KR20030092051A - 플라비바이러스 감염 예방용 핵산 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제1 플라비바이러스의 신호서열 및 제2 플라비바이러스의 면역원성 플라비바이러스 항원 또는 하나 이상의 플라비바이러스로부터의 서열을 포함하는 키메라 면역원성 플라비바이러스 항원을 코딩하는 전사 단위를 포함하는 분리된 핵산을 포함한다. 본 발명은 또한 핵산 및 단백질 백신 및 플라비바이러스 감염에 대항하여 개체를 면역화하기 위한 상기 백신의 용도를 포함한다. 본 발명은 본 발명의 핵산에 의하여 코딩된 항원, 상기 항원에 반응하여 유도된 항체 및/또는 플라비바이러스를 검출하거나 플라비바이러스 감염을 진단하는데 있어서 상기 항원 및/또는 항체의 용도를 또한 제공한다.

Description

플라비바이러스 감염 예방용 핵산 백신{Nucleic acid vaccines for prevention of flaviviurs infection}
본 발명은 2000년 11월 29일 출원되고, 현재 출원 계류 중이며, 1998년 6월 4일 출원된 미국 가출원 번호 제60/087908호로부터 1999년 6월 3일 출원된 국제출원 번호 PCT/US99/12298의 국내단계 출원인 미국출원 번호 제09/701,536호의 일부계속출원(CIP)이며 그 이익을 주장하는 2001년 4월 4일 출원되고, 현재 계류중인 미국출원번호 제09/826,115호의 일부계속 출원(CIP)이며 그 이익을 주장한다. 상기 출원들은 참조에 의하여 그 전체로서 본 명세서에 포함되어진다.
본 발명은 신규한 백신, 진단제(diagnostics) 및 상기 둘을 이용한 플라비바이러스에 의하여 야기되는 질병의 치료 및 예방의 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 백신은 일본 뇌염 바이러스 (JEV), 웨스트 나일 바이러스 (WNV) 또는 관련 플라비바이러스와 같은 플라비바이러스의 구조 단백질 유전자를 포함하는 재조합 핵산이다. 이들 백신은 인 비보에 투여되었을 때 상기 바이러스 단백질 항원의 생합성에 대한 전사단위로서 역할을 한다. 상기 진단제는 플라비바이러스 감염을 검출하는 데 사용될 수 있는 상기 재조합 핵산으로부터 생산된 항원을 포함하는 조성물이다.
플라비바이러스(flaviviruses)는 플라비비리대(Flaviviridae) 과(family) 내에 분류된 플라비바이러스 속(genus)의 일원이다. 상기 플라비바이러스는 인간 및 다른 포유동물에 대하여 대부분 병원성이다. 인간 및 포유동물에 대하여 질병을 유발하는 플라비바이러스에는 알푸이(Alfuy), 아포이(Apoi), 아로아(Aroa), 바가자(Bagaza), 반지(Banzi), 바투 케이브(Batu Cave), 부부이(Bouboui), 부칼라사 바트(Bukalasa bat), 부수쿠아라(Bussuquara), 카시파코아(Cacipacore), 캐리 아일랜드(Carey Island), 카우본 릿지(Cowbone Ridge), 다카르 바트(Dakar bat), 뎅기 (혈청형 1, 2, 3 및 4), 에지 힐(Edge Hill), 엔테베 바트(Entebbe bat), 가제트 굴리(Gadgets Gully), 이구아페(Iguape), 일헤우스(Ilheus), 이스라엘 터키 수막뇌염(Israel turkey meningoencephalitis), 일본 뇌염, 주그라(Jugra), 주티아파(Jutiapa), 카담(Kadam), 카르쉬(Karshi), 케두구(Kedougou), 코코베라(Kokobera), 쿠탄고(Koutango), 쿤진(Kunjin), 캬사누르 포레스트병(Kyasanur Forest disease), 란가트(Langat), 메반(Meaban), 모도크(Modoc), 몬타나 마이오티스 백뇌염(Montana myotis leukoencephalitis), 머레이계속 뇌염, 나란잘(Naranjal), 네기쉬(Negishi), 은타야(Ntaya), 옴스크 출혈열(Omsk hemorrhagic fever), 프놈펜 바트(Phnom Penh bat), 포티스쿰(Potiskum), 포와산, 리오 브라보(Rio Bravo), 로치오(Rocio), 로얄 팜(Royal Farm), 러시아 봄 여름 뇌염(Russian spring summer encephalitis), 사보야(Saboya), 살 비에자(Sal Vieja), 산 페를리타(San Perlita), 사우마레즈 리프(Saumarez Reef), 세피크(Sepik), 소쿨루크(Sokuluk), 스폰드웨니(Spondweni), 세인트루이스 뇌염, 스트라트포드(Stratford), 진드기 매개 뇌염 중앙 유럽 서브타입, 진드기-매개 뇌염-극동 서브타입, 템부수(Tembusu), THCAr, 트율레니(Tyuleniy), 우간다 에스(Uganda S), 우수투(Usutu), 웨스트 나일, 야운데(Yaounde), 황열, 요코즈(Yokose), 지키(Ziki), 세포 융합제 및 Kuno 등 (J. Virol. 72: 73-83 (1998))에 의하여 목록화된 다른 관련 플라비바이러스가 포함된다.
상기 플라비바이러스는 하기의 3개의 구조 단백질을 포함한다: prM/M, 프리막(premembrane) 및 막 단백질; E, 엔벨로프 단백질; 및 C, 캡시드 단백질 (Monath, in Virology (Fields, ed.), Raven Press, 뉴욕, 1990, pp. 763-814; Heinz 및 Roehrig, in Immunochemistrv of Viruses II: The Basis for Serodiagnosis and Vaccines (van Regenmortel and Neurath, eds.), Elsevier, 암스테르담, 1990, pp. 289-305). M은 분자량(MW)이 약 7-8 kDa이고 E는 분자량(MW) 약 55-60 kDa이다. M은 prM라고 하는 더 큰 전구체로서 합성된다. prM의 상기 pr 부분은 성숙한 비리온 내에서 prM이 가공되어 M 단백질을 형성할 때 제거된다. M 및 E는 플라비바이러스 입자의 막에 위치하며, 그렇기 때문에 오랫 동안 플라비바이러스의 중요한 면역원성 성분으로서 여겨져 왔다.
상기 플라비바이러스는 다양한 종 중에서, 길이가 약 10kb인 단일가닥 RNA를 포함하는 RNA 바이러스이다. 상기 C 단백질은 분자량이 12-14 kDa이고, 상기 RNA와 복합체를 형성하여 뉴클레오캡시드 복합체를 형성한다. NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5로 명명된 여러 비구조 단백질도 상기 RNA 게놈에 의하여 코딩된다. 상기 게놈은 숙주 세포에서 폴리단백질로 번역된 다음, 바이러스- 또는 숙주-특이적 프로테아제(protease)에 의하여 번역과 동시 또는 번역 후에 개별 유전자 산물로 가공된다 (도. 1).
여러 플라비바이러스의 게놈의 뉴클레오티드 서열은 미국특허 제5,494,671호에 요약된 바와 같이, 알려져 있다. JEV 게놈의 뉴클레오티드 서열은 스미요시(Sumiyoshi) 등 (Virology 161: 497-510 (1987)) 및 하시모토(Hashimoto) 등 (Virus Genes 1: 305-317 (1988))에 의하여 개시되었다. JEV의 독성주 SA-14와 중화인민 공화국에서 백신으로서 사용되고 있는 약독화주 SA-14-14-2의 뉴클레오티드 서열이 니타야판(Nitayaphan) 등의 연구에서 비교되었다 (Virology 177: 541-552 (1990)).
다른 플라비바이러스 종의 구조 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열도 또한 알려져 있다. 많은 경우에, 완전한 게놈 서열이 보고되었다. 이용가능한 상기 서열에는 뎅기 혈청형 1 바이러스, 뎅기 혈청형 2 바이러스 (Deubel 등, Virology 155: 365-377 (1986); Gruenberg 등, J. Gen. Virol. 69: 1391-1398 (1988); Hahn 등 Virology 162: 167-180 (1988)), 뎅기 혈청형 3 바이러스 (Osatomi 등, Virus gene 2: 99-108 (1988)), 뎅기 혈청형 4 바이러스 (Mackow 등, Virology 159: 217-228 (1987), Zhao 등, Virology 155: 77-88 (1986)), 웨스트 나일 바이러스 (Lanciotti 등, Science 286: 2331-2333 (1999)), 포와산 바이러스 (Mandl 등, Virology 194: 173-184 (1993)) 및 황열 바이러스 (YFV) (Rice 등, Science 229: 726-733 (1985))가 포함된다.
세인트루이스 뇌염 바이러스 (SLEV), WNV 및 JEV를 포함한, 많은 플라비바이러스는 모기에 의하여 인간과 다른 숙주 동물에 전달된다. 그러므로, 플라비바이러스는 광범위한 영역에 걸쳐 존재하고, 그 전달은 쉽게 중단되거나 예방되지 않는다.
웨스트 나일 열은 Culex 모기의 다양한 종에 의하여 주로 척추동물로 전달되는 모기매개 플라비바이러스 감염이다. JE, SLE 및 머레이계곡 뇌염 (MVE) 바이러스를 포함한, 플라비바이러스의 일본뇌염(JE) 항원성 복합체의 다른 구성원과 같이, WNV는 절지동물 매개체와 조류 사이의 자연적 순환(natural cycle)으로 유지된다. 상기 바이러스는 1937년 우간다의 웨스트 나일 지역의 열성환자(febrile human)로부터 최초로 분리되었다 (Smithburn 등, Am. J. Trop. Med. Hyg. 20: 471-492 (1940)). 상기 바이러스는 곧 지역적 범위로는 아프리카, 중동, 서아시아, 유럽 및 호주를 포함하는, 가장 널리 분포되어 있는 플라비바이러스 중의 하나로서 인정되었다 (Hubalek 등, Emerg. Infect. Dis. 5: 643-50 (1999)). 임상적으로, 인간의 웨스트 나일 열은 자기-제한적 급성 열병으로서 두통, 근육통(myalgia), 폴리관절병증(polyarthropathy), 발진(rash) 및 림프선종(lymphadenopathy)를 수반한다 (Monath 및 Tsai, in Clinical Virology, (Richman, Whitley 및 Hayden eds.), Churchill-Livingtone, 뉴욕, 1997, pp. 1133-1186). 가끔 급성 간염 또는 췌장염(pancreatis)이 보고되고, 노인 환자의 WNV 감염의 경우 가끔 뇌염 또는 수막염(meningitis)이 병발(倂發)한다 (Asnis 등, Clin. Infect. Dis. 30: 413-418 (2000)). 따라서, WNV에 의한 감염은 세계의 많은 지역에서 심각한 건강 문제이다.
상기 질병의 지역적 전파, 구체적으로는 1999년 미국으로의 WNV의 도입은 이 질병의 인간 및 동물 보건 문제(health concerns)에 대한 주의(awareness)를 크게 향상시켰다. 1999년 8월말과 9월초 사이에, 뉴욕시와 인근 지역에서 확인된 62건의 바이러스 뇌염이 발생(outbreak)하였으며, 7명이 사망하였다. 이 발생과 동시에, 지역 보건관리들은 조류(특히 까마귀) 및 말의 사망률이 증가하였음을 관찰하였다. 단일클론 항체 (Mab) 맵핑과 인간, 조류 및 모기 표본의 게놈 서열의 검출에 근거하여, 상기 발병은 WNV에 의하여 야기된다는 것이 뒤이어 밝혀졌다 (Anderson 등, Science 286: 2331-2333 (1999); Jia 등, Lancet 354: 1971-1972 (1999); Lanciotti 등, Science 286: 2333-2337 (1999)). 그해 겨울의 수개월 동안 검출된 바이러스 활성으로부터, 상기 바이러스가 북미에 그 자체로서 확립되었음(established)을 알 수 있었다 (Morb. Mortal. Wkly. Rep. 49: 178-179 (2000); Asnis 등, Clin. Infect. Dis. 30: 413-418 (2000); Garmendia 등, J. Clin. Micro. 38: 3110-3111 (2000)). 2000년 동안의 북동 및 중-대서양 주로부터 보고된 조사 자료(Surveillance data)에 의하여, 인간 뿐만 아니라 조류, 모기 및 말에서의 많은 발병 건수의 기록화로 상기 바이러스가 동물간유행성(epizootic)/유행성 전파가 강화되고 및 지역적으로 확장되었음이 확인되었다 (Morb. Mortal. Wkly. Rep. 49: 820-822 (2000)).
현재, WNV 감염을 예방하기 위하여 이용가능한 인간 또는 수의용 백신은 없으며, 모기 방제가 상기 질병의 전파와 싸우는 유일한 실제적 전략이다.
일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus) (JEV)는 성인과 소아(children)가 감염되며, 열대 및 아열대 아시아의 유아, 소아 및 노인 중에서 높은 사망률을 보인다 (Tsai 등, in Vaccines (Plotkin, ed.) W. B. Saunders, Philadelphia, Pa, 1999, pp. 672-710). 생존자 중에는 감염 후 지속되는 뇌염의 증상과 관련되는 심각한 뇌 예후(neurological consequences)가 있다. 일본, 중화공화국(타이완) 및 한국과 같은 이 지역의 보다 개발된 나라에서는, 불활성화된 JEV로된 백신을 사용하여 거의 방제되었다. 그럼에도 불구하고, JEV는 상기 지역의 다른 나라에서는 여전히 만연하고 있다.
JEV에 대항하는데 사용가능한 백신에는 약독화(attenuated) 바이러스 뿐만 아니라, 포르말린 처리와 같은 방법에 의하여 불활성화된 생 바이러스(live virus)가 포함된다 (Tsai 등, in Vaccines (Plotkin, ed.) W. B. Saunders, Philadelphia, Pa, 1994, pp. 671-713). 효과적이지만, 전 바이러스 백신은 특정한 문제 및/또는 단점을 가지고 있다. 상기 바이러스는 숙주로서 생쥐 뇌 또는 포유동물 세포를 사용한 세포 배양으로 배양된다. 그러한 배양 방법은 성가시고 비싸다. 더욱이, 최종 백신 제품 중에 숙주 세포 즉, 뇌 또는 다른 숙주의 항원이 삽입되어, 백신을 투여 받는자에게 의도하지 않고 바람직하지 않은 알러지 반응을 잠재적으로 유도할 수 있는 위험이 존재한다. 마지막으로, 상기 바이러스는 철저하게 또는 완전하게 불활성화되거나 약독화되지 않을 수 있기 때문에, 백신이 실제 질병을 야기할 수도 있다.
뎅기열 및 뎅기 출혈열 (DF/DHF)은 역시 모기매개 플라비바이러스인 뎅기 바이러스에 의하여 야기된다. 4개의 항원적으로(antigenically) 관련되나, 구별되는 뎅기 바이러스 혈청형(serotype), (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4)이 있으며, 이들 모두는 DF/DHF를 야기할 수 있다. 뎅기-관련 질병의 가벼운 형태인 DF의 증상에는, 열(fever), 발진(rash), 심한 두통(severe headache) 및 관절통(joint pain)이 포함된다. DF를 앓는 환자 중의 사망률은 낮다; 그러나, DHF를 앓는 환자 중의 사망률은 5% 까지 높아질 수 있다. 이용가능한 증거로부터, 지난 40년 동안에 걸쳐 3백만건 이상의 DHF가 발생하였고, DHF로 인하여 58,000명이 사망한 것으로 밝혀졌으며, 이는 DHF가 주요 출현 질병(emerging disease)임을 나타낸다 (Halstead, in Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever (Gubler and Kuno, eds.) CAB International, New York, N.Y., (1997) pp 23-44). 그럼에도 불구하고, 수십년간의 노력에도 불구하고 뎅기 바이러스 감염에 대항하는 안전하고 효과적인 백신은 아직 이용가능하지 않다.
황열는 남아메리카 및 사하라 이남 아프리카에 만연되어 있으며, 모기에 의하여 전파된다. 감염에 의하여 황달(jaundice)의 출현과 함께, 열(fever), 오한(chill), 심한 두통 및 다른 통증, 식욕부진(anorexia), 메스꺼움(nausea) 및 구토가 유발된다. 감염된 닭 배아에서 생육된 생 바이러스 백신, 17D는 안전하고 효과적인 것으로 여겨진다. 그럼에도 불구하고, 상기 백신을 가장 필요로 하는 아프리카 및 아메리카의 열대 지역에서 흔히 만나게 되는 가혹 조건(adverse conditions) 하에서 안정한 백신이 여전히 요구되고 있다.
두 플라비바이러스 사이의 키메라인 재조합 플라비바이러스가 PCT 공개 WO 93/06214에 개시되어 있다. 상기 키메라는 뎅기 바이러스 또는 다른 플라비바이러스의 한 "형태(type)" 또는 혈청형으로부터 얻은 비구조 단백질을 다른 "형태(type)" 또는 혈청형으로부터 얻은 구조 단백질과 융합시키는 구조체이다.
여러 재조합 서브유니트 및 바이러스 백신이 최근 고안되었다. 미국특허 제4,810,492에는 백신의 항원으로서 사용하기 위하여 JEV의 E 당단백질을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 해당 DNA는 발현 시스템에 클로닝되어 대장균, 효모, 또는 고등 개체 세포 배양과 같은 적당한 숙주세포에서 항원 단백질을 발현한다. 미국특허 제5,229,293호에는 JEV E 단백질의 유전자를 포함하는 재조합 바큘로바이러스가 개시되어 있다. 상기 바이러스는 배양물 중의 곤충 세포를 감염시키는 데 사용되어 E 단백질을 생산하고, E 단백질은 백신으로서 사용하기 위하여 회수된다.
미국특허 제5,021,347호에는 JEV E 단백질의 유전자가 삽입된 재조합 백시니아 바이러스 게놈이 개시되어 있다. 상기 생 재조합 백시니아 바이러스는 JEV에 대항하여 면역화하기 위하여 백신으로서 사용된다. 뎅기 혈청형 2, 뎅기 혈청형 4 및 JEV의 E 단백질의 C-말단 절단체(truncation)의 유전자를 삽입한 재조합 백시니아 바이러스 및 바큘로바이러스가 미국특허 제5,494,671호에 개시되어 있다. 미국특허 제5,514,375호에는 prM으로부터 NS2B까지 연장되어 있는 JEV 오픈 리딩 프레임의 부분을 발현하는 다양한 재조합 백시니아 바이러스가 개시되어 있다. 이들 폭스(pox) 바이러스는 유도된 가공된 M 단백질과 E 단백질을 포함하는 세포외 입자의 형성을 유도하였다. 이들 JEV 단백질을 코딩하는 두 재조합 바이러스가 고역가의 중화 및 헤마글루티닌-저해 항체(hemagglutinin-inhibiting antibody) 생산하였으며, 생쥐에서 보호 면역성을 유발하였다. 이들 효과의 정도는 단 한번 보다 두 번의 면역 처리 후에 더 컸다. JEV의 prM/M 및 E 단백질의 유전자를 함유하는 재조합 백시니아 바이러스는 생쥐에 투여되었을 때 보호 면역성을 부여하였다 (Konishi 등, Virology 180: 401-410 (1991)). JEV의 prM 및 E의 유전자를 갖는 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 HeLa 세포는 서브바이러스 입자를 생산하는 것이 밝혀졌다 (Konishi 등, Virology 188: 714-720 (1992)). 드미트리브(Dmitriev) 등은 진드기 매개 뇌염 바이러스의 구조 및 특정 비구조 단백질을 코딩하는 재조합 백시니아 바이러스로 생쥐를 면역화는 방법을 보고하였다 (J. Biotechnology 44: 97-103 (1996)).
재조합 바이러스 벡터는 또한 뎅기열을 위한 바이러스 백신으로서 역할을 하기 위하여 제조되었다. 자오(Zhao) 등 (J. Virol. 61: 4019-4022 (1987))은 뎅기 혈청형 4의 구조 단백질 및 NS1을 갖는 재조합 백시니아 바이러스를 제조하였으며, 재조합 바이러스로서 포유동물 세포를 감염시킨 후에 발현시켰다. 표적 곤충 세포를 감염시키기 위하여 재조합 바큘로바이러스를 사용함으로써 비슷한 발현 결과가 얻어졌다 (Zhang 등, J. Virol. 62: 3027-3031(1988)). 브레이(Bray) 등 (J. Virol. 63: 2853-2856 (1989))은 또한 챌린지되었을 때 뎅기 뇌염에 대항하여 생쥐에게 보호 면역성을 부여하는 E 단백질 유전자에 근거한 재조합 백시니아 뎅기 백신을 보고하였다. 팔고우트(Falgout) 등 (J. Virol 63: 1852-1860 (1989)) 및 팔고우트(Falgout) 등 (J. Virol. 64: 4356-4363 (1990))도 비슷한 결과를 보고하였다. 장(Zhang) 등 (J. Virol. 62: 3027-3031 (1988))은 뎅기 E 및 NS1 단백질을 코딩하는 재조합 바큘로바이러스도 비슷하게 챌린지되었을 때 뎅기 뇌염에 대하여 생쥐를 보호한다는 것을 보였다. 구조 및 비구조 유전자가 재조합 바이러스 백신내로 삽입된 다른 조합은 유의한 면역성을 생산하지 못하였다 (Bray 등, J. Virol. 63: 2853-2856 (1989)). 또한, 원숭이는 상기 E 단백질을 발현하는 재조합 바큘로바이러스로 면역화되었을 때 뎅기 바이러스 챌린지에 대하여 완전한 보호 면역성을 발생시키지 못하였다 (Lai 등 (1990) pp. 119-124 in F. Brown, R. M. Chancock, H. S. Ginsberg 및 R. Lerner (eds.) Vaccines 90: Modem approaches to new vaccines including prevention of AIDS, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
재조합 DNA 조성물을 이용하는 면역방법이, 모델로서 새끼 생쥐를 사용한, SLEV 및 뎅기-2 바이러스에 대하여 보고되었다 (Phillpotts 등, Arch. Virol. 141: 743-749 (1996); Kochel 등, Vaccine 15: 547-552 (1997)). SLEV의 prM 및 E 유전자를 코딩하는 플라스미드 DNA는 단일 또는 2배 용량의 DNA 면역화로 SLEV 챌린지에 대한 부분적 보호를 제공하였다. 이들 실험에서, 대조군 생쥐는 약 25%의 생존율을 보였으며, 어떠한 보호 항체도 DNA-면역화된 생쥐에서 검출되지 않았다 (Phillpotts 등, Arch. Virol. 141: 743-749 (1996)). prM을 함유하는 재조합 뎅기-2 플라스미드 DNA를 3회 피내 주사받은 생쥐에서, 100% 항-뎅기-2 중화항체를 생산하였으며, 해당 E 유전자를 투여받은 생쥐의 92%가 비슷하게 중화 항체를 생산하였다 (Kochel 등, Vaccine 15: 547-552 (1997)). 그러나, 2-용량 스케줄을 사용한 챌린지 실험에서는 치명적 뎅기-2 바이러스 챌린지에 대항하여 보호하지 못하였다.
JEV, SLEV, 뎅기 바이러스 및 다른 플라비바이러스에 의한 감염에 대항하여 면역화하기 위하여 오늘날까지 개발된 백신은 사용함에 있어 많은 단점과 문제점을 가지고 있다. 불활성화된 백신은 비싸고 제조하기에 불편하다. 더욱이, 그러한 백신은 상기 바이러스를 제조하는 데 사용된 숙주세포의 단백질로부터 유래하는 알러지 반응의 위험을 수반한다. 더욱이, 그러한 백신은 그의 생산에 고용된 작업자에게 상당한 위험이 된다. 후보 약독화 JEV 백신은 임상 시험 중에 있으나, 1996년 기준으로 중화인민공화국 외에는 널리 허용되고 있지 않다 (Hennessy 등, Lancet 347: 1583-1586 (1996)).
세포 배양에서 생합성적으로 발현된 다음 항원의 정제 또는 처리에 의하여 생산된 JEV와 같은, 플라비바이러스의 특정 단백질만을 사용하는 것에 근거한 재조합 백신은 높은 항체 역가를 유발하지 않는다. 또한, 전 바이러스 조성물과 마찬가지로, 이들 백신은 상기 숙주 유래의 항원 또는 벡터에 대한 심한 알러지 반응의 위험을 가지고 있다. 뎅기 바이러스 및 WNV에 대항하는 백신 개발은 덜 발전하였으며, 그러한 바이러스-근거 또는 재조합 단백질-근거 백신은 상기한 바와 같은 것과 비슷한 문제점을 가지고 있다.
그러므로, 제조 비용이 싸고, 그의 제조에 관련되는 작업자가 거의 위험하지 않고, 불순물 또는 외래 면역원성 성분으로 인한 심각한 면역 반응의 위험이 최소화되고, 중화 항체와 보호 면역성을 유발하는데 아주 효과적인, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, JEV, SLEV 및 WNV와 같은 플라비바이러스에 대항하는 백신 또는 개선된 백신이 요구되고 있다. 더욱이, 필요한 면역 용량(dose)의 수를 최소화하는 JEV, WNV 및 관련 플라비바이러스에 대항하는 백신이 요구되고 있다.
백신의 생산에 대하여 상세하게 기술한 바와 같은 현재 기술의 많은 단점은 면역진단제(immunodiagnostics)의 생산을 위하여 사용되는 항원 및 항체의 생산에도 적용된다. 구체적으로, 바이러스로부터 항원의 생산과 관련된 위험과 고비용은 대부분의 현재 이용가능한 재조합적으로 발현된 항원이 효과적인 면역 반응을 유발하지 못한다는 점은 동일한 위험, 고비용 및 대응하는 민감성(sensitivity)의 결여에 의하여 면역진단제의 분야에서도 병행적으로 적용된다. 따라서, 고비용, 생 바이러스에 의한 우발적 감염의 위험 및 종래 이용가능한 시험의 원하는 수준 보다 더 낮은 민감성 때문에, 빠르고, 간단하고 아주 민감한 플라비바이러스 감염 및/또는 오염 검출용 진단 시험기(diagnotic test)가 요구되고 있다.
본 발명은 선택된 플라비바이러스에 대한 항체의 검출을 위한 진단 분석 방법에 사용하기 위한 높은 면역원성 재조합 항원을 제공함으로써 이들 요구를 만족시킨다. 본 발명은 또한 플라비바이러스 유래의 재조합 항원, 플라비바이러스 유전자 또는 그들의 모사체(mimetics)를 사용하는 플라비바이러스 단백질에 대한 항체의 검출용 면역진단 분석 방법을 제공한다.
도 1은 플라비바이러스 폴리단백질 가공 과정을 도식적으로 나타낸 것이다. 중앙의 수평 영역은 상기 바이러스 게놈을 도식적으로 나타낸 것이다. 선은 5' 및 3' 비번역 영역 및 박스친) 영역은 구조 (좌측 및 상단) 및 비구조(우측 및 하단) 단백질에 대한 오픈 리딩 프레임을 나타낸다. 숙주세포 시그날라제(signalase)에 의한 절단은 E 단백질 C-말단에서 번역과 동시에 일어나며, 구조 및 비구조 영역을 분리한다. 서브틸라제-유사(subtilase-like) 세포 효소, 퓨린(furin)은 prM 절단에 관여한다. 바이러스 폴리단백질의 잠재적 막통과(transmembrane) 도메인은 빗금친 영역으로 나타내었다.
도 2는 JEV 게놈의 지도 (상단) 및 prM-E 단백질 코딩 영역 (하단)의 발현을 위한 전사단위를 구축하기 위하여 역전사-PCR (RT-PCR)에 사용된 올리고뉴클레오티드의 DNA 서열이다. 바이러스 폴리단백질의 잠재적 막통과 도메인은 빗금친 영역으로 나타내었다.
도 3은 플라스미드 벡터, pCDNA3, pCBamp, 및 pCIBamp, 및 그들 간의 상관관계를 도식적으로 나타낸 것이다. 이들 플라스미드는 대장균에서의 선발 및 유지를 위한 CMV (사이토메갈로바이러스) 프로모터/인핸서 요소, BGHp(A) (우성장 호르몬 폴리아데닐레이션 신호 및 전사 종결 서열), 앰피실린 저항성 유전자 및 ColE1 복제 기점을 포함한다. 대장균 세포에서 단일-가닥 구제(rescue)를 위한 f1 복제 기점, SV40 복제 기점 (SV40 ORI), 네오마이신 저항성 코딩 영역 및 SV40p(A) 서열을 pCDNA3로부터 제거하여 pCBamp를 생성하였다. 인트론 서열을 pCBamp의 NcoI-KpnI 부위에 삽입하여 플라스미드 pCIBamp를 생성하였다.
도 4는 JE-4B COS-1 배양액으로부터 자당 구배 정제된 서브바이러스 입자의 SDS-PAGE-면역블롯팅 분석 결과를 나타낸다 (4B, 각 쌍의 우측 레인). JEV 감염된 C6/36 세포 배양물로부터 얻은 밀도 구배 정제된 JE 비리온을 양성 대조군으로서 사용하였다 (JEV, 각 쌍의 좌측 레인). JE HIAF (과면역 복수); 4G2, 항-E 단일클론 항체; JM01, 항-M 단일클론 항체; NMAF (정상 생쥐 복수).
도 5는 Triton X-100 처리 또는 처리 없이 JE-4B 세포 배양 배지의 PEG 침전물로부터 준비된 속도 영역 자당 구배 분석(rate zonal sucrose gradient analysis)에서의 E 항원의 프로필을 나타낸다.
도 6은 SignalP-HMM 프로그램에 의하여 예측된 pCBJE1-14(pCBJE)의 신호 펩티드 확률을 나타낸다(A). 상기 신호 펩티드 확률은 -4와 -2 위치의 c-영역 서열을 변경시킴으로써(C-4G 및 G-2S)(패널 B, JE-LSS-M), n-영역을 짧게 함으로써(패널 C, JE-SS-ORI), 또는 상기 두 변경의 조합에 의하여(패널 D, JE-SS-M) 개선될 수 있다.
도 7은 플라스미드 벡터 pCBD2-14-16(100% DEN-2 E), pCBD2-1J-4-3(90% DEN-2 E : 10% JEV E), 및 pCB8D2-2J-2-9-1(80% DEN-2E : 20% JEV E)를 도식적으로 나타낸 것이다. 이들 플라스미드는 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 유전자 프로모터; JE 바이러스 신호 서열; DEN-2 바이러스 prM 및 E 유전자 영역(아미노 말단 100%, 90%, 또는 80%, 각각); JE 바이러스 E 유전자 영역(없음, 10% 또는 20%, 각각); 및 우성장 호르몬 폴리 A 신호(BGH)를 포함한다.
도 8은 웨스턴 블롯팅에 의한 분비된 재조합 단백질과 막-결합 재조합 단백질을 비교한 결과를 나타낸다. (A) DEN-2 플라스미드 pCB8D2-2J-2-9-1, pCB9D2-1J-4-3, pCBD2-14-16, 및 대조군 플라스미드 pEGFP에 대한 배양액의 PEG-침전 및 에탄올 침전 후 분비된 재조합 항원의 분석결과. 레인1(V), Gold Blot으로 염색된 정제된 DEN-2 바이러스(Owl Separation Systems, Portsmouth, NH).
각 플라스미드로부터 유래한 분비된, 재조합 항원의 a, 항-엔펠로프 (E) 특이적 Mab 1A6A-8; b, MAB 1A6A-8, 항-캡시드 (C) 특이적 Mab 1A2A-1, DEN-2 바이러스 프리막 (prM) 단백질에 대하여 특이적인 항-혈청의 혼합물; 및 c, 정상 생쥐 복수와의 반응성. (B) 재조합 플라스미드-형질전환된 세포 소수성 막 단백질의 분석 결과. 레인 I (V), Gold Blot으로 염색된 정제된 DEN-2 바이러스; 레인 2 (V), 정제된 DEN-2의 Mab 1A6A-8, Mab 1A2A-1, DEN-2 바이러스 M 단백질에 대하여 특이적인 항-혈청, 및 DEN-2 바이러스 prM 단백질에 대하여 특이적인 항-혈청의 혼합물과의 반응성. 각 플라스미드-형질전환된 세포 주로부터 유래한 분리된 소수성 막 단백질의 a, Mab 1A6A-8; b, Mab 1A6A-8, Mab 1A2A-1, DEN-2 바이러스 M 단백질에 대하여 특이적인 항-혈청, 및 DEN-2 바이러스 prM 단백질에 대한 항-혈청의 혼합물; 및 c, 정상 생쥐 복수와의 반응성.
본 발명의 특정한 구현예를 하기 실시예에 개시하였다. 이들 실시예는 본 명세서에 개시된 바와 같은 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 의도는 아니다.
본 발명은 면역원성 플라비바이러스 항원에 대한 전사단위(TU)를 포함하는 핵산을 제공한다. 상기 TU는 숙주세포에 삽입된 후에 상기 숙주세포가 상기 항원을 합성하도록 지시한다. 본 발명의 중요한 태양에 있어서, 상기 플라비바이러스는 황열 바이러스 (YFV), 뎅기 혈청형 1 바이러스 (DEN-1), 뎅기 혈청형 2 바이러스 (DEN-2), 뎅기 혈청형 3 바이러스 (DEN-3), 뎅기 혈청형 4 바이러스 (DEN-4), 세인트루이스 뇌염 바이러스 (SLEV), 일본 뇌염 바이러스 (JEV), 웨스트 나일 바이러스 (WNV), 포와산 바이러스 또는 임의의 다른 플라비바이러스일 수 있다. 본 발명의 중요한 구체예에 있어서, 상기 항원은 플라비바이러스 prM/M 단백질, E 단백질, 또는 둘다일 수 있다. 구체적으로, TU가 prM/M 및 E 단백질 모두를 포함하는 경우, 상기 숙주세포는 prM/M 및 E 항원을 함유하는 서브바이러스 입자를 분비한다. 본 발명의 또다른 중요한 태양에 있어서, 상기 핵산은 DNA 분자이다. 추가의 중요한 태양에 있어서, 상기 핵산 TU는 prM/M 및 E 항원의 발현을 작동가능하게 조절하도록 적절하게 배치된 조절 서열을 포함하고, 이 조절서열은 사이토메갈로바이러스 바로 초기(immediate early) 프로모터일 수 있다. 추가의 구체예에서, 상기 TU의 뉴클레오티드 서열은 상기 TU에 의하여 생산되는 mRNA의 5′-말단 비번역 영역의 큰 헤어핀 구조를 최소화함으로써 및/또는 상기 TU에 의하여 생산되는 mRNA의 번역 개시 부위에 코자크 콘센서스(Kozak consensus) 서열을 포함시킴으로써 진핵 세포 발현을 최적화하기 위하여 조작된다. 또다른 구체예에서, 상기 전사단위는 또한 폴리-A 터미네이터를 포함한다.
본 발명은 또한 숙주세포가 상기 면역원성 항원을 합성하도록 지시하는 면역원성 플라비바이러스 항원에 대한 전사 단위를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 숙주세포를 제공한다. 상기 플라비바이러스는 YFV, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, SLEV, JEV, WNV, 포와산 바이러스 또는 다른 플라비바이러스일 수 있다. 중요한 구체예에서, 상기 항원 prM/M 단백질, E 단백질, 또는 prM/M 및 E 단백질 둘다일 수 있다. 후자의 경우, 상기 세포는 prM/M 및 E 항원을 포함하는 서브바이러스 입자를 분비한다.
또한, 본 발명은 면역원성 플라비바이러스 항원에 대한 전사 단위를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 플라비바이러스에 대항하는, 개체의 면역접종용 조성물을 제공한다. 상기 전사단위는 세포내에 삽입된 후에, 개체의 체내의 상기 세포가 상기 면역원성 항원을 합성하도록 지시한다. 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 중요한 구체예에서, 상기 플라비바이러스는 YFV, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, SLEV, JEV, WNV, 포와산 바이러스 또는 다른 플라비바이러스일 수 있다. 더욱이, 상기 항원은 prM/M 단백질, E 단백질, 또는 prM/M 및 E 단백질 둘다일 수 있다. 후자의 경우, 상기 세포는 플라비바이러스 prM/M 및 E 항원을 포함하는 서브바이러스 입자를 분비한다. 이들 서브바이러스 입자는 또한 비감염성 재조합 항원(noninfectious recombinant antigen) (NRA)이라고도 한다. 중요한 구체예에서, 상기 핵산 분자는 DNA 분자이다. 추가의 중요한 구체예에서, 상기 전사 단위는 상기 핵산이 개체의 세포내로 도입되었을 때 prM/M 및 E 항원의 합성을 작동가능하게 조절하도록 적절하게 배치된 조절서열을 추가로 포함한다. 이 조절서열은 사이토메갈로바이러스 바로 초기(immediate early) 프로모터일 수 있다. 또다른 추가의 구체예에서, 상기 전사단위는 또한 폴리-A 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명에 의하여 제공되는 플라비바이러스에 대항하는 개체의 면역접종용 상기 조성물은 하나이상의 면역원성 플라비바이러스 항원에 대한 전사단위를 포함하는, 핵산분자 또는 분자를 포함할 수 있다. 상기 하나이상의 면역원성 플라비바이러스 항원은 임의의 조합의 다른 플라비바이러스 종, 주(strain) 또는 분리체로부터 얻어질 수 있다. 중요한 구체예에서, 상기 포함된 플라비바이러스는 2이상, 3이상, 4이상, 5이상, 7이상의 플라비바이러스일 수 있다. 그러한 플라비바이러스의 예에는, YFV, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, SLEV, JEV, WNV, 포와산 바이러스 또는 다른 플라비바이러스가 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 특정한 지리적 영역에 공통적인 플라비바이러스 질병에 대한 면역성을 부여하기 위하여 조합 백신이 제제화될 수 있다. 열대 및 아열대 아시아 지역을 겨냥한 특정한 구체예에서, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, WN, 및 JE 바이러스가 선택될 수 있다. 아프리카 지역을 겨냥한 특정한 구체예에서, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, WN, 및 YF 바이러스가 선택될 수 있다. 라틴 아메리카 지역을 겨냥한 특정한 구체예에서, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, 로치오(Rocio), 및 YF 바이러스가 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 플라비바이러스에 의한 감염에 대항하여 개체를 면역화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 면역원성 플라비바이러스 항원에 대한 전사단위를 포함하는 효과적인 양의 면역접종 조성물을 개체에 투여하는 것과 관련된다. 상기 전사단위는 세포에 의하여 도입되어진 후, 개체의 체내의 세포가 면역원성 항원을 합성하도록 지시한다. 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법의 중요한 구체예에서, 상기 플라비바이러스는 YFV, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, SLEV, JEV, WNV, 포와산 바이러스 또는 다른 플라비바이러스일 수 있다. 상기 방법의 또다른 중요한 구체예에서, 상기 항원은 prM/M 단백질, E 단백질, 또는 prM/M 및 E 단백질 둘다일 수 있다. 상기 항원이 prM/M 및 E 단백질 둘다일 경우, 상기 개체 체내의 세포는 그 내부에 상기 핵산을 삽입시킨 후에, 플라비바이러스 prM/M 및 E 항원을 포함하는 서브바이러스 입자를 분비한다. 또한, 상기 방법의 중요한 구체예에서, 상기 면역접종 조성물은 비경구 경로를 통하여 단일 용량(single dose)으로 상기 개체에 투여된다. 상기 방법의 또다른 태양에서, 상기 핵산은 DNA 분자이다. 상기 방법의 또다른 구체예에서, 상기 전사단위는 prM/M 및 E 항원의 합성을 작동가능하게 조절하도록 적절하게 배치된 조절서열을 더 포함할 수 있고, 이 구체예의 중요한 태양에서, 상기 조절서열은 사이토메갈로바이러스 바로 초기(immediate early) 프로모터이다. 또한, 상기 전사단위는 폴리-A 터미네이터일 수 있다.
본 발명의 이들 태양 및 구체예는 본 발명의 구별되는 특징 및 이점에 대한 근거이다. 플라비바이러스의 전 게놈을 포함하는 서열이 아닌 그 일부분과 관련되는 핵산 구조체이기 때문에, 상기 핵산 TU-함유 백신은 완전히 생존불가하다(nonviable). 그러므로 상기 백신의 제조에 관련되는 자 또는 상기 백신을 투여받는 개체에 플라비바이러스에 의한 감염을 유발할 위험이 없다. 상기 핵산 백신은 제조하기 쉽고 투여하기 용이하며 사용전 저장에 안정하다. 예기치 않게, 본 발명의 상기 핵산 백신은 단일 용량만을 투여한 후에 포유동물에서 보호면역성을 부여하는데 실질적으로 100% 성공적임이 밝혀졌다. 또다른 예기치 않은 결과는 상기 핵산 TU는 암컷 포유동물에서 플라비바이러스에 대한 면역성을 생성시킬 수 있고, 이는 우유를 통하여 자손에게 전달될 수 있다는 것이다. 상기 핵산이 보호 면역성을 부여할 수 있는 가능한 기작은, 상기 백신을 투여받은 개체의 세포와 같은 상기 핵산을 보유하는 숙주세포가 플라비바이러스 prM/M 및 E 항원을 포함하는 서브바이러스 입자를 생산하는 것으로 여겨지나, 이러한 이론에 한정하고자 하는 것은 아니다. 이들 입자는 천연 플라비바이러스 비리온의 면역원성 특징을 흉내낸다.
본 발명은 또한 비감염 항원성 폴리펩티드, 항원성 폴리펩티드 단편 및 플라비바이러스 prM/M 및/또는 E 단백질를 포함하는 NRA를 제공하며, 여기서 상기 막 신호 서열은 제1 플라비바이러스로부터 유래하고, M 및/또는 E 단백질은 제2 플라비바이러스로부터 유래한다. 더욱이, prM/M 단백질은 상기 제1 및 제2 플라비바이러스로부터 유래한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "키메라(chimeric)"라는 용어는 둘이상의 플라비바이러스로부터의 서열을 포함하는 임의의 단백질 또는 핵산을 의미한다. 본 명세서에 사용된 "비독성(non-virulent)"이란 용어는 본 발명의 항원 또는 백신이 질병을 야기시킬 수 없다는 것을 의미한다. 더욱 구체적으로, 상기 재조합 단백질 항원은 플라비바이러스 감염, 복제 및 발병(pathogenesis)에 필요한 플라비바이러스 유래의 게놈 물질로 오염되어 있지 않다.
본 발명의 상기 폴리펩티드는 선택된 플라비바이러스의 prM, M 및/또는 E 단백질의 본 명세서에서 정의된, 또는 당업계에 알려진 상기 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 핵산은 선택된 플라비바이러스의 prM, M 및/또는 E 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 항원은 접합되어 있지 않거나, 고체상에 항원을 위치시키는 것을 촉진하는 담체 분자에 접합되어질 수 있다. 담체 분자는 항원이 접합되어질 수 있고, 인간 혈청 내의 항체와 반응하지 않는 분자이다. 그러한 담체의 예에는 우혈청 알부민(BSA)이다.
본 발명의 상기 항원은 또한 상기 항원을 생산할 수 있는 발현 시스템에서 상기 항원을 코딩하는 핵산을 발현함으로써 얻어지는 재조합 단백질일 수 있다.
본 발명의 항원의 상기 아미노산 서열은 prM, M 및/또는 E 항원의 면역반응성 부분을 포함할 수 있다. 이들 항원은, 더 견고한(rigid) 2차 구조를 제공함으로써 에피토프의 반응성을 증가시키기 위하여 디설파이드 결합할 수 있는 아미노산을 제거/추가하기 위하여, 항원의 생물-수명(bio-longevity)를 증가시키기 위하여, 또는 항원의 세포독성을 변경시키기 위하여 또는 감염을 예방하기 위한 것과 같은, 일부 추가의 특성을 제공하기 위하여 고안된 서열에 더 부착되어질 수 있다. 어떠한 경우에도, 상기 항원은 면역반응성 및/또는 면역원성(immunogenicity)을 가져야만 한다.
본 발명은 prM/M 및 E 단백질 항원과 같은, 플라비바이러스 항원성 단백질을 코딩하는 핵산 전사단위를 포함한다. 상기 핵산은 상기 핵산이 적당한 세포, 특히 개체의 세포에 의하여 섭취되었을 때, prM/M 및 E 단백질 항원을 발현하는 기능을 한다. 본 발명은 또한 활성 성분이 상기 핵산 전사단위 (TU)인 백신을 포함한다. 본 발명은 또한 TU를 포함하는 세포를 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 핵산 TU 분자를 포함하는 효과적인 양의 백신을 개체에 투여함으로써 플라비바이러스 감염에 대항하여 개체를 면역화하는 방법을 포함한다.
본 발명은 제1 플라비바이러스의 구조 단백질의 신호 서열 및 제2 플라비바이러스의 면역원성 플라비바이러스 항원을 코딩하는 전사단위를 포함하는 분리된 핵산을 제공하며, 여기서 상기 전사단위는 상기 항원의 합성을 지시한다. 본 발명은 또한 플라비바이러스 항원을 생성시키기 위한 상기 핵산 전사단위 (TU)의 사용 및 상기 핵산 TU에 의하여 생산된 플라비바이러스 항원을 포함한다. 본 발명은 또한 플라비바이러스-특이적 항체를 생산하기 위한 및 플라비바이러스-특이적 항체의 존재를 검출하기 위한 본 발명의 TU에 의하여 코딩된 상기 플라비바이러스 항원의 사용을 포함한다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 분리된 핵산은 일본 뇌염 바이러스 신호 서열을 코딩하는 전사단위를 포함할 수 있다.
또다른 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 전사단위는 하기 플라비바이러스 중의 하나이상으로부터 유래할 수 있는 면역원성 플라비바이러스 항원을 코딩할 수 있다: 황열 바이러스, 뎅기 혈청형 1 바이러스, 뎅기 혈청형 2 바이러스, 뎅기 혈청형 3 바이러스, 뎅기 혈청형 4 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 포와산 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스.
또다른 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 전사단위는 하기 플라비바이러스 중의 2이상으로부터 유래한 서열을 포함할 수 있는 면역원성 키메라 플라비바이러스 항원을 코딩할 수 있다: 황열 바이러스, 뎅기 혈청형 1 바이러스, 뎅기 혈청형 2 바이러스, 뎅기 혈청형 3 바이러스, 뎅기 혈청형 4 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 포와산 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스.
특정한 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 핵산은 일본 뇌염 바이러스의 신호서열 및 웨스트 나일 바이러스, SLEV, YFV 및/또는 포와산 바이러스의 M 단백질 및 E 단백질을 코딩할 수 있다. 상기 핵산은 또한 플라비바이러스의 M 단백질, 플라비바이러스의 E 단백질, 플라비바이러스의 M 단백질 및 E 단백질 둘다, 플라비바이러스의 M 단백질의 일부분, 플라비바이러스의 E 단백질의 일부분 및/또는 플라비바이러스의 M 단백질의 일부분 및 플라비바이러스의 E 단백질의 일부분 둘다일 수 있는 면역원성 항원을 코딩할 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 분리된 핵산은 플라비바이러스의 M 단백질 및 E 단백질을 코딩한다. 더욱이, 본 발명의 핵산은 DNA일 수 있으며, 뉴클레오티드 서열 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23 또는 서열번호 42를 포함할 수 있다.
또다른 특정 구체예에서, 본 발명의 상기 핵산은 일본 뇌염 바이러스의 신호서열, 제2 바이러스의 M 단백질 및 상기 제2 바이러스의 E 단백질을 코딩하는 핵산의 일부분을 JEV E 단백질의 해당 부분을 코딩하는 핵산으로 치환하여 형성되는 키메라 E 단백질을 코딩할 수 있다. 또한, 상기 제2 바이러스의 E 단백질의 결실된 부분에 해당하는 서열의 부분은 제3 바이러스로부터 선택된 다른 서열로 치환할 수 있거나 비바이러스 서열일 수 있다. 제2 단백질은 웨스트 나일 바이러스, SLEV, YFV, 포와산 및/또는 뎅기 바이러스 중의 일 혈청형일 수 있다. 키메라 E 단백질은 카르복시 말단 부분은 하나의 플라비바이러스로부터 유래하고 상기 키메라 E 단백질의 나머지 부분은 또다른 플라비바이러스로부터 유래하는 단백질을 포함할 수 있다. 상기 카르복시 말단은 예를 들면, 상기 키메라 E 단백질의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 또는 75%이다. 본 발명의 상기 핵산은 DNA일 수 있고, 뉴클레오티드 서열, 서열번호 44 또는 서열번호 46으로부터의 단백질-코딩 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 핵산은 뉴클레오티드 서열, 서열번호 44 또는 서열번호 46를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 전사단위는 상기 항원의 합성을 작동가능하게 조절할 수 있도록 적절하게 배치된 조절서열을 또한 포함할 수 있다. 상기 조절서열은 예를 들면, 사이토메갈로바이러스 바로 초기(immediate early) 프로모터일 수 있다. 본 발명의 상기 핵산은 또한 상기 전사단위에 의하여 코딩되는 상기 항원을 포함하는 폴리펩티드의 번역 개시 부위에 위치한 코자크 컨센서스 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 전사단위는 폴리-A 터미네이터를 또한 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 상기 핵산을 포함하는 세포를 제공한다.
또한, 약제학적으로 허용가능한 담체 및 본 발명의 핵산 또는 세포 또는 항원을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 더욱이 효과적인 양의 본 발명의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 플라비바이러스에 의한 감염에 대항하여 개체를 면역화하는 방법을 제공한다. 특정한 구체예에서, 개체를 면역화하기 위하여 사용된 상기 조성물은 플라비바이러스의 M 단백질과 E 단백질 둘다의 합성을 지시하고, 개체의 체내의 세포에 상기 핵산이 삽입된 후에, 상기 세포는 상기 M 단백질 및 상기 E 단백질을 포함하는 서브바이러스 입자를 분비한다. 또한, 상기 조성물은 플라비바이러스의 M 단백질 및/또는 E 단백질 또는 M 단백질 및 E 단백질을 포함하는 서브바이러스 입자를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 방법에 있어서, 상기 면역화 조성물은 단일 용량(single dose)으로 개체에 투여될 수 있으며 비경구 경로를 통하여 투여될 수 있다.
더욱이, 본 발명은 본 발명의 상기 분리된 핵산으로부터 생산되는 상기 항원을 제공한다. 예로서, TU의 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 상기 제2 플라비바이러스로부터의 상기 항원은 예를 들면, 웨스트 나일 바이러스로부터 유래한 것일 수 있는 M 단백질일 수 있다. 상기 항원은 또한 뎅기 바이러스, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 포와산 바이러스 및/또는 황열 바이러스로부터 유래한 단백질일 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 항원은 제1 플라비바이러스로부터의 막통과 신호서열 및 추가로 SLEV, JEV, YFV, WNV 및/또는 포와산 바이러스로부터 일 수 있는, 제2 플라비바이러스로부터의 상기 prM/M 단백질의 나머지 부분을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 prM/M 단백질을 포함할 수 있다. 제1 플라비바이러스로부터의 상기 막통과 신호서열은 높은 신호서열 확률과 같은 원하는 특성을 부과하는 개선된 또는 변경된 신호서열일 수 있다. 디자인 또는 선발에 의하여 이러한 목적을 달성하기 위하여 숨겨진 마르코브 모델(hidden Markov model)을 사용하는 프로그램을 포함하는 기계-학습 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있으나, 상기 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 TU의 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩된 상기 항원은 웨스트 나일 바이러스 항원, 뎅기 바이러스 항원, 세인트루이스 뇌염 바이러스 항원, 일본 뇌염 바이러스 항원, 포와산 바이러스 항원 및/또는 황열 바이러스 항원일 수 있다.
상기 TU의 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩된 상기 항원은 또한 E 단백질일 수 있으며, 상기 E 단백질은 웨스트 나일 바이러스, 뎅기 바이러스, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 포와산 바이러스 및/또는 황열 바이러스로부터 유래할 수 있다. 코딩된 상기 항원은 또한 2이상의 플라비바이러스로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 E 단백질일 수 있다.
또한, 상기 TU의 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩된 상기 항원은 웨스트 나일 바이러스, 뎅기 바이러스, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 포와산 바이러스 및/또는 황열 바이러스로부터 유래한 것일 수 있는, M 단백질 및 E 단백질일 수 있다.
본 명세서에 사용된, "M 단백질" 또는 "prM 단백질" 또는 "prM/M 단백질"은 플라비바이러스 M 단백질 또는 플라비바이러스 prM 단백질을 의미한다. 예에는 하나이상의 플라비바이러스 prM 단백질로부터의 아미노산을 포함하는 prM 단백질, 추가의 아미노산 서열을 포함하지 않는 M 단백질 및 인 비트로 또는 인 비보에서 성숙한 M 단백질을 생성하기 위하여 가공되는 추가의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된, "핵산 전사단위" 또는 "핵산 전사단위 분자"는 하나이상의 특정한 단백질을 코딩하는 핵산을 의미한다. 상기 TU는 적당한 세포에 도입된 후에, 상기 핵산이 상기 핵산에 의하여 코딩되는 하나이상의 특정한 유전자 산물의 합성을 유도하도록 하는, 생물학적 활성을 갖는다. 상기 유전자 산물은 상기 TU와는 화학적으로 관련이 없는, 단백질과 같은, 다른 생물학적 거대 분자이다. 상기 핵산 TU는 상기 TU의 핵산에 의하여 코딩되는 특정한 유전자 산물 또는 산물들을 생산하기 위한 세포 성분을 이용하도록 상기 세포를 유도한다. 어떠한 핵산이라도 TU로서 역할을 할 수 있으나, 바람직한 구체예에서, 상기 TU는 플라스미드 또는 유사한 벡터의 DNA이고, 여기서 상기 플라스미드 또는 벡터는 마커 유전자의 코딩 서열 또는 실험 및 생합성을 위하여 상기 TU의 사용을 촉진하는 다른 서열 구조체(constructions)를 포함한다.
본 명세서에 사용된, "조절서열(control sequence)"은 상기 세포의 세포 성분과 상호작용하고, 상기 TU에 의하여 코딩되는 유전사 산물의 생합성을 증진 또는 활성화시키도록 하는 TU 내에 삽입된 조절(regulatory) 뉴클레오티드 서열이다. 따라서, 적당한 조절서열은 상기 세포의 성분이 상호작용할 수 있고, 유전자 산물의 합성이 이루어지도록 하는 서열이다. 특정된 코딩 서열에 관하여 핵산에 작동가능하게 배치되었을 때, 조절서열은 효과적으로 특정된 핵산의 발현을 효과적으로 조절하여 상기 유전자 산물을 생산한다.
본 명세서에 사용된, "프로모터(promoter)"는 조절서열로서 역할을 하는 TU 내의 뉴클레오티드 서열이다.
본 명세서에 사용된, "코자크 서열(Kozak sequence)" 또는 "코자크 콘센서스 서열(Kozak consensus sequence)"은 진핵 mRNA의 번역을 최적화하는 번역 개시 부위의 뉴클레오티드 서열이다 (Kozak, Mol. Cell. Biology 9: 5134-5142 (1989)).
본 명세서에 사용된, "터미네이터(terminator)"는 성숙한 mRNA의 3′말단에서 폴리아데닐레이션을 유도하는 작용을 하는 연장된(extended) 뉴클레오티드 서열 이다. 터미네이터 서열은 특정한 코딩 서열의 후, 또는 하류에서 발견된다.
본 명세서에 사용된, "세포(cell)"는 하나이상의 유전자 산물을 코딩하는 TU를 포함하거나, 그러한 TU가 도입되어진 원핵 또는 진핵 세포이다. 따라서, 세포는 성분으로서 상기 세포에 천연적으로 또는 내재적으로는 발견되지 않는 외래 또는 비균질(heterologous) 물질을 보유한다. 적당한 세포는 상기 TU가 도입된 결과로서 유전자 산물을 생합성할 수 있는 능력을 가진 세포이다. 특히, 적당한 세포는 상기 TU 내에 포함되어질 수 있는, 조절 서열 및 터미네이터 서열이 존재하는 경우, 이들에 반응하는 세포이다. 본 발명의 중요한 구체예에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다. 본 발명의 특히 중요한 구체예에서, 상기 세포는 상기 TU가 백신의 성분으로서 투여되어진 인간 또는 비인간 개체의 체내에 천연적으로 존재하는 세포이다. 또한, 백신으로서 또는 면역진단 분석 방법에서 사용 또는 증명(demostrative) 목적을 위하여 항원을 제조하는 것을 포함한, 분석 또는 진단적 적용에서, 상기 세포는 인 비트로 배양된 인간 또는 비인간 세포일 수 있다.
본 명세서에 사용된, 특정한 병원체에 특이적인 "백신(vaccine)" 또는 "개체를 면역접종하기 위한 조성물(composition for vaccinating a subject)"은 개체에 투여되었을 경우, 개체에서 면역원성 반응을 유도하는 조성물(preparation)을 의미한다. 본 명세서에 사용된, "면역원성(immunogenic)" 반응은 병원체에 대하여 개체에게 보호 면역성(protective immunity)을 부여하는 반응이다. 이론에 한정하고자 하는 의도는 아니나, 면역원성 반응은 중화 항체의 생성 (즉, 체액성 면역 반응) 또는 면역 체계의 세포독성 세포 (즉, 세포성 면역 반응) 또는 둘다로부터 발생할 수 있는 것으로 믿어지고 있다. 본 명세서에 사용된, "면역원성 항원(immunogenic antigen)"은 개체에 도입되었을 경우, 또는 숙주 또는 개체의 세포에서 합성되어진 경우, 면역원성 반응을 유도하는 항원이다. 본 명세서에 사용된, 백신 또는 면역접종 조성물의 "효과적인 양(effective amount)"은 개체에 투여되었을 경우, 개체에 보호 면역성을 부여하기에 충분한 양이다. 역사적으로, 백신은 활성 성분(active principle)으로서 상기 병원체, 특히 그 표면을 포함하는 하나이상의 특이적 분자 성분 또는 구조체를 포함하는 것으로 이해되었다. 그러한 구조체는 병원성 개체에 흔하게 발견되는 단백질, 탄수화물 복합체 및/또는 지질 복합체와 같은 표면 성분일 수 있다.
그러나, 본 명세서에 사용된 바와 같이, "백신" 또는 "개체를 면역접종하기 위한 조성물"은 앞절에서 요약된 종래의 의미를 확장한다는 점에 주의해야 한다. 본 명세서에 사용된, 이들 용어들은 또한 본 발명의 상기 TU 또는 상기 TU를 포함하는 조성물과 관련된다. 상기 TU는 개체의 세포내에서 상기 TU에 의하여 코딩된 하나이상의 특정한 유전자 산물의 생합성을 유도하며, 여기서 상기 유전자 산물은 병원체의 특정한 항원이다. 상기 생합성 항원은 다음으로 면역원(immunogen)으로 역할을 한다. 이미 설명한 바와 같이, 상기 TU, 및 그에 따른 상기 백신은 특정한 면역원성 항원을 코딩하는 임의의 핵산일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 백신의 TU는 DNA이다. 상기 TU는 추가의 유전자 또는 분자 생물학, 세포 생물학 및 바이러스 면역학의 분야에서 숙련된 작업자의 편의를 위한 특정한 서열이 삽입된 플라스미드 또는 벡터를 포함할 수 있다(원용에 의하여 본 명세서에 포함되어지는, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; 및 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 등, John Wiley 및 Sons, New York 1987 (4분기 마다 최신화됨), 참조).
본 발명의 상기 TU 분자는 WNV, JEV, 뎅기 바이러스, 황열 바이러스 및 SLEV와 같은 플라비바이러스의 항원과 관련되는 특정한 유전자 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, 그러나 상기 예에 한정되지는 않는, 핵산 또는 핵산의 유도체를 포함한다. 임의의 핵산이 TU로서 역할을 할 수 있으나, 중요한 구체예에서, 상기 TU는 DNA이다. 또한, 상기 핵산은 RNA 분자일 수 있다. 상기 핵산은 또한 약제학적 제제로서 TU의 안정성을 증가시키기 위하여 화학적으로 변경되어진 포스포디에스테르 골격을 갖는 DNA 또는 RNA의 여러 유도체 중의 임의의 하나일 수 있다. 그렇게 고안된 변경체에는 포스포로티오에이트 유도체 또는 포스포네이트 유도체가 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이들 및 다른 유도체의 예는 핵산 화학 분야에서의 당업자에게 잘 알려져 있다.
JEV의 게놈은 특성이 밝혀졌으며, 서열분석되었다 (도 1 및 2). M 구조 단백질은 프리-M 서열 (pr)을 포함하는 폴리단백질의 일부분으로서 발현된다. M 단백질 서열의 바로(immediatetely) 아미노 말단인 이 pr 서열은, 상기 폴리단백질의 가공에 있어서 고차구조적 문제(conformational problem)를 예방한다. 특히, 상기 pr 서열의 존재는 상기 E 단백질이 잘못 폴딩되는 것을 예방하는데 중요하다. 따라서, prM의 존재는 JEV 입자가 조립되어지도록 한다. 비록 M 단백질을 생성하기 위하여 prM 단백질을 절단하는 것이 감염성 입자를 생산하는데에 필요적인 것은 아닐지라도, 일단 비리온 또는 입자가 형성되면, M 단백질을 포함하는 성숙한 바이러스 입자를 생산하기 위하여 상기 pr 서열은 prM 단백질로부터 잘려질 수 있다. 많은 여러 관련된 플라비바이러스로부터 유래한 prM 서열은 낮은 정도로만 잘려지나, 상기 플라비바이러스 자체는 그럼에도 불구하고, 감염성이다. 비슷한 게놈 구조 및 기능을 갖는 그러한 관련된 플라비바이러스의 예에는 WNV, YFV, 뎅기 바이러스 및 SLEV가 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 본 발명의 플라비바이러스 M 및 E 단백질을 코딩하는 상기 TU는 DNA이다. 앞절에서 논의된 바에 따라서, 이 DNA는 pre-M 서열을 포함한, 상기 M 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 상기 E 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이런 방식으로, 상기 원하는 유전자 산물은 상기 세포내에서 서브바이러스 입자를 형성할 수 있게 된다. 다음으로, 상기 pre-M 서열은 완전한 비리온에 관하여 일어나는 것과 유사한 방식으로 잘려진다.
백신으로서 인 비보에서 효과적으로 기능을 하기 위하여는, 상기 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사를 증진 또는 촉진하는 효과를 갖는 조절 서열을 TU 내에 포함하는 것이 유익하다. 그러한 프로모터의 사용은 분자 생물학, 세포 생물학 및 바이러스 면역학의 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; 및 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 등, John Wiley 및 Sons, New York 1987 (4분기마다 최신화됨, 참조). 상기 TU가 포유동물 숙주에서 백신으로서 사용되는 경우, 바람직하게는 이용되는 상기 프로모터는 포유동물 세포에서 효과적으로 작동하는 프로모터이다. 그러한 프로모터는 전사가 촉진되어질 코딩 서열에 관하여 그러한 전사를 작동가능하게 촉진할 수 있는 위치에서 배치된다. 본 발명의 중요한 구체예에서, 이 프로모터는 사이토메갈로바이러스 초기(early) 프로모터. 더욱이, 본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 TU 핵산 서열에서 상기 코딩 서열 다음에 터미네이터 서열이 뒤따른다 (Sambrook 등). 본 발명의 특정한 구체예는 원핵 및 진핵 세포 모두에 관한 것이다. 원핵 또는 진핵 세포에 유용한 많은 프로모터 서열이 알려져 있다 (Sambrook 등 참조).
본 발명의 상기 핵산은 당업자에게 면역촉진 요소로서 알려진 DNA 서열을 더 포함할 수 있다. 그러한 요소의 예에는, 박테리아 DNA의 특정의 CpG 모티프가 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다 (Sato 등, Science 273: 352-354 (1996); Klinman 등, Vaccine 17: 19-25 (1998)).
본 발명의 상기 TU는 분자 생물학 분야의 당업자에게 잘 알려진 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 관련되는 과정은 예를 들면, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 및 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 등, John Wiley 및 Sons, New York 1987 (4분기마다 최신화됨)에 개시되어 있다. 상기 플라비바이러스 RNA 분자는 예를 들면, 플라비바이러스 및 또한 다른 그룹의 바이러스에 익숙한 바이러스 학자들 사이에 널리 알려진 방법에 의하여 생 바이러스의 시료로부터 분리할 수 있다. JEV에 대하여 사용되는 방법은 쿠노(Kuno) 등 (J. Virol. 72: 73-83 (1998))에 요약되어 있다. 상기 RNA는 역전사 효소를 이용한 cDNA를 합성하는데 주형으로서 사용된다. 상기 cDNA 단편으로부터, pre-M으로부터 E 코딩 영역을 포함하는 단편 (도 2)은 그러한 단편을 제공하기에 적절하게 상기 cDNA를 자르는 것으로 알려진 제한 효소로 소화시킴으로써 얻어진다. JEV를 제한 소화시키는 예는 니타야판(Nitayaphan) 등 (1990) 및 코니쉬(Konishi) 등 (1991)에 개시되어 있다. 사이토메갈로바이러스 프로모터와 같은 프로모터, 코자크 서열과 같은 효과적인 번역을 촉진하기 위한 서열 및 폴리아데닐레이션 신호를 삽입하는 것도 또한 비슷하게 분자 생물학 및 재조합 DNA 공학의 당업자에게 잘 알려져 있다 (Kozak, Mol. Cell. Biology 9: 5134-5142 (1989); Azevedo 등, Braz. J. Med. Biol. Res. 32: 147-153 (1999)). 원하는 코딩 서열 및 조절 서열을 포함하는 TU를 포함하는 핵산을 제조하는 경우, 핵산을 증폭하는 방법에 의하여 많은 양으로 얻어질 수 있다. 그러한 방법은 분자 생물학 및 재조합 DNA 공학의 당업자에게 널리 알려져 있다. 그러한 방법의 예에는 원핵 세포와 같은 세포 내에서 배양하고 배양 완료후에 상기 플라스미드를 회수하는, 증폭을 위하여 상기 핵산을 플라스미드 내에 삽입하는 방법 뿐만 아니라, PCR과 같은 방법 및 다른 증폭 과정에 의한 핵산의 증폭이 포함되며, 당업자에게 잘 알려져 있다. 상기 TU를 포함하는 상기 핵산을 얻는 방법이 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 TU-함유 핵산 분자는 분자 생물학 및 바이러스 면역학 분야의 당업자에게 잘 알려진 많은 방식으로 적당한 세포내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 세포에 의하여 도입되어지는 플라스미드 또는 비슷한 핵산 벡터내로의 삽입, 또는 리포좀, 특히 양이온성 지질을 포함하는 리포좀과 같은 낭포성(vesicular) 지질 구조내에 포집, 또는 엔도사이토시스(endocytosis)에 의하여 세포내로 삽입되어지는 입자에의 흡착이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
일반적으로, 본 발명의 세포는 TU를 포함하거나, TU가 도입된 원핵 또는 진핵 세포이다. 본 발명의 상기 TU는 상기 인코딩된 prM/M 및 E 항원의 세포내 생합성을 유도한다. 적당한 세포는 상기 핵산의 도입의 결과로서 상기 유전자 산물을 생합성할 수 있는 능력을 가진 세포이다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 적당한 세포는 상기 TU 내에 포함되어질 수 있는 조절서열 및 터미네이터 서열이 존재하는 경우, 이들 서열에 반응하는 세포이다. 이러한 방식으로 반응하기 위하여는, 그러한 세포는 그 내부에 조절 서열 및 터미네이터와 상호작용할 수 있는 성분을 포함하고, 각각의 촉진 및 종결 기능을 수행하도록 작용한다. 상기 세포가 인 비트로에서 배양되는 경우, 상기 세포는 원핵, 단세포 진핵 또는 다세포 진핵 세포일 수 있다. 본 발명의 특정한 구체예에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다. 이들 경우에, 합성된 prM/M 및 E 단백질 유전자 산물은 백신으로서 또는 면역진단 분석 방법에 사용하기 위한, 또는 증명(demostrative) 목적을 위한 항원을 제조하는 것을 포함한, 분석적 또는 진단적 적용에의 사용에 이용가능하다.
상기 세포가 배양된 포유동물 세포인 경우와 같은, 일부의 경우에, 상기 prM/M 및 E 항원은 서브바이러스 입자의 형태로 분비된다. 이들은 표면 초미세구조적 모양 및 면역원성 특성에 있어서 생 바이러스와 닮은 prM/M 및 E 단백질의 응집체(aggregate)이다. 그러나, 본 발명의 상기 TU는 플라비바이러스 게놈의 나머지 부분을 포함하고 있지 않기 때문에, 캡시드가 삽입되어 있지 않고, 가장 중요하게는, 감염성 바이러스 RNA가 포함되어 있지 않다.
본 발명의 또다른 중요한 구체예에서, 상기 세포는 상기 TU가 백신으로서 도입되어지는 개체의 자연적 세포 구성원이다. 상기 TU는 상기 개체에 도입되어지는 경우, 상기 개체의 세포에 의하여 섭취된다. 상기 개체의 세포는 임의의 프로모터 서열 및 터미네이터가 존재하는 경우, 이들 서열에 반응하는 능력을 가진다. 어떠한 경우에도, 상기 TU는 상기 개체의 세포가 플라비바이러스 prM/M 및 E 유전자 산물을 합성하도록 유도한다. 이론적 고찰에 한정하고자는 하는 의도는 아니나, 인 비트로에서 배양된 포유동물 세포에 일어나는 것으로 밝혀진 바와 같이, 상기 개체의 세포는 상기 prM/M 및 E 항원으로 구성되는 인 비보 서브바이러스 입자를 생산하는 것으로 믿어진다. 그러한 서브바이러스 입자는, 다음으로 개체에 보호 면역성을 부여하는 면역 반응을 생성하도록 상기 개체의 면역 체계를 자극하는, 인 비보 면역원(immunogen)으로서 작용하는 것으로 여겨진다. 역시 이론에 의하여 본 발명을 한정하고자는 하는 의도는 아니나, 상기 얻어지는 보호 면역성은 체액성 또는 세포성 면역, 즉, MHC 클라스 II- 또는 클라스 I-제한된 기작, 각각, 또는 이 두 기작에 의하여 발생할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 prM 및/또는 E 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 효과적인 양의 TU를 개체에 투여함으로써, 개체는 JEV, YFV, 뎅기 바이러스, SLEV, WNV 또는 다른 플라비바이러스와 같은, 플라비바이러스에 의한 감염에 대항하여 면역화된다. 상기 핵산은 개체의 세포에 삽입된 후에, 플라비바이러스 prM/M 및/또는 E 항원을 합성하도록 유도한다.
상기 개체에 상기 TU를 투여하기 위하여, 상기 TU는 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 삽입되어진다. 상기 "약제학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"이란 용어는 생물학적으로 또는 다른 방법으로 부적절(undesirable)하지 않은 물질을 의미한다. 즉, 상기 물질은 어떠한 부적절한 생물학적 효과를 야기시키기 않거나 상기 담체가 포함되어진 백신의 임의의 다른 성분과 해로운 방식으로 상호작용하지 않으면서 면역원성 물질(즉, 재조합 플라비바이러스 단백질 항원 또는 그 일부분)과 함께 개체에 투여될 수 있다는 것을 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 담체, 또는 그 성분의 예에는, 물, 생리적 염수 및 통상의 생리학적 버퍼(추가의 예에 대하여는, Arnon, R. (Ed.) Synthetic Vaccines I: pp. 83-92, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1987 참조)가 포함된다.
면역접 용량(dose)을 기술하는데 있어서 중요한 값(critical value)은 독성 또는 야생형 플라비바이러스 감염에 의하여 야기되는 감염성 질병을 앓고 있는 숙주에서 보호 반응을 유도하는 데 필요로 하는 면역원의 총량인 것으로 당업자에게 이해되고 있다. 사용되는 용량의 수 및 부피는 변할 수 있으며, 나이, 체중, 성별, 종, 투여되는 백신의 형태, 투여 방식, 개체의 전체 조건 등과 같은 변수 뿐만 아니라, 당업자에 의하여 인정된 다른 중요한 인자에 근거하여, 종사자(practitioner)에 의하여 결정된다.
상기 TU는 경구, 비경구(예, 정맥내), 근육내 주사, 복강내 주사, 경피(transdermally), 체외(extracorporeally), 경비, 국소 등으로 개체내에 투여될 수 있다. 삽관법(intubation)을 통하여 호흡기 체계의 임의의 영역 (예, 폐)에 직접적으로도 전달될 수 있다. 필요로하는 상기 TU의 정확한 양은 종, 나이, 체중, 개체의 일반적 조건, 사용되는 백신의 면역원성, 개체가 면역화되어지는 플라비바이러스의 종 또는 주, 투여 방식 등에 따라 개체 마다 다르다. 따라서, 본 발명의 매 구체예에 대하여 정확한 양을 특정하는 것은 불가능하다. 그러나, 적절한 양은 본 명세서에 개시된 내용 및 당업계에 알려진 사항만을 사용한 통상적인 실험에 의하여 당업자에 의하여 결정될 수 있다.
본 발명의 백신이 비경구 투여되는 경우, 일반적으로 주사에 의하여 특징지워진다. 주사가능한 제제는 액체 용액 또는 현탁액, 용액에 적당한 고체 형태 또는 주사전의 액체 중의 현탁액, 또는 유화액(emulsion)과 같은 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 보다 최근에 고안된 비경구 투여 접근법은 일정한 투여량(dosage)이 유지되는 서방 또는 지속 방출 시스템을 사용하는 것에 관한 것이다. 예, 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어지는, 미국특허 제 3,610,795호 참조.
고체 조성물에 대하여, 통상적인 비독성 고체 담체에는, 예를 들면, 약제학적 등급의 마니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탈크, 셀룰로즈, 포도당, 자당, 마그네슘 카르보네이트, 등이 포함된다. 액체 약제학적으로 투여가능한 조성물은 예를 들면, 본 명세서에 설명한 바와 같은 활성 성분 및 선택적 약제학적 보조제를 예를 들면, 물, 염수, 수성 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 부형제 중에 용해, 분산 등을 수행하여, 용액 또는 현탁액을 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 희망하는 경우, 투여되어질 약제학적 조성물은 예를 들면, 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소듐 아세테이트, 트리에탄올아민 올리에이트 등과 같은 수화제(wetting agent) 또는 유화제, pH 버퍼제 등과 같은 부수적인 양(minor amount)의 비독성 보조 물질을 또한 포함할 수 있다. 그러한 투여 형태(dosage form)를 제조하는 실제적 방법은 당업자에게 알려져 있거나, 분명하다; 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E. W. (ed.), 최신판, Mack Publishing Co., Easton, Pa.) 참조.
일 구체예에서, 본 발명의 상기 TU는 전기전달 매개 인 비보 유전자 전달법 (electrotransfer)을 사용하여 개체에 투여될 수 있다. 상기 방법에서, 상기 TU를 개체에 투여한 직후, 경피적(transcutaneous) 전기 펄스가 상기 개체에 인가되어, 상기 개체의 조직으로 인 비보 핵산 전달이 더 높은 효율과 재현성으로 이루어지도록 한다 (Mir 등, Proc. Nat. Acad. Sci USA 96: 4262-4267 (1999)).
본 발명의 백신을 개체에 투여함으로써 개체를 면역화하는 방법을 설명하고 있는 본 발명의 방법에서, 상기 면역화의 효능(efficacy)은 개체의 면역 상태를 모니터링하기 위한 당업계에 잘 알려진 임상적 과정에 따라서 모니터링될 수 있다.
면역접종 조성물의 효과적인 양은 개체에 투여되었을 경우, 상기 개체에 보호 면역성을 부여하는 양인 것으로 당업자에 의하여 용이하게 결정된다. 그러한 결정을 하기 위하여, 숙련된 작업자(skilled artisan)는 상기 백신이 투여된 개체의 혈중에 존재하는 플라비바이러스 prM/M- 및 E-특이적 항체 및/또는 플라비바이러스 prM/M- 및 E-특이적 세포독성 T 림프구를 유도할 수 있는 능력을 검사할 수 있다. 또한, 실험적 개체를 면역화하기 위하여 사용되는 항원성 조성물에 해당하는 생 플라비바이러스 챌린지에 의하여 상기 실험 개체에 부여되는 보호 면역성의 수준을 결정할 수도 있다. 그러한 챌린지 실험은 당업자에게 잘 알려져 있다.
일반적으로, 본 발명에 따른 WNV, JEV, YFV, 뎅기 바이러스, SLEV, 또는 다른 플라비바이러스에 의한 감염에 대항하여 개체를 면역화하기 위하여, 그러한 방법에 사용되는 상기 TU가 다른 전체 크기(overall size)를 가질 수 있다는 것을 인정한다면, 약 0.1 ㎍/kg 체중 내지 약 50 ㎍/kg 체중 범위의 용량이 사용될 수 있다.
DNA인 본 발명의 TU가 근육내(i.m.) 주사 또는 전기적전달(electrotransfer)에 의하여 상기 TU를 단일 효과적인 용량(dose)만을 투여한 후에 약 100%의 효율 수준으로 보호 면역성을 부여한다는 것이 예기치 않게 밝혀졌다. 이는 (상기한 바와 같은) 통상적인 백신을 사용하여 수행되는 많은 면역화 방법과 대조적인데, 상기 통상적인 방법은 하나이상의 부스터 면역접종을 필요로 하고, 100% 가까운 효율로 보호 면역성을 부여하지 않는다.
또한, 보호 면역성은 면역접종된 암컷 개체로부터 상기 개체의 자손에게 전파될 수 있다는 것이 예기치 않게 밝혀졌다. 어미가 본 발명의 상기 TU DNA로 면역접종된 후에 신생 생쥐의 상당한 부분이 바이러스 챌린지에 대하여 보호되는 것이 밝혀졌다. 본 발명의 범위를 이론에 한정하고자 하는 의도는 아니나, 다양한 병원체에 특이적인 중화 항체가 모유에 존재함으로 인하여 수동 면역성이 신생 포유동물에 부여될 수 있다는 것이 알려져 있다. 신생 생쥐에서 발견된 JEV에 대한 보호 면역성은 이런 방식으로 그들에게 전달될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 상기 TU는 제1 플라비바이러스의 신호서열과 제2 플라비바이러스의 면역원성 플라비바이러스 항원을 코딩한다. 따라서, 일 구체예에서, 예를 들면, 제1 플라비바이러스의 구조 단백질의 신호서열이, 신생(nascent) 폴리펩티드가 적절하게 폴딩되게 하고, 숙주에서 적절하게 가공되게 하고, 및/또는 상기 가공된 단백질을 적절하게 폴딩되도록 하는 제2 플라비바이러스의 구조 단백질의 신호서열로 치환된다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 상기 TU는 하나의 플라비바이러스라기 보다는 하나이상의 플라비바이러스로부터의 서열을 포함하는 면역원성 플라비바이러스 항원을 코딩할 수 있다. 상기 신호 서열은 개선된 신호 서열일 수 있다. 신호 서열의 개선, 또는 더 적절한 신호 서열의 선발은 실시예 18 및 거기에 인용된 문헌에 개시된 원리 및 가르침을 적용하여 달성될 수 있다. 상기 인용 문헌 각각은 원하는 특성 및 기능을 가진 신호서열의 선발, 확인 및 디자인과 각각 관련된 명확한 가르침을 위하여 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어진다. 일반적으로, 이들 원하는 특성 및 기능에는 높은 신호서열 확률이 포함된다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 2이상의 플라비바이러스로부터 유래한 면역원성 플라비바이러스 항원을 코딩하는 2이상의 TU 또는 TU가 단일 조성물에 포함된다. 따라서, 일 구체예에서, 예를 들면, TU는 2이상의 플라비바이러스로부터 유래한 단백질로 가공될 수 있는 신생 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들을 코딩할 수 있다. 바람직하게는, 상기 가공된 단백질은 상기 단백질에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 서브바이러스 입자를 형성한다. 상기 서브바이러스 입자는 동일한 플라비바이러스, 플라비바이러스의 조합, 또는 키메라 플라비바이러스 단백질의 서열로부터 유래하는 가공된 단백질로부터 형성될 수 있다. 2이상의 플라비바이러스로부터 유래한 면역원성 플라비바이러스 항원을 코딩하는 2이상의 TU 또는 TU를 포함하는, 조합 백신(combination vaccine)은 특정한 지리적 영역에 고유하거나 마주칠 것 같은 플라비바이러스로부터 유래한 단백질을 포함시킴으로써 특정한 지리적 영역에서 사용하기 위하여 맞추어질 수 있다. 예를 들면, 열대 및 아열대 아시아 지역용 백신에는 DEN의 4개의 혈청형, WN, 및 JE 바이러스 백신으로부터의 단백질을 코딩하는 TU를 포함할 수 있다. 비슷하게 아프리카 및 라틴 아메리카에 유용한 백신은 각각, DEN의 4개의 혈청형, WN, 및 YF 바이러스 및 DEN의 4개의 혈청형, 로치오(Rocio), 및 YF 바이러스로부터의 단백질을 코딩하는 TU를 포함할 수 있다.
또다른 구체예에서, 상기 TU는 제1 플라비바이러스의 구조 단백질의 신호서열 및 2이상의 플라비바이러스로부터의 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 키메라 플라비바이러스 항원을 코딩한다. 상기 신호서열은 일본 뇌염 바이러스 신호서열일 수 있다. 상기 키메라 플라비바이러스 항원은 일본 뇌염 바이러스 항원으로부터의 서열을 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 상기 키메라 항원은 E 단백질이다. 상기 E 단백질의 카르복시 말단 부분은 일본 뇌염 바이러스로부터의 E 단백질 서열일 수 있다. 상기 카르복시 말단 부분은 예를 들면, 상기 키메라 E 단백질의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 75% 일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 TU는 일본 뇌염 바이러스의 구조 단백질의 신호서열, 뎅기 바이러스의 prM 단백질 및 일본 뇌염 바이러스 및 뎅기 바이러스 둘다로부터의 서열을 포함하는 키메라 E 단백질을 코딩한다. 상기 키메라 단백질은 카르복시 말단 부분이 일본 뇌염 바이러스 서열을 포함하는 E 단백질일 수 있다. TU의 예에는 서열번호 45 및 서열번호 47에 나타낸 바와 같은 플라비바이러스 항원의 합성을 지시할 수 있는 서열번호 44 및 서열번호 46에 나타낸 바와 같은 핵산 서열이 포함된다.
또한, 본 발명은 단백질 백신으로서 사용하기 위하여 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 전사단위로부터 생산된 항원은 개체에서 효과적인 면역 반응을 유도하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위한 항원은 플라비바이러스 prM 단백질, 플라비바이러스 M 단백질, 플라비바이러스 E 단백질 또는 상기 단백질의 면역원성 단편을 포함한, 그들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 특히 바람직한 구체예는 본 명세서에 기술한 바와 같은 상기 NRA의 사용이다. 더욱 바람직한 구체예는 하나의 플라비바이러스의 신호서열 및 하나이상의 다른 플라비바이러스의 구조 단백질을 포함하는 키메라 단백질이다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 항원의 신호서열은 일본 뇌염 바이러스 신호서열이다. 다른 바람직한 구체예에서, 상기 신호 서열은 개선된 신호 펩티드이다. 신호 서열의 개선, 또는 더 적절한 신호 서열의 선발은 실시예 18 및 거기에 인용된 문헌에 개시된 원리 및 가르침을 적용하여 달성될 수 있다. 상기 인용 문헌 각각은 원하는 특성 및 기능을 가진 신호서열의 선발, 확인 및 디자인과 각각 관련된 명확한 가르침을 위하여 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어진다. 일반적으로, 이들 원하는 특성 및 기능은 높은 신호서열 확률을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 상기 단백질 백신은 적당한 보조제를 더 포함한다. 본 명세서에 사용된, "보조제(adjuvant)"는 면역 반응의 강화제(potentiator) 또는 증진제(enhancer)이다. "적당한(suitable)"이라는 용어는 면역접종되는 개체에 부작용(adverse reaction)을 생산하지 않으면서, 상기 면역 반응을 증가시키기 위하여 백신 면역원(즉, 플라비바이러스 prM 단백질, 플라비바이러스 M 단백질, 플라비바이러스 E 단백질, 또는 그들의 임의의 조합)과 조합되어 사용될 수 있는 임의의 물질을 포함하는 의도이다. 특정한 보조제의 효과적인 양은 면역접종되는 개체의 면역 반응에 미치는 특정한 보조제의 강화(potentiation) 효과를 최적화하기 위하여 용이하게 결정될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 상기 백신의 보조 작용(adjuvanting)은 먼저 2% 알루미늄 히드록사이드 용액 및 다음으로, 미네랄 오일을 이용하는, 2-단계 공정이다. 특정한 구체예에서, 적당한 보조제는 하기 그룹으로부터 선택될 수 있다: 미네랄, 수중 식물유 또는 어류 오일 유화액, 불완전 프로인트 보조제, E. coli J5, 덱스트란 설페이트, 철 옥사이드, 소듐 알지네이트, 박토-보조제(Bacto-Adjuvant), Carbopol (BF Goodrich Company, Cleveland, Ohio)과 같은 특정한 합성 중합체, 폴리-아미노산 및 아미노산의 중합체, 사포닌, 카라지난, REGRESSIN (Vetrepharm, Athens, Ga.), AVRIDINE (N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-히드록시에틸)-프로판디아민), O-아세틸화 기가 산재되어 있는 긴 사슬 다중분산된(polydispersed) β(1,4) 결합 만난 중합체 (예, ACEMANNAN), 미토박테리움 종의 비병원성 주(strain)로부터 유래하는 단백질이 제거된 고도로 정제된 세포 벽 추출물 (예, EQUIMUNE, Vetrepharm Research Inc., Athens Ga.), 만나이트 모노올리에이트(Mannite monooleate), 파라핀 오일 및 뮤라밀 디펩티드.
또다른 태양에 있어서, 본 발명은 면역원성 양의 본 발명의 상기 단백질 백신으로 개체를 면역화하여 개체에서 효과적인 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 면역화는 경구, 비경구, 비강내, 기관내(intratracheally), 근육내, 유방내(intrammarily), 피하(subcutaneously), 정맥내 및/또는 진피내(intradermally)로 수행될 수 있다. 플라비바이러스 prM 단백질, 플라비바이러스 M 단백질 및/또는 플라비바이러스 E 단백질을 포함하는 상기 백신은 주사, 흡입, 섭취(ingestion), 또는 주입(infusion)에 의하여 투여될 수 있다. 단일 용량으로 투여될 수 있으며/또는, 백신 조성물의 반복 용량, 즉 "부스터(boosters)"가 초기 면역 반응 및/또는 마지막 용량이 투여된 이후 오랜 기간 동안 증진시키기 위하여 일정한 시간 간격으로 투여될 수 있다. 상기 백신접종의 시간 간격은 개체의 나이 및 조건에 따라 변할 수 있다.
"면역원성 양(immunogenic amount)"이라는 용어는, 면역접종된 개체에 면역 반응을 유도하기에 충분하고, 노출되었을 경우 야생형 또는 독성 플라비바이러스 감염에 의하여 야기되는 질병에 대항하여 개체를 보호하거나 상기 면역접종된 개체에 대한 플라비바이러스 감염의 영향을 감소시키는 치료 또는 상업적으로 유익한 효과를 갖는 면역원, 또는 그 일부분의 양을 의미한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원에 의한 면역화에 대응하여 생산되는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 온전한 면역글로불린, 키메라 면역글로불린 분자, "인간화된 항체" 또는 Fab 또는 F(ab')2일 수 있는 다클론 및 단일클론 항체를 포함할 수 있다. 그러한 항체 및 항체 단편은 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어지는, 할로우(Harlow) 및 레인(Lane) (Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) 및 콜러(Kohler) 등 (Nature 256:495-97, 1975) 및 미국특허 번호 제5,545,806호, 제5,569,825호 및 제5,625,126호에 개시된 기술을 포함하는 당업계에 잘 알려진 기술에 의하여 생산될 수 있다. 상기 항체는 임의의 이소타입 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM일 수 있다.
본 발명은 또한 연결된 VH 및 VL 도메인 및 천연 항체의 이디오타입(idiotype)의 고차구조(conformation)와 특이적 결합 활성을 보유하고 있는, 단일쇄 항체(ScFv)를 포함할 수 있다. 그러한 단일쇄 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 표준 방법에 의하여 생산될 수 있다 (예를 들면, Alvarez 등, Hum. Gene Ther. 8: 229-242 (1997) 참조).
하나이상의 플라비바이러스의 prM, M 및/또는 E 항원의 면역원성 아미노산 서열 및 여러 플라비바이러스의 신호서열 (예, JEV)을 코딩하는 핵산 서열로부터 합성되는 본 발명의 항원에 대항하는 항체가 생산되어질 수 있다. 이들 키메라 구조체를 사용함으로써 합성되는 면역원성 펩티드는, 아미노산 서열에 있어서 면역원성 영역을 확인하는데 및 본 발명의 항체를 생산하기 위하여 사용되는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 용이하게 확인될 수 있다.
항원/항체 복합체 뿐만 아니라, 항원/항체 복합체 형성을 검출하기 위한 분석방법 및 검출된 단백질을 정량하는 방법은 당업계에 표준적이다. 그러한 분석 방법에는 당업자에게 잘 알려진 바와 같은, 웨스턴 블롯팅, 면역침전법, 면역형광법, 면역세포화학(immnunocytochemistry), 면역조직화학, 형광 활성화된 세포 소팅(FACS), 형광 인 시투 혼성화(FISH), 면역자기 분석(immunomagnetic assay), ELISA, ELISPOT (Coligan 등, eds. 1995. Current Protocols in Immunology. Wiley, N.Y.), 응집 분석(agglutination assay), 면상반응(綿狀反應) 분석 (flocculation assays), 세포 패닝(panning) 등이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "결합한다(bind)"라는 용어는 항원에 대한 잘 특성화된 항체의 결합 뿐만 아니라, 다른 항원과의 무작위 결합(association)을 의미한다. 본 명세서에 사용된 "특이적으로 결합한다(specifically bind)"라는 용어는 특정한 항원, 본 발명의 경우에는 본 발명의 항원 이외의 항원에는 실질적으로 교차반응하지 않는 항체 또는 다른 리간드를 나타낸다.
본 발명의 항체 또는 리간드는 기질(예를 들면, 비드, 튜브, 슬라이드, 플레이트, 니트로셀룰로즈 시트 등)에 결합되거나 검출가능한 부위(moiety)에 접합되거나 결합 및 접합되어질 수 있다. 본 발명에 의하여 고려된 상기 검출가능한 부위는 면역형광 부위(예, 플루오레신(fluorescein), 로다민(rhodamine)), 방사성 부위(예, 32P, 125I, 35S), 효소 부위 (예, 호스래디위 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제), 콜로이드성 금 부위 및 바이오틴 부위를 포함하나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 그러한 접합 기술은 당업계에 표준이다 (예를 들면, Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Yang 등, Nature 382: 319-324 (1996)).
본 발명은 또한 항원/항체 복합체가 형성될 수 있는 조건하에서, 시료를 본 발명의 플라비바이러스 항원과 접촉하는 단계; 및 상기 복합체의 형성을 검출하여, 상기 시료 중의 플라비바이러스 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 시료 중의 플라비바이러스 항체를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 항원/항체 복합체가 형성될 수 있는 조건하에서, 시료를 본 발명의 플라비바이러스 항체와 접촉하는 단계; 및 상기 복합체의 형성을 검출하여, 상기 시료 중의 플라비바이러스 항원을 검출하는 단계를 포함하는, 시료 중의 플라비바이러스 항원을 검출하는 방법을 제공한다.
시료 중의 플라비바이러스 항원을 검출하는 방법은 예를 들면, 개체로부터 유래한 액체(fluid) 또는 조직을 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계 및 상기 항체와 항원의 결합을 검출하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 상기 항원은 온전한 플라비바이러스 비리온 상에 있을 수 있고, 상기 항원을 발현하는 플라비바이러스-감염된 세포의 표면 상에 표시된 플라비바이러스-코딩된 단백질일 수 있고, 또는 상기 항원의 단편일 수 있다. 본 발명의 액체 시료는 뇌척수액, 혈액, 쓸개즙(bile), 혈장, 혈청, 침 및 뇨와 같은, 항원 또는 항원을 포함하는 세포를 포함할 수 있는 임의의 생물학적 액체를 포함할 수 있다. 체액의 다른 가능한 예에는 가래(sputum), 점액(mucus) 등을 포함한다.
시료 중의 플라비바이러스 항체를 검출하는 방법은 예를 들면, 개체로부터 얻은 액체 또는 조직 시료를 본 발명의 항원과 접촉시키는 단계 및 상기 항원과 항체의 결합을 검출하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 본 방법의 액체 시료는 뇌척수액, 혈액, 쓸개즙(bile), 혈장, 혈청, 침 및 뇨와 같은, 상기 항체를 포함할 수 있는 임의의 생물학적 액체를 포함할 수 있다. 체액의 다른 가능한 예에는 가래(sputum), 점액(mucus) 등을 포함한다.
면역형광 분석법(IFA), 효소연결 면역흡착 분석법 (ELISA) 및 면역블롯팅과 같은 효소 면역분석법은 본 발명에 따른 플라비바이러스 항체를 검출하는 방법을 실현하기 위하여 용이하게 조정될 수 있다. 상기 항체를 검출하는 방법에 효과적인 ELISA 방법은 예를 들면, 다음과 같은 것일 수 있다: (1) 상기 항원을 기판에 결합시킨다; (2) 상기 결합된 항원을 상기 항체를 포함하는 액체 또는 조직 시료와 접촉시킨다; (3) 상기 반응물을 상기 결합된 항체에 반응성이 있는 검출가능한 부위(예, 호스래디쉬 퍼옥시다제 효소 또는 알칼리 포스파타제 효소)에 결합되어 있는 2차 항체와 접촉시킨다; (4) 상기 반응물을 상기 효소에 대한 기질과 접촉시킨다; (5) 상기 반응물을 발색제와 접촉시킨다; 및 (6) 색변화 또는 색 발생을 관찰/측정한다.
플라비바이러스 항체의 검출에 유용할 수 있는 또다른 면역학적 기법은 경쟁적 저해 분석법(competitive inhibition assay)에서 플라비바이러스 항원과 특이적 반응성이 있는 항체를 검출하기 위하여 단일클론 항체(MAb)를 사용한다. 간략하게 설명하면, 시료를 기판(예, ELISA 96-웰 플레이트)에 결합된 본 발명의 항원과 접촉시킨다. 과량의 시료는 완전히 세척하여 제거한다. 다음으로, 표지된 (예, 효소-연결, 형광, 방사성 물질, 등) 단일클론 항체를 전단계에서 형성된 항원-항체 복합체와 접촉시키고, 단일클론 항체 결합의 양을 측정한다. 단일클론 항체 결합 저해의 양을 대조군(항체가 없음)에 대하여 상대적으로 측정하여, 상기 시료 중의 항체의 검출 및 측정을 할 수 있도록 한다. 플라비바이러스의 특정한 변종(variety) 또는 주에 대한 단일클론 항체 결합 특이성에 근거하는 경우, 단일클론 항체 저해의 정도는 특정한 플라비바이러스 변종 또는 주를 검출하는데 아주 특이적인 분석방법일 수 있다. MAb은 또한 예를 들면, 표준 방법에 따른 면역형광 분석법(IFA)에 의하여 세포 중의 플라비바이러스 항원을 직접 검출하는 데 사용될 수 있다.
또다른 예로서, 미세-응집 시험법(micro-agglutination test)이 시료 중의 플라비바이러스 항체의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 간략하게 설명하면, 락테스 비드, 적혈구 또는 다른 응집가능한 입자를 본 발명의 상기 항원으로 코팅하고, 시료와 혼합하여, 상기 항원과 특이적 반응성이 있는 상기 시료 중의 항체가 상기 항원과 가교되어 응집을 일으키도록 한다. 상기 응집된 항원-항체 복합체는 육안으로 볼 수 있거나 분광기로 측정할 수 있는 침전물을 형성한다. 상기 시험법의 변형에 있어서, 본 발명의 항체는 상기 응집가능한 입자에 결합되어질 수 있으므로, 상기 시료 중의 항원을 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 항원/항체 복합체가 형성될 수 있는 조건하에서 상기 개체로부터 유래한 시료를 본 발명의 항원과 접촉시키는 단계; 및 항원/항체 복합체 형성을 검출하여, 개체의 플라비바이러스 감염을 진단하는 단계를 포함하는, 개체의 플라비바이러스 감염을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 항원/항체 복합체가 형성될 수 있는 조건하에서 상기 개체로부터 유래한 시료를 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계; 및 항원/항체 복합체 형성을 검출하여, 개체의 플라비바이러스 감염을 진단하는 단계를 포함하는, 개체의 플라비바이러스 감염을 진단하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 개시된 진단 방법에 있어서, 본 발명의 상기 항원은 기판에 결합되어지고, 혈액, 혈청, 뇨 또는 타액과 같은 액체 시료와 접촉된다. 이 시료는 환자로부터 직접 채취할 수 있거나, 부분적으로 정제된 형태일 수 있다. 이런 방식으로, 상기 항원에 특이적인 항체(일차 항체)는 상기 결합 항원에 특이적으로 반응할 것이다. 그후, 검출가능한 부위에 결합하거나 상기 부위로 표지된 이차 항체를 상기 일차 항체의 검출을 증진시키기 위하여 첨가할 수 있다. 일반적으로, 상기 항원의 다른 에피토프와 특이적 반응성이 있거나 리간드 또는 반응된 항체와 비특이적 반응성이 있는, 상기 이차 항체 또는 다른 리간드는 상기 일차 항체 상의 복수의 부위와 반응하는 능력에 대하여 선발될 것이다. 따라서, 예를 들면, 상기 이차 항체의 여러 분자는 각 일차 항체와 반응할 수 있어, 상기 일차 항체를 더 검출가능하게 한다.
상기 검출가능한 부위는 침전물 또는 색 변화의 육안 검출, 현미경에 의한 육안 검출, 또는 분광법, 방사능 측정법(radiometric measurement) 등에 의하여 자동 검출이 가능하도록 한다. 검출가능한 부위의 예에는 (형광 현미경에 대하여) 플루오로레신 및 로다민, (광학 또는 전자 현미경 및 생화학적 검출에 대하여) 호스래디쉬 퍼옥시다제, (광학 또는 전자 현미경에 대하여) 바이오틴-스트렙타비딘 및 (색 변화에 의한 생화학적 검출에 대하여) 알칼리 포스파타제가 포함된다.
본 발명의 상기 핵산 TU 분자를 제조하고 발현하는 것과 관련된 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술을 이용하는 일반적 방법은 예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 등, John Wiley 및 Sons, New York 1987 (4분기마다 최신화됨), 및 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. 에 개시되어 있다.
실시예 1 : JEV prM 및 E 항원을 코딩하는 상기 전사단위를 포함하는 재조합 플라스미드의 제조
게놈 RNA는 QIAampTM Viral RNA Kit (Qiagen, Santa Clarita, Calif.)를 이용하여 생쥐 뇌에서 생육된 150㎕의 JEV 주 SA 14 바이러스 시드로부터 추출하였다. 실리카 막에 흡착된 RNA를 80㎕의 뉴클레아제가 없는 물로 용출하고, JEV prM 및 E 유전자 코딩 서열의 증폭을 위한 주형으로 사용하였다. 프라이머 서열은 니타야판(Nitayaphan) 등 (Virology 177: 541-552 (1990))의 연구 결과로부터 얻었다. 게놈 뉴클레오티드 영역 389-2478을 포함하는 하나의 cDNA 단편이 역전사-PCR (RT-PCR)에 의하여 증폭되었다. 제한 부위 KpnI 및 XbaI, 콘센서스 코자크 리보좀 결합 서열, 및 번역 개시 부위를 앰플리머 14DV389 (뉴클레오티드 서열, 서열번호 1; 아미노산 서열, 서열번호 2)에 의하여 cDNA의 5′말단에 조작하여 만들었다. 인-프레임 번역 종결 코돈 및 뒤따르는 NotI 제한 부위을 앰플리머 c14DV2453 (서열번호 3) (도. 2)에 의한 cDNA의 3'말단에 도입하였다. 하나의 튜브(One-tube) RT-PCR을 Titan RT-PCR Kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)를 사용하여 수행하였다. 10㎕의 바이러스 RNA를 1㎕의 각 14DV389 (50 μM) 및 c14DV2453 (50 μM) 및 18 ㎕의 뉴클레아제가 없는 물과 혼합하고, 혼합물을 85 ℃에서 5분 동안 가열하고, 다음으로 4℃로 냉각하였다. 75㎕의 반응 믹스(reaction mix)[20 ㎕ 5x 버퍼, 2 ㎕의 dNTP 혼합물 (각각 10 mMh), 5 ㎕ 디티오트레이톨(dithiothreitol) (0.1 mM), 0.5 ㎕의 RNasinTM(40 U/㎕, Boehringer Mannheim), 2 ㎕의 폴리머라제 혼합물, 및 45.5 ㎕의 뉴크레아제가 없는 물]을 첨가하고, RT-PCR을 다음과 같이 수행하였다: 1 회 (50℃에서 30 분, 94℃에서 3 분, 50℃에서 30 초, 68℃에서 2.5 분), 9 회 (94℃에서 30 초, 50℃에서 30초, 68℃에서 2.5 분), 20 회 (제1회에서 94℃에서 30 초, 50℃에서 30 초, 68℃에서 2.5 분, 그후 5초/회로 증가), 및 68℃에서 15 분 동안 최종 연장. 상기 RT-PCR 산물을 QIAquickTM PCR Purification Kit (Qiagen)에 의하여 정제하고, 50 ㎕의 1 mM Tris-HCl, pH 7.5로 용출하였다.
모든 벡터 제조 및 분석은 표준 기법을 사용하여 수행하였다 (Sambrook 등, 1989). RT-PCR 증폭된 cDNA를 KpnI 및 NotI 뉴클레아제로 소화시키고, 진핵세포 발현 플라스미드 벡터의 KpnI-NotI 부위에 삽입하였다 (pCDNA3, Invitrogen, Carlsbad, Calif.). 전기천공-가능(competent) 대장균 XL 1-Blue 세포 (Stratagene, La Jolla, Calif.)를 전기천공(electroporation) (Gene PulserTM, Bio-Rad, Hercules, Calif.)에 의하여 형질전화시키고, 100 ㎍/mL 카르베니실린 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)을 포함하는 LB 아가 플레이트 상에 도말하였다. 클론을 선택하여 100 ㎍/mL 카르베니실린을 포함하는 3ml의 LB 브로쓰에 접종하였다. 14시간 배양후 플라스미드 DNA를 QIAprepTM Spin Miniprep Kit (Qiagen)를 사용하여 추출하였다. 제작자의 권고에 따라, 자동화 DNA 서열분석을 수행하였다(Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, Calif.). cDNA의 두가닥을 모두 서열분석하였고, 최초 SA14 주에 대한 서열과 동일한 것이 밝혀졌다 (Nitayaphan 등, 1990).
f1 ori, SV40 ori, 네오마이신 저항성 유전자 및 SV40 폴리(A) 요소를 포함하는 뉴클레오티드 1289번 내지 3455번의 플라스미드 pCDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)의 단편을 PvuII 소화에 의하여 결실시킨 다음, 연결하여 pCBamp 플라스미드를 생성하였다. 상기 pCBamp의 NcoI/KpnI 부위에서의 키메라 인트론 삽입체를 포함하는 벡터 pCIBamp를 NcoI와 KpnI로 소화시켜 pCI (Promega, Madison, Wis.)로부터 인트론 서열을 잘라냄으로써 제조하였다. 얻어진 566 bp 단편을 NcoI-KpnI로 소화시키고 289 bp 단편으로 치환시킴으로써 pCBamp에 클로닝하였다. 도 3은 플라스미드 pCDNA3, pCBamp, 및 pCIBamp 사이의 관계를 나타낸다.
JEV prM 및 E 단백질을 코딩하는 전사단위를 포함하는 플라스미드를 이들 플라스미드로부터 제작하였다. pCDNA3 벡터로부터 유래한, 재조합 플라스미드 pCDJE2-7 (뉴클레오티드 서열, 서열번호 10; 아미노산 서열, 서열번호 11)의 JEV prM 및 E 코딩 영역을 포함하는 cDNA 단편을 NotI 및 KpnI 또는 XbaI로 소화하여 클로닝하여 잘라내고, pCBamp, pCIBamp, pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), 또는 pREP4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)의 KpnI-NotI 부위, 또는 pRc/RSV (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 발현 벡터의 SpeI-NotI에 클로닝하여 pCBJE1-14 (뉴클레오티드 서열, 서열번호 17; 아미노산 서열, 서열번호 18), pCIBJES14, pCEJE, pREFE, 및 pRCJE를 각각 작제하였다. 각 플라스미드의 클론으로부터 유래한 cDNA의 두 가닥을 서열분석하고, 맞는 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 클론을 확인하였다. 포유동물 세포의 인 비트로 형질전환 또는 생쥐 면역화 실험에 사용하기 위한 플라스미드 DNA를 EndoFreeTM Plasmid Maxi Kit (Qiagen)를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 정제하였다.
실시예 2. 간접 면역형광 항체 분석법을 사용하여 다양한 재조합 플라스미드에 의하여 발현된 JEV prM 및 E 단백질의 평가.
다양한 재조합 발현 플라스미드에 의한 JEV 특이적 유전자 산물의 발현을 간접 면역형광 항체 분석(IFA)에 의하여 임시적으로 트랜스펙션된 세포주 COS-1, COS-7 및 SV-T2 (ATCC, Rockville Md.; 각각 1650-CRL, 1651-CRL, 및 163.1-CCL)에서 평가하였다. 상기 SV-T2 세포주는 예비적 결과에 의하면, 단지 1-2%의 형질전환된 SV-T2 세포만이 JEV 항원 양성이었기 때문에 추후의 시험에서 제외하였다. 형질전환을 위하여, 세포를 150 cm2 배양 플라스크에서 75% 컨플루언스(confluence)까지 생육시키고, 트립신처리하고, 포스페이트 버퍼 염수(PBS)에서 4℃에서 재현탁하여 최종 세포 수가 5 x106/mL가 되게 하였다. 10 ㎍의 플라스미드 DNA를 300 ㎕의 세포 현탁액에 150 V, 960 μF 및 100 Ω 저항으로 맞춰진 BioRad Gene PulseTM (Bio-Rad)를 사용하여 전기천공하였다. 전기천공 5분 후에, 세포를 25 mL 신선한 배지로 희석하고, 75 cm2 플라스크에 접종하였다. 48 시간 후, 형질전환 배지를 세포로부터 제거하고, 상기 세포를 트립신 처리하고 3% 정상 염소(goat) 혈청을 갖는 5ml PBS 중에 재현탁하였다. 10 ㎕ 분획을 슬라이드 상에 스팟팅하고, 공기 건조하고 -20℃에서 20분 동안 아세톤으로 고정하였다. IFA는 플루오레신 이소티오시아네이트-접합된 염소 항-생쥐 면역글로불린 G (Sigma Chemical Co.) 및 JEV HIAF를 사용하여 아세톤-고정된 플라스미드-형질전환 세포를 가지고 수행하였다.
다양한 프로모터 및 폴리(A) 요소가 JEV prM 및 E 단백질 발현에 미치는 영향을 결정하기 위하여, COS-1 및 COS-7 세포주를 동량의 pCDJE2-7 (서열번호 10), pCEJE, pREJE, 또는 pRCJE 플라스미드 DNA로 임시적으로 형질전환하였다. JEV 항원이 모든 4개의 재조합 플라스미드에 의하여 형질전환된 두 세포주 모두에서 발현되었으므로, CMV 또는 RSV (rous sarcoma virus) 프로모터 및 BGH 또는 SV40 폴리(A) 요소가 기능적으로 작용하는 것을 확인하였다. 그러나, IFA 양성 세포의 수 및 IFA 강도에 의하여 결정된 바와 같이, 형질전환 세포의 백분율 및 발현된 JEV 항원의 수준은 각각, 다양한 플라스미드 사이에서 크게 달랐다 (표 1). 상당히 높은 백분율의, pCDJE2-7 (서열번호 10), pCBJE1-14 (서열번호 17) 및 pCIBJES14에 의하여 형질전환된 COS-1 세포가 JEV 항원을 발현하였고, 상기 발현된 단백질의 수준은 JEV-감염된 세포와 상응하는 것이다. 반면, pCEJE, pREJE, 또는 pRCJE 벡터로 형질전환된 세포는 낮은 백분율의 항원-발현 세포 뿐만 아니라, 낮은 형광 강도을 나타내었으며, 이는 상기 항원의 발현이 약하다는 것을 나타낸다.
pCDJE2-7 (서열번호 10)에 의한 JEV 단백질의 발현증가가 SV40-코딩된 진핵세포 복제 기점에 의하여 영향을 받았는지를 확인하기 위하여, pCDJE2-7로부터 f1 ori, SV40 ori, 네오마이신 저항성 유전자 및 SV40 폴리(A) 요소를 포함하는, 2166 bp 단편을 결실시킨 플라스미드 pCBJE1-14 (서열번호 17) 제조하였다. 다음으로, 키메라 인트론을 pCBJE1-14에 삽입하여 pCIBJES14을 생성하였다. 상기 pCIBJES14 플라스미드를 JEV 단백질의 발현이 상기 인트론 서열에 의하여 증진될 수 있는지를 결정하기 위하여 사용하였다. 형질전환한 후, pCBJE1-14 및 pCIBJES 14 벡터를 포함하는 세포는 pCDJE2-7 (표. 1)에 대하여 관찰된 것과 비슷한 수준의 JEV 항원을 발현하였다. 이 결과는 재조합 벡터에 의한 JEV prM 및 E 항원의 발현은 상기 전사 조절 요소에 의하여만 영향을 받는다는 것을 나타낸다. 상기 진핵세포 복제기점 또는 상기 인트론 서열 어느 것도 사용된 세포에서 JEV 항원 발현을 증진시키지 않았다. 상기 CMV 프로모터 및 BGH 폴리(A) (도. 3)를 함유하는 벡터를 추후의 분석을 위하여 선택하였다.
실시예 3: JEV 특이적 유전자 산물을 구성적으로 발현하는 인 비트로 형질전환된, 안정한 세포의 선발
COS-1 세포를 전 실시예에서 설명한 바와 같이 전기천공에 의하여 10 ㎍의 pCDJE2-7 DNA로 형질전환하였다. 비선택 배양 배지에서 24시간 배양한 후, 세포를 네오마이신 (0.5 mg/mL, Sigma Chemical Co.)으로 처리하였다. 2-3 주 후에서 가시적으로 되는, 네오마이신-저항성 콜로니를 네오마이신-함유 배지에서 한정(limited) 희석에 의하여 클로닝하였다. 벡터-코딩된 JEV 유전자 산물의 발현을 JEV HIAF를 사용한 IFA에 의하여 초기 스크리닝하였다. 하나의 JEV-IFA 양성 클론 (JE-4B) 및 하나의 음성 클론(JE-5A)을 추가의 분석을 위하여 선택하고, 200 ㎍/mL 네오마이신 함유 배지에서 유지하였다.
JE-4B 클론에 의하여 발현된 JEV E 단백질의 진정성(authenticity)을 JEV E-특이적 쥐(murine) 단일클론 항체 (Mab)의 패널을 사용한 IFA에 의하여 에피토프 맵핑에 의하여 입증하였다(Kimura 등, J. Virol. 45: 124-132 (1983); Kimura-Kuroda 등, J. Gen. Virol. 67: 2633-2672 (1986) ; Zhang 등, J. Med. Virol. 29: 133-138 (1989); 및 Roehrig 등, Virol. 128: 118-126 (1983)). JEV HIAF 및 정상 생쥐 혈청을 양성 및 음성 항체 대조군으로 각각 사용하였다. 4개의 JEV-특이적, 6개의 플라비바이러스-서브그룹 특이적, 및 두개의 플라비바이러스-그룹 반응성 Mab은 4B 클론 또는 JEV-감염된 COS-1 세포와 비슷하게 반응하였다 (표. 2).
실시예 4 : JE-4B COS-1 세포주에 의하여 분비된 서브바이러스 입자의 항원 특성 및 면역학적 검출
a. 서브바이러스 입자의 제조.
JE-4B COS-1 세포를 200㎍/mL의 네오마이신를 포함하는 배지에서 생육 및 유지하였다. 상기 배양된 배지를 일상적으로 회수하여 4℃에서 저장하고, 2 주마다 보충(replenished)하고, 상기 세포를 매 7-10일 마다 1:5로 나누었다. 4℃에서 Sorvall F16/250 로터로 10,000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하여 배양 배지를 맑게 하고, 5% 자당 쿠션(w/w, 10 mM Tris HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl (TN 버퍼)으로 제조됨)을 통하여 4℃에서 Sorvall TH641 로터로 39,000 rpm으로 4시간 더 원심분리하였다. 서브바이러스 입자를 포함하는 상기 펠렛을 TN 버퍼에 재현탁하고 4℃에서 저장하였다. 또한(alternatively), 7% 또는 10% PEG-8000 (w/v)를 상기 맑게된 배양 배지에 첨가하였다. 상기 혼합물을 4℃에서 2시간 동안 교반하고, 상기 침전된 입자를 10,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 수집하였다. 상기 침전을 TN 버퍼에 재현탁하고, 4℃에 저장하였다. 상기 서브바이러스 입자를 38,000 rpm, 4℃에서 90 분 동안 TN에서 5-25% 연속 자당 구배에서 속도 띠 원심분리(rate zonal centrifugation)에 의하여 펠렛화 및 PEG-침전된 조성물로부터 정제하였다. 상기 구배의 상단(top)으로부터 1-mL 분획을 수집하고, 항원 포획 ELISA (아래 참조)에 의하여 시험하고, 상기 양성 분획을 TN 중의 25-50% 자당 구배 상에 적재하였다. 이 적재물을 35,000 rpm, 4℃에서 평형 밀도 원심분리(equilibrium density centrifugation)로 밤새 원심분리하였다. 상기 평형 구배로부터 0.9ml의 분획을 바닥으로부터 수집하였다. 수집물을 항원-포획 ELISA에 의하여 시험하고, pH 6.6에서 응집(hemagglutination) (HA) 활성을 검사하였다. 각 분획의 100 ㎕ 분액(aliquot)을 정확하게 무게를 재어 밀도를 결정하였다. 상기 ELISA-양성 분획을 풀링(pooling)하고 39,000 rpm, 4℃에서 3-4 시간 동안 펠렛화하고, 상기 펠렛을 TN 버퍼에 재현탁하였다. 항원-포획 ELISA 및 HA 역가를 상기 펠렛화 시료에 대하여 결정하였다. JEV-감염된 COS-1 세포 상등액을 또한 상기한 바와 같은 비슷한 정제 과정을 거쳐 상기 구배 분석을 위한 양성 대조군으로 사용하였다. JE 비리온을 또한 글리세롤/타르타레이트 평형 구배에서의 침강법에 의하여 감염후 5-6일 후 감염된 C6/36 세포로부터 정제하였다.
b. 서브바이러스 입자의 웨스턴 블롯트.
상기 서브바이러스 입자의 구배-정제된 시료를 전기영동 시료 버퍼와 혼합하고, 램리(Laemmli)에 의하여 설명된 바와 같은 (Nature 277: 680-685 (1970)), 10 또는 12.5% 소듐 도데실 설페이트-함유 폴리아크릴아미드 겔 (SDS-PAGE) 상에 전개하였다. 단백질을 니트로셀룰로즈 막으로 전이하고, 다클론 JEV HIAF, 플라비바이러스 교차-반응성 항-E Mab 4G2 (Henchal 등, Amer. J. Trop. Med. Hyg. 31: 830-836 (1982)), 또는 생쥐 항-prM 펩티드 과면역 혈청(JM01)으로 면역화학적으로 검출하였다. 도 4는 JEV 감염된 C6/36 및 JE-4B COS-1 세포에 의하여 생산된 M 및 E 단백질를 비교한 결과를 나타낸다. E 단백질에 대한 일부 비특이적 반응성이 정상 생쥐 복수 및 JMO1 항-펩티드 혈청에서 관찰되었다. M 및 E와 크기가 동일한 단백질이 상기 서브바이러스 입자에 분비되었으며, 각각 E-특이적 Mab 4G2 및 prM-특이적 JM01 항혈청에 의하여 검출할 수 있었다.
c. 배양 배지에서 JEV 서브바이러스 입자의 밀도 구배 검출. ELISA를 위하여, 항원-포획 항체 (4G2)를 0.1 M 소듐 카르보네이트 버퍼, pH 9.6에 희석하고, 4℃에서 밤새 배양하여 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Immulon U, Dynatech. Chantilly, VA)를 코팅하는데 사용하였다. PBS 중의 3% 정상 염소 혈청으로 블록킹하고, 2 배씩 연속 희석된 시료를 4G2-코팅된 플레이트에 첨가하고 37℃에서 1.5시간 동안 배양하였다. 포획된 항원을 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합된 6B6C-1 Mab 및 37℃에서 1시간 동안의 반응을 통하여 검출하였다. 다음으로, 고체상에서의 상기 효소 활성을 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)-ELISA (Life Technologies, Grand Island, NY)로 검출하였다.
JE-4B 세포의 15 x 150 cm2 플라스크로부터 약 500 mL 의 세포 배양 배지를 세포 접종후 4일 후에 수집하였다. PEG-침전된 서브바이러스 입자를 2 mL의 TN 버퍼, pH 7.5에 재현탁하였다; 이 재현탁된 펠렛 0.7 mL 분액을 5-25% 자당구배 상에 적재하였다. 서브바이러스 입자를 파괴하는 Triton X-100를 또다른 0.7ml 분액에 첨가하여 최종 농도가 0.1%가 되게 하고, 이를 O.1% Triton X-100을 포함하는 TN 버퍼에서 제조된 5-25% 자당 구배 상에 적재하였다. Triton X-100을 함유하는 상기 구배의 상단으로부터 약 2.5cm 지점에서 분명한 불투명 밴드가 관찰되었으나, 세제가 없는 상기 구배에서는 관찰되지 않았다. 각 구배에 대하여 상단으로부터 바닥까지 분획 (1 mL)을 수집하였다(도 5). 각 수집된 분획을 항원 포획 ELISA에 의하여 분석하였다. 항원은 분획 4-6에서 검출되었으며, 이는 서브바이러스 입자의 상대적으로 빠른 침감 특성을 나타낸다. JE-4B 배양 배지로부터 유래한 PEG 침전물을 Triton X-100로 처리함으로써, 상기 구배의 상단에 대한 ELISA-반응성 물질의 위치가 이동되었다. 따라서, Triton X-100 처리에 의하여 천천히 침강하는 물질만 생산되게 된다. 비슷한 결과가 코니쉬(Konishi) 등 (Virol. 188: 714-720 (1992))에 의하여 보고되었다. 이들 결과는 prM/M 및 E를 함유하는 빠르게 침강하는 서브바이러스 입자 는 세제 처리에 의하여 파괴될 수 있다는 것을 나타낸다.
응집(Hemagglutination) (HA) 활성을 클라크(Clarke) 및 카살스(Casals)의 방법에 의하여 pH 범위 6.1 내지 7.0에 결정하였다 (Amer. J. Trop. Med. Hyg. 7: 561-573 (1958)). JE-4B 세포에 의하여 분비된 서브바이러스 입자 및 JEV 감염된 COS-1 세포에 의하여 생산된 비리온 입자는 비슷한 HA 프로필을 가지며, 최적 pH는 6으로 결정되었다.
실시예 5 : 본 발명의 pCDJE2-7 핵산 백신 및 상업적으로 구입가능한 JEV 백신으로 면역접종된 생쥐에서의 면역반응의 비교.
5 마리의 3주령 암컷 그룹의 ICR 이계교배된 생쥐에 100㎕의 dH2O 중의 100㎍의 pCDJE2-7 플라스미드로 좌측과 우측 사두근(quadriceps)에 균육내 주사하거나, 인간에 투여되는 용량의 1/5에 해당하는 용량의 JE-VAX(the Research Foundation for Microbial Disease of Osaka University에 의하여 제조되고, Connaught Laboratories, Swiftwater, PA.에 의하여 분배됨)를 피하 주사하였다. 관련이 없는 단백질을 코딩하고 발현하는 플라스미드 pCDNA3/CAT (Invitrogen)를 음성 면역접종 대조군으로 사용하였다. pCDJE2-7 면역접종된 생쥐의 하나의 그룹을 제외하고, 모든 생쥐를 플라스미드 또는 JE-VAX의 추가 용량으로 3주 후 부스팅하였다. 접종 3, 6, 9, 23, 40 및 60 주 후에 생쥐의 안와후 사이너스(retroorbital sinus)로부터 혈액을 채취하였다. JEV 항체 역가는 정제된 JEV에 대한 ELISA 또는 플라크 감소 중화 시험(PRNT)에 의하여 결정하였다(Roehrig 등, Virol. 171: 49-60 (1989); 및 Hunt 및 Calisher, Amer. J. Trop. Med. Hyg. 28: 740-749 (1979)).
pCDJE2-7 핵산 백신 및 JE-VAX는 3 그룹의 생쥐 모두에서 1차 면역접종 3주후 내에서 100% 혈청전환(seroconversion)이 일어났다 (표. 3). 상기 JEV ELISA 및 PRNT 항체 역가는 각각 면역후 6 주 및 9주에 최고 수준에 도달하였다. DNA 백신 1 용량을 투여받은 생쥐는 2 용량(dose)를 투여받은 생쥐와 비슷한 항체 반응을 보였다. 비교할만한 ELISA 항체 역가는 실험이 종결된 60주까지 DNA-면역접종된 그룹에서 유지되었다. 그러나, JE-VAX 그룹에서는 4 마리의 생쥐 중 한 마리만이 접종 60일 후에 JEV 항체 양성이었다. 상기 pCDNA3/CAT 대조군 그룹은 측정가능한 JEV 항체를 보유하지 않았다. 이들 결과는 JEV-특이적 핵산 백신의 단일 용량이 상업적으로 이용가능한, FDA-인가된 JE-VAX 백신에 비하여 생쥐에서 JEV 항체를 유지하는데 더 효과적이다는 것을 입증하는 것이다.
실시예 6 : 본 발명의 다양한 핵산 백신 구조체와 상업적 JEV 백신의 여러 연령에서 면역접종의 효능의 비교
비슷한 수준의 JEV 단백질이 pCDJE2-7, pCBJE1-14, 또는 pCIBJES14로 형질전환된 COS-1 세포에 의하여 발현되었다. 이들 핵산 구조체에 의한 JEV 항체의 유도를 두가지의 다른 면역접종 연령에서 상업적으로 이용가능한 JE-VAX 백신과 비교하였다. 3일령 (혼합된 성별) 또는 3 주령 (암컷) ICR 이계교배된 생쥐(10 마리/그룹)를 50 또는 100 ㎍의 플라스미드 DNA로 근육내 면역접종하거나, 인간에 투여되는 용량의 1/5에 해당하는 용량의 JE-VAX를 피하 면역접종하였다. 혈청 표본을 면역 후 3 및 7 주후에 수집하고, 항원으로서 정제된 JEV를 사용한 ELISA에 의하여 1:1600 희석하여 시험하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
플라스미드 pCBJE1-14가 가장 높은 정도의 혈청전환, 즉 1:1600이상의 항체 역가를 보여, 양 면역접종 연령에서 80-100%를 달성하였다. pCDJE2-7 또는 pCIBJES14를 투여하는 경우, 3일령 생쥐를 면역접종하였을 경우 6주 까지 적당한(moderate) 혈청전환이 제공되었으나(각각에 대하여 60%), 면역접종 3주후에는 더 약한 혈청전환(각각 40% 및 10%)이 제공되었다. 그러나, 이들 플라스미드가 3주령 생쥐에 투여되었을 경우, 면역접종 3주 및 7주 후에 90 또는 100%의 혈청전환이 달성되었다. 대조적으로, 상기 상업적 백신, JE-VAX는 3일령에 투여되었을 경우 혈청전환을 부여하지 않았으나, 3주령에서는 100% 혈청전환이 달성되었다. 따라서, JEV prM 및 E에 대한 상기 핵산 TU는 아주 높은 용량의 상업적 백신 보다 나은 정도의 혈청전환을 제공하며, 예기치 않게 어린 동물(young animal) 및 더 성숙한 동물 모두에서 높은 혈청전환이 제공되었다.
실시예 7 : 본 발명의 상기 핵산 백신에 의하여 부여되는 보호 면역성
실시예 6의 3일령 면역접종된 그룹을 생쥐에서 순응된 JEV 주 SA14 50,000 pfu/100㎕를 복막 주사에 의하여 면역접종 7주후에 챌린지하고, 3주동안 관찰하였다. 21일까지 다양한 핵산 TU-함유 구조체를 투여받은 그룹에서 100% 보호가 달성되었다(표 5). 대조적으로, JE-VAX-백신접종된 생쥐의 60% 및 pCDNA3/CAT-면역접종된 음성 대조군의 70%가 바이러스 챌린지에 대하여 21일까지 생존하지 않았다. 이들 결과는 본 발명의 상기 핵산 TU가 면역접종된 생쥐에 대하여 예기치 않게 효과적인 보호를 제공한다는 것을 나타낸다. 이는 인간의 이른 아동기 (early childhood) 백신으로 상기 본 발명의 핵산 백신이 이용될 가능성이 있다는 것을 암시한다. 대조적으로, 현재 사용되고 있는 불활성화된 인간 백신인 JE-VAX은, 어린 동물(young animal)에서는 효과적이지 않은 것처럼 보인다.
실시예 8 : 모계(maternal) 항체 역가와 상관되는 신생 생쥐의 수동 보호
3주령 암컷 ICR 생쥐를 100 ㎍/㎕로, pCDJE2-7 플라스미드 DNA를 1 용량(dose) 또는 2일 간격에서 2 용량으로 면역접종하거나, 인간에 투여되는 1/5 용량의 2 용량으로 JE-VAX로 면역접종하였다. 상기 음성 대조군 그룹은 2 용량의 100 ㎍/㎕의 pCDNA-3/CAT 플라스미드를 투여받았다. 모계 항체에 의한 수동 보호를 1차 면역후 9주 또는 2차 면역후 6주에 행하여진 실험 대상 암컷과 면역화되지 않은 수컷 생쥐의 교배로부터 나온 새끼(pup)에 대하여 평가하였다. 새끼를 생쥐-순응된 SA14 바이러스 5,000 pfu/100㎕를 복강내에 투여하여 생후 3-15일 사이에 챌린지하고, 3주 동안 매일 관찰하였다 (표 6). 생존율은 모계 중화항체 역가와 상관관계 있었다. 1:80의 PRNT 를 갖는 어미에 의하여 양육된 새끼는 100% 바이러스 감염에 대하여 생존하였으나, 대조군 어미로부터 양육된 새끼는 모두 생존하지 않았다 (표 6). 각각, 1:20 및 1:40의 PRNT 역가를 갖는 어미에 의하여 양육된 더 나이가 많은(older) 새끼는 45% 및 75%의 부분적 보호가 관찰되었다. 상기 생존율은 새끼가 면역된 어미에 의하여 양육되는 시간의 길이와도 또한 상관되었다. 설명한 바와 같이, 13-15 일령 새끼는 높은 생존율을 보였다. 그러나, 3-4일령 새끼 중 어느 것도 어미가 1:20 및 1:40의 PRNT 역가를 갖는 경우 바이러스 챌린지에 생존하지 않았다. 따라서, 모계 항체는 그의 자손에게 부분적 내지 완전한 보호 면역성을 제공한다. 더욱이, 챌린지된 후의 새끼 97% (29/30)의 혈청에서 ELISA에 의하여 JEV 항체가 검출되었다.
생쥐를 100㎍ 용량(dose) 플라스미드 DNA의 1 또는 2 용량으로 근육내 접종하거나, JE-VAX 백신의 1/5 인간 용량의 2 용량으로 피하에 접종하였다. 비면역 수컷과 교배하기 전에 PRNT 시험을 위하여 면역접종 9주후에 혈청을 수집하였다.
실시예 9 : WNV prM 및 E 항원을 코딩하는 전사단위를 포함하는 재조합 플라스미드의 제조
QIAampTM Viral RNA Kit (Qiagen, Santa Clarita, CA)를 사용하여, 1999년 뉴욕 발병(outbreak)으로부터 분리된 변이주(strain)인, NY99-6480 주로 감염된 베로 세포 배양 배지의 150㎕로부터 게놈 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 용출하고, 80㎕의 뉴클레아제가 없는 물에 현탁하고, WNV prM 및 E 유전자 코딩 서열을 증폭하기 위한 주형으로 사용하였다. 프라이머 서열은 란시오티(Lanciotti) 등 (Science 286: 2333-2337 (1999))의 연구결과로부터 얻었다. 상기 게놈 뉴크레오티드 영역을 포함하는 cDNA 단편을 RT-PCR에 의하여 증폭하였다. 제한 부위 BsmBI 및 KasI을 앰플리머 WN466 (뉴클레오티드 서열, 서열번호 12)를 사용함으로써 cDNA의 5' 말단에 삽입하였다. 인-프레임 번역 종결 코돈과 그에 뒤따르는 NotI 제한 부위를 앰플리머 cWN2444 (서열번호 13)를 사용함으로써 상기 cDNA의 3' 말단에 도입하였다. 상기 RT-PCR 산물을 QIAquickTM PCR Purification Kit (Qiagen)로 정제하였다.
상기 두 앰플리머(서열번호 12 및 서열번호 13)의 사용에 의하여 생산된 두가닥 앰프리콘을 KasI 및 NotI 효소로 소화시켜 998 bp (1470번 내지 2468번) DNA 단편을 생성하고, 이를 pCBJESS 벡터의 KasI 및 NotI 부위에 삽입하여 중간 플라스미드, pCBINT를 형성하였다. 상기 pCBJESS는 pCBamp 플라스미드로부터 유래하였으며, 사이토메갈로바이러스 초기 유전자 프로모터 및 번역 조절 요소 및 조작된 JE 신호서열 요소를 포함하고 있다 (Chang 등, J. Virol. 74: 4244-4252 (2000)). 상기 JE 신호서열 요소는 신호서열 상기 JE 신호서열 (서열번호 14)을 포함한다.
다음으로, 상기 cDNA 앰플리콘을 BsmBI 및 KasI 효소로 소화시키고, 남은 1003 bp 단편(466번 내지 1470번)을 pCBINT의 KasI 부위에 삽입하여 pCBWN을 형성하였다(핵산 서열, 서열번호 15; 아미노산 서열, 서열번호 16). ABI prism 377 Sequencer (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA)를 사용한 자동 DNA 분석법을 이용하여, 상기 재조합 플라스미드가 란시오티(Lanciotti) 등 (Science 286: 2333-2337 (1999))에 의하여 설명된 바와 같은 맞는 prM 및 E 서열을 가지고 있는지를 확인하였다.
포유동물 세포의 인 비트로 형질전환 또는 생쥐 면역화 실험에 사용하기 위한 플라스미드 DNA는 실시예 1에 설명한 바와 같은 음이온 교환 크로마토그래피에 의하여 정제하였다.
실시예 10 : pCBWN에 의하여 발현된 WNV prM 및 E 단백질의 면역학적 특성 및 평가
pCBWN 플라스미드에 의하여 코딩되는 WNV 특이적 유전자 산물을 COS-1 세포에서 발현시켰다. 세포를 창(Chang) 등 (J. Virol. 74: 4244-4252 (2000))에 따른 pCBWN 플라스미드로 전기천공하고 형질전환시켰다. 전기천공된 세포를 75 cm2 배양 플라스크 또는 하나의 멸균 커버슬립/웰을 포함하는 12-웰 조직 배양 디쉬에 접종하였다. 모든 플라스크 및 12-웰 플레이트를 37℃, 5% C02 배양기에서 유지하였다. 전기천공 40시간 후, 부착된 세포를 포함하는 커버슬립을 상기 웰로부터 제거하고, PBS로 간단하게 세척하고, 실온에서 2분 동안 아세톤으로 고정하고, 공기 건조하였다.
단백질 발현은 실시예 2에 설명한 바와 같이, 간접 면역형광 항체 분석법(IFA)을 사용하여 검출하였다. 플라비바이러스 E-단백질 특이적 단일클론 항체 (Mab) 4G2, WNV 생쥐 과면역 복수액 (HIAF) 및 정상 생쥐 혈청 (NMS)을 PBS 중 1:200 희석액을 일차 항체로서 사용하여 단백질 발현을 검출하였다 (Henchal 등, Am. J. Trop. Med. Hyg. 31: 830-836 (1982)).
조직 배양 배지를 전기천공 40 및 80시간 후에 수확하였다. 항원-포획 (Ag-capture) ELISA를 임시적으로 형질전환된 COS-1 세포의 배양 배지에서 분비된 WN 바이러스 항원을 검출하는데 사용하였다. 상기 Mab 4G2와 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 Mab 6B6C-1을 상기 WN 바이러스 항원을 포획하는데 및 포획된 항원을 검출하는데 각각 사용하였다 (Chang 등, J. Virol. 74. 4244-4452 (2000); Henchal 등, Am. J. Trop. Med. Hyg. 31: 830-836 (1983); Roehrig 등, Virology 128: 118-126 (1983)).
배지 중의 WN 바이러스 항원을 10 % 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 침전시켜 농축시켰다. 상기 침전을 TNE 버퍼 (50 rnM Tris, 100 mM NaCI, 10 mM EDTA, pH 7.5)에서 재현탁하고, 원심분리에 의하여 맑게 하고, 4℃에서 저장하였다. 또한, 상기 침전을 동결건조(lyophilization buffer) (0.1 M TRIZMA 및 보레이트 염수 버퍼 중의 0.4% 우혈청 알부민, pH 9.0)에 재현탁하고, 동결건조하고, 4℃에서 저장하였다. 동결건조된 조성물(preparation)을 MAC- 및 간접 IgG ELISA로 평가하기 위한 항원으로서 사용하였다.
WN 바이러스-특이적 단백질을 임시적으로 형질전환된 COS-1 세포 상에서 IFA에 의하여 검출하였다. 이들 세포에 의하여 발현된 E, prM 및 M 단백질은 상기 배양배지 중에 분비되었다. PEG 침전에 의하여 농축된 WN 바이러스 항원을 7.0% 에탄올로 추출하여 PEG를 제거하였다 (Aizawa 등, Appl. Enviro. Micro. 39: 5457 (1980)). 에탄올 추출된 항원 및 구배-정제된 WN 비리온을 Excel Plus Electrophoresis Apparatus (Invitrogen Corp., Carlsbad,CA) 중의 NuPAGE, 4-12% 구배 Bis-Tris Gel 상에서 분석한 다음, Excel Plus Blot Unit (Invitrogen Corp.)를 사용하여 니트로셀룰로즈 막상에 전기블롯팅하였다. 임시적으로 형질전환된 COS-1 세포에 의하여 생산된 WN 바이러스-특이적 단백질을 웨스턴 블롯팅 분석에서 WN 바이러스 특이적 생쥐 HIAF 또는 플라비바이러스 E 단백질 반응성 Mab 4G2에 의하여 검출하고, 음성 혈청 대조군으로서 NMS를 사용하였다. 상기 단백질은 WN 바이러스 감염된 젖먹이 생쥐 뇌(suckling mouse brain) (SMB)로부터 유래한, 대응되는 구배 정제된 비리온 E, prM 및 M 단백질과 비슷한 반응성 및 동일한 분자량을 나타내었다.
진단 ELISA를 위한 항원으로서 NRA의 분석에 있어서, 40 ml의 조직 배양액으로부터 수확된 항원을 나타내는, 한 바이알의 동결건조된 NRA를 1.0 ml의 증류수에 재구성하고, 동결건조된 프로피오락톤-불활성화 자당-아세톤 추출물로서 제공된 재구성된 WN 바이러스 감염된 젖먹이 생쥐 뇌 (SMB) 항원과 비교하였다 (Clarke 등, Am. J. Trop. Med. Hyg. 7: 561-573 (1958)). 모든 재조합 단백질, prM, M 및 E는 상기 구배-정제된 비리온 E, prM 및 M 단백질의 반응성과 비슷한 반응성을 보였다.
표준(Coded) 인간 표본을 개발 단계에서 동일한 시험에서 항원과 함께 시험하였다. 사용된 상기 MAC- 및 IgG ELISA 프로토콜은 공개된 방법과 동일하였다 (Johnson 등, J. Clin. Microbiol. 38: 1827-1831 (2000); Martin 등, J. Clin. Microbiol. 38: 1823 (2000)). 인간 혈청 표본은 본 발명자의 시설 내의 혈청 은행으로부터 얻었다. 상기 혈청 은행은 1999년 발생(outbreak) 중에 WN 바이러스 확인을 위하여 DVBID으로 보내진 표본으로 구성된다. 이들 시험에서, 스크리닝 MAC- 및 IgG ELISA는 1:400 표본 희석액에 대하여 수행하였다. 2와 3 사이의 양성/음성(P/N) 비율을 나타내는 표본을 의사 양성(suspect positive)으로 간주하였다. 의사 혈청 표본을 ELISA 종말점 적정(end-point titration) 및 플라크-감소 중화 시험(plaque-reduction neutralization test) (PRNT)에 의하여 양성으로서 확인하는데 사용하였다. 3.0 이상의 P/N OD 비율을 나타내는 모든 표본을 추가의 확인시험을 거치지 않고 양성으로 간주하였다.
플라비바이러스-그룹 반응성, 항-E Mab, 4G2 및 6B6C-1을 이용하는 Ag-포획 ELISA를, pCBWN 형질전환된 COS-1 세포의 배양액으로 분비된 NRA를 검출하는데 사용하였다. 상기 항원은 형질전환 1일후의 배지에서 검출할 수 있었으며, 추가의 농축이 없이 상기 배양액의 최대 ELISA 역가 (1:32-1:64)는 2일과 4일 사이에서 관찰되었다. NRA를 PEG 침전에 의하여 농축하고, 동결건조 버퍼에서 재현탁하고, 동결건조하여 보존하였다. 진단 시험 개발을 위하여, 동결건조된 NRA의 하나의 바이알을 1.0 ml 증류수에 재구성하고, WN 바이러스 양성 및 음성 표준 인간 혈청을 사용한 MAC- 또는 간접 IgG ELISA로 적정하였다 (Johnson 등, J. Clin. Microbiol. 38: 1827-1831 (2000); Martin 등, J. Clin. Microbiol. 38: 1823-1826 (2000)). 상기 NRA의 1:320 및 1:160 희석액이 각각 MAC- 및 IgG ELISA에 사용하기에 최적 농도인 것으로 밝혀졌다. 이들 희석액은 MAC- 및 IgG 시험에서 각각 4.19 및 4.54의 P/N OD450 비율을 보였다. NY-6480 및 Eg101 주에 의하여 생산된 WN 바이러스 SMB 항원을 MAC-ELISA에 대하여는 1:320 및 1:640 희석액을, IgG ELISA에 대하여는, 1:120 및 1:320 희석액을 각각 사용하였다. 상기 음성 대조군 항원, 정상 COS-1 세포의 배양 배지의 PEG 침전 및 정상 SMB 항원은 각각 NRA 및 SMB 항원에 대한 희석 비율과 동일한 희석 비율을 사용하였다. 1:400으로 희석된, 인간 혈청 표본을 바이러스-특이적 및 음성 대조군 항원과 함께 3배수로 시험하였다. 양성 시험 결과로서 유효하기 위하여는, 바이러스 항원과 결합하는 시험 혈청(P)에 대한 OD450 가 음성 대조군 항원 (N)과 반응하는 동일한 혈청의 대응하는 광밀도 값에 비하여 2배이상이어야 한다.
NRA 및 NY-06480, Eg101 및 SLE 바이러스 SMB의 반응성을 21 표준(Coded) 인간 혈청 표본을 사용한 MAC- 및 IgG ELISA에 의하여 비교하였다. 21 표본 중, 19개가 모든 3개 항원에 대하여 비슷한 결과를 나타내었다 (8 음성 및 11 의사 양성 또는 양성). 18개의 표본을 또한 SLE SMB 항원을 사용하여 별도로 시험하였다. 13 Eg-101 SMB 양성 표본 중 3개만이 SLE MAC-ELISA에서 양성이었다 (표. 1). WN 항원 음성 표본의 어느 것도 SLE MAC-ELISA에 의하여 양성으로 나타나지 않았다. 이 결과는 항-WN 바이러스 IgM은 다른 플라비바이러스와 유의하게 교차반응하지 않으며 (Tardei 등, J. Clin. Microbiol. 38: 2232-2239 (1940)), NRA 또는 SMB 항원이 시험에 사용되었는지 여부와 관계없이, 급성 WN 바이러스 감염을 진단하는데 특이적이다라고 하는, 종전의 관찰 결과를 확인하여 주는 것이다. 모든 표본을 또한 간접 IgG ELISA에 의하여 동시에 시험하였다. 21 표본 중 10개가 3개 항원 중 임의의 것을 사용하는 경우에도 양성이었다.
동일한 환자로부터 유래하고, 각각 질병 발생 4일 및 44일 후에 수집된 두개의 불일치(discrepant) 혈청 표본 (7 및 9)은 NRA 및 SMB NY 항원에 대하여 IgM-음성이었고 Eg-101 SMB 항원에 대하여 IgM-양성이었다. 이들 두개의 불일차(discordant) 표본을 더 검사하기 위하여, 이 환자로부터 연속적으로 수집된 6개의 표본을 종말점 MAC- 및 IgG ELISA에 의하여 재시험하였다. 3일 및 15일 사이의 MAC-ELISA 역가에 나타난 32 배 이상의 연속 증가는 사용된 모든 항원에 대하여 확인될 수 있다. 질병 발생 9일 후에 수집된 뇌척수액도 또한 이 환자가 진정으로 시료 채취 직전에 WN에 의하여 감염되었다는 것을 확인해 주는 것이었다. 상기 뇌척수액은 Eg-101- 및 SLE-SMB 항원에 대한 IgM P/N 값이 각각 13.71 및 2.04 이었다. 31 일 및 44 일 표본은 NY-SMB 항원에 대하여는 음성 (<1:400)이었으나, NRA 및 EglO1-SMB에 대하여는 양성이었다. 호환성(compatible) IgG 역가가 시험에 사용된 모든 3개의 항원에 대하여 관찰되었다.
실시예 11 : pCBWN으로 면역접종된 동물에서 면역반응의 평가.
10마리의 3주령 암컷 ICR 생쥐의 그룹을 실험에 사용하였다. 생쥐를 단일 용량(single dose)의 pCBWN 또는 녹색 형광 단백질 플라스미드 (pEGFP) DNA를 근육내 주사하였다(Clonetech, San Francisco, Calif.). 상기 pCBWN 플라스미드 DNA 는 EndoFree Plasmid Giga Kits (Qiagen)를 사용하여 XL-1 블루(blue) 세포로부터 정제하고 1.0 ㎍/㎕의 농도로 PBS, pH 7.5에 재현탁하였다. 100 ㎍의 pEGFP를 투여받은 생쥐를 면역접종되지 않는 대조군으로 사용하였다. 생쥐는 100 ㎕의 부피로 100, 10, 1.0, 또는 0.1 ㎍의 용량으로 pCBWN 플라스미드로 주사되었다. 10, 1.0, 또는 0.1 ㎍의 pCBWN를 주사받은 생쥐 그룹은 EMC-830 square wave electroporator (Genetronics Inc. San Diego, Calif.)를 사용한 전기전이 매개 인 비보 유전자 전달 방법에 의하여 면역접종되었다. 상기 전기전달 방법은 미르(Mir) 등의 방법에 근거하였다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4262-4267.(1999)). DNA 주사 직후, 경피성 전기 펄스가 다리의 각 면에서 4.5-5.5 mm 떨어져 있는, 두개의 스텐레스 강철 판에 의하여 인가되었다. 상기 다리 피부와의 전기적 접촉은 PBS로 상기 다리를 완전하게 적심으로써 확보하였다. 40 volts/mm, 25 msec 지속시간(duration) 및 펄스간의 간격 200 msec인 두 쌍의 4개 펄스가 인가되었다. 상기 전극의 극성은 전기전달 효능을 증진시키기 위하여 상기 펄스 쌍 사이에서 역전될 수 있다.
주사 후 3 마다 생쥐로부터 채혈하였다. WN 바이러스 특이적 항체 반응은 Ag-포획 ELISA 및 플라크 감소 중화 시험(plaque reduction neutralization test) (PRNT)으로 평가하였다. 개별 혈청은 IgG-ELISA로 시험하고, 각 그룹의 10마리 생쥐로부터 얻은 풀링된 혈청은 PRNT로 분석하였다. pCBWN로 면역접종된 모든 생쥐는 면역접종 3 후 IgG ELISA 역가가 1:640 내지 1:1280의 범위이었다. 3주 및 6주에서 수집된 상기 풀링된 혈청은 Nt 항체 역가가 1:80이었다. pEGFP 대조군 생쥐로부터 얻은 혈청 표본은 어느 것도 WN 바이러스에 대한 ELISA 또는 Nt 역가를 보이지 않았다.
pCBWN의 상기 단일의 근육내(i.m) 면역접종에 의하여 생쥐를 WN 바이러스 감염으로부터 보호할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 생쥐를 복강내 주사 또는 바이러스-감염된 Culex 모기에 물리게 함으로써 NY-6480 바이러스로 챌린지하였다. 상기 생쥐 그룹의 반은 1,000 LD50 (1,025 PFU/100 ㎕)의 NY99-6480 바이러스로 면역접종 6주후에서 복강내(ip) 챌린지되었다. 나머지 생쥐는 상기 챌린지 실험 7일 전에 NY99-6480 바이러스로 감염된 3 마리의 Culex tritaeniorhynchus 모기에 각각 물리게 하였다. 완전히 충혈될 때가지 모가가 생쥐의 피를 빨아 들이도록 하였다. 챌린지 후 3주 동안 하루 두번 생쥐를 관찰하였다.
WN 바이러스 DNA로 면역화된 모든 생쥐가 바이러스 챌린지 후 건강하게 유지된 반면 모든 대조군 생쥐는 바이러스 챌린지 4-6 주후 CNS 감염 증상을 나타내었고 각각 복강 또는 감염성 모기 챌린지 각각 평균 6.9 및 7.4 일 후 죽었기 때문에, Nt 항체의 존재가 보호 면역성과 상관관계가 있다는 것은 분명하였다. 상기 면역접종된 그룹에서, 바이러스 챌린지 3주후 (면역접종 9주후)에 수집된 상기 풀링된 혈청은 Nt 항체 역가가 1:640 또는 1:320이었다. 풀링된 면역접종된 생쥐 혈청은 웨스턴 블롯팅 분석에서 E 단백질과만 반응하였다.
10 마리 생쥐의 그룹은 전기전달(electrotransfer)을 사용하여 10.0 내지 0.1 ㎍ 의 pCBWN/동물로 면역화하였다. pCBWN를 투여받은 모든 동물은 바이러스 챌린지로부터 완전하게 보호되었다. 면역화 6 주 후에, 전기전달 생쥐의 모든 그룹이 전기전달 없이 통상의 근육내 (i.m.) 주사에 의하여 100 ㎍의 pCBWN을 투여받은 동물에 비하여 Nt 역가가 4배 이상 작았다. 이들 두 결과는 효과적인 면역화가 유도되었다는 것을 나타내며, 상기 전기전달 방법이 (Mir 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 4262-4267.(1999)에 개시된 바에 따라 수행되는 경우) 본 발명의 상기 DNA 백신의 면역원성(immunogenicity)과 보호 효능을 증진시킨다는 것을 암시하는 것이다.
본 연구에 사용된 다양한 나이의 혼합-교배된(mixed bred) 암말(mare) 및 거세된 말(gelding)은 ELISA 및 PRNT에 의하여 WN 바이러스 및 SLE 바이러스 항체-음성인 것으로 밝혀졌다. 4마리의 말은 단일 용량(single dose) (1,000 ㎍/1,000 ㎕ in PBS, pH 7.5) 의 pCBWN 플라스미드로 근육내(i.m.) 주사되었다. 혈청 표본을 바이러스 챌린지 전 38일 동안 매 2일마다 수집하고, 상기 WN 바이러스 특이적 항체 반응을 MAC- or IgG ELISA 및 PRNT에 의하여 평가하였다.
바이러스 챌린지 2일 전에, 12마리의 말 (면역접종된 4 마리 및 대조군 8 마리)를 콜로라도 주립대학에 있는 생물-안전성 수준(bio-safety level) (BSL)-3 격리 건물에 옮겼다. 상기 8마리의 면역접종되지 않은 대조군 말은, 말에서 WN 바이러스 유도된 발병과정(pathogenesis)을 조사하는데 사용하고, 잠재적으로는 숙주를 증식시키기 위한 말로서의 역할을 하는 본 연구의 서브세트였다. 말을 말 챌린지 12일 전에 NY99-6425 또는 BC787 바이러스에 의하여 감염된 14 또는 15 마리의 Aedes albopictus 모기로 물리하게 하여 각각 챌린지하였다. 10분 동안 모기가 말의 피를 빨아들이도록 하였다. 말에서 1일 2회 질병의 징후를 검사하였다. 체온을 기록하고, 혈청 표본을 0 일 (감염시킨 날)로부터 10일에 매일 2회, 그후 14일 까지 매일 1회 수집하였다. 챌린지 후 매일 맥박 및 호흡을 기록하였다. 상기 수집된 혈청 시료를 비레미아(viremia)에 대하여 플라크 적정(plaque titration), 및 항체 반응에 대하여 MAC- 또는 IgG ELISA 및 PRNT에 의하여 시험하였다.
면역접종된 말에서는 어떠한 전신 또는 국부 반응도 관찰되지 않았다. 개별 말 혈청은 PRNT로 시험하였다. 면역접종된 말은 14 및 31일 사이에 1:5이상의 Nt 항체를 생성하였다. 37일 (모기 챌린지 2일 전)에서의 면역접종된 말, #5, #6, #7, 및 #8에 대한 종말점 역가는 각각 1:40, 1:5, 1:20, 및 1:20 이었다. pCBWN 플라스미드로 면역접종된 말은 바이러스 챌린지 후 건강하게 유지되었다. 이들 중 어느 것도 1 내지 14일째에 검출가능한 비레미아 또는 열을 발생시키기 않았다. 모든 면역접종되지 않은 대조군 말은 감염된 모기에 물리도록 하였을 경우 WN 바이러스에 감염되었다. 상기 8 마리의 면역접종되지 않은 말 중 7 마리가 바이러스 챌린지 후 첫 6일 동안에 나타내는 비레미아를 발생시켰다. 비레미아 말은 바이러스 챌린지 7일과 9일 사이에 Nt 항체를 생성시켰다. 전 연구에서 질병의 임상적 징후를 보인 유일한 말은 말 #11이었으며, 열성(febrile)이었으며 감염 8일에 시작되는 신경 징후(neurologic signs)를 보였다. 이 말은 24시간 내에 심각한 임상적 질병으로 발전하여 9일 째에 안락사시켰다. 0, 2, 4, 또는 6 일에 비레미아를 보이는 4개의 대표적 말, #9, 10, 14 및 15을 선택하고, 본 실시예의 예로서 사용하였다. 바이러스 역가는 본 분석에서 검출가능한 가장 낮은 수준인 101.0 PFU/ml 혈청(말 #10)으로부터 102.4/ml (말 #9)의 범위이었다. 말 #14는 시험 기간 동안에 감출가능한 비레미아를 생성하지 않았다. 그러나, 이 말은 12 일 후 검출된 Nt 항체에 의하여 입증되는 바와 같이, 상기 바이러스에 의하여 감염된 것이었다.
Nt 항체 면역 기억 반응(anamnestic response)은 본 실험 중에 Nt 역가가 점차 증가하는 것에 의하여 입증되는 바와 같이, 면역접종된 말에서는 관찰되지 않았다. 모기 챌린지 전에 면역접종된 말에서 이미 존재하던(pre-existing) Nt 항체는 초기 바이러스 감염 및 복제를 억제할 수 없었다. 바이러스 복제 없이, 감염된 모기에 의하여 공급되는 챌린지 바이러스 항원은 상기 면역접종된 말에서 면역 기억 반응(anamestic immune response)를 촉진하기에 충분한 항원 양을 포함할 수 없다. 모든 면역접종된 말은 바이러스 챌린지 14일 후에 안락사시켰다. WN 바이러스 감염의 징표가 되는 전체적 병리학적 및 조직학적 병상은 관찰되지 않았다.
실시예 12 : 황열 바이러스 (YFV) 또는 세인트루이스 뇌염 바이러스 (SLEV) prM 및 E 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 재조합 플라스미드의 제조.
pCDJE2-7 재조합 플라스미드를 제조하는 것과 비슷한 전략을 사용하여 YFV 및 SLEV 재조합 플라스미드를 제조하였다. 게놈 RNA를 Q1AampTM Viral RNA Kit (Qiagen, Santa Clarita, Calif.)를 사용하여 150 ㎕의 YFV 주 TRI-788379 또는 SLE 주 78V-6507 바이러스 시드로부터 추출하였다. 상기 바이러스 RNA를 YFV 또는 SLEV prM 및 E 유전자 코딩 영역을 증폭하기 위한 주형으로서 사용하였다. JEV 및 WNV 재조합 플라스미드에 대하여 상기한 바와 같이, 프라이머 YFDV389 (뉴클레오티드 서열, 서열번호 4; 아미노산 서열, 서열번호 5), cYFDV2452 (서열번호 6), SLEDV410 (뉴클레오티드 서열, 서열번호 7; 아미노산 서열, 서열번호 8) 및 cSLEDV2449 (서열번호 9)를 사용하여 대응되는 재조합 핵산을 생성하였다. RT-PCR 증폭된 cDNA를 KpnI 및 NotI 효소로 소화시키고, 진핵세포 발현 벡터, 플라스미드 pCDNA3 (Invitrogen)의 KpnI-NotI 부위에 삽입하였다. 상기 cDNA의 양가닥을 서열분석하고, YFV 주 TRI-788379 또는 SLEV 주 78V-6507로부터 얻은 서열과의 동일성을 확인하였다. 각각 YFV 또는 SLEV에 대한 prM 및 E 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 플라스미드 pCDYF2 및 pCDSLE4-3를 EndoFreeTM Plasmid Maxi Kit (Qiagen)를 사용하여 정제하고, 인 비트로 형질전환 또는 생쥐 면역화에 사용하였다.
YFV 또는 SLEV 특이적 항원은 각각 pCDYF2 또는 pCDSLE4-3에 의하여 형질전환된 COS-1 세포에서 발현하였다. 발현된 단백질의 수준은 YFV- 또는 SLEV-감염된 COS-1 세포 대조군과 비슷하였다. 상기 JEV 모델에서, 바이러스 항원을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터에 의하여 형질전환되어, YFV 또는 SLEV 항원성 단백질을 구성적으로 발현하는, COS-1 세포주를 얻었다. YFV 또는 SLEV E-특이적 Mab의 패널을 사용한 IFA에 의한 에피토프 맵핑에 의하여 진정한 E 단백질이 상기 pCDYF2- 또는 pCDSLE4-3-형질전환된 COS-1 세포에 의하여 발현되었다는 것이 밝혀졌다. 예비적 연구에 의하여 3주령 암컷, ICR 생쥐의 100%는 증류수 중의 100 ㎍/100 ㎕ 의 pCDSLE4-3 플라스미드의 단일 용량(single dose)으로 근육접종한 후 혈청전환된다는 것이 밝혀졌다.
실시예 13 : JEV 신호서열과 함께 세인트루이스 뇌염 바이러스 prM 및 E 항원에 대한 코딩 서열을 포함하는 재조합 플라스미드의 제조.
게놈 RNA를 QIAampTM Viral RNA Kit (Qiagen, Santa Clarita, Calif.)를 사용하여 세인트루이스 뇌염 바이러스의 MSI-7 주로 감염된 베로(Vero) 세포 배양 배지 150 ㎕로부터 추출하였다. 추출된 RNA을 용출하고, 80 ㎕의 뉴클레아제가 없는 물에 현탁하고, 세인트루이스 뇌염 바이러스 prM 및 E 유전자 코딩 서열을 증폭하기 위한 주형으로서 사용하였다. 프라이머 서열은 트랜트(Trent) 등의 연구결과로부터 얻었다 (Virology 156: 293-304 (1987)). 상기 게놈 뉴클레오티드 영역을 포함하는 cDNA는 RT-PCR로 증폭하였다. 제한 부위 AfeI를 앰플리머 SLE463 (서열번호 30)을 사용하여 cDNA의 5' 말단에 작제하였다. 인-프레임 번역 종결 코돈 및 그에 뒤따르는 NotI 제한 부위를 앰플리머 cSLE2447 (서열번호 31)을 사용하여 cDNA의 3' 말단에 도입하였다. 상기 RT-PCR 산물을 QIAquickTM PCR Purification Kit (Qiagen)로 정제하였다.
상기 두개의 앰플리머 (서열번호 30 및 서열번호 31)에 의하여 생산된 양가닥 앰플리콘을 AfeI 및 NotI 효소로 소화하여 2004bp의 DNA 단편(463 내지 2466 번 뉴클레오티드)을 생성시키고, pCBJESS-M 벡터의 AfeI 및 NotI 부의에 삽입하여 pCBSLE (뉴클레오티드 서열, 서열번호 21; 아미노산 서열, 서열번호 22)를 형성하였다. 상기 pCBJESS-M은 pCBamp 플라스미드로 부터 유래하였고, 사이토메갈로바이러스 초기 유전자 프로모터 및 번역 조절 요소 및 조작되고(engineered), 변경된 JE 신호서열 요소 (서열번호 27)를 포함한다. 상기 JE 신호서열 요소는 원 pCBJESS 플라스미드의 -4 (Cys을 Gly으로) 및 -2 (Gly을 Ser으로) 번째 위치에 상기 변경된 JE 신호서열을 포함한다.
상기 재조합 플라스미드가 트랜트(Trent) 등 (Virology 156: 293-304 (1987))에 의하여 정의된 바와 같은 올바른 prM 및 E 서열을 가지고 있는지를 확인하기 위하여 ABI prism 377 Sequencer (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, Calif.)를 사용한 자동 DNA 서열분석법을 사용하였다.
실시예 14 : JEV 신호서열과 함께 황열 바이러스 (YFV) prM 및 E 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 플라스미드의 제조.
게놈 RNA를 QIAampTM Viral RNA Kit (Qiagen, Santa Clarita, Calif.)를 사용하여 황열 바이러스의 17D-213 주로 감염된 베로(Vero) 세포 배양 배지 150 ㎕로부터 추출하였다. 추출된 RNA을 용출하고, 80 ㎕의 뉴클레아제가 없는 물에 현탁하고, 황열 바이러스 prM 및 E 유전자 코딩 서열을 증폭하기 위한 주형으로서 사용하였다. 프라이머 서열은 도스 산토스(dos Santos) 등의 연구결과로부터 얻었다 (Virus Research 35: 35-41 (1995)). 상기 게놈 뉴클레오티드 영역을 포함하는 cDNA는 RT-PCR로 증폭하였다. 제한 부위 AfeI를 앰플리머 YF482 (서열번호 28)를 사용하여 cDNA의 5' 말단에 작제하였다. 인-프레임 번역 종결 코돈 및 그에 뒤따르는 NotI 제한 부위를 앰플리머 cYF2433 (서열번호 29)를 사용하여 cDNA의 3' 말단에 도입하였다. 상기 RT-PCR 산물을 QIAquickTM PCR Purification Kit (Qiagen)로 정제하였다.
상기 두개의 앰플리머 (서열번호 28 및 서열번호 29)에 의하여 생산된 양가닥 앰플리콘을 AfeI 및 NotI 효소로 소화하여 1971bp의 DNA 단편(482 내지 2452 번 뉴클레오티드)을 생성시키고, pCBJESS-M 벡터의 AfeI 및 NotI 부의에 삽입하여 pCBYF (뉴클레오티드 서열, 서열번호 23; 아미노산 서열, 서열번호 24)를 형성하였다. 상기 pCBJESS-M은 pCBamp 플라스미드로 부터 유래하였고, 사이토메갈로바이러스 초기 유전자 프로모터 및 번역 조절 요소 및 조작된(engineered) JE 신호서열 요소 (서열번호 27)를 포함한다. 상기 JE 신호서열 요소는 pCBJESS 플라스미드의 JESS의 -4 (Cys을 Gly으로) 및 -2 (Gly을 Ser으로) 번째 위치에 상기 변경된 JE 신호서열을 포함한다.
상기 재조합 플라스미드가 도스 산토스 (dos Santos) 등 (Virus Research 35: 35-41 (1995))에 의하여 정의된 바와 같은 올바른 prM 및 E 서열을 가지고 있는지를 확인하기 위하여 ABI prism 377 Sequencer (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, Calif.)를 사용한 자동 DNA 서열분석법을 사용하였다.
실시예 15 : JEV 신호서열과 함께 포와산 바이러스(Powassan virus) prM 및 E 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 플라스미드의 제조.
게놈 RNA를 QIAampTM Viral RNA Kit (Qiagen, Santa Clarita, Calif.)를 사용하여 포와산 바이러스의 LB 주로 감염된 베로(Vero) 세포 배양 배지 150 ㎕로부터 추출하였다. 추출된 RNA을 용출하고, 80 ㎕의 뉴클레아제가 없는 물에 현탁하고, 포와산 바이러스 prM 및 E 유전자 코딩 서열을 증폭하기 위한 주형으로서 사용하였다. 프라이머 서열은 맨들(Mandl) 등의 연구결과로부터 얻었다 (Virology 194: 173-184 (1993)). 상기 게놈 뉴클레오티드 영역을 포함하는 cDNA 는 RT-PCR로 증폭하였다. 제한 부위 AfeI을 앰플리머 POW454 (서열번호 25)를 사용하여 cDNA의 5' 말단에 작제하였다. 인-프레임 번역 종결 코돈 및 그에 뒤따르는 NotI 제한 부위를 앰플리머 cPOW2417 (서열번호 26)를 사용하여 cDNA의 3' 말단에 도입하였다. 상기 RT-PCR 산물을 QIAquickTM PCR Purification Kit (Qiagen)로 정제하였다.
상기 두개의 앰플리머 (서열번호 25 및 서열번호 26)에 의하여 생산된 양가닥 앰플리콘을 AfeI 및 NotI 효소로 소화하여 1983bp의 DNA 단편(454 내지 2436 번 뉴클레오티드)을 생성시키고, pCBJESS-M 벡터의 AfeI 및 NotI 부의에 삽입하여 pCBPOW (뉴클레오티드 서열, 서열번호 19; 아미노산 서열, 서열번호 20)를 형성하였다. 상기 pCBJESS-M은 pCBamp 플라스미드로 부터 유래하였고, 사이토메갈로바이러스 초기 유전자 프로모터 및 번역 조절 요소 및 조작된(engineered) JE 신호서열 요소 (서열번호 27)를 포함한다. 상기 JE 신호서열 요소는 pCBJESS 플라스미드의 JESS의 -4 (Cys을 Gly으로) 및 -2 (Gly을 Ser으로) 번째 위치에 상기 변경된 JE 신호서열을 포함한다.
상기 재조합 플라스미드가 맨들(Mandl) 등 (Virology 194: 173-184 (1993))에 의하여 정의된 바와 같은 올바른 prM 및 E 서열을 가지고 있는지를 확인하기 위하여 ABI prism 377 Sequencer (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, Calif.)를 사용한 자동 DNA 서열분석법을 사용하였다.
실시예 16 : 뎅기 혈청형 2 구조 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드의 제조
다른 플라비바이러스 (실시예 1, 9 및 12-15 참조)에 대하여 수행된 것과 같은 과정을 따라, 뎅기 혈청형 2 항원에 대한 핵산 TU를 포함하는 벡터를 제조하였다. 실시예에 따르면, 상기 벡터의 제조에 사용된 상기 앰플리머는 정상 뎅기 바이러스 신호서열을 조작하기 위하여 선택되어질 수 있고, 또는 변경된 일본 뇌염 바이러스 신호서열과 같은, 다른 플라비바이러스로부터 유래한 신호서열을 조작하기 위하여 선택되어질 수 있다.
prM 내지 E의 뎅기 혈청형 2 유전자 영역을 포함하는 플라스미드를 제조하였다. 상기 뎅기 혈청형 2 prM 및 E 유전자 (Deubel 등, Virology 155:365-377 (1986); Gruenberg 등, J. Gen. Virol. 69: 1301-1398 (1988); Hahn 등, Virology 162:167-180 (1988))를 pCDNA3과 같은 플라스미드에 연결한 다음, 잘라 내어 pCBamp, pCEP4, pREP4, 또는 pRc/RSV (Invitrogen에 의하여 공급, Carlsbad, Calif.)과 같은 벡터에 클로닝하여 발현될 수 있도록 하였다. 필요하다면, cDNA 서열을 코딩하는 뎅기 혈청형 2 바이러스-특이적 서열을 PCR과 같은 방법을 사용하여 증폭할 수 있다. 또한, 상기 바이러스 RNA가 유전자 영역의 기원이라면, DNA 서열은 RT-PCR에 의하여 증폭할 수 있다. 5' 말단에 개시 코돈 및 3' 말단에 종결 코돈를 포함하는 DNA 단편은 사이토메갈로바이러스 (CMV) 바로 초기(immediate early) (IE) 프로모터, 개시코돈, 및 터미네이터가 상기 뎅기 혈청형 2 바이러스 서열에 작동가능하게 연결되도록, 적절한 제한 뉴클레아제-특이적 부위에서 발현 벡터에 클로닝된다.
실시예 17: 뎅기 혈청형 2 DNA 백신을 이용한 생쥐의 면역접종.
실시예 16에서 제조된 prM 내지 E의 유전자 영역을 코딩하는 뎅기 혈청형 2 핵산 TU 백신을 주사용 물 또는 완충된 생리적 염수와 같은, 적당한 약제학적 담체에 현탁하고, 이유 생쥐(weanling mice)의 그룹에 주사하였다. 대조군 그룹에는 뎅기 혈청형 2 특이적 유전자가 없는 비교될만한(comparable) 플라스미드 조성물을 투여하였다. 그 후 고정된 간격, 예를 들면, 일주 간격으로, 뎅기 혈청형 2-특이적 항체, 및/또는 뎅기 혈청형 2-특이적 면역계 세포독성 세포의 생성을 검사하였다. 상기 핵산 TU 백신 투여 후 약 2 내지 4 개월에, 생쥐를 뎅기 혈청형 2 바이러스로 챌린지하였다. 그 후, 적당한 간격, 예를 들면, 매 2일 마다 비레미아의 수준을 검사하였다. 어미 항체에 의한 수동 보호는 실시예 8에 나타낸 바와 같이 관찰하였다.
실시예 18. 개선된 신호 펩티드의 디자인 및 제작.
신호 펩티드는 삽입된 단백질의 위치(translocation) 및 단백질의 배치(orientation)을 결정할 수 있고, 그에 따라 prM 및 E 단백질의 토폴로지(topology)를 결정할 수 있다. 진핵생물의 신호 펩티드의 가장 흔한 특징은 h-영역이라 불리우는 8 내지 12 범위의 소수성 아미노산으로 구성된다는 것이다 (von Heijne, "Signal Sequences. The limits of variation" J. Mol. Biol. 184: 99-105 (1985)). n-영역으로서 알려진, 개시 Met 및 h-영역 사이의 영역은 보통 1 내지 5의 아미노산이 있으며, 보통 양전하를 띠는 아미노산을 갖는다. 상기 h-영역 및 절단 부위 사이는 c-영역으로서, 3 내지 7 개의 극성이나, 대부분 전하를 띠지 않는 아미노산 잔기로 구성된다. 바이러스 폴리단백질 합성 중에, C 및 prM 단백질의 접합 부위에서 잘려지지 않는 고차구조(cryptic conformation)로부터 잘려질 수 있는 고차 구조까지 상기 시그날라제(signalase) 절단 부위를 조절하는 것은 의 바이러스 프로테아제 복합체, NS2B/NS3에 C 단백질의 제거에 따라 달라진다 (Lobigs, "Flavivirus premembrane protein cleavage and spike heterodimer secretion require the function of the viral proteinase NS3," Proc. Nad. Acad. Sci. U S A. 90: 6218-6222 (1993)). 따라서, prM 및 E 단백질만이 발현 플라스미드에 의하여 발현되는 경우, 바이러스 신호서열의 효능을 고려하는 것은 결정적인 사항이다.
다양한 플라스미드 구조체에 있어서 신호펩티드의 차이는 적어도 부분적으로는, 단백질 위치, 절단 부위 제공(presentation) 및 올바른 토폴로지에 있어서의 차이를 설명할 수 있고, 따라서 prM 및 E 분비 및 VLP 형성을 설명할 수 있다. 이들 특성의 조절 또는 최적화는 원하는 특성을 부여하는 특성을 가진 신호서열을 선택하거나 사용함으로써 개선될 수 있다. 이는 기계-학습 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, 진핵생물에 대하여 학습되어진(trained) 숨견진 마르코브 모델(hidden Markov model) (HMM)에 의하여 달성될 수 있다 (Henrik Nielsen 등, "Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model," In Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, California, pp. 122-130 (1998); Nielsen 등, "Machine learning approaches to the prediction of singal peptides and other protein sorting signals," Protein Engineering 12:3-9 (1999); Nielsen 등, "A neural network method for identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites," Int. J. Neural Sys. 8: 581-599 (1997); "From signal to sorting. Prediction of signal peptides," Henrik Nielsen, Ph.D. thesis. Defended at Department of Biochemistry, Stockholm University, Sweden (May 25 1999) 참조; 상기 문헌 각각은, 특히 컴퓨터-지원 알고리듬을 사용한 신호서열의 최적화에 관련되는 사항은 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어진다).
사용된 프로그램의 형태의 예는 2002년 4월 3일자의 www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP-2.0/ 에서 발견할 수 있다. 참조되고 포함되어지는 참고문헌에 개시되어 이는 바와 같이 상기 HMM은 여러 플라스미드 구조체에서 prM 신호 펩티드 서열의 상기 신호 펩티드 확률을 계산하는데 적용될 수 있다(표. 7). SignalP-HMM 검색은 모든 구조체에 있어서 상기 신호 펩티다제(peptidase) 절단 부위를 올바르게 예측하였다. 그러나, 절단 확률 (0.164 및 1.000 사이의 범위) 및 신호 펩티드 확률 (0.165 내지 1.00의 범위)에 있어서 상당한 차이가 관찰되었다(표. 7). 상기 절단 부위 및 신호 펩티드 확률은 상기 구조체의 n-영역에 있어서의 양전하를 띤 아미노산, h-영역에서의 소수성 아미노산의 길이 및 c-영역에 있어서의 아미노산 조성에 의하여 또한 영향을 받을 수 있는 것으로 알려져 있기 때문에, 이것은 놀라운 것이 아니다 (Chang 등, "Flavivirus DNA vaccine: current status and potential", Annals of NY Acad. Sci. 951: 272-285 (2001); Sakaguchi 등, "Functions of Signal and Signal-Anchor Sequences are Determined by the Balance Between the Hydrophobic Segment 및 the N-Terminal Charge," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 16-19 (1992)).
각각 다른 JE 바이러스 주로부터 유래한, 3개의 JE 바이러스 플라스미드 구조체는 다른 백신 가능성을 나타내었다 (Lin 등, "DNA immunization with Japanese encephalitis virus nonstructural protein NS1 elicits protectice immunity in mice," J. Virol. 72: 191-200 (1998); Konishi 등, "Induction of protective immunity against Japanese encephalitis in mice by immunization with a plasmid encoding Japanese encephalitis virus premembrane and envelope gene," J. Virol. 72: 4925-4930 (1998); Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol. 74. 4244-4252 (2000)). 이들 구조체에서 상기 신호 펩티드 서열은 전하를 띤 아미노산을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 n-영역의 길이에 있어서 다르다 (표. 7). 양전하를 띤 아미노산을 포함하는 상기 n-영역은 상기 h-영역(막투과 나선)이 꼬리 배향(tail orientation)으로 삽입되어, 시그날라제(signalase) 절단 부위가 노출되어 지도록 하는 세포질 면에 짧은 루프를 형성한다. 본 연구에서, prNW 및 E 단백질을 포함하는 VLP는 pCDJE2-7 형질전환된 세포주, JE4B, 또는 pCBJE1-14 임시적으로 형질전환된 COS-1 세포의 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 상기 구배-정제된 VLP 및 비리온은 동일한 면역학적 및 생화학적 특성을 가진다. 플라비바이러스 변태과정의 표지인, prM로부터 성숙한 M 단백질로의 가공도 VLP 및 비리온 입자 사이에서 비슷하다. 따라서, pCDJE2-7 및 pCBJEI-14에 의하여 발현된 prM 및 E 단백질은 비리온 prM 및 E의 배향과 비슷한 배향의 I 형 막투과 단백질로서 발현될 수 있다 (Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol. 74. 4244-4252 (2000)). 대조적으로, pcDNA3JENM의 상기 prM 단백질은 n-영역에 양전하를 띤 아미노산이 없기 때문에 머리 배향으로 삽입된 막투과 h-영역을 갖는 II 형 막 단백질로서 발현될 수 있다 (Konishi 등, "Induction of protective immunity against Japanese encephalitis in mice by immunization with a plasmid encoding Japanese encephalitis virus premembrane and envelope gene," J. Virol. 72: 4925-4930 (1998)). 올바른 토폴로지를 갖는 상기 발현된 단백질, 특히 상기 발현된 prM 및 E와 조합되어지는 효과적인 단백질 합성은, VLP 형성 및 분비를 증진시킬 수 있으며, 그에 따라 상기 DNA 백신의 면역원성을 촉진할 수 있다 (Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol. 74. 4244-4252 (2000)).
상기한 바와 같이, 컴퓨터-지원 계산과정이 발현 플라스미드의 디자인을 최적하기 위하여 적용되었다. 특히, 상기 SignaIP-HMM 프로그램의 예측력을 WN 바이러스 발현 플라스미드를 디자인하는데 적용하였다(표. 2) (Davis 등, "West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays," J. Virol. 75: 4040-4047 (2001)). 상기 pCBWN 플라스미드는 JE 바이러스 신호 펩티드의 짧은 형태 및 뒤 따르는 WN 바이러스 prM-E 유전자 서열로 구성된다. 이 구조체의 백신 잠재력은 pCBWN DNA를 단일 용량으로 근육내(i.m.) 주사하였을 경우, 생쥐 및 말에 있어서 보호 면역성을 유도할 뿐만 아니라, WN 바이러스 감염을 예방하였기 때문에 충분히 입증되었다.
상기에서 논의되고, 실시예 13-15에서 설명한 바와 같이, 항원-코딩 영역으로서 동일 바이러스로부터 유래한 바이러스-코딩된 신호서열은 반드시 이용가능한 최적의 신호 펩티드인 것은 아니다. 더욱이, 비변경된 신호서열이 반드시 최적인 것은 아니다. 예를 들면, n-영역을 짧게 함으로써, c-영역 서열을 변경함으로써, 또는 두 변경을 조합함으로써 상기 신호서열 확률로 측정된 바와 같이, pCBJE1-14 플라스미드에서 코딩된 신호 펩티드는 개량되어질 수 있다 (도 6). 실예로서, 본 명세서 및 개시(teaching)를 위하여 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어지는 문헌에 설명된 바와 같이, JE 바이러스 신호 펩티드의 짧게된 형태(shortened version)는 WN 바이러스 prM 및 E 유전자의 발현을 위하여 사용될 수 있다 (Davis 등, "West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays," J. Virol. 75: 4040-4047 (2001)). 단일 용량으로 근육내(i.m.) 접종하는 것에 의한 용량 적정(dose titration) 연구로부터, 상기 pCBWN가 생쥐에서 pCBJE1-14 보다 2-4 배 이상 더 면역원성이 있다는 것이 밝혀졌다.
실시예 19. 다가 백신(Multivalent vaccines).
복수의 플라비바이러스에 대하여 면역화하기 위하여 고안된 다가 및/또는 조합 백신도 또한 생산될 수 있다. 다가 백신의 제조에 있어서, YF, DEN의 여러 혈청형, JE, WN, SLE 및 TBE (RSSE 및 CEE) 바이러스 또는 플라비바이러스의 임의의 다른 조합과 같은, 표적 병원체와 관련되는 요소를 포함하는 단가 백신 성분을 제조한다. 다른 실시예 및 명세서 중에서 상기한 바와 같은 DNA 구조체의 디자인과 생산은 설명한 바와 같이 수행하였다. 적절한 백신의 조합을 제조하여 복수 병원체에 대하여 보호성을 부여하는 다가 또는 조합 백신을 제공할 수 있다. 본 그룹에서 얻은 예비적 결과에 의하면, 조합된 pCBJEl-14 및 pCBWN DNA 백신을 근육내(i.m.)에 투여하면, 생쥐에서 JE 바이러스- 및 WN 바이러스-특이적 Nt 항체를 유도할 수 있다는 것이 확인되었다 (표. 8). 비록 동일한 전사 및 번역 조절인자(regulator)를 사용하여 제작되었을지라도, 각 단가(monovalent) 성분은 그 백신 성능을 확보하기 위하여 유사한 모델 시스템에 시험되어지는 것이 바람직하다. 다음으로, 조합 백신 칵테일이 제제화될 수 있다. 이들 백신 칵테일은 특정 지리적 영역에 대하여 특이적으로 맞추어 제작될 수 있다. 예를 들면, 열대 및 아열대 아시아에 맞는 백신 칵테일은 DEN의 4개지 혈청형, WN 및 JE 바이러스 백신을 포함하여야 한다. 비슷하게 아프리카 및 라틴 아메리카에 맞는 유용한 백신은 DEN의 4개지 혈청형, WN 및 YF 바이러스 백신 및 DEN의 4개지 혈청형, 로치오(Rocio) 및 YF 바이러스 백신을 각각 포함하여야 한다.
실시예 20. 재조합 뎅기 바이러스 타입 2 백신의 제조 및 시험.
a. 실시예의 요약. 뎅기 바이러스 타입 2 (DEN-2) 프리막(premembrane) (prM) 및 엔벨로프(envelope) (E) 단백질을 코딩하는 일련의 플라스미드를 제작하였다. 이들 플라스미드는 서열번호 43에 의하여 개시된 상기 단백질을 코딩하는 진정한 DEN-2 prM-E 구조체 (pCBD2-14-6)(서열번호 42), 서열번호 45에 의하여 개시된 단백질을 코딩하는 90% DEN-2 E-10% 일본 뇌염 (JE) 바이러스 E 키메라 구조체 (pCB9D2-1J-4-3)(서열번호 44) 및 서열번호 47에 의하여 개시된 단백질을 코딩하는 80% DEN-2 E 20% JE E 키메라 구조체 (pCB8D2-2J-2-9-1)(서열번호 46)를 포함한다. 단일클론 항체 (MAb) 반응성에 대한 결과는 모든 3개의 플라스미드가 도메인 1, 2 및 3 항체의 패널과 반응하는 E 단백질 에피토프를 발현한다는 것을 나타내고 있다. 그러나, pCB8D2-2J-2-9-1 구조체 (서열번호 46)만이 prM, M (성숙한 prM) 및 E를 고수준으로 플라스미드 형질전환된 COS-1 세포의 배지에 분비하였다. pCBD2-14-6 플라스미드 (서열번호 42)로 형질전환된 COS-1 세포 및 pCB9D2-4-3 플라스미드 (서열번호 44)로 형질전환된 COS-1 세포에 의하여 발현된 prM 및 E 단백질의 주요한 부분은, 막에 결합한 채로 유지되었다. DEN-2 E의 E 단백질을 코딩하는 서열의 20%를 대응되는 JE E 단백질 서열을 코딩하는 서열로 치환하여도, MAb 반응성에 아무런 영향을 미치지 못하였다.
시험함에 있어서,생쥐 그룹은 0 및 3 주에 선택된 플라스미드로 근육내에 2회 면역접종하고, 상기 면역 반응을 특이적 중화 항체 및 ELISA 항체를 결정함으로써 평가하였다. 서브바이러스-입자 (SVP)를 형성할 수 있는, 분비된 prM 및 E를 발현하는 상기 플라스미드는 항체 반응을 촉진하는데 있어서 다른 구조체에 비하여 우수하였다. 1:40 내지 >1:1000 범위의 90% 중화 역가는 pCB8D2-2J-2-9-1로 면역화된 생쥐의 9개의 혈청 표본 중 7개로부터 관찰되었다.
b. DEN-2 바이러스 및 백신의 중요성. 뎅기 (DEN) 열은 열대 및 아열대 지역에서 일어나는 급성 감염이다. 뎅기열은 인간의 가장 중요한 플라비바이러스 질병 중의 하나이다. 상기한 바와 같이, 뎅기 바이러스에는 구별되는 4가지의 DEN 혈청형이 있다 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4). 이들 중 어느 하나로 감염되면 일반적으로 증상이 없거나(asymptomatic) 뎅기열(DF)이라고 하는 자기-제한적 열병을 일으킨다. 그러나, 적은 비율의 발병에서, 뎅기 바이러스 감염은 훨씬 더 심각한 질병인 생명 위협 뎅기 출혈열 또는 뎅기 쇼크 증후군 (DBF/DSS)을 일으킨다. 따라서, 제한된 관심을 끄는 상대적으로 순한 뎅기열(DF)이 매년 전세계적으로 약 100,000,000 건이 발병하는 동시에, 500,000건으로 추정되는 입원 DBF/DSS 발병 건도 매년 보고되고 있다. 이 질병에 대항하여 보호하기 위하여, 4개 혈청형 모두에 대하여 효과적인 안전하고 효과적인 DEN 백신을 DEN 풍토성 및 유행성 영역에서 아동 및 비면역 성인에게 투여할 필요가 있다.
안전한 백신은 독성 바이러스에 의한 중증 감염의 잠재적 위험을 최소화하여야 한다. 그러한, 독성 바이러스는 약독화된 백신 바이러스로부터 유래한 백신의 일부 형태의 유전자 복귀(gene reversion) 또는 재조합에 의하여 생겨날 수 있다. 그러한 발생은 소아마비바이러스(poliovirus) 박멸 운동 과정에서 실제로 일어났다(Guillot 등, "Natural Genetic Exchanges between vaccine and Wild Poliovirus Strains in Humans," J. Virol. 74: 8434-8443 (2000); Liu 등, "Molecular Evolution of a Type 1 Wild-vaccine Poliovirus recombinant during Widespread Circulation in China," J. Virol. 74: 11153-11161 (2000)). 더욱이, 황열 바이러스의 아메리카 변이주(American strain), TRINID79A의 게놈 서열분석 결과에 의하여, 이 변이주와 상기 약독화된 황열 백신 바이러스, FNV 사이에는 광범위한 유사성(similarity)가 있음이 밝혀졌다 (Chang 등, "Nucleotide sequence variation of the envelope protein gene identifies two distinct genotypes of yellow fever virus," J. Virol. 69: 5773-5780 (1995); Pisano 등, "Complete nucleotide sequence and phylogeny of an American strain of yellow fever virus, TRINED79A," Arch. Virol. 144. 1837-1843 (1999)). 그 자체로서 결정적인 것은 아니나, 상기 유사성은 TRINID79A가 FNV 백신 바이러스로부터 유래한다는 것을 강하게 암시하는 것이다.
DNA-근거한 백신을 사용하는 것은 플라비바이러스 백신의 개발에 있어서 신규하고 전망있는 면역화 접근법이다 (본 명세서에 개시한 바와 같이, Chang 등, "Flavivirus DNA vaccine: current status and potential", Annals of NY Acad. Sci. 951: 272-285 (2001), 및 본 명세서에 인용한 참고문헌 참조). 본 실시예에서, 많은 DEN-2 백신이 생산되었으며, DEN-2 구조체의 근육내(i.m.) 면역화 후의 생쥐에서 면역 반응은 prM/M 및 E 분비의 효율과 상관이 있었다. 상당한 양의 prM/M 및 E 항원을 분비하게 하는 하나의 구조체가 플라스미드 면역접종된 생쥐에서 고역가의 중화 항체를 자극할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
c. 재료 및 방법
i. 세포 배양 및 바이러스 변이주.
COS-1 세포 (ATCC, Manassas, VA; 1650CRL)는 37℃, 5 % C02 및 10% 열 불활성화된 우태아 혈청 (FBS, Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT), 1mM 소듐 피루베이트, 1mM 비필수 아미노산, 30 ml/리터 7.5% NaHCO3, 100 유니트/ml의 페니실린, 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 변경된 이글 최소 필수 배지 (DMEM, GIBCO, Grand Island, NY)에서 생육시켰다. 베로 및 C6/36 세포는 COS-1 세포에 대하여 사용된 조건과 동일한 조건하에서 생육시켰다. DEN-2 바이러스, 변이주-16681를 cDNA 클로닝, IgG ELISA 및 플라크 감소 중화 시험 (PRNT)에 사용하였다. 바이러스는 C6/36 세포 배양물에서 증식시켰다. 면역학적 또는 생화학적 연구에 대하여 사용된 바이러스는 7% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG-8000; Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) 침전 및 30% 글리세롤-45% 포타슘-타르타레이트 구배 상에서의 초원심분리에 의하여 정제하였다(Obijeski 등, "Segmented genome and nucleocapsid of La Crosse virus," J. Virol. 20:664-675 (1976)).
ii. 플라스미드 제작.
게놈 RNA는 QIAampTM Viral RNA Kit (Qiagen, Santa Clarita, CA)를 사용하여 DEN-2 16681 변이주로 감염된 C6/36 세포 배양 배지 150 ㎕로부터 추출하였다. 추출된 RNA는 디에틸 피로카르보네이트-처리 수 80 ㎕ (DEPC, Sigma, ST. Louis, MO)에 재현탁한 다음, DEN-2 바이러스 prM 및 E 유전자를 RT-PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하였다. 프라이머 서열 (표. 9)은 공개서열에 근거하여 고안하였다 (Gadkari 등, "Critical evaluation of Kyasanur Forest disease virus neutralizing antibody found in bats (a preliminary report)," Indian J. Med. Res. 64: 64-67 (1976); Kinney 등, "Construction of infectious cDNA clones for Dengue 2 virus: strain 16681 and its attenuated vaccine derivative, strain PDK-53," Virology 230: 300-308 (1997)). 상기 cDNA 앰플리콘의 5' 말단에 제한 효소 KasI에 대한 인지 및 절단 부위를 삽입하였다. 인-프레임 종결 코돈 및 뒤 따르는 NotI 제한 부위를 상기 cDNA 앰플리콘의 3' 말단에 도입하였다. 상기 DEN-2 바이러스 cDNA 앰플리콘을 KasI 및 NotI 효소로 소화시킨 다음, pCBJESS 벡터의 KasI 및 NotI 부위에 삽입하여, 100% DEN-2 E 플라스미드, pCBD2-14-6 (서열번호 42)을 형성하였다.
90% 및 80% DEN-2 E 플라스미드, 100% DEN-2 플라스미드, pCBD2-14-6 (서열번호 42), 및 JE 플라스미드를 제작하기 위하여, pCBJE 1-14 (서열번호 17)를 각각 DEN-2 및 JE DNA 서열을 증폭하기 위한 PCR 주형으로서 사용하였다. DEN-2 및 JE 유전자 단편을 얻기 위한 증폭 반응에 사용된 프라이머의 세트를 표. 9에 목록화하였다. T7 및 SP6 프라밍 부위(priming site)가 원 pCDNA-3 플라스미드에서 유래한, 상기 pCBamp 플라스미드에서 발견되며(Invitrogen, Carlsbad, CA), 원하는 바 또는 필요로 하는 바에 따라 이용될 수 있다. 90% DEN-2-10% JE E 단백질 유전자에 대한 PCR 증폭된 DNA 단편을 BxtXI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고, T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시키고, KasI 및 NotI 효소로 다시 소화시킨 다음, pCBJESS 벡터의 KasI 및 NotI 부위에 삽입하여 플라스미드, pCB9D2-1J-4-3(서열번호 44)를 얻었다. 80% DEN-2-20% JE E 유전자에 대한 PCR 증폭된 DNA 단편을 BsmBI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고, T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시키고, KasI 및 NotI 효소로 다시 소화시킨 다음, pCBJESS 벡터의 KasI 및 NotI 부위에 삽입하여 플라스미드, pCB8D2-2J-2-9-1 (서열번호 46)를 얻었다. 이들 플라스미드 구조체를 도 7에 도식적으로 나타내었다. 상기 90% DEN-2-10% JE E 및 80% DEN-2-20% JE E 단백질 영역은 각각, 표 9에 나타내었다.
자동 DNA 서열분석은 제조자가 권고한 과정에 따라 ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA)로 수행하였다. 올바른 prM 및 E 서열을 갖는 재조합 플라스미드는 서열분석을 이용하여 확인하였다.
iii. 전기천공에 의한 COS-1 세포에서의 DEN-2 재조합 항원의 임시적 발현.
COS-1 세포를 상기 실시예의 다른 부분 및 창(Chang) 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol. 74. 4244-4252 (2000)에 의하여 개시된 과정(protocol)을 이용하여 각각 DEN-2 플라스미드 또는 녹색 형광 단백질 발현 플라스미드 대조군(pEGFP, Clonetech, San Francisco, CA)으로 별도로 전기천공하였다. 전기천공된 세포는 75 cm2 배양 플라스크 상에 접종하고, 37℃ 및 5% CO2에서 유지하였다. 전기천공 6시간 후 상기 성장 배지를 2% 우태아 혈청을 포함하는 유지 배지로 교환하였다. 조직 배양 배지 및 세포를 항원 특성화(characterization)을 위한 전기천공 48시간 후에 별도로 수확하였다.
iv. DEN-2 E-특이적 단일클론 항체를 이용한 에피토프 맵핑.
전기천공 48시간 후, 부착 세포를 트립신 처리하고, 5% 염소 혈청을 포함하는 PBS에서 재현탁하고, 12웰 스팟-슬라이드 상에 스팟팅하고, 공기 건조하였다. 상기 스팟-슬라이드에 부착된 세포를 -20℃에서 10분 동안 아세톤으로 고정하고, 공기 건조되도록 하였다. E-단백질 특이적 단일클론 항체 (MAb)는 상기한 바와 같이, 간접 면역형광 분석법 (IFA)에 의하여 단백질 발현을 검출하기 위하여 사용하였다 (표. 10; Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol. 74. 4244-4252 (2000)).
v. 재조합 DEN-2 바이러스 항원의 특성확인.
조직 배양 배지를 전기천공 48시간 후에 회수하였다. 임시적으로 형질전환된 COS-1 세포의 배양 배지에서 분비된 DEN-2 바이러스 항원를 검출하기 위하여 항원-포획(Ag-capture) ELISA를 사용하였다. DEN 바이러스 항원을 포획하고, 포획된 항원을 검출하기 위하여, MAb 4G2 및 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 MAb 6B6C-1을 각각 사용하였다(Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol. 74. 4244-4252 (2000)); Hunt 등, "A recombinant particulate antigen of Japanese encephalitis virus produced in stably-transformed cell is an effective noninfectious antigen and subunit immunogen," J. Virol. Methods. 97. 133.149 (2001)).
전기천공 48시간 후, 각각의 플라스미드에 대하여 형질전환된 세포를 트립신 처리하고, 5 x106 세포를 포함하는 분액으로서 PBS 중에 재현탁하였다. 제작자가 제시한 과정에 따라 Mem-PER 포유동물 막 단백질 추출 시약 키트 (Pierce, Rockford, IL)를 이용한 막 단백질 추출을 위하여 이들 세포 시료를 처리하였다. 소수성 및 친수성 단백질 모두가 분리되었다. 이 과정은 소수성 상에서 발견되는 내재(integral) 막 단백질을 부유화시키기 위하여 개발되었다. 소수성 및 친수성 분획을 DEN-2 재조합 항원에 대하여 항원-포획 ELISA 에 분석하였다.
상기 배지 중의 재조합 항원을 10% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 침전시켜 농축하였다. 상기 침전물은 TNE 버퍼 (50 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 7.5) 중에 원 부피의 1/100로 재현탁하고, 원심분리하여 맑게 하고, 4℃에서 저장하였다. PEG 침전에 의하여 농축되고 TNE 버퍼에서 재현탁된 재조합 항원을 4.0% 에탄올로 추출하여 잔존 PEG를 제거하였다 (Hunt 등, "A recombinant particulate antigen of Japanese encephalitis virus produced in stably-transformed cell is an effective noninfectious antigen and subunit immunogen," J. Virol. Methods. 97. 133.149 (2001)). 상기 형질전환된 세포 및 구배-정제된 DEN-2 비리온으로부터 얻어진 에탄올 침전된 항원, 소수성 막 단백질을 Excel Plus Electrophoresis ApparatusTM (Invitrogen Corp., Carlsbad,CA) 중의 NuPAGE, 4-12% Bis-Tris 구배 겔 상에서 분석하고, Excel Plus Blot Unit (Invitrogen Corp.)를 이용하여 니트로셀룰로즈 막 상에 전기블롯팅하였다. DEN-2 바이러스-특이적 단백질은 DEN-2 바이러스 특이적 MAb 1A6A-8 (E 특이적) 및 1A2A-1 (캡시드 특이적) 뿐만 아니라, DEN-2 prM에 특이적인 토끼 항혈청 및 DEN-2 M 단백질의 아미노산 1-34로 구성되는 펩티드에 특이적인 생쥐 혈청을 사용한, 웨스턴 블롯팅에 의하여 검출하였으며, 정상 생쥐 복수액을 음성 대조군으로 사용하였다(Murray 등, "Processing of the Dengue virus type 2 proteins prM 및 C-prM," J. Gen. Virol. 74 (Pt 2): 175-182 (1993); Roehrig 등, "Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the Dengue 2 virus, Jamaica," Virology 246: 317-328 (1998)).
vi. 생쥐 면역접종
10마리의 3주령 암컷 ICR 이계교배된 생쥐의 그룹을 본 연구에 사용하였다. 생쥐는 100㎕/생쥐의 부피로 100㎍의 용량으로 0 주 및 3 주령에서 pCBD2-14-6, pCB9D2-1J-4-3, pCB8D2-2J-2-9-1 또는 pEGFP로 근육내 주사하였다. EndoFree Plasmid Giga KitsTM (Qiagen)로 상기 플라스미드 DNA를 XL-I 블루 세포로부터 정제하고, 1.0 ㎍/㎕의 농도로 PBS, pH 7.5 중에 재현탁하였다. pEGFP 100 ㎍을 투여받은 생쥐를 플라스미드-면역접종된 대조군으로 사용하였다. 생쥐를 주사 3 주후에 채혈하고, 상기 DEN-2 바이러스 특이적 항체 반응을 간접 ELISA 및 PRNT을 사용하여 평가하였다.
vii. 혈청학적 시험.
면역접종 전 및 후 혈청 표본을, 정제된 DEN-2 비리온에 대한 항체 결합 능력에 대하여는 ELISA에 의하여, 중화(neutralizing) (Nt) 항체에 대하여는 PRNT에 의하여, 정제된 DEN-2 바이러스 단백질을 인지하는 항체에 대하여는 웨스턴 블롯팅으로 시험하였다. PRNT는 상기한 바와 같이, DEN-2 (변이주-16681) 및 JE (변이주-Nakayama) 바이러스를 사용하여, 베로 세포에 대하여 수행하였다 (Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol. 74. 4244-4252 (2000)). 종말점(endpoint)은 90% 플라크-감소 수준에서 결정하였다 (Hunt 등, "A recombinant particulate antigen of Japanese encephalitis virus produced in stably-transformed cell is an effective noninfectious antigen and subunit immunogen," J. Virol. Methods. 97. 133.149 (2001)).
d. 결과
i. DEN-2 바이러스 재조합 항원의 임시적 발현.
DEN-2 바이러스의 prM 및 E 유전자 또는 DEN-2 및 JE 바이러스 서열의 조합으로부터의 키메라 E 유전자(80% DEN-20% JE 또는 90% DEN-10% JE)의 발현은 3개 재조합 DEN-2 DNA 플라스미드 각각을 COS-1 세포에 별도로 형질전환시킴으로써 달성되었다. 플라스미드-형질전환된 세포가 세포 배양액으로 진정한 바이러스 단백질을 발현하고, 분비하는 JE 바이러스 및 WN 바이러스 재조합 플라스미드로 행하여진 종래의 연구 결과에 근거하여, 기본적인 플라스미드를 설계하였다 (Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol. 74. 4244-4252 (2000); Davis 등, "West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays," J. Virol. 75: 4040-4047 (2001)). DEN-2 재조합 단백질의 임시적 발현은 세포 배양 상등액의 항원-포획 ELISA 및 아세톤-고정된, 형질전환된 COS-1 세포의 IFA에 의하여 초기 검사하였다 (Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol. 74. 4244-4252 (2000)). 최적 항원 발현 지점(point)은 전기천공 4시간 후에 결정되었다.
ii. 임시적으로 형질전환된 COS-1 세포에 의하여 발현된 E 단백질의 에피토프 맵핑
각각의 재조합 플라스미드에 의하여 발현된 DEN-2 단백질을 DEN-2 바이러스에 대하여 알려진 반응성을 갖는 생쥐 MAb 패널을 이용하여 평가하였다 (표. 10; Henchal 등, "Epitopic analysis of antigenic determinants on the surface of Dengue-2 virion using monoclonal antibody," Am. J. Trop. Med Hyg. 34: 162-169 (1985); Roehrig 등, "Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the Dengue 2 virus, Jamaica," Virology 246: 317-328 (1998)). 상기 MAb 패널은 prM 및 C 단백질 뿐만 아니라 플라비바이러스의 E 단백질의 3개 항원성 도메인 각각과 반응성인 항체를 포함한다(Mandl 등, "Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model," J. Virol. 63: 564-571 (1989); Rey 등, "The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution," Nature 375: 291-298 (1995)). 플라비바이러스 항원성 도메인 2 및 3에 특이적인 MAb은 DEN-2 바이러스와 3개의 플라스미드-발현된 단백질 각각과 거의 동일한 정성적 반응성을 나타내었다. 도메인 1-특이적 MAb 중의 하나인, 1B4C-2도 또한 발현된 모든 단백질과 비슷한 반응성 패턴을 보였다. 그러나, 도메인 1-특이적 MAb 중 두개 즉, 2B3A-1 및 9A4D-1은 종말점 적정에 의하여 나타난 바와 같이, 플라스미드 pCBD2-14-6 및 pCB9D2-1J-4-3에 의하여 발현된 E 단백질과 훨씬 적은 반응성을 보였다(괄호 안의 값, 표. 10). 종말점 역가의 비교 결과에 의하면, 외견상 에피토프 C3 및 C4가 100% DEN-2 E 및 90% DEN-2 E-10% JE E를 포함하는 구조체에서 잘 발현되지 않는다는 것이 밝혀졌다. prM에 특이적인 MAb 2H2는 3개의 플라스미드 모두에 의하여 발현된 항원과 동일한 반응성을 나타내었다. 항-C MAb 1A2A-1는 DEN-2 바이러스와 반응하였고, prM 및 E를 포함하나, C는 포함하지 않는, 상기 플라스미드-발현된 바이러스 단백질과 낮은 수준의 비특이적 반응성을 보였다.
iii. 3종류 DEN-2 재조합 플라스미드 각각에 의하여 생산된 분비된 단백질 및 막-결합 단백질의 비교
비슷한 양의 세포 배양액을 각 재조합 DEN-2 플라스미드로 형질전환 48시간 후 COS-1 세포로 회수하였다. 상기 배양액 중에서 발견된 분비된 재조합 항원을 PEG 침전에 의하여 100배 농축한 다음, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 추후의 분석을 방해하는 PEG를 에탄올 추출로 제거하였다. 각 플라스미드에 의하여 발현된 분비된 항원의 상대적인 양은 PEG-침전 및 에탄올-추출 세포 배양액 조성물을 Ag-포획 ELISA 분석 (표. 11)에 의하여 결정하였다. 분비된 항원은 80% DEN-2 E 및 20% JE E 유전자를 포함하는, pCB8D2-2J-2-9-1 (서열번호 34)로 트랜스펙션된 세포로부터만 검출되었다. 100% DEN-2 E 또는 90% DEN-2 E-10% JE E 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드는, 발현된 단백질을 농축하려는 노력에도 불구하고, 상기 배양액 중에 ELISA-검출가능한 항원을 생산하지 않았다.
상기 DEN-2 재조합 플라스미드 각각에 의한 분비된 항원의 생산을 평가하기 위하여 웨스턴 블롯팅 분석을 또한 사용하였다. 비교 목적으로, 동량의 PEG-침전, 에탄올-추출 세포 배양액 상등액을 NuPAGE 구배 겔에 전개하고, 니트로셀룰로즈 상에 전기블롯팅하고, 모든 DEN-2 구조 단백질과 반응할 수 있는 Mab 또는 다클론 항혈청을 이용하여 분석하였다(도 8A). DEN-2-특이적 단백질은 2종류의 플라스미드, 즉 pCB8D2-2J-2-9-1 및 pCB9D2-1J-4-3 (각각, 서열번호 46 및 44)로부터 유래한 배양액에서 검출되었기 때문에, 웨스턴 블롯팅 분석이 항원-포획 ELISA에 비하여 재조합 항원을 검출하는데 더 민감도가 높았다. 플라스미드 pCB8D2-2J-2-9-1 (서열번호 46)는 E, prM, 및 M 단백질로 구성되는 것을 밝혀진, 분비된 항원을 가장 많은 양으로 발현하였다. 상대적으로 적은 분비된 항원이 pCB9D2-1J-4-3 (서열번호 44)에 의하여 생산되었으며, pCBD2-14-6 (서열번호 42) 조성물에 대하여는 가까스로 검출가능한 수준으로서, 특히 대조군 상에서 E-특이적 MAb, 1A6A-8의 비특이적 반응성을 고려하는 경우, 상대적으로 적게 발현된 E 단백질을 포함하는 것처럼 보였다 (도 8A, 14-6 및 GFP에 대하여 레인 a, b).
E, prM, 및 M는 세포내 생합성 과정 내내 막-결합 단백질이기 때문에, 상기 3개의 재조합 DEN-2 플라스미드에 의하여 이들 단백질의 발현을 검사는 어느 경우에나 플라스미드-형질전환된 세포로부터 얻어진 세포 막 조성물의 평가를 포함하여야 한다. Mem-PER Mammalian Membrane Protein Extraction Reagent kit (Pierce)를 이용하여, 상기 재조합 플라스미드 각각에 의하여 형질전환된 동등한 수의 세포로부터 막 내재 단백질을 분리하였다. 소수성 단백질을 상 분배(phase partitioning)에 의하여 친수성 단백질로부터 분리하였다. Ag-포획 ELISA에 의한 예비 분석 결과, 상기 친수성 단백질 분획은 비반응성이나, 상기 재조합 DEN-2 플라스미드 각각에 의하여 형질전환된 COS-1 세포로부터 얻은 상기 소수성 단백질 분획은 ELISA 시험(표. 1)에서 비슷한 역가를 갖는 것이 밝혀졌다. 이들 결과는, 3개의 플라스미드에 의하여 코딩되는 재조합 항원은 형질전환 후 발현되나, 상기 발현된 재조합 항원은 모두 동일한 수준으로 분비되는 것은 아니라는 것을 나타낸다.
상기 소수성 단백질 분획에 대한 상기 Ag-포획 결과의 확인은 웨스턴 블롯팅에 의하여 달성되었다(도 8B). 밴드 및 레인 왜곡을 감소시키기 위하여, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 대하여 한 제조자의 권고에 따라, 상기 플라스미드-형질전환된 세포 각각으로부터 얻은 동부피의 소수성 단백질 분획을 희석하였다. E, prM, C-, 및 M-특이적 MAb 또는 다클론 항혈청으로 면역블롯팅을 한 결과, 모든 3개의 재조합 DEN-2 플라스미드가 비슷한 양의 E 및 prM으로 이루어지는 재조합 항원의 생산을 유도한다는 것이 밝혀졌다. M 단백질은 검출되지 않았으며, 이는 prM으로부터 가공되지 않았거나, 그 발현 수준이 너무 낮아 검출할 수 없었기 때문일 수 있다. 밴드 왜곡을 감소시키려는 노력에도 불구하고, 상기 소수성 단백질 시료 중의 높은 세제 수준은 외견상 그러한 높은 농도의 세제가 없는 시료에 비하면, E 및 prM이 다소 비정상 방식으로(더 느린 이동) 전개되도록 한다(도 8A 및 8B에서 E 및 prM 이동을 비교하라).
iv. 3개의 다른 DEN-2 재조합 DNA 플라스미드로 면역접종된 생쥐에서 면역 반응의 비교.
3주령 ICR 생쥐를 100㎍의 pCB8132-2J-2-9-1 (서열번호 46), pCB9D2-1J-4-3 (서열번호 44), pCBD2-14-6 (서열번호 42), 또는 pEGFP를 0과 3주에 근육내 주사에 의하여 면역화하였다. 일차 면역화 3, 6, 및 9 주 후 생쥐로부터 채혈하였다. 면역접종 3 및 6주 후에 1:100 및 1:400의 스크리닝 희석 및 면역접종 9주 후에 종말점 적정(endpoint titration)을 사용하여, 개별 및 풀링된 혈청을 간접 ELISA에 의하여 시험하였다. 9주 혈청을 DEN-2 및 JE 바이러스를 이용한 PRNT에 의하여 또한 시험하였다. 상기 ELISA 결과에 의하면, 한번의 면역화 후(3주 혈청), pCB8132-2J-2-9-1을 투여받은 모든 생쥐는 혈청전환되었으나, pCB9D2-1J-4-3 및 pCBD2-14-6-면역접종된 생쥐 중의 각각 50% 및 20%만이 DEN-2 바이러스와 반응하였다 (표. 12). 면역접종 9 주 후, pCB8D2-2J-2-9-1 또는 pCBD2-1J-43으로 면역접종된 모든 생쥐는 항-DEN-2 ELISA 반응성을 보였다; 그러나, 기하 평균 역가는 상당히 달랐다 (각각, 1:20,000 대 1:708의 역가). pCBD2-14-6-면역화된 생쥐의 40%만이 1:100 보다 큰 항-DEN-2 ELISA 역가를 보였다. 정제된 DEN-2 바이러스에 대한 pCB8D2-2J-2-9-1-면역화된 생쥐로부터 얻어진 풀링된 9-주 혈청의 웨스턴 블롯팅 결과, 면역우세 반응(immunodominant response)은 E 당단백질에 대한 것이라는 것이 밝혀졌다. prM 및 M에 대한 약한 반응성이 또한 검출되었다.
더욱 중요하게도, 상기 3개의 DEN-2 플라스미드의 백신 잠재력의 관점에서, pCB8D2-2J-2-9-1 (서열번호 46)로 면역 접종된 9마리의 생쥐 중 7마리에서 바이러스-중화 항체가 유도되는 것이 90% 플라크-감소 종말점에 근거하여 관찰되었다(표. 10). 그러나, 50% 중화 종말점이 사용되는 경우, 9개 혈청 중 모든 9개가 1:40의 PRNT 역가를 가졌다. 90% 중화 역가는 중화 활성을 갖는 7개 혈청에 대하여 1:40 내지 >1:1000의 범위이다. pCB9D2-1J-4-3로 면역화된 생쥐 중 어느 것도 중화항체를 생산하지 않았고, pCBD2-14-6-면역접종된 생쥐의 10개 혈청 중 1개 만이 바이러스를 중화하였으나, 그 역가는 1:8만에 되지 않았다.
상기 2개의 재조합 플라스미드, 즉 pCB9D2-IJ-4-3 (서열번호 44) 및 pCB8D2-2J-2-9-1 (서열번호 46)은 JE 바이러스 E-유전자 서열을 포함하고 있기 때문에, 모든 혈청이 또한 JE 바이러스 중화 항체가 존재하는 것으로 평가되었다. 그러나, 면역화된 그룹의 임의의 생쥐에서, 생쥐에 대한 90% 중화 종말점에서 그러한 활성은 검출되지 않았다. 당연하게도, 대조군 플라스미드 pEGFP로 면역접종된 생쥐는 DEN-2 또는 JE 바이러스의 어느 것에도 반응성을 보이지 않았다.
e. 토의
진정한 DEN-2 prM 및 E 유전자 영역으로 구성되는, 재조합 DEN-2 플라스미드, pCBD2-14-6 (서열번호 42)를 제조하기 위하여, 상기 JE 및 WN 백신에 대하여 이전에 사용된 동일한 단계를 먼저 사용되었다. IFA에 의한 MAb의 패널을 사용한, 이 플라스미드에 의하여 형질전환된 COS-1 세포에 의하여 발현된 DEN-2 단백질의 항원 맵핑 결과에 의하면, prM 및 E 단백질은 바이러스 감염된 세포 (표. 10)와 같은, 호환성(compatible) 형광 강도 및 비슷한 MAb 반응성을 보였다. 그러나, 진정한 DEN-2 prM 및 E 영역을 코딩하는 상기 플라스미드에 의하여 형질전환된 이들 COS-1 세포는 배양액에 검출가능한 DEN-2 항원을 분비하지 못하였다 (항원-포획 ELISA로 측정함). 더욱이, 진정한 DEN-2 prM 및 E 영역을 코딩하는 플라스미드를 사용한 면역접종은 근육내 면역접종된 생쥐에서 항-DEN-2 바이러스 중화 항체를 자극하지 못하였다 (표. 13). 흥미롭게도, pCBD2-14-6에 의하여 세포를 형질전환시키면 점이 찍힌-구형(punctuated-globular) 형광 염색이 유도되는데, 이는 DEN-2의 E 단백질의 C-말단이 상기 단백질의 막 체류 신호에 기여할 수 있다는 것을 나타낸다. 이 IFA 염색 페턴은 JE 또는 WN 구조체-형질전환된 세포에서는 어느 쪽에서도 관찰되지 않았다 (Chang 등, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice," J. Virol. 74. 4244-4252 (2000); Davis 등, "West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays," J. Virol. 75: 4040-4047 (2001)). 그러므로, 본 출원의 개시(teaching)에 따라서 이루어진 관찰의 관점에서, 두개의 추가의 플라스미드, 즉, pCB9D2-IJ-4-3 (서열번호 44) 및 pCB8D2-2J-2-9-1 (서열번호 46)에 대하여, DNA 서열을 적절하게 조작하여 DEN-2의 E 단백질의 C-말단의 10 % 또는 20 %를 각각 JE 바이러스 E 단백질의 대응되는 영역으로 치환하였다. 면역접종된 생쥐에서 검출가능한 항-DEN-2 ELISA 항체를 자극하는데 있어서 여러 구조체의 상대적 효율성을 표 13에 나타내었다.
이들 결과는 prM 및 E 사이의 상호작용이 입자 조립(assembly) 및 분비 과정에 영향을 미칠 수 있다는 모델과 일관된다. 이 모델을 지지하는 결과(support)는 prM 및 E의 엑토도메인 사이의 상호작용이 prM-E의 prM-매개 세포내 전달에 관여되어 있고, 따라서 바이러스-유사 입자의 분비에 관여되어 있다는 것을 잠정적으로 암시하는, 진드기-매개 뇌염 바이러스의 연구에서 발견할 수 있다 (Allison 등, "Mapping of functional elementss in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E," J. Virol. 73: 5605-5612 (1999)).
본 발명의 실시예에서, DEN-2 E 단백질의 C-말단을 TBE H1pred 내지 TM2에 해당하는 JE E 단백질로 치환하는 경우, DEN-2 prM 단백질 및 키메라 E 단백질이 분비되었다. 그러나, 대조적으로, TBE내의 TM1 및 TM2를 치환시키는 경우, 항원 분비가 단지 사소한 정도로 개선되었다. pCBD2-14-6 및 pCB9D24-3 플라스미드 중 어느 하나에 의하여 형질전환된 COS-1에 의하여 발현된 prM 및 E 단백질의 대부분 막-결합 상태이었다 (표. 13). 이들 결과는 미확인 막 체류 서열이 DEN-2 E 단백질의 C-말단 스템 영역에 위치한다는 것을 나타낸다. 이 C-말단 스템 영역을 JE 바이러스 유래의 서열로 치환하는 경우, 이 체류 서열을 제거하거나 효과적이지 못하게 한다.
prM-E 성숙과정 중에 E 단백질의 적절한 고차구조와 분비를 유지하기 위하여는 상기 prM 단백질이 필수적이라는 것이 다른 연구자들에 의하여 주장되었다 (Aberle 등, "A DNA immunization model study with constructs expressing the tick-borne encephalitis virus envelope protein E in different physical forms," J. Immunol. 163. 6756-6761 (1999), Allison 등, "Synthesis and secretion of recombinant tick-borne encephalitis virus protein E in soluble and particulate form," J. Virol. 69:5816-5820 (1995)). 더욱이, E 단백질의 엑토도메인이 prM과 상호작용한다는 것이 또한 개시되어 있었다. 이 상호작용은 머레이계곡 뇌염 바이러스의 E의 아미노산 잔기 200-327 내의 아미노산 서열과 관련이 있는 것으로 추정되고 있다 (Guirakhoo 등, "The Murray Valley encephalitis virus prM protein confers acid resistance to virus particles and alters the expression of epitopes within the R2 domain of E glycoprotein," Virology 191: 921-931 (1992)).
적절한 prM 및 E 상호작용 및 상기 E 단백질의 구조의 보류된 견고성(retained integrity)은, 면역반응성에서 필요로 하는 정도에서는, 모든 3개의 DEN-2 구조체에 의하여 발현된 단백질에서 유지되는 것처럼 보인다. 더욱이, pCB8D2-2J-2-9-1에서 C-말단 20% E를 치환에 의하여, 진정한 DEN-2 E의 395 아미노산을 유지한 단백질이 얻어지도록 하였다. 임의의 그러한 변형은 E 및 prM-E 상호작용 및 키메라 E 단백질의 항원성 성질에 미치는 그들의 영향을 최소화하는 것으로 예측된다. DEN-2 E의 C-말단 영역을 JE 스템-앵커 서열로 치환하였을 경우, MAb 반응성에 아무런 영향을 미치지 않았기 때문에 (표. 10), 그렇게 치환된 DEN-2 서열을 보유하는 것은 DEN-2 특이적 면역학적 반응을 얻는데 단지 선택적일 수 있다.
종래, 항체 반응의 정도 및 기능성(functionality)의 관점에서 및 바이러스 챌린지에 대한 반응의 관점에서, 분비된 C-말단이 잘려진 용해성 E 이량체, 분비되지 않은 전장 E, 또는 효과적으로 분비되지 않은 잘려진 E에 비하여, 진드기-매개 뇌염 바이러스 prM 및 E 단백질의 분비된 서브바이러스 입자를 코딩하는 플라스미드 구조체가 우수하다는 것이 알려졌다 (Aberle 등, "A DNA immunization model study with constructs expressing the tick-borne encephalitis virus envelope protein E in different physical forms," J. Immunol. 163. 6756-6761 (1999)). 그러나, 본 발명자들은 본 명세서에서 DEN-2 DNA의 백신 성능은 prM/M 및 E의 분비와 상관된다는 것을 밝혔다 (표. 13). 분비된 prM 및 E의 모양(morphology) 및 물리적 특성은 본 연구에서 개시하지 않았다. 그러나, pCB8D2-2J-2-9-1 구조체에 의하여 분비된 prM 및 E는 바이러스-유사 입자를 형성할 것으로 여겨진다. 상기 입자 표면 상에 복수의 보호 항원을 제시하는 것은 이 구조체의 백신 성능을 개선시킬 것으로 여겨진다.
DEN-2 바이러스 DNA 백신 개발을 위한 종래의 시도는 다양한 정도의 성공을 거두었다 (Kochel 등, "Inoculation of plasmids expressing the Dengu-2 envelope gene elicit neutralizing antibody in mice," Vaccine 15: 547-552 (1997); Konishi 등, "A DNA vaccine expressing Dengue type 2 virus premembrane and envelope gene induces neutralizing antibody and memory B cell in mice," Vaccine 18: 1133-1139 (2000)). 효능 수준을 개선하기 위하여, 다양한 전략이 도입되었다. 예를 들면, 면역촉진 CpG 모티프 함유 pUC19 플라스미드의 공동면역화, 백신 제제(regimen) 내에서 생쥐 GM-CSF를 발현하는 플라스미드, 또는 E 단백질의 C-말단 43 아미노산을 DEN-2 백신에 대한 항체 반응을 개선시킨 리소좀-결합 막 체류 서열로 치환하는 방법이 사용되었다 (Porter 등, "Protective efficacy of a Dengue 2 DNA vaccine in mice and the effect of CpG immuno-stimulatory motifs on antibody responses," Arch. Virol. 143: 997-1003 (1998); Raviprakash 등, "Synergistic Neutralizing antibody Response to a Dengue virus type 2 DNA vaccine by Incorporation of Lysosome-Associated Membrane protein sequences and Use of plasmid Expressing GM-CSF," Virology 290: 74-82 (2001)). 메틸화되지 않은 CpG 모티프는 마크로파아지, 천연 킬러(natural killer) 세포 및 림프구가 사이토카인 및 키모카인을 분비하게 하고, Th1 사이토카인에 의하여 매개되는 면역 반응의 발생을 뒤받침하여 준다 (Manders 등, "Immunology of DNA vaccines: CpG motifs and antigen presentation," Inflamm. Res. 49: 199-205 (2000)). 그러나, CpG를 포함시키면 숙주의 사이토카인 프로필을 편향되게 할 수도 있어 Th-1-매개 기관-특이적 자가면역 질환의 발생 및 면역 항상성의 방해 모두에 기여할 수 있다 (Smith 등, "The regulation of DNA Vaccines," Curr. Opin. Biotech. 12: 299-303 (2001)). 또한, 생쥐에서 과수준의 사이토카인은, 비록 특정한 T-헬퍼 세포의 반응을 증가시키지만, 면역반응의 다른 작용자(actor)의 반응을 감소시키거나 없애버리기 때문에, 일반적 면역억제(immunosuppression) 또는 만성 염증을 유발할 수 있다는 것이 입증되었다 (Robertson 등, "Assuring the quality, safety, and efficacy of DNA Vaccines," Mol. Biotechnol. 17: 143-149 (2001)). 따라서, 플라비바이러스 DNA 면역화의 안전성 및 효능(efficacy)는 전사 및 번역을 증진시키기 위하 발현 플라스미드의 조작 및 올바른 폴리단백질 가공 및 조립(assembly)을 촉진하는 분비가 이루어지도록 prM 및 E 단백질을 표적화(targeting)하는 것에 의하여 유익하게 될 수 있다 (Chang 등, "Flavivirus DNA vaccine: current status and potential", Annals of NY Acad. Sci. 951: 272-285 (2001)). 추가의 개선은 항원제공세포 또는 근육 세포에 의한 DNA 섭취(uptake)를 증진시키는데 집중될 수 있다 (Rodriguez 등, "Enhancing DNA immunization," Virology 268: 233-238 (2000)).
표 1. 두개의 트랜스펙션된 세포주에서 다양한 재조합 플라스미드에 의한 JE prM 및 E 단백질의 임시적 발현.
* 다양한 세포주가 pCDNA3/CAT(음성 대조군), pCDJE2-7, pCBJE1-14, pC1BJES14, pCEJEm pREJE, 또는 pRCJE로 형질전환되었고, 세포는 48시간 후 트립신 처리하고, JE 바이러스-특이적 HIAF로 간접 면역형광 항체 분석법(IFA)에 의하여 시험하였다. 데이터는 강도(1+ 내지 4+) 및 IFA 양성 세포의 백분율로 나타내었다. 상기 pCDNA3/CAT 형질전환된 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
표 2. JE 바이러스-반응성 항체를 사용한 COS-1 세포의 pCDJE2-7로 안정하게 형질전환된 클론(JE-4B)에 의하여 발현된 단백질의 특성 분석.
표 3. pCDJE2-7 또는 JE-VEX 백신으로 면역화된 생쥐에서 면역 반응의 지속성.
생쥐를 100 ㎍/용량(dose) 플라스미드 DNA 또는 JE-VAX 백신의 1/5 인간 용량(dose)의 1 또는 2 용량으로 접종하였다. 혈청을 2차 면역화 전에 시험하기 위하여 수집하였다.
* 개별 혈청 역가
표 4. 다양한 JEV 백신으로 면역접종한 후 생쥐에서 연령-의존적 혈청양성 백분율(percent seropositive rate)
표 5. 다양한 JEV 백신으로 3일령에서 면역접종한 후 8주령 생쥐에서 JEV 챌린지로부터의 보호
표 6. JEV-핵산-면역접종된 암컷 생쥐로부터 어미 항체가 치명적 JEV 뇌염으로부터 새끼를 보호하는 능력의 평가
생쥐를 플라스미드 DNA 100㎍ 용량의 1 또는 2 용량으로 근육내 접종하거나, JE-VAX 백신의 1/5 인간 용량의 2 용량으로 피하 접종하였다. 혈청을 면역접종 9주 후에 수집하여 비면역 수컷과 교배하기 전에 PRNT를 검사하였다.
1 : 생존자 없음/각각의 한배에서 난 새끼 총수
2 : JEV ELISA-항체 양성 동물의 수(역가 ≥ 1:4000)/생존자 수; 혈청은 챌린지 12 주후 시험하기 위하여 수집하였다.
표 7. 플라비바이러스 DNA 백신 구조체 중 신호 펩티드의 특성과 백신 잠재력
a SignalP HMM 프로그램을 시그날 펩티드(SP), 앵커 펩티드(AP) 및 시그날라제 절단 부위(C) 확률을 계산하는데 사용하였다. 단일 아미노산 코드를 사용하였으며, 전하를 띤 아미노산을 굵은 밑줄로 표시하였다. SP와 prM을 분리하는 상기 시그날라제 절단 부위는 "/"로 표시하였다. DNA 백신은 근육내(im), 피내(id), 또는 유전자 총(gg) 법에 의하여 접종하였다.
표 8. 조합된 WN 및 JE 바이러스 DNA 백신의 여러 용량(dose)으로 면역된 생쥐에서 중화항체(Nt) 반응
10마리의 3 주령 암컷 ICR 이계교배 생쥐의 그룹을 표시한 바와 같은 조합된 플라스미드 DNA의 단일 용량(single dose)으로 근육내 주사하였다. 면역접종 12 후 수집된 혈청 표본을 플라크-감소 중화 시험(PRNT)에 의하여 분석하였다. JE 및 WN 바이러스에 대한 종말점 역가는 각각 JE 바이러스(변이주 SA-14) 및 웨스트 나일 바이러스(변이주 NY-6480)을 사용하여 90% 플라크 감소에 근거하여 계산하였다.
표 9. DEN-2 바이러스 prM-E 발현 플라스미드를 제조하는데 사용된 올리고뉴클레오티드, 및 키메라 DEN-2 및 JE E의 접합 부위
a 올리고뉴클레오티드에 코딩된 제한 효소 부위는 볼드체, 이탤릭체 및 밑줄로 표시하였다.
표 10. 간접 형광 항체 분석법(IFA)에 의하여 결정된 재조합 DEN-2 플라스미드에 의하여 발현된 DEN-2 E 당단백질 에피토프의 특성
a IFA 기질은 DEN-2 16681로 감염되거나, 감염되지 않거나, DEN-2 재조합 플라스미드로 형질전환된 아세톤-고정된 COS-1 세포이었다.
b 단일클론항체는 DEN-2 16681 바이러스와의 반응성에 근거하여 설정된 최적 희석배수에서 사용하였다. 일부 MAb에 대하여는, 괄호안에 나타낸 바와 같이 종말점 역가를 보고하였고, 다른 일부에 대하여는 단지 정성적인 수치만을 1+ 내지 4+의 범위, 즉 3-4+는 양성, 2+는 애매함(equivocal), 및 1+ 음성으로 간주하여 보고하였다.
c TBE 바이러스의 E-당단백질에 기초한 항원성 도메인(Mandl 등, "Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-bome encephalitis virus as a model," J. Virol. 63: 564-571 (1989); Rey 등, "The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution," Nature 375: 291-298 (1995)).
d 90% 플라크-감소 종말점을 사용한, 복수의 1:100 희석액에서 플라크-감소 중화 활성, 4G2 및 9D12-6에 대하여는 예외적으로 50% 중화 종말점을 나타내었다 (Henchal 등, "Epitopic analysis of antigenic determinants on the surface of Dengue-2 virion using monoclonal antibody," Am. J. Trop. Med Hyg. 34: 162-169 (1985); Roehrig 등, "Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the Dengue 2 virus, Jamaica," Virology 246: 317-328 (1998)).
표 11. 항원-포획 ELISA에 의한 분비된 및 막-결합 DEN-2 재조합 단백질의 검출
a 플라스미드-형질전환된 세포로부터 얻은 배양 상등액을 10% PEG로 침전시키고, 원 부피의 1/100로 재현탁하였다.
b PEG-침전된 배양 상등액을 4% 에탄올로 추출하여 PEG를 제거하고, 상기 펠렛을 추출된 부피의 1/5로 재현탁하였다.
c 소수성 막 분획을 재료 및 방법에 개시된 바와 같이 제조하였다.
표 12. ICR 생쥐에서 3개의 DEN-2 재조합 플라스미드의 면역원성
플라스미드 DNAb 생쥐 # DEN-2 바이러스에 대한 ELISA DEN-2 바이러스에 대한 PRNTa종말점 역가9주, p.v. JE 바이러스에 대한PRNTa종말점 역가9주, p.v.
스크린 3주,p.v.c 스크린 6주,p.v.c 종말점 역가9주, p.v.
1:100 1:400 1:100 1:400
pCB8D2-2J-2-9-1 풀, 1,2,4-10 NDd ND + + 64,000 ND ND
1 + + + + 64,000 >1000 <2
2 + + + + 32.000 >1000 <2
4 + + + + 16,000 200 <2
5 + + + + 4,000 <10 <2
6 + + + + 16,000 200 <2
7 + - + + 64,000 100 <2
8 + - + + 8,000 40 <2
9 + + + + 6,400 <2 <4
10 + + + + 64,000 >1000 <2
pCB9D2-1J-4-3 풀, 1-10 ND ND + + 1,000 ND <2e
1 - - + - 400 <10 ND
2 + - + + 200 <10 ND
3 + + + + 4,000 <2 ≤4
4 + - + - 200 <10 ND
5 - - + + 400 <10 ND
6 + + + + 4,000 <2 2
7 - +/- - - 100 <10 ND
8 - - - - 200 <10 ND
9 + - + - 4,000 <2 <2
10 - - + + 4,000 <2 <2
pCBD2-14-6 풀, 1-10 ND ND + - 200 <2f <2g
1 - - - - 400 <10 ND
2,3,6-9 - - - - <100 ND ND
4 + + + + 1,000 <2 <2
5 - - + - 2,000 8 <2
10 + - - - <100 ND ND
pEGFP 풀, 1-10 - ND - ND <100 <2 <2
a PRNT, 플라크-감소 중화 시험(plaque-reduction neutralizaton test), 90% 중화 종말점.
b 생쥐를 0 및 3 주에 100㎍ 플라스미드 DNA로 근육내 면역접종하였다.
c ELISA 스크린에는 1:100 및 1:400으로 희석된 혈청을 사용하였다.
d ND, 행하여지지 않음(not done).
e 풀, 1,2,4,5,7,8
f 풀, 2,3,6-10
g 풀, 1-3,6-10
표 13. 3개의 DEN-2 재조합 플라스미드의 특성 요약
플라스미드 IFAa Ag-포획 ELISA 역가 DEN-2에 대한 ELISA 역가b DEN-2 PRNTc
+/- 구형/퍼짐 분비된 항원 소수성 막 단백질 조성물 ≥1:100인 혈청의 수 풀링된 혈청 역가 ≥1:10인 혈청의 수
pCB8D2-2J-2-9-1 + 퍼짐 1:640 1:80 9/9 1:64000 7/9d
pCB9D2-1J-4-3 + 구형 ＜1:10 1:80 10/10 1:1000 0/10
pCBD2-14-6 + 구형 ＜1:10 1:160 3/10 1:200 0/10
a 간접 형광 항체 분석법(IFA) 염색 특성, + 또는 -, 및 퍼짐(diffuse) 또는 구형(globular) 패턴.
b 재조합 플라스미드로 면역접종된 생쥐로부터 얻은 혈청의 항-DEN-2 ELISA 역가. 혈청은 면역접종(0 및 3 주) 9주 후 수집하였다. 풀링된 혈청 시료의 종말점 ELISA 역가를 포함한, ≥ 1:100의 역가를 갖는 생쥐의 수/생쥐의 총 수를 나타내었다.
c 플라크-감소 중화 역가(PRNT, 90% 감소) ≥ 1:10을 갖는 생쥐의 수/생쥐의 총수. 혈청은 면역접종 9주 후에 수집하였다.
d 중화 항체를 갖는 7마리의 생쥐 중, 3마리 생쥐가 ＞ 1:1000의 PRNT를 가졌고, 3마리는 ≥ 1:100 ＜ 1:1000의 역가를 가졌고, 한 마리는 1:40의 역가를 가졌다.
<110> The Government of the United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services, c/o Centers for Disease Control and Prevention Chang, Gwong-Jen J <120> Nucleic Acid Vaccines for Prevention of Flavivirus Infection <130> 14114.0332P2 <150> 09/826,115 <151> 2001-04-04 <150> 09/701,536 <151> 2000-11-29 <150> PCT/US99/12298 <151> 1999-06-03 <150> 60/087,908 <151> 1998-06-04 <160> 61 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <221> CDS <222> (25)...(48) <221> misc_feature <222> 1-48 <223> Amplimer 14DV389 <400> 1 cttggtacct ctagagccgc cgcc atg ggc aga aag caa aac aaa aga 48 Met Gly Arg Lys Gln Asn Lys Arg 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 2 Met Gly Arg Lys Gln Asn Lys Arg 1 5 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <221> misc_feature <222> 1-50 <223> Amplimer c14DV2453 <400> 3 ttttcttttg cggccgctca aacttaagca tgcacattgg tcgctaagaa 50 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <221> CDS <222> (25)...(48) <221> misc_feature <222> (1)...(48) <223> Amplimer YFDV389 <400> 4 cttggtacct ctagagccgc cgcc atg cgt tcc cat gat gtt ctg act 48 Met Arg Ser His Asp Val Leu Thr 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 5 Met Arg Ser His Asp Val Leu Thr 1 5 <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <221> misc_feature <222> 1-41 <223> Amplimer cYFDV2452 <400> 6 ttttcttttg cggccgctca cgccccaact cctagagaaa c 41 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <221> CDS <222> (25)...(54) <221> misc_feature <222> 1-54 <223> Amplimer SLEDV410 <400> 7 cttggtacct ctagagccgc cgcc atg tct aaa aaa aga gga ggg acc aga 51 Met Ser Lys Lys Arg Gly Gly Thr Arg 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 8 Met Ser Lys Lys Arg Gly Gly Thr Arg 1 5 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <221> misc_feature <222> 1-38 <223> Amplimer cSLEDV2449 <400> 9 ttttcttttg cggccgctta ggcttgcacg ctggttgc 38 <210> 10 <211> 7500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <221> CDS <222> (916)...(3009) <221> misc_feature <222> 1-7500 <223> pCDJE 2-7 <400> 10 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc 900 gagctcgccg ccgcc atg ggc aga aag caa aac aaa aga gga gga aat gaa 951 Met Gly Arg Lys Gln Asn Lys Arg Gly Gly Asn Glu 1 5 10 ggc tca atc atg tgg ctc gcg agc ttg gca gtt gtc ata gct tgt gcg 999 Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala 15 20 25 gga gcc atg aag ttg tcg aat ttc cag ggg aag ctt ttg atg acc atc 1047 Gly Ala Met Lys Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys Leu Leu Met Thr Ile 30 35 40 aac aac acg gac att gca gac gtt atc gtg att ccc acc tca aaa gga 1095 Asn Asn Thr Asp Ile Ala Asp Val Ile Val Ile Pro Thr Ser Lys Gly 45 50 55 60 gag aac aga tgc tgg gtc cgg gca atc gac gtc ggc tac atg tgt gag 1143 Glu Asn Arg Cys Trp Val Arg Ala Ile Asp Val Gly Tyr Met Cys Glu 65 70 75 gac act atc acg tac gaa tgt cct aag ctt acc atg ggc aat gat cca 1191 Asp Thr Ile Thr Tyr Glu Cys Pro Lys Leu Thr Met Gly Asn Asp Pro 80 85 90 gag gat gtg gat tgc tgg tgt gac aac caa gaa gtc tac gtc caa tat 1239 Glu Asp Val Asp Cys Trp Cys Asp Asn Gln Glu Val Tyr Val Gln Tyr 95 100 105 gga cgg tgc acg cgg acc agg cat tcc aag cga agc agg aga tcc gtg 1287 Gly Arg Cys Thr Arg Thr Arg His Ser Lys Arg Ser Arg Arg Ser Val 110 115 120 tcg gtc caa aca cat ggg gag agt tca cta gtg aat aaa aaa gag gct 1335 Ser Val Gln Thr His Gly Glu Ser Ser Leu Val Asn Lys Lys Glu Ala 125 130 135 140 tgg ctg gat tca acg aaa gcc aca cga tat ctc atg aaa act gag aac 1383 Trp Leu Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Met Lys Thr Glu Asn 145 150 155 tgg atc ata agg aat cct ggc tat gct ttc ctg gcg gcg gta ctt ggc 1431 Trp Ile Ile Arg Asn Pro Gly Tyr Ala Phe Leu Ala Ala Val Leu Gly 160 165 170 tgg atg ctt ggc agt aac aac ggt caa cgc gtg gta ttt acc atc ctc 1479 Trp Met Leu Gly Ser Asn Asn Gly Gln Arg Val Val Phe Thr Ile Leu 175 180 185 ctg ctg ttg gtc gct ccg gct tac agt ttt aat tgt ctg gga atg ggc 1527 Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly 190 195 200 aat cgt gac ttc ata gaa gga gcc agt gga gcc act tgg gtg gac ttg 1575 Asn Arg Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu 205 210 215 220 gtg ctg gaa gga gat agc tgc ttg aca atc atg gca aac gac aaa cca 1623 Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro 225 230 235 aca ttg gac gtc cgc atg att aac atc gaa gct agc caa ctt gct gag 1671 Thr Leu Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu 240 245 250 gtc aga agt tac tgc tat cat gct tca gtc act gac atc tcg acg gtg 1719 Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val 255 260 265 gct cgg tgc ccc acg act gga gaa gcc cac aac gag aag cga gct gat 1767 Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp 270 275 280 agt agc tat gtg tgc aaa caa ggc ttc act gac cgt ggg tgg ggc aac 1815 Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn 285 290 295 300 gga tgt gga ctt ttc ggg aag gga agc att gac aca tgt gca aaa ttc 1863 Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe 305 310 315 tcc tgc acc agt aaa gcg att ggg aga aca atc cag cca gaa aac atc 1911 Ser Cys Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile 320 325 330 aaa tac gaa gtt ggc att ttt gtg cat gga acc acc act tcg gaa aac 1959 Lys Tyr Glu Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn 335 340 345 cat ggg aat tat tca gcg caa gtt ggg gcg tcc cag gcg gca aag ttt 2007 His Gly Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe 350 355 360 aca gta aca ccc aat gct cct tcg ata acc ctc aaa ctt ggt gac tac 2055 Thr Val Thr Pro Asn Ala Pro Ser Ile Thr Leu Lys Leu Gly Asp Tyr 365 370 375 380 gga gaa gtc aca ctg gac tgt gag cca agg agt gga ctg aac act gaa 2103 Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu 385 390 395 gcg ttt tac gtc atg acc gtg ggg tca aag tca ttt ctg gtc cat agg 2151 Ala Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg 400 405 410 gag tgg ttt cat gac ctc gct ctc ccc tgg acg tcc cct tcg agc aca 2199 Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr 415 420 425 gcg tgg aga aac aga gaa ctc ctc atg gaa ttt gaa gag gcg cac gcc 2247 Ala Trp Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala 430 435 440 aca aaa cag tcc gtt gtt gct ctt ggg tca cag gaa gga ggc ctc cat 2295 Thr Lys Gln Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His 445 450 455 460 cag gcg ttg gca gga gcc atc gtg gtg gag tac tca agc tca gtg aag 2343 Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys 465 470 475 tta aca tca ggc cac ctg aaa tgt agg ctg aaa atg gac aaa ctg gct 2391 Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Ala 480 485 490 ctg aaa ggc aca acc tat ggc atg tgt aca gaa aaa ttc tcg ttc gcg 2439 Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala 495 500 505 aaa aat ccg gcg gac act ggt cac gga aca gtt gtc att gaa ctc tcc 2487 Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser 510 515 520 tac tct ggg agt gat ggc ccc tgc aaa att ccg att gct tcc gtt gcg 2535 Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Ala Ser Val Ala 525 530 535 540 agc ctc aat gac atg acc ccc gtt ggg cgg ctg gtg aca gtg aac ccc 2583 Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro 545 550 555 ttc gtc gcg act tcc agt gcc agc tca aag gtg ctg gtc gag atg gaa 2631 Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala Ser Ser Lys Val Leu Val Glu Met Glu 560 565 570 ccc ccc ttc gga gac tcc tac atc gta gtt gga agg gga gac aag cag 2679 Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln 575 580 585 atc aac cac cat tgg cac aaa gct gga agc acg ctg ggc aag gcc ttt 2727 Ile Asn His His Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe 590 595 600 tca aca act ttg aag gga gct caa aga ctg gca gcg ttg ggc gac aca 2775 Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr 605 610 615 620 gcc tgg gac ttt ggc tct att gga ggg gtc ttc aac tcc ata gga aaa 2823 Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys 625 630 635 gcc gtt cac caa gtg ttt ggt ggt gcc ttc aga aca ctc ttt ggg gga 2871 Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly 640 645 650 atg tct tgg atc aca caa ggg cta atg ggt gcc cta ctg ctc tgg atg 2919 Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met 655 660 665 ggc gtc aac gca cga gac cga tca att gct ttg gcc ttc tta gcc aca 2967 Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr 670 675 680 ggg ggt gtg ctc gtg ttc tta gcg acc aat gtg cat gct taa 3009 Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala * 685 690 695 ttagtttgag cggccgctcg agcatgcatc tagagggccc tattctatag tgtcacctaa 3069 atgctagagc tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 3129 gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 3189 aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 3249 tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 3309 tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg 3369 cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 3429 cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 3489 tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc ggggcatccc tttagggttc cgatttagtg 3549 ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat 3609 cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 3669 tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag 3729 ggattttggg gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 3789 cgaattaatt ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagg 3849 caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc 3909 caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag 3969 tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc 4029 cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc 4089 tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg 4149 gagcttgtat atccattttc ggatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga 4209 ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct 4269 atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc 4329 aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg 4389 acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg 4449 acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc 4509 tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc 4569 ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg 4629 agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc 4689 atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg 4749 aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc 4809 gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag 4869 cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg 4929 tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg 4989 agttcttctg agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc 5049 atcacgagat ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt 5109 ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca 5169 ccccaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 5229 cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 5289 atcttatcat gtctgtatac cgtcgacctc tagctagagc ttggcgtaat catggtcata 5349 gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag 5409 cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg 5469 ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca 5529 acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 5589 gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 5649 gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 5709 ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 5769 cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 5829 ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 5889 taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg 5949 ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 6009 ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 6069 aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 6129 tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 6189 agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 6249 ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 6309 tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 6369 tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 6429 cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 6489 aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 6549 atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 6609 cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga 6669 tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 6729 atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt 6789 taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt 6849 tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat 6909 gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 6969 cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 7029 cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 7089 gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 7149 aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 7209 accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 7269 ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 7329 gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 7389 aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 7449 taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg t 7500 <210> 11 <211> 697 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <223> pCDJE 2-7 <400> 11 Met Gly Arg Lys Gln Asn Lys Arg Gly Gly Asn Glu Gly Ser Ile Met 1 5 10 15 Trp Leu Ala Ser Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Met Lys 20 25 30 Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys Leu Leu Met 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tcc tgg ata acg caa 2869 Gly Gly Ala Phe Arg Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln 640 645 650 gga ttg ctg ggg gct ctc ctg ttg tgg atg ggc atc aat gct cgt gat 2917 Gly Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Ile Asn Ala Arg Asp 655 660 665 agg tcc ata gct ctc acg ttt ctc gca gtt gga gga gtt ctg ctc ttc 2965 Arg Ser Ile Ala Leu Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu Phe 670 675 680 685 ctc tcc gtg aac gtg cac gcc t gaaggcggcc gctcgagcat gcatctagag 3017 Leu Ser Val Asn Val His Ala 690 ggccctattc tatagtgtca cctaaatgct agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct 3077 tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt 3137 gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg 3197 tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac 3257 aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc 3317 tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 3377 cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 3437 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ggc att ttt gtg cat gga acc acc act tcg gaa aac 1959 Lys Tyr Glu Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn 335 340 345 cat ggg aat tat tca gcg caa gtt ggg gcg tcc cag gcg gca aag ttt 2007 His Gly Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe 350 355 360 aca gta aca ccc aat gct cct tcg ata acc ctc aaa ctt ggt gac tac 2055 Thr Val Thr Pro Asn Ala Pro Ser Ile Thr Leu Lys Leu Gly Asp Tyr 365 370 375 380 gga gaa gtc aca ctg gac tgt gag cca agg agt gga ctg aac act gaa 2103 Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu 385 390 395 gcg ttt tac gtc atg acc gtg ggg tca aag tca ttt ctg gtc cat agg 2151 Ala Phe Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg 400 405 410 gag tgg ttt cat gac ctc gct ctc ccc tgg acg tcc cct tcg agc aca 2199 Glu Trp Phe His Asp Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr 415 420 425 gcg tgg aga aac aga gaa ctc ctc atg gaa ttt gaa gag gcg cac gcc 2247 Ala Trp Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala 430 435 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Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met 655 660 665 ggc gtc aac gca cga gac cga tca att gct ttg gcc ttc tta gcc aca 2967 Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr 670 675 680 ggg ggt gtg ctc gtg ttc tta gcg acc aat gtg cat gct t aattagtttg 3017 Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala 685 690 695 agcggccgct cgagcatgca tctagagggc cctattctat agtgtcacct aaatgctaga 3077 gctcgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc 3137 cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag 3197 gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag 3257 gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct 3317 atggcttctg aggcggaaag aaccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3377 gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 3437 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 3497 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 3557 aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 3617 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 3677 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 3737 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 3797 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 3857 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 3917 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 3977 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 4037 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 4097 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 4157 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 4217 actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 4277 taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 4337 gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 4397 tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 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aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 5297 ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgt 5334 <210> 18 <211> 697 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <223> pCBJE 1-14 <400> 18 Met Gly Arg Lys Gln Asn Lys Arg Gly Gly Asn Glu Gly Ser Ile Met 1 5 10 15 Trp Leu Ala Ser Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Met Lys 20 25 30 Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys Leu Leu Met Thr Ile Asn Asn Thr Asp 35 40 45 Ile Ala Asp Val Ile Val Ile Pro Thr Ser Lys Gly Glu Asn Arg Cys 50 55 60 Trp Val Arg Ala Ile Asp Val Gly Tyr Met Cys Glu Asp Thr Ile Thr 65 70 75 80 Tyr Glu Cys Pro Lys Leu Thr Met Gly Asn Asp Pro Glu Asp Val Asp 85 90 95 Cys Trp Cys Asp Asn Gln Glu Val Tyr Val Gln Tyr Gly Arg Cys Thr 100 105 110 Arg Thr Arg His Ser Lys Arg Ser Arg Arg Ser Val Ser Val Gln Thr 115 120 125 His Gly Glu Ser Ser Leu Val Asn Lys Lys Glu Ala Trp Leu Asp Ser 130 135 140 Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Met Lys Thr Glu Asn Trp Ile Ile Arg 145 150 155 160 Asn Pro 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cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc 900 gccgccgcc atg ggc aag agg tcc gcc ggc tca atc atg tgg ctc gcg agc 951 Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser 1 5 10 ttg gca gtt gtc ata gct ggt aca agc gct acc acc atc cac cgg gac 999 Leu 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1335 Gly Arg Gly His Ala Trp Leu Lys Gly Asp Asn Ile Arg Asp His Val 130 135 140 acc cga gtc gag ggc tgg atg tgg aag aac aag ctt cta act gcc gcc 1383 Thr Arg Val Glu Gly Trp Met Trp Lys Asn Lys Leu Leu Thr Ala Ala 145 150 155 att gtg gcc ttg gct tgg ctc atg gtt gat agt tgg atg gcc aga gtg 1431 Ile Val Ala Leu Ala Trp Leu Met Val Asp Ser Trp Met Ala Arg Val 160 165 170 act gtc atc ctc ttg gcg ttg agt cta ggg cca gtg tac gcc acg agg 1479 Thr Val Ile Leu Leu Ala Leu Ser Leu Gly Pro Val Tyr Ala Thr Arg 175 180 185 190 tgc acg cat ctt gag aac aga gat ttt gtg aca gga act caa ggg acc 1527 Cys Thr His Leu Glu Asn Arg Asp Phe Val Thr Gly Thr Gln Gly Thr 195 200 205 acc aga gtg tcc cta gtt ttg gaa ctt gga ggc tgc gtg acc atc aca 1575 Thr Arg Val Ser Leu Val Leu Glu Leu Gly Gly Cys Val Thr Ile Thr 210 215 220 gct gag ggc aag cca tcc att gat gta tgg ctc gaa gac att ttt cag 1623 Ala Glu Gly Lys Pro Ser Ile Asp Val Trp Leu Glu Asp Ile Phe Gln 225 230 235 gaa agc ccg gct gaa acc aga gaa tac tgc ctg 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gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 3805 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 3865 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 3925 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 3985 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 4045 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 4105 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 4165 actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 4225 taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 4285 gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 4345 tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 4405 ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 4465 accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 4525 agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 4585 acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 4645 tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 4705 cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 4765 tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 4825 ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 4885 gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 4945 tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 5005 ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 5065 gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 5125 cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 5185 gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 5245 ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtc 5283 <210> 20 <211> 681 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 20 Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala 1 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aaa gat gac atc aca tac ctg tgc cca 1143 Leu Asp Val Gly Val Met Cys Lys Asp Asp Ile Thr Tyr Leu Cys Pro 65 70 75 gtg ctt tca gcg gga aat gat ccc gag gac att gac tgt tgg tgt gac 1191 Val Leu Ser Ala Gly Asn Asp Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Asp 80 85 90 gtc gaa gag gtg tgg gtg cac tac ggc aga tgc acg cgc atg gga cat 1239 Val Glu Glu Val Trp Val His Tyr Gly Arg Cys Thr Arg Met Gly His 95 100 105 110 tcg agg cgt agc cga cgg tca atc tct gtg cag cat cat gga gat tcc 1287 Ser Arg Arg Ser Arg Arg Ser Ile Ser Val Gln His His Gly Asp Ser 115 120 125 aca ctg gca aca aag aac acg cca tgg ttg gac acc gtg aaa acc acc 1335 Thr Leu Ala Thr Lys Asn Thr Pro Trp Leu Asp Thr Val Lys Thr Thr 130 135 140 aaa tac ttg aca aaa gta gaa aac tgg gtt ttg cgc aat cct gga tat 1383 Lys Tyr Leu Thr Lys Val Glu Asn Trp Val Leu Arg Asn Pro Gly Tyr 145 150 155 gcc cta gtt gcg ctg gcg att gga tgg atg ctc ggt agc aac aac aca 1431 Ala Leu Val Ala Leu Ala Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Asn Thr 160 165 170 cag aga gtg gtt 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gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 4936 ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 4996 aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 5056 actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 5116 aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 5176 tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 5236 aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 5296 ctgacgtc 5304 <210> 22 <211> 692 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 22 Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala 1 5 10 15 Val Val Ile Ala Gly Thr Ser Ala Leu Gln Leu Ser Thr Tyr Gln Gly 20 25 30 Lys Val Leu Met Ser Ile Asn Lys Thr Asp Ala Gln Ser Ala Ile Asn 35 40 45 Ile Pro Ser Ala Asn Gly Ala Asn Thr Cys Ile Val Arg Ala Leu Asp 50 55 60 Val Gly Val Met Cys Lys Asp Asp Ile Thr Tyr Leu Cys Pro Val Leu 65 70 75 80 Ser Ala Gly 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of artificial sequence; note = synthetic construct <221> CDS <222> (910)...(2953) <400> 23 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 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tat ggt aag tgt gac tca gca ggc agg tct agg agg 1239 Val Arg Val Ala Tyr Gly Lys Cys Asp Ser Ala Gly Arg Ser Arg Arg 95 100 105 110 tca aga agg gcc att gac ttg cct acg cat gaa aac cat ggt ttg aag 1287 Ser Arg Arg Ala Ile Asp Leu Pro Thr His Glu Asn His Gly Leu Lys 115 120 125 acc cgg caa gaa aaa tgg atg act gga aga atg ggt gaa agg caa ctc 1335 Thr Arg Gln Glu Lys Trp Met Thr Gly Arg Met Gly Glu Arg Gln Leu 130 135 140 caa aag att gag aga tgg ttc gtg agg aac ccc ttt ttt gca gtg acg 1383 Gln Lys Ile Glu Arg Trp Phe Val Arg Asn Pro Phe Phe Ala Val Thr 145 150 155 gct ctg acc att gcc tac ctt gtg gga agc aac atg acg caa cga gtc 1431 Ala Leu Thr Ile Ala Tyr Leu Val Gly Ser Asn Met Thr Gln Arg Val 160 165 170 gtg att gcc cta ctg gtc ttg gct gtt ggt ccg gcc tac tca gct cac 1479 Val Ile Ala Leu Leu Val Leu Ala Val Gly Pro Ala Tyr Ser Ala His 175 180 185 190 tgc att gga att act gac agg gat ttc att gag ggg gtg cat gga gga 1527 Cys Ile Gly Ile Thr Asp Arg Asp Phe Ile Glu Gly Val His Gly Gly 195 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Lys Glu Gly Ser Ser Ile Gly Lys Leu Phe Thr Gln Thr Met 580 585 590 Lys Gly Val Glu Arg Leu Ala Val Met Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe 595 600 605 Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr Ser Val Gly Lys Gly Ile His Thr 610 615 620 Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly Leu Phe Gly Gly Leu Asn Trp Ile 625 630 635 640 Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val Leu Ile Trp Val Gly Ile Asn Thr 645 650 655 Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser Met Ile Leu Val Gly Val Ile Met 660 665 670 Met Phe Leu Ser Leu Gly Val Gly Ala 675 680 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <221> misc_feature <222> 1-35 <223> POW 454 <400> 25 aaaagaaaaa gcgctaccac catccaccgg gacag 35 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <221> misc_feature <222> 1-41 <223> CPOW 2417 <400> 26 actgttaccc tcaaccccgt actcgccggc gaaaaagaaa a 41 <210> 27 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <223> Modified JE Signal <400> 27 Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala 1 5 10 15 Val Val Ile Ala Gly Thr Ser Ala 20 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <221> misc_feature <222> 1-36 <223> YF 482 <400> 28 aaaagaaaaa gcgctgtgac cttggtgcgg aaaaac 36 <210> 29 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <221> misc_feature <222> 1-41 <223> CYF 2433 <400> 29 acagagatcc tcaaccccgc actcgccggc gaaaaagaaa a 41 <210> 30 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <221> misc_feature <222> 1-41 <223> SLE 463 <400> 30 aaaagaaaaa gcgctttgca gttatcaacc tatcagggga a 41 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <221> misc_feature <222> 1-40 <223> CSLE 2477 <400> 31 accgttggtc gcacgttcgg actcgccggc gaaaaagaaa 40 <210> 32 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 32 Leu Asp Thr Ile Asn Arg Arg Pro Ser Lys Lys Arg Gly Gly Thr Arg 1 5 10 15 Ser Leu Leu Gly Leu Ala Ala Leu Ile Gly Leu Ala Ser Ser Leu Gln 20 25 30 Leu Leu Ser Thr Tyr Gln Gly 35 <210> 33 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 33 Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Met 1 5 10 15 Lys Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys 20 <210> 34 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 34 Met Asn Glu Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala Val Val Ile 1 5 10 15 Ala Cys Ala Gly Ala Met Lys Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys 20 25 30 <210> 35 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 35 Met Gly Arg Lys Gln Asn Lys Arg Gly Gly Asn Glu Gly Ser Ile Met 1 5 10 15 Trp Leu Ala Ser Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Met Lys 20 25 30 Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys 35 <210> 36 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 36 Met Ser Lys Lys Arg Gly Gly Ser Glu Thr Ser Val Leu Met Val Ile 1 5 10 15 Phe Met Leu Ile Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lys Leu Ser Asn Phe Gln 20 25 30 Gly Lys <210> 37 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 37 Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala 1 5 10 15 Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Val Thr Leu Ser Asn Phe Gln Gly 20 25 30 Lys <210> 38 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 38 Met Asn Val Leu Arg Gly Phe Arg Lys Glu Ile Gly Arg Met Leu Asn 1 5 10 15 Ile Leu Asn Arg Arg Arg Arg Thr Ala Gly Met Ile Ile Met Leu Ile 20 25 30 Pro Thr Val Met Ala Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu 35 40 45 <210> 39 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 39 Met Val Gly Leu Gln Lys Arg Gly Lys Arg Arg Ser Ala Thr Asp Trp 1 5 10 15 Met Ser Trp Leu Leu Val Ile Thr Leu Leu Gly Met Thr Leu Ala Ala 20 25 30 Thr Val Arg Lys Glu Arg Gly Asp 35 40 <210> 40 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 40 Met Gly Trp Leu Leu Val Val Val Leu Leu Gly Val Thr Leu Ala Ala 1 5 10 15 Thr Val Arg Lys Glu Arg Gly Asp 20 <210> 41 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 41 Met Ser Trp Leu Leu Val Ile Thr Leu Leu Gly Met Thr Ile Ala Ala 1 5 10 15 Thr Val Arg Lys Glu Arg Gly Asp 20 <210> 42 <211> 5292 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <221> CDS <222> (910)...(2964) <400> 42 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 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aat gag cca gaa gac ata gac tgt tgg tgc aac tct 1191 Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Asn Ser 80 85 90 acg tcc acg tgg gta act tat ggg acg tgt acc acc atg gga gaa cat 1239 Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys Thr Thr Met Gly Glu His 95 100 105 110 aga aga gaa aaa aga tca gtg gca ctc gtt cca cat gtg gga atg gga 1287 Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val Pro His Val Gly Met Gly 115 120 125 ctg gag aca cga act gaa aca tgg atg tca tca gaa ggg gcc tgg aaa 1335 Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys 130 135 140 cat gtc cag aga att gaa act tgg atc ttg aga cat cca ggc ttc acc 1383 His Val Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu Arg His Pro Gly Phe Thr 145 150 155 atg atg gca gca atc ctg gca tac acc ata gga acg aca cat ttc caa 1431 Met Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile Gly Thr Thr His Phe Gln 160 165 170 aga gcc ctg att ttc atc tta ctg aca gct gtc act cct tca atg aca 1479 Arg Ala Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala Val Thr Pro Ser Met Thr 175 180 185 190 atg cgt tgc ata gga atg tca aat aga gac ttt gtg gaa ggg gtt tca 1527 Met Arg Cys Ile Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser 195 200 205 gga gga agc tgg gtt gac ata gtc tta gaa cat gga agc tgt gtg acg 1575 Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 210 215 220 acg atg gca aaa aac aaa cca aca ttg gat ttt gaa ctg ata aaa aca 1623 Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr 225 230 235 gaa gcc aaa cag cct gcc acc cta agg aag tac tgt ata gag gca aag 1671 Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys 240 245 250 cta acc aac aca aca aca gaa tct cgc tgc cca aca caa ggg gaa ccc 1719 Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro 255 260 265 270 agc cta aat gaa gag cag gac aaa agg ttc gtc tgc aaa cac tcc atg 1767 Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met 275 280 285 gta gac aga gga tgg gga aat gga tgt gga cta ttt gga aag gga ggc 1815 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly 290 295 300 att gtg acc tgt gct atg ttc aga tgc aaa aag aac atg gaa gga aaa 1863 Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Arg Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys 305 310 315 gtt gtg caa cca gaa aac ttg gaa tac acc att gtg ata aca cct cac 1911 Val Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His 320 325 330 tca ggg gaa gag cat gca gtc gga aat gac aca gga aaa cat ggc aag 1959 Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys 335 340 345 350 gaa atc aaa ata aca cca cag agt tcc atc aca gaa gca gaa ttg aca 2007 Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr 355 360 365 ggt tat ggc act gtc aca atg gag tgc tct cca aga acg ggc ctc gac 2055 Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 370 375 380 ttc aat gag atg gtg ttg ttg cag atg gaa aat aaa gct tgg ctg gtg 2103 Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val 385 390 395 cac agg caa tgg ttc cta gac ctg ccg tta cca tgg ttg ccc gga gcg 2151 His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala 400 405 410 gac aca caa ggg tca aat tgg ata cag aaa gag aca ttg gtc act ttc 2199 Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe 415 420 425 430 aaa aat ccc cat gcg aag aaa cag gat gtt gtt gtt tta gga tcc caa 2247 Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln 435 440 445 gaa ggg gcc atg cac aca gca ctt aca ggg gcc aca gaa atc caa atg 2295 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met 450 455 460 tca tca gga aac tta ctc ttc aca gga cat ctc aag tgc agg ctg aga 2343 Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg 465 470 475 atg gac aag cta cag ctc aaa gga atg tca tac tct atg tgc aca gga 2391 Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly 480 485 490 aag ttt aaa gtt gtg aag gaa ata gca gaa aca caa cat gga aca ata 2439 Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile 495 500 505 510 gtt atc aga gtg caa tat gaa ggg gac ggc tct cca tgc aag atc cct 2487 Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro 515 520 525 ttt gag ata atg gat ttg gaa aaa aga cat gtc tta ggt cgc ctg att 2535 Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile 530 535 540 aca gtc aac cca att gtg aca gaa aaa gat agc cca gtc aac ata gaa 2583 Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu 545 550 555 gca gaa cct cca ttc gga gac agc tac atc atc ata gga gta gag ccg 2631 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro 560 565 570 gga caa ctg aag ctc aac tgg ttt aag aaa gga agt tct atc ggc caa 2679 Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln 575 580 585 590 atg ttt gag aca aca atg agg ggg gcg aag aga atg gcc att tta ggt 2727 Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly 595 600 605 gac aca gcc tgg gat ttt gga tcc ttg gga gga gtg ttt aca tct ata 2775 Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly Val Phe Thr Ser Ile 610 615 620 gga aag gct ctc cac caa gtc ttt gga gca atc tat gga gct 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cac aca gca ctt aca ggg gcc aca gaa atc caa atg 2295 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met 450 455 460 tca tca gga aac tta ctc ttc aca gga cat ctc aag tgc agg ctg aga 2343 Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg 465 470 475 atg gac aag cta cag ctc aaa gga atg tca tac tct atg tgc aca gga 2391 Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly 480 485 490 aag ttt aaa gtt gtg aag gaa ata gca gaa aca caa cat gga aca ata 2439 Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile 495 500 505 510 gtt atc aga gtg caa tat gaa ggg gac ggc tct cca tgc aag atc cct 2487 Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro 515 520 525 ttt gag ata atg gat ttg gaa aaa aga cat gtc tta ggt cgc ctg att 2535 Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile 530 535 540 aca gtc aac cca att gtg aca gaa aaa gat agc cca gtc aac ata gaa 2583 Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu 545 550 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Ala Phe Leu 655 660 665 670 gcc aca ggg ggt gtg ctc gtg ttc tta gcg acc aat gtg cat gct 2964 Ala Thr Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala 675 680 685 taattagttt gggcggccgc tcgagcatgc atctagaggg ccctattcta tagtgtcacc 3024 taaatgctag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg 3084 tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct 3144 aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg 3204 gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg 3264 cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg cattaatgaa tcggccaacg 3324 cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 3384 gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 3444 atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 3504 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 3564 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 3624 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 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caactttatc 4524 cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 4584 tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 4644 tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 4704 gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 4764 agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 4824 aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 4884 gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac 4944 tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 5004 gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 5064 tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 5124 aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 5184 catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 5244 acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtc 5293 <210> 45 <211> 685 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 45 Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala 1 5 10 15 Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly 20 25 30 Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu 35 40 45 Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp 50 55 60 Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr Ile Thr Tyr Lys Cys Pro Leu Leu 65 70 75 80 Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys Thr Thr Met Gly Glu His Arg Arg 100 105 110 Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu 115 120 125 Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Val 130 135 140 Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu Arg His Pro Gly Phe Thr Met Met 145 150 155 160 Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile Gly Thr Thr His Phe Gln Arg Ala 165 170 175 Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala Val Thr Pro Ser Met Thr Met Arg 180 185 190 Cys Ile Gly Met Ser Asn 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420 attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc 900 gccgccgcc atg ggc aag agg tcc gcc ggc tca atc atg tgg ctc gcg agc 951 Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser 1 5 10 ttg gca gtt gtc ata gct tgt gca ggc gcc ttc cat tta acc aca cgt 999 Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Phe His Leu Thr Thr Arg 15 20 25 30 aac gga gaa cca cac atg atc gtc agc aga caa gag aaa ggg aaa agt 1047 Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg Gln Glu Lys Gly Lys Ser 35 40 45 ctt ctg ttt aaa 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gca gca atc ctg gca tac acc ata gga acg aca cat ttc caa 1431 Met Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile Gly Thr Thr His Phe Gln 160 165 170 aga gcc ctg att ttc atc tta ctg aca gct gtc act cct tca atg aca 1479 Arg Ala Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala Val Thr Pro Ser Met Thr 175 180 185 190 atg cgt tgc ata gga atg tca aat aga gac ttt gtg gaa ggg gtt tca 1527 Met Arg Cys Ile Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser 195 200 205 gga gga agc tgg gtt gac ata gtc tta gaa cat ggg agc tgt gtg acg 1575 Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 210 215 220 acg atg gca aaa aac aaa cca aca ttg gat ttt gaa ctg ata aaa aca 1623 Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr 225 230 235 gaa gcc aaa cag cct gcc acc cta agg aag tac tgt ata gag gca aag 1671 Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys 240 245 250 cta acc aac aca aca aca gaa tct cgc tgc cca aca caa ggg gaa ccc 1719 Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro 255 260 265 270 agc cta aat gaa gag cag gac aaa agg ttc gtc tgc aaa cac tcc atg 1767 Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met 275 280 285 gta gac aga gga tgg gga aat gga tgt gga cta ttt gga aag gga ggc 1815 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly 290 295 300 att gtg acc tgt gct atg ttc aga tgc aaa aag aac atg gaa gga aaa 1863 Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Arg Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys 305 310 315 gtt gtg caa cca gaa aac ttg gaa tac acc att gtg ata aca cct cac 1911 Val Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His 320 325 330 tca ggg gaa gag cat gca gtc gga aat gac aca gga aaa cat ggc aag 1959 Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys 335 340 345 350 gaa atc aaa ata aca cca cag agt tcc atc aca gaa gca gaa ttg aca 2007 Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr 355 360 365 ggt tat ggc act gtc aca atg gag tgc tct cca aga acg ggc ctc gac 2055 Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 370 375 380 ttc aat gag atg gtg ttg ttg cag atg gaa aat aaa gct tgg ctg gtg 2103 Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val 385 390 395 cac agg caa tgg ttc cta gac ctg ccg tta cca tgg ttg ccc gga gcg 2151 His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala 400 405 410 gac aca caa ggg tca aat tgg ata cag aaa gag aca ttg gtc act ttc 2199 Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe 415 420 425 430 aaa aat ccc cat gcg aag aaa cag gat gtt gtt gtt tta gga tcc caa 2247 Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln 435 440 445 gaa ggg gcc atg cac aca gca ctt aca ggg gcc aca gaa atc caa atg 2295 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met 450 455 460 tca tca gga aac tta ctc ttc aca gga cat ctc aag tgc agg ctg aga 2343 Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg 465 470 475 atg gac aag cta cag ctc aaa gga atg tca tac tct atg tgc aca gga 2391 Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly 480 485 490 aag ttt aaa gtt gtg aag gaa ata gca gaa aca caa cat gga aca ata 2439 Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile 495 500 505 510 gtt atc aga gtg caa tat gaa ggg gac ggc tct cca tgc aag atc cct 2487 Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro 515 520 525 ttt gag ata atg gat ttg gaa aaa aga cat gtc tta ggt cgc ctg att 2535 Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile 530 535 540 aca gtc aac cca att gtg aca gaa aaa gat agc cca gtc aac ata gaa 2583 Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu 545 550 555 gca gaa cct cca ttc gga gac agc tac atc atc ata gga gta gag ccg 2631 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro 560 565 570 gga caa ctg aag ctc aac tgg ttt aag aaa gga agc acg ctg ggc aag 2679 Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Thr Leu Gly Lys 575 580 585 590 gcc ttt tca aca act ttg aag gga gct caa aga ctg gca gcg ttg ggc 2727 Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly 595 600 605 gac aca gcc tgg gac ttt ggc tct att gga ggg gtc ttc aac tcc ata 2775 Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile 610 615 620 gga aaa gcc gtt cac caa gtg ttt ggt ggt gcc ttc aga aca ctc ttt 2823 Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe 625 630 635 ggg gga atg tct tgg atc aca caa ggg cta atg ggt gcc cta ctg ctc 2871 Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu 640 645 650 tgg atg ggc gtc aac gca cga gac cga tca att gct ttg gcc ttc tta 2919 Trp Met Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu 655 660 665 670 gcc aca ggg ggt gtg ctc gtg ttc tta gcg acc aat gtg cat gct 2964 Ala Thr Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala 675 680 685 taattagttt gagcggccgc tcgagcatgc atctagaggg ccctattcta tagtgtcacc 3024 taaatgctag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg 3084 tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct 3144 aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg 3204 gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg 3264 cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg cattaatgaa tcggccaacg 3324 cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 3384 gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 3444 atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 3504 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 3564 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 3624 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 3684 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg 3744 taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 3804 cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 3864 acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 3924 aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt 3984 atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 4044 atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 4104 gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 4164 gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 4224 ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 4284 ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt 4344 tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 4404 accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt 4464 atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 4524 cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 4584 tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 4644 tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 4704 gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 4764 agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 4824 aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 4884 gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac 4944 tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 5004 gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 5064 tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 5124 aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 5184 catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 5244 acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtc 5293 <210> 47 <211> 685 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 47 Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala 1 5 10 15 Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly 20 25 30 Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu 35 40 45 Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp 50 55 60 Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr Ile Thr Tyr Lys Cys Pro Leu Leu 65 70 75 80 Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys Thr Thr Met Gly Glu His Arg Arg 100 105 110 Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu 115 120 125 Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Val 130 135 140 Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu Arg His Pro Gly Phe Thr Met Met 145 150 155 160 Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile Gly Thr Thr His Phe Gln Arg Ala 165 170 175 Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala Val Thr Pro Ser Met Thr Met Arg 180 185 190 Cys Ile Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser Gly Gly 195 200 205 Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr Thr Met 210 215 220 Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr Glu Ala 225 230 235 240 Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys Leu Thr 245 250 255 Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro Ser Leu 260 265 270 Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Val Cys Lys His Ser Met Val Asp 275 280 285 Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly Ile Val 290 295 300 Thr Cys Ala Met Phe Arg Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys Val Val 305 310 315 320 Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His Ser Gly 325 330 335 Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys Glu Ile 340 345 350 Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr Gly Tyr 355 360 365 Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn 370 375 380 Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val His Arg 385 390 395 400 Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala Asp Thr 405 410 415 Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe Lys Asn 420 425 430 Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly 435 440 445 Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met Ser Ser 450 455 460 Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg Met Asp 465 470 475 480 Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe 485 490 495 Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile 500 505 510 Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu 515 520 525 Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val 530 535 540 Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu 545 550 555 560 Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln 565 570 575 Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe 580 585 590 Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr 595 600 605 Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys 610 615 620 Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly 625 630 635 640 Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met 645 650 655 Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr 660 665 670 Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala 675 680 685 <210> 48 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 48 tgtgcaggcg ccttccattt aaccacacgt aacg 34 <210> 49 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 49 tcgagcggcc gctcaactaa ttaggcctgc accatgactc 40 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 50 cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg 30 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 51 atagattgct ccaaacactt ggtgg 25 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 52 actccatagg aaaagccgtt cacc 24 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 53 gcgagctcta gcatttaggt gacactatag 30 <210> 54 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 54 ctccaccaag tgtttggtgg tgccttcaga aca 33 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 55 Leu His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr 1 5 10 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 56 cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg 30 <210> 57 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 57 gaattcgtct cacttccttt cttaaaccag ttgagcttc 39 <210> 58 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 58 ggaattcgtc tcggaagcac gctgggcaag g 31 <210> 59 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 59 gcgagctcta gcatttaggt gacactatag 30 <210> 60 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 60 aactggttta agaaaggaag cacgctgggc gcc 33 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence; note = synthetic construct <400> 61 Asn Trp Lys Lys Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala 1 5 10

Claims (43)

  1. 제1 플라비바이러스의 구조 단백질의 신호 서열 및 제2 플라비바이러스의 면역원성 플라비바이러스 항원을 코딩하는 전사 단위를 포함하고, 상기 전사 단위는 상기 항원의 합성을 지시하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 신호 서열은 일본 뇌염 바이러스 신호 서열임을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 플라비바이러스 항원은 황열 바이러스, 뎅기 혈청형 1 바이러스, 뎅기 혈청형 2 바이러스, 뎅기 혈청형 3 바이러스, 뎅기 혈청형 4 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 포와산 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 플라비바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  4. 제1항에 있어서, 상기 전사 단위는 일본 뇌염 바이러스의 신호서열 및 웨스트나일 바이러스의 M 단백질 및 E 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  5. 제1항에 있어서, 상기 전사 단위는 일본 뇌염 바이러스의 신호서열 및 황열 바이러스의 M 단백질 및 E 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  6. 제1항에 있어서, 상기 전사 단위는 일본 뇌염 바이러스의 신호서열 및 세인트 루이스 뇌염 바이러스의 M 단백질 및 E 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  7. 제1항에 있어서, 상기 전사 단위는 일본 뇌염 바이러스의 신호서열 및 포와산 바이러스의 M 단백질 및 E 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항원은 플라비바이러스의 M 단백질, 플라비바이러스의 E 단백질, 플라비바이러스의 M 단백질 및 E 단백질 둘다, 플라비바이러스의 M 단백질의 일부분, 플라비바이러스의 E 단백질의 일부분 및 플라비바이러스의 M 단백질의 일부분 및 플라비바이러스의 E 단백질의 일부분 둘다 또는 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항원은 플라비바이러스의 M 단백질 및 E 단백질 둘다인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  10. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 DNA인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  11. 제10항에 있어서, 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 21 및 서열번호 23으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  12. 제1항에 있어서, 상기 전사 단위는 항원의 합성을 작동가능하게 조절할 수 있도록 적절하게 배치된 조절서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조절서열은 사이토메갈로바이러스 바로 초기(immediate early) 프로모터인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  14. 제1항에 있어서, 상기 TU에 의하여 코딩되는 항원을 포함하는 폴리펩티드의 번역 개시 부위에 위치하는 코자크(Kozak) 콘센서스 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  15. 제1항에 있어서, 상기 전사단위는 폴리-A 터미네이터를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  16. 제1항의 핵산을 포함하는 세포.
  17. 제1항의 핵산 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  18. 효과적인 양의 제17항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 플라비바이러스에 의한 감염에 대항하여 개체를 면역화하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 플라비바이러스 항원은 황열 바이러스, 뎅기 혈청형 1 바이러스, 뎅기 혈청형 2 바이러스, 뎅기 혈청형 3 바이러스, 뎅기 혈청형 4 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 포와산 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 플라비바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 항원은 플라비바이러스의 M 단백질, 플라비바이러스의 E 단백질, 플라비바이러스의 M 단백질 및 E 단백질 둘다, 플라비바이러스의 M 단백질의 일부분, 플라비바이러스의 E 단백질의 일부분 및 플라비바이러스의 M 단백질의 일부분 및 플라비바이러스의 E 단백질의 일부분 둘다 또는 그들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항원은 플라비바이러스의 M 단백질 및 E 단백질 둘다이고, 상기 개체의 체내의 세포는 상기 핵산이 세포 내에 삽입된 후에, 상기 M 단백질 및 상기 E 단백질을 포함하는 서브바이러스 입자를 분비하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제18항에 있어서, 상기 전사 단위는 일본 뇌염 바이러스의 신호서열, 및 웨스트나일 바이러스의 M 단백질 및 E 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제18항에 있어서, 상기 전사 단위는 일본 뇌염 바이러스의 신호서열 및 황열 바이러스의 M 단백질 및 E 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제18항에 있어서, 상기 전사 단위는 일본 뇌염 바이러스의 신호서열, 및 세인트 루이스 뇌염 바이러스의 M 단백질 및 E 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제18항에 있어서, 상기 전사 단위는 일본 뇌염 바이러스의 신호서열, 및 포와산 바이러스의 M 단백질 및 E 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제18항에 있어서, 상기 조성물을 개체에 단일 용량으로 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제18항에 있어서, 상기 조성물은 비경구 경로를 통하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제1항에 있어서, 상기 항원은 세인트 루이스 뇌염 바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  29. 제18항에 있어서, 상기 항원은 세인트 루이스 뇌염 바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 항원은 일본 뇌염 바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  31. 제18항에 있어서, 상기 항원은 일본 뇌염 바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제1항에 있어서, 상기 항원은 황열 바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  33. 제18항에 있어서, 상기 항원은 황열 바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제1항에 있어서, 상기 항원은 뎅기 바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  35. 제18항에 있어서, 상기 항원은 뎅기 바이러스 바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제1항에 있어서, 상기 항원은 웨스트 나일 바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
  37. 제18항에 있어서, 상기 항원은 웨스트 나일 바이러스 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제1항의 핵산으로부터 생산된 항원.
  39. (a) 항원/항체 복합체가 형성될 수 있는 조건하에서 시료를 제38항의 항원과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 항원/항체 복합체 형성을 검출하여, 상기 시료 중의 플라비바이러스 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 시료 중의 플라비바이러스 항체를 검출하는 방법.
  40. 제38항의 항원에 의한 면역화에 반응하여 생산된 항체.
  41. (a) 항원/항체 복합체가 형성될 수 있는 조건하에서 시료를 제40항의 항체와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 항원/항체 복합체 형성을 검출하여, 시료 중의 플라비바이러스 항원을 검출하는 단계를 포함하는, 시료 중의 플라비바이러스 항원을 검출하는 방법.
  42. (a) 항원/항체 복합체가 형성될 수 있는 조건하에서 개체로부터 얻은 시료를 제38항의 항원과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 항원/항체 복합체 형성을 검출하여, 개체의 플라비바이러스 감염을 진단하는 단계를 포함하는, 개체의 플라비바이러스 감염을 진단하는 방법.
  43. (a) 항원/항체 복합체가 형성될 수 있는 조건하에서 개체로부터 얻은 시료를 제40항의 항체와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 항원/항체 복합체 형성을 검출하여, 개체의 플라비바이러스 감염을 진단하는 단계를 포함하는, 개체의 플라비바이러스 감염을 진단하는 방법.
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