BRPI0208301B1 - ácido nucléico isolado, e, composição - Google Patents

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Abstract

"vacinas de ácido nucléico para prevenção de infecção por flavivírus". a presente invenção engloba ácidos nucléicos isolados contendo unidades transcricionais que codificam uma seqüência de sinal de um flavivírus e um antígeno de flavivírus imunogênico de um segundo flavivírus ou de um antígeno de flavivírus imunogênico quimérico compreendendo seqüência de mais de um flavivírus. a invenção engloba, adicionalmente, um ácido nucléico e vacina de proteína e o uso da vacina para imunizar um indivíduo contra infecção por flavivírus. a invenção também provê antígenos codificados por ácidos nucléicos da invenção, anticorpos extraídos em resposta aos antígenos e uso dos antígenos e/ou anticorpos na detecção do flavivírus ou diagnóstico de infecção por flavivírus.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO
Patente de Invenção para “ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, E, COMPOSIÇÃO” [001] Este pedido é uma continuação-em-parte e reivindica o benefício do pedido US número de série 09/826.115, depositado em 4 de abril de 2001, que encontra-se pendente e que é uma continuação-em-parte e reivindica o benefício do pedido US número de série 09/701.536, depositado em 29 de novembro de 2000, que encontra-se pendente e que é um pedido de estágio nacional do pedido internacional número de série PCT/US99/12298, depositado em 3 de junho de 1999 e que reivindica o benefício do pedido provisório US número de série 60/087.908, depositado em 4 de junho de 1998, os pedidos sendo incorporados aqui em sua totalidade, como referência.
Campo da Invenção [002] Esta invenção refere-se a novas vacinas, diagnósticos e processos de uso no tratamento e prevenção de doenças causadas por flavivírus. Especificamente, as vacinas são ácidos nucléicos recombinantes que contêm genes para proteínas estruturais de flavivírus, tais como vírus da encefalite Japonesa (JEV), vírus do West Nile (WNV) ou flavivírus correlatos. Estas vacinas servem como uma unidade transcricional para a biosíntese de antígenos de proteína do vírus quando administrados in vivo. Os diagnósticos são composições contendo antígenos produzidas de ácidos nucléicos recombinantes que podem ser usados para detectar infecção por flavivírus.
Histórico da Invenção [003] Flaviviroses são elementos do gênero Flavivirus, que está classificado na família Flaviviridae. Os flavivírus são largamente patogênicos aos seres humanos e aos outros mamíferos. Flaviviroses que infringem doenças nos homens e outros mamíferos. Os flavivírus que passam doenças para os humanos e animais incluem Alfuy, Apoi, Aroa, Bagaza, Banzi, Batu Cave, Bouboui, Bukalasa bat, Bussuquara, Cacipacore, Carey Island, Cowbone Ridge, Dakar bat, Dengue (serótipos 1, 2, 3 e 4), Ege Hill, Entebbe bat, Gadgets Gully, Iguape, Ilheus, meningoencefalite de frangos em Israel, encefalite japonesa, Jugra,
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 16/118 / 99
Jutiapa, Kadam, Karshi, Kedougou, Kokobera, Koutango, Kunkin, doença Kyasanur Forest, Langat, Meaban, Modoc, leucoencefalite de miotes Montana, encefalite de Murray Valey, Naranjal, Negishi, Ntaya, febre hemorrágica Omsk, Phnom Penh bat, Potiskum, Powasan, Rio Bravo, Rocio, Royal Farm, encefalite de primavera verão russa, Saboya, Sal Vieja, San Perlita, Sauramrez Reef, Sepik, Sokuluk, Spondweni, encefalite de Saint Louis, Stratford, subtipo da Europa Central de encefalite transmitida pelo carrapato, subtipo do Extremo Oriente transmitida pelo carrapato, Tembusu, THCAr, Tyuleniy, Uganda S, Usutu, West Nile, Yaounde, febre amarela, Yokose, Ziki, agente de fusão de célula e outras flaviviroses correlatas, conforme listado em Kuno e outros (J. Virol. 72:73-83 (1998)).
[004] As flavoviroses contêm as três proteínas estruturais que se seguem: prM/M, a pré-membrana e proteína de membrana; E, a proteína invólucro; e C, a proteína capsídio. (Monath, em Virology (Fields, ed.), Raven Press, New York, 1990, pp 763-814; Heinz and Roehrig, em Immunochemistry of Viruses II: The Basis for Serodiagnosis and Vaccines (van Regenmortel and Neurath, eds.), Elsevier, Amsterdam, 1990, pp. 289-305). M possui um peso molecular (MW) de cerca de 7-8 kDa; e E possui um MW de cerca de 55-60 kDa. M é sintetizado como um precursor maior denominado prM. A proporção de prM é removida quando prM é processada para formar proteína M nos vírus maduros. M e E são encontrados na membrana das partículas flavirírus, e assim têm há muito sido considerados como constituindo importante componente imunogênico das viroses.
[005] As flaviviroses são viroses de RNA compreendendo um RNA de filamento simples possuindo um comprimento, dentre as várias espécies, de cerca de 10 kb. A proteína C, com MW fr 12-14 kDa, complexa com o RNA para formar um complexo “nucleocapsidio”. Diversas proteínas não estruturais são também codificadas pelo genoma de RNA; as quais são denominadas NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. O genoma é traduzido dentro da célula hospedeira como uma poliproteína, então processado co- ou pósPetição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 17/118 / 99 translacionalmente nos produtos de gene individual, por proteases específicas de hospedeiro ou viróticas (figura 1).
[006] As seqüências de nucleotídeos dos genomas de diversas flaviviroses são conhecidas, como resumidas na Patente US 5.494.671. As de JEV são providas por Sumiyoshi e outros (Virology 161: 497-510(1987)) e Hashimoto e outros (Vírus Genes 1, 305-317 (1988)). As seqüências de nucleotídeos da cepa virulenta SA-14 da JEV e a cepa atenuada SA-14-14-2 usada como vacina na República Popular da China são comparadas no trabalho de Nitayaphan e outros (Virology 177: 541-552(1990)).
[007] Seqüências de nucleotídeos codificando as proteínas estruturais de outras espécies de flavivírus são também conhecidas. Em muitos casos as seqüências para os genomas completos têm sido relatadas. As seqüências disponíveis incluem vírus serótipo da dengue 1 vírus serótipo da dengue 2, (Deubel e outros, Virology 155:365-377 (1986), Gruenberg e outros, J. Gen. Virol. 69, 1391-1398 (1988); Hahn e outros, Virology 162, 167-180 (1988)), vírus serótipo da dengue 3, (Osatomi e outros, Virus Genes 2:99-108 (1988)), vírus serótipo da dengue 4 (Mackow e outros, Virology 159:217-228 (1987); Zhao e outros, Virology 155, 77-88 (1986)), e vírus do West Nile (Lanciotti e outros, Science 286: 2331-1333 (1999)), vírus Powassan (Mandl e outros, Virology 194: 173-184 (1993)) e vírus da febre amarela (YFV) (Rice e outros, Science 229, 726-733 (1985)).
[008] Muitas flaviviroses incluindo vírus da encefalite de Saint Louis (SLEV), WNV e JEV são transmitidas aos seres humanos e outros animais hospedeiros por mosquitos. Elas conseqüentemente ocorrem em áreas muito amplas e sua transmissão não é facilmente interrompida ou prevenida.
[009] A febre do West Nile é uma infecção flavivirótica que tem origem no mosquito que é transmitida aos vertebrados primariamente por várias espécies de mosquitos Culex. Como outros elementos do complexo antigênico de encefalite japonesa (JE) de flaviviroses, incluindo JE, SLE e viroses de encefalite de Murray Valley (MVE), MNV é mantido em um ciclo natural entre vetores artrópodes e pássaros. O vírus foi isolado primeiro de um ser humano febril no
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 18/118 / 99 distrito de West Nile de Uganda, em 1937 (Smithburn e outros, Am. J. Trop. Med. Hyg. 20: 471-492 (1940)). Ela foi reconhecida como uma das flaviviroses mais amplamente distribuída, com sua faixa geográfica incluindo África, Oriente Médio, Ásia Ocidental, Europa e Austrália (Hubalek e outros, Emerg. Infec. Dis. 5: 643-50 (1999)). Clinicamente, a febre do West Nile em seres humanos é uma doença febril propriamente limitada, acompanhada por dores de cabeça, mialgia, poliartropatia, erupções e linfadenopatia (Monath e Tsai, em Clinical Virology (Richman, Whitley e Hayden eds), Churchill-Livingtone, New York, 1997, páginas 1133-1186). A hepatite aguda ou pancreatite foi reportada na ocasião e casos de infecção por WNV em pacientes mais velhos são algumas vezes complicados por encefalite ou meningite (Asnis e outros, Clin. Infec. Dis. 30: 413-418 (2000)). Assim, a infecção por WNV é uma doença série em muitas regiões do mundo.
[010] A dispersão geográfica da doença, especificamente a introdução de WNV nos Estados Unidos em 1999, aumento em muito a consciência da saúde dos seres humanos e animais com relação a esta doença. Entre o último agosto e antes de setembro de 1999, a cidade de New York e áreas vizinhas experimentou um surto de encefalite virótica, com 62 casos confirmados, resultando em sete mortes. Concorrentemente com este surto, os oficiais de saúde sítio observaram mortalidade crescente entre os pássaros (especialmente galos) e cavalos. Foi demonstrado subseqüentemente que o surto foi causado por WNV, com base no mapeamento monoclonal de anticorpos (MAb) e detecção de seqüências genômicas em seres humanos, aves e espécies de mosquito (Anderson e outros, Science 286: 2331-2333 (1999); Jia e outros, Lancet 354: 1971-1972 (1999); Lanciotti e outros, Science 286: 2333-2337 (1999). A atividade do vírus detectada durante os meses de inverso indicou que o vírus havia se estabelecido propriamente na América do Norte (Morb. Mortal. Wkly. Rep. 49: 178-179 (2000); Asnis e outros, Clin. Infect. Dis. 30: 413-418 (2000: Garmendia e outros, J. Clin. Micro. 38: 3110-3111 (2000)). Os dados de sobrevivência reportados dos estados do nordeste e meio-atlântico durante o ano de 2000 confirmaram uma transmissão epizoótica/epidêmica intensificada e uma expansão geográfica do
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 19/118 / 99 vírus com documentação de vários casos de infecção em pássaros, mosquitos e cavalos, bem como casos em seres humanos (Morb. Mortal. Wkly. Rep. 49: 820822 (2000)).
[011] Atualmente, nenhuma vacina para seres humanos ou veterinária encontra-se disponível para prevenir infecção por WNV e o controle do mosquito é a única estratégia prática para combater a dispersão da doença.
[012] O vírus da encefalite japonesa (JEV) afeta adultos e crianças, e existe uma alta taxa de mortalidade entre os recém-nascidos, crianças e os mais velhos, nas áreas da Ásia tropical e subtropical (Tysai e outros em Vaccines (Plotkin, ed.) W. B. Saunders, Philadelphia, Pa 1994, pp. 672-710). Dentre os sobreviventes, existem sérias conseqüências neurológicas, relacionadas aos sintomas de encefalite, que persistem após infecção. Em muitos países desenvolvidos desta região, tais como o Japão, a República da China, e a Coréia, JEV têm sido largamente controlada pelo uso de uma vacina de JEV inerte. Todavia, ela ainda prevalece em outros países da região.
[013] As vacinas disponíveis para uso contra infecção por JEV incluem vírus vivos inativados por processos, tais como, tratamento com formalina, bem como vírus atenuados (Tsai e outros, em Vaccines (Plotkin, ed.) W. B. Saunders, Philadelphia, Pa 1994, pp. 671-713). As vacinas de vírus totais, embora eficazes, possuem determinados problemas e/ou desvantagens. Os vírus são cultivados em cérebro de camundongo ou na cultura de célula usando células de mamíferos como hospedeiro. Tais processos de cultura são incômodos e caros. Adicionalmente, existe o risco crescente de incorporação de antígenos das células hospedeiras, isto é, o cérebro ou outro hospedeiro, no produto de vacina final, conduzindo potencialmente as respostas alérgicas não desejadas e não pretendidas nos recipientes de vacina. Há também o risco de infecção inadvertida entre os trabalhadores envolvidos na produção de vacina. Finalmente, há o risco de que o vírus possa não estar plena ou completamente inativado ou atenuado e assim, a vacina pode realmente causar a doença.
[014] A febre da dengue e febre da dengue hemorrágica (DF/DHF) são causadas por vírus da dengue, que é também um flavivírus transmitido pelo
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 20/118 / 99 mosquito. Existe quatro serótipos do vírus da dengue antigenicamente correlates, porém distintos, (DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4) todos os quais podem causar DF/DHF. Os sintomas de DF, a forma branda da doença relacionada à dengue, incluem, febre, erupções, dor de cabeça grave e dores nas juntas. A mortalidade entre os indivíduos que sofrem de DF é baixa; contudo, entre os indivíduos que sofrem de DHF, a mortalidade pode ser tão alta quanto de 5%. A partir de evidência disponível, mais do que 3 milhões de casos de DHF e 58.000 mortes foram atribuídos ao DHF nos últimos 40 anos, tornando a DHF uma doença de grande surgimento (Halstead, em Dengue and Dengue-Hemorrahig-Fever (Gubler e Kuno, eds.) CAB International, New York, NY, (1997) pp 23-44). Não obstante, a despeito de décadas de esforço, as vacinas seguras e eficazes para proteger contra infecção por vírus da dengue não estão disponíveis ainda.
[015] Febre amarela prevalece em regiões tropicais da América do Sul e subSaara africano, e é transmitida por mosquitos. Infecções levam a febre, calafrio, forte dor de cabeça e outras dores, anorexia, náusea e vômitos, com o surgimento de icterícia. Uma vacina com vírus vivo, 17D, desenvolvido em embriões de crianças infectadas, é considerada segura e eficaz. Entretanto, permanece a necessidade de uma vacina que seja estável sob condições adversas, tal como as que são geralmente encontradas nas regiões tropicais da África e das Américas onde a vacina é mais necessária.
[016] Um flavirírus recombinante o qual é uma quimera entre dois flavivírus é descrito na publicação PCT WO 93/06214. A quimera é uma construção fundindo proteínas não estruturais de um tipo ou serótipo de vírus da dengue ou um flavivírus, com proteínas estruturais de um “tipo” diferente, ou serótipo do vírus da dengue ou um outro flavivírus.
[017] Diversas sub-unidades recombinantes e vacinas virais têm sido desenvolvidas nos anos recentes. Patente US N° 4.810.492 descreve a produção de glicoproteína E de JEV para uso como antígeno em uma vacina. O DNA correspondente é clonado em um sistema de expressão de maneira a expressar a proteína antígeno em uma célula hospedeira adequada, tal como E. coli, levedura, ou uma cultura de célula de organismo superior. A Patente US N° 5.229.293
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 21/118 / 99 descreve bacilovírusrecombinante protegendo o gene para a proteína JEV E. O vírus é usado para células de insetos infectadas em culturas, tais que a proteína E é produzida e recuperada para uso como uma vacina.
[018] A Patente US N° 5.021.347 descreve um genoma de vírus de varíola bovina recombinante no qual o gene para a proteína JEV E tenha sido incorporado. O vírus da varíola bovina recombinante vivo é usado como uma vacina para imunizar contra JEV. Vírus de varíola bovina e bacilovírus recombinante onde as viroses incorporam um gene para uma truncagem da terminação C da proteína E do serótipo da dengue 2, serótipo da dengue 4 e JEV são descritos na Patente US 5.494.671. A Patente US N° 5.514.375 descreve várias viroses de varíola bovina recombinantes que expressam porções do JEV de estruturas de leitura abertas estendendo-se a partir do prM para NS2B. Estas viroses de pústula induziram a formação de partículas extracelulares que contêm a proteína M e a proteína E processadas. Duas viroses recombinantes codificando estas proteínas JEV produziram altas titulações de neutralização e anticorpos de inibição de hemaglutinina e imunidade de proteção, em camundongos. A extensão destes efeitos foi maior após dois tratamentos de imunização que após somente um. Vírus de varíola bovina recombinante contendo genes para prM/M e proteínas E de JEV conferiram imunidade de proteção quando administrados à camundongos (Konishi e outros Virology 180: 401-410 (1991)). Células HeLa infectadas com vírus de varíola bovina recombinantes carregando genes para prM e E a partir do JEV mostraram que produzem partículas subviróticas (Konishi e outros Virology 188: 714-720 (1992)). Dmitriev e outros reportaram imunização de camundongos com um vírus de varíola bovina recombinante codificando proteínas estruturais e certas não estruturais a partir do vírus da encefalite transmitido por carrapato (J. Biotechnology 44:97-103 (1996)).
[019] Vetores do vírus recombinante têm também sido preparados para servir como vacinas de vírus para febre dengue. Zhao e outros (J. Virol. 61, 4019-4022 (1987)) prepararam vírus de varíola bovina recombinante carregando proteínas estruturais e NS1 a partir do tipo 4 da dengue e encontraram expressão após infecção das células de mamíferos com o vírus recombinante. A expressão similar
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 22/118 / 99 foi obtida usando bacilovírus recombinante infectando células de insetos alvo (Zhang e outros J. Virol. 62, 3027-3031(1988)). Bray e outros ( J. Virol. 63, 2853-2856 (1989)) também reportam a vacina da dengue de varíola recombinante com base no gene da proteína E que confere imunidade protetora em camundongos contra encefalite da dengue quando desafiados. Falgout e outros (J. Virol 63, 1852-1860 (1989)) e Falgout e outros (J. Virol. 64, 4356-4363 (1990) reportam resultados similares. Zhang e outros (J. Virol 62, 3027-3031 (1988) mostram que bacilovírusrecombinante codificando proteínas da dengue E e NS1 igualmente podem proteger camundongos contra dengue encefálica quando provocada. Outras combinações, nas quais genes estruturais e não estruturais são incorporados em vacinas de vírus recombinantes, fracassam em produzir imunidade significante (Bray e outros, J. Virol. 63, 2853-2856 (1989)). Também, macacos fracassam em desenvolver imunidade de proteção completa ao vírus da dengue provocado quando imunizados com bacilovírus recombinante expressando a proteína E (Lai e outros (1990) páginas 119-124 em F. Brown, R. M. Chancock, H. S. Ginsberg e R. Lerner (eds) Vaccines 90: Modern approaches to new vaccines including prevention of AIDS, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
[020] Imunização usando preparações de DNA recombinante tem sido relatada para SLEV e vírus da dengue-2 usando camundongo recém-desmamado como modelo (Phillpotts e outros Arch. Virol. 141: 743-749 (1996); Kochel e outros Vaccine 15:547-552 (1997)). DNA de plasmídeo codificando os genes prM e E de SLEV provê proteção parcial contra SLEV provocado com uma dose simples ou dupla de imunização de DNA. Nestes experimentos os camundongos de controle exibem cera de 25% de sobrevida, e nenhum anticorpo de proteção foi detectado nos camundongos imunizados com DNA (Phillpotts e outros, Arch. Virol. 141: 743-749 (1996)). Em camundongos que receberam três injeções intradérmicas de DNA de plasmídeo de dengue-2 recombinante contendo prM, 100% desenvolveram anticorpos de neutralizantes anti-dengue-2, e 92% deles recebem o gene E correspondente, do mesmo modo desenvolvendo anticorpos neutralizantes (Kochel e outros, Vaccine 15: 547-552 (1997)). Experimentos
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 23/118 / 99 provocados usando uma programação de duas doses, entretanto, falharam em proteger o camundongo contra vírus da dengue-2 letal provocada.
[021] As vacinas desenvolvidas até hoje para imunização contra infecção por JEV, SLEV, vírus da dengue e outras flaviviroses possuem inúmeras desvantagens e problemas com relação a seu uso. Vacina de vírus inerte é cara e inconveniente para preparar. Além disto, qualquer tal vacina traz o risco de reação alérgica originária de proteínas das células de hospedeiro usados na preparação do vírus. Além disso, tais vacinas apresentam risco considerável aos trabalhadores empregados na sua produção. Candidatas a vacinas JEV atenuadas são submetidas a experimentos clínicos, mas desde 1996 não encontraram ampla aceitação fora da República popular da China (Hennessy e outros, Lancet 347: 1583-1586 (1996)).
[022] As vacinas recombinantes com base no uso de apenas determinadas proteínas de flaviviroses, tais como, JEV, produzidas por expressão biosintética na cultura de célula com purificação subsequente ou tratamento de antígenos, não induzem titulações altas de anticorpos. Também, de modo semelhante às preparações de vírus integral, estas variam possuem o risco de reação alérgica adversa aos antígenos a partir do hospedeiro ou em relação ao vetor. O desenvolvimento de vacinas contra o vírus da dengue e MNV está menos avançado e tais vacinas a base de proteína recombinante ou de vírus encontram problemas semelhantes aos aludidos acima.
[023] Existe, portanto, a necessidade de vacinas ou vacinas aperfeiçoadas dirigidas contra flaviviroses, tais como, vírus da febre amarela, vírus da dengue, JEV, SLEV e WNV que não sejam caras de preparar, apresentem pouco risco aos trabalhadores envolvidos em sua fabricação, além de apresentar um risco mínimo de reações imunológicas adversas devido à impurezas ou componentes imunogênicos acidentais e serem altamente eficazes na obtenção de anticorpos neutralizantes e imunidade de proteção. Existe, além disso, a necessidade para vacinas contra JEV, WNV e flaviviroses correlatas que minimizem o número de doses de imunização necessárias.
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 24/118 / 99 [024] Muitas das desvantagens da técnica presente, conforme descritas em detalhes para a produção de vacinas também se aplicam à produção de antígenos e anticorpos a serem usados para produção de imunodiagnósticos. Especificamente, os riscos concorrentes e custos envolvidos na produção de antígenos a partir de viroses e a falha da maioria dos antígenos expressos recombinantemente disponíveis correntemente para provocar respostas imunes eficazes são paralelos no campo dos imunodiagnósticos pelos mesmos riscos, custos altos e falta de sensibilidade correspondente. Assim, devido aos altos custos, risco de infecção acidental com o vírus vivo e níveis inferiores aos desejados de sensibilidade dos testes disponíveis anteriormente, existe a necessidade de testes de diagnóstico rápidos, simples e altamente sensíveis para detecção de infecção e/ou contaminação por flavivírus.
[025] A presente invenção satisfaz estas necessidades pela provisão de antígenos recombinantes altamente imunogênicos para uso nos ensaios de diagnóstico para a detecção de anticorpos para flaviviroses selecionadas. A presente invenção provê, adicionalmente, para uso de antígenos recombinantes derivados de flaviviroses, genes de flavivírus ou imitações dos mesmos em ensaios imunodiagnósticos para detecção de anticorpos para proteínas de flavivírus.
Sumário da Invenção [026] A presente invenção provê uma molécula de ácido nucléico que contém uma unidade transcricional (TU) para um antígeno de flavivírus imunogênico. A TU direciona uma célula hospedeira, após ser incorporada dentro da célula, para sintetizar o antígeno. Em um importante aspecto da invenção, o flavivírus pode ser vírus da febre amarela (YFV), vírus da dengue serótipo 1 (DEN-1), vírus da dengue serótipo 2 (DEN-2), vírus da dengue serótipo 3 (DEN-3), vírus da dengue serótipo 4 (DEN-4). Vírus da encefalite de Saint Louis (SLEV), vírus da encefalite Japonesa (JEV), vírus de West Nile (WNV), vírus Powassan ou qualquer outro flavivírus. Em importante concretização da presente invenção, o antígeno pode ser proteína do flavivírus prM/M, a proteína E, ou ambas. Nas concretizações importantes da presente invenção, o antígeno pode ser uma
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 25/118 / 99 proteína quimérica de flavivírus. Em particular, quando a TU inclui ambas as proteínas prM/M e E, as células hospedeiras secretam partículas subviróticas contendo os antígenos de prM/ M e E. Em um importante aspecto adicional da presente invenção, o ácido nucléico é uma molécula de DNA. Nas concretizações significativas adicionais, a TU do ácido nucléico inclui uma seqüência de controle disposta apropriadamente, tal que ela, operavelmente, controla a expressão dos antígenos prM/M e E e esta seqüência de controle pode ser o promotor precoce imediato do citomegalovírus. Em uma concretização adicional, a seqüência de nucleotídeo da TU é transformada por engenharia para otimizar a tradução eucariótica por minimizar as estruturas grandes de cabeça de grampo na região não traduzida de terminação 5' de um mRNA produzido pela TU e/ou a inclusão de uma seqüência de consenso Kozak no sítio de partida de tradução de um mRNA produzido pela TU. Em uma concretização adicional, a unidade transcricional também inclui um terminador poli-A.
[027] A presente invenção adicionalmente provê uma célula hospedeira compreendendo uma molécula de ácido nucléico, que inclui uma unidade transcricional para um antígeno do flavivírus imunogênico que leva a célula hospedeira a sintetizar o antígeno imunogênico. O flavivírus pode ser YFV, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, SLEV, JEV, WNV, vírus Powassan ou outro flavivírus. Nas concretizações importantes, o antígeno pode ser a proteína prM/M, a proteína E ou ambas a proteína prM/M e E. No último caso, a célula secreta partículas subviróticas contendo os antígenos prM/M e E.
[028] Adicionalmente a invenção provê uma composição para vacinação de um indivíduo contra o flavivírus contendo uma molécula de ácido nucléico que inclui uma unidade transcricional para um antígeno flavivirótico imunogênico. A unidade transcricional conduz a célula dentro do corpo do indivíduo, após ser incorporada lá, para sintetizar o antígeno imunogênico. A composição adicionalmente inclui um veículo farmaceuticamente aceitável. Nas concretizações significativas, o flavivírus pode ser vírus YFV, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, SLEV, JEV, WNV, vírus Powassan e outros flavivírus. Além disso, o antígeno pode ser a proteína prM/M, a proteína E, ou ambas as proteínas
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 26/118 / 99 prM/M e E; neste último exemplo as células secretam partículas subviróticas compreendendo os antígenos flavivírus prM/M e E. Estas partículas subviróticas são também referidas como antígeno recombinante não infeccioso (NRA). Nas concretizações importantes, a molécula de ácido nucléico é uma molécula de DNA. Nas concretizações adicionalmente significativas, a unidade transcricional adicionalmente contém uma seqüência de controle disposta apropriadamente de tal modo que ela controla operavelmente a expressão dos antígenos prM/M e E quando o ácido nucléico é introduzido nas células do indivíduo. Esta seqüência de controle pode ser o promotor imediatamente anterior do citomegalovírus. Em uma concretização ainda adicional, a unidade transcricional também inclui um terminador poli-A.
[029] As composições providas pela presente invenção para vacinação de um indivíduo contra um flavivírus podem incluir uma molécula de ácido nucléico, ou moléculas, que incluem unidades transcricionais para mais de um antígeno de flavivírus imunogênico. Mais do que um antígeno de flavivírus imunogênico pode se de diferentes espécies de flavivírus, cepas ou isolados em qualquer combinação. Nas concretizações significativas, os flavivírus incluídos podem ser dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou sete ou mais flavivírus. Exemplos de tais flavivírus incluem, porém não estão limitados aos vírus YFV, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, SLEV, JEV, WNV, vírus Powassan e outros flavivírus. Combinações de vacinas podem ser formuladas para conferir imunidade à doença do flavivírus para regiões geográficas específicas. Em uma concretização específica, direcionada para a Ásia tropical e subtropical, os vírus da DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, WEN e JE podem ser selecionados. Em uma concretização específica direcionada à África, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, WN e YF podem se selecionados. Em uma concretização específica direcionada à América Latina, os vírus da DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, Rocio e YF podem ser selecionados.
[030] A invenção provê ainda adicionalmente um método de imunização de um indivíduo contra infecção por flavivírus. O método envolve administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição de vacinação que contém
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 27/118 / 99 uma molécula de ácido nucléico, que inclui uma unidade transcricional para um antígeno flavivírus. A unidade transcricional dirige a célula dentro do corpo do indivíduo, após ser absorvida pela célula, para sintetizar o antígeno imunogênico. A composição adicionalmente inclui um veículo farmaceuticamente aceitável. Nas concretizações significativas do processo, o flavivírus pode ser vírus YFV, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, SLEV, JEV, WNV, vírus Powassan e outros flavivírus. Ainda em outros aspectos importantes do processo, o antígeno pode ser a proteína prM/M, a proteína E, ou ambas as proteínas prM/M e E. Quando o antígeno é ambas as proteínas prM/M e E, a célula dentro do corpo do indivíduo, após incorporar o ácido nucléico dentro dele, secreta partículas subviróticas compreendendo os antígenos flaviviróticos prM/M e E. Adicionalmente, nas concretizações significativas do processo, a composição de vacinação é administrada ao indivíduo em uma dose simples, e é administrada via parenteral. Ainda em outro aspecto do processo, o ácido nucléico é uma molécula de DNA. Ainda nas concretizações adicionais do processo, a unidade transcricional adicionalmente inclui uma seqüência de controle disposta apropriadamente, de tal modo que ela controla operavelmente a síntese dos antígenos prM/M e E; em um aspecto significativo desta concretização, a seqüência de controle é o promotor precoce imediato do citomegalovírus. Adicionalmente, a unidade transcricional também inclui um terminador poli-A.
[031] Estes aspectos e concretizações da invenção são a base para seus atributos distintos e vantagens. Sendo um ácido nucléico construído envolvendo somente porções do genoma flavivírus ao invés da seqüência abrangendo o genoma completo, a vacina contendo a TU - ácido nucléico é completamente inviável. Ele, conseqüentemente, não apresenta nenhum perigo de infecção pelo flavivírus àqueles envolvidos em sua fabricação, e nenhum perigo ao indivíduo que recebe a vacina. A vacina de ácido nucléico é fácil de preparar e de administrar, e é estável em estoque antes do uso. Inesperadamente encontrou-se que a vacina de ácido nucléico da invenção é 100 % bem sucedida em conferir imunidade de proteção em mamíferos após administração de somente uma dose simples. Um resultado inesperado adicional é que a TU do ácido nucléico é capaz
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 28/118 / 99 de engendrar imunidade ao flavivírus em um mamífero fêmea, o que pode ser transmitido à sua progênie através do leite. Sem desejar estar limitado por teoria, o inventor acredita que um possível mecanismo para o sucesso do ácido nucléico em conferir imunidade de proteção é que a célula hospedeira protegendo o ácido nucléico, tal como a célula de um indivíduo ao qual a vacina é administrada, produz partículas subviróticas contendo os antígenos flaviviróticos prM/M e E. Estas partículas imitam os atributos imunogênicos das flaviviroses virulentas nativas.
[032] A presente invenção também provê polipeptídeos antigênicos não infecciosos, fragmentos de polipeptídeo antigênico e RNA compreendendo as proteínas de prM/M e/ou E dos flavivírus, onde a seqüência de sinalização de transmembrana de um primeiro flavivírus e as proteínas de M e/ou E são derivadas de um segundo flavivírus. Adicionalmente, a proteína prM/M pode compreender seqüências de aminoácido dos primeiro e segundo flavivírus. Adicionalmente, a proteína E pode compreender seqüências de aminoácido dos primeiro e segundo flavivírus. Quimérico conforme usado aqui significa qualquer proteína ou ácido nucléico compreendendo seqüência de mais de um flavivírus. Conforme usado aqui, não virulento significa que o antígeno ou vacina desta invenção é incapaz de causar doença. Mais especificamente, os antígenos de proteína recombinante são isentos de contaminação por material genômico dos flavivírus que é necessário para infecção por flavivírus, replicação e patogênese.
[033] Os polipeptídeos da presente invenção podem compreender as seqüências de aminoácido definidas aqui ou aquelas que são conhecidas na técnica de proteínas prM, M e/ou E de flavivírus selecionados. Os ácidos nucléicos desta invenção podem compreender seqüência de nucleotídeo que codifica as proteínas prM, M e/ou E dos flavivírus selecionados.
[034] Os antígenos da presente invenção podem ser não conjugados ou eles podem ser conjugados a uma molécula veículo que facilita a substituição do antígeno em uma fase sólida. Uma molécula veículo é uma onde os antígenos
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 29/118 / 99 podem ser conjugados e que não reagirá com anticorpos do soro humano. Um exemplo de tal veículo é a albumina de soro bovino (BSA).
[035] Os antígenos da presente invenção podem também ser proteínas recombinantes obtidas por expressão de ácidos nucléicos codificando o antígeno em um sistema de expressão capaz de produzir o antígeno.
[036] As seqüências de aminoácido dos presentes antígenos podem conter uma porção imunoreativa do antígeno prM, M e/ou E. Estes antígenos podem ser adicionalmente adicionados às seqüências designadas para prover alguma propriedade adicional, tal como, para remover/adicionar aminoácidos capazes de ligação de dissulfeto para aumentar a reatividade de um epítopo pela provisão de uma estrutura secundária mais rígida, para aumentar sua biolongevidade ou para alterar sua citotoxicidade ou prevenir infecção. Em qualquer caso, o antígeno deve possuir imunoreatividade e/ou imunogenicidade.
Breve Descrição dos Desenhos [037] A figura 1 é uma representação esquemática do processamento da poliproteína flavivirótica. A região horizontal central provê uma representação esquemática do genoma virótico. A linha indica as regiões não traduzidas 5’ e 3’ e as regiões em caixas representam a estrutura de leitura aberta para proteínas estruturais (esquerda e topo) e não estruturais (direita e parte inferior). A clivagem pela sinalização das células hospedeiras ocorre simultaneamente com tradução na terminação C da proteína E, separando regiões estruturais e não estruturais. Uma enzima celular semelhante a “subtilase” a furina, pode ser responsável pela clivagem de prM. Domínios da transmembrana em potencial da poliproteína virótica são indicados por áreas sombreadas.
[038] A figura 2 apresenta um mapa de um genoma JEV (topo), a seqüência de DNA do oligonucleotídeo usado na reação de cadeia transcriptase-polimerase reversa (PCR) (centro) para construir a unidade transcricional para a expressão da proteína prM-E da região de codificação (parte inferior). Os domínios das transmembranas em potencial da poliproteína virótica são indicados por áreas sombreadas.
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 30/118 / 99 [039] A figura 3 mostra uma representação esquemática dos vetores de plasmídeos, pCDNA3, pCBamp, e pCIBamp, e a relação entre eles. Estes plasmídeos incluem o elemento de aumento/promotor CMV (citomegalovírus). BGHp(A) (sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino e seqüência de terminação de transcrição), gene resistente à ampicilina e ColE1 originário da replicação para seleção e manutenção em E. coli. A origem f1 da replicação para um resgate de filamento simples nas células de E. coli, origem de SV 40 da replicação (SV40 ORI), região de codificação de resistência da neomicina e seqüências SV40p(A) foram apagadas de pCDNA3 para gerar pCBamp. Uma seqüência intron foi inserida no sítio NcoI-KpnI do pCBamp para gerar o plasmídeo pCIBamp.
[040] A figura 4 mostra análises imuno-manchadas SDS-PAGE das partículas subviróticas purificadas do gradiente de sacarose a partir do fluido de cultura JE-4B COS-1 (4B, rota direita de cada par). O virion JE purificado de gradiente de densidade de JEV infectado com cultura de células C6/36 foi usado como um controle positivo (JEV, rota esquerda de cada par). JE HIAF (fluido ascítico hiperimune); 4G2, e anticorpo monoclonal anti-E. JM01, anticorpo monoclonal anti-M, NMAF (fluido ascítico de camundongo normal).
[041] A figura 5 mostra um perfil do antígeno E em uma análise do gradiente de sacarose, em uma razão de zona, preparada a partir do precipitado PEG do meio de cultura de células JE-4B com ou sem tratamento com Triton X-100.
[042] A figura 6 mostra probabilidade de peptídeo de sinalização de pCBJE114 (pCBJE) prevista pelo programa SinalP-HMM (A). A probabilidade de peptídeo de sinalização ser aperfeiçoado por alteração da seqüência da região c nas posições -4 e -2 (C-4G e G-2S) (painel B, JE-LSS-M), por encurtamento da região n (painel C, JE-SS-ORI) ou por uma combinação de ambas modificações (painel D, JE-SS-M).
[043] A figura 7 mostra representações esquemáticas de vetores de plasmídeo pCBD2-14-16 (100% DEN-2 E), pCBD2-IJ-4-3 (90% DEN-2 E: 10% JEV E) e pCB8D2-2J-2-9-1 (80% DEN-2 E: 20% JEV E). Estes plasmídeos incluem o promotor de gene precoce (CMV) de citomegalovírus humano; a seqüência de
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 31/118 / 99 sinalização de vírus JE; vírus DEN-2 prM e região de gene E (terminal amino 100%, 90% ou 80% respectivamente); vírus JE e região de gene E (nenhum, 10% ou 20% respectivamente); e sinal poli A de hormônio do crescimento bovino (BGH).
[044] A figura 8 mostra uma comparação da proteína recombinante de ligação de membrana e secretada por manchamento Western. (A) Análise do antígeno recombinante secretado seguindo precipitação PEG e extração com etanol do fluido de cultura para plasmídeos DEN-2 pCB8D2-2J-2-9-1, pCB9D21J-4-3, pCBD2-14-16 e plasmídeo de controle pEGFP. A rota 1(V), vírus DEN-2 purificado por Gold Blot (Owl Separation Systems, Portsmouth, NH). Reatividade de antígeno recombinante, secretado, de cada plasmídeo com a: antiinvólucro (E) específico MAb 1A6A-8; b: uma mistura de MAB 1A6A-8, anti-capsídio (C) específico MAb 1A2A-1, anti-soro específico para proteína (prM) de pré-membrana de vírus DEN-2 ; e c: ascítios de camundongo normal. (B) Análise de proteínas de membrana hidrófobas de célula transformadas por plasmídeo recombinante. Rota 1 (V), vírus purificado de DEN-2 manchado por Gold Blot; Rota 2 (V), reatividade de vírus purificado de DEN-2 com uma mistura de MAb 1A6A-8, MAb 1A2A-1, anti-soro específico para proteína M do vírus de DEN-2, e anti-soro para proteína prM do vírus de DEN-2. Reatividade de proteínas de membrana hidrófobas isoladas de cada linhagem de célula transformada por plasmídeo com a: MAb 1A6A-8; b: uma mistura de MAb 1A6A-8, MAb 1A2A-1, anti-soro específico para proteína M do vírus de DEN-2 e anti-soro para proteína prM do vírus de DEN-2; e c: ascítios de camundongo normal.
Descrição Detalhada da Invenção [045] A invenção abrange unidades transcricionais de ácido nucléico que codificam as proteínas antigênicas flaviviróticas tais como antígenos da proteína prM/M e E. O ácido nucléico funciona para expressar os antígenos de proteína prM/M e E quando o ácido nucléico é absorvido pela célula hospedeira apropriada, especialmente quando a célula é a célula de um indivíduo. A invenção também abrange uma vacina cujo agente ativo é a unidade
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 32/118 / 99 transcricional (TU) do ácido nucléico. A invenção adicionalmente abrange as células contendo uma TU. A invenção também abrange um processo para imunização de um indivíduo contra a infecção flavivirótica, por administração ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma vacina contendo moléculas de TU de ácido nucléico.
[046] A invenção provê um ácido nucléico isolado compreendendo uma unidade transcricional codificando uma seqüência de sinalização de uma proteína estrutural de um primeiro flavivírus e um antígeno de flavivírus imunogênico de um segundo flavivírus, onde a unidade transcricional direciona a síntese do antígeno. A invenção engloba, adicionalmente, o uso da unidade transcricional de ácido nucléico (TU) para gerar antígenos flaviróticos e os antígenos flaviviróticos produzidos apela TU de ácido nucléico. Os antígenos de flaviróticos englobados pela presente invenção incluem antígenos de flavivírus quiméricos incorporando seqüência de aminoácido de um primeiro flavivírus e pelo menos um flavivírus adicional. A invenção ainda engloba, adicionalmente, o uso de antígenos flaviróticos codificados pela TU da invenção para produzir anticorpos específicos de flavivírus e detectar a presença de anticorpos específicos de flavivírus.
[047] Em uma concretização, o ácido nucléico isolado desta invenção pode compreender uma unidade transcricional codificando uma seqüência de sinalização de vírus de encefalite japonesa.
[048] Em outra concretização, a unidade transcricional desta invenção pode codificar um antígeno de flavivírus imunogênico que pode ser de uma ou mais das seguintes flaviviroses: vírus da febre amarela, vírus serótipo 1 da dengue, vírus serótipo 2 da dengue, vírus serótipo 3 da dengue, vírus serótipo 4 da dengue, vírus de encefalite japonesa, vírus Powassan e vírus West Nile.
[049] Em outra concretização, a unidade transcricional desta invenção pode codificar um antígeno de flavivírus quimérico imonogênico que pode incluir seqüência de mais de um dos seguintes flavivírus: vírus da febre amarela, vírus serótipo 1 da dengue, vírus serótipo 2 da dengue, vírus serótipo 3 da dengue, vírus serótipo 4 da dengue, vírus de encefalite japonesa, vírus Powassan e vírus West Nile.
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 33/118 / 99 [050] Em uma concretização específica, o ácido nucléico desta invenção pode codificar uma seqüência de sinalização do vírus de encefalite japonesa e uma proteína M e uma proteína E do vírus West Nile, SLEV, YFV e/ou vírus Powassan. O ácido nucléico pode também codificar um antígeno imunogênico que pode ser uma proteína M de um flavivírus, uma proteína E de um flavivírus, ambas uma proteína M e E de um flavivírus, uma porção da proteína M de um flavivírus, uma porção de uma proteína E de um flavivírus e/ou ambas a porção de uma proteína M de um flavivírus e uma porção de uma proteína E de um flavivírus. Em uma concretização preferida, o ácido nucléico isolado codifica ambas a proteína M e a proteína E do flavivírus. Adicionalmente, o ácido nucléico da invenção pode ser DNA e pode compreender seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 42.
[051] Em outra concretização específica, o ácido nucléico desta invenção pode codificar uma seqüência de sinalização do vírus de encefalite japonesa, uma proteína M e um segundo vírus e uma proteína quimérica E formada por substituição de uma porção do ácido nucleico codificando a proteína E do segundo vírus com ácido nucléico codificando a porção correspondente da proteína E de JEV. Alternativamente, a porção da seqüência correspondendo à porção apagada da proteína E do segundo vírus pode ser substituída por outra seqüência selecionada de um terceiro vírus ou pode ser uma seqüência não virótica. A segunda proteína pode ser do vírus West Nile, SLEV, YFB, vírus Powassan e/ou um serótipo do vírus da Dengue. As proteínas E quiméricas podem incluir aquelas onde a porção terminal carbóxi pode ser de um flavivírus e o restante da proteína E quimérica de outro flavivírus. A porção de terminal carbóxi pode ser, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 ou 75% da proteína E quimérica. O ácido nucléico da invenção pode ser DNA e pode compreender a seqüência codificando proteína da seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 46. O ácido nucléico da invenção pode compreender seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 46.
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 34/118 / 99 [052] A unidade transcricional desta invenção pode também compreender uma seqüência de controle disposta apropriadamente, de modo que ela controla operativamente a síntese do antígeno. A seqüência de controle pode ser, por exemplo, o promotor precedente imediato ao citomegalovírus. O ácido nucléico desta invenção pode também compreender uma seqüência de consenso Kozak, localizada em um sítio de partida translacional para um polipeptídeo compreendendo o antígeno codificado pela unidade transcricional. A unidade transcricional desta invenção pode também compreender um terminador poli-A.
[053] A presente invenção provê, adicionalmente, uma célula compreendendo o ácido nucléico desta invenção.
[054] É também provida uma composição compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e ácido nucléico ou célula ou antígeno desta invenção. A presente invenção provê, adicionalmente, um processo para imunizar um indivíduo contra infecção por um flavivírus, compreendendo administração ao indivíduo, de uma quantidade eficaz de uma composição da invenção. Em uma concretização específica, a composição usada para imunizar um indivíduo direciona a síntese de ambas a proteína M e a proteína E de um flavivírus e uma célula dentro do corpo do indivíduo, após incorporação do ácido nucléico dentro do mesmo, secreta partículas subviróticas compreendendo a proteína M e a proteína E. Alternativamente, a composição pode compreender a proteína M e/ou a proteína E de um flavivírus ou partículas subviróticas compreendendo a proteína M e a proteína E. Nos processos desta invenção, a composição de imunização pode ser administrada ao indivíduo em uma dose simples e pode ser administrada através da via parenteral.
[055] Esta invenção provê, adicionalmente, os antígenos produzidos de ácidos nucléicos isolados desta invenção. Como um exemplo, o antígeno do segundo flavivírus codificado pela seqüência de nucleotídeo de TU pode ser a proteína M que pode ser, por exemplo, do vírus West Nile. O antígeno pode também ser proteína do vírus da dengue, vírus de encefalite de Saint Louis, vírus de encefalite japonesa, vírus Powassan e/ou vírus da febre amarela. Em uma concretização adicional, o antígeno compreende uma proteína prM/M
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 35/118 / 99 compreendendo a seqüência de sinalização de transmembrana de um primeiro flavivírus e adicionalmente a seqüência de aminoácido compreendendo o restante da proteína prM/M de um segundo flavivírus, que pode ser de vírus SLEV, JEV, YFV, WNV e/ou Powassan. A seqüência de sinalização da transmembrana de um primeiro flavivírus pode ser uma seqüência de sinalização aperfeiçoada ou modificada onde a seqüência de sinalização fornece características desejadas, tais como, probabilidade de seqüência de sinalização alta. O acompanhamento destes objetivos por desenho ou seleção pode ser feito com o uso de programas de computador de aprendizado em máquina incluindo, porém não limitado àqueles usando um modelo Markov escondido.
[056] O antígeno codificado pela seqüência de nucleotídeo de TU pode ser antígeno de vírus West Nile, antígeno de vírus da dengue, antígeno de vírus de encefalite Saint Louis, antígeno de vírus de encefalite japonesa, vírus Powassan e/ou antígeno de vírus da febre amarela.
[057] O antígeno codificado pela seqüência de nucleotídeo da TU pode também ser a proteína E, que pode ser a proteína E do vírus West Nile, vírus da dengue, vírus de encefalite de Saint Louis, vírus de encefalite japonesa, vírus Powassan e/ou vírus da febre amarela. O antígeno codificado pode também ser uma proteína E quimérica compreendendo seqüência de aminoácido selecionada de mais do que um flavivírus.
[058] Adicionalmente, o antígeno codificado pela seqüência de nucleotídeo da TU pode ser a proteína M e a proteína E, que pode ser do vírus West Nile, vírus dengue, vírus de encefalite de Saint Louis, vírus de encefalite japonesa, vírus Powassan e/ou vírus da febre amarela.
[059] Conforme usado aqui, a proteína M ou proteína pr/M ou proteína prM/M significa uma proteína M de flavivírus ou proteína prM de flavivírus. Exemplos incluem, porém não estão limitados às proteínas prM compreendendo uma seqüência de aminoácido de uma ou mais proteínas prM de flavivírus, as proteínas M não compreendendo a seqüência de aminoácido adicional e proteínas compreendendo seqüências de aminoácido adicionais que são processadas in vitro ou in vivo para gerar a proteína M madura.
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 36/118 / 99 [060] Como usado aqui, “unidade transcricional de ácido nucléico”, ou molécula de unidade transcricional de ácido nucléico” se refere ao ácido nucléico codificando um ou mais genes especificados. A TU possui a atividade biológica que, após ter sido introduzida em uma célula adequada, o ácido nucléico induz a biosíntese de um ou mais produtos de gene especificados codificados pelo ácido nucléico. O(s) produto(s) do gene é (são) outras macromoléculas biológicas, tais como proteínas, não quimicamente relacionadas para a TU. A TU do ácido nucléico induz a célula a empregar seus componentes celulares para produzir o produto ou produtos do gene pelo ácido nucléico da TU. Embora qualquer ácido nucléico possa servir como uma TU, em uma concretização preferida, a TU é o DNA de um plasmídeo ou vetor similar, onde o plasmídeo ou vetor compreende as seqüências de codificação dos genes marcadores ou outras construções de seqüências que facilitam o uso da TU para experimentação e biosíntese.
[061] Como usado aqui, uma “seqüência de controle” é uma seqüência de nucleotídeo reguladora incorporada dentro da TU que interage com os componentes celulares apropriados da célula e conduz a biosíntese melhorada ou ativada dos produtos do gene codificados pela TU. Assim, uma seqüência de controle adequada é uma com a qual os componentes da célula possuem a capacidade de interagir, resultando em síntese estimulada do produto do gene. Quando operavelmente disposto em um ácido nucléico com relação a uma seqüência de codificação específica, uma seqüência de controle efetivamente controla a expressão do ácido nucléico especificado para produzir o produto de gene.
[062] Como usado aqui, um “promotor” é uma seqüência de nucleotídeo em uma TU que serve como seqüência de controle.
[063] Como usado aqui, uma seqüência Kozak ou seqüência de consenso Kozak é uma seqüência de nucleotídeo no sítio de partida de tradução que otimiza a tradução de mRNAs eucarióticos (Kozak, Mol. Cell. Biology 9: 51345142 (1989)).
[064] Como usado aqui, um “terminador” é uma seqüência de nucleotídeo estendida, que atua para induzir poliadenilação na terminação 3’ do mRNA
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 37/118 / 99 maduro. Uma seqüência do terminador é encontrada após, ou à jusante, uma seqüência de codificação específica.
[065] Como usado aqui, uma “célula” é um procariótico ou célula procariótica compreendendo uma TU codificando um ou mais produtos de genes, ou no qual tal TU tenha sido introduzida. Assim uma célula protege uma substância estranha ou heteróloga, a TU que é naturalmente ou inerentemente encontrada nela como um componente. Uma célula adequada é uma que possui a capacidade para a biosíntese dos produtos genes como uma conseqüência da introdução do TU. Em particular, uma célula adequada é uma que responde à seqüência de controle e a uma seqüência do terminador, qualquer que possa estar incluída dentro da TU. Em concretizações importantes da presente invenção, a célula é uma célula de mamífero. Especificamente em concretizações importantes desta invenção, a célula é uma célula que ocorre naturalmente no corpo de um ser humano ou não humano ao qual a TU tenha sido administrada como componente de uma vacina. Alternativamente, em aplicações analíticas ou diagnósticas, incluindo preparação de antígeno para uso como uma vacina ou em ensaios imunodiagnósticos ou para fins demonstrativos, a célula pode ser uma célula de humano ou não humano cultivada in vitro.
[066] Como usado aqui, uma “vacina” ou uma “composição para a vacinação de um indivíduo” específica para uma patogênese particular, se refere a preparação, a qual, quando administrada a um indivíduo, permite uma resposta imunogênica no indivíduo. Como usado aqui, uma resposta “imunogênica” é uma que confere ao indivíduo imunidade de proteção contra a patogênese. Sem desejar estar ligado a qualquer teoria, acredita-se que uma resposta imunogênica pode surgir da geração ou neutralização de anticorpos (isto é, resposta imune humoral) ou a partir de células citotóxicas do sistema imunológico, (isto é, resposta imune celular) ou ambas. Como usado aqui, um “antígeno imunogênico” é um antígeno que leva a uma resposta imunogênica quando é introduzido em um indivíduo, ou quando ele é sintetizado dentro da célula de um hospedeiro ou um indivíduo. Como usado aqui, uma “quantidade eficaz” de uma vacina ou de uma composição de vacinação é, uma quantidade que, quando administrada a um
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 38/118 / 99 indivíduo, suficiente para conferir imunidade de proteção ao indivíduo. Historicamente, a vacina tem sido entendida como contendo como princípio ativo uma ou mais estruturas ou componentes moleculares específicos que incluem o agente patogênico, especialmente sua superfície. Tais estruturas podem incluir componentes de superfície tais como proteínas, carboidratos complexos, e/ou lipídios complexos que comumente são encontrados em organismos patogênicos. [067] Como usado aqui, entretanto, é para ser salientado que o termo “vacina” ou “composição para a vacinação de um indivíduo” estende-se ao significado convencional resumido no parágrafo precedente. Como usado aqui, estes termos também se referem à TU da presente invenção ou às composições contendo a TU. A TU induz a biosíntese de um ou mais produtos de genes especificados codificados pela TU dentro das células do indivíduo, onde os produtos dos genes são proteínas antigênicas específicas do agente patogênico. Os antígenos biosintéticos servem, então, como um imunogênio. Como já observado, a TU, e conseqüentemente a vacina, podem ser qualquer ácido nucléico que codifica os antígenos imunogênicos específicos. Em uma concretização preferida desta invenção, a TU da vacina é um DNA. A TU pode incluir um plasmídeo, ou um vetor incorporando genes adicionais, ou seqüências particulares para a conveniência dos versados na técnica da biologia molecular, biologia das células, e imunológica virótica (Vide Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989; e Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e outros John Wiley and Sons, New York 1987 (atualizado trimestralmente), os quais são incorporados aqui por referência).
[068] As moléculas da TU da presente invenção compreendem ácidos nucléicos ou derivados de ácidos nucléicos, possuindo seqüências de nucleotídeos codificam os produtos de gene específico relacionados às proteínas antigênicas da flavivirose tais como, porém não limitados a WNV, JEV, vírus da dengue, vírus da febre amarela e SLEV. Embora qualquer ácido nucléico possa servir como uma TU em uma importante concretização, a TU é um DNA. Alternativamente, os ácidos nucléicos podem ser moléculas de RNA. Eles
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 39/118 / 99 também podem ser um de diversos derivados de DNA ou RNA possuindo uma estrutura de ligações fosfodiéster que foi quimicamente modificada para aumentar a estabilidade da TU como um agente farmacêutico. Modificações assim previstas incluem, mas não são limitadas a derivados fosforotioato ou derivados fosfonato. Estes e outros exemplos de derivados são bem conhecidos dos versados na técnica da química do ácido nucléico.
[069] O genoma de JEV foi caracterizado e sequenciado (figuras 1 e 2). A proteína estrutural M é expressa como uma porção da poliproteína que inclui uma seqüência pre-M (pr). Esta seqüência pr, imediatamente de terminal amino para a seqüência de proteína M, previne problemas de conformação no processamento da poliproteína. Especificamente, a presença da seqüência pr é importante para prevenir deformação da proteína E. Assim, a presença de prM segue para montagem das partículas JEV. Uma vez que o virion ou partícula esteja formado, a seqüência pr pode ser clivada da proteína prM para render partículas de vírus maduras contendo proteínas M, embora a clivagem da proteína prM para render a proteína M não seja necessária para produzir partículas infecciosas. As seqüências prM de muitas flaviviroses diferentes correlatas são clivadas porém a uma determinada extensão, porém as flaviviroses propriamente, não obstante, são infecciosas. Exemplos de tais flaviviroses correlatas com estruturas genômicas semelhantes e funções incluem, porém não estão limitadas a WNV, YFV, vírus da dengue e SLEV.
[070] Em uma concretização, a TU codificando proteínas de flavivírus M e E na presente invenção é DNA. De acordo com a discussão nos parágrafos precedentes, este DNA compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a proteína M, compreendendo a pré-seqüência M e uma seqüência de nucleotídeo codificando a proteína E. Deste modo os produtos de genes pretendidos são capazes de formar partículas subviróticas dentro da célula. A seqüência de pre-M pode então ser clivada em um modo análogo aquele que ocorre com relação aos virions repletos.
[071] De maneira a funcionar efetivamente in vivo como uma vacina, é vantajoso incluir dentro da TU uma seqüência de controle que possui o efeito de
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 40/118 / 99 aumentar ou promover a transcrição das seqüências de nucleotídeo codificando os antígenos. Uso de tais promotores é em conhecido daqueles técnicos no campo da biologia molecular, biologia das células, e imunologia virótica (Vide Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Ed. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, e Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e outros John Wiley and Sons, New York 1987 (atualizada trimestralmente)). Quando a TU é usada como uma vacina em um hospedeiro mamífero, o promotor a ser empregado é preferivelmente um que opera efetivamente em células mamíferas. Tal promotor é disposto com relação às seqüências de codificação das quais a transcrição deve ser promovida, na qual ele pode operavelmente promover tal transcrição. Em uma concretização significativa da presente invenção, este promotor é o promotor precoce do citomegalovírus. Adicionalmente, em uma concretização preferida adicional da invenção, as seqüências de codificação são seguidas, na TU do ácido nucléico, por uma seqüência terminadora (Sambrook e outros). Concretizações particulares da invenção relatam ambas as células procariótica e eucariótica. Muitas seqüências promotoras são conhecidas, as quais são úteis em ambas as células procariótica e eucariótica. (Vide Sambrook e outros).
[072] Os ácidos nucléicos da invenção podem incluir, adicionalmente, seqüências de DNA conhecidas dos versados na técnica para agirem como elementos imunoestimulatórios. Exemplos de tais elementos incluem, porém não estão limitados a, determinados motivos CpG no DNA bacteriano (Sato e outros, Science 273: 352-354 91996); Linman e outros, Vaccine 17: 19-25 (1998)).
[073] Preparação da TU da invenção é prontamente acompanhada pelos processos bem conhecidos pelos versados na técnica no campo da biologia molecular. Procedimentos envolvidos são demonstrados, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, e Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e outros John Wiley and Sons. New York 1987 (atualizado trimestralmente). A molécula RNA flavivirótica pode ser isolada a partir da amostra do vírus vivo pelos métodos amplamente
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 41/118 / 99 conhecidos dentre os virologistas familiarizados com flaviviroses, por exemplo e com outros grupos de viroses. Os processos usados com JEV são resumidos em Kuno e outros (J. Virol. 72: 73-83 (1998)). O RNA é usado como um gabarito para a síntese de cDNA usando transcriptase reversa. A partir do cDNA, um fragmento contendo a pré-M através da região de codificação E ( Figura 2) pode ser obtido por digestão com nucleases de restrição conhecidas para clivar o cDNA apropriadamente para prover tais fragmentos. Exemplos de digestão de restrição do JEV são providos em Nitayaphan e outros (1990) e Konishi e outros (1991). Incorporação de promotores, tais como promotores citomegalovírus, seqüências para promover tradução eficiente tais como, seqüência Kozak e do sinal de poliadenilação, é do mesmo modo bem conhecido aos praticantes versados em biologia molecular e engenharia do DNA recombinante. (Kozak, Mol.Cell. Biology 9: 5134-5142 (1989); Azevedo e outros, Braz, J. Med. Biol. Res. 32: 147-153 91999)). Quando um ácido nucléico compreendendo ma TU contendo as seqüências de codificação desejadas e seqüências de controle é preparado, ele pode ser obtido em largas quantidade pelos processos que ampliam o ácido nucléico. Tais métodos são largamente conhecidos pelos versados na técnica em biologia molecular e engenharia de DNA recombinante. Exemplos destes processos incluem incorporação de ácido nucléico em um plasmídeo para replicação por cultivo em uma célula, tal como uma célula procariótica e colhendo o plasmídeo após completar a cultura, bem como a ampliação do ácido nucléico pelos métodos, tais como PCR e outros protocolos de ampliação, são bem conhecidos na técnica. Estes exemplos não se destinam a limiar os modos nos quais o ácido nucléico contendo a TU pode ser obtido.
[074] As moléculas de ácido nucléico contendo TU da presente invenção podem ser introduzidas em células apropriadas em muitas maneiras apropriadas bem conhecidas pelos técnicos no campo da biologia molecular e imunologia virótica. Por meio do exemplo, estes incluem, mas não estão limitados a, incorporação em um plasmídeo ou vetor de ácido nucléico similar que é absorvido pelas células, ou encapsulamento dentro das estruturas de lipídeos vesiculares tais como lipossomas, especialmente lipossomas compreendendo
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 42/118 / 99 lipídeos catiônicos, ou absorção de partículas que são incorporadas em células por endocitose.
[075] Em geral, a célula desta invenção é uma célula procariótica ou eucariótica compreendendo uma TU ou na qual uma TU tenha sido introduzida. A TU da presente invenção induz a biosíntese intramolecular dos antígenos codificados prM/M e E. Uma célula adequada é uma que tenha a capacidade para a biosíntese dos produtos do gene como uma conseqüência da introdução do ácido nucléico. Nas concretizações específicas da invenção, uma célula adequada é uma que responde à seqüência de controle e à seqüência do terminador, caso haja, que pode ser incluída dentro da TU. De maneira a responder nesta forma, tal como célula contendo nela seus componentes os quais interagem com a seqüência de controle e com um terminador e atuam para realizar as respectivas funções de promoção e terminação. Quando a célula é cultivada in vitro, ela pode ser uma procariote, uma eucariote de célula simples ou uma célula de multicelular eucariote. Nas concretizações específicas da presente invenção, a célula é uma célula de mamífero. Nestes casos, os produtos do gene da proteína prM/M e E estão disponíveis para uso em aplicações analíticas ou de diagnósticos incluindo preparação de antígeno para uso como uma vacina ou nos ensaios imunodiagnósticos ou para fins demonstrativos.
[076] Em algumas circunstâncias, tais como, quando a célula é uma célula de mamífero cultivada, os antígenos de prM/M e E são secretados na forma de partículas subviróticas. Estes são agregados de proteínas prM/M e E que lembram vírus vivos na morfologia ultraestrutural da superfície e propriedades imunogênicas. Desde que a TU da invenção não inclua o restante do genoma flavivirótico, contudo, não há capsídio incorporado e de modo mais importante, nenhum RNA virótico infeccioso.
[077] Em outra concretização importante desta invenção, a célula é um componente celular natural do indivíduo ao qual a TU tenha sido administrada como uma vacina. A TU, quando assim administrada a um indivíduo, é absorvida pelas células do indivíduo. As células do indivíduo possuem a capacidade de responder a quaisquer seqüências promotoras e terminadoras, se presente. Em
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 43/118 / 99 qualquer caso, a TU induz as células do indivíduo a sintetizar produtos do gene prM/M e E flavivirótico. Sem desejar ser confinado pelas considerações teóricas, acredita-se que as células do indivíduo produzem partículas subviróticas in vivo consistindo em antígenos prM/M e E, justamente conforme foi verificado como ocorrendo com as células de mamífero cultivadas in vitro. Acredita-se que tais partículas subviróticas, então servem como um imunogênico in vivo, estimulando o sistema imunológico do indivíduo a gerar respostas imunológicas que conferem imunidade de proteção ao indivíduo. Novamente sem desejar ser limitado pela teoria, a imunidade de proteção resultante pode surgir tanto via imunidade celular ou humoral, isto é, tanto via um mecanismo restrito da classe I ou da classe II MHC, respectivamente, ou por ambos os mecanismos.
[078] De acordo com a invenção, os indivíduos podem ser imunizados contra infecções por flaviviroses tais como vírus JEV, YFV, dengue, SLEV e WNV ou outras flavoviroses por administração aos mesmos de uma quantidade eficaz de um ácido nucléico compreendendo TU que codifica antígenos prM e/ou E. O ácido nucléico, após ser incorporado nas células do indivíduo, leva a síntese dos antígenos prM/M e ou E flaviviróticos.
[079] De maneira a administrar a TU ao indivíduo, ela é incorporada na composição que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo farmaceuticamente aceitável significa um material que não é biológica ou de outra forma indesejável, isto é, o material pode ser administrado ao indivíduo juntamente com o material imunogênico (isto é, antígenos de proteína de flavivírus recombinante ou porções dos mesmos) sem causar quaisquer efeitos biológicos indesejados ou interagir em uma maneira prejudicial com qualquer dos outros componentes da vacina onde está contido. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis ou componentes dos mesmos, incluem água, salmoura fisiológica e tampões fisiológicos comuns (para exemplos adicionais, vide Arnon, R. (Ed.) Synthetic Vaccines I: páginas 83-92, CRC Press, Inc., Boca Raton, Flórida, 1987).
[080] É entendido pelos versados na técnica que o valor importante na descrição da dose de vacinação é a quantidade total de imunogênio necessária
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 44/118 / 99 para promover uma resposta protetora em um hospedeiro que é submetido a doença infecciosa causa por infecção de flavivírus do tipo selvagem ou virulento. O número e volume de doses usadas pode variar e são determinados pelo médio com base em parâmetros, tais como, idade, peso, gênero, espécies, tipo de vacina a ser administrada, modo de administração, condições totais do indivíduo, etc., bem como outros fatores importantes reconhecidos pelos versados na técnica.
[081] A TU pode ser dministrada a um indivíduo oral, parenteral (por exemplo, intravenosamente), por injeção intramuscular, por injeção intraperitoneal, transdérmica, extracorpórea, intranasal, topicamente ou semelhantes. A liberação pode também ser diretamente para qualquer área do sistema respiratório (por exemplo, pulmões) através de intubação. A quantidade exata de TU necessária variará de indivíduo a indivíduo, dependendo da espécie, idade, peso e condição geral do indivíduo, a imunogenicidade da vacina usada, a cepa ou espécies de flavivírus contra as quais o indivíduo está sendo imunizado, o modo de administração e semelhantes. Assim, não é possível especificar uma quantidade exata para cada concretização da presente invenção. Contudo, uma quantidade apropriada pode ser determinada por um dos versados na técnica usando apenas experimentação de rotina dado aos ensinamentos aqui e que está disponível na técnica.
[082] A administração parenteral da vacina da presente invenção, caso usada, é geralmente caracterizada por injeção. Injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, tanto como soluções líquidas ou suspensões, formas sólidas apropriadas para solução ou suspensão no líquido antes da injeção ou como emulsões. Uma abordagem mais recentemente revista para administração parenteral envolve o uso de uma liberação lenta ou sistema de liberação contínua, tal que uma dosagem constante é mantida. Vide, por exemplo, Patente US número 3.610.795, que é incorporada aqui como referência.
[083] Para composições sólidas, veículos não tóxicos convencionais incluem, por exemplo, classificações farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio e semelhantes. Composições líquidas farmaceuticamente
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 45/118 / 99 administráveis podem, por exemplo, ser preparadas por dissolução, dispersão, etc. de um composto ativo conforme descrito aqui, e coadjuvantes farmacêuticos em um excipiente, tal como, por exemplo, água, salmoura, dextrose aquosa, glicerol, etanol e semelhantes para assim formar uma solução ou suspensão. Caso desejado, a composição farmacêutica a ser administrada pode também conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como, agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH e semelhantes, por exemplo, estearato de sódio, monolaurato de sorbitan, acetato de trietanolamina de sódio, oleato de trietanolamina, etc. Modos reais de preparação de tais formas de dosagem são conhecidos, ou serão aparentes, aos versados na técnica; por exemplo, vide Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W. (ed.), última edição, Mack Publishing Co., Easton, PA).
[084] Em uma concretização, a TU desta invenção pode ser administrada ao indivíduo por uso de liberação de gene in vivo mediada por eletrotransferência, onde seguindo-se imediatamente a administração da TU ao indivíduo, os pulsos elétricos transcutâneos aplicados ao indivíduo, provendo maior eficácia e reprodutividade de transferência de ácido nucleico in vivo para o tecido do indivíduo (Mir e outros, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 4262-4267 (1999)).
[085] Nos processos da presente invenção que descrevem a imunização de um indivíduo por administração de uma vacina desta invenção ao indivíduo, a eficácia da imunização pode ser monitorada de acordo com os protocolos clínicos bem conhecidos na técnica por controle do estado imune do paciente.
[086] Uma quantidade eficaz de uma composição de vacinação é prontamente determinada pelos versados como sendo uma quantidade que, quando administrada ao indivíduo, confere imunidade de proteção ao indivíduo. De maneira a entender tal determinação, os versados na técnica podem avaliar a capacidade para induzir os anticorpos específicos E- e prM/M de flavivírus e/ou linfócitos T citotóxicos específicos E- e prM/M- presentes no sangue de um indivíduo ao qual a vacina tenha sido administrada. Pode-se também determinar o nível de imunidade protetora conferido a um indivíduo de experimento por desafiar o mesmo com o flavivírus vivo correspondente à composição antigênica
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 46/118 / 99 usada para imunizar o indivíduo de experimento. Tais experimentos de desafio são bem conhecidos pelos versados na técnica.
[087] Em geral, de maneira a imunizar um indivíduo contra infecções por WNV, JEV, YFV, vírus da dengue, SLEV ou outras flaviviroses, de acordo com a presente invenção, e reconhecendo que as moléculas das TUs empregadas em tais processos podem possuir tamanhos totais variados, doses variando de cerca de 0.1 pg/kg de peso corpóreo a cerca de 50 pg/kg de peso corpóreo podem ser usadas.
[088] Foi verificado, inesperadamente que a TU da presente invenção que é um DNA confere imunidade de proteção a um nível de eficácia de aproximadamente 100% após a administração de somente uma dose efetiva simples da TU por injeção i.m. ou por eletrotransferência. Isto é um contraste aos muitos processos de imunização realizados usando as vacinas convencionais (como descrito acima), que freqüentemente requerem um ou mais vacinações de reforço e que não conferem imunidade de proteção em uma eficácia próxima de 100%.
[089] Tem sido adicionalmente verificado, inesperadamente, que a imunidade de proteção pode ser transmitida a partir da fêmea vacinada para a descendência do indivíduo. Uma proporção significante de camundongos no período neonatal foi mostrada sendo protegida contra desafio virótico após suas mães terem sido vacinadas usando o DNA da TU da invenção. Sem desejar ser limitado pela teoria, é conhecido que a imunidade passiva pode ser conferida aos mamíferos neonatais devido à presença no leite materno dos anticorpos específicos para várias patogenias. É possível que a imunidade de proteção contra JEV encontrada nos neonatais tenha sido transmitida aos mesmos deste modo.
[090] Em outra concretização da invenção, a TU codifica uma seqüência de sinalização de uma proteína estrutura de um primeiro flavivírus e um antígeno de flavivírus imunogênico de um segundo flavivírus. Assim, em uma concretização, por exemplo, a seqüência de sinalização da proteína estrutural de um primeiro flavivírus é substituída por uma seqüência de sinalização da proteína estrutural de um segundo flavivírus, que resulta em multiplicação apropriada do polipeptídeo
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 47/118 / 99 nascente, processamento apropriado em um hospedeiro e/ou multiplicação apropriada da proteína processada.
[091] Em outra concretização da invenção, a TU pode codificar um antígeno de flavivírus imunogênico onde o antígeno compreende a seqüência de um ou mais de um flavivírus. A seqüência de sinalização pode ser um peptídeo de sinalização aperfeiçoado. O aperfeiçoamento das seqüências de sinalização ou seleção de mais seqüências de sinalização ótimas, pode ser obtido por aplicação dos princípios e técnicas ensinados no Exemplo 18 e referências citadas aqui, cada uma das quais é incorporada aqui por referência aos ensinamentos expressos em cada um de seleção, identificação e projeto das seqüências de sinalização com as propriedades e funções desejadas. De modo geral, estas propriedades desejadas e funções incluirão uma probabilidade de seqüência de sinalização alta.
[092] Em outra concretização da invenção, mais de uma TU ou uma TU codificando um antígeno de flavivírus imunogênico de mais de um flavivírus é incluída em uma composição simples. Assim, em uma concretização, por exemplo, uma TU pode codificar um polipeptídeo nascente ou polipeptídeos que são processados em proteínas de mais de um flavivírus. Preferivelmente, as proteínas processadas formam partículas subviróticas que promovem uma resposta imunológica contra as proteínas. As partículas subviróticas podem ser formadas de proteínas processadas derivadas da seqüência dos mesmos flavivírus, uma combinação de flavivírus ou proteínas de flavivírus quiméricas. Vacinas de combinação, compreendendo mais do que uma TU ou uma TU codificando um antígeno de flavivírus imunogênico de mais do que um flavivírus podem ser talhadas par uso em regiões geográficas específicas, por inclusão de proteínas de flavivírus endêmicos à região ou de outra forma semelhante para serem encontradas. Por exemplo, uma vacina para Ásia subtropical e tropical pode incluir TU(s) que codificam proteínas de quatro serótipos de vacinas de vírus DEN, WN e JE. Vacinas similarmente úteis para a África e América Latina incluiriam TU(s) que codificam proteínas de quatro serótipos de vírus da DEN, WN e YF e os quatro serótipos dos vírus da DEN, Rocio e YF, respectivamente.
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 48/118 / 99 [093] Em outra concretização, a TU codifica uma seqüência de sinalização de uma proteína estrutural de um primeiro flavivírus e um antígeno de flavivírus quimérico imunogênico que inclui seqüência de aminoácido de mais de um flavivírus. A seqüência de sinalização pode ser uma seqüência de sinalização de vírus de encefalite japonesa. O antígeno de flavivírus quimérico pode incluir seqüência de um antígeno de vírus de encefalite japonesa. Em determinadas concretizações, o antígeno quimérico é uma proteína E. A porção terminal carbóxi da proteína E pode ser uma seqüência de proteína E do vírus da encefalite japonesa. A porção terminal carbóxi pode ser, por exemplo, 5, 10, 15 20, 25, 30, 40, 50 ou 75% da proteína E quimérica. Em uma concretização preferida, a TU codifica uma seqüência de sinalização de uma proteína estrutural do vírus da encefalite japonesa, uma proteína prM de um vírus da Dengue e uma seqüência contendo proteína E quimérica do vírus da encefalite japonesa e vírus da Dengue. A proteína quimérica pode ser uma proteína E onde a porção terminal carbóxi compreende seqüência de vírus da encefalite japonesa. Exemplos de TUs incluem seqüências de ácido nucléico mostradas na SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 46 que podem direcionar a síntese dos antígenos de flavivírus tal como mostrado na SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 47.
[094] A presente invenção adicionalmente provê composições imunogênicas compreendendo os polipeptídeos desta invenção em um veículo farmacêutico aceitável, para uso como uma vacina de proteína. Os antígenos produzidos das unidades transcricionais da presente invenção podem ser usados para promover as respostas imunes eficazes em um indivíduo. Os antígenos para esta finalidade pode compreender proteína prM de flavivírus, proteína E de flavivírus ou qualquer combinação das mesmas, incluindo fragmentos imunogênicos das proteínas. Uma concretização especificamente preferida é usar o RNA descrito aqui. Uma concretização adicionalmente preferida é uma proteína quimérica compreendendo a seqüência de sinalização do flavivírus e a(s) proteína(s) estrutural(is) de uma ou mais flaviviroses. Em uma concretização especificamente preferida, a seqüência de sinalização do antígeno é a seqüência de sinalização do vírus da encefalite japonesa. Em outras concretizações
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 49/118 / 99 preferidas, a seqüência de sinalização é um peptídeo de sinalização aperfeiçoado. O aperfeiçoamento das seqüências de sinalização ou seleção de mais seqüências de sinalização ótimas, pode ser realizado por aplicação dos princípios e técnicas ensinados no Exemplo 18 e referências citadas aqui, cada uma sendo incorporada como referência para os ensinamentos expressos em cada uma, relacionados a seleção, identificação e desenho das seqüências de sinalização com as propriedades desejadas e função. De modo geral, estas propriedades desejadas e funções incluirão uma probabilidade de seqüência de sinalização alta.
[095] Em outras concretizações, a vacina de proteína desta invenção compreende, adicionalmente, um coadjuvante apropriado. Conforme usado aqui, um codjuvante é um potencializador ou melhorador da resposta imune. O termo apropriado significa a inclusão de qualquer substância que possa ser usada em combinação com o imunogênio da vacina (isto é, proteína prM de flavivírus, proteína M de flavivírus, proteína E de flavivírus ou qualquer combinação destas) para aumentar a resposta imune, sem produzir reações adversas no indivíduo vacinado. Quantidades eficazes de um coadjuvante específico podem ser prontamente determinadas, de modo a otimizar o efeito de potencialização do coadjuvante na resposta imune de um indivíduo vacinado. Em uma concretização preferida, o coadjuvante das vacinas desta invenção é um processo de dois estágios, utilizando primeiro uma solução de hidróxido de alumínio e então um óleo mineral. Nas concretizações específicas, coadjuvantes apropriados podem ser escolhidos do grupo que se segue: óleo mineral, vegetal ou de peixe com emulsões aquosas, coadjuvante de Freund incompleto, E.coli J5, sulfato de dextrano, óxido de ferro, alginato de sódio, Coadjuvante Bacto, determinados polímeros sintéticos, tais como, Carbopol (BF Goodrich Company, Cleveland, Ohio), poli-aminoácidos e copolímeros de aminoácidos, saponina, carragena, REGRESSIN (Vetrepharm, Atenas, GA), AVRIDINE (N,N-dioctadecil-N',N'bis(2-hidróxietil)-propanodiamina), polímeros de mamíferos ligados β (1,4) polidispersos de cadeia longa interpostos com grupos O-acetilados (por exemplo, ACEMANNAN), extratos de parede de célula purificados altamente desproteinizados derivados de cepa não patogênica de espécies de Micobacterium
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 50/118 / 99 (por exemplo, EQUIMUNE, Vetrepharm Research Inc., Atenas, GA), monooleato de manita, óleo de parafina e dipeptídeo de muramila.
[096] Em outro aspecto, esta invenção provê um processo para imunização de indivíduos com quantidades imunogênicas da vacina de proteína da invenção para promover uma resposta imune eficaz no indivíduo. A imunização pode ser realizada oral, parenteral, intranasal, intratraqueal, intramuscular, intramamária, subcutânea, intravenosa e/ou intradermicamente. A vacina contendo a proteína prM de flavivírus, proteína M de flavivírus e/ou proteína E de flavivírus pode ser administrada por injeção, por inalação, por ingestão ou por infusão. Uma dose simples pode ser fornecida e/ou doses repetidas de preparações de vacina, isto é, reforçadoras podem ser administradas em intervalos de tempo periódicos para melhorar a resposta imune inicial ou após um longo período de tempo, desde a última dose. O intervalo de tempo entre as vacinações pode variar, dependendo da idade e condições do indivíduo.
[097] O termo quantidade imunogênica significa uma quantidade de um imunogênio ou uma porção do mesmo, que é suficiente par induzir uma resposta imune em um indivíduo vacinado e que protege o indivíduo contra doenças causadas por infecções de flavivírus virulento ou do tipo selvagem mediante exposição ao mesmo ou que tenha um efeito terapêutico ou comercialmente benéfico que diminua o efeito da infecção de flavivírus no indivíduo vacinado.
[098] A invenção adicionalmente provê um anticorpo produzido em resposta a imunização por antígeno desta invenção. Os anticorpos da presente invenção podem incluir anticorpos policlonais e monoclonais que podem ser moléculas de imunoglobulina intactas, moléculas de imunoglobulina quimérica, anticorpos humanizados, ou fragmentos de Fab ou F(ab')2. Tais anticorpos e fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por técnicas bem conhecidas na arte que incluem aquelas descritas em Harlow e Lane (Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989) e Kohler e outros (Nature 256:495-97, 1975) e Patentes US 5.545.806, 5.569.825 e
5.625.126, incorporadas aqui como referência. Os anticorpos podem ser de qualquer isotipo IgG, IgA, IgD, IgE e IgM.
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 51/118 / 99 [099] A presente invenção pode também incluir anticorpos de cadeia simples (ScFv), compreendendo domínios ligados Vh e Vl e que retêm a conformação e atividade de ligação específica do idiotipo nativo do anticorpo. Tais anticorpos de cadeia simples são bem conhecidos na técnica e podem ser produzidos por processos padrão. (Vide, por exemplo, Alvarez e outros, Hum. Gene. Ther. 8:229-242 (1997)).
[0100] Os anticorpos podem ser produzidos contra antígenos desta invenção que são sintetizados de seqüências de ácido nucléico codificando seqüências de aminoácido imunogênico de antígenos de prM, M e/ou E de um ou mais flavivírus e a seqüência de sinalização de um flavivírus diferente (por exemplo, JEV). Os peptídeos imunogênicos sintetizados do uso destas construções quiméricas podem facilmente ser identificados por uso de processos bem conhecidos na técnica para identificar regiões imunogênicas em uma seqüência de aminoácido e usados para produzir os anticorpos desta invenção.
[0101] As condições pelas quais um complexo de antígeno/anticorpo pode ser formado, bem como ensaios para a detecção da formação de um complexo de antígeno/anticorpo e quantificação desta proteína são padrão na técnica. Tais ensaios podem incluir, porém não estão limitados a manchamento Western, imunoprecipitação, imunofluorescência, imunocitoquímica, imunohistoquímica, classificação de célula ativada por fluorescência (FACS), hibridização de fluorescência in situ (FISH), ensaios imunomagnéticos, ELISA, ELISPOT (Coligan e outros, eds. 1995. Current Protocols in Immunology. Wiley, New York), ensaios de aglutinação, ensaios de floculação, lavagem da célula, etc. são bem conhecidos dos versados na técnica.
[0102] Conforme usado aqui, o termo ligação significa a ligação bem caracterizada do anticorpo ao antígeno, bem como outra associação não aleatória com um antígeno. Especificamente ligado conforme usado aqui, descreve um anticorpo ou outro ligando que não cruza reação substancialmente com qualquer outro antígeno que não o especificado, que neste caso é um antígeno desta invenção.
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 52/118 / 99 [0103] O anticorpo ou ligante desta invenção pode ser ligado a um substrato (por exemplo, contas, tubos, slides, placas, folhas de nitrocelulose, etc.) ou conjugado com uma porção detectável ou ambos, ligado e conjugado. As porções detectáveis contempladas para a presente invenção podem incluir, porém não estão limitadas a porção imunofluorescente (por exemplo, fluoresceína, rodamina), uma porção radioativa (por exemplo, 32P, 125I, 35S), uma porção de enzima, (por exemplo, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina), uma porção de ouro coloidal e uma porção de biotina. Tais técnicas de conjugação são padrão na arte (por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); Yang e outros, Nature 382: 319-324 (1996)).
[0104] A presente invenção provê, adicionalmente, um processo para detectar anticorpo de flavivírus em uma amostra compreendendo contato da amostra com o antígeno de flavivírus da presente invenção, sob condições pelas quais um complexo de antígeno/anticorpo pode ser formado; e detecção da formação do complexo, desta forma detectando o anticorpo de flavivírus na amostra.
[0105] A presente invenção provê, adicionalmente, um processo para detectar antígeno de flavivírus em uma amostra compreendendo contato da amostra com um anticorpo desta invenção, sob condições pelas quais um complexo de antígeno/anticorpo pode ser formado; e detecção da formação do complexo, pelo que, detectando o antígeno de flavivírus na amostra.
[0106] O processo de detecção do antígeno de flavivírus em uma amostra pode ser realizado, por exemplo, por contato de uma amostra de tecido ou fluido de um indivíduo com um anticorpo desta invenção e detecção da ligação do anticorpo ao antigeno. É contemplado que o antígeno estará em um vírus de flavivírus intacto, será uma proteína codificada por flavivírus revelada na superfície da célula infectada com flavivírus expressando o antígeno ou será um fragmento de antígeno. Uma amostra de fluido deste processo pode compreender qualquer fluido biológico que conteria o antígeno ou célula contendo o antígeno, tal como, fluido cerebroespinhal, sangue, biles, plasma, soro, saliva ou urina. Outros exemplos possíveis de fluidos corpóreos incluem escarro, muco e semelhante.
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 53/118 / 99 [0107] O processo para detecção de anticorpo de flavivírus em uma amostra pode ser realizado, por exemplo, por contato de um fluido ou amostra de tecido de um indivíduo com um antígeno desta invenção e detectando a ligação do antígeno ao anticorpo. Uma amostra de fluido deste processo pode compreender qualquer fluido biológico que contenha o anticorpo, tal como, fluido cerebroespinhal, sangue, biles, plasma, soro, saliva ou urina. Outros exemplos possíveis de fluidos corpóreos incluem escarro, muco e semelhante.
[0108] Os imunoensaios de enzima, tais como, ensaios de imunofluorescência (IFA), ensaios de imunosorvente ligado a enzima (ELISA) e imunomanchamento podem ser prontamente adaptados para acompanhar a detecção dos anticorpos de flavivírus de acordo com os processos desta invenção. Um processo ELISA eficaz para detecção dos anticorpos pode, por exemplo, ser como se segue: (1) ligação do antígeno a um substrato; (2) contato do antígeno ligado com um fluido ou amostra de tecido contendo o anticorpo; (3) contato do acima com uma ligação de anticorpo secundário para uma porção detectável que é reativa com o anticorpo de ligação (por exemplo, enzima de peroxidase de rábano silvestre ou enzima de fosfatase alcalina); (4) contato do acima com o substrato da enzima; (5) contato do acima com um reagente de cor; e (6) observação/medição de alteração de cor ou desenvolvimento.
[0109] Outra técnica imunológica que pode ser útil na detecção dos anticorpos de flavivírus usa anticorpos monoclonais (MAbs) para detecção de anticorpos especificamente reativos com antígenos de flavivírus em um ensaio de inibição competitiva. Em resumo, a amostra é contatada a um antígeno desta invenção que é ligado a um substrato (por exemplo, uma placa ELISA de 96 poças). A amostra em excesso é completamente lavada. Um anticorpo monoclonal rotulado (por exemplo, ligado por enzima, fluorescente, radioativo, etc.) é então contatado com quaisquer complexos de antígeno-anticorpo formados anteriormente e a quantidade de ligação de anticorpo monoclonal é medida. A quantidade de inibição de ligação de anticorpo monoclonal é medida em relação a um controle (sem anticorpo), permitindo a detecção e medição do anticorpo na amostra. O grau de inibição de anticorpo monoclonal pode ser um ensaio muito específico
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 54/118 / 99 para detectar uma variedade específica de flavivírus ou cepa, quando com base na especificidade de ligação do anticorpo monoclonal para uma variedade específica ou cepa de flavivírus. MAbs podem também ser usados par detecção direta dos antígenos de flavivírus nas células, por exemplo, ensaio de imunofluorescência (IFA) de acordo com os processos padrão.
[0110] Como um exemplo adicional, um teste de microaglutinação pode ser usado para detectar a presença de anticorpos de flavivírus em uma amostra. Em resumo, contas de látex, hemácias ou outras partículas aglutináveis são revestidas com o antígeno desta invenção e misturadas com uma amostra, tal que os anticorpos na amostra que são especificamente reativos com a reticulação de antígeno com o antígeno, causando a aglutinação. Os complexos de anticorpoantígeno aglutinados formam um precipitado, visível a olho nu ou mensuráveis por espectrofotômetro. Em uma modificação do teste acima, os anticorpos desta invenção podem ser ligados às partículas aglutináveis e antígeno na amostra desta forma detectada.
[0111] A presente invenção adicionalmente provê um processo de dignóstico de uma infecção por flavivírus em um indivíduo, compreendendo contato da amostra do indivíduo com o antígeno desta invenção, sob condições onde o complexo de antígeno/anticorpo pode ser formar; e detecção da formação do complexo de antígeno/anticorpo, desta forma diagnosticando infeção de flavivírus em um indivíduo.
[0112] A presente invenção provê, adicionalmente, um processo de diagnóstico de uma infecção por flavivírus em um indivíduo, compreendendo o contato da amostra do indivíduo com o anticorpo desta invenção, sob condições onde um complexo de antígeno/anticorpo pode se formar; e detecção da formação de complexo de antígeno/anticorpo, pelo que diagnosticando a infecção de flavivírus em um indivíduo.
[0113] Nos processos de diagnóstico ensinados aqui, o antígeno desta invenção pode ser ligado a um substrato e contatado com uma amostra de fluido, tal como sangue, soro, urina ou saliva. Esta amostra pode ser tomada diretamente do paciente ou em uma forma parcialmente purificada. Desta maneira, os anticorpos
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 55/118 / 99 específicos para o antígeno (o anticorpo primário) especificamente reagirão com o antígeno ligado. Após isto, uma ligação de anticorpo secundária para ou rotulada com uma porção detectável pode ser adicionada para melhorar a detecção do anticorpo primário. De modo geral, o anticorpo secundário ou outro ligando, que é reativo, tanto especificamente com um epítopo diferente do antígeno quanto não especificamente com o ligando ou anticorpo reagido, será selecionado quanto a sua capacidade de reagir com sítios múltiplos no anticorpo primário. Assim, por exemplo, várias moléculas de anticorpo secundário podem reagir com cada anticorpo primário, tornando o anticorpo primário mais detectável.
[0114] A porção detectável permite a detecção visual de um precipitado ou alteração de cor, detecção visual por microscópio ou detecção automática por espectrometria, medição radiométrica ou semelhante. Exemplos de porções detectáveis incluem fluoresceína e rodamina (para microscopia fluorescente), peroxidase de rábano silvestre (para microscopia por elétron ou luz e detecção bioquímica), biotina-estreptavidina (para microscopia por elétron ou luz) e fosfatase alcalina (para detecção bioquímica por troca de cor).
[0115] Concretizações particulares da presente invenção são demonstradas nos exemplos seguintes. Estes exemplos não pretendem limitar o escopo da invenção como descrito nesta especificação.
Exemplos [0116] Processos gerais utilizando biologia molecular e técnicas de DNA recombinante relacionadas à preparação e expressão das moléculas TU do ácido nucléico da invenção são demonstrados em, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel e outros John Wiley and Sons, New York 1987 (atualizado trimestralmente), e Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Exemplo 1: Preparação de plasmídeos recombinantes contendo a unidade transcricional codificando antígenos de JEV prM e E. RNA genômico foi extraído de 150 pL de cepa JEV SA 14 germes de vírus desenvolveram-se a
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 56/118 / 99 partir do cérebro do camundongo usando um Kit QIAampTM Viral RNA (Qiagen, Santa Clarita, CA). RNA, absorvido na membrana de sílica, foi diluído em 80 llL de água isenta de nuclease, e usado como um gabarito para a amplificação de seqüências de codificação de JEV prM e E. Seqüências de primer foram obtidas a partir do trabalho de Nitayaphan e outros (Virology 177: 541-552 (1990)). Um fragmento cDNA simples contendo região de nucleotídeo genômico 389-2478 foi ampliado pela reação de cadeia de polimerase-transcriptase reversa (RT-PCR). Sítios de restrição Kpnl e XbaI, o acordo Kosak de seqüência de ligação do ribossoma, e o sítio de iniciação de tradução sofreram engenharia na terminação 5’ do cDNA pelo amplimer 14DV389 (seqüência de nucleotídeo, SEQ ID NO:1; seqüência de aminoácido, SEQ ID NO: 2). Em um códon de terminação de tradução na estrutura, seguido por um sítio de restrição NotI, foi introduzido na terminação 3’ do cDNA pelo amplimer c14DV2453 (SEQ ID NO: 3) (vide Figura 2). Um tubo RT-PCR foi performado usando um kit Titânio RT-PCR (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). 10 pL de RNA virótico foi misturado com 1 pL de cada 14DV389 (50 pM) e c14DV2453 (50 pM) e 18 pL da água isenta de nuclease e a mistura foi aquecida a 85°C por 5 min e então resfriada a 4°C. 75 pL da mistura de reação [20 pL 5 x tampão, 2 pL da mistura de dNTP (10 mM cada). 5 pL de ditiotreitol (0.1 mM), 0.5 pL de RNasinTM (40 U/pL, Boehringer Mannheim). 2 pL da mistura polimerase, e 45.5 pL de água isenta de nuclease] foi adicionada e RT-PCR realizado como se segue: 1 ciclo (50°C por 30 min, 94°C por 3 min, 50°C por 30 s, 68°C por 2,5 min), 9 ciclos (94°C por 30 s, 50°C por 30 s, 68°C por 2,5 min), 20 ciclos (94°C por 30 s, 50°C por 30 s, 68°C por 2,5 min no primeiro ciclo, com um aumento de 5 s por ciclo após isto), e uma extensão final a 68°C por 15 min. O produto RT-PCR foi purificado por um Kit de purificação QIAquickTM PCR (Qiagen) e diluído com 50 pL de 1 mM trisHCl, pH 7,5.
[0117] Todas as construções de vetores e análises foram realizadas pelo uso de técnicas padrão (Sambrook e outros 1989). CDNA amplificado por RT-PCR, digerido com Kpnl e nucleases NotI, foi inserido no sítio KpnI-NotI do vetor plasmídeo de expressão eucariótica (pCDNA3, Invitrogen, Carlsbad, CA).
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 57/118 / 99
Células de Escherichia coli XL 1-Blue competentes em eletroporação de (Stratagene, La Jolla, CA) foram transformadas por eletroporação (Gene Pulser™, Bio-Rad, Hercules, CA) e colocadas nas lâminas Agar LB contendo 100 pg/ml carbenicilina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Clones foram colhidos e inoculados em 3 ml de caldo LB contendo 100 pg/ml de carbenicilina. DNA de plasmídeo foi extraído a partir de 14 h de cultura usando um Kit Miniprep QIAprep™ Spin (Qiagen). Seqüênciamento de DNA automatizado foi realizado como recomendado (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA). Ambas as linhagens de cDNA foram seqüenciadas e mostradas como sendo idênticas à seqüência para a cepa SA14 original (Nitayaphan e outros 1990).
[0118] O fragmento de plasmídeo pCDNA3 (Invitrogen, CA) a partir de nucleotídeo (nt) 1289 a nt 3455, contendo fl ori, SV40 ori, o gene de resistência à neomicina, e elementos SV40 poli(A) foram deletados por digestão Pvull e então ligados ao gerador de plasmídeo pCBamp. O vetor pCIBamp, contendo uma inserção de introdução quimérica no sítio Ncol/Kpnl do pCBamp foi construído por excisão da seqüência de introdução a partir do pCI (Promega, Madison, WI) por digestão com Ncol e Kpnl. O fragmento de 566-bp resultante foi clonado em pCBamp por digestão com Ncol-Kpnl para substituir seu fragmento de 289-bp. A Figura 3 apresenta a relação entre os plasmídeos pCDA3, pCBamp e pCIBamp. [0119] Plasmídeos contendo a unidade transcricional codificando as proteínas E e JEV e prM foram preparados a partir destes plasmídeos. O fragmento de cDNA contendo as regiões de codificação de JEV prM e E no plasmídeo recombinante pCDJE2-7, (seqüência de nucleotídeo, SEQ ID NO: 10; seqüência de aminoácido, SEQ ID NO: 11), derivado do vetor pCDNA3, foi excisado por digestão com NotI e KpnI ou XbaI e clonado no sítio KpnI-NotI do pCBamp, pCIBamp, pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), ou pREP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), ou no sítio Spel-NorI do vetor de expressão pRc/RSV (Invitrogen, Carlsbad, CA) para criar pCBJE1-14, (seqüência de nucleotídeo, SEQ ID NO: 17; seqüência de aminoácido, SEQ ID NO: 18), pCIBJES 14, pCEJE, pREFE, e pRCJE, respectivamente. Ambas as cepas do cDNA dos clones de cada plasmídeo foram seqüenciadas e clones recombinantes com as seqüências de
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 58/118 / 99 nucleotídeos corretas foram identificados. O DNA de plasmídeo para uso na transformação in vitro de células de mamíferos ou experiências de imunização de camundongos, foi purificado por cromatografia de troca de ânion usando um Kit Maxi Plasmid EndoFree™ (Qiagen).
Exemplo 2: Avaliação das proteínas JEV prM e E expressas por vários plasmídeos recombinantes usando um ensaio de anticorpo imunofluorescente indireto. A expressão dos produtos de gene específico JEV por vários plasmídeos de expressão recombinante, foi avaliada em linhagens de células transferidas transilientemente de COS-1, COS-7 e SV-T2 (ATCC, Rockville MD, 1650-CRL, 1651-CRL, e 163.1-CCL, respectivamente) por ensaio de anticorpo imunofluorescente indireto (IFA). A linhagem de célula SV-T2 foi excluída a partir de teste, adicional uma vez que um resultado preliminar mostrou somente 1-2% de células SV-T2 transformadas eram antígeno positivo JEV. Para transformação, células foram desenvolvidas a uma confluência de 75% em frascos de cultura de 150 cm2, tripsinizados, e resuspensos a 4°C em salmoura tamponada de fosfato (PBS) a uma contagem da célula final de 5 x 106 por ml. 10 pg de DNA de plasmídeo foram eletroforados em 300 pL de uma suspensão de célula usando um BioRad Gene Pulse™ (Bio-Rad) ajustado a 150 V, 960 pF e resistência de 100 Ω. Cinco minutos após eletroforação, as células foram diluídas com 25 ml do meio fresco e semeadas em um frasco de 75 cm2. 48 h após transformação o meio foi removido das células, e as células foram tripsinizadas e ressuspensas em 5 ml PBS com soro de cabra 3% normal. Alíquotas de 10 pL foram maculadas em lâminas, secas ao ar e fixadas com acetona a -20°C por 20 minutos. IFA foi realizado com células transformadas por plasmídeos fixadas em acetona usando isotiocianato fluoresceína-imunoglobulina G anti-camundongo de cabra conjugado (Sigma Chemical Co.) e JEV HIAF.
[0120] Para determinar a influência de vários promotores e elementos poli(A) na expressão da proteína E e JEV prM, linhagens de células COS-1 e COS-7 foram transilientemente transformadas por uma quantidade igual de DNA de plasmídeos pCDJE2-7, pCEJE, pREJE, ou pRCJE. Antígenos JEV foram expressos em ambas as linhagens de células, transformadas por todos os quatro
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 59/118 / 99 plasmídeos recombinantes, assim confirmando que o promotor CMV ou RSV (vírus sarcoma “rous”) e elementos poli(A) BGH ou SV40 estavam funcionalmente ativos. Entretanto, a porcentagem de células transformadas e o nível de antígenos de JEV expressados, como determinado pelo número de células positiva IFA e intensidade IFA, respectivamente, diferindo muito dentre os vários plasmídeos (Tabela 1). Uma porcentagem significativamente alta de células COS-1 transformada por pCDJE2-7, (SEQ ID NO: 10), pCBJE1-14 (SEQ ID NO: 17) e pCIBJES14 expressa por antígenos JEV, e o nível das proteínas expressadas eram compatíveis com as células infectadas por JEV. Células transfectadas com vetores pCEJE, pREJE, ou pRCJE, ou por outro lado, possuindo uma alta percentagem de células expressando antígeno, bem como a baixa intensidade da fluorescência, indicam a expressão fraca do antígenos.
[0121] De maneira a determinar se a expressão melhorada das proteínas de JEV por pCDJE2-7 (SEQ ID NO: 10) foi influenciada pela origem eucariótica codificada de replicação de SV-40, o plasmídeo pCBJE1-14 (SEQ ID NO: 17) foi construído de maneira que um fragmento 2166 pares de base contendo fI ori, SV40 ori, o gene de resistência a neomicina e elementos poli(A) SV40 a partir de pCDJE2-7 foi deletado. Um intron quimérico foi então inserido no pCBJE1-14 para gerar pCIBJES14. O plasmídeo pCIBJES 14 foi usado para determinar se a expressão da proteína JEV poderia ser melhorada pela seqüência de intron. Seguindo-se a transformação, as células protegendo ambos os vetores pCBJE1-14 e pCIBJES14 expressaram um nível do antígeno JEV similar aquele observado com pCDJE2-7 (Tabela 1). Este resultado indica que a expressão dos antígenos de JEV prM e E por vetores recombinantes é influenciada somente pelos elementos reguladores transcricionais. Nem a origem eucariótica da replicação nem a seqüência de introdução melhoraram a expressão do antígeno JEV nas células usadas. Vetores contendo o promotor CMV e poli(A) BGH (Vide Figura 3) foram selecionados para análise adicional.
Exemplo 3: Seleção de uma linhagem de célula estável, transformada in vitro constitutivamente expressando produtos de gene específicos JEV. Células COS-1 foram transformadas com 10 pg de DNA de pCDJE2-7 por
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 60/118 / 99 eletroforação como descrito no exemplo anterior. Após 24 horas de incubação em meio de cultura não seletivo, as células foram tratadas com neomicina (0,5 mg/ml, Sigma Chemical Co.). Colônias resistentes à neomicina, que tornam-se visíveis após 2-3 semanas, foram clonadas por diluição limitada em meio contendo neomicina. Expressão dos produtos de gene JEV codificados por vetor foi inicialmente classificada por IFA usando JEV HIAF. Um clone positivo JEVIFA (JE-4B) e um clone negativo (JE-5B) foram selecionados por análise adicional e mantidos em meio contendo 200 pg/ml de neomicina.
[0122] A autenticidade da proteína JEV E, expressada pelo clone JE-4B, foi demonstrada pelo mapeamento de epítopo por IFA usando um painel de anticorpos monoclonais de murino específicos JEV E (MAb) (Kimara-Kudora e outros J. Virol. 45, 124-132 (1983). Kimora-Kudora e outros J. Virol. 67, 26632672 (1986); Zhang e outros J. Med. Virol 29, 133-138 (1989); and Roehrig e outros Virol. 128, 118-126 (1983)). JEV HIAF e camundongos normais foram usados como controles de anticorpos positivo e negativo, respectivamente. Quatro MAbs específicos para JEV-específicos, seis específicos para subgrupo de flavivírus e dois reativos para grupo de flavivírus reagiram similarmente com o clone 4B ou células COS-1 infectadas por JEV (Tabela 2).
Exemplo 4: Propriedades antigênicas e detecção imunológica de partículas subviróticas secretadas pela linhagem de célula JE-4B COS-1.
a. Preparação de partículas subviróticas. Células JE-4B COS-1 foram desenvolvidas e mantidas em meio contendo 200 pg/ml de neomicina. O meio cultivado foi rotineiramente colhido e estocado a 4°C, e reabastecido duas vezes por semana, e as células foram divididas 1:5 a cada 7-10 dias. O meio de cultura foi clarificado por centrifugação a 10.000 rpm por 30 min em um rotor Sorvall F16/250 a 4°C, e centrifugado adicionalmente por 4 horas a 39.000 rpm em um rotor Sorvall TH641 a 4°C através de 5% de almofada de sacarose (p/p preparado com 10 mM TrisHCl, pH 7.5, 100 mM de NaCl (tampão-TN)). A pelota contendo partículas subviróticas foi novamente suspensa em tampão TN e estocada a 4°C. Alternativamente, 7% ou 10% de PEG-8000 (p/v) foi adicionado ao meio de cultura clarificado. A mistura foi agitada a 4°C por pelo menos 2 horas, e as
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 61/118 / 99 partículas precipitadas foram coletadas por centrifugação a 10,000 rpm por 30 min. O precipitado foi novamente suspenso em tampão TN e estocado a 4°C. As partículas subviróticas foram purificadas a partir de ambas as preparações precipitadas-PEG e peletizadas por taxa de centrifugação zonal em 5-25% do gradiente de sacarose contínua em TN a 38,000 rpm a 4°C por 90 min. Frações de 1-ml foram coletadas a partir do topo do gradiente, testado por captura de antígeno ELISA (vide abaixo), e as frações positivas carregadas no gradiente de sacarose a 25-50% em TN. Isto foi centrifugado por toda uma noite em uma centrifugação de densidade em equilíbrio a 35,000 rpm a 4°C. Frações de 0,9 ml a partir dos gradientes de equilíbrio foram coletadas a partir do fundo. Elas foram testadas por captura de antígeno ELISA e avaliadas quanto a atividade hemoglutinação a pH 6,6. Uma alíquota de 100 μ! de cada fração foi precisamente pesada para determinar sua densidade. As frações positivas ELISA foram agrupadas e peletizadas a 39,000 rpm a 4°C por 3-4 horas e a pelota novamente suspensa em tampão PN. A captura de antígeno ELISA e as titulações foram determinadas nas amostras peletizadas. Sobrenadantes de célula COS-1 infectada-JEV foram também submetidos aos protocolos de purificação similares, como detalhado acima e usados como um controle positivo para análise de gradiente. Virions JEV foram também purificados de células C6/36 infectadas, 56 dias pós-infecção por sedimentação em um gradiente de equilíbrio glicerol/tartrato.
b. Manchas Western de partículas subviróticas. Amostras purificadas por gradiente de partículas subviróticas foram misturadas com tampão de amostra eletroforese e prosseguiram em 10 ou 12,5% de géis poliacrilamida contendo sulfato de dodecil sódio (SDS-PAGE) como descrito por Laemmli (Nature 277, 680-685 (1970). Proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose e imunoquimicamente detectadas com anti-E MAb 4G2 de reação cruzada para flavirírus de JEV HIAF policlonal (Henchal e outros Amer. J. Trop. Méd. Hyg. 31, 830-836 (1982)), ou soro hiperimune de peptídeo anti-prM de camundongo (JM01). Figura 4 mostra a comparação das proteínas M e E produzidas por células C6/36 e JE-4B COS-1 infectadas por JEV. Alguma
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 62/118 / 99 reatividade não específica para a proteína E foi observada no fluido ascítico do camundongo normal e soro anti-peptídeo Jmo1. Proteínas idênticas em tamanho à M e E foram secretadas nas partículas subviróticas e puderam ser detectadas, respectivamente, por antisoro JM01 prM-específico e MAb 4G2 E-específico.
c. Detecção do gradiente de densidade das partículas subviróticas de JEV em meio de cultura. Para ELISA, anticorpo de captura de antígeno (4G2) foi diluído em 0,1 M de tampão de carbonato de sódio, pH 9,6, e usado para revestir placas de microtitulação de 96 poças (Immulon II, Dynatech Chantilly, VA) por incubação, por toda a noite a 4°C. Após bloqueio com 3% de soro de cabra normal em PBS, foram adicionadas amostras, periodicamente, duas vezes a 4G2 as placas revestidas com 4G2 e incubadas por 1 hora e meia a 37°C. Antígeno capturado foi detectado por peroxidase de rábano silvestre-MAg 6B6C-1 conjugado, e incubado por 1 hora a 37°C. A atividade da enzima na fase sólida foi então detectada com TMB (3,3’,5,5’-tetremetilbenzidina)-ELISA (Life Technologies, Grand Island, NY) [0123] Aproximadamente 500 ml do meio de cultura de célula de frascos de 15 x 150 cm3 de células JE-4B foram coletados por quatro dias após as células serem semeadas. Partículas PEG-subviróticas precipitadas foram novamente suspensas em 2 ml de tampão TN, pH a 7,5 uma alíquota de 0,7 ml, destas pelotas novamente suspensas, foi carregada em gradiente de sacarose a 5-25%. Triton X100, que rompe partículas subviróticas, foi adicionado a uma outra alíquota 0,7 ml a uma concentração final de 0,1 % e esta foi carregada no gradiente de sacarose a 5-25% de sacarose preparada em tampão TN contendo 011 Triton X100. Uma faixa opaca definida foi observada aproximadamente 2,5 cm a partir do topo do gradiente contendo Triton X, mas não em gradiente sem detergente. Frações (1 ml) foram coletadas a partir do topo ao fundo para cada gradiente (Figura 5). Cada fração coletada foi analisada por ELISA de captura de antígeno. O antígeno foi detectado em frações 4-6, indicando características de sedimentação relativamente rápida das partículas subviróticas. Tratamento do precipitado PEG a partir do meio de cultura JE-4B com Triton X-100 comutou na posição do material reativo em ELISA para o topo do gradiente. Assim o
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 63/118 / 99 tratamento com Triton X-100 produz somente moléculas de sedimentação lenta. Uma descoberta similar foi relatada por Konishi e outros 1992 (Virol. 188: 714720). Este resultado mostra que partículas subviróticas que sedimentam rapidamente contendo prM/M e E poderiam ser rompidas por tratamento com detergente.
[0124] Atividade de hemaglutinação de HA foi determinada na faixa de pH de 6,1 a 7,0 pelo método do Clarke e Casals (Amer. J. Trop. Med. Hyg. 7:561-573 (1958)). A partícula subvirótica secretada por células JE-4B e as partículas vírus produzidas por células COS-1 infectadas com JEV tinham um perfil HA similar com o pH ótimo determinado para ser 6,6.
Exemplo 5: Comparação da resposta imune em camundongos vacinados com vacina de ácido nucléico pCDJE2-7 da invenção e vacina JEV comercial. Grupos de 5 fêmeas de 3 semanas de idade, de camundongos ICR receberam, intramuscularmente, nos quadríceps esquerdo e direito injeções de 100 pg de plasmídeo pCDJE2-7 em 100 ml de dH2O ou foram dadas doses de JEVAX (fabricado por Research Foundation for Microvial Disease of Osaka University e distribuído por Connaught Laboratories, Swiftwater, PA.) subcutaneamente, que são um-quinto da dose dada aos seres humanos. O plasmídeo pCDNA3/CAT (Invitrogen) que codifica e expressa uma proteína não relacionada, foi usado como um controle de vacinação negativa. Exceto para um grupo de camundongos vacinados com pCDJ-2-7, todos os animais receberam reforço 3 semanas mais tarde com uma dose adicional de plasmídeo ou JE-VAX. Camundongos foram sangrados a partir da cavidade retroorbital a 3, 6, 9, 23 e 40 e 60 semanas após inoculação. As titulações de anticorpos JEV foram determinadas pelo ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) contra JEV purificado ou teste de neutralização da placa de redução (PRNT) (Roehrig e outros Virol. 171: 49-60 (1989), e Hunt and Calisher, Amer. J. Trop. Med. Hyg. 28: 749-749 (1979)).
[0125] A vacina de ácido nucléico pCDJE2-7 e JE-VAX forneceu soroconversão a 100°, três semanas após a primeira vacinação em todos os três grupos de camundongos (Tabela 3). As titulações de anticorpos PRNT e ELISA
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JEV alcançaram o maior nível nas semanas 6 e 9, respectivamente, após imunização. Camundongos que receberam uma dose da vacina de DNA tiveram resposta de anticorpo similar aos que receberam duas doses. Titulações de anticorpos ELISA comparáveis foram mantidas em grupos vacinados de DNA até 60 semanas, após o que a experiência foi terminada. Entretanto, somente um dos quatro camundongos no grupo JE-VAX possuía anticorpo JEV positivo em 60 semanas pós-inoculação. O grupo de controle pCDNA3/CAT não possuía qualquer anticorpo JEV mensurável. Estes resultados demonstram que uma dose única da vacina do ácido nucléico específico-JEV é mais eficaz na manutenção do anticorpo de JEV nos camundongos do que a vacina. O FDA aprovou a vacina JE-VAX.
Exemplo 6: Comparação de várias construções de vacinas de ácido nucléico da invenção e da vacina comercial de JEV para a eficácia da vacinação em diferentes idades. Um nível similar de proteína JEV foi expresso por células COS-1 transformadas tanto por pCDJE2-7 pCBJE1-14, quanto pCIBJES14. Indução de anticorpos JEV por estas construções de ácidos nucléicos foi comparada à vacina comercial JE-VAX em duas idades diferentes na vacinação. Camundongos ICR acasalados de três semanas (fêmeas) ou de três dias (sexos misturados) 10 por grupo, foram vacinados intramuscularmente com 50 ou 100 pg de DNA de plasmídeo, ou subcutaneamente com doses de JE-VAX que são um-décimo ou um-quinto da dose dada aos seres humanos. Espécimes de soro foram coletados na 3a e 7a semana após imunização e testados em uma diluição de 1:1600 por ELISA usando JEV purificado como um antígeno. Resultados são mostrados na Tabela 4.
[0126] Plamídeos pCBJE1-14 forneceram a extensão maior de soroconversão, isto é, títulação de anticorpo maior que 1:1600, encontrando 80-100% em ambas as idades de vacinação. Administração de pCDJE2-7 ou pCIBJES14 forneceu soroconversão moderada por 7 semanas quando camundongos de 3 dias foram vacinados (60% para cada), porém soroconversão mais fraca (40% e 10%, respectivamente) quando medido 3 semanas após vacinação. Quando estes plasmídeos foram administrados na idade de 3 semanas, entretanto,
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 65/118 / 99 soroconversão de 90% ou 100% foi atingida em ambas as 3 semanas e 7 semanas após a vacinação. Em contraste, a vacina comercial, JEV-VAX, não confere soroconversão quando administrada na idade de 3 dias, e 100% quando dada na idade de 3 semanas. Assim as TU’s do ácido nucléico para JEV prM e E forneceram uma extensão de soroconversão melhor que uma dose muito alta da vacina comercial, e inesperadamente alta soroconversão em ambos os animais, mais jovens e mais velhos.
Exemplo 7: Imunidade de proteção conferida pela vacina de ácido nucléico da invenção. Grupos com 3 dias de idade vacinados a partir do Exemplo 6 foram desafiados 7 semanas após vacinação por injeção intraperitoneal de 50,000 pfu/100 pl de SA14 cepa JEV adaptada de camundongo e observados por 3 semanas. Proteção de 100% foi encontrada em grupos que receberam várias construções de vacinas contendo TU do ácido nucléico formadas cerca de 21 dias (Tabela 5). Em contraste, 60% dos camundongos vacinados com JE-VAX, bem como 70% dos controles negativos vacinados pCDNA3/CAT, não sobreviveram ao vírus provocado por 21 dias. Estes resultados indicam que as TU’s do ácido nucléico da invenção conferem proteção efetiva inesperada nos camundongos vacinados. Isto sugere a possibilidade de emprego da vacina do ácido nucléico como uma vacina da primeira infância para humanos. Em contraste, JE-VAX, a vacina inerte correntemente usada, não parece ser efetiva em animais jovens.
Exemplo 8: Proteção passiva de camundongos recém nascidos correlacionada com à titulação de anticorpo maternal. Camundongos ICR fêmeas com idade de 3 semanas foram vacinados tanto com uma ou duas doses espaçadas dois dias de DNA plasmídeo pCDJE2-7, a 100 pg/100pL, ou com duas doses de JE-VAX que foram um quinto da dose dada aos seres humanos. O grupo de controle negativo recebeu duas doses de 100 pg/100pl do plasmídeo pCDNA3/CAT. Proteção passiva por anticorpo materno foi avaliada em filhotes resultantes da maternidade das fêmeas experimentais com camundongo macho não imunizado que ocorreu nove semanas seguintes à primeira vacinação e 6 semanas seguintes a segunda vacinação. Filhotes foram provocados entre 3-15 dias após o nascimento por administração intraperitoneal de 5.000 pfu/100pl de
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 66/118 / 99 vírus SA14 adaptado ao camundongo e observado diariamente por 3 semanas (Tabela 6). As taxas de sobrevivência correlacionaram-se às titulações de anticorpo de neutralização maternal. 100% dos filhotes nutridos por mães com um PRNT de 1:80 sobreviveram à infecção virótica, enquanto que nenhum dos filhotes das mães de controle sobreviveu. (Tabela 6). Proteções parciais de 45% e 75% foram observadas em filhotes mais velhos que foram nutridos com mães com uma titulação PRNT de 1:20 e 1:40, respectivamente. As taxas de sobrevivência também correlacionaram-se com a duração do tempo que os filhotes foram nutridos pela mãe imune. Como indicado, os filhotes de 13-15 dias tiveram altas taxas de sobrevivência. Nenhum dos filhotes de 3-4 dias de idade, entretanto, sobreviveu ao ser provocado com o vírus quando a mãe tinha uma titulação PRNT de 1:20 ou 1:40. Assim, anticorpo maternal provê imunidade de proteção parcial à completa aos descendentes. Em adição, anticorpo JEV foi detectado por ELISA no soro de 97% (29/30) dos filhotes pós-provocados.
[0127] Os camundongos foram intramuscularmente inoculados com 1 ou 2 doses de 100 pg doses de DNA de plasmídeo, ou subcutaneamente com duas doses de 1/5 do ser humano de vacina JEV. Os soros foram coletados 9 semanas após a vacinação para teste do PRNT antes do acasalamento com o macho não imune.
Exemplo 9: Preparação de plasmídeos recombinantes contendo unidade transcricional codificando antígenos WNV prM e E. RNA genômico foi extraído de 150 pl dado meio de cultura de célula Vero infectado com a cepa NY 99-6480, uma cepa isolada do surto em New York em 1999, usando Kit de QIAampTM de RNA Virótico (Qiagen, Santa Clarita, CA). O RNA extraído foi eluído e suspenso em 80 pl de água isenta de nuclease e usado como um gabarito para a ampliação de seqüências de gene de WNV prM e E. As seqüências de primers foram obtidas do trabalho de Lanciotti e outros (Science 286:2333-2337 (1999)). Um fragmento de cDNA contendo a região de nucleotídeo genômico foi ampliada por reação de cadeia de transcriptase-polimerase inversa (RT-PCR). Sítios de restrição BsmBI e KasI foram transformados geneticamente no terminal 5' do cDNA por uso do amplimer WN466 (seqüência de nucleotídeo, SEQ ID
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NO: 12). Um códon de terminação de tradução na estrutura, seguido por um sítio de restrição NotI foi introduzido na terminação 3' do cDNA por uso do amplimer cWN2444 (SEQ ID NO: 13). O produto de RT-PCR foi purificado por um Kit de Purificação QIAquick™ PCR (Qiagen).
[0128] O amplicon de filamento duplo produzido por uso dos dois amplímeros acima (SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13) foi digerido com enzimas KasI e NotI para gerar um fragmento de 998 pares de base (nt-1470 a 2468) de DNA foi inserido nos sítios KasI e NotI de um vetor de pCBJESS para formar um plasmídeo intermediário, pCBINT. O pCBJESS foi derivado do plasmídeo de plasmídeo pCBamp, que continha o promotor de gene anterior de citomegalovírus e elemento de controle de translação e um elemento de seqüência de sinalização JE transformado por engenharia (Chang e outros, J. Virol. 74: 4244-4252 (2000)). O elemento de seqüência de sinalização JE compreende a seqüência de sinalização JE (SEQ ID NO: 14).
[0129] O amplicon de cDNA foi subseqüentemente digerido com enzimas BsmBI e Kas e o restante do fragmento de 1003 pares de base (nt-466 a 1470) foi inserido no sítio de KasI do pCBINT para formar pCBWN (seqüência de ácido nucleico, SEQ ID NO: 15, seqüência de aminoácido, SEQ ID NO: 16). O sequenciamento de DNA automatizado usando um Sequenciador de prisma ABI 377 (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA) foi usado para confirmar que o plasmídeo recombinante tinha uma seqüência prM e E correta, conforme definido por Lanciotti e outros (Science 286: 233-2337 (1999)).
[0130] O DNA de plasmídeo para uso na transformação in vitro de células de mamíferos ou experimentos de imunização de camundongo foi purificado por cromatografia de troca de ânion conforme descrito no Exemplo 1.
Exemplo 10: Caracterização Imunoquímica e avaliação de proteínas WNV prM e E expressas por pCBWN. Os produtos de gene específicos WNV codificados pelo plasmídeo de pCBWN foram expressos nas células COS-1. As células sofreram eletroporação e foram transformadas com plasmídeo pCBWN de acordo com Chang e outros (J. Virol. 74: 4244-4252 (2000)). As células que sofreram eletroporação foram semeadas em frascos de cultura de 75
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 68/118 / 99 cm2 ou um prato de cultura de tecido de 12 poças contendo uma poça/borda de revestimento estéril. Todos os frascos e as placas de 12 poças foram mantidos a 37°C, em um incubador com CO2 a 5%. Quarenta e oito horas após sofrer eletroporação, as células aderentes contendo bordos de revestimento foram removidas das poças, lavadas rapidamente com PBS, fixadas com acetona por 2 minutos a temperatura ambiente e deixadas secar ao ar.
[0131] A expressão da proteína foi detectada usando ensaio de anticorpo de imunofluorescência (IFA), conforme descrito no Exemplo 2. Anticorpo monoclonal específico para proteína E de flavivírus (MAb) 4G2, fluido ascítico hiperimune de camundongo WNV (HIAF) e soro de camundongo normal (NMS) em diluição a 1:200 em PBS foram usados como o anticorpo primário para detectar a expressão de proteína (Henchal e outros, Am. J. Trop. Med. Hyg. 31:830-836 (1982)).
[0132] Meio de cultura de tecido foi colhido 40 e 80 horas seguindo-se a eletroporação. ELISA de captura de antígeno (captura de Ag) foi usado para detectar antígeno de vírus WN secretado no meio de cultura de células COS-1 transformadas transientemente. O MAb 4G2 e MAb 6B6C-1 conjugado com peroxidase de rábano silvestre foram usados para capturar os antígenos de vírus WN e detectar antígeno capturado, respectivamente (Chang e outros, J. Virol. 74: 4244-4452 (2000); Henchal e outros., Am. J. Trop. Med. Hyg. 31:830-836 (1983); Roehrig e outros, Virology 128: 118-126 (1983)).
[0133] Antígeno do vírus WN no meio foi concentrado por precipitação com polietileno glicol a 10% (PEG)-8000. O precipitante foi ressuspenso em tampão TNE (50 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 7,5), clarificado por centrifugação e armazenado a 4°C. Alternativamente, o precipitante foi ressuspenso em um tampão de liofilização (0,1 M TRIZMA e 0,4% de albumina de soro bovino em tampão de salmoura borato, pH 9,0), liofilizado e armazenado a 4°C. Preparações liofilizadas foram usadas como antígeno para a avaliação em MAC e ELISAs IgG indiretos.
[0134] A proteína específica para o vírus WN foi detectada por IFA nas células COS-1 transientemente transformadas. As proteínas E, prM e M expressas nestas
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 69/118 / 99 células foram secretadas no meio de cultura. O antígeno do vírus WN concentrado por precipitação de PEG foi extraído com etanol a 7% para remover PEG residual (Aizawa e outros, Appl. Enviro. Micro. 39: 54-57 (1980)). Os antígenos extraídos e etanol e virions WN purificados por gradiente foram analisados em um NuPAGE, Gel Bis-Tris de gradiente de 4-12% em um Aparelho de Eletroforese Excel Plus (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) e seguido por eletromanchamento nas membranas de nitrocelulose usando uma Unidade de Manchamento Excel Plus (Invitrogen Corp.). Proteínas específicas para vírus WN produzidas por células COS-1 transformadas transientemente foram detectadas por vírus WN específicos para camundongo HIAF ou MAb 4G2 reativo em proteína E de flavivírus, em uma análise de manchamento Western, usando NMS como um controle de soro negativo. As proteínas revelaram reatividade semelhante e pesos moleculares idênticos a proteína E, prM e M de virion purificado com gradiente correspondente do cérebro de camundongo mamando (SMB) infectado com vírus WN.
[0135] Na análise do RNA como um antígeno para diagnóstico por ELISA, um frasco de RNA liofilizado, representando antígeno colhido de 40 ml de fluido de cultura de tecido, foi reconstituído em 1,0 ml de água destilada e comparado ao vírus WN reconstituído infectado por antígeno de cérebro de camundongo mamando (SMB) infectado por WN, provido como extratos de acetona-sacarose inativados com β-propiolactona (Clarke e outros, Am. J. Trop. Med. Hyg. 7:561573 (1958)). Todas a proteínas recombinantes, prM, M e E tinham reatividade semelhante aquela das proteínas E, prM e M de virion purificadas por gradiente. [0136] Espécimes humanos codificados foram testados concorrentemente com antígenos no mesmo teste no estágio de desenvolvimento. Os protocolos MAC e IgG ELISA empregados eram idênticos aos processos publicados (Johnson e outros, J. Clin. Microbiol. 38:1827-1831 (2000)); Martin e outros, J. Clin. Microbiol. 38: 1823-1826 (2000)). Espécimes de soro humano foram obtidos do banco de soro em nossas instalações, que consistiam de espécimes enviados ao DVBID para teste de confirmação de vírus WN durante o surto de 1999. Nestes testes, uma classificação de MAC e IgG ELISA foi realizada em uma diluição de
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 70/118 / 99 espécime de 1:400. Os espécimes rendendo razões OD (PN) positivas/negativas entre 2 e 3 foram considerados positivos suspeitos. Os espécies de soro suspeitos foram submetidos à confirmação como positivos por titulação de ponto terminal ELISA e teste de neutralização de redução de placa (PRNT). Todos os espécimes rendendo razões de OD P/N maiores do que 3,0 foram considerados positivos sem teste de confirmação adicional.
[0137] Um ELISA de captura de Ag empregando anti-E MAb, 4G2 e 6B6C-1 reativos ao grupo flavivírus foi usado para detectar RNA secretado no fluido de cultura de células COS-1 transformadas com pCBWN. O antígeno seria detectado no meio, um dia após a transformação e a titulação de ELISA máxima (1:321:64) no fluido de cultura sem concentração adicional foi observado entre o dia dois e o dia quatro. RNA foi concentrado por precipitação de PEG, ressuspenso em um tampão de liofilização e liofilizado para preservação. Para o desenvolvimento do teste de diagnóstico, um frasco de RNA liofilizado foi reconstituído com 1,0 ml de água destilada e titulado em IgG ELISA indireto ou MAC usando soro humano de referência negativa e positiva de vírus WN (Johnson e outros, J. Clin. Microbiol. 38:1827-1831 (2000); Martin e outros, J. Clin. Microbiol. 38: 1823-1826 (2000)). As diluições 1:320 e 1:160 de RNA foram verificadas como sendo a concentração ótima para uso em MAC e IgG ELISA, respectivamente. Estas diluições resultaram em uma razão P/N OD450 de 4,19 e 4,54, respectivamente para o teste MAC- e IgG. Os antígenos SMB de vírus WN produzidos por cepas NY-6480 e Eg101 foram usados na diluição de 1:320 e 1:640 para MAC-ELISA e 1:120 e 1:320 para IgG ELISA, respectivamente. Os antígenos de controle negativo, precipitados PEG do meio de cultura de células COS-1 normais e antígeno SMB normal foram usados nas mesmas diluições como para o respectivo antígeno RNA e SMB. Os espécimes de soro humano, diluídos a 1:400, foram testados concorrentemente para triplicar com os antígenos de controle específicos de vírus e negativos. Para o resultado de teste positivo ser válido, o OD450 para o soro de teste reagido com antígeno virótico (P) tinha de ser pelo menos duas vezes maior do que o valor de
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 71/118 / 99 densidade óptica correspondente do mesmo soro reagido com antígeno de controle negativo (N).
[0138] A reatividade de RNA e NY-06480, Eg101 e SMBs de vírus SLE foi comparada pelos MAC- e IgG ELISAs usando 21 espécimes de soro humano codificados. Dos 21 espécimes, 19 tinham resultados semelhantes em todos três antígenos (8 negativos e 11 suspeitos positivos ou positivos). Dezoito espécimes foram também testados separadamente usando antígeno SLE SMB. Apenas três dos 13 espécimes positivos Eg-101-SMB foram positivos no SLE MAC-ELISA (Tabela 1). Nenhum dos espécies negativos de antigeno WN foi positivo por SLE MAC-ELISA. Este resultado confirmou uma observação anterior de que o vírus anti-WN IgM não causou reação cruzada significativa com outros flavivírus (Tardei e outros, J. Clin. Microbiol. 38: 2232-2239 (1940)) e foi específico para diagnosticar infecção aguda por vírus WN independente se o antígeno RNA ou SMB foi usado para teste. Todos os espécimes foram também testados concorrentemente por IgG ELISA indireto. Dez dos 21 espécimes foram positivos usando qualquer um dos três antígenos.
[0139] Os dois espécimes de soro discrepantes (7 e 9) ambos do mesmo paciente, coleados no dia 4 e 44 após início da doença, respectivamente, eram negativos para IgM com antígeno RNA e SMB NY e positivos para IgM usando antígeno Eg-101 SMB no teste inicial. Para investigar estes dois espécimes discordantes, adicionalmente, seis espécimes coletados sequenciamente deste paciente foram testados novamente por MAC- e IgG ELISAs de ponto terminal. Um aumento em série superior a 32 vezes mostrado na titulação de Mac-ELISA entre os dias 3 e 15, seria demonstrado com todos os antígenos usados. O fluido cerebrospinal coletado no dia 9 após o início da doença também confirmou que este paciente, na realidade, foi infectado por WN pouco antes da retirada da amostra. O fluido cerebrospinal tinha leitura IgM P/N de 13,71 e 2,04 contra antígenos Eg-101- e SLE-SMB, respectivamente. Os espécimes do dia 31 e 44 eram negativos (<1:400) por uso de antígeno NY-SMB, porém positivos usando RNA e Eg101-SMB. Titulações IgG compatíveis foram observadas com todos os três antígenos usados no teste.
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 72/118 / 99 [0140] Exemplo 11: Avaliação da resposta imune em animais vacinados com pCBWN. Grupos de dez camundongos ICR fêmeas de três semanas de idade foram usados no estudo. Os camundongos receberam injeção intramuscular (i.m.) com uma dose simples de pCBWN ou um DNA de plasmídeo expressando proteína fluorescente verde (pEGFP)DNA (Clonetech, San Francisco, CA). O DNA de plasmídeo de pCBWN foi purificado de células XL-1 blue com Kits Giga de Plasmídeo EndoFree (Qiagen) e ressuspensas em PBS, pH 7,5 a uma concentração de 1,0 pg/pl. Os camundongos que receberam 100 pg de pEGFP foram usados como controles inativos. Os camundongos receberam injeção de plasmídeo pCBWN em uma dose de 100, 10, 1,0 ou 0,1 pg em um volume de 100 pl. Os grupos que receberam 10, 1,0 ou 0,1 pg de pCBWN foram vacinados por protocolo de liberação de gene in vivo mediado por eletrotransferência usando o eletroporador de onda ao quadrado EMC-830 (Genetronics Inc. San Diego, CA). O protocolo de eletrotransferência baseou-se no processo de Mir e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:4262-4267 (1999)). Imediatamente após a injeção com DNA, os pulsos elétricos transcutâneos foram aplicados por dois elétrodos de placa de aço inoxidável 4,5-5,5 mm separados, em cada lado da perna. O contato elétrico com a pele da perna foi garantido por umedecimento completo da pele com PBS. Foram aplicados dois conjuntos de quatro pulsos de 40 volts/mm de 25 microsegundos de duração com um intervalo de 200 microsegundos entre os pulsos. A polaridade do elétrodo foi revertida entre o conjunto de pulsos para melhorar a eficiência da eletrotransferência.
[0141] Os camundongos foram sangrados a cada 3 semanas seguindo-se a injeção. A resposta do anticorpo específico para vírus WN foi avaliada por teste ELISA de captura Ag e neutralização de redução de placa (PRNT). Os soros individuais foram testados por IgG-ELISA e soros agrupados de 10 camundongos de cada foram analisados quanto a PRNT. Todos os camundongos vacinados com pCBWN tinham titulações IgG ELISA variando de 1:640 a 1:1280 três semanas após vacinação. Os soros coletados nas semanas três e seis tinham uma titulação de anticorpo Nt de 1:80. Nenhum dos espécies de soro de camundongos de controle pEGFP revelou qualquer titulação de ELISA ou Nt para vírus WN.
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 73/118 / 99 [0142] Para determinar se a vacinação i.m. simples de pCBWN poderia proteger o camundongo de infecção por vírus WN, os camundongos foram desafiados com vírus NY-6480 por injeção intraperitoneal ou por exposição a picada dos mosquitos Culex infectados com vírus. Metade dos grupos de camundongos foram desafiados intraperitoneamente (ip) nas 6 semanas após vacinação com 1.000 LD50 (1,025 PFU/100 pl) de vírus NY99-6480. Os outros camundongos foram expostos a picadas de três mosquitos Culex tritaeniorhynchus que foram infectados com vírus NY99-6480, 7 dias antes do experimento de desafio. Os mosquitos foram deixados se alimentar do sangue dos camundongos até estarem saciados. Os camundongos foram observados duas vezes ao dia por três semanas após o desafio.
[0143] Foi evidente que a presença de anticorpos de Nt correlacionou-se à imunidade protetora, uma vez que todos os camundongos imunizados com DNA de vírus WN permaneceram saudáveis após desafio do vírus enquanto doso os camundongos de controle desenvolveram sintomas de infecção no CNS 4-6 dias após o desafio com o vírus e morreram em média 6,9 e 7,4 dias após desafio intraperitoneal ou infectivo, respectivamente. No grupo vacinado, o soro agrupado, coletado três semanas após o desafio com o vírus (9 semanas após imunização) tinha titulações de anticorpo Nt de 1:640 ou 1:320. Os soros de camundongos vacinados agrupados reagiram apenas com proteína E na análise de manchamento Western.
[0144] Grupos de dez camundongos foram imunizados com 10,0 a 0,1 pg de pCBWN por animal por uso de eletrotransferência. Todos os grupos que receberam pCBWN foram completamente protegidos do desafio do vírus. Após 6 semanas depois da imunização, todos os grupos de eletrotransferência de camundongo tinham titulações Nt inferiores a quatro vezes, diferente daqueles animais que receberam 100 pg de pCBWN por injeção i.m. convencional sem eletrotransferência. Ambos os resultados evidenciando imunização eficaz sugeriram que o protocolo de eletrotransferência melhora a imunogenicidade e eficácia protetora da vacina de DNA da invenção (quando realizado conforme descrito em (Mir e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:4262-4267. (1999))).
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 74/118 / 99 [0145] Éguas prenhas e animais castrados mistos de várias idades usados neste estudo mostraram ser negativos com anticorpos de vírus WN e vírus SLE por ELISA e PRNT. Quatro cavalos receberam injeção i.m. com uma dose simples (1.000 pg/l.000 pl em PBS, pH 7,5) de plasmídeo pCBWN. Os espécimes de soro foram coletados, dia sim dia não, por 38 dias antes do desafio com o vírus e a resposta de anticorpo específica para vírus WN foi avaliada por MAC- ou IgG ELISA e PRNT.
[0146] Dois dias antes do desafio do vírus, 12 cavalos (4 vacinados e 8 controles) foram relocados em uma construção de contenção de nível de biosegurança (BSL)-3 na Universidade do Estado de Colorado. Os oito cavalos de controle não vacinados foram o alvo de um estudo que foi designado para investigar patogenese induzida por vírus WN em cavalos e o potencial dos cavalos de servir como hospedeiros de ampliação. Os cavalos foram desafiados pela picada de 14 ou 15 mosquitos Aedes albopictus que foram infectados por vírus NY99-6425 ou BC787 12 dias antes do desafio ao cavalo. Os cavalos foram picados pelos mosquitos por um período de 10 minutos. Os cavalos foram examinados quanto a sinais de doença duas vezes ao dia. A temperatura do corpo foi registrada e os espécimes de soro coletados duas vezes no dia 0 (dia da infecção) a 10, então uma vez ao dia até o dia 14. Pulso e respiração foram registrados diariamente após o desafio. As amostras de soro coletadas foram testadas quanto a titulação de placa para detecção de viremia, e por MAC- ou IgG ELISA e PRNT para resposta de anticorpo.
[0147] Nenhuma reação sistêmica ou local foi observada em qualquer cavalo vacinado. Os soros de cavalos individuais foram testados quanto a PRNT. Os cavalos vacinados desenvolveram anticorpo Nt maior ou Igl a 1:5 entre os dias 14 e 31. Titulações de ponto final para cavalos vacinados, número 5, número 6, número 7 e número 8, no dia 37 (dois dias antes do desafio do mosquito) foram de 1:40, 1:5, 1:20 e 1:20, respectivamente. Os cavalos vacinados com o plasmídeo pCBWN permaneceram saudáveis após o desafio com o vírus. Nenhum deles desenvolveu uma viremia detectável ou febre dos dias 1 a 14. Todos os cavalos de controle não vacinados foram infectados com vírus WN após
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 75/118 / 99 exposição às picadas dos mosquitos infectados. Sete a oito cavalos não vacinados desenvolveram viremia que apareceu durante os primeiros 6 dias após o desafio do vírus. Os cavalos virêmicos desenvolveram anticorpo para Nt entre o dia 7 e dia 9 após desafio do vírus. O único cavalo de todo o estudo que mostrou sinais clínicos de doença foi o cavalo número 11, que ficou febril e mostrou sinais neurológicos começando no dia 8 a pós infecção. Este cavalo progrediu para doença clínica grave em 24 horas e foi sacrificado no dia 9. Quatro cavalos representantes, os de número 9, 10, 14 e 15 apresentando viremia para os dias 0, 2, 4 ou 6 foram selecionados e usados como exemplos nesta experiência. As titulações de vírus variaram de 101,0 PFU/ml de soro (no cavalo número 10), o nível mais baixo detectável em nosso ensaio para 102,4/ml (no cavalo número 9). O cavalo número 14 não desenvolveu uma viremia detectável durante o período de teste. Entretanto, este cavalo foi infectado por vírus, conforme evidenciado por anticorpo Nt detectado após o dia 12.
[0148] A resposta de anticorpo anamnéstica não foi observada nos cavalos vacinados, conforme evidenciado pelo aumento gradual na titulação de Nt durante o experimento. O anticorpo Nt preexistente no cavalo vacinado antes do desafio do mosquito suprimiria infecção e replicação virótica inicial. Sem qualquer replicação virótica, o antígeno para o vírus desafiante fornecido pelos mosquitos infectados pode não conter massa de antígeno suficiente para estimular resposta imune anamnéstica no cavalo vacinado. Todos os cavalos vacinados foram sacrificados no dia 14 após o desafio com o vírus. Lesões histopatológicas e patológicas grosseiras indicativas de infecção virótica por WN não foram observadas.
Exemplo 12: Preparação de plasmídeos recombinantes contendo seqüências de codificação para proteínas pRM e E do vírus da febre amarela (YFV) ou vírus encefalite de St.Louis (SLEV). Uma estratégia semelhante para construção de plasmídeo recombinante pCDJE2-7 foi usada para preparar plasmídeos recombinantes YFV e SLEV. RNA genômico foi extraído de 150 pl de UFV cepa TRI-788379 ou sementes de vírus SLE cepa 78V-6507 usando Kit RNA Virótico QIAamp™ (Qiagen, Santa Clarita, CA). O RNA virótico foi
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 76/118 / 99 usado como um gabarito para ampliação de regiões codificando gene UFV ou SLEV prM e E. Os primers YFDV389 (seqüência de nucleotídeo, SEQ ID NO: 4; seqüência de aminoácido, SEQ ID NO: 5), e cYFDV2452 (SEQ ID NO: 6), SLEDV410 (seqüência de nucleotídeo, SEQ ID NO: 7; seqüência de aminoácido, SEQ ID NO: 8) e cSLEDV2449 (SEQ ID NO: 9) foram usados para gerar os ácidos nucléicos recombinantes correspondentes, conforme descrito acima para a preparação de plasmídeos recombinantes JEV e WNV. cDNA ampliado RT-PCR, digerido com enzimas KpnI e NotI, foi inserido no sítio de KpnI-NotI de um vetor de plasmídeo de expressão eucariótica, pCDNA3 (Invitrogen). Os filamentos de cDNA foram seqüenciados e verificados quanto a identidade para seqüências YFV da cepa TRI-788379 ou SLEV cepa 78V-6507. Os plasmídeos recombinantes pCDYF2 e pCDSLE4-3 que continham as seqüências de nucleotídeo das regiões de codificação prM e E para YFV ou SLEV, respectivamente, foram purificadas usando um Kit Maxi Plasmídeo EndoFree™ (Qiagen) e usados para transformação in vitro ou imunização de camundongo.
[0149] Antígenos específicos para YFV ou SLEV foram expressos nas células COS-1 transformadas por pCDYF2 ou pCDSLE4-3, respectivamente. O nível de proteínas expressas era semelhante ao controle de célula COS-1 infectada com YFV ou SLEV. Como no modelo JEV, as linhagens de células COS-1 modelo JEV transformadas por vetores portando genes para os antígenos viróticos foram obtidas, as quais constitutivamente expressam proteínas antigênicas YFV ou SLEV. O mapeamento do epítopo por IFA usando um painel de MAbs específicos para YFV ou SLEV E indicou que a proteína autêntica E foi expressa pelas células COS-1 transformadas por pCDYF2- ou pCDSLE4-3. Um estudo preliminar indicou que 100% dos camundongos ICR fêmeas de três semanas de idade tiveram o soro convertido após inoculação intramuscular com uma dose simples de 100 pg/10 pl de plasmídeo pCDSLE4-3 em água deionizada.
Exemplo 13: Preparação de plasmídeos recombinantes contendo seqüências de codificação para antígenos prM e E do vírus da encefalite St. Louis com seqüência de sinalização JEV. RNA genômico foi extraído de 150 pl de meio de cultura de célula Vero infectado com cepa MSI-7 de vírus da encefalite
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St. Louis usando um Kit de RNA Virótico QIAmp™ (Qiagen, Santa Clarita, CA). O RNA extraído foi eluído e suspenso em 80 μΐ de água isenta de nuclease e usado como um gabarito para ampliação das seqüências de codificação de gene prM e E do vírus de encefalite St. Louis. As seqüências de primer foram obtidas do trabalho de Trent e outros (Virology 156: 293-304 (1987)). Um fragmento de cDNA contendo a região de nucleotídeo genômico foi ampliado por reação em cadeia de polimerase-transcriptase inversa (RT-PCR). O sítio de restrição AfeI foi transformado por engenharia no terminal 5' do cDNA usando amplimer SLE463 (SEQ ID NO: 30). Um códon de terminação de tradução na estrutura, seguido por um sítio de restrição NotI foi introduzido na terminação 3' do cDNA por uso de amplimer cSLE2447 (SEQ ID NO: 31). O produto de RT-PCR foi purificado por um Kit de Purificação QIAquick™ PCR (Qiagen).
[0150] O amplicon de filamento duplo, produzido por uso dos dois amplímeros acima (SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31) foi digerido com enzimas AfeI e NotI para gerar 2004 fragmentos de DNA (463 para 2466nt) e inserido nos sítios AfeI e NotI de um vetor pCBJESS-M para formar pCBSLE (seqüência de nucleotídeo, SEQ ID NO: 21; seqüência de aminoácido, SEQ ID NO: 22). O pCBJESS-M foi derivado do plasmídeo pCBamp, que continha o promotor de gene precoce de citomegalovírus e elemento de controle de tradução e um modificado por engenharia, elemento de seqüência de sinalização de JE modificado (SEQ ID NO: 27). O elemento de seqüência de sinalização JE compreende a seqüência de sinalização JE modificada na posição -4 (Cys a Gly) e -2 (Gly a Ser) no plasmídeo pCBJESS original.
[0151] O sequenciamento de DNA atomizado usando um Sequenciador ABI prisma 377 (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA) foi usado para confirmar que o plasmídeo recombinante tinha uma seqüência de prM e E correta, conforme definido por Trent e outros (Virology 156: 293-304 (1987)).
Exemplo 14: Preparação de plasmídeos recombinantes contendo seqüências de codificação para proteínas prM e E do vírus da febre amarela (YFV) com seqüência de sinalização JEV. RNA genômico foi extraído de 150 μl de meio de cultura de célula Vero infectado com cepa 17D-213 de vírus da febre
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 78/118 / 99 amarela usando um Kit de RNA Virótico QIAmp™ (Qiagen, Santa Clarita, CA). RNA extraído foi eluído e suspenso em 80 μΐ de água isenta de nuclease e usado como um gabarito para ampliação das seqüências de codificação de gene prM e G do vírus da febre amarela. As seqüências de primer foram obtidas do trabalho de Dos Santos e outros (Virus Research 35:35-41 (1995)). Um fragmento de cDNA contendo a região de nucleotídeo genômica foi ampliado por reação de cadeia de polimerase- transcriptase inversa (RT-PCR). O sítio de restrição AfeI foi transformado por engenharia no terminal 5' do cDNA por uso do amplimer YF482 (SEQ ID NO: 28). Um códon de terminação de tradução na estrutura, seguido por um sítio de restrição de NotI foi introduzido na terminação 3' do cDNA por uso do amplimer cYF2433 (SEQ ID NO: 29). O produto de RT-PCR foi purificado por um Kit de Purificação de PCR QIAquick™ (Qiagen).
[0152] O amplicon de filamento duplo, produzido por uso dos dois amplimers acima (SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 29) foi digerido com enzimas AfeI e NotI para gerar 1.971 fragmentos de DNA (482 a 2452nt) e inserido nos sítios de AfeI e NotI de um vetor pCBJESS-M para formar pCBYF (seqüência de nucleotídeo, SEQ ID NO: 23; seqüência de aminoácido, SEQ ID NO: 24). O pCBJESS-M foi derivado de plasmídeos pCBamp, que continha o promotor de gene precoce citomegalovírus e o elemento de controle translacional e um elemento de seqüência de sinalização JE transformado por engenharia (SEQ ID NO: 27). O elemento de seqüência de sinalização JE compreende a seqüência de sinalização JE modificada na posição -4 (Cys a Gly) e -2 (Gly a Ser) de JESS no plasmídeo pCBJESS.
[0153] A seqüência de DNA automatizada usando um Sequenciador ABI prism 377 (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA) foi usado para confirmar que o plasmídeo recombinante tinha uma seqüência de prM e E correta, conforme definido por Dos Santos e outros (Virus Research 35:35-41 (1995)).
Exemplo 15: Preparação de plasmídeos recombinantes contendo seqüências de codificação para antígenos prM e E de vírus Powassan com seqüência de sinalização de JEV. RNA genômico foi extraído de 150 μl de meio
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 79/118 / 99 de cultura de célula Vero infectado com cepa LB do vírus Powassan usando um Kit de RNA Virótico QIAmp™ (Qiagen, Santa Clarita, CA). RNA extraído foi eluído e suspenso em 80 pl de água isenta de nuclease e usado como um gabarito para ampliação das seqüências de codificação de gene prM e G do vírus Powassan. As seqüências de primer foram obtidas do trabalho de Mandl e outros (Virology 194: 173-184 (1993)). Um fragmento de cDNA contendo a região de nucleotídeo genômica foi ampliado por reação de cadeia de polimerasetranscriptase inversa (RT-PCR). O sítio de restrição AfeI foi transformado por engenharia no terminal 5' do cDNA por uso do amplimer POW454 (SEQ ID NO: 25). Um códon de terminação de tradução na estrutura, seguido por um sítio de restrição de NotI foi introduzido na terminação 3' do cDNA por uso do amplimer cPOW2417 (SEQ ID NO: 26). O produto de RT-PCR foi purificado por um Kit de Purificação de PCR QIAquick™ (Qiagen).
[0154] O amplicon de filamento duplo, produzido por uso dos dois amplimers acima (SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26) foi digerido com enzimas AfeI e NotI para gerar 1.983 pares de fragmentos de DNA (454 a 2436nt) e inserido nos sítios de AfeI e NotI de um vetor pCBJESS-M para formar pCBPOW (seqüência de nucleotídeo, SEQ ID NO: 19; seqüência de aminoácido, SEQ ID NO: 20). O pCBJESS-M foi derivado de plasmídeos pCBamp, que continha o promotor de gene precoce citomegalovírus e o elemento de controle translacional e um elemento de seqüência de sinalização JE transformado por engenharia (SEQ ID NO: 27). O elemento de seqüência de sinalização JE compreende a seqüência de sinalização JE modificada na posição -4 (Cys a Gly) e -2 (Gly a Ser) de JESS no plasmídeo pCBJESS.
[0155] A seqüência de DNA automatizada usando um Sequenciador ABI prism 377 (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA) foi usado para confirmar que o plasmídeo recombinante tinha uma seqüência de prM e E correta, conforme definido por Mandl e outros (Virology 194:173-184 (1993)).
Exemplo 16: Preparação de plasmídeos contendo seqüências de codificação para proteínas estruturais de serótipo da dengue 2. Procedimentos tais como aqueles realizados para outros flavivírus (Vide Exemplos 1, 9 e 12-15)
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 80/118 / 99 devem ser seguidos para preparar vetores incluindo TU's de ácido nucleico para antígenos de serótipo da dengue 2. De acordo com os exemplos os amplimers usados para construção dos vetores podem ser escolhidos para transformar por engenharia a seqüência de sinalização do vírus da dengue normal ou eles podem ser escolhidos como para transformar por engenharia uma seqüência de sinalização de outro flavivírus, tal como uma seqüência de sinalização de vírus da encefalite japonesa.
[0156] Um plasmídeo contendo a região do gene de serótipo da dengue tipo 2 de prM a E deve ser construído. Os genes de prM e E do serótipo da dengue do tipo 2 (Deubel e outros, Virology 155:365-377 (1986); Gruenberg e outros, J. Gen. Virol. 69: 1301-1398 (1988); Hahn e outros, Virology 162:167-180 (1988)) devem ser ligados a um plasmídeo, tal como, pCDNA3 e então excisados e clonados nos vetores, tais como, pCBamp, pCEP4, pREP4 ou pRc/RSV (fornecido por Invitrogen, Carlsbad, CA) para permitir expressão. Caso necessário, uma seqüência específica de serótipo da dengue 2 em uma seqüência de cDNA pode ser ampliada usando um procedimento, tal como, reação de cadeia de polimerase (PCR). Alternativamente, se o RNA virótico for a fonte da região do gene, uma seqüência de DNA pode ser ampliada por um procedimento de RT-PCR. Um fragmento de DNA incluindo um códon de iniciação na extremidade 5' e um códon de terminação na extremidade 3' deve ser clonado em um vetor de expressão em um sítio específico de nuclease de restrição apropriado, de modo que o promotor precoce imediato (IE) do citomegalovírus (CMV), um códon de iniciação e um terminador, são operavelmente ligados à seqüência de serótipo da dengue 2.
Exemplo 17: Vacinação de camundongo usando uma vacina de DNA de serótipo da dengue 2. A vacina de TU nucleica de serótipo da dengue 2 codificando a região de gene de prM a E preparada no Exemplo 16 deve ser suspensa em um veículo farmacêutico apropriado, tal com água para injeção ou salmoura fisiológica tamponada e injetada intramuscularmente nos grupos de camundongos mamando. Os grupos de controle receberam uma preparação de plasmídeo comparável sem os genes específicos do serótipo da dengue 2. A
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 81/118 / 99 geração de anticorpos específicos para serótipo da dengue 2 e/ou células citotóxicas do sistema imune específicas para serótipo da dengue 2 deve ser avaliada em intervalos fixos, após isto, por exemplo, em intervalos semanais. Em cerca de dois a quatro meses após administração da vacina de TU de ácido nucleico, os camundongos devem ser desafiados com o vírus de serótipo da dengue 2. Os níveis de viremia devem ser avaliados em intervalos apropriados após isto, tais como a cada dois dias. A proteção passiva por anticorpo maternal deve ser avaliada, conforme indicado no Exemplo 8.
Exemplo 18: Projeto e construção de peptídeos de sinalização aperfeiçoados. Os peptídeos de sinalização podem determinar a translocação e orientação da proteína inserida, conseqüentemente, a topologia de proteínas prM e E. O aspecto mais comum dos peptídeos de sinalização de eucariotes consiste em 8 a 12 estiramentos de aminoácidos hidrófobos denominados a região h (de Heijne, Signal sequences. The limits of variation J. Mol. Biol. 184:99-105 (1985)). A região entre o iniciador Met e a região h, que é conhecida como região n, geralmente possui um a cinco aminoácidos e normalmente transporta aminoácidos carregados positivamente. Entre a região h e o sítio de clivagem está a região c, que consiste em três a sete resíduos polares, porém em sua maioria, resíduos de aminoácido não carregado. Durante a síntese da poliproteína virótica, a modulação do sítio de clivagem de distinção de uma conformação críptica para clivável na junção das proteínas C e prM, depende da remoção anterior da proteína C por complexo de protease virótica, NS2B/NS3 (Lobigs, Flavivirus premembrane protein cleavage and spike heterodimer secretion require the function of the viral proteinase NS3, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6218-6222 (1993)). Assim, é crítico considerar-se a eficácia da seqüência de sinalização virótica quando as proteínas prM e E devem ser expressas sozinhas por um plasmídeo de expressão.
[0157] As diferenças de peptídeo de sinalização nas várias construções de plasmídeo podem ser responsáveis, pelo menos em parte, pela diferença na translocação da proteína, apresentação do sítio de clivagem e topologia correta, assim, na secreção de prM e E e formação de VLP. A modulação ou otimização
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 82/118 / 99 destes atributos pode ser aperfeiçoada por seleção ou uso de seqüências de sinalização com propriedades que fornecem as características desejadas. Isto pode ser realizado por uso de programas de computador eu aprendem com a máquina, por exemplo, um modelo impedido Markov (HMM) treinado em eucariotes (vide Henrik Nielsen e outros, Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model, In Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, Califórnia, páginas 122-130 (1998); Nielsen e outros, Machine learning approaches to the prediction of signal peptides and other protein sorting signals Protein Engineering 12:3-9 (1999); Nielsen e outros, A neural network method for identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites, Int. J. Neural Sys. 8:581-599 (1997); From sequence to sorting: Prediction of signal peptides, Henrik Nielsen, Tese de Ph.D. Defendida no Departamento de Bioquímica, Universidade de Estocolmo, Suécia (em 25 de maio de 1999); cada uma das quais é incorporada aqui como referência, especificamente para ensinamento relacionado à otimização das seqüências de sinalização usando algoritmos fornecidos pelo computador).
[0158] Um exemplo do tipo de programa usado é encontrado em http: // www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP-2.0 como de 3 de abril de 2002. O HMM descrito nas citações referidas e incorporadas foi aplicado para calcular a probabilidade do peptídeo de sinalização das seqüências de peptídeo de sinalização de prM nas diferentes construções de plasmídeo (tabela 7).As pesquisas SinalP-HMM previram corretamente os sítios de clivagem de peptidase de sinalização em todas as construções. Contudo, diferenças consideráveis na probabilidade de clivagem (variando entre 0,164 e 1.000) e na probabilidade de peptídeo de sinalização (variando entre 0,165 a 1,00) foram observadas (tabela 7). Não é surpreendente, como a probabilidade do sítio de clivagem e peptídeo de sinalização são conhecidas de também serem influenciadas pelos aminoácidos carregados positivamente na região n, o comprimento do aminoácido hidrófobo na região h e da composição do aminoácido na região c nas construções (Chang e outros, Flavivirus DNA vaccines: current status and potential, Annals of NY
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Acd. Sci. 951: 272-285 (2001); Sakaguchi e outros, Functions of Signal and Signal-Anchor Sequences are Determined by the Balance Between the Hydrophobic Segment and the N-terminal Charge, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 16-19 (1992)).
[0159] Três construções de plasmídeo de vírus JE, cada uma derivada de uma cepa diferente do vírus JE, mostrou potenciais de vacina diferentes (Lin e outros, DNA immunization with Japanese encephalitis virus nonstructural protein NS1 elicits protective immunity in mice, J. Virol. 72: 191-200 (1998); Konishi e outros, Induction of protective immunity against Japanese encephalitis in mice by immunization with a plasmid encoding Japanese encephalitis virus premembrane and envelope genes, J. Virol. 72:4925-4930 (1998); Chang e outros, A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice J. Virol. 74: 4244-4254 (2000)). As seqüências de peptídeo de sinalização nestas construções são diferentes no comprimento da região n que pode ou não conter aminoácidos carregados (Tabela 7). A região n contendo aminoácidos carregados positivamente forma um laço pequeno no lado citoplásmico que faz com que a região h (hélice da transmembrana) seja inserida em uma orientação de cauda, expondo o sítio de clivagem de distinção. Em nosso estudo, proteínas prM/M e E contendo VLPs secretados seria purificada do meio de cultura da linha de célula transformada pCDJE-2, JE4B ou células COS- transformadas transientemente pCBJE-14. Os VLPs purificados com gradiente e virions possuem propriedades imunológicas e bioquímicas idênticas. A eficiência de processamento da proteína de pRM para M madura, a marca da morfogenese de flavírus, é também semelhante entre VLPs e partículas de vírus. Assim, as proteínas de prM e E expressas por pCDJE2-7 e pCBJE1-14 podem ser expressas como proteínas de transmembrana do tipo I na orientação semelhante aquela do prM e E de vírus (Chang e outros, A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice, J. Virol. 74: 4244-4252 (2000)). Ao contrário, a proteína de prM de pcDNA3JEME seria expressa como uma proteína de membrana do tipo II com sua região h de
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 84/118 / 99 transmembrana inserida em uma orientação de cabeça devido a ausência de aminoácidos carregados positivamente em sua região n (Konishi e outros, Induction of protective immunity against Japanese encephalitis in mice by immunization with a plasmid encoding Japanese encephalitis virus premembrana and envelope genes, J. Virol. 72:4925-4930 (1998)). A síntese da proteína eficiente em combinação com a proteína expressa possuindo a topologia correta, especificamente prM e E expressos, pode melhorar a formação de VLP e secreção e, assim, promove a imunogenicidade da vacina de DNA (Chang e outros, A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice, J. Virol. 74:4244-4252 (2000)).
[0160] O uso de computações com base em computadores, conforme descrito acima, foi aplicado para otimizar o projeto do plasmídeo de expressão. Especificamente, a potência previsível do programa SignalP-HMM foi aplicada ao projeto do plasmídeo de expressão do vírus WN (Tabela 2) (Davis e outros, West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays, J. Virol. 75: 4040-4047 (2001)). O plasmídeo pCBWN consiste em uma versão curta do peptídeo de sinalização do vírus JE seguido por seqüência de gene prM-e de vírus WN. O potencial de vacina desta construção foi amplamente demonstrado, como uma injeção i.m. simples de DNA de pCBWN não apenas induziu uma imunidade protetora, porém também impediu infecção do vírus WN em camundongos e cavalos.
[0161] Conforme discutido anteriormente, e conforme demonstrado nos exemplos 13-15, a seqüência de sinalização codificada por vírus do mesmo vírus que as regiões codificando antígeno não é necessariamente o peptídeo de sinalização ótimo disponível. Adicionalmente, a seqüência de sinalização não modificada não é necessariamente ótima. Por exemplo, o peptídeo de sinalização codificado no plasmídeo de pCBJE1-14 pode ser aperfeiçoado, conforme medido pela probabilidade da seqüência de sinalização por encurtamento da região n,
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 85/118 / 99 alterando-se a seqüência da região c ou por combinação de ambas modificações (figura 6). Como ilustração, uma versão encurtada do peptídeo de sinalização de vírus JE foi usada para a expressão dos genes prM e E do vírus WN, conforme descrito aqui e nos documentos incorporados aqui como referência como para ensinamento (Davis e outros, West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and hose from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays, J. Virol. 75: 4040-4047 (2001)). Estudos de titulação de dose por inoculação i.m. simples indicaram que o pCBWN era pelo menos duas a quatro vezes mais imunogênico do que o pCBJE1-14 no camundongo.
Exemplo 19: Vacinas Multivalentes. Vacinas multivalentes e/ou combinação projetada para imunização contra flavivírus múltiplos podem também ser produzidas. Na preparação de uma vacina multivalente, os componentes da vacina monovalente são preparados, os quais incluem elementos relacionados aos agentes patogênicos de interesse, tais como, YF, serotipos diferentes de vírus DEN, JE, WN, SLE e TBE (RSSE e CEE) ou qualquer outra combinação de flavivírus. O projeto e produção de construções de DNA são descritos nos outros exemplos e na especificação são realizados conforme descrito. Combinações de vacinas apropriadas podem ser feitas para prover vacinas multivalentes ou vacinas de combinação que protegem contra agentes patogênicos múltiplos. Os dados preliminares do nosso grupo demonstraram que a injeção i.m. das vacinas de DNA combinadas de pCBJE1-14 e pCBWN induziram anticorpos Nt específicos para vírus JE e WN em camundongos (tabela 8). Cada componente monovalente, mesmo se construído usando reguladores transcripcionais e translacionais idênticos, preferivelmente seriam testados em um sistema de modelo análogo para garantir seu potencial de vacina. Um coquetel de combinação de vacinas pode então ser formulado. Estes coquetéis de vacina podem ser talhados especificamente para regiões geográficas específicas. Por exemplo, um coquetel de vacina para Ásia tropical e subtropical incluiria quatro serótipos de vacinas para vírus de DEN, WN e JE. De modo semelhante, os coquetéis de vacina úteis para África e América Latina incluiriam quatro
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 86/118 / 99 serótipos de vacinas para os vírus DEN, WN e YF e quatro serótipos para vacinas para vírus DEN, Rocio e YF, respectivamente.
Exemplo 20: Preparação e teste de vacinas do vírus da dengue tipo 2 combinantes.
a. Resumo do Exemplo: Uma série de plasmídeos que codificam a pré- membrana (prM) e proteínas de invólucro (E) do vírus da dengue tipo 2 (DEN-2) foi construída. Estes plasmídeos incluíram uma construção DEN-2-prM-E autêntica (pCBD2-14-6) (SEQ ID NO: 42) codificando a proteína descrita pela SEQ ID NO: 43, uma construção quimérica E do vírus da encefalite japonesa (JE) a 90% DEN-2-E-10% (pCB9D2-1J-4-3) (SEQ ID NO: 44) que codifica a proteína descrita pela SEQ ID NO: 45 e uma construção quimérica E de JE 80% DEN-2-E-20% (pCB8D2-2J-2-9-1) (SEQ ID NO: 46) que codifica a proteína descrita pela SEQ ID NO: 47. A reatividade do anticorpo monoclonal (MAb) indicou que todos os três plasmídeos expressaram epítopos de proteína E que reagiram com um painel de anticorpos de domínio 1, 2 e 3. Contudo, apenas a construção pCB8D2-2J-2-9-a (SEQ ID NO: 46) secretou níveis altos de prM, M (prM maturado) e E nos meios de células COS-1 transformadas por plasmídeos. A porção maior da proteína prM e E expressa por células COS-1 transformadas com plasmídeo pCBD2-14-6 (SEQ ID NO: 42) e por células COS-1 transformadas com plasmídeo pCB9D2-4-3 (SEQ ID NO: 44) permaneceu ligada à membrana. A substituição de 20% da seqüência codificando a proteína E de DEN-2 E com a seqüência codificando a seqüência de proteína E de JE correspondente não teve efeito na reatividade de MAbs.
[0162] Nos testes, os grupos de camundongos receberam duas imunizações intramusculares de plasmídeos selecionados nas semanas 0 e 3, e a resposta imune foi avaliada por determinação da neutralização específica e anticorpo ELISA. O plasmídeo expressando prM e E secretados, que pode formar partículas subviróticas (SVPs), era superior às outras construções na estimulação de uma resposta de anticorpo. Titulações de 90% de neutralização variando de 1:40 a >
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1:1.000 foram observadas de 7 a 9 espécimes de soro de camundongos imunizados com pCB8D2-2J-2-9-1.
b. Importância de vírus da DEN-2 e vacinas: A febre da dengue (DEN) é uma infecção aguda que ocorre em áreas subtropicais e tropicais. É uma das doenças flaviviróticas mais importantes dos seres humanos. Conforme citado anteriormente, existem quatro serótipos DEN distintos (DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4) do vírus da dengue. A infecção com qualquer um destes é geralmente assintomática ou apenas causa um estado febril propriamente limitado, conhecido como febre da dengue (DF). Contudo, em uma pequena porcentagem dos casos, a infecção por vírus da dengue resulta em uma doença muito mais séria, a febre hemorrágica da dengue que ameaça a vida ou sindrome de choque da dengue (DHF/DSS). Assim, enquanto existem cerca de 100 milhões de casos de DF relativamente branda disseminados pelo mundo anualmente, os quais são uma questão limitada, existe também uma estimativa de 500.000 casos hospitalizados de DHF/DSS reportados anualmente. Para proteção contra esta doença, uma vacina de DEN segura e eficaz contra todos os quatro serótipos é necessária, para administração as crianças e adultos não imunes nas regiões endêmicas e epidêmicas de DEN.
[0163] Vacinas seguras devem minimizar o risco em potencial de infecção séria por viroses virulentas. Tais viroses virulentas podem surgir da reversão do gene ou recombinação de alguns tipos de vacinas derivados de viroses de vacina atenuadas. Tais ocorrências surgiram na campanha de erradicação do vírus da polio (Guillot e outros, Natural Genetic Exchanges between Vaccine and Wild Poliovirus Strains in Humans, J. Virol. 74:8434-8443 (2000); Liu e outros, Molecular Evolution of a Tipe 1 Wild-Vaccine Poliovirus Recombinant during Widespread Circulation in China, J. Virol. 74:11153-11161(2000). Adicionalmente o sequenciamento genômico de uma cepa americana do vírus da febre amarela, TRINID79A, demonstra que existe uma similaridade extensiva entre esta cepa e o vírus da vacina da febre amarela atenuada, FNV (Chang e outros, Nucleotide sequence variation of the envelope protein gene identifies two distinct genotypes of yellow fever virus, J. Virol. 69:5773-5780 (1995);
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Pisano e outros Complete nucleotide sequence and phylogeny of an American strain of yellow fever virus, TRINID79A, Arch. Virol. 144:1837-1853 (1999)). Embora não conclusivo propriamente, a similaridade sugere fortemente que TRINID 79A é derivado do vírus de vacina FNV.
[0164] O uso de vacinas a base de DNA é uma nova e promissora abordagem de imunização para o desenvolvimento de vacinas de flavivírus (conforme descrito aqui em Chang e outros, Flavivirus DNA vaccines: current status and potential, Ann. NY Acad. Sci. 951: 272-285 (2001), e nas referências citadas aqui). Neste exemplo, várias vacinas da DEN-2 foram produzidas e a resposta imune nos camundongos após imunização i.m. das construções de DEN-2 foram correlacionadas a eficácia da seção de prM/M e E. Uma construção que conduziu à secreção de quantidades significativas de antígenos prM/M e E foi mostrada como sendo capaz de estimular altas titulações de anticorpos de neutralização em camundongos vacinados com plasmídeos.
c. Materiais e Processos [0165] Cultura de célula e cepas de vírus. Células COS-1 (ATTC, Manassas, VA; 1650-CRL) foram desenvolvidas a 37°C com 5% de CO2 em meio essencial mínimo Eagle modificado da Dulbecco (DMEM, GIBCO, Grand Island, NY) suplementado com soro bovino fetal inativado por aquecimento a 10% (FBS, Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT), 1mM de piruvato de sódio, 1mM de aminoácidos não essenciais, 30 ml/litro de NaHCOs a 7,5%, 100 unidades/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina. Células Vero e C6/36 foram desenvolvidas sob as mesmas condições usadas para as células COS-1. O vírus da DEN-2, cepa-16681, foi usado para clonagem de cDNA, IgG ELISA e teste de neutralização de redução de placa (PRNT). O vírus foi propagado na cultura de célula Có/C36. O vírus usado para estudos imunológicos ou bioquímicos foi purificado por precipitação com polietileno glicol a 7% (PEG-8000; Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) seguido por ultracentrifugação em gradientes de tartrato de potássio a 45%-glicerol a 30% (Obijeski e outros, Segmented genome and nucleocapsid of La Crosse virus, J. Virol. 20:664-675 (1976)).
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 89/118 / 99 [0166] ii. Construção de Plasmídeo. RNA genômico foi extraído de 150 μΐ de meio de cultura de célula C6/36 infectada com cepa DEN-2 16681 usando o Kit RNA Virótico QIAamp™ (Qiagen, Santa Clarita, CA). RNA extraído foi ressuspenso em 80 μl de água tratada com pirocarbonato de dietila (DEPC, Sigma, St. Louis, MO) e então usada como um gabarito na ampliação de PCRtranscriptase inversa (RT-PCR) dos genes prM e E do vírus da DEN-2. As seqüências de primer (tabela 9) foram designadas com base nas seqüências publicadas (Gadkari e outros, Critical evaluation of Kyasanur Forest disease virus neutralizing antibodies found in bats (a preliminary report), Indian J. Med. Res. 64:64-67 (1976); Kinney e outros, Construction of infectious cDNA clones for dengue 2 virus: strain 16681 and its attenuated vaccine derivative, strain PDK-53, Virology 230:300-308 (1997)). O sítio de reconhecimento e clivagem para a enzima de restrição KasI foi incorporado no término 5' do amplicon de cDNA. Um códon de terminação na estrutura, seguido por sítio de restrição NotI, foi introduzido na terminação 3' do amplicon de cDNA. Um códon de terminação na estrutura, seguido por um sítio de restrição NotI foi introduzido na terminação 3' do amplicon de cDNA. O amplicon de cDNA do vírus DEN-2 foi digerido com enzimas KasI e NotI e foi então inserido nos sítios KasI e NotI de um vetor pCBJESS para formar o plasmídeo 100% de DEN-2 E, pCBD2-14-6 (SEQ ID NO: 42).
[0167] Para construir os plasmídeos DEN-2 E a 90% e 80%, o plasmídeo 100% DEN-2, pCBD2-14-6 (SEQ ID NO: 42) e o plasmídeo JE, pCBJE1-14 (SEQ ID NO: 17), foram usados como os gabaritos de PCR para ampliar a seqüência de DNA de DEN-2 e JE, respectivamente. Os conjuntos de primers usados nas reações de ampliação para obter os fragmentos de gene de DEN-2 e JE são listados na Tabela 9. Os sítios de primerização T7 e SP6 são encontrados no plasmídeo pCBamp, derivado do plasmídeo de pCDNA-3 original (Invitrogen, Carlsbad, CA) e podem ser utilizados conforme desejado ou necessário. Os fragmentos de DNA ampliados de PCR para o gene de proteína JE E a 10% DEN-2 a 90% foram digeridos com endonuclease de restrição BxtXI, ligados usando ligase de DNA T4, digeridos com enzima KasI e NotI e inseridos nos
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 90/118 / 99 sítios KasI e Notl do vetor pCBJESS para obter o plasmídeo, pCB9D2-1J-4-3 (SEQ ID NO: 44). Os fragmentos de DNA ampliados por PCR para o gene E de JE DEN-2 a 20% foram digeridos com BsmBI, ligados com ligase de DNA de T4, digeridos com enzima KasI e NotI e inseridos nos sítios KasI e NotI do vetor pCBJESS para obter o plasmídeo, pCB8D2-2J-2-9-1 (SEQ ID NO: 46). A representação esquemática destas três construções de plasmídeo são mostradas na figura 7. As regiões de junção de proteína E de DEN-2 a 90% JE a 10% e DEN-2 a 80% JE a 20%, respectivamente, são mostradas na Tabela 9.
[0168] O sequenciamento automatizado de DNA foi realizado em um Sequenciador ABI Prism 377 (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA) de acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante. Os plasmídeos recombinantes com as seqüências de prM e E corretas foram identificados usando análise de seqüência.
[0169] iii. Expressão transiente de antígeno recombinante de DEN-2 nas células COS-1 por eletroporação. As células COS-1 foram eletroporadas separadamente com cada plasmídeo de DEN-2 ou controle de plasmídeo de expressão de proteína fluorescente verde (PEGFP, Clonetech, San Francisco, CA) usando o protocolo descrito nos exemplos e em Chang e outros (A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice, J. Virol. 74: 4244-4252 (2000)). As células foram semeadas em frascos de cultura de 75 cm2 e mantidas a 37°C e CO2 a 5%. Seis horas após a eletroporação, os meios de crescimento foram substituídos com um meio de manutenção contendo 2% de soro bovino fetal. O meio de cultura de tecido e as células foram colhidos separadamente 48 horas seguindo a eletroporação para caracterização de antígeno.
[0170] iv. Mapeamento de epítopo usando anticorpos monoclonais específicos de DEN-2 E. Quarenta e oito horas após a eletroporação, as células aderentes foram tripsinizadas, resusspensas em PBS contendo soro de cabra a 5%, manchadas em slide de 12 poças e secas ao ar. As células aderidas ao slide de manchas foram fixadas com acetona por 10 minutos a -20°C e deixadas secar ao ar. Anticorpos monoclonais específicos de proteína E (MAb) foram usados para
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 91/118 / 99 detectar expressão por ensaio de anticorpo de imunofluorescência indireta (IFA), conforme descrito anteriormente (Tabela 10; Chang e outros, A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice, J. Virol. 74:4244-4252 (2000)).
[0171] v. Caracterização do antígeno do vírus de DNE-2 recombinante. O meio de cultura foi colhido 48 horas após eletroporação. ELISA de captura de antígeno (captura de Ag) foi usado para detectar antígeno do vírus DEN-2 secretado no meio de cultura de células COS-1 transformadas transientemente. O MAb 4G2 e MAb 6B6C-1 conjugado com peroxidase de rábano silvestre foram usados para capturar os antígenos do vírus da DEN e detectar antígeno capturado, respectivamente (Chang e outros, A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice, J. Virol. 74:4244-4252 (2000); Hunt e outros, A recombinant particulate antigen of Japanese encephalitis virus produced in stablytransformed cells is an effective noinfectious antigen and subunit immunogen, J. Virol. Methods 97:133-149 (2001)).
[0172] Quarenta e oito horas após a eletroporação, as células transformadas para cada plasmídeo foram tripsinizadas e ressuspensas em PBS como alíquotas contendo 5 x 106 células. Estas amostras de células foram processadas para extração de proteína de membrana usando o kit de reagente de proteína de membrana de mamífero Mem-PER (Pierce, Rockford, IL) seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante. As proteínas hidrófobas e hidrófilas são isoladas. Este procedimento foi desenvolvido para enriquecimento da proteína de membrana integral encontrada na fase hidrófoba. As frações hidrófoba e hidrófila foram analisadas por ELISA de captura Ag para antígeno recombinante DEN-2.
[0173] O antígeno recombinante no meio foi concentrado por precipitação com polietileno glicol a 10% (PEG)-8000. O precipitado foi ressuspenso no tampão de TNE (40 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 7,5) para 1/100 do volume original, clarificado por centrifugação e armazenado a 4°C. O antígeno recombinante concentrado por precipitação de PEG e ressuspenso no tampão de
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TNE foi extraído com etanol a 4,0% para remover PEG residual (Hunt e outros, A recombinant particulate antigen of Japanese encephalitis virus produced in stably-tarnsformed cells is na effective noninfectious antigen and subunit immunogen, J. Virol. Methods 97:133-149 (2001)). Antígenos extraídos com etanol, proteínas de membrana hidrófobas de células transformadas e virions DEN-2 purificados por gradiente foram analisados em um gel NuPAGE, de gradiente 4-12% Bis-Tris em um Excel Plus Eletrophoresis Apparatus™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), seguido por eletromanchamento em membranas de nitrocelulose usando uma Unidade de Manchamento Excel Plus (Invitrogen Corp.). A proteína específica do vírus de DEN-2 foi detectada por manchamento Western usando MAbs específicos para vírus DEN-2 1A6A-8 (específico para E) e 1A2A-1 (específico para capsídio), bem como antisoro de coelho específico para prM DEN-2 e soro de camundongo específico para um peptídeo composto de aminoácido 1-34 da proteína DEN-2 M e fluido ascítico de camundongo normal foi usado como controle negativo (Murray e outros, Processing of the dengue virus type 2 proteins prM and C-prM, J. Gen. Virol. 74 (Pt 2): 175-182 (1983); Roehrig e outros, Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus, Jamaica, Virology 246:317-328 (1998)).
[0174] vi. Vacinação de camundongos. Grupos de dez camundongos fêmeas ICR de três semanas de idade, fora de procriação, foram usados neste estudo. Os camundongos receberam injeção i.m. de pCBD2-14-6, pCB9D2-IJ-4-3, pCB8D22J-2-9-a ou pEGFP na semana 0 e semana 3 em uma dose de 100 pg em um volume de 100 pg por camundongo. O DNA do plasmídeo foi purificado com células XL-1 blue com Kits EndoFree™ de plasmídeo Giga (Qiagen) e ressuspenso em PBS, pH 7,5 em uma concentração de 1,0 pg/pl. Os camundongos que receberam 100 pg de pEGFP foram usados como controles vacinados de plasmídeo. Os camundongos foram sangrados a cada 3 semanas seguindo a injeção e a resposta do anticorpo específica para vírus da DEN-2 foi avaliada por uso de ELISA e PRNT indiretos.
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 93/118 / 99 [0175] vii. Testes sorológicos. Espécimes de soro pré e pós-vacinação foram testados quanto a capacidade de ligação de anticorpo ao virion purificado DEN-2 por ELISA, neutralização de anticorpo (Nt) por PRNT e anticorpos que reconhecem proteínas de vírus DEN-2 purificadas por manchamento Western. PRNT foi realizado com células Vero, conforme descrito anteriormente (Chang e outros, A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice, J. Virol. 74:4244-4252 (2000)), usando vírus da DEN-2 (cepa 16681) e JE (cepa
Nakayama). Os pontos finais foram determinados em um nível de redução de placa a 90% (Hunt e outros, A recombinant particulate antigen of Japanese encephalitis virus produced in stably-transformed cells is na effective noinfectious antigen and subunit immunogen, J. Virol. Methods 97:133-149 (2001).
d. Resultados [0176] i - Expressão transiente de antígeno recombinante de vírus da DEN-2. Expressão de genes prM e E do vírus DEN-2 ou um gene E quimérico de uma combinação de seqüências de vírus de JE e DEN-2 (DEN 80%-JE 20% ou DEN 90%-JE 10%) foi realizada por transformações separadas de cada um dos três plasmídeos de DNA de DEN-2 recombinantes nas células COS-1. O projeto do plasmídeo básico teve como suporte os resultados dos estudos anteriores com plasmídeos recombinantes de vírus JE e vírus WN, onde as células transformadas por plasmídeo expressaram e secretaram proteínas viróticas autênticas no fluido de cultura de célula (Chang e outros, A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice, J. Virol. 74:4244-4252 (2000); Davis e outros, West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays, J. Virol. 75:4040-4047 (2001)). A expressão transiente das proteínas recombinantes de DEN-2 foi inicialmente avaliada quanto a ELISA de captura de Ag dos sobrenadantes de cultura de célula e por IFA de células COS-1 transformadas, fixadas com acetona (Chang e outros,
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A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice, J. Virol. 74:4244-4242 (2000)). O ponto de expressão de antígeno ótima foi determinado para 48 horas seguindo eletroporação.
[0177] ii. Mapeamento de epítopo da proteína E expresso por células COS-1 transformadas transientemente. A proteína DEN-2 expressa por cada um dos plasmídeos recombinantes foi avaliada por IFA usando um painel de murinos MAbs com reatividade conhecida para vírus DEN-2 (Tabela 10: Henchal e outros, Epitopic analysis of antigenic determinants on the surface of dengue-2 virions using monoclonal antibodies, Am. J. Trop. Med. Hyg. 34:162-169 (1985); Roehrig e outros, Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus, Jamaica, Virology 246: 317-328 (1998)). O painel MAb incluiu anticorpos reativos com cada um dos três domínios antigênicos da proteína E de flaviviroses bem como proteínas prM e C. (Mandl e outros, Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model, J. Virol. 63: 564-571 (1989); Rey e outros, The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 Â resolution, Nature 375: 291-298 (1995)). Os MAbs específicos para Domínios 2 e 3 antigênicos de flavivírus mostraram reatividade qualitativa quase idêntica com o vírus DEN-2 e cada uma das três proteínas expressas por plasmídeo. Um dos MAbs específico para Domínio 1, 1B4C-2 também mostrou um padrão de reatividade semelhante a todas as proteínas expressas. Contudo dois dos MAbs específicos de Domínio-1, 2B3A-1 e 9A4D-1 foram muito menos reativos com a proteína E expressa pelos plasmídeos pCBD2-14-6 e pCB9D2-1J4-3 conforme mostrado por titulação de ponto final (valores em parêntesis, tabela 10). A comparação das titulações de ponto final revelou a expressão aparente e pobre dos epítopos C3 e C4 nas construções contendo DEN-2 E a 100% e DEN-2 E a 90% e JE E a 10%. MAb 2H2, específico para prM, tinha a mesma reatividade que o antígeno expresso por todos os três plasmídeos. MAb anti-C 1A2A-1 reagiu bem com vírus DEN-2 e teve reatividade não específica, de baixo
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 95/118 / 99 nível, com as proteínas viróticas expressas por plasmídeos, que incluíram prM e E, porém não C.
[0178] iii. Comparação de proteína secretada e proteína ligada à membrana produzida por cada um dos três plasmídeos recombinantes DEN-2. Quantidades semelhantes de fluido de cultura de célula foram colhidas de células COS-1, 48 horas após transformação de cada plasmídeo DEN-2 recombinante. Antígeno recombinante secretado encontrado no fluido de cultura foi concentrado 100 vezes por precipitação com PEG, seguido por extração com etanol para remover PEG o que interferiu com a análise subsequente por eletroforese de gel poliacrilamida. A quantidade relativa de antígeno secretado expressa por cada plasmídeo foi determinada por análise de ELISA de captura de Ag de ambas preparações de cultura de célula extraída de etanol e precipitada com PEG (Tabela 11). O antígeno secretado foi detectado apenas de células transfectadas com pCB8D2-2J-2-9-1 (SEQ ID NO: 34), que continham genes 80% de DEN-2 E e 20% de JE E. Os plasmídeos recombinantes contendo tanto genes de DEN-2 E a 100% quanto DEN-2 E a 90% e JE E a 10% não produziram antígeno detectável por ELISA no fluido de cultura, a despeito dos esforços para concentrar a proteína expressa.
[0179] Análise de manchamento Western foi também usada para avaliar a produção do antígeno secretado por cada um dos plasmídeos recombinantes DEN-2. Para fins de comparação, volumes equivalentes de sobrenadante de cultura de célula extraído com etanol, precipitado com PEG foram operados nos géis de gradiente de NuPAGE, eletromanchados para nitrocelulose e analisados usando MAbs ou antisoros policlonais capazes de reagir com todas as proteínas estruturais de DEN-2 (figura 8A). Análise de manchamento Western mostrou sensibilidade maior na detecção de antígeno recombinante do que o ELISA de captura Ag, uma vez que as proteínas específicas para DEN-2 foram detectadas no fluido de cultura de dois dos plasmídeos, pCB8D2-2J-2-9-1 e pCB9D2-1J-4-3 (SEQ ID NOS: 46 e 44, respectivamente). O plasmídeo pCB8D2-2J-9-1 (SEQ ID NO: 46) expressou a maior quantidade de antígeno secretado que foi mostrada como sendo composta de proteínas E, prM e M. Antígeno secretado menos
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 96/118 / 99 relativamente foi produzido por pCB9D2-1J-4-3 (SEQ ID NO: 44) e níveis fracamente detectáveis foram encontrados para preparação de pCBD2-14-6 (SEQ ID NO: 42), que pareceu conter proteína E relativamente menos expressa, especialmente se a reatividade não específica do MAb não específico para E, 1A6A-8, no pEGFP de controle, tiver sido levada em consideração (figura 8A, pranchas a, b para 14-6 e GFP).
[0180] Uma vez que E, prM e M são proteínas associadas à membrana através de sua síntese intracelular, qualquer avaliação da expressão destas proteínas pelos três plasmídeos DEN-2 recombinantes incluiria uma avaliação das preparações de membrana de célula a partir das células transformadas por plasmídeos. O Kit de Reagente de Extração de Proteína de Membrana de Mamíferos Mem-PER (Pierce) foi usado para isolar as proteínas de membrana integrais de números equivalentes de células transformadas por cada um dos plasmídeos recombinantes. Proteínas hidrófobas foram separadas de proteínas hidrófilas por divisão de fase. A análise preliminar por ELISA de captura de Ag indicou que a fração de proteína hidrófila não era reativa; contudo, as frações de proteína hidrófobas das células COS-1 transformadas com cada um dos plasmídeos de DEN-2 recombinante tinham titulações semelhantes nos testes ELISA (tabela 11). Estes resultados indicaram que o antígeno recombinante codificado por todos os três plasmídeos foi expresso seguindo-se a transformação, porém que os antígenos recombinantes expressos não foram todos secretados no mesmo nível.
[0181] A confirmação dos resultados de captura de Ag para as frações de proteína hidrófobas foi realizada por manchamento Western (figura 8B). Volumes equivalentes de frações de proteína de cada uma das células transformadas por plasmídeo foram diluídos de acordo com as recomendações do fabricante para eletroforese de gel SDS-poliacrilamida, a fim de reduzir distorção de faixa e prancha. O imunomanchamento com MAbs específicos para E-, prM-, C- e M- ou antisoros policlonais demonstrou que todos os três plasmídeos DEN-2 recombinantes induziram a produção de quantidades semelhantes de antígeno recombinante composto de E e prM. Nenhuma proteína M foi detectada, tanto porque ela não foi processada de prM ou porque os níveis eram muito baixos para
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 97/118 / 99 serem detectados. A despeito dos esforços para reduzir a distorção de faixa, altos níveis de detergente nas amostras de proteína hidrófobas aparentemente fizeram com que E e prM operassem em uma maneira ligeiramente aberrante (migração mais lenta) em comparação às amostras sem tais altas concentrações de detergentes (comparar migração de E e prM nas figuras 8A e 8B).
[0182] iv. Comparação da mesma resposta imune em camundongos vacinados com três plasmídeos de DNA recombinantes DEN-2 diferentes. Camundongos ICR de três semanas foram imunizados por injeção de i.m. com 100 pg de pCB8D2-2J-2-9-1 (SEQ ID NO: 46), pCB9D2-1J-4-3 (SEQ ID NO: 44), pCBD214-6 (SEQ ID NO: 42) ou pEGFP nas semanas 0 e 3. Os camundongos foram sangrados, 3, 6 e 9 semanas após a imunização primária. Soros individuais e em grupo foram testados por ELISA indireto, usando diluições de classificação de 1:100 e 1:400 nas semanas 3 e 6 após vacinação, e titulações de ponto final na semana 9 após vacinação. Os soros de nove semanas foram também testados por PRNT com ambos vírus DEN-2 e JE. Os resultados de ELISA mostraram que, após uma imunização (soros de 3 semanas) todos os camundongos que receberam pCB8D2-2J-2-9-1 foram soroconvertidos, considerando-se que apenas 50% dos camundongos vacinados com pCB9D2-1J-4-3 e 20% com pCBD2-14-6 reagiram com vírus DEN-2 (Tabela 12). Nove semanas após vacinação, todos os camundongos vacinados tanto com pCB8D2-2J-2-9-1 ou pCBD2-1J-4-3 demonstraram reatividade ELISA anti-DEN-2; contudo, as titulações médias geométricas diferiram significativamente (titulações de 1:20.000 versus 1:708, respectivamente). Apenas 40% dos camundongos imunizados com pCBD2-14-6 tinham titulações ELISA anti-DEN-2 maiores do que 1:100. Um manchamento Western de soros de 9 semanas agrupados de camundongos imunizados com pCB8D1-2J-9-1 no vírus de DEN-2 purificado mostrou que a resposta imunodominante era para a glicoproteína E. Foi também observada ligeira reatividade para prM e M.
[0183] Mais significativamente, em termos de avaliação do potencial de vacina dos três plasmídeos de DEN-2, a indução do anticorpo de neutralização de vírus em 7 dos 9 camundongos imunizados com pCB8D2-2J-2-9-1 (SEQ ID NO: 46)
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 98/118 / 99 foi observada, com base em um ponto final de redução de placa de 90% (tabela 10). Contudo, se um ponto final de neutralização a 50% fosse usado, então todos os 9 dos 9 soros teriam titulações de PRNT de 3 1:40. Titulações de neutralização a 90% variaram de 1:40 a >1:1.000 para os 7 soros com atividade neutralizante. Nenhum dos camundongos imunizados com pCB9D2-1J-4-3 produziu anticorpo neutralizante e apenas 1 dos 10 soros de camundongos vacinados com pCBD214-6 neutralizaram o vírus, porém a uma titulação de apenas 1:8.
[0184] Uma vez que dois dos plasmídeos recombinantes, a saber, pCB9D2-1J4-3 (SEQ ID NO: 44) e pCB8D2-2J-2-9-1 (SEQ ID NO: 46) continham seqüências de gene E para vírus JE, todos os soros foram também avaliados quanto a presença da atividade de neutralização do vírus de JE. Contudo, nenhuma atividade foi detectada no ponto final de neutralização a 90% para camundongos em qualquer dos grupos de imunização. Não surpreendentemente, camundongos imunizados com o plasmídeo de controle pEGFP não exibiram reatividade para vírus DEN-2 ou JE.
[0185] e. Discussão. As mesmas etapas usadas anteriormente para as vacinas de JE e WN foram inicialmente utilizadas para construir um plasmídeo DEN-2 recombinante, pCBD2-14-6 (SEQ ID NO: 42), consistindo na região de gene E e prM de DEN-2 autêntica. O mapeamento antigênico das proteínas de DEN-2 expressas por células COS-1 transformadas por este plasmídeo, usando um painel de MAb por IFA, indicou que as proteínas prM e E tinham uma intensidade de fluorescência compatível e uma reatividade MAb semelhante as células infectadas por vírus (Tabela 10). Contudo, estas células COS-1 transformadas por plasmídeo codificando uma região prM e E de DEN-2 autêntica, falharam em secretar antígeno de DEN-2 detectável no fluido de cultura (conforme medido por ELISA de captura de antígeno). Além disto, vacinação usando o plasmídeo codificando uma região de prM e E de DEN-2 autêntica falhou em estimular anticorpo de neutralização de vírus anti-DEN-2 em camundongo imunizado i.m. (Tabela 13). De forma interessante, a transformação das células por pCBD2-146 resultou em um manchamento fluorescente globular pontuado que sugeriu que a terminação C da proteína E do DEN-2 pode contribuir para o sinal de retenção de
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 99/118 / 99 membrana de proteína. Este padrão de manchamento IFA não foi observado tanto nas células transformadas construídas com JE ou WN (Chang e outros, A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice, J. Virol. 74:4244-4252 (2000); Davis e outros, West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays, J. Virol. 75:4040-4047 (2001)). Portanto, a luz da observação feita de acordo com os ensinamentos do presente pedido, dos plasmídeos adicionais, pCB9D2-1J-4-3 (SEQ ID NO: 44) e pCB8D2-2-9-1 (SEQ ID NO: 46), nos quais a manipulação apropriada da seqüência de DNA foi feita para 10% ou 20% do E na terminação C de DEN-2 a ser substituída com a região correspondente da proteína E do vírus de JE, respectivamente. A eficácia relativa das diferentes construções no anticorpo ELISA anti-DEN-2 detectável por estimulação em camundongos vacinados é mostrada na tabela 13.
[0186] Estes resultados são consistentes com o modelo de que, as interações entre prM e E podem influenciar os processos de conjunto de partícula e secreção. O suporte para este modelo pode ser encontrado em um estudo de vírus de encefalite transmitido pelo carrapato que sugere putativamente que as interações entre prM e o ectodomínio de E estão envolvidas no transporte intracelular mediado por prM de prM-E, deste modo, a secreção da partícula semelhante a vírus (Allison e outros, Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E, J. Virol. 73:5605-5612 (1999)).
[0187] No presente exemplo, a substituição de uma porção de terminação
C da proteína de DEN-2 E com a proteína JE E, correspondendo ao TBE H1pred para TM2, resultou na secreção da proteína prM de DEN-2 e proteína quimérica E. Contudo, em contraste, a substituição de TM1 e TM2, em TBE, causou apenas um aperfeiçoamento menor na secreção de antígeno. A proporção maior da proteína de prM e E expressa tanto por plasmídeos pCBD2-14-6 e pCB9D2-4-3 permaneceu ligada à membrana (Tabela 13). Estes resultados indicaram que uma
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 100/118 / 99 seqüência de retenção de membrana não identificada está localizada na região de haste de terminação C da proteína de DEN-2 E. A substituição desta região de haste de terminação C com a seqüência do vírus de JE remove ou torna ineficaz esta seqüência de retenção.
[0188] Foi avaliado por outros que a proteína prM é essencial para manutenção da conformação e secreção apropriadas da proteína E durante maturação de prME (Aberle e outros, A DNA immunization model study with constructs expressing the tick-borne encephalitis virus envelope protein E in different physical forms, J. Immunol. 163:6756-6771 (1999), Allison e outros, Synthesis and secretion of recombinant tick-borne encephalitis protein E in soluble and particulate form, J. Virol. 69:5816-5820 (1995)). Adicionalmente, foi demonstrado que o ectodomínio da proteína E interage com prM. Esta interação foi estimada para envolver a seqüência de aminoácido dentro dos resíduos de aminoácido 200-327 de E no vírus de encefalie Murray Valley (Guirakhoo e outros, The Murray Valley encephalitis virus prM protein confers acid resistance to virus particles and alters the expression of epitopes within the R2 domain of E glycoprotein, Virology 191:921-931 (1992)).
[0189] Interações de prM e E apropriadas e integridade mantida da estrutura da proteína E são da mesma forma mantidas na proteína expressa por todas as três construções de DEN-2, pelo menos à medida que elas são necessárias para imunoreatividade. Adicionalmente, a substituição da terminação C de E a 20% no pCB8D2-2J-2-9-1 resultou em uma proteína que manteve 395 aminoácidos de DEN-2 E autêntico. Qualquer dessas modificações é esperada como tendo influência mínima nas interações de E e prM-E e sua influência na natureza antigênica da proteína E quimérica. A substituição da região de terminação C de DEN-2 E com a seqüência de ancoramento de haste JE não teve efeito na reatividade de MAbs (tabela 10), retenção da seqüência de DEN-2 assim substituída, pode ser apenas opcional para obtenção da resposta imunológica específica de DEN-2.
[0190] Anteriormente, foi demonstrado que uma construção de plasmídeo codificando uma partícula subvirótica secretada de proteína de prM e E de vírus
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 101/118 / 99 de encefalite transmitido por carrapato era superior, em termos de extensão e funcionalidade da resposta de anticorpo e em termos de resposta ao desafio por virus, em relação a outras construções que codificaram dímero E solúvel truncado no terminal C que foi secretado, o comprimento E pleno que não foi secretado ou um E truncado que não foi eficazmente secretado (Aberle e outros, A DNA immunization model study with constructs expressing the tick-borne encephalitis virus envelope protein E in different physical forms, J. Immunol. 163:6756-6761 (1999)). Contudo, aqui, nós demonstramos que a potência da vacina de DNA de DEN-2 está correlacionada à secreção de prM/M e E (tabela 13). O caráter morfológico e o físico de prM e E secretadas não foram demonstrados neste estudo. Contudo, a prM e E secretadas pela construção de pCB8D2-2J-2-9-1 do mesmo modo forma uma partícula semelhante a vírus. Acredita-se que a apresentação de múltiplos antígenos protetores na superfície de partícula aperfeiçoe a potência da vacina desta construção.
[0191] Tentativas anteriores para o desenvolvimento de vacina de DNA do vírus DEN-2 resultaram em vários graus de sucesso (Kochel e outros, Inoculation of plasmids expressing the dengue-2 envelope gene elicit neutralizing antibodies in mice, Vaccine 15:547-552 (1997); Konishi e outros, DNA vaccine expressing dengue type 2 virus premembrane and envelope genes induces neutralizing antibody and memory B cells in mice, Vaccine 18: 11331139 (2000)). Para aperfeiçoar o nível de eficácia, foram adotadas diferentes estratégias. Por exemplo, foram utilizadas comunicação do motivo CpG imunoestimulatório contendo plasmídeo pUC19, GM-CSF de murino expressando plasmídeo no regime de vacina, ou substituição de 43 aminoácidos no terminal C de E por seqüência de retenção de membrana associada a lisossomas o que melhorou a resposta de anticorpo para a vacina de DEN-2 (Porter e outros, Protective efficacy of a dengue 2DNA vaccine in mice and the effect of CpG immuno-stimulatory motifs on antibody responses, Arch. Virol. 143:997-1003 (1998); Raviprakash e outros, Synergistic Neutralizing Antibody Response to a Dengue Virus Type 2 DNA Vaccine by Incorporation of Lysosome-Associated Membrane Protein Sequences and Use of Plasmid
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Expressing GM-CSF, Virology, 290: 74-82 (2001)). Motivos CpG não metilados ativam diretamente macrófagos, células exterminadoras naturais e linfócitos para secretarem citocinas e quimiocinas e sustentam o desenvolvimento de respostas imunes mediadas por citoquinas Th1 (Manders e outros, Immunology of DNA vaccines: CpG motifs and antigen presentation, Inflamm. Res. 49: 199-205 (2000)). Contudo, a inclusão de CpG pode modificar o perfil de citoquina do hospedeiro e desta forma contribuir para o desenvolvimento de distúrbios autoimunes específicos de órgãos mediados por Th-1 e interferir com a homeostase imune (Smith e outros, The regulation of DNA vaccines, Curr. Opin. Biotech. 12: 299-303 (2001)). Existe também evidência em camundongos de que os níveis em excesso de citoquina, embora aumentando a resposta de determinadas células auxiliadoras T, pode diminuir ou cessar a resposta de outros acionadores na resposta imune, conduzindo a imunosupressão generalizada de inflamação crônica (Robertson e outros, Assuring the quality, safety, and efficacy of DNA vaccines, Mol. Biotechnol. 17:143-149 (2001). Correspondentemente, a segurança e eficácia da imunização do DNA de flavivirus seriam beneficiadas por manipulação de um plasmídeo de expressão para melhorar a transcrição e tradução e obtenção de proteínas alvo prM e E para secreção, que promovem processamento e montagem de poliproteína corretos (Chang e outros, Flavivirus DNA vaccines: current status and potential, Ann. NY Acad. Sci. 951:272-285 (2001)). Aperfeiçoamentos futuros seriam focalizados para melhorar a absorção de DNA por células apresentando antígenos ou por células musculares (Rodriguez e outros, Enhancing DNA immunization, Virology 268:233-238 (2000)).
Tabela 1. Expressão transiente das proteínas E e JE prM por vários plasmídeos recombinantes em duas linhagens de células transferidas
Vetor
Promotor Intron Poli(A) ORI
pCDNA3 CMV Não BGH SV40
PCBamp CMV Não BGH Não
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PCIBamp CMV Sim BGH Não
pCEP4 CMV Não SV40 OriP
pREP4 RSV Não SV40 OriP
pRe/RSV RSV Não BGH SV40
PCDNA3 CMV Não BGH SV40
Plasmídeo Recombinante Intensidade de IFA /percentagem de células de antígeno-positivo *
COS-1 COS-7
pCDJE2-7 3+/40 3+/35
pCBJE1-14 3+/45 Nd
pCIBJES14 3+/39 Nd
pCEJE 2+/4 2+/3
pREJE 1+/3 1+/2
pRCJE 1+/3 1+/3
PCDNA3/CAT - -
* Várias linhagens de células foram transformadas com pCDNA3/CAT (controle negativo), pCDJE2-7, pCBJE1-14, pCIBJES14, pCEJEm, pREJE, ou pRCJE. As células foram tripsizadas 48 horas depois e testadas por um ensaio de anticorpo imunofluorescente indireto (IFA) com HIAF específico para vírus JE. Os dados são apresentados como a intensidade (escala de 1+ a 4+) e a percentagem de células positivas IFA. As células transformadas por pCDNA3/CAT foram utilizadas como um controle negativo.
Tabela 2. Caracterização das proteínas expressas por um clone (JE
4B) transformado estavelmente por pCDJE2-7 de células COS-1 com anticorpos reativos ao vírus JE
MAb ou antisoro Atividade Biológica de MAb Intensidade imunofluorescente das células
Especificidade Função Biológica Infectadas por JEV 4B
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MAb:
MC3 Específica de JEV 2+ 2+
2F2 Específica de JEV HI, N 4+ 4+
112 Específica de JEV 4+ 4+
503 Específica de JEV N 4+ 3+
109 Subgrupo HI 2+ 1+
N.04 Subgrupo HI, N 3+ 4+
201 Subgrupo 1+ 1+
203 Subgrupo 4+ 3+
204 Subgrupo 2+ 2+
301 Subgrupo HI 2+ 2+
504 Flavivírus 4+ 4+
6B6C-1 Flavivírus 2+ 2+
3B4C-4 VEE - -
H1AF:
Anti-JEV 4+ 3+
Anti-WEE - -
PBS - -
Tabela 3. Persistência da resposta imune em camundongos imunizados com vacina de pCDJE2-7 ou JE-VEX
Titulação ELISA (log10) Titulação ELISA (log10)
3 semanas 6 semanas 9 semanas 23 semanas 40 semanas 60 semanas*
1 x pCDJE2-7 2,6 - 3,2 3,8 - 5,0 3,8 - 4,4 > 3,2 > 3,2 2,4; 2,4; 3,8; 4,4
2 x pCDJE2-7 2,6 - 3,8 4,4 3,8 - 4,4 > 3,2 >3,2 2,6; 3,8; 3,8
2 x JE-VAX 2,6 - 3,8 4,4 - 5,0 3,8 - 5,6 > 3,2 > 3,2 < 2; <2; <2; 4,4
2 x pCDNA3/CAT < 2 < 2 < 2 ND ND <2
Continuação da tabela 3
Titulação PRNT90%
3 semanas 6 semanas 9 semanas
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1 x pCDJE2-7 < 20 20 40-160
2 x pCDJE2-7 < 20 20-40 40-160
2 x JE-VAX < 20 20-40 20-160
2 x pCDNA3/CAT < 20 < 20 < 20
Os camundongos foram inoculados com 1 ou 2 doses de 100 pg de DNA de plasmídeo ou com 1/5 doses humanas de vacina JE-VAX. Os soros foram coletados para teste antes da segunda imunização. * Titulação individual de soro.
Tabela 4. A razão de soropositivo em porcentagem dependente da idade em camundongos seguida da vacinação com várias vacinas de JEV
Idade 3 dias Idade 3 semanas
3 semanas PV 7 semanas PV 3 semanas PV 7 semanas PV
JE-VAX 0 0 100 100
pCDNA3/CAT 0 0 0 0
pCDJE2-7 40 60 90 90
pC1BJES14 10 60 80 100
pCBJE1-14 80 100 100 100
Tabela 5. Proteção de desafio por JEV em camundongos de 8 semanas seguindo a vacinação em 3 dias de idade com várias vacinas de JEV
Vacina Soroconversão JEV pré-desafiado Razão de sobrevivência em dias, apósdesafio (%)
6 7 8 9 21
JE-VAX 0 100 100 60 40 40
pCDNA3/CAT 0 100 80 30 30 30
pCDJE2-7 60 100 100 100 100 100
pC1BJES14 60 100 100 100 100 100
PCBJE1-14 100 100 100 100 100 100
Tabela 6. Avaliação da capacidade do anticorpo maternal de camundongos fêmeas vacinadas com ácido nucléico-JEV para proteger seus filhotes de encefalite JEV fatal
Mãe vacinada
Filhotes desafiados por JEV
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Vacina RNT90% Idade de desafio (dias) Nenhum Sobrevivente1 ELISA2
1 x pCDJE2-7 40 4 0/11
2 x pCDJE2-7 80 4 12/12 12/12
2 x JE-VAX 20 3 0/16
2 x pCDNA3/ CAT <10 5 0/14
1 x pCDJE2-7 20 15 5/11 5/5
2 x pCDJE2-7 40 14 8/12 7/8
2 x JE-VAX 80 13 5/5 5/5
2 x pCDNA3/CAT <10 14 0/14
Os camundongos foram inoculados intramuscularmente com 1 ou 2 doses de 100 gg de DNA de plasmídeo ou subcutaneamente com duas doses 1/5 humanas de vacina JE-VAX. Os soros foram coletados 9 semanas após vacinação para teste de PRNT antes de acasalamento com macho não imune.
1: Nenhum sobrevivente total para cada ninhada 2: Número de animais positivos para anticorpo JEV-ELISA (titulação: > 1:400)/N° de sobreviventes: soros foram coletados para teste 12 semanas após desafio.
Tabela 7. Características de peptídeos de sinalização e suas vacinas em potencial dentre construções de vacina de DNA de flavivírus.
Plasmídeo Seqüência de peptídeo de sinalização precedendo proteína prM Probabilidade de peptídeo de sinalizaçãoa Protocolo/p roteção de imunização
pSLE1 ?LDTINRRPSKKRGGTRS LLGLAALIGLASS/LQLLS TYQG (SEQ ID NO:32) 0,702 0,292 0,352 I.m. x 2/parcial
pJME MWLASLAVVIACAGA/M KLSNFQGK (SEQ ID NO:33) 0,998 0,000 0,778 I.m. x 2/parcial
pCJEME MNEGSIMWLASLAVVIA CAGA/MKLSNFQGK (SEQ ID NO:34) 0,985 0,012 0,785 I.m. x 2/100%
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cCBJE1-14 MGRKQNKRGGNEGSIM WLASLAVVIACAGA/MK LSNFQGK (SEQ ID NO:35) 0,791 0,199 0,623 I.m. x 1/100%
pcDNA3pr M-E MSKKRGGSETSVLMVIF MLIGFAAA/LKLSNFQGK (SEQ ID NO:36) 0,721 0,277 0,622 I.m. x 4/parcial gg x 24/100%
pCBWN MGKRSAGSIMWLASLAV VIACAGA/VTLSNFQGK (SEQ ID NO:37) 0,976 0,024 0,526 I.m. x 1/100%
p1012D2M E MNVLRGFRKEIGRMLNI LNRRRRTAGMIIMLIPTV MA/FHLTTRNGE (SEQ ID NO:38) 0,165 0,778 0,164 I.d. x 2/nenhum
SV-PE MVGLQKRGKRRSATDW MSWLLVITLLGMTLA/AT VRKERGD (SEQ ID NO:39) 0,943 0,056 0,899 I.m. ou gg x 2/100%
pWRG70- 77-RSSE MGWLLVVVLLGVTLA/A TVRKERGD (SEQ ID NO:40) 1,000 0,000 0,912 gg x 2/100%
pWRG70- 77-CEE MSWLLVITLLGMTIA/AT VRKERGD (SEQ ID NO:41) 0,999 0,000 0,821 gg x 2/100%
aO programa SignalP HMM foi aplicado para calcular as probabilidades de peptídeo de sinalização (SP), peptídeo de ancoramento (AP) e sítio de clivagem de distinção (sítio C).
Códigos de aminoácidos simples foram usados e aminoácidos carregados foram ressaltados por letras sublinhadas e em negrito. O sítio de clivagem de distinção separando SP e prM é indicado por /. As vacinas de DNA foram inoculadas por processo intramuscular (i.m.), intradérmico (i.d.) ou disparo de gene (gg).
Tabela 8. Respostas de neutralização de anticorpo (Nt) em camundongos imunizados com doses diferentes de vacinas de DNA de vírus WN e JE
Dose por plasmídeo (pg) _ pCBWN + pCBJE1-14 Controle pCB
100 + 100 40 + 40 20 + 20 10 + 10 100
Porcentagem de camundongos com Nt: vírus WN/vírus 100/100 100/70 70/0 60/0 0/0
JE Faixa de titulação de PRNT90: vírus WN 1:320 - 1:80 1:80 - 1:20 1:80 - <1:10 1:20 - <1:10 <1:10
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I vírus JE____________1:40 - 1:10 1:10 - <1:10_________< 1:10____________< 1:10__________< 1:10 |
Grupos de dez camundongos fêmea ICR fora do período reprodutivo, com três semanas de idade receberam injeção i.m. de uma dose simples de DNAs de plasmídeo combinados, conforme indicado. Espécimes de soro coletadas 12 semanas após imunização, foram analisadas por teste de neutralização de redução de placa (PRNT). As titulações de ponto final contra vírus JE e WN foram calculadas com base na redução de placa de 90% usando vírus JE (cepa AS-14) e vírus West Nile (cepa NY-6480), respectivamente.
Tabela 9. Oligonucleotídeos utilizados para construir plasmídeos de expressão de prM-E do vírus DEN-2 e a região de junção de DEN-2 quimérico e JE E indicado.
prM-E de DEN-2 100%___________________________________________
D2KasI-438a 5' TGTGCAGGCGCCTTCCATTTAACCACACGTAACG _____________(SEQ ID NO: 48)________________________________________ CD2NotI-2402 5'TCGAGCGGCCGCTCAACTAATTAGGCCTGCACCATGACTC _____________(SEQ ID NO: 49)_________________________________________ DEN-2 E 90% e JE E 10%:_______________________________________
T7 5'CTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGG (SEQ ID NO : 50)
CD2BstXI-2244 5'ATAGATTGCTCCAAACACTTGGTGG (SEQ D NO : 51)
JE-2281 5'ACTCCATAGGAAAAGCCGTTCACC (SEQ ID NO : 52)
CSP6 5'GCGAGCTCTAGCATTTAGGTGACACTATAG ________________(SEQ D NO : 53)_____________________________________
DEN-2K ^JE
Junção 9-10 : Leu His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr (seq id no: 55) ___________CTC CAC CAA GTG TTT GGT GGT GCC TTC AGA ACA (seq id no : 54) DEN-2 E 80% e JE E 20%:_______________________________________
T7 5'CTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGG (SEQ ID NO: 56)
CD2BsmBI-2097 5'GAATTCGTCTCACTTCCTTTCTTAAACCAGTTGAGCTTC (SEQ ID NO : 57)
JEBsmBI-2175 5'GGAATTCGTCTCGGAAGCACGCTGGGCAAGG (SEQ ID NO: 58)
CSP6 5'GCGAGCTCTAGCATTTAGGTGACACTATAG 3' _______________(SEQ ID NO: 59)______________________________________
DEN-2K ^JE
Junção 8-20: Asn Trp Lys Lys Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala (seq id no : 61) ____________AAC TGG TTT AAG AAA GGA AGC ACG CTG GGC GCC (seq id no :60) a Sítios de enzima de restrição codificados nos oligonucleotídeos onde foram ressaltados por negrito, itálico e subscrito
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 109/118 / 99
Tabela 10. Caracterização de epítopos de glicoproteína de DEN-2
E, expressos pelos plasmídeos recombinantes de DEN-2, conforme determinado por ensaio de anticorpo fluorescente indireto (IFA)
Anticorpo Controlesa Construção de Plasmídeoa
MAb (Epítopo)b Domínio Antigênicoc PRNTd Células infectadas por DEN-2 Células normais pCBD2-14-6 pCB9D2-1J- 4-3 pCB8D2-2J- 2-9-1
4G2(A1) 2 +/- 4+ - 4+ 4+ 4+
4E5(A2) 2 Sim 3+ - 3-4+ 3-4+ 2-3+
1B7(AS) 2 Sim 3-4+ - 4+ 4+ 2-3+
1B4C-2(C1) 1 Não 3-4+(8000) - 2-3+(4000) 2-3+(4000) 2-3+(8000)
2B3A-1(C3) 1 Não 3-4+(>3200) - 3+(100) 2+(100) 2-3+(>3200)
9A4D-1(C4) 1 Não 3-4+ - 2-3+(400) 1-3+(400) 3+(>12800)
3H5(B2) 3 Sim 4+ - 4+ 4+ 4+
10A4D- 3 Sim 2-3+ - 3-4+ 3-4+ 2-3+
2(B3)
1A1D-2(B4) 3 Sim 4+ - 3-4+ 4+ 3-4+
9D12-6 Sim 2-4+ 2-3+ 2-3+ 3-4+
2H2 prM Não 4+ - 4+ 3-4+ 3-4+
1A2A-1 Capsídio Não 2-3+ - 1+ 2+ 1-2+
aSubstratos IFA eram células COS-1 fixadas com acetona, cada um infectado com DEN-2
16681, controles não infectados ou transformados com um plasmídeo recombinante DEN-2. bAnticorpos monoclonais foram usados em uma diluição ótima predeterminada, com base na reatividade com vírus DEN-1 16681. Para alguns MAbs, titulações de ponto final, mostradas em parênteses, são reportadas para outras, apenas valores qualitativos são reportados, com base em uma escala de 1+ a 4+, com 3-4+ considerado positivo, 2+ equivocado e 1+ negativo. cDomínios antigênicos com base na E-glicoproteína do vírus TBE (Mandl e outros, Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model, J. Virol. 63:564-571 (1989); Rey e outros, The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution, Nature 375: 291-298 (1995)).
dAtividade de redução de placa em uma diluição a 1:100 de fluido ascítico, usando um ponto final de redução de placa a 90%, exceto para 4G2 e 9D12-6, para o qual um ponto final de neutralização é reportado (Henchal e outros, Epitopic analysis of antigenic determinants on the surface of dengue-2 virions using monoclonal antibodies, Am. J. Trop. Med. Hyg. 34:162-169
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 110/118 / 99 (1985); Roehrig e outros, Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus, Jamaica, Virology 246:317-328 (1998)).
Tabela 11. Detecção de proteína recombinante de DEN-2 ligada à membrana por ELISA de captura de antígeno
Plasmídeo Tipo de Amostra Titulação ELISA de ponto final
pCBD2-14-6 PEG-fluido de cultura precipitadoa < 1:10
pCBD2-14-6 PEG-fluido de cultura extraído de etanol, precipitadob < 1:20
pCBD2-14-6 Preparação de proteína de membrana hidrófobac 1:160
pCB9D2-1J-4-3 PEG-fluido de cultura precipitadoa < 1:10
pCB9D2-1J-4-3 PEG-fluido de cultura extraído de etanol, precipitadob < 1:20
pCB9D2-1J-4-3 Preparação de proteína de membrana hidrófobac 1:80
pCB8D2-2J-2-9-1 PEG-fluido de cultura precipitadoa 1:640
pCB8D2-2J-2-9-1 PEG-fluido de cultura extraído de etanol, precipitadob 1:80
pCB8D2-2J-2-9-1 Preparação de proteína de membrana hidrófobac 1:80
PEGFP PEG-fluido de cultura precipitadoa < 1:10
PEGFP PEG-fluido de cultura < 1:10
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 111/118 / 99
extraído de etanol, precipitadob
PEGFP Preparação de proteína de membrana hidrófobac < 1:10
aSobrenadante de cultura de células transformadas por plasmídeo foi precipitado com polietileno glicol a 10% (PEG) e suspenso novamente em 1/100 do volume original.
bSobrenadante de cultura precipitado por PEG foi extraído com etanol a 4% para remover PEG e a pelota foi ressuspensa em 1/5 do volume extraído.
cFrações de membrana hidrófoba foram preparadas conforme descrito em Materiais e Processos.
Tabela 12. Imunogenicidade dos três plasmídeos recombinantes de
DEN-2 em camundongos ICR
DNA de Plasmídeob Camundongo número ELISA no vírus DEN-2 PRNT no vírusa DEN-2 Titulação ponto final 9 sem. p.v. PRNT no vírusa JEV Titulação ponto final 9 sem. p.v.
Classific. 3 sem. p.v.c Classific. 6 sem. p.v.c Titulação de ponto final 9 sem. p.v.
1:100 1:400 1:100 1:400
pCB8D 2-2J-2- 9-1 Grupo, 1,2,4-10 NDd ND + + 64.000 ND ND
1 + + + + 64.000 >1.000 < 2
2 + + + + 32.000 >1.000 <2
4 + + + + 16.000 200 <2
5 + + + + 4.000 <10 <2
6 + + + + 16.000 200 <2
7 + - + + 64.000 100 <2
8 + - + + 8.000 40 <2
9 + + + + 6.400 <2 <4
10 + + + + 64.000 >1.000 <2
pCB9D2 -1J- 4-3 Grupo, 1-10 ND ND + + 1.000 ND <2e
1 - - + - 400 <10 ND
2 + - + + 200 <10 ND
3 + + + + 4.000 <2 s4
4 + - + - 200 <10 ND
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 112/118 / 99
5 - - + + 400 <10 ND
6 + + + + 4.000 <2 2
7 - -/+ - - 100 <10 ND
8 - - - - 200 <10 ND
9 + - + - 4,000 <2 <2
10 - - + + 4.000 <2 <2
pCBD2- 14-6 Grupo, 1-10 ND ND + - 200 <2f <2g
1 - - - - 400 <10 ND
2,3,6-9 - - - - <100 ND ND
4 + + + + 1.000 <2 <2
5 - - + - 2.000 9 <2
10 + - - - <100 ND ND
pEGFP Grupo, 1-10 - ND - ND <200 <2 <2
aPRNT, teste de neutralização de redução de placa, 90% ponto final de neutralização bOs camundongos foram imunizados intramuscularmente com 100 pg de DNA de plasmídeo nas semanas 0 e 3.
cClassificações ELISA usaram soro diluído 1:100 e 1:400 dND, não realizado eGrupo, 1,2,4,5,7,8.
gGrupo, 1-3,6-10
Tabela 13. Resumo das características dos três plasmídeos recombinantes de DEN-2.
Plasmídeo IFAa Titulação de ELISA de captura de antígeno Titulação de ELISA em DEN-2b PRNT em DEN-2c
+/- Globular/ Difuso Antígeno secretado Prep. proteína membrana hidrófoba Número soros > 1:100 Titulação de soros agrupados Número de soros > 1:10
pCB8D2-2J-2-9-1 + Difuso 1:640 1:80 9/9 1:64.000 7/9d
pCB9D2-1J-4-3 + Globular <1:10 1:80 10/10 1:1000 0/10
pCBD2-14-6 + Globular <1:10 1:160 3/10 1:200 0/10
aCaracterísticas de manchamento (IFA) de ensaio de anticorpo fluorescente indireto, + ou -, e padrão difuso ou globular.
bTitulação ELISA anti-DEN-2 de soro de camundongo imunizado com plasmídeos recombinantes. Os foros foram coletados 9 semanas pós vacinação (semanas 0 e 3). O número
Petição 870190010977, de 01/02/2019, pág. 113/118 / 99 de camundongos com titulação de > 1:100/número total de camundongos é mostrado, incluindo a titulação ELISA de ponto final da amostra de soro agrupada.
cNúmero de camundongos com titulações de neutralização de reação de placa (PRNT, 90% de redução) > 1:10/número total de camundongos. Os soros foram coletados 9 semanas após vacinação.
dDos 7 camundongos com anticorpo de neutralização, 3 camundongos tinham titulações de PRNT de >1:1.000, 3 tinham titulações de >1:100<1:1000 e um tinha uma titulação de 1:40.

Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Ácido nucléico isolado, caracterizado por compreender uma unidade transcricional codificando uma sequência de sinal de pré-memnraba (prM) de vírus encefalite Japonesa (JEV) e um antígeno de flavivírus imunogênico compreendendo uma proteína de flavivírus M e uma proteína de flavivírus E, em que a sequência de sinal de prM JEV, em que:
    o antígeno de flavivírus imunogênico é de um segundo flavivírus selecionado do grupo consistindo de vírus da febre amarela, vírus Powassan vírus do West Nile e vírus da encefalite de St. Louis; ou o antígeno de flavivírus imunogênico é um antígeno quimérico compreendendo sequência de aminoácido de JEV e vírus da dengue serótipo 2, onde a unidade transcricional compreende a sequência de nucleotídeo das posições 911-2987 da SEQ ID NO: 15, posições 910-2965 da SEQ ID NO: 19, posições 910-2986 da SEQ ID NO: 21, posições 910-2953 da SEQ ID NO: 23, posições 910-2964 da SEQ ID NO: 44 ou posições 910-2964 da SEQ ID NO:46, onde a unidade transcricional direciona a síntese do antígeno.
  2. 2. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a unidade transcricional compreender a sequência de nucleotídeo das posições 911-2987 da SEQ ID NO: 15 e codificar a sequência de sinal prM JEV e uma proteína M e uma proteína E do vírus do West Nile.
  3. 3. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a unidade transcricional compreender a sequência de nucleotídeo das posições 910-2953 da SEQ ID NO: 23 e codificar a sequência de sinal prM JEV e uma proteína M e uma proteína E do vírus da febre amarela.
  4. 4. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a unidade transcricional compreender a sequência de nucleotídeo das posições 910-2986 da SEQ ID NO: 21 e codificar a sequência de sinal prM JEV e uma proteína M e uma proteína E do vírus de encefalite de Saint Louis.
  5. 5. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a unidade transcricional compreender a sequência de nucleotídeo das
    Petição 870190048409, de 23/05/2019, pág. 13/15
    2 / 2 posições 910-2965 da SEQ ID NO: 19 e codificar a sequência de sinal prM JEV e uma proteína M e uma proteína E do vírus Powassan.
  6. 6. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a unidade transcricional compreender a sequência de nucleotídeo das posições 910-2964 da SEQ ID NO: 44 ou posições 910-2964 da SEQ ID NO: 46, e codificar um antígeno quimérico compreendendo uma proteína M do vírus da dengue serótipo 2 e uma proteína quimérica E compreendendo sequência de aminoácido de JEV e o vírus da dengue serótipo 2.
  7. 7. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ácido nucléico ser DNA.
  8. 8. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 23.
  9. 9. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a unidade transcricional compreender um promotor operativamente ligado ao antígeno.
  10. 10. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o promotor ser o promotor imediato anterior do citomegalovírus.
  11. 11. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ainda compreender a sequência de ácido nucleico de consenso Kozak localizada em um sítio de partida de tradução para o antígeno de flavivírus imunogênico codificado pela unidade transcricional.
  12. 12. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a unidade transcricional compreender um terminador poli-A.
  13. 13. Composição, caracterizada por compreender o ácido nucléico como definido na reivindicação 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
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B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 24/12/2019, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 04/04/2002 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF

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