CN112646838A

CN112646838A - 一种hspa13基因表达载体及其构建方法和应用

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Publication number: CN112646838A
Application number: CN202110011566.4A
Authority: CN
Inventors: 邢陈; 宋伦; 王仁喜; 侯春梅; 黄欣; 李葛; 吴霖; 争鸣
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2021-01-06
Filing date: 2021-01-06
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2041-01-06
Also published as: CN112646838B

Abstract

本发明公开了一种HSPA13基因表达载体及其构建方法和应用。本发明公开的HSPA13基因表达载体为在出发表达载体中插入HSPA13基因得到的能表达HSPA13蛋白质的重组载体。本发明发现，HSPA13蛋白质以及HSPA13过表达载体能同时在转录水平和蛋白水平促进IL‑10的表达，可广泛用于构建获得特异性HSPA13表达的工程细胞株，并用于表达目的蛋白，以及IL‑10；HSPA13蛋白质也可作为一种重要的促进IL‑10表达来发挥抗炎和免疫抑制功能的保护因子，也可作为相应疾病状态下的药物干预靶点分子，在未来临床应用中具有重要应用价值和前景。

Description

一种HSPA13基因表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种HSPA13基因表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一类高度保守，但在机体细胞应激状态下可以被大量诱导表达的因子。作为应对机体受损、高温、受寒、紫外线暴露、组织修复等各种应激伤害而大量产生的功能因子，HSP与提升细胞对损伤的耐受和应激能力有关。HSP根据分子量大小分为4个家族，包括HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族及小分子量HSP家族。其中，HSP70家族被认为是最重要的一类热休克蛋白，普遍存在于动植物和微生物中。HSP70家族中，由于HSP70分布的广泛性和多功能性让其成为目前研究最为深入的应激蛋白质之一。HSP70的主要功能体现在耐受细胞免疫、先天免疫反应、抗氧化、抗细胞凋亡和作为分子伴侣参与蛋白质的折叠修饰调控过程。

HSPA13，也被称为STCH(Stress-70 protein chaperone microsoxne-associated60kDa protein)，是1994年由A.O.Gregory等人发现并克隆的HSP70家族的成员。但是，自发现至今人们对HSPA13的研究和认识仍然非常有限。在蛋白结构上，HSPA13具有一段HSP70家族同源的ATPase结构。但是HSPA13结构在C端缺少底物结合结构域，而N端具有一段疏水的结构，推测可能介导HSPA13在细胞中的定位。而且，在HSPA13分子内部具有三段物种间保守的序列，以及一段在高等脊椎动物中特有而低等生物没有的序列结构。在生物学功能方面，利用HSPA13过表达的转基因小鼠模型研究发现HSPA13可以显著减少朊病毒蛋白的潜伏期，提示HSPA13与蛋白质折叠异常疾病有一定关系。通过单核苷酸多态性(SNP)分析，发现HSPA13基因与胃癌的发生有一定联系，并从胃癌样本中发现导致HSPA13蛋白223-226位氨基酸缺失的HSPA13基因突变。而且，细胞中过表达实验显示HSPA13突变体降低了该蛋白对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)引起的细胞凋亡的敏感度。但总的来说，目前对HSPA13研究较少而缺乏系统和深入的认识。

其它HSP70家族成员被认为是重要的免疫调节因子，可通过与免疫细胞如树突状细胞(DCs)、骨髓源的抑制性细胞(MDSCs)和单核细胞作用，促进抗炎因子产生，从而在免疫调节中发挥重要作用。作为HSP70家族中的一员，HSPA13是否也在免疫反应或免疫功能调节中发挥作用也是值得和需要重点关注的方面。综上所述，由于HSPA13在物种间高度保守，在各种细胞内广泛表达，进一步探究HSPA13生物学功能十分必要。因此，获得可用于细胞内过表达且易筛选的HSPA13载体，可用于后续研究HSPA13在各种类型细胞中的表达及包括免疫功能调节等在内的生物学功能研究。

IL-10是一种多功能的细胞因子，参与调节细胞的生长与分化，尤其是对炎性反应和免疫反应发挥重要的免疫调节功能。IL-10具有很强的抗炎作用，既可抑制促炎因子的合成及活性，又可与抗炎因子协同发挥作用。目前，IL-10是公认的一种炎症与免疫抑制因子，与肿瘤、炎症疾病、自身免疫病、感染、器官移植排斥等多种疾病的发生发展密切相关，靶向IL-10的干预和治疗具有广阔的临床应用价值。但是，尽管IL-10启动子序列已为人所知，关于其在转录水平的调控因子尚知之较少。弄清IL-10的转录调控因子，将有助于通过调控IL-10表达来治疗疾病，为免疫干预策略提供新方法和药物靶点。

目前，有以IL-10作为治疗疾病或作为药物的应用。例如，利用表达载体获得的人重组IL-10蛋白(Tenovil)用于治疗克罗恩病和急性胰腺炎已进行至2期临床实验。Pegilodecakin(AM0010)是将聚乙二醇(PEG)与重组IL-10相连后形成的特殊IL-10。由于PEG与IL-10结合增加了其体积，起到防止或延缓IL-10分解的作用，从而延长IL-10在体内循环的时间。Pegilodecakin单独给药、联合PD-1抗体或联合化疗在肺癌、胰腺癌、肾癌等多种实体瘤治疗中证实有一定疗效。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何促进哺乳动物细胞中IL-10的表达或如何制备IL-10。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述N1或N2的方法：

N1、一种制备IL-10的方法，所述方法包括：将HSPA13基因表达载体导入哺乳动物细胞中，得到重组细胞，培养所述重组细胞，得到IL-10；所述HSPA13基因表达载体为在出发表达载体中插入HSPA13基因得到的能表达HSPA13蛋白质的重组载体；

N2、一种高表达IL-10哺乳动物细胞的制备方法，包括：将所述HSPA13基因表达载体导入哺乳动物细胞中，得到与所述哺乳动物细胞相比IL-10表达量增加的重组细胞(即高表达IL-10哺乳动物细胞)。

上述方法中，所述HSPA13蛋白质可为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；

A2)将序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

所述HSPA13基因可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)编码序列是序列表中SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述HSPA13蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述HSPA13蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

上述A2)中的蛋白质，为与SEQ ID No.2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，SEQ ID No.1所示的DNA分子编码SEQID No.2所示的蛋白质。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码HSPA13蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的HSPA13蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码HSPA13蛋白质且具有HSPA13蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述方法中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

所述HSPA13基因表达载体含有编码HSPA13蛋白质的核酸分子的表达盒(HSPA13基因表达盒)。所述HSPA13基因表达盒，是指能够在宿主细胞中表达HSPA13蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动HSPA13基因转录的启动子，还可包括终止HSPA13基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述HSPA13基因表达盒的重组载体。

上述方法中，所述出发表达载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

具体的，所述出发表达载体的序列可如序列表中SEQ ID No.4所示。

在本发明的一个实施例中，所述B3)所述重组载体为HSPA13-pEGFP-N1，所述HSPA13-pEGFP-N1为将SEQ ID No.4所示的pEGFP-N1载体中的XholⅠ和Hind III识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.1所示的HSPA13基因得到的重组载体。所述HSPA13-pEGFP-N1能表达绿色荧光蛋白(EGFP)与HSPA13蛋白质所形成的融合蛋白。

上述方法中，所述出发表达载体的序列可如序列表中SEQ ID No.4所示。

上述N1中，IL-10可从所述重组细胞的培养产物中利用常规的蛋白质的分离方法分离得到，如疏水作用层析、离子交换层析等、凝胶过滤层析等。

本发明还提供了所述HSPA13基因表达载体在制备增强哺乳动物细胞中IL-10表达产品中的应用。

本发明还提供了所述HSPA13蛋白质或所述HSPA13基因在制备增强哺乳动物细胞中IL-10表达产品中的应用。

为了使HSPA13蛋白质便于纯化，可在由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

在本发明的一个实施例中，HSPA13蛋白质带有绿色荧光蛋白(GFP)标签。

上文中，所述增强哺乳动物细胞中IL-10表达可为提高所述哺乳动物细胞中IL-10在RNA或蛋白质水平上的表达量。

上文中，所述哺乳动物细胞含有IL-10启动子及IL-10基因，且IL-10基因的表达由IL-10启动子驱动。

具体的，所述哺乳动物细胞可为人或鼠的细胞。具体的，所述哺乳动物细胞可为人胚胎肾细胞(如293T细胞)或中国仓鼠卵巢细胞(如CHO细胞)。

本发明还提供了所述HSPA13基因表达载体，或所述HSPA13蛋白质，或HSPA13基因的下述任一应用：

X1、生产IL-10；

X2、制备生产IL-10的产品。

本发明还提供了所述HSPA13蛋白质的下述任一应用：

Y1、作为转录因子；

Y2、作为IL-10基因转录因子；

Y3、增强IL-10启动子的转录活性；

Y4、制备增强IL-10启动子的转录活性产品。

利用所述高表达IL-10哺乳动物细胞的制备方法得到的高表达IL-10哺乳动物细胞，也属于本发明的保护范围。所述高表达IL-10哺乳动物细胞不包括繁殖材料。

本发明还提供了一种成套试剂，所述成套试剂包括P1与P2：

P1、所述HSPA13基因表达载体，或所述HSPA13蛋白质，或所述HSPA13基因；

P2、IL-10启动子。

所述成套试剂可由P1与P2组成，还可由P1、P2与所表达的目的蛋白的编码基因组成。所述目的蛋白的编码基因可为IL-10基因。

在本发明的一个实施例中，所述目的蛋白的编码基因为荧光素酶的编码基因。

所述成套试剂可用于表达目的蛋白(如IL-10)，还可用于制备表达目的蛋白(如IL-10)的产品。

所述成套试剂或所述高表达IL-10哺乳动物细胞的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：

X1、表达目的蛋白；

X2、制备表达目的蛋白的产品；

X3、生产IL-10；

X4、制备生产IL-10的产品。

本发明中，所述IL-10启动子的序列可如SEQ ID No.3的第39-1640位或SEQ IDNo.5或SEQ ID No.7所示。

本发明利用小鼠HSPA13基因的一种转录本序列构建了带绿色荧光蛋白(GFP)标签的HSPA13过表达载体，并将该载体成功应用于哺乳动物蛋白表达系统中国仓鼠卵巢细胞CHO和人胚胎肾细胞293T细胞中表达。将HSPA13过表达载体转染CHO细胞后能同时在转录水平和蛋白水平促进IL-10的表达；而且，将HSPA13过表达载体与含IL-10promoter的荧光素酶报告载体共转染，可以提高荧光素酶的表达。因此，HSPA13蛋白质以及所得HSPA13过表达载体可广泛用于构建获得特异性HSPA13表达的工程细胞株，并用于表达目的蛋白，以及IL-10；HSPA13蛋白质也可作为一种重要的促进IL-10表达来发挥抗炎和免疫抑制功能的保护因子，也可作为相应疾病状态下的药物干预靶点分子，在未来临床应用中具有重要应用价值和前景。

附图说明

图1为荧光显微镜下转染HSPA13-pEGFP-N1载体的细胞，图中绿色荧光细胞代表HSPA13过表达细胞。其中，图A为CHO细胞，图B为293T细胞。

图2为HSPA13-pEGFP-N1载体转染CHO细胞后，利用Real-Time PCR方法检测IL-10在mRNA水平上的表达情况。pEGFP-N1表示转染pEGFP-N1载体的细胞，Hspa13-pEGFP-N1表示转染HSPA13-pEGFP-N1的细胞。*表示显著性分析p值＜0.05。

图3为HSPA13-pEGFP-N1载体转染CHO细胞后，利用流式细胞方法在蛋白质水平检测CHO细胞中IL-10的表达情况。

A为检测结果，pEGFP-N1表示转染pEGFP-N1载体的细胞，Hspa13-pEGFP-N1表示转染HSPA13-pEGFP-N1的细胞；

B为统计分析结果，Control表示转染pEGFP-N1载体后表达Il-10的细胞比例，Hspa13表示转染HSPA13-pEGFP-N1载体后表达Il-10的细胞比例，*表示显著性分析p值＜0.05。

图4为pGL2B-1538/+64的图谱。

图5为共转染HSPA13-pEGFP-N1载体和IL-10promoter荧光素酶报告载体(pGL2B-1538/+64)后，利用荧光素酶报告基因检测系统试剂盒的测定结果。Medium表示阴性对照，pEGFP-N1表示转染pEGFP-N1载体的细胞，Hspa13-pEGFP-N1表示转染HSPA13-pEGFP-N1的细胞。**表示显著性分析p值＜0.01，***表示显著性分析p值＜0.001。

图6为将HSPA13-pEGFP-N1过表达载体转染293T细胞后，利用DAPI染色，在激光扫描共聚焦显微镜下观察HSPA13在细胞内的定位。与细胞核内DNA结合的DAPI在激光扫描共聚焦显微镜下观察呈现蓝色荧光，绿色荧光代表的是细胞内表达的HSPA13。结果表明HSPA13在293T细胞表达后，可聚集在细胞核周围和部分进入细胞核(A)，以及完全进入细胞核定位于细胞核(B)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

pEGFP-N1载体：其序列为NCBI中GenBank:U55762.1(up date:22-AUG-2003)，即SEQ ID No.4。

哺乳动物蛋白表达系统中国仓鼠卵巢细胞CHO(Chinese hamster ovary cell)：记载在“Ming Lv et al.,Novel anti-CD20 antibody TGLA with enhanced antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity mediates potent anti-lymphoma activity,Cancer Letters 294(2010)66–73”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。CHO细胞中IL-10启动子序列为序列表中SEQ ID No.5，IL-10基因序列为序列表中SEQ ID No.6。

哺乳动物蛋白表达系统人胚胎肾细胞293T细胞：记载在“Ning Ma et al.,BAFFSuppresses IL-15Expression in B Cells,The Journal of Immunology，publishedonline 26March 2014”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。293T细胞中IL-10启动子序列为序列表中SEQ ID No.7，IL-10基因序列为序列表中SEQ ID No.8。

实施例1、HSPA13可以作为转录因子促进IL-10的表达

本实施例发现来源于小鼠(Mus musculus)的HSPA13可以作为转录激活因子调控抗炎因子IL-10启动子转录活性，并可以提高IL-10的表达水平。HSPA13蛋白质其氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2，在小鼠中其CDS序列为SEQ ID No.1，将SEQ ID No.1所示的DNA片段记为HSPA13基因。

一、重组载体的制备

以小鼠脾淋巴细胞的cDNA为模板，利用HSPA13-F与HSPA13-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物(该PCR产物也可以通过合成SEQ ID No.1所示的HSPA13基因，并以其为模板利用HSPA13-F与HSPA13-R组成的引物对进行PCR扩增得到)；利用XholⅠ和Hind III对所得PCR产物进行酶切，得到酶切产物；将所得酶切产物与pEGFP-N1载体经XholⅠ和HindIII双酶切得到的载体骨架相连，将得到的序列正确的重组载体记为HSPA13-pEGFP-N1。

HSPA13-pEGFP-N1为将pEGFP-N1载体中的XholⅠ和Hind III识别序列间的DNA片段替换为序列表中SEQ ID No.1所示的HSPA13基因得到的重组载体，HSPA13-pEGFP-N1能表达绿色荧光蛋白(EGFP)与HSPA13所形成的融合蛋白。

引物序列如下：

HSPA13-F：5′-ccctcgagatggccggagagatgacga-3′，下划线处为XholⅠ的识别序列；

HSPA13-R：5′-ccaagctttcagttgaagttggttttct-3′，下划线处为Hind III的识别序列。

二、HSPA13在细胞系中的表达

1、在CHO细胞中的表达

利用Thermo Fisher Scientific商品化的Lipofectamine 2000试剂将HSPA13-pEGFP-N1载体转染入CHO细胞，得到重组细胞CHO/HSPA13-pEGFP-N1；利用Thermo FisherScientific商品化的Lipofectamine 2000试剂将pEGFP-N1载体转染入CHO细胞，得到重组细胞CHO/pEGFP-N1，作为空载体对照。

利用荧光显微镜观察蛋白质在CHO细胞中的表达情况，结果显示，CHO/pEGFP-N1与CHO/HSPA13-pEGFP-N1中有大量的绿色荧光信号，说明HSPA13在CHO细胞中成功表达，CHO/HSPA13-pEGFP-N1的结果如图1所示。

2、在293T细胞中的表达

利用Thermo Fisher Scientific商品化的Lipofectamine 2000试剂将HSPA13-pEGFP-N1载体转染入293T细胞，得到重组细胞293T/HSPA13-pEGFP-N1；利用Thermo FisherScientific商品化的Lipofectamine 2000试剂将pEGFP-N1载体转染入293T细胞，得到重组细胞293T/pEGFP-N1，作为空载体对照。

利用荧光显微镜观察蛋白质在293T细胞中表达情况，结果显示，293T/pEGFP-N1与293T/HSPA13-pEGFP-N1中有大量的绿色荧光信号，说明HSPA13在293T细胞中成功表达，293T/HSPA13-pEGFP-N1的结果如图1所示。

三、HSPA13可以提高抗炎因子IL-10的表达水平

在12孔板中利用Sigma-Aldrich商品化DMEM培养基培养CHO细胞，按照5×10⁵个/ml细胞密度接种细胞，每孔培养体系均为1ml，于37℃，5％CO₂细胞培养箱培养24h留待转染。用100μl Gibco商品化Opti-MEM培养基稀释步骤一所得HSPA13-pEGFP-N1载体2μg，用100μl Opti-MEM培养基稀释Thermo Fisher Scientific商品化的Lipofectamine 2000 4μl，室温孵育5min。将稀释的HSPA13-pEGFP-N1载体和Lipofectamine 2000混合，轻轻混匀，室温放置20min，得到混悬液。然后向每孔中均匀添加上述混悬液，每孔204μl，而后将12孔板于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养72h。设置三个重复。

而后收集细胞，分别利用Real-time PCR检测IL-10在mRNA水平上的表达情况，利用流式细胞术方法检测IL-10在蛋白质水平上的表达情况。Real-time PCR中利用GAPDH作为内参，所用引物如下：

IL-10引物：

IL-10-F：5′-ggttgccaagccttatcgga-3′；

IL-10-R：5′-acctgctccactgccttgct-3′。

GAPDH引物：

GAPDH-F：5′-ttgatggcaacaatctccac-3′；

GAPDH-R：5′-cgtcccgtagacaaaatggt-3′。

流式细胞术方法所用流式抗体为IL-10-PE(Biolegend公司)，利用IL-10-PE未染色的CHO细胞作为裸细胞对照。

按照上述方法，将HSPA13-pEGFP-N1替换为pEGFP-N1载体，其他步骤均不变，作为空载体对照。

IL-10在mRNA水平上表达的检测结果如图2所示，IL-10mRNA在转染HSPA13-pEGFP-N1的细胞中的相对表达量(2.86±0.38)显著高于转染pEGFP-N1载体的细胞(0.98±0.02)。

IL-10在蛋白质水平上表达的检测结果如图3所示，发现与转染pEGFP-N1载体的细胞相比，转染HSPA13-pEGFP-N1的细胞IL-10蛋白表达水平显著升高，具有表达IL-10的能力的CHO细胞比例(A)及其统计分析结果(B)呈现显著增加，后者为前者的约6.6倍(7.08％/1.08％)。

说明，HSPA13可以提高抗炎因子IL-10的表达水平。

四、HSPA13在作为转录因子中的应用

荧光素酶报告载体(pGL2B-1538/+64)，为Addgene公司产品，含有IL-10启动子，其图谱如图4所示，其序列为序列表中SEQ ID No.3，SEQ ID No.3的第39-1640位为IL-10启动子的序列。

在12孔板中利用Sigma-Aldrich商品化DMEM培养CHO细胞，按照5×10⁵个/ml细胞密度接种细胞，每孔培养体系均为1ml；用100μl Gibco商品化Opti-MEM培养基稀释步骤一所得HSPA13-pEGFP-N1载体1μg和荧光素酶报告载体(pGL2B-1538/+64)0.8μg，用100μlOpti-MEM培养基稀释Thermo Fisher Scientific商品化的Lipofectamine 2000 4μl，室温孵育5min。将上述稀释的载体和Lipofectamine 2000混合，轻轻混匀，室温放置20min，得到混悬液。然向每孔中均匀添加上述混悬液，每孔204μl，而后将12孔板于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养72h。设置三个重复。

而后收集细胞，利用Promega商品化荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光强度变化，检测HSPA13作为转录因子对IL-10启动子序列的结合和激活作用。

按照上述方法，将HSPA13-pEGFP-N1替换为pEGFP-N1载体，其他步骤均不变，作为空载体对照；利用培养基作为阴性对照。

结果如图5所示,代表荧光素酶活性的相对荧光强度倍数在阴性对照、转染pEGFP-N1载体的细胞、转染HSPA13-pEGFP-N1的细胞中分别为0.58±0.16、1.04±0.22、5.78±0.51，相对荧光强度在转染HSPA13-pEGFP-N1的细胞中均显著高于阴性对照和空载体对照。说明，HSPA13可以作为转录因子增强IL-10启动子的转录活性。

五、HSPA13的亚细胞定位

利用Thermo Fisher Scientific商品化的Lipofectamine 2000试剂将HSPA13-pEGFP-N1载体转染入293T细胞，得到重组细胞293T/HSPA13-pEGFP-N1。

利用DAPI对所得细胞进行细胞核染色，在激光共聚焦显微镜下观察HSPA13在细胞中的定位，结果显示，HSPA13蛋白定位在细胞核，如图6所示。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种HSPA13基因表达载体及其构建方法和应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1416

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 1

atggccggag agatgacgat cttaggttca gctgttttga ctctcctctt ggcgggctac 60

ttggcacaac agtatttacc attgcctacg ccaaaagtga ttggcattga cctgggtacc 120

acctactgtt cggttggtgt attttttccc gggacaggaa aagtgaaggt gattccagat 180

gaaaacgggc atatcagcat ccccagcatg gtgtccttca cggacggtga tgtgtatgtg 240

ggctatgaga gcctagagct ggctgattca aatcctcaaa acacaatcta tgatgccaaa 300

cggttcatcg ggaagatctt caccccggag gagctggagg ctgaagttgg cagataccca 360

tttaaggttt tacacagaaa tgggatggct gagttttctg tgacaagtaa tgaaaccatc 420

atcgtttctc cagagtttgt cggctctcga ttgctgctga agctaaagga gatggccgag 480

gaatacctcg gcatgccggt tgccaatgct gtcatttctg tgcctgcaga attcgaccta 540

caacagagaa attcaacaat ccaagctgcc aaccttgctg ggctgaagat cttgagggtg 600

ataaatgagc ctacagcagc agcgatggcc tatggtctcc acaaggttga cgtgttctac 660

gtgttggtca tagacttggg tggaggaact cttgatgtgt cgttactgaa taaacaagga 720

gggatgttcc taacacgagc gatgtctgga aacaacaaac ttggaggaca agacttcaat 780

cagaggctgc ttcagcattt atataaagag atctatcaaa cgtacggctt tctcccttcc 840

aggaaagagg aaatccacag attaagacag gcggtggaga tggtcaagct aaacttgaca 900

attcatcagt ctgcccaggt atcagtttta ctcactgtgg aggggaagga cagcaaggaa 960

cctcagaatg gtgactctga actgccaaaa gaccagctca ccccaggaga tggtcaccat 1020

gtgaatagag tgtttagacc tggcctttct gaaagcaaga gtggaaaaag tcaggttttg 1080

tttgagacag aagtatcccg caagctcttt gatgccctca atgaagatct ctttcagaaa 1140

atactcgtac ccattcagca agtattaaaa gaaggcctct tagacaagac ggaaattgac 1200

gaggtggttc tagttggggg ttctactcgt attcctcgga tccgccaagt tattcaggag 1260

ttctttggaa aggacccgaa tacatctgta gaccctgacc tggcagtggt gacaggagtg 1320

gccatccaag ctgggattga tggaggctcc tggcctctcc aagttagtgc tttggaaatt 1380

cccaataagc atttacagaa aaccaacttc aactga 1416

<210> 2

<211> 471

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 2

Met Ala Gly Glu Met Thr Ile Leu Gly Ser Ala Val Leu Thr Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ala Gly Tyr Leu Ala Gln Gln Tyr Leu Pro Leu Pro Thr Pro Lys

20 25 30

Val Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Cys Ser Val Gly Val Phe

35 40 45

Phe Pro Gly Thr Gly Lys Val Lys Val Ile Pro Asp Glu Asn Gly His

50 55 60

Ile Ser Ile Pro Ser Met Val Ser Phe Thr Asp Gly Asp Val Tyr Val

65 70 75 80

Gly Tyr Glu Ser Leu Glu Leu Ala Asp Ser Asn Pro Gln Asn Thr Ile

85 90 95

Tyr Asp Ala Lys Arg Phe Ile Gly Lys Ile Phe Thr Pro Glu Glu Leu

100 105 110

Glu Ala Glu Val Gly Arg Tyr Pro Phe Lys Val Leu His Arg Asn Gly

115 120 125

Met Ala Glu Phe Ser Val Thr Ser Asn Glu Thr Ile Ile Val Ser Pro

130 135 140

Glu Phe Val Gly Ser Arg Leu Leu Leu Lys Leu Lys Glu Met Ala Glu

145 150 155 160

Glu Tyr Leu Gly Met Pro Val Ala Asn Ala Val Ile Ser Val Pro Ala

165 170 175

Glu Phe Asp Leu Gln Gln Arg Asn Ser Thr Ile Gln Ala Ala Asn Leu

180 185 190

Ala Gly Leu Lys Ile Leu Arg Val Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala

195 200 205

Met Ala Tyr Gly Leu His Lys Val Asp Val Phe Tyr Val Leu Val Ile

210 215 220

Asp Leu Gly Gly Gly Thr Leu Asp Val Ser Leu Leu Asn Lys Gln Gly

225 230 235 240

Gly Met Phe Leu Thr Arg Ala Met Ser Gly Asn Asn Lys Leu Gly Gly

245 250 255

Gln Asp Phe Asn Gln Arg Leu Leu Gln His Leu Tyr Lys Glu Ile Tyr

260 265 270

Gln Thr Tyr Gly Phe Leu Pro Ser Arg Lys Glu Glu Ile His Arg Leu

275 280 285

Arg Gln Ala Val Glu Met Val Lys Leu Asn Leu Thr Ile His Gln Ser

290 295 300

Ala Gln Val Ser Val Leu Leu Thr Val Glu Gly Lys Asp Ser Lys Glu

305 310 315 320

Pro Gln Asn Gly Asp Ser Glu Leu Pro Lys Asp Gln Leu Thr Pro Gly

325 330 335

Asp Gly His His Val Asn Arg Val Phe Arg Pro Gly Leu Ser Glu Ser

340 345 350

Lys Ser Gly Lys Ser Gln Val Leu Phe Glu Thr Glu Val Ser Arg Lys

355 360 365

Leu Phe Asp Ala Leu Asn Glu Asp Leu Phe Gln Lys Ile Leu Val Pro

370 375 380

Ile Gln Gln Val Leu Lys Glu Gly Leu Leu Asp Lys Thr Glu Ile Asp

385 390 395 400

Glu Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Arg Ile Arg Gln

405 410 415

Val Ile Gln Glu Phe Phe Gly Lys Asp Pro Asn Thr Ser Val Asp Pro

420 425 430

Asp Leu Ala Val Val Thr Gly Val Ala Ile Gln Ala Gly Ile Asp Gly

435 440 445

Gly Ser Trp Pro Leu Gln Val Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asn Lys His

450 455 460

Leu Gln Lys Thr Asn Phe Asn

465 470

<210> 3

<211> 7199

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (595)..(595)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

cccgggaggt accgagctct tacgcgtgct agctcgagag ggtccatgct agctgcgtct 60

tgagcctctt ctggggttca gatctctgat ctacagcagt gtgtccacac ctaaaacatc 120

agctcagaga ggcagttgct tctgctgttg gaaacggaca tcccaaaaaa aaacaaaaaa 180

cagaaatcaa aagggaagga gaaagtgaaa gggatggagg cagcttgtcc ccttccctgt 240

gcttgctgct ggtagaaaac tcagcctgga actgaccgga gcagcagttc ttgagtcaat 300

tccattccaa cttctagaag gttcttttcc cgtcgaagag tgacaggagg agaggccaga 360

cccccttgat cctgatctgc cagccactgc atcagataag acgagataac cccgagttcc 420

tgttctacca gccctggtgt ggtaaccctc tccaatgggg caggcttgga accctgtgcc 480

aacgaagatc ctcccccgta ctgatgcagg aaggacagcc cgggagtgta ccctctacat 540

gggtctactt ttatttaagc aaacattccc tggtcaacag gacgtgtagc attgnccccc 600

cccccttggg tcacacagaa aacaggtacc aggaggacaa gtagttgctt gcccagggta 660

cagaatgaaa ggcaataggg gactctaggc gaatgttctt cccacccaaa ctgaggtagt 720

aggagaagtc cctactgaag ggaaggtcca gacataatca aaggactacc agagatctcc 780

caggtatctg tagaagtact aacatctcca tccttcaaca gctacaggtt acacgtctcc 840

aaggctggga cattgtaaaa cagggccatg gtaaggtcta cccgacagct cagagcaagc 900

ctcccagaag tctgagttcc ttctcctaac ttctcatgct gggatctgag cttcttcgtg 960

aaacacgggg cagaggaggc accagaactc tcctctgacc aactgcccca cagcacacat 1020

atcctcaaag gatagtcttg aatacgtgat ggaagaatta aagagagtga ggtctgaaga 1080

aaatcagccc tctcggggtt tcctttgggt aactgagtgc taaggtgact tccgagtcag 1140

caagaaatat cggacgttca acccaggttg agtggaggaa acaattattt ctcaatccta 1200

atatgttctg gaatagccca tttatccacg tcattatgac ctgggagtgc gtgaatggaa 1260

tccacagatg agggcctctg tacatagaac agctgtctgc ctcaggaaat acaactttta 1320

gtattgagag gctaaaaaga aaaaaaaatt aaaagagagg tagcccatac taaaaatagc 1380

tgtaatgcag aagttcattc cgaccagttc tttagcgctt acaatgcaaa aaaaagggaa 1440

aggaaaaaaa aaaagaaaga aattaaactc aaaaattgca tggtttagaa gagggaggag 1500

gagcctgaat aacaaaaacc tttgccagga aggccccact gagccttcag tataaaaggg 1560

ggaccaagaa caggaggtct acatttagag acttgctctt gcactaccaa agccacaagg 1620

cagccttgca gaaaagagag ctctatcaag cttggcattc cggtactgtt ggtaaaatgg 1680

aagacgccaa aaacataaag aaaggcccgg cgccattcta tcctctagag gatggaaccg 1740

ctggagagca actgcataag gctatgaaga gatacgccct ggttcctgga acaattgctt 1800

ttacagatgc acatatcgag gtgaacatca cgtacgcgga atacttcgaa atgtccgttc 1860

ggttggcaga agctatgaaa cgatatgggc tgaatacaaa tcacagaatc gtcgtatgca 1920

gtgaaaactc tcttcaattc tttatgccgg tgttgggcgc gttatttatc ggagttgcag 1980

ttgcgcccgc gaacgacatt tataatgaac gtgaattgct caacagtatg aacatttcgc 2040

agcctaccgt agtgtttgtt tccaaaaagg ggttgcaaaa aattttgaac gtgcaaaaaa 2100

aattaccaat aatccagaaa attattatca tggattctaa aacggattac cagggatttc 2160

agtcgatgta cacgttcgtc acatctcatc tacctcccgg ttttaatgaa tacgattttg 2220

taccagagtc ctttgatcgt gacaaaacaa ttgcactgat aatgaattcc tctggatcta 2280

ctgggttacc taagggtgtg gcccttccgc atagaactgc ctgcgtcaga ttctcgcatg 2340

ccagagatcc tatttttggc aatcaaatca ttccggatac tgcgatttta agtgttgttc 2400

cattccatca cggttttgga atgtttacta cactcggata tttgatatgt ggatttcgag 2460

tcgtcttaat gtatagattt gaagaagagc tgtttttacg atcccttcag gattacaaaa 2520

ttcaaagtgc gttgctagta ccaaccctat tttcattctt cgccaaaagc actctgattg 2580

acaaatacga tttatctaat ttacacgaaa ttgcttctgg gggcgcacct ctttcgaaag 2640

aagtcgggga agcggttgca aaacgcttcc atcttccagg gatacgacaa ggatatgggc 2700

tcactgagac tacatcagct attctgatta cacccgaggg ggatgataaa ccgggcgcgg 2760

tcggtaaagt tgttccattt tttgaagcga aggttgtgga tctggatacc gggaaaacgc 2820

tgggcgttaa tcagagaggc gaattatgtg tcagaggacc tatgattatg tccggttatg 2880

taaacaatcc ggaagcgacc aacgccttga ttgacaagga tggatggcta cattctggag 2940

acatagctta ctgggacgaa gacgaacact tcttcatagt tgaccgcttg aagtctttaa 3000

ttaaatacaa aggatatcag gtggcccccg ctgaattgga atcgatattg ttacaacacc 3060

ccaacatctt cgacgcgggc gtggcaggtc ttcccgacga tgacgccggt gaacttcccg 3120

ccgccgttgt tgttttggag cacggaaaga cgatgacgga aaaagagatc gtggattacg 3180

tcgccagtca agtaacaacc gcgaaaaagt tgcgcggagg agttgtgttt gtggacgaag 3240

taccgaaagg tcttaccgga aaactcgacg caagaaaaat cagagagatc ctcataaagg 3300

ccaagaaggg cggaaagtcc aaattgtaaa atgtaactgt attcagcgat gacgaaattc 3360

ttagctattg taatactgcg atgagtggca gggcggggcg taattttttt aaggcagtta 3420

ttggtgccct taaacgcctg gttgctacgc ctgaataagt gataataagc ggatgaatgg 3480

cagaaattcg ccggatcttt gtgaaggaac cttacttctg tggtgtgaca taattggaca 3540

aactacctac agagatttaa agctctaagg taaatataaa atttttaagt gtataatgtg 3600

ttaaactact gattctaatt gtttgtgtat tttagattcc aacctatgga actgatgaat 3660

gggagcagtg gtggaatgcc tttaatgagg aaaacctgtt ttgctcagaa gaaatgccat 3720

ctagtgatga tgaggctact gctgactctc aacattctac tcctccaaaa aagaagagaa 3780

aggtagaaga ccccaaggac tttccttcag aattgctaag ttttttgagt catgctgtgt 3840

ttagtaatag aactcttgct tgctttgcta tttacaccac aaaggaaaaa gctgcactgc 3900

tatacaagaa aattatggaa aaatattctg taacctttat aagtaggcat aacagttata 3960

atcataacat actgtttttt cttactccac acaggcatag agtgtctgct attaataact 4020

atgctcaaaa attgtgtacc tttagctttt taatttgtaa aggggttaat aaggaatatt 4080

tgatgtatag tgccttgact agagatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta 4140

cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt 4200

gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca 4260

aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc 4320

aatgtatctt atcatgtctg gatccgtcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc 4380

agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt 4440

atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 4500

gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 4560

gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 4620

ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 4680

cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 4740

ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 4800

taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 4860

ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 4920

ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 4980

aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 5040

tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac 5100

agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 5160

ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 5220

tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 5280

tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 5340

cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 5400

aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 5460

atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 5520

cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga 5580

tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 5640

atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt 5700

taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt 5760

tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat 5820

gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 5880

cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 5940

cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 6000

gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 6060

aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 6120

accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 6180

ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 6240

gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 6300

aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 6360

taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg cgccctgtag 6420

cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag 6480

cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt 6540

tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca 6600

cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata 6660

gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca 6720

aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc 6780

gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa 6840

caaaatatta acgcttacaa tttgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg 6900

gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagcccaag ctaccatgat aagtaagtaa 6960

tattaaggta cgtggaggtt ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc 7020

tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt 7080

acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 7140

gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatggtac tgtaactgag ctaacataa 7199

<210> 4

<211> 4733

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540

acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600

ccggactcag atctcgagct caagcttcga attctgcagt cgacggtacc gcgggcccgg 660

gatccaccgg tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc 720

atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 780

gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 840

cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 900

taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc 960

caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag 1020

ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac 1080

ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 1140

gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac 1200

ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 1260

ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 1320

aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 1380

gacgagctgt acaagtaaag cggccgcgac tctagatcat aatcagccat accacatttg 1440

tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa 1500

tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 1560

atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 1620

ccaaactcat caatgtatct taaggcgtaa attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc 1680

gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc 1740

ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 1800

agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc 1860

gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa 1920

gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg 1980

aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt 2040

gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc 2100

gcgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 2160

atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 2220

tgaaaaagga agagtcctga ggcggaaaga accagctgtg gaatgtgtgt cagttagggt 2280

gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt 2340

cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc 2400

atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc 2460

cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg 2520

ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc 2580

taggcttttg caaagatcga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa 2640

gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg 2700

gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc 2760

ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca agacgaggca 2820

gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc 2880

actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca 2940

tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 3000

acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca 3060

cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg 3120

ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgagca tgcccgacgg cgaggatctc 3180

gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct 3240

ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct 3300

acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac 3360

ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc 3420

tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag 3480

atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg 3540

ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccctaggg 3600

ggaggctaac tgaaacacgg aaggagacaa taccggaagg aacccgcgct atgacggcaa 3660

taaaaagaca gaataaaacg cacggtgttg ggtcgtttgt tcataaacgc ggggttcggt 3720

cccagggctg gcactctgtc gataccccac cgagacccca ttggggccaa tacgcccgcg 3780

tttcttcctt ttccccaccc caccccccaa gttcgggtga aggcccaggg ctcgcagcca 3840

acgtcggggc ggcaggccct gccatagcct caggttactc atatatactt tagattgatt 3900

taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 3960

ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 4020

aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 4080

caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 4140

taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 4200

gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 4260

cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 4320

taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 4380

agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 4440

ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 4500

gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 4560

acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 4620

acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 4680

tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccatg cat 4733

<210> 5

<211> 2000

<212> DNA

<213> 中国仓鼠（Cricetulus griseus）

<400> 5

tcttctgcag gtaaaatggc ataatttacc agacagagct tcccagagca ttaggatgtc 60

ctgcatcaat ggccactaga cttggacttc accacgtctt ggctccttgg catcctgcag 120

tgaaggatgg tgtcggagac agaaggcaat aaaaggcctg gtaatgtgtg agtgcaatac 180

cagccataga ctgcaggcca ctcaagctgg gtgtgaaggc atgtctgtcg tcctagcgct 240

ctgcaggtta agacaggaag atggtgtgtc ccaggctatc ctcagctaca caggcaaaca 300

aacaacaaat cctttctttt agccacgtgt aataatgtga cttcattggc agctgactag 360

aaatagggga tattttggaa caagggcact aggggagaca ttgttcctcc gcaccccccc 420

ctccacccac agcctctatc tgatctccac agtggagaat ttttttaaaa ttcaacttcc 480

ctaggttcta gactgactca ggccacttat tcccaaggaa tgcacaaata gatatgtgta 540

acagtcatgt cttctttaat tcacagcacc aaacagcacc caggctggca ctgtgcccat 600

ttctccccag gctctgctct cacttccccc tcatgggcac ttcccttgtc ctgaaaccca 660

agctcaaacc tcctgccatg caattcttgg catttatgtc tcagaagtag ctgtgggttt 720

cgggcttttc ccagcgtatg ccaaatgcct ttcagctgag tagatgtcct cccagacttg 780

agataaagca gttctctgct tggtccttat ttggctaaat atgtacttgc atcaaggaac 840

tcacctgagg tttttgagga ccatttaaaa tctgaaatgc tgaggaagag agtgagcaac 900

aatttgaagt caatggggaa agaaaggatc atctactcaa caaatggctg aagataactg 960

gctatgcatt tcagaacaaa taaagaattc agatcccgac cttagcccca gtgagtggaa 1020

tatgtattaa caagaaatat atatagcttt catacatctc tcttcttcct gtcattgtgg 1080

gagtgtggag tgtacacata cgtagcatgt caatacatat agcatatcca caaccatgtt 1140

atattatact aatagcatgt gctcagacat tattaagata tcaatatatc aagatgatgt 1200

acaaatttta ttaatataaa ttatatacta tgattagaca catgctaata ttttttgtgt 1260

tttatgaagt agtttgatgt acatctagaa gaagtaattg taaaaagatg taagaggcac 1320

tacctctccc cgagttgcac ctccacccct ctgcctcctg aggttccatc ctctagccct 1380

gggtcaggct cactgagcta tccaatgcca gttccaagga cagcagctac cttctgtagg 1440

ccagactgtg ctgggggtta gacacacaag gaaaaacaca acctgctcag gaagacaaag 1500

acagcaaaag gggtggggtg tgctgtcaca gtgaaataag tactagatgc agtcaggagg 1560

aagggtagtg agggtccatg ccgtctgggt caaggaggaa ctcaagcctc atctgggatt 1620

cggatcccct ggcttacctg gttgacagca ctgtgtttac acctaaaaca tgcagcgcag 1680

agagagggtt gcttctgcaa gcagtaacag acatcccaga atatccaaga gttaaaaggg 1740

aaggagaaag tgaaaggaat ggagccccgc ctcacccctt gctctgtgcc tgtggttggt 1800

agaactcagc ctggaataaa taggagcagc agttcttgtg tcaacgccat tccaacttct 1860

agaaggttct tcttcccttc acagtaaatt tatgcacaga cacgccccag agtgttgaga 1920

ggagaggtca cagcccttgt tcctgatcaa ccagtcacca catcaggtaa gactggctag 1980

gctcaggtgc ctggcccact 2000

<210> 6

<211> 597

<212> DNA

<213> 中国仓鼠（Cricetulus griseus）

<400> 6

atgcccgtct cagcactgct ctgttgcctg ctcttactgg ctggagtggg gcccagcaga 60

ggccagtata cccagcaaga gaataactgc acccacttcc cagtcagcca gacccacatg 120

ctccgagagc tgagaactgc cttcagccag gtgaagactt tctttcaaaa gaaggaccag 180

ctggacaaca tactactcac tgactcctta gtgcaggact ttgagggtta cttgggttgc 240

caaaccttat cagaaatgat ccagttttac ctggtagaag tgatgcccca ggcagagaac 300

catggcccag aaatcaagga gcatttgaac tctctgggag agaagctgaa gacagagaac 360

catggcccag aaatcaagga gcatttgaac tctctgggag agaagctgaa gaccctcagg 420

aggcagctgc agcgctgtca tcgattcctc ccctgtgaaa ataaaagcaa ggctgtggaa 480

aaggtgaaga gtgattttaa taagctccaa gagaaaggcg tctacaaggc catgaatgaa 540

tttgatatct tcatcaactg catagaaaca tacatgacca tcaaaatgaa aagctaa 597

<210> 7

<211> 2000

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 7

tggccgatga ctgctctaat gggaggcaga ttctttataa gatcttgtaa actgtagaat 60

gcaccctcca aaatctattt gcataagcac acacacacac acacacacac acaccccagc 120

agttcttgcc tgcccagatt cctctgcagc taaagtgatg aaacttactg ggcggagctt 180

cctaaaaaga ttattagggt ctcctgggtt ggtgtgcctt taaacctttg gactttacca 240

cctcctatct ctcctatctc cttgcaacaa aggttaggag aacaagaatg cagaaaaaac 300

gggtcctgga tgacatctga gtgcctgctt tgggcttctt gatgagtgag acagaaaata 360

aaatacaacc ccctctttta aaagccatgc ttactcaggt tttccttcat ttgcagctaa 420

atacagaaat gagagaatat tttggagcag ggatggaaga agagaggtat tccccttccc 480

acaaccttct gatttcccag tacatccccc actggaaaaa ttcatttaaa atcagtataa 540

taagcattga ttagatgcct actatgcatc tgggcttgag ggcaaactgg actcaggcct 600

tttggcctca agaagctcac agtgtgagag tggcatttgt gtcctcttga aattcacagg 660

actaaattgt gcccaggctg acattctatc catccatagg tgcctgcctt ctcacttccc 720

tctcttcatg ggctcttgcc ttgtaccaaa atccaaaccc aaatctcctc acatgtgagt 780

gttggcattc atgtctcaga catgacctat gggcttggga cttttccccg tggaccccag 840

tgacttttca gatgaacagg tatcttcaaa aacttgagaa ataggagtcc tgtttgttgt 900

tcttgttgct ttgtcaatat aaggacacag ggtctttatt caaatgttca tatctatctc 960

ttgacagaaa tactatgaga catattgatg gagaagccgt tatctccata tgctaaatga 1020

ggacttgcac cagggaactt gcccatggtt ctctccaacc acttaaattc tgaaattttg 1080

aaatgagagt ggacagtaat ttcaaatcaa tggggaaaga atcaaatctt cagcaaatgg 1140

cttgagataa ttagctacac atttcagaac aaataaagaa gtcagatccg ggccgggcac 1200

agtggctcat gcctgtaatc tcagcactct gggaggccaa ggcgggcgga tcataaggtc 1260

aggagatcga gaccatcctg gttaacacag tgaaaccccg tctctaataa aaatacaaaa 1320

aaaaataaaa aaacttagcc gggcgtggtg ccaggcgcct gtagtcccag ctactcggga 1380

cgctgaggca ggagaatggc ttgaactcgg gaggcagagc ttgcagtgag ctgagatcat 1440

gccactgcac tccagcctgg gcaacagagc gagactctgt ctcaaaaaaa aaaaagaagt 1500

cagatcctaa cctcaaccct atttaacaga ttatagatga aagaaaggta caaatggctt 1560

ttacatacct cccttctccc tgacattttg tatgtgtgtg tgtgtgtatt tacacacaca 1620

tctcatataa ggaaattgaa gggaggctgc ctgcatccct gagtcactct ccctctcctt 1680

ctgaatgctt acctgtgccc agaccacctc cttagcctcg caccctccag gcttacaggg 1740

cactcttcta tgcccatccc aagtatagct gataccttcc aagggccaga cttggtgcta 1800

agtaccaagt acgcaaagat taataaaaca atgtcctgtt tcagggagct caaagctgat 1860

tcggcagggc atggtgtgta catgaatgat aaccacgtag ggttgcaggt ttcctagtga 1920

ggtaagcaca aggcaagatg ggaaacaaag gaaggagggg ttcacagcct cacccagagt 1980

ccagaacccc tggcctgcct 2000

<210> 8

<211> 593

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 8

atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccagccca 60

ggccagggca cccagtctga gaacagctgc acccacttcc caggcaacct gcctaacatg 120

cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga gtgaagactt tctttcaaat gaaggatcag 180

ctggacaact tgttgttaaa ggagtccttg ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc 240

caagccttgt ctgagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca agctgagaac 300

caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac tccctggggg agaacctgaa gaccctcagg 360

ctgaggctac ggcgctgtca tcgatttctt ccctgtgaaa acaagagcaa ggccgtggag 420

caggtgaaga atgcctttaa taagctccaa gagaaaggca tctacaaagc catgagtgag 480

taggtgaaga atgcctttaa taagctccaa gagaaaggca tctacaaagc catgagtttg 540

acatcttcat caactacata gaagcctaca tgacaatgaa gatacgaaac tga 593

Claims

1.下述N1或N2的方法：

N1、一种制备IL-10的方法，包括：将HSPA13基因表达载体导入哺乳动物细胞中，得到重组细胞，培养所述重组细胞，得到IL-10；所述HSPA13基因表达载体为在出发表达载体中插入HSPA13基因得到的能表达HSPA13蛋白质的重组载体；

N2、一种高表达IL-10哺乳动物细胞的制备方法，包括：将所述HSPA13基因表达载体导入哺乳动物细胞中，得到与所述哺乳动物细胞相比IL-10表达量增加的重组细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述HSPA13蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

和/或，所述HSPA13基因为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)编码序列是序列表中SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述出发表达载体的序列如序列表中SEQ ID No.4所示。

4.权利要求1-3中任一所述HSPA13基因表达载体在制备增强哺乳动物细胞中IL-10表达产品中的应用。

5.权利要求1或2中所述HSPA13蛋白质或所述HSPA13基因在制备增强哺乳动物细胞中IL-10表达产品中的应用。

6.根据权利要求1-3中任一所述的方法或权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述哺乳动物细胞为人或小鼠的细胞。

7.下述I或II的应用：

I、权利要求1-3中任一所述HSPA13基因表达载体，或所述HSPA13蛋白质，或所述HSPA13基因的下述任一应用：

X1、生产IL-10；

X2、制备生产IL-10的产品；

II、权利要求1或2中所述HSPA13蛋白质的下述任一应用：

Y1、作为转录因子；

Y2、作为IL-10基因转录因子；

Y3、增强IL-10启动子的转录活性；

Y4、制备增强IL-10启动子的转录活性产品。

8.利用权利要求1-3中任一所述高表达IL-10哺乳动物细胞的制备方法得到的高表达IL-10哺乳动物细胞。

9.成套试剂，包括P1与P2：

P1、权利要求1-3中任一所述HSPA13基因表达载体，或所述HSPA13蛋白质，或所述HSPA13基因；

P2、IL-10启动子。

10.权利要求9所述的成套试剂或权利要求8所述高表达IL-10哺乳动物细胞的下述任一应用：

X1、表达目的蛋白；

X2、制备表达目的蛋白的产品；

X3、生产IL-10；

X4、制备生产IL-10的产品。