길항제, 바소프레신, 시클로스포린, 칼시토닌, 부갑상선 호르몬, 부갑상선 호르몬 펩티드 및 인슐린으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  46. 제1항에 있어서, 입자가 치료제 필요 대상에게 생체내 전달하기에 적합한 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 전달 방법이 주사용, 흡입용, 비경구, 국소, 경구, 직장, 비강, 폐, 질, 협측, 설하, 경피, 경점막, 귀, 안구, 안내 및 안과용으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 전달 방법이 폐 전달에 의한 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 입자가 대상의 폐의 중심 또는 말초 부분에 침착하기에 적합한 것인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 입자가 건조 분말 흡입기, 정량식 흡입기 및 연무기로 이루어진 군에서 선택되는 장치에 의해 전달되는 것인 방법.
  51. 제46항에 있어서, 입자가 적당한 액체 현탁액으로서 전달되는 것인 방법.
  52. 제1항에 있어서, 입자가 실질적으로 동일한 입자 크기를 갖는 것인 방법.
  53. 제1항에 있어서, 입자가 약 0.01 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 평균 입자 크기를 갖 는 것인 방법.
  54. 제1항에 있어서, 입자가 약 0.5 ㎛ 내지 약 10 ㎛의 평균 입자 크기를 갖는 것인 방법.
  55. 제1항에 있어서, 활성제가 입자의 약 0.1 내지 약 100 중량%인 방법.
  56. 제1항에 있어서, 활성제가 입자의 약 75 내지 약 100 중량%인 방법.
  57. 제1항에 있어서, 활성제가 입자의 90 중량% 이상인 방법.
  58. 제1항에 있어서, 작은 구형 입자가 좁은 크기 분포를 갖는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 좁은 크기 분포가 작은 구형 입자의 90분위의 체적 직경 대 10분위의 체적 직경의 비가 약 5 이하인 것인 방법.
  60. 제1항에 있어서, 작은 구형 입자가 반결정성 또는 비결정성인 것인 방법.
  61. 활성제 및 상 분리 개선제를 수성 또는 수혼화성 용매에 용해시켜 단일 연속상의 용액을 형성하는 단계; 및
    활성제의 액체-고체 상 분리를 야기시켜 고체의 작은 구형 활성제 입자를 포함하는 고상 및 상 분리 개선제의 액상을 형성하도록 상 변화를 유도하는 단계
    를 포함하는, 활성제의 작은 구형 입자의 제조 방법.
  62. 제61항에 있어서, 용액이 상 전이 온도, 제1 온도 및 제2 온도를 가지며, 용액을 상 변화되게 하는 단계가 용액을 상 전이 온도 이상인 제1 온도에서 상 전이 온도 아래인 제2 온도로 냉각시키는 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 제어된 속도가 약 0.2 ℃/분 내지 약 50 ℃/분인 것인 방법.
  64. 실질적으로 구형이고, 좁은 크기 분포 및 약 0.5 내지 약 2 g/㎤의 밀도를 갖는 고체, 구형 치료제 입자를 포함하는, 생체내 전달을 위한 치료제의 작은 입자.
  65. 제64항에 있어서, 고체의 작은 구형 입자가 약 0.5 내지 약 1.5 g/㎤의 밀도를 갖는 것인 입자.
  66. 제64항에 있어서, 고체의 작은 구형 입자가 0.75 g/㎤보다 큰 밀도를 갖는 것인 입자.
  67. 제64항에 있어서, 고체의 작은 구형 입자가 0.85 g/㎤보다 큰 밀도를 갖는 것인 입자.
  68. 제64항에 있어서, 고체의 작은 구형 입자가 실질적으로 비다공성인 것인 입자.
  69. 제64항에 있어서, 고체의 작은 구형 입자의 안정성을 향상시키거나 고체의 작은 구형 입자의 제어된 방출을 제공하거나 또는 생물 조직을 통한 고체의 작은 구형 입자의 투과를 향상시키기 위해, 고체의 작은 구형 입자가 부형제를 더 포함하는 것인 입자.
  70. 제64항에 있어서, 부형제가 탄수화물, 양이온, 음이온, 아미노산, 지질, 지방산, 계면활성제, 트리글리세리드, 담즙산 또는 그들의 염, 지방산 에스테르 및 폴리머로 이루어진 군에서 선택되는 것인 입자.
  71. 제64항에 있어서, 양이온이 Zn2 +, Mg2 + 및 Ca2 +로 이루어진 군에서 선택되는 것인 입자.
  72. 제64항에 있어서, 작은 구형 입자가 각각 길이를 갖는 2개의 횡축을 가지며, 두 축의 길이의 비가 약 1.5 이하인 것인 입자.
  73. 제64항에 있어서, 작은 구형 입자가 약 0.01 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 평균 크기를 갖는 것인 입자.
  74. 제64항에 있어서, 작은 구형 입자가 약 0.1 ㎛ 내지 약 10 ㎛의 평균 크기를 갖는 것인 입자.
  75. 제64항에 있어서, 작은 구형 입자가 약 0.1 ㎛ 내지 약 5 ㎛의 평균 크기를 갖는 것인 입자.
  76. 제76항에 있어서, 좁은 크기 분포가 작은 구형 입자의 90분위의 체적 직경 대 10분위의 체적 직경의 비가 약 5 이하인 것인 입자.
  77. 제64항에 있어서, 작은 구형 입자가 반결정성 또는 비결정성인 것인 입자.
KR1020067001079A 2003-07-18 2004-07-19 제어된 상 분리에 의해 제조된 작은 구형 입자의 제조방법, 이용 방법 및 조성물 KR101137785B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48871203P 2003-07-18 2003-07-18
US60/488,712 2003-07-18
PCT/US2004/023182 WO2005035088A2 (en) 2003-07-18 2004-07-19 Method for preparing small spherical by controlled phase separation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060039003A true KR20060039003A (ko) 2006-05-04
KR101137785B1 KR101137785B1 (ko) 2012-04-25

Family

ID=34434818

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067001079A KR101137785B1 (ko) 2003-07-18 2004-07-19 제어된 상 분리에 의해 제조된 작은 구형 입자의 제조방법, 이용 방법 및 조성물

Country Status (15)

Country Link
US (4) US20050233945A1 (ko)
EP (1) EP1646445A4 (ko)
JP (1) JP2007531701A (ko)
KR (1) KR101137785B1 (ko)
CN (1) CN1826170B (ko)
AU (1) AU2004280158B2 (ko)
BR (1) BRPI0412735A (ko)
CA (1) CA2532837A1 (ko)
IL (1) IL172546A (ko)
MX (1) MXPA06000720A (ko)
NO (1) NO20060796L (ko)
RU (1) RU2426590C2 (ko)
SG (1) SG135204A1 (ko)
WO (1) WO2005035088A2 (ko)
ZA (1) ZA200600515B (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105163739A (zh) * 2012-12-21 2015-12-16 株式会社先端医疗开发 组合物及饮食

Families Citing this family (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6458387B1 (en) * 1999-10-18 2002-10-01 Epic Therapeutics, Inc. Sustained release microspheres
ES2326209T3 (es) 2000-10-27 2009-10-05 Baxter Healthcare S.A. Produccion de microesferas.
EP1418890B1 (en) * 2001-08-16 2008-05-14 Baxter International Inc. Propellant-based microparticle formulations
US20080026068A1 (en) * 2001-08-16 2008-01-31 Baxter Healthcare S.A. Pulmonary delivery of spherical insulin microparticles
KR101137785B1 (ko) 2003-07-18 2012-04-25 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 제어된 상 분리에 의해 제조된 작은 구형 입자의 제조방법, 이용 방법 및 조성물
US20050142205A1 (en) * 2003-07-18 2005-06-30 Julia Rashba-Step Methods for encapsulating small spherical particles prepared by controlled phase separation
AU2004258971A1 (en) * 2003-07-22 2005-02-03 Baxter Healthcare S.A. Small spherical particles of low molecular weight organic molecules and methods of preparation and use thereof
US8728525B2 (en) * 2004-05-12 2014-05-20 Baxter International Inc. Protein microspheres retaining pharmacokinetic and pharmacodynamic properties
MXPA06012992A (es) * 2004-05-12 2007-02-12 Baxter Int Microesferas que comprenden proteina y que muestran inyectabilidad en altas concentraciones de este agente.
CA2566199C (en) * 2004-05-12 2013-10-22 Baxter International Inc. Delivery of as-oligonucleotide microspheres to induce dendritic cell tolerance for the treatment of autoimmune type 1 diabetes
PT1765294E (pt) 2004-05-12 2008-12-30 Baxter Healthcare Sa Microesferas de ácido nucleico, sua produção e entrega
CA2575916A1 (en) * 2004-08-04 2006-02-16 Allos Therapeutics, Inc. Methods and compositions to reduce tissue irritation in parenteral formulations
CN101188996B (zh) * 2005-04-27 2013-03-27 巴克斯特国际公司 表面改性的微粒及其形成和使用方法
AU2006304757A1 (en) * 2005-10-20 2007-04-26 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Intranasal administration of rapid acting insulin
JP5457680B2 (ja) 2006-01-24 2014-04-02 アンサン バイオファーマ，インコーポレイテッド 高分子マイクロスフェアの調製技術
US20070281031A1 (en) * 2006-06-01 2007-12-06 Guohan Yang Microparticles and methods for production thereof
JP5098225B2 (ja) * 2006-06-09 2012-12-12 東レ株式会社 親水性活性物質含有微粒子の製造方法
MX2009001226A (es) 2006-08-04 2009-03-20 Baxter Int Composicion basada en microesferas para prevenir y/o revertir la diabetes autoinmune de nuevo inicio.
AU2007319577A1 (en) * 2006-10-06 2008-05-22 Baxter Healthcare S.A. Microencapsules containing surface-modified microparticles and methods of forming and using the same
CA2682135A1 (en) 2007-04-17 2008-10-30 Baxter International Inc. Nucleic acid microparticles for pulmonary delivery
US9044385B2 (en) * 2007-05-16 2015-06-02 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Therapeutic compositions for targeted vessel delivery
DK2170283T3 (en) 2007-06-22 2019-04-15 Univ Texas CREATION OF STABLE SUBMICRON Peptide OR PROTEIN PARTICLES BY THIN FILM FREEZING
RU2010102865A (ru) * 2007-07-24 2011-08-27 НексБио, Инк. (US) Технология изготовления микрочастиц
KR100845009B1 (ko) * 2007-08-07 2008-07-08 한국생명공학연구원 전하를 띠는 물질이 고착된 다공성 고분자 입자 및 그제조방법
EP2212412A4 (en) * 2007-10-15 2011-03-09 Biogen Idec Inc METHODS OF MANUFACTURING A BIOLOGICAL PRODUCT USING AN INTERMEDIATE STABLE STORAGE PRODUCT
WO2009137689A2 (en) * 2008-05-07 2009-11-12 Surmodics, Inc. Delivery of nucleic acid complexes from particles
US20090297621A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Microparticles For The Treatment Of Disease
GB0812742D0 (en) 2008-07-11 2008-08-20 Critical Pharmaceuticals Ltd Process
US20100047292A1 (en) * 2008-08-20 2010-02-25 Baxter International Inc. Methods of processing microparticles and compositions produced thereby
US8323615B2 (en) * 2008-08-20 2012-12-04 Baxter International Inc. Methods of processing multi-phasic dispersions
US8367427B2 (en) * 2008-08-20 2013-02-05 Baxter International Inc. Methods of processing compositions containing microparticles
US8323685B2 (en) * 2008-08-20 2012-12-04 Baxter International Inc. Methods of processing compositions containing microparticles
WO2010030763A2 (en) * 2008-09-10 2010-03-18 Bind Biosciences, Inc. High throughput fabrication of nanoparticles
WO2010033878A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 David Brown Solute concentration measurement device and related methods
JP5711138B2 (ja) 2008-11-16 2015-04-30 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 高濃度の低粘度懸濁液
EP2379059A4 (en) * 2008-12-10 2012-10-31 Anhui Zhongren Technology Co Ltd COMPOSITION WITH CONTROLLED RELEASE
KR102165021B1 (ko) 2008-12-19 2020-10-14 박스알타 인코퍼레이티드 Tfpi 억제제 및 사용 방법
AR075628A1 (es) * 2009-02-26 2011-04-20 Valent Biosciences Corp Composiciones liquidas y granuladas estables y de bajo contenido de voc (compuestos organicos volatiles) que regulan el crecimiento vegetal
AU2010217760B2 (en) 2009-02-27 2015-04-09 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for determination of flow reservoir volume
US9250106B2 (en) 2009-02-27 2016-02-02 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for determination of flow reservoir volume
EP2429503A1 (en) * 2009-05-13 2012-03-21 Protein Delivery Solutions, LLC Pharmaceutical system for trans-membrane delivery
SG10201505101VA (en) 2009-05-19 2015-07-30 Neuroderm Ltd Compositions For Continuous Administration Of Dopa Decarboxylase Inhibitors
ITMI20091049A1 (it) * 2009-06-12 2010-12-13 Finser S P A Metodo e dispositivo di produzione di sacchetti a fondo rettangolare
KR100924236B1 (ko) * 2009-06-23 2009-10-29 충남대학교산학협력단 균일한 입도분포를 가지는 초미세입자의 신규한 제조방법 및 장치
EP3284494A1 (en) 2009-07-30 2018-02-21 Tandem Diabetes Care, Inc. Portable infusion pump system
CN107184954A (zh) * 2010-01-04 2017-09-22 Mapi医药公司 包含格拉默或其药用盐的储药系统
USRE49251E1 (en) 2010-01-04 2022-10-18 Mapi Pharma Ltd. Depot systems comprising glatiramer or pharmacologically acceptable salt thereof
JP5730983B2 (ja) 2010-03-19 2015-06-10 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ Ｔｆｐｉ阻害剤および使用方法
US8632846B2 (en) * 2010-09-17 2014-01-21 Medtronic Vascular, Inc. Apparatus and methods for loading a drug eluting medical device
HUE037005T2 (hu) 2010-11-15 2018-08-28 Neuroderm Ltd L-dopának, dopa dekarboxiláz inhibitoroknak, katechol-O-metil transzferáz inhibitoroknak és ezekhez szolgáló kompozícióknak folyamatos bevezetése
WO2012089622A2 (en) * 2010-12-27 2012-07-05 Intervet International B.V. Topical localized isoxazoline formulation
WO2012089623A1 (en) * 2010-12-27 2012-07-05 Intervet International B.V. Topical localized isoxazoline formulation comprising glycofurol
WO2012138419A1 (en) * 2011-04-04 2012-10-11 Georgia Tech Research Corporation Mof nanocrystals
US8821616B2 (en) 2011-04-04 2014-09-02 Georgia Tech Research Corporation Zeolite DDR nanoparticles
WO2012138418A1 (en) 2011-04-04 2012-10-11 Georgia Tech Research Corporation Zeolite ddr nanocrystals
WO2012143924A1 (en) 2011-04-21 2012-10-26 Mapi Pharma Ltd. Random pentapolymer for treatment of autoimmune diseases
KR20140034842A (ko) * 2011-05-26 2014-03-20 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 알파₁-항트립신 활성을 측정하기 위한 고체상-결합된 엘라스타제-결합 분석법
CN103301788B (zh) * 2012-03-09 2015-09-02 中国科学院大连化学物理研究所 Peg接枝改性的海藻酸盐-壳聚糖微胶囊及制备和应用
SI2827883T1 (sl) 2012-03-21 2019-08-30 Baxalta GmbH Inhibitorji TFPI in postopki uporabe
RU2518449C2 (ru) * 2012-04-19 2014-06-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова Министерства сельского хозяйства Российской Федерации Способ получения микрокапсул пестицидов физико-химическим способом
US9180242B2 (en) 2012-05-17 2015-11-10 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for multiple fluid transfer
US9375678B2 (en) 2012-05-25 2016-06-28 Georgia Tech Research Corporation Metal-organic framework supported on porous polymer
ES2715028T3 (es) 2012-06-05 2019-05-31 Neuroderm Ltd Composiciones que comprenden apomorfina y ácidos orgánicos y sus usos
US9360408B2 (en) 2012-06-20 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Methods of measuring effective density of nanoparticle agglomerates dispersed in a liquid using centrifugation
EP2866792A4 (en) 2012-06-28 2016-08-17 Ansun Biopharma Inc MICROPARTICLE FORMULATIONS FOR DELIVERY TO LOWER AND CENTRAL RESPIRATORY PATHS AND METHOD OF PREPARING THEM
CN102697738B (zh) * 2012-06-28 2014-03-05 华侨大学 二氧化碳流体抗溶剂法制备多孔微球的方法
CN102830222B (zh) * 2012-09-20 2014-11-26 成都斯马特科技有限公司 一种固体颗粒状生化试剂的制备方法
US9757395B2 (en) 2012-12-20 2017-09-12 Otitopic Inc. Dry powder inhaler and methods of use
US9757529B2 (en) 2012-12-20 2017-09-12 Otitopic Inc. Dry powder inhaler and methods of use
MX371067B (es) * 2012-12-24 2020-01-15 Softkemo Pharma Corp Composicion de cabazitaxel.
US9173998B2 (en) 2013-03-14 2015-11-03 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for detecting occlusions in an infusion pump
EP2991634A1 (en) 2013-04-30 2016-03-09 Otitopic Inc. Dry powder formulations and methods of use
US9994501B2 (en) 2013-05-07 2018-06-12 Georgia Tech Research Corporation High efficiency, high performance metal-organic framework (MOF) membranes in hollow fibers and tubular modules
US9687791B2 (en) 2013-05-07 2017-06-27 Georgia Tech Research Corporation Flow processing and characterization of metal-organic framework (MOF) membranes in hollow fiber and tubular modules
EP4119131A1 (en) 2014-02-20 2023-01-18 Otitopic Inc. Dry powder formulations for inhalation
US10022320B2 (en) 2014-03-13 2018-07-17 Neuroderm, Ltd. Dopa decarboxylase inhibitor compositions
US10258585B2 (en) 2014-03-13 2019-04-16 Neuroderm, Ltd. DOPA decarboxylase inhibitor compositions
BR112017000175B1 (pt) * 2014-07-08 2023-11-21 Amphastar Pharmaceuticals,Inc. Método de preparação de uma insulina inalável adequada para a liberação pulmonar e partículas de insulina micronizadas
CN104198717B (zh) * 2014-08-30 2016-04-06 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球及其制备方法
MX2017005692A (es) 2014-10-31 2017-08-07 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Formulacion en polvo.
CN114365792A (zh) 2014-11-11 2022-04-19 克莱拉食品公司 用于生成卵清蛋白的方法和组合物
US9155775B1 (en) 2015-01-28 2015-10-13 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Process for manufacturing glatiramer acetate product
US9925233B2 (en) 2015-01-30 2018-03-27 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US9687526B2 (en) 2015-01-30 2017-06-27 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US9744209B2 (en) 2015-01-30 2017-08-29 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US9750785B2 (en) 2015-01-30 2017-09-05 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US9744239B2 (en) 2015-01-30 2017-08-29 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US9937223B2 (en) 2015-01-30 2018-04-10 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US10322168B2 (en) 2016-01-07 2019-06-18 Amphastar Pharmaceuticals, Inc. High-purity inhalable particles of insulin and insulin analogues, and high-efficiency methods of manufacturing the same
CN105963258B (zh) 2016-04-26 2021-01-22 广州帝奇医药技术有限公司 一种缓释微粒的制备方法
RU2647466C1 (ru) * 2016-12-01 2018-03-15 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет" (СПбГУ) Способ получения нативного белка пролонгирующего действия в составе полимерных наносфер и резорбируемых микросфер для доставки
KR101942449B1 (ko) * 2016-12-13 2019-01-28 주식회사 삼양바이오팜 생분해성 고분자의 다공성 미립자, 및 이를 포함하는 고분자 필러
KR20180103666A (ko) 2017-03-09 2018-09-19 (주)엘지하우시스 열가소성 폴리우레탄 시트 및 이의 제조방법
CN110382052A (zh) 2017-03-26 2019-10-25 Mapi医药公司 用于治疗进展型形式的多发性硬化症的格拉替雷储库系统
EP3638312B1 (en) * 2017-06-12 2024-02-21 Elgan Pharma Ltd. Multiparticulate granulate comprising insulin
CN108704588B (zh) * 2018-06-29 2020-10-09 广西壮族自治区林业科学研究院 一种微胶囊化酸性水溶液的制备方法
WO2020018058A2 (en) * 2018-07-16 2020-01-23 Arven Ilac Sanayi Ve Ticaret Anonim Sirketi The injectable micronized human insulin
CN110064344B (zh) * 2018-09-07 2023-03-28 中北大学 具有高热稳定性的叶酸超分子有机凝胶
WO2020115283A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Baxalta GmbH Bispecific antibodies binding factor ixa and factor x
WO2020114615A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Baxalta GmbH Bispecific antibodies binding factor ixa and factor x
KR20220034848A (ko) 2019-07-11 2022-03-18 클라라 푸드즈 컴퍼니 단백질 조성물 및 이의 섭취 가능한 제품
US10927360B1 (en) 2019-08-07 2021-02-23 Clara Foods Co. Compositions comprising digestive enzymes
RU2738451C1 (ru) * 2020-02-06 2020-12-14 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) Устройство для получения радиоактивного аэрозоля для диагностики заболеваний легких
CN111978073B (zh) * 2020-09-04 2021-07-06 山东大学 基于微流控芯片制备新月形陶瓷颗粒的装置、方法及应用
US11844754B2 (en) 2020-11-17 2023-12-19 Neuroderm, Ltd. Methods for treatment of Parkinson's disease
US11213502B1 (en) 2020-11-17 2022-01-04 Neuroderm, Ltd. Method for treatment of parkinson's disease
US11331293B1 (en) 2020-11-17 2022-05-17 Neuroderm, Ltd. Method for treatment of Parkinson's disease
WO2022251709A1 (en) * 2021-05-28 2022-12-01 Natural Extraction Systems, LLC Bioactive biphasic compositions
CN113769164B (zh) * 2021-09-24 2022-05-17 杭州科腾生物制品有限公司 一种聚己内酯微球及其制备方法和用途
CN114345252B (zh) * 2021-12-28 2022-09-02 华熙生物科技股份有限公司 一种聚合物微球及其制备方法
WO2023200363A1 (ru) * 2022-04-13 2023-10-19 Фания Иршатовна МАГАНОВА Способ получения пероральной формы субстанции, содержащей инсулин
CN115920793A (zh) * 2022-12-28 2023-04-07 江苏海洋大学 一种血管紧张素转化酶ace功能化磁性纳米微球的制备及其应用

Family Cites Families (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3102077A (en) * 1953-08-19 1963-08-27 Christensen Henry Marinus Preparation of insulin containing 2.75 to 8 percent zinc content
DE2010115A1 (de) * 1970-03-04 1971-09-16 Farbenfabriken Bayer Ag, 5090 Leverkusen Verfahren zur Herstellung von Mikrogranulaten
JPS523342B2 (ko) * 1972-01-26 1977-01-27
JPS5515681A (en) * 1978-07-21 1980-02-02 Kuraray Co Ltd Production of microcapsule
US4389330A (en) 1980-10-06 1983-06-21 Stolle Research And Development Corporation Microencapsulation process
US4530840A (en) * 1982-07-29 1985-07-23 The Stolle Research And Development Corporation Injectable, long-acting microparticle formulation for the delivery of anti-inflammatory agents
JPS60100516A (ja) * 1983-11-04 1985-06-04 Takeda Chem Ind Ltd 徐放型マイクロカプセルの製造法
US4818542A (en) * 1983-11-14 1989-04-04 The University Of Kentucky Research Foundation Porous microspheres for drug delivery and methods for making same
US5417986A (en) * 1984-03-16 1995-05-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Vaccines against diseases caused by enteropathogenic organisms using antigens encapsulated within biodegradable-biocompatible microspheres
DE3678308D1 (de) * 1985-02-07 1991-05-02 Takeda Chemical Industries Ltd Verfahren zur herstellung von mikrokapseln.
JP2551756B2 (ja) * 1985-05-07 1996-11-06 武田薬品工業株式会社 ポリオキシカルボン酸エステルおよびその製造法
US4681627A (en) * 1985-06-03 1987-07-21 Mitsubishi Kinzoku Kabushiki Kaisha Process for preparing an ingot from metal scrap
US5102872A (en) 1985-09-20 1992-04-07 Cetus Corporation Controlled-release formulations of interleukin-2
GB8601100D0 (en) 1986-01-17 1986-02-19 Cosmas Damian Ltd Drug delivery system
EP0248531A3 (en) 1986-05-02 1988-09-28 Southern Research Institute Encapsulated nucleic acids
AU612591B2 (en) * 1986-08-11 1991-07-18 Innovata Biomed Limited Pharmaceutical formulations comprising microcapsules
US5075109A (en) * 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
CS261131B1 (en) * 1986-12-22 1989-01-12 Antonin Svoboda Moistening equipment
US5985354A (en) * 1995-06-07 1999-11-16 Brown University Research Foundation Preparation of multiwall polymeric microcapsules from hydrophilic polymers
US4861627A (en) 1987-05-01 1989-08-29 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of multiwall polymeric microcapsules
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
US4853462A (en) * 1988-03-21 1989-08-01 Arco Chemical Technology, Inc. Preparation of discrete particles of polyalkylene carbonate
US5422120A (en) * 1988-05-30 1995-06-06 Depotech Corporation Heterovesicular liposomes
IL92344A0 (en) 1989-01-04 1990-07-26 Gist Brocades Nv Microencapsulation of bioactive substances in biocompatible polymers,microcapsules obtained and pharmaceutical preparation comprising said microcapsules
GB8903593D0 (en) * 1989-02-16 1989-04-05 Pafra Ltd Storage of materials
USRE38385E1 (en) * 1989-02-16 2004-01-13 Nektar Therapeutics Storage of materials
ATE133087T1 (de) * 1989-05-04 1996-02-15 Southern Res Inst Einkapselungsverfahren
MY107937A (en) * 1990-02-13 1996-06-29 Takeda Chemical Industries Ltd Prolonged release microcapsules.
ATE226091T1 (de) * 1990-05-16 2002-11-15 Southern Res Inst Mikrokapseln mit gesteuerter freigabe sowie deren verwendung zur stimulierung des nervenfaserwachstums
GB9016885D0 (en) * 1990-08-01 1990-09-12 Scras Sustained release pharmaceutical compositions
US5149543A (en) * 1990-10-05 1992-09-22 Massachusetts Institute Of Technology Ionically cross-linked polymeric microcapsules
WO1992014449A1 (en) * 1991-02-20 1992-09-03 Nova Pharmaceutical Corporation Controlled release microparticulate delivery system for proteins
US5993805A (en) * 1991-04-10 1999-11-30 Quadrant Healthcare (Uk) Limited Spray-dried microparticles and their use as therapeutic vehicles
US5330768A (en) * 1991-07-05 1994-07-19 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery using polymer/pluronic blends
US6063910A (en) * 1991-11-14 2000-05-16 The Trustees Of Princeton University Preparation of protein microparticles by supercritical fluid precipitation
US5525519A (en) * 1992-01-07 1996-06-11 Middlesex Sciences, Inc. Method for isolating biomolecules from a biological sample with linear polymers
US5173454A (en) * 1992-01-09 1992-12-22 Corning Incorporated Nanocrystalline materials
US5912015A (en) * 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
JP2651320B2 (ja) 1992-07-16 1997-09-10 田辺製薬株式会社 徐放性マイクロスフェア製剤の製造方法
JP3277342B2 (ja) * 1992-09-02 2002-04-22 武田薬品工業株式会社 徐放性マイクロカプセルの製造法
EP0595030A3 (en) * 1992-10-01 1995-06-07 Tanabe Seiyaku Co Composition of microspheres with several delayed release nuclei and its preparation process.
ATE195652T1 (de) 1992-12-02 2000-09-15 Alkermes Inc Wachstumhormon enthaltende mikrosphaeren mit kontrollierter freisetzung
ATE258685T1 (de) * 1993-03-09 2004-02-15 Baxter Int Makromolekulare mikropartikel und verfahren zur ihrer herstellung
US6090925A (en) 1993-03-09 2000-07-18 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
US5981719A (en) * 1993-03-09 1999-11-09 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
IS1796B (is) 1993-06-24 2001-12-31 Ab Astra Fjölpeptíð lyfjablanda til innöndunar sem einnig inniheldur eykjaefnasamband
US5543158A (en) * 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
AU693821B2 (en) 1993-11-18 1998-07-09 Sirtex Medical Limited Controlled release preparation
ATE212830T1 (de) 1993-11-19 2002-02-15 Alkermes Inc Herstellung biologisch abbaubarer, einen biologisch aktiven stoff enthaltender, mikropartikel
US5650173A (en) * 1993-11-19 1997-07-22 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Preparation of biodegradable microparticles containing a biologically active agent
CZ92497A3 (en) 1994-09-29 1997-08-13 Andaris Ltd Micro-particles of water soluble material intended for use in therapy or diagnosis, inhaling apparatus containing such particles and application of a therapeutical agent
US6387399B1 (en) 1994-12-02 2002-05-14 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Microencapsulated bioactive agents and method of making
US5780014A (en) * 1995-04-14 1998-07-14 Inhale Therapeutic Systems Method and apparatus for pulmonary administration of dry powder alpha 1-antitrypsin
DK0828495T3 (da) 1995-06-01 2003-02-24 Searle & Co Misoprostolholdige faste stabiliserede dispersioner
SE505146C2 (sv) * 1995-10-19 1997-06-30 Biogram Ab Partiklar för fördröjd frisättning
US5665428A (en) * 1995-10-25 1997-09-09 Macromed, Inc. Preparation of peptide containing biodegradable microspheres by melt process
US6270795B1 (en) * 1995-11-09 2001-08-07 Microbiological Research Authority Method of making microencapsulated DNA for vaccination and gene therapy
CA2192782C (en) * 1995-12-15 2008-10-14 Nobuyuki Takechi Production of microspheres
US6395302B1 (en) * 1996-11-19 2002-05-28 Octoplus B.V. Method for the preparation of microspheres which contain colloidal systems
US5945126A (en) * 1997-02-13 1999-08-31 Oakwood Laboratories L.L.C. Continuous microsphere process
BR9811793A (pt) * 1997-07-18 2000-09-26 Infimed Inc MacrÈmeros biodegradáveis para a liberação controlada de substâncias biologicamente ativas.
US6042792A (en) * 1997-09-18 2000-03-28 International Flavors & Fragrances Inc. Apparatus for preparing a solid phase microparticulate composition
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) * 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
JPH11302156A (ja) 1998-04-16 1999-11-02 Tanabe Seiyaku Co Ltd ポリペプチドの微粒子化方法
US6395253B2 (en) * 1998-04-23 2002-05-28 The Regents Of The University Of Michigan Microspheres containing condensed polyanionic bioactive agents and methods for their production
CA2330476A1 (en) * 1998-04-27 1999-11-04 Altus Biologics Inc. Stabilized protein crystals, formulations containing them and methods of making them
EP2311436A1 (en) 1998-04-27 2011-04-20 Altus Pharmaceuticals Inc. Stabilized protein crystals, formulations containing them and methods of making them
US6270802B1 (en) * 1998-10-28 2001-08-07 Oakwood Laboratories L.L.C. Method and apparatus for formulating microspheres and microcapsules
US6194006B1 (en) * 1998-12-30 2001-02-27 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Preparation of microparticles having a selected release profile
US6365173B1 (en) * 1999-01-14 2002-04-02 Efrat Biopolymers Ltd. Stereocomplex polymeric carriers for drug delivery
ATE248587T1 (de) * 1999-06-14 2003-09-15 Baxter Int Mikrosphären mit verzögerter wirkstoffabgabe
US6458387B1 (en) * 1999-10-18 2002-10-01 Epic Therapeutics, Inc. Sustained release microspheres
FR2809309B1 (fr) * 2000-05-23 2004-06-11 Mainelab Microspheres a liberation prolongee pour administration injectable
KR100392501B1 (ko) * 2000-06-28 2003-07-22 동국제약 주식회사 다중 에멀젼법에 의한 서방출성 미립구의 제조방법
US6795068B1 (en) * 2000-07-21 2004-09-21 Sony Computer Entertainment Inc. Prop input device and method for mapping an object from a two-dimensional camera image to a three-dimensional space for controlling action in a game program
US6471995B1 (en) * 2000-09-27 2002-10-29 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Ii Apparatus and method for preparing microparticles using liquid-liquid extraction
KR20030040532A (ko) * 2000-10-12 2003-05-22 다나베 세이야꾸 가부시키가이샤 폴리펩티드의 미립자화 방법
JP3928399B2 (ja) * 2000-10-12 2007-06-13 田辺製薬株式会社 ポリペプチドの微粒子化方法
SE518007C2 (sv) * 2000-11-16 2002-08-13 Bioglan Ab Förfarande för framställning av mikropartiklar
CA2429100A1 (en) * 2000-11-16 2002-05-23 Jagotec Ag Parenterally administrable microparticles
IL156310A0 (en) * 2000-12-22 2004-01-04 Baxter Int Method for preparing submicron particle suspensions
US6896905B2 (en) * 2001-02-15 2005-05-24 Rohm And Haas Company Porous particles, their aqueous dispersions, and method of preparation
AU2002322295C1 (en) 2001-06-21 2008-12-18 Altus Pharmaceuticals Inc. Spherical protein particles and methods of making and using them
EP1418890B1 (en) * 2001-08-16 2008-05-14 Baxter International Inc. Propellant-based microparticle formulations
US20080026068A1 (en) * 2001-08-16 2008-01-31 Baxter Healthcare S.A. Pulmonary delivery of spherical insulin microparticles
US20070092452A1 (en) 2003-07-18 2007-04-26 Julia Rashba-Step Methods for fabrication, uses, compositions of inhalable spherical particles
US20050142205A1 (en) * 2003-07-18 2005-06-30 Julia Rashba-Step Methods for encapsulating small spherical particles prepared by controlled phase separation
KR101137785B1 (ko) 2003-07-18 2012-04-25 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 제어된 상 분리에 의해 제조된 작은 구형 입자의 제조방법, 이용 방법 및 조성물
MXPA06012992A (es) 2004-05-12 2007-02-12 Baxter Int Microesferas que comprenden proteina y que muestran inyectabilidad en altas concentraciones de este agente.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105163739A (zh) * 2012-12-21 2015-12-16 株式会社先端医疗开发 组合物及饮食

Also Published As

Publication number Publication date
SG135204A1 (en) 2007-09-28
CN1826170B (zh) 2010-12-08
MXPA06000720A (es) 2006-08-23
AU2004280158A1 (en) 2005-04-21
IL172546A (en) 2011-03-31
EP1646445A2 (en) 2006-04-19
WO2005035088A2 (en) 2005-04-21
US20050142206A1 (en) 2005-06-30
IL172546A0 (en) 2006-04-10
US20050147687A1 (en) 2005-07-07
RU2006105019A (ru) 2007-08-27
US20050142201A1 (en) 2005-06-30
CA2532837A1 (en) 2005-04-21
EP1646445A4 (en) 2007-09-19
BRPI0412735A (pt) 2006-09-26
KR101137785B1 (ko) 2012-04-25
ZA200600515B (en) 2006-12-27
US8075919B2 (en) 2011-12-13
JP2007531701A (ja) 2007-11-08
US20050233945A1 (en) 2005-10-20
NO20060796L (no) 2006-02-17
CN1826170A (zh) 2006-08-30
WO2005035088A3 (en) 2005-12-15
AU2004280158B2 (en) 2011-02-17
RU2426590C2 (ru) 2011-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101137785B1 (ko) 제어된 상 분리에 의해 제조된 작은 구형 입자의 제조방법, 이용 방법 및 조성물
US20050142205A1 (en) Methods for encapsulating small spherical particles prepared by controlled phase separation
US20080026068A1 (en) Pulmonary delivery of spherical insulin microparticles
US20070092452A1 (en) Methods for fabrication, uses, compositions of inhalable spherical particles
EP0257915B1 (en) Pharmaceutical formulations comprising microcapsules
Nokhodchi et al. Pulmonary drug delivery: advances and challenges
US20060260777A1 (en) Surface-modified microparticles and methods of forming and using the same
US20080248122A1 (en) Microencapsules Containing Surface-Modified Microparticles And Methods Of Forming And Using The Same
JP2009532489A (ja) 薬剤微粒子
JP2014517043A (ja) 大容量のジケトピペラジン微粒子
JP2001507722A (ja) 薬物送達のための安定化乾燥薬学的組成物、およびそれを調製する方法
Wilson et al. Formulation of high-performance dry powder aerosols for pulmonary protein delivery
Umerska et al. Carbohydrate-based Trojan microparticles as carriers for pulmonary delivery of lipid nanocapsules using dry powder inhalation
JP2003528907A (ja) 医薬製剤およびそれらの製造
EP2334394B1 (en) Methods of processing compositions containing microparticles
Nyambura Protein formulations for pulmonary delivery

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160328

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee