MXPA03008838A - Vacunas de acido nucleico para la prevencion de infeccion por flavicirus. - Google Patents

Vacunas de acido nucleico para la prevencion de infeccion por flavicirus.

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Abstract

La presente invencion comprende acidos nucleicos aislados que contienen unidades de transcripcion que codifican una secuencia de senal de un flavivirus y un antigeno de flavivirus inmunogenico de un segundo flavivirus o de un antigeno de flavivirus inmunogenico quimerico que comprende la secuencia de mas de un flavivirus. La invencion ademas comprende una vacuna de acido nucleico y proteina y el uso de la vacuna para inmunizar un sujeto contra la infeccion por flavivirus. La invencion tambien proporciona antigenos codificados por acidos nucleicos de la invencion, anticuerpos producidos en respuesta a los antigenos y uso de los antigenos y/o anticuerpos en la deteccion de flavivirus o la diagnosis de infeccion por flavivirus.

Description

VACUNAS DE ACIDO NUCLEICO PARA LA PREVENCION DE INFECCION POR FLAVIVIRUS Esta solicitud es una continuación en parte de, y reivindica el beneficio de, la solicitud norteamericana No. de Serie 09/826,115, presentada el 4 de abril del 2001, estado que está pendiente y que es una continuación en parte de, y reivindica el beneficio de la solicitud norteamericana No. de Serie 09/701,536 presentada el 29 de noviembre del 2000, estado que está pendiente y que es una solicitud en etapa nacional de la solicitud internacional No. de Serie PCT/US99/12298, presentada el 3 de Junio de 1999 de, y que reivindica el beneficio de, la solicitud provisional norteamericana No. de Serie .60/087, 908, presentada el 4 de junio de 1998, solicitudes que son incorporadas en la presente en su totalidad por referencia. Campo de la Invención Esta invención se refiere a vacunas novedosas, diagnósticos y métodos de uso de ambos en el tratamiento y la prevención de las enfermedades ocasionadas por flavi irus. En particular, las vacunas son ácidos nucleicos recombinantes que contienen genes para proteínas estructurales de flavivirus, tales como el virus de encefalitis japonés (JEV) , virus de West Nile (WNV) (virus del Nilo) o flavi irus. relacionados. Estas vacunas sirven como una unidad de transcripción para la biosintesis de los antigenos de proteína del virus cuando son administrados in vivo. Los diagnósticos son composiciones que contienen antígenos producidos de los ácidos nucleicos recombinantes que pueden ser utilizadas para detectar la infección por flavivirus. Antecedentes de la Invención Los flavivirus son miembros del género Flavivirus, que es clasificado dentro de la familia Flaviviridae. Los flavivirus son grandemente patogénicos a humanos y a otros mamiferos . Los flavivirus que infligen enfermedad en humanos y animales incluyen Alfuy, Apoi, Aroa, Bagaza, Banzi, Batu Cave, Bouboui, murciélago de Bukalasa, Bussuquara, Cacipacore, Carey Island, Cowbone Ridge, murciélago de Dakar, Dengue (serotipos 1, 2, 3 y 4), Edge Hill, murciélago de Entebbe, Gadgets Gully, Iguape, Ilheus, meningoencefalitis de Israel Turquía, encefalitis Japonesa, Jugra, Jutiapa, Kadam, Karshi, Kedougou, Kokobera, Koutango, Kunjin, enfermedad de Kyasanur Forest, Langat, Meaban, Modoc, leucoencefalitis de miotis de Montana, encefalitis de Murray Valley, Naranjal, Negishi, Ntaya, fiebre hemorrágica de Omsk, murciélago de Phnom Penh, Potiskum, Powassan, Rio Bravo, Roció, Royal Farm, encefalitis de primavera verano Rusa, Saboya, Sal Vieja, San Perlita, Saumarez Reef, Sepik, Sokuluk, Spondweni, encefalitis de St. Louis, Stratford, encefalitis portada por garrapatas - encefalitis portada por garrapatas del subtipo Europeo central - subtipo del lejano oriente, Tembusu, THCAr, Tyuleniy, Uganda S, Usutu, West Nile, Yaounde, Fiebre Amarilla, Yokose, Ziki, agente de fusión celular y otros flavivirus relacionados, como son listados en Kuno y colaboradores (J. Virol 72:73-83 (1998)). Los flavivirus contienen las siguientes tres proteínas estru turales: prM/M, la proteina de premembrana y membrana; E, la proteina de envoltura; y C, la proteina capsid. ( onath, en Virology (Fields, Ed) , Raven Press, New York, 1990, pp. 763-814; Heinz y Roehrig, en InmiTiunochemistry of Viruses II: The Basis for Serodiagnosis and Vaccines (van Regenmortel y Neurath, eds), Elsevier, Amsterdam, 1990, pp. 289-305) . M tiene un peso molecular (MW) de aproximadamente 7-8 kilodaltons (kDa) y E tiene un MW de aproximadamente 55-60 kDa. M es sintetizada como un precursor más grande llamado prM. La porción pr de prM es retirada cuando prM es procesada para formar la proteina M en viriones maduros. M y E están localizadas en la membrana de la partícula de flavivirus y de e,sta manera se han considerado por mucho tiempo que constituyen los componentes inmunogénicos importantes de los virus . Los flavivirus son virus de RNA que comprenden RNA de una sola hebra que tiene una longitud, entre las diversas especies, de aproximadamente 10 kilobases (kb) . La proteina C, con un MW de 12-14 kDa, se forma en complejo con el RNA para formar un complejo nucleocapsid. Varias proteínas no estructurales también son codificadas por el- genoma de RNA que son llamadas NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5. El genoma es traducido dentro de la célula huésped como una poliproteina, luego procesado co- o pos-traduccionalmente en los productos de gen individuales por las proteasas especificas virales o especifican del huésped (Figura 1) . Las secuencias de nucleótidos de los genomas de varios flavi irus son conocidas, como es resumido en la patente norteamericana No. 5,494,671. Aquella para JEV es proporcionada- por Sumiyoshi y colaboradores (Virology 161:497-510 (1987)) y Hashimoto y colaboradores (Virus Genes 1:305-317 (1988)). Las secuencias de nucleótidos de la cepa virulenta SA-14 de JEV y la cepa atenuada SA-14-14-2, utilizadas como una vacuna en la Gente de la República de China, son comparadas en el trabajo de Nitayaphan y colaboradores ( Virology 177 : 541-552 (1990)). Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas estructurales de otras especies de flavivirus también son conocidas. En muchos casos, se han reportado las secuencias para los genomas completos. Las secuencias disponibles incluyen el virus del dengue serotipo 1, virus del dengue serotipo 2 (Deubel y colaboradores, Virology 155:365-377 (1986); Gruenberg y colaboradores, J. Gen. Virol, 69:1391-1398 (1988); Hahn y colaboradores Virology 162:167-180 (1988)), virus del dengue serotipo 3 (Osatomi y colaboradores, Virus Genes 2:99-108 (1988)), virus del dengue serotipo 4 (Mackow y colaboradores, Virology 159:217-228 (1987), Zhao y colaboradores, Virology 155:77-88 (1986)), virus de West Nile (Lanciotti y colaboradores, Science 286:2331-2333 (1999)), virus de Po assan (Mandl y colaboradores, Virology 194:173-184 (1993)) y virus de la fiebre amarilla (YFV) (Rice y colaborador s, Science 229:726-733 (1985)). Muchos flavivirus, incluyéndose el virus de encefalitis de St. Louis (SLEV), WNV y JEV, son transmitidos a los humanos y otros animales huéspedes por mosquitos. Por lo tanto, ellos surgen sobre áreas extendidas y su transmisión no es fácilmente interrumpida o prevenida. La fiebre de West Nile es una infección flaviviral portada por mosquitos que es transmitida a los vertebrados principalmente por varias especies de mosquitos Culex. Similar a otros miembros del complejo antigénico de encefalitis japonesa (JE) de flavivirus, incluyéndose los virus de JE, SLE y de encefalitis de Murray Valley (MVE), el WNV es mantenido en un ciclo natural entre los vectores artrópodos y pájaros. El virus primero se aisló de un humano febril en el distrito de West Nile de Uganda en 1937 (smithburn y colaboradores, Azn. J. Trop. Med. Hyg. 20:471-492 (1940)). Pronto se reconoció como uno de los flavivirus más ampliamente distribuidos, con su rango geográfico que incluye Africa, el Oriente Medio, Asia Occidental, Europa y Australia (Hubalek y colaboradores, Emexg. Infecí. Dis. 5:643-50 (1999)). Clínicamente, la fiebre del West Nile en humanos es una enfermedad febril aguda autolimitada acompañada por dolor de cabeza, mialgia, poliartropatia, salpullido y linfadenopatia (Monath y Tsai, en Clinical Virology, (Richman, Whitley y Hayden eds.)/ Churchill-Livingtone New York, 1997, pp. 1133-1186). La hepatitis aguda o pancreatis se ha reportado en ocasiones y casos de infección por WNV en pacientes de avanzada edad son algunas veces complicados por la encefalitis o meningitis (Asnis y colaboradores, Clin. Infect. Dis. 30:413-418 (2000)). Asi, la infección por WNV es una preocupación de salud seria en muchas regiones del mundo. La difusión geográfica de la enfermedad, particularmente la introducción del WNV en los Estados Unidos en 1999, ha incrementado grandemente la conciencia de las preocupaciones de salud humana y animal de esta enfermedad. Entre fines de agosto y principios de septiembre de 1999, la Ciudad de Nueva York y áreas circundantes experimentaron un brote de encefalitis viral, con 62 casos confirmados, dando por resultado siete muertes. Concurrente con este brote, los funcionarios det salud locales observaron mortalidad incrementada entre los pájaros (especialmente cuervos) y caballos . El brote fue subsecuentemente mostrado que es ocasionado por el WNV, basado en el mapeo de anticuerpo monoclonal (Mab) y la detección de secuencias genómicas en humanos, aves y especímenes de mosquitos (Anderson y colaboradores, Science 286:2331-2333 (1999); Jia y colaboradores, Lancet 354:1971-1972 (1999); Lanciotti y colaboradores Science 286:2333-2337 (1999)). La actividad del virus detectada durante los meses de invierno consecuentes indicó que el virus se ha establecido por si mismo en norteamérica {Morb. Mortal. Wkly. Rep. 49:178-179 (2000); Asnis y colaboradores, Clin. Infect. Dis. 30:413-418 (2000); Garmendia y colaboradores, J. Clin. Micro. 38:3110-3111 (2000) ) . Los datos de vigilancia reportados de los estados del nordeste y del Atlántico medio durante el año 2000 confirmaron una transmisión epizoótica/epidémica intensificada y una expansión geográfica del virus con documentación de numerosos casos de infección en pájaros, mosquitos y caballos, asi como casos en humanos (Morb. Mortal. Wkly. Rep. 49:820-822 (2000)'). Actualmente, ninguna vacuna humana o veterinaria está disponible para prevenir la infección por WNV y el control de los mosquitos es la única estrategia parcial para combatir la difusión de la enfermedad. El virus de encefalitis japonés (JEV) infecta adultos y niños y existe una alta tasa de mortalidad entre infantes, niños y las personas de edad avanzada en áreas de Asia tropical y subtropical (Tsai y colaboradores, en Vaccines (Plotkin, ed. ) W.B. Saunders, Philadelphia, Pa, 1999, pp. 672-710. Entre los sobrevivientes, existen varias consecuencias neurológicas, relacionadas con los síntomas de encefalitis, que persisten después de la infección. En los paises más desarrollados de esta región, tal como Japón, la República de China (Taiwan) y Corea, el JEV ha sido grandemente controlado por el uso de una vacuna de JEV inactivado. No obstante, aún es prevalente en otros paises de la región. Las vacunas disponibles para el uso contra la infección por JEV incluyen el virus vivo inactivado por tales métodos como el tratamiento con formalina, asi como el virus atenuado (Tsai y colaboradores, in Vaccines (Plotkin, ed.) .B. Saunders, Philadelphia, Pa, 1994, pp. 671-713). Las vacunas de virus completo, aunque efectivas, tienen ciertos problemas y/o desventajas. Los virus son cultivados en el cerebro del ratón o en cultivo de células utilizando células mamiferas como el huésped. Tales métodos de cultivo son difíciles de manejar y costosos. Además, existe el riesgo acompañante de incorporar antigenos de las células huéspedes, es decir, el cerebro u otro huésped, en el producto de vacuna final, conduciendo potencialmente a respuestas alérgicas no propuestas e indeseadas en los recipientes de la vacuna. También existe el riesgo de infección inadvertida entre los trabajadores involucrados en la producción de la vacuna.
Finalmente, existe el riesgo de que el virus no puede ser total o completamente inactivado o atenuado y de esta manera, la vacuna puede realmente ocasionar enfermedad. La fiebre del dengue y la fiebre hemor ágica del dengue (DF/DHF) son ocasionadas por el virus del dengue, que también es un flavi irus poicado por mosquitos. Existen cuatro serotipos del virus del dengue antigénicamente relacionados, pero distintos (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN- ) , todos los cuales pueden ocasionar DF/DHF. Los síntomas de la DF, la forma leve de la enfermedad relacionada con el dengue, incluyen fiebre, salpullido, dolor de cabeza severo y dolor de articulaciones. La mortalidad entre esos sujetos que sufren de DF es baja; sin embargo, entre esos sujetos que sufren de DHF, la mortalidad puede ser tan alta como 5%. De la evidencia disponible, más de 3 millones de casos de DHF y 58,000 muertes se han atribuido a la DHF durante los pasados 40 años, haciendo la DHF una enfermedad emergente mayor (Halstead, en Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever (Gubler y Kuno, eds.) CAB International, New York, NY, (1997) pp 23-44). No obstante, a pesar de décadas de esfuerzo, vacunas seguras y efectivas para proteger contra la infección por el virus del dengue todavía no están disponibles. La fiebre amarilla es prevalente en las regiones tropicales de Sudamérica y el Sub-Sahara de Africa y es transmitida por mosquitos. La infección conduce a fiebre, escalofríos, dolor de cabeza severo, y otros dolores, anorexia, náusea y vómito, con la emergencia de ictericia. Una vacuna de virus vivo, 17D, cultivada en embriones de pollo infectados, es considerada segura y efectiva. No obstante, aun permanece una necesidad por una vacuna que sea estable bajo condiciones adversas, tal como on comúnmente encontradas en las regiones tropicales de Africa y las Américas donde la vacuna es mucho más necesitada. Un flavivirus recombinante que es una quimera entre dos flavivirus es descrita en la publicación de PCT WO93/06214. La quimera es una construcción que fusiona proteínas no estructurales de un "tipo", o serotipo, del virus del dengue o un flavivirus, con proteínas estructurales de un diferente "tipo", o serotipo, del virus del dengue u otro flavivirus . Varias vacunas virales y subunitarias recombinantes se han ideado en años recientes. La patente norteamericana No. 4,810,492 describe la producción de la glicoproteina E de JEV para el uso como el antigeno en una vacuna. El DNA correspondiente es clonado en un sistema de expresión para expresar la proteina de antigeno en una célula huésped adecuada tal como E. coli, levadura o un cultivo de células de organismo superior. La patente norteamericana No. 5,229,293 describe el baculovirus recombinante que alberga el gen para la proteina E de JEV. El virus es utilizado para p infectar células de insecto en cultivo, tal que la proteina E es producida y recuperada para el uso como una vacuna. La patente norteamericana No. 5,021,347 describe un genoma de virus de vaccinia recombinante en el cual el gen para la proteina S de JEV se ha incorporado. El virus de vaccinia recombinante vivo es utilizado como la vacuna para inmunizar contra JEV. Los virus y baculovirus de vaccinia recombinantes en los cuales el virus incorpora un gen para un truncamiento C-terainal de la proteina E del serotipo 2 de dengue, serotipo 4 de dengue y JVE son descritos en la patente norteamericana No. 5,494,671. La patente norteamericana No. 5,514,375 describe varios virus de vaccinia recombinantes que expresan porciones de la estructura de lectura abierta de JEV que se extiende de prM a NS2B. Estos virus de erupción pustulosa indujeron la formación de partículas extracelulares que contienen la proteina M procesada y la proteina E. Dos virus recombinantes que codifican estas proteinas de JEV produjeron altos títulos de anticuerpos neutralizantes y de inhibición de hemaglutinina, e inmunidad protectora, en ratones. El grado de estos efectos fue más grande después de dos tratamientos de inmunización que después de sólo uno. El virus de vaccinia recombinante que contiene genes para las proteínas prM/M y E de JEV confirió inmunidad protectora cuando es administrado a ratones (Konishi y colaboradores, Virology 180:401-410 (1991)). Las células HeLa infectadas con el virus de vaccinia recombinante que lleva genes de prM y E de JEV se mostraron que producen partículas subvirales (Konishi y colaboradores, Virology 188:714-720 (1992)). Dmitriev y colaboradores reportaron la inmunización de ratones con un virus de vaccinia recombinante que codifica proteínas estructurales y ciertas proteínas no -estructurales del virus de encefalitis portado por garrapatas (J. Biotechnology 44:97-103 (1996)). Los vectores de virus recombinantes también se han preparado para servir como vacunas de virus para la fiebre del dengue. Zhao y colaboradores (<J. Virol. 61:4019-4022 (1987) ) prepararon el virus de vaccinia recombinante que lleva proteínas estructurales NSl del serotipo 4 de dengue y obtuvieron la expresión después de infectar células mamlferas con el virus recombinante. La expresión similar se obtuvo utilizando baculovirus recombinante para infectar células de insecto objetivo (Zhang y colaboradores, J. Vlrol, 62:3027-3031 (1988)). Bray y colaboradores [j. Virol. 63:2853-2856 (1989)) también reportaron una vacuna para dengue de vaccinia recombinante basada en el gen de proteina E que contiene inmunidad protectora a ratones contra la encefalitis por dengue cuando son estimulados. Falgout y colaboradores («J. ViroJ 63:1852-1860 (1989)) y Falgout y colaboradores {J. Virol. 64:4356-4363 (1990) reportaron resultados similares. Zhang y colaboradores (J. Virol 62:3027-3031 (1988)) mostraron que el baculovirus recombinante que codifica las proteínas E y NSl del dengue del mismo modo protegieron a los ratones contra la encefalitis por dengue cuando son estimulados. Otras combinaciones en las cuales los genes estructurales y no estructurales fueron incorporados en vacunas de viras recombinantes no lograron producir -inmunidad significante (Bray y colaboradores, J. Vízol. 63: 2853-2856 (1989)). También, los monos no lograron desarrollar inmunidad completamente protectora a la estimulación con el virus del dengue cuando son inmunizados con el baculovirus recombinante que expresa la proteina E (Lai y colaboradores (1990) pp. 119-124 en F. Brown, R.M. Chancock, H.S. Ginsberg y R. Lerner (eds.) Vaccines 90: Modern approaches to new vaccines including prevention of AIDS. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) . La inmunización utilizando preparaciones de DNA recombinantes se han reportado para SLEV y el virus del dengue-2, utilizando ratones destetados como el modelo (Phillpotts y colaboradores, Axch. Virol. 141:743-749 (1996); Kochel y colaboradores, Vaccine 15:547-552 (1997)). El DNA de plásmido que codifica los genes prM y E de SLEV proporcionaron protección parcial contra la estimulación con SLEV con una sola o doble dosis de inmunización con DNA. En estos experimentos, los ratones de control mostraron aproximadamente 25¾ de supervivencia y ningún anticuerpo protector se detectó en los ratones inmunizados con DNA (Phillpotts y colaboradores, Arch. Virol. 141:743-749 (1996) ) . En ratones que recibieron tres inyecciones intradériaicas de DNA de plásmido de dengue-2 recombinante que contiene prM, 100% desarrollaron anticuerpos neutralizantes anti-dengue-2 y 92% de aquellos que reciben el gen E correspondiente del mismo modo desarrollaron anticuerpos neutralizantes {Kochel y colaboradores, Vaccine 15:547-552 (1997) ). Los experimentos de estimulación utilizando un programa de dos dosis, sin embargo, no lograron proteger a los ratones contra la estimulación por el virus del dengue-2 letal. Las vacunas desarrolladas hasta la fecha para la inmunización contra la infección por JEV, SLEV, virus del dengue y otros flavi irus tienen un número de desventajas y problemas que acompañan su uso. La vacuna inactivada es costosa e inconveniente de preparar .· Además, cualquier vacuna de tal clase ocasiona el riesgo de reacción alérgica que se origina de las proteínas de la célula huésped utilizadas en la preparación del virus. Además, tales vacunas presentan riesgo considerable a los trabajadores empleados en su producción. Las vacunas de JEV atenuadas candidatas son sometidas a experimentos clínicos, pero a partir de 1996 no han encontrado amplia aceptación fuera de la Gente de la República de China (Hennessy y colaboradores, Lancet 347:1583-1586 (1996) ) . Las vacunas recombinantes basadas en el uso de solamente ciertas proteínas de flavi irus, tal como JEV, producidas por la expresión biosintética en cultivos de células con la purificación o tratamiento subsecuente de los antigenos, no inducen altos títulos de antic-ierpo. También, similar a las preparaciones de virus completo, estas vacunas llevan el riesgo de reacción alérgica adversa a los antígenos del huésped o al vector. El desarrollo de la vacuna contra el virus del dengue y WNV es menos avanzado y tales vacunas basadas en proteína recombinante o basadas en virus enfrentan problemas similares a aquellos mencionados en lo anterior. Por lo tanto, existe una necesidad por vacunas o vacunas mejoradas dirigidas contra flavivirus tales como el virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, JEV, SLEV y WNV que sean de bajo costo para preparar, presenten poco riesgo a los trabajadores involucrados en su elaboración, lleven riesgo mínimo de reacciones inmunológicas adversas debido a impurezas o componentes inmunogénicos adventicios y sean altamente efectivas en producir anticuerpos neutralizantes e inmunidad protectora. Además, existe una necesidad por una vacuna contra JEV, WNV y flavivirus relacionados que minimice el número de dosis de inmunización requeridas. Muchas de las desventajas de la técnica actual, como es descrito en detalle para la producción de vacunas, también aplican a la producción de antigenos y anticuerpos a ser utilizados para la producción de inmunodiagnósticos . Particularmente, los riesgos concurrentes y los costos involucrados en la producción de antigenos a partir de virus y la deficiencia de la mayoría de los antigenos recombinantemente expresados, actualmente disponibles para producir respuestas inmunes efectivas están en paralelo en el campo de los inmunodiagnósticos por los mismos riesgos, altos costos y una falta de sensibilidad correspondiente. Asi, debido a los altos costos, riesgo de infección accidental con el virus vivo y niveles de sensibilidad menores que los deseados de las pruebas previamente disponibles, aun existe una necesidad por pruebas de diagnóstico rápidas, simples y ampliamente sensibles para detectar la infección y/o contaminación por flavivirus. La presente invención satisface estas necesidades al proporcionar antigenos recombinantes altamente inmunogénicos para el uso en ensayos de diagnóstico para la detección de anticuerpos a flavi irus seleccionados. La presente invención además proporciona el uso de antlgenos recombinantes derivados de flavivirus, genes de flavivirus o miméticos de los mismos en ensayos de inmunodiagnóstico para la detección de anticuerpos a proteínas de flavivirus.
Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que contiene una unidad de transcripción (TU) para un antigeno de flavivirus in unogénico . La TU dirige una célula huésped, después de que es incorporada dentro de la célula, para sintetizar el antigeno. En un aspecto importante de la invención, el flavivirus puede ser el virus de la fiebre amarilla (YFV) , virus del dengue serotipo 1 (DEN-1), virus del dengue serotipo 2 (DEN-2), virus del dengue serotipo 3 (DEN-3) , virus del dengue serotipo 4 (DEN-4) , virus de encefalitis de St. Louis (SLEV) , virus de encefalitis japonés (JEV) , virus de West Nile (WNV) , virus de Powassan o cualquier otro flavivirus. En modalidades importantes de la presente invención, el antigeno puede ser la proteina prM/M de flavivirus, la proteina E o ambas. En modalidades importantes de la presente invención, el antigeno puede ser una proteina de flavivirus quimérica. En particular, cuando la TU incluye ambas de las proteínas prM/M y E, la célula huésped secreta partículas subvirales que contienen los antigenos prm/ y E. En un aspecto importante adicional de la invención, el ácido nucleico es una molécula de D A. En modalidades significantes adicionales, la TU de ácido nucleico incluye una secuencia de control dispuesta apropiadamente tal que operablemente controla la expresión de los antigenos prM/M y E y esta secuencia de control puede ser el promotor temprano inmediato de citomegalovirus . En ana modalidad adicional, la secuencia de nucleótidos de la TU es diseñada para optimizar la traducción eucariótica al minimizar las estructuras de horquilla grandes en la región no traducida del extremo 5' de un mRNA producido por la TU y/o la inclusión de una secuencia consensual Kozak en el sitio de inicio de traducción de un mRNA. producido por la TU. En una modalidad adicional, la unidad de transcripción también incluye un terminador poli-A. La presente invención además proporciona una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico que incluye una unidad de transcripción para un antigeno de flavivirus inmunogénico que dirige la célula huésped a sintetizar el antigeno inmunogénico. El flavivirus puede ser YFV, DEN-1, DEN-2 , DEN-3, DEN- , SLEV, JEV, WNV, virus de Powassan u otros flavivirus. En modalidades importantes, el antigeno puede ser la proteina prM/M, la proteina E o ambas de las proteínas prM/M y E. En este último caso, la célula secreta partículas subvirales que contienen los antigenos prM/M y E. Adicionalmente, la invención proporciona una composición para vacunar a un sujeto contra un flavivirus, que contiene una molécula de ácido nucleico que incluye una unidad de transcripción para un antigeno flaviviral inmunogénico. La unidad de transcripción dirige una célula dentro del cuerpo del sujeto, después de que es incorporado en el mismo, para sintetizar el antigeno inmunogénico . La composición además' incluye un portador farmacéuticamente aceptable. En modalidades significantes, el flavivirus puede ser YFV, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, SLEV, JEV, WNV, virus de Powassan u otros flavivirus. Adamas, el antigeno puede ser la p oteina prM/M, la proteina E, o ambas de las proteinas prM/M y E. En este último caso, la célula secreta partículas subvirales que comprenden los antigenos prM/M y E de flavivirus. Estas partículas subvirales también son referidas como antigeno recombinante no infeccioso (NRA) . En modalidades importantes, la molécula de ácido nucleico es una molécula de DNA. En modalidades significantes adicionales, la unidad de transcripción adicionalmente contiene una secuencia de control dispuesta apropiadamente tal que operablemente controla la síntesis de los antígenos prM/M y E cuando el ácido nucleico es introducido en la célula del sujeto. Esta secuencia de control puede ser el promotor temprano inmediato de citomegalovirus. En una modalidad aun adicional, la unidad de transcripción también puede incluir un terminador poli-A. Las composiciones proporcionadas por la presente invención para vacunar un sujeto contra un flavivirus, pueden incluir una molécula de ácido nucleico, o moléculas, que incluyen unidades de transcripción para más de un antigeno flaviviral inmunogénico. Más de un antigeno flaviviral irimunogénico puede, ser de diferentes especies de flavivirus, cepas o aislados en cualquier combinación. En modalidades significantes, los flavivirus incluidos pueden ser dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, siete o más flavivirus. Ejemplos de tales flavivirus incluyen, pero no están limitados a YFV, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DE:~-4, SLEV, JEV, WNV, virus de Powassan u otros flavivirus. Las vacunas de combinación pueden ser formuladas para conferir inmunidad a la enfermedad por flavivirus común a las regiones geográficas particulares. En ana modalidad particular dirigida hacia Asia tropical y subtropical, los virus DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, ¾fN y JE pueden ser seleccionados. En una modalidad particular dirigida a Africa, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, WN y YF pueden ser seleccionados. En una modalidad particular dirigida a Latinoamérica, los virus DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN- , Roció e YF pueden ser seleccionados . La invención proporciona aún además un método para inmunizar a un sujeto contra la infección por un flavivirus. El método involucra administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición de vacunación que contiene una molécula de ácido nucleico que incluye una unidad de transcripción para un antigeno de flavivirus inmunogénico. La unidad de transcripción dirige una célula dentro del cuerpo del sujeto, después de que es captada por la célula, para sintetizar el antigeno inmunogénico. La composición adicionalmente incluye un portador farmacéuticamente aceptable. En modalidades significantes del método, el flavi irus puede ser YFV, DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN- , SLEV, JEV, WNV, virus de Powassan u otros flavi irus. Todavía en otros aspectos importantes del método, el antígeno puede ser la proteína prM/M, la proteína E o ambas de las proteínas prM/M y E. Cuando el antígeno es ambas de las proteínas prM/M y E, la célula dentro del cuerpo del sujeto, después de que incorpora el ácido nucleico dentro de ésta, secreta partículas subvirales que comprenden los antígenos prM/M y E flavi irales . Adicionalmente, en modalidades significantes del método, la composición de vacunación es administrada al sujeto en una dosis individual, vía una ruta parenteral. Todavía en un aspecto adicional del método, el ácido nucleico es una molécula de DNA. Todavía en modalidades adicionales del método, la unidad de transcripción además incluye una secuencia de control dispuesta apropiadamente tal que operablemente controla la síntesis de los antígenos prM/M y E y en un aspecto significante de esta modalidad, la secuencia de control es el promotor temprano inmediato de citomegalovirus.. Además, la unidad de transcripción puede incluir un terminador poli-A. Estos aspectos y modalidades de la invención son la base para sus distintos atributos y ventajas. Siendo una construcción de ácido nucleico que involucra solamente porciones del genoiaa de flavivirus antes que la secuencia que comprende el genoma completo, la vacuna que contiene TU de ácido nucleico es completamente no viable. Por lo tanto no presenta peligro de infección por el flavivirus aquellos involucrados en su elaboración o a los sujetos que reciben la vacuna. La vacuna de ácido nucleico es fácil de preparar y fácil de administrar y es estable en el almacenamiento antes del uso. Inesperadamente se ha encontrado que la vacuna de ácido nucleico de la invención es esencialmente 100% exitosa en conferir inmunidad protectora en mamíferos después de la administración de solamente una sola dosis. Un resultado no esperado adicional es que la TU de ácido nucleico es capaz de engendrar inmunidad a un flavivirus en un mamífero hembra que puede ser transmitido a su progenie a través de la leche. Sin desear que sea limitado por la teoría, el inventor cree que un mecanismo posible para el éxito del ácido nucleico en conferir inmunidad protectora es que una célula huésped que alberga el ácido nucleico, tal como la célula de un sujeto a quien la vacuna es administrada, produce partículas subvirales que contienen los antígenos prm/M y E flavivirales . Estas partículas imitan los atributos inmunogénicos de los viriones de flavivirus nativos. La presente invención también proporciona polipéptidos antigénicos no infecciosos, fragmentos de polipéptido antigénico y NRA que comprenden las proteínas pr /M y/o E de flavivirus, en donde la secuencia de señal de transmembrana es derivada de un primer, flavivirus y las proteínas M y/o E son derivadas de un segundo flavivirus. Además, la proteína prM/M puede comprender secuencias de aminoácidos de tanto el primero como el segundo flavivirus. Además, " la proteína E puede comprender secuencias de ami oácidos de tanto el primero como el segundo flavivirus . "Quimérico" como se utiliza en la presente, significa cualquier proteína o ácido nucleico que comprende la secuencia de más de un flavivirus. Como se utiliza en la presente, "no virulento" significa que el antlgeno o vacuna de esta invención es incapaz de ocasionar enfermedad. Más particularmente, los antigenos de proteína recombinantes están libres de material genómico contaminante de los flavivirus que es necesario para la infección, replicación y patogénesis del flavivirus. Los polipéptidos de la presente invención pueden comprender las secuencias de aminoácidos definidas en la presente, o que son conocidas en la técnica, de las proteínas prM, M y/o E de flavivirus seleccionados. Los ácidos nucleicos de esta invención pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas prM, M y/o E de flavivirus seleccionados . Los antígenos de la presente invención pueden ser no conjugados, o pueden ser conjugados a una molécula portadora que facilita la colocación del antigeno en una fase sólida. Una molécula portadora es una a la cual los antigenos pueden ser conjugados y que no reaccionará con los anticuerpos en el suero humano. Un ejemplo de tal portador es la albúmina de suero bovino (BSA) . Los antigenos de la presente invención también pueden ser proteínas recombinantes obtenidas al expresar ácidos nucleicos que codifican el antigeno en un sistema de expresión capaz de producir el antigeno. Las secuencias de aminoácidos de los presentes antigenos pueden contener una porción inmunoreactiva del antigeno prM, M y/o E. Esos antigenos pueden además ser unidos a secuencias diseñadas para proporcionar alguna propiedad adicional, tal para como para retirar/adicionar aminoácidos capaces del enlace de disulfuro para incrementar la reactividad de un epitope al proporcionar una estructura secundaria más rigida, para incrementar su biolongevidad o para alterar su citotoxicidad o para prevenir la infección. En cualquier caso, el antigeno debe poseer inmunoreactividad y/o inmunogenicidad . Br¾ e Descripción de los Dibujos La Figura 1 es una representación esquemática del procesamiento de la poliproteina flaviviral. La región horizontal central proporciona una representación esquemática del genoma viral. Las lineas denotan las regiones no traducidas 5' y 3' y las regiones encuadradas representan la estructura de lectura abierta para las proteinas estructurales (izquierda y superior) y no estructurales (derecha y fondo) . La segmentación por la señalasa de la célula huésped surge simultáneamente con la traducción en el C-terminal de la proteina E, separandc las regiones estructurales y no estructurales. Una enzima celular similar a la subtilasa, furina, puede ser responsable para la segmentación de prM. Los dominios de transmembrana potenciales de la poliproteina viral son indicados por áreas sombreadas . La Figura 2 es un mapa del genoma de JEV (superior) y la secuencia de DNA de los oligonucleótidos utilizados en una reacción de cadena de polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR) (centro) para construir la unidad de transcripción para la expresión de las regiones de codificación de la proteina prM-E (fondo) . Los dominios de transmembrana potenciales de la poliproteina viral son indicados por áreas sombreadas . La Figura 3 muestra una representación esquemática de los vectores de plásmido, pCDNA3, pCBamp y PCIBamp, y la relación entre éstos. Estos plásmidos incluyen el elemento promotor/aumentador de CMV (citoraegalovirus) , BGHp(A) (señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino secuencia de terminación de transcripción) , gen de resistencia a la ampicilina y el origen ColEl de replicación para la selección y mantenimiento en E. col!. El origen fl de replicación para el rescate de una sola hebra en células de £. coli, origen SV40 de replicación (SV40 ORI) , región de codificación de resistencia a neomicina y secuencias SV40p(A) fueron suprimí das de pCDNA3 para generar pCBamp. Una secuencia de intrón se insertó en el sitio NcoI-Kpr.I del pCBamp para generar el plásmido pCIBamp. La Figura 4 muestra los análisis de SDS-PAGE-inmunomanchado de las partículas subvirales purificadas con gradiente de sucrosa del fluido de cultivo COS-1 de JE-4B (4B, franja derecha de cada par). El virión JE purificado con gradiente de densidad del cultivo de células C6/36 infectadas con JEV se utilizó como un control positivo (JEV, franja izquierda de cada par) . JE HIAF (fluido ascitico hiperinmune) ; 4G2, anticuerpo monoclonal anti-E; JM01, anticuerpo monoclonal anti-M; NMAF (fluido ascitico de ratón normal) . La Figura 5 muestra un perfil del antigeno E en un análisis de gradiente de sucrosa zonal de proporción preparado del precipitado de PEG del medio de cultivo de células JE-4B con o sin tratamiento con Tritón X-100. La Figura 6 muestra la probabilidad de péptido de señal del pCBJEl-14 (pCBJE) predicha por el programa SignalP-HMM (A) . La probabilidad de péptido de señal es me orada por la alteración de la secuencia de la c-región en las posiciones -4 y -2 (C-4G y G-2S) (panel B, JE-LSS-M) , mediante el acortamiento de la n-región (panel C, JE-SS-ORI), o por una combinación de ambas modificaciones (panel D, JE-SS-M) - La Figura 7 muestra representaciones esquemáticas de vectores de plásmido pCBD2-14-16 (100% Den-2 E) , pCBD2-U-4-3 (90% DEN-2 E:10% JEV E) , y pCB8D2-2J-2-9-1 (80% DEN-2 E:20% JEV E) . Estos plásmidos incluyen el promotor de gen temprano de citomegalovirus (CMV) humano; secuencia de señal del virus JE; región del gen pr y E del virus Den-2 (amino terminal 100%, 90% u 80%, respectivamente); región del gen E del virus JE (ninguno, 10% o 20%, respectivamente); y la señal poli A de hormona de crecimiento bovino (BGH) . La Figura 8 muestra una comparación de la proteina recombinante enlazada a la membrana y secretada por el manchado de Western- (A) Análisis .del antigeno recombinante secretado después de la precipitación con PEG y la extracción con etanol del fluido de cultivo para los plásmidos de DEN-2 PCB8D2-2J-2-9-1, pCB9D2~lJ-4-3, pCBD2-14-16, y el plásmido de control pEGFP. La franja 1 (V), virus de DEN-2 purificado manchado por Gold Blot (Owl Separation Systems, Portsmouth, NH) . La reactividad del antigeno recombinante, secretado de cada plásmido con a, Mab 1A6A-8 especifico de antienvoltura (E); b, una mezcla de MAB 1A6A-8; Mab 1A2A-1 especifico de anticapsid (C) , antisuero especifico para la proteina de premembrana (prM) del virus de DEN-2; y c, ascitis de ratón normal. (B) Análisis de las proteinas de membrana hidrofóbica de células transformadas con plásmido recombinante . Franja 1 (V) , virus de DEN-2 purificado, manchado por Gold Blot; franja 2 (V), reactividad del virus de DEN-2 purificado con una mezcla de Mab 1A6A-8, Mab 1A2A-1, antisuero especifico para la proteina M del virus de DEN-2 y antisuero para la proteina prM del virus de DEN-2. La reactividad de las proteinas de membrana hidrofóbica aisladas de cada linea de células transformadas con plásmido con a, Mab 1A6A-8, b, una mezcla de Mab 1A6A-8, Mab 1A2A-1, antisuero especifico para la proteina M del virus de DEN-2, y antisuero para la proteina prM del virus de DEN-2 y c, ascitis de ratón normal. Descripción Detallada de la Invención La invención comprende unidades de transcripción de ácido nucleico que codifican proteinas antigénicas flavivirales, tales como los antigenos de proteinas prM/M y E. Los ácidos nucleicos funcionan para expresar los antigenos de proteínas prM/M y E, cuando el ácido nucleico es captado por una célula apropiada, especialmente cuando la célula es la célula de un sujeto. La invención también comprende una vacuna cuyo agente activo es la unidad de transcripción (TU) de ácido nucleico. La invención además comprende células que contienen una TU. La invención además comprende un método para iimiunizar a un sujeto contra la infección flavi iral, al administrar al sujeto una cantidad efectiva de una vacuna que contiene las moléculas de TU de ácido nucleico. La invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una unidad de transcripción que codifica una secuencia de señal de una estructural de un primer flavivirus - y un antig^no de. flavi irus inmunogénico de un segundo flavivirus, en donde la unidad de transcripción dirige la síntesis del antigeno. La dimensión además comprende el uso de la unidad de transcripción (TU) de ácido nucleico para generar antigenos flavivirales y los antigenos flavivirales producidos por la TU de ácido nucleico. Los antigenos flavivirales comprendidos por la presente invención incluyen antigenos de flavivirus quiméricos que incorporan las secuencias de aminoácidos de un primer flavivirus y por lo menos un flavivirus adicional. La invención aún además comprende el uso de los antigenos flavivirales codificados por la TU de la invención para producir anticuerpos específicos del flavivirus y para detectar la presencia de anticuerpos específicos del flavivirus. En una modalidad, el ácido nucleico aislado de esta invención puede comprender una unidad de transcripción que codifica una secuencia de señal del virus de encefalitis aponés . En otra modalidad, la unidad de transcripción de esta invención puede codificar un antigeno de flavivirus inmunogénico crue puede ser de uno o más de los siguientes flavivirus: virus de la fiebre amarilla, virus del dengue serotipo 1, virus del dengue serotipo 2, virus del dengue serotipo 3, virus del dengue serotipo 4, virus de encefalitis japonés, virus de Powassan y virus de West Nile. En otra modalidad, la uniddd^ de transcripción de. esta invención puede codificar un antigeno de flavivirus quimérico inmunogénico que puede incluir la secuencia de más de uno de los siguientes flavivirus: virus de la fiebre amarilla, virus del dengue serotipo 1, virus del dengue serotipo 2, virus del dengue serotipo 3, virus del dengue serotipo 4, virus de encefalitis japonés, virus de Powassan y virus de West Nile. En una modalidad particular, el ácido nucleico de esta invención puede codificar una secuencia de señal del virus de encefalitis japonés y una proteina M y una proteina E del virus de West Nile, SLEV, YFV y/o virus de Powassan. El ácido nucleico también puede codificar un antigeno inmunogénico que puede ser una proteina M de un flavivirus, una proteina E de un flavivirus, tanto una proteina M como una proteina E de un flavivirus, una porción de una proteina M de un flavivirus, una porción de una proteina E de un flavivirus y/o tanto una porción de una proteina M de un flavivirus como una porción de una proteina E de un flavivirus. En una modalidad preferida, el ácido nucleico aislado codifica tanto la proteina M como la proteina E del flavivirus. Además, el ácido nucleico de la invención puede ser DNA y puede comprender las secuencias de nucleótidos SEQ ID N0:15 SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:21, SEQ ID NO:23 0 SEQ ID NO : 42. En otra modalidad particular, el .ácido nucleico de esta invención puede codificar una secuencia de señal del virus de encefalitis japonés, una proteina M de un segundo virus y una proteina E quimérica formada por la sustitución de una porción del ácido nucleico que codifica la proteina E del segundo virus con el ácido nucleico que codifica la porción correspondiente de la proteina E de JEV. Alternativamente, la porción de la secuencia correspondiente a la porción suprimida de la proteina E del segundo virus puede ser sustituida por otra secuencia seleccionada de un tercer virus o puede ser una secuencia no viral. La segunda proteina puede ser el virus de West Nile, SLEV, YFV, Powasan y/o un serotipo del virus del dengue. Las proteinas E quiméricas pueden incluir aquellas donde la porción carboxi terminal puede ser de un flavivirus y el resto de la proteina E quimérica es de otro flavivirus. La porción carboxi terminal puede ser, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 o 75% de la proteina E quimérica. El ácido nucleico de la invención puede ser DNA y puede comprender la secuencia de codificación de proteina de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 46. El ácido nucleico de la invención puede comprender la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:44 o SEQ ID NO:46. La unidad de transcripción de esta invención también puede comprender una secuencia de control dispuesta apropiadamente, de modo - que operablemente controla la síntesis del antigeno. La secuencia de control puede ser, por ejemplo, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus . El ácido nucleico de esta invención también puede comprender una secuencia consensual Kozak localizada en un sitio de inicio de traducción de un polipéptido que comprende el antigeno codificado por la unidad de transcripción. La unidad de transcripción de esta invención también puede comprender un terminador poli-A. La presente invención además proporciona una célula que comprende el ácido nucleico de esta invención. También se proporciona una composición que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y el ácido nucleico o célula o antigeno de esta invención. La presente invención adicionalmente proporciona un método para inmunizar un sujeto contra la infección por un flavivirus, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición de esta invención. En una modalidad particular, la composición utilizada para inmunizar un sujeto dirige la síntesis de tanto la proteina M como la proteina E de un flavivirus y una célula dentro del -cuerpo del sujeto, después de que incorpora el ácido nucleico dentro de ésta, secreta partículas subvirales que comprenden la proteina y la proteina E. Alternativamente, la composición puede comprender un proteina M y/o proteina E de un~flavivirus o partículas subvirales que comprenden la proteína M y la proteína E. En los métodos de esta invención, la composición de inmunización puede ser administrada al sujeto en una sola dosis y puede ser administrada por medio de una ruta parenteral. Esta invención además proporciona los antigenos producidos de los ácidos nucleicos aislados de esta invención. Como un ejemplo, el antigeno del segundo flavivirus codificado por la secuencia de nucleótidos de la TU puede ser la proteína M que puede ser, por, ejemplo, del virus de West Nile. El antígeno también puede ser la proteína del virus del dengue, virus de encefalitis de St. Louis, virus de encefalitis japonés, virus de Po assan y/o virus de la fiebre amarilla. En una modalidad adicional, el antígeno comprende una proteína prM/M que comprende la secuencia de señal de transmembrana de u primer flavivirus y la secuencia de aminoácidos adicional que comprende el resto de la proteína prMM de un segundo flavivirus, que puede ser de SLEV, JEV, YFV, V y/o virus de Powassan. La secuencia de señal de transmembrana de un primer flavivirus puede ser una secuencia de señal mejorada o modificada, en donde la secuencia de señal imparte caracteristicas deseadas tal como una alta probabilidad de secuencia de señal. La realización de estos objetivos por el diseño o selección puede ser con el uso de programas de computadora de instrucción en máquina que - incluyen, pero no limitador- a, aquellos que utilizan un modelo Markov oculto. El antigeno codificado por la secuencia de nucleótidos de la TU puede ser el antígeno del virus de West Nile, el antígeno del virus del dengue, el antígeno del virus de encefalitis de St. Louis, el antigeno del virus de encefalitis japonés, el antígeno del virus de Powassan y/o el antígeno del virus de la fiebre amarilla. El antígeno codificado por la secuencia de nucleótidos de la TU también puede ser la proteína E, que puede ser la proteína E del virus de West Nile, virus del dengue, virus de encefalitis de St. Louis, virus de encefalitis japonés, virus de Powassan y/o virus de la fiebre amarilla. El antígeno codificado también puede ser una proteína M quimérica que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de más de un flavivirus. Adicionalmente, el antígeno codificado por la secuencia de nucleótidos de la TU puede ser la proteína M y la proteína E, que puede ser del virus de West Nile, virus del dengue, virus de encefalitis de St. Louis, virus de encefalitis japonés, virus de Powassan y/o virus de la fiebre amarilla. Como se utiliza en la presente, "proteina M" o "proteina pr/M" o "proteina prM/M" significa una proteina M de flavivirus o proteina prM de flavivirus. Ejemplos incluyen, pero no -están limitados a, proteínas prM que -comprenden secuencias de aminoácidos de una o más proteínas prM de flavi irus, proteínas M que no comprenden secuencias de aminoácidos adicionales y proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos adicionales que son procesadas in vitio o ín vivo para generar la proteína M madura. Como se utiliza en la presente, "unidad de transcripción de ácido nucleico" o "molécula de unidad de transcripción de ácido nucleico" significa un ácido nucleico que codifica una o más proteínas especificadas. La TU tiene actividad biológica tal que, después de que se ha introducido en una célula adecuada, el ácido nucleico induce la síntesis de uno o más productos de gen especificados, codificados por el ácido nucleico. El (los) producto (s) de gen es (son) otras macromoléculas biológicas, tales como proteínas, no químicamente relacionadas con la TU. La TU de ácido nucleico induce a la célula a emplear sus componentes celulares para producir el producto o productos de gen específicos, codificados por el ácido nucleico de la TU. Aunque cualquier ácido nucleico puede servir como una TU, en una modalidad preferida, la TU es el DNA de un plásmido o vector similar, en donde el plásmido o vector comprende secuencias de codificación de genes marcadores u otras construcciones de secuencias que facilitan el uso de la TU para la experimentación y biosintesis. Como se utiliza en la presente, una "secuencia ¿3 control" es una secuencia de nucleótidos reguladora incorporada dentro de una TU que interactúa con los componentes celulares apropiados de la célula y conduce a la biosintesis aumentada o activada de los productos de gen codificados por la TU. Asi una secuencia de control adecuada es una con la cual los componentes de la célula tienen la capacidad para interactuar, dando por resultado la sintesis del producto de gen. Cuando se dispone operablemente en un ácido nucleico con respecto a una secuencia de codificación especificada, una secuencia de control efectivamente controla la expresión del ácido nucleico especificado para producir el producto de gen. Como se utiliza en la presente, un "promotor" es una secuencia de nucleótidos en una TU que sirve como una secuencia de control. Como se utiliza en la presente, una "secuencia Kozak" o "secuencia consensual Kozak" es una secuencia de nucleótidos en el sitio de inicio de traducción que optimiza la traducción de los mRNAs eucarióticos (Kozak, Mol. Cell.
Biology 9:5134-5142 (1989)). Como se utiliza en la presente, un "terminador" es una secuencia de nucleótidos extendida que actúa para inducir la poliadenilación en el extremo 3' de un mRNA maduro. Una secuencia de terminador es encontrada después de, o corriente abajo de, una secuencia de codificación particular. Como se utiliza en la presente, una ""célula" es una célula procariótica o eucariótica que comprende una TU que codifica para uno o más productos de gen, o en la cual se ha introducido una TU de tal clase. Asi, una célula alberga una sustancia extraña o heteróloga, la TU, que no es naturalmente o endógenamente encontrada en la célula como un componente. Una célula adecuada es una . que tiene la capacidad para la biosintesis de los productos de gen como una consecuencia de la introducción de la TU. En particular, una célula adecuada es una que responde a una secuencia de control en una secuencia de terminador, si lo hay, que puede ser incluida dentro de la TU. En modalidades importantes de la presente invención, la célula es una célula mamifera. En modalidades particularmente importantes de esta invención, la célula es una célula que surge de manera natural en el cuerpo de un humano o sujeto no humano a quién (el cual) la TU se ha administrado como un componente de una vacuna. Alternativamente, en aplicaciones analiticas, o aplicaciones de diagnóstico, que incluyen la preparación del antigeno para el uso como una vacuna o en ensayos de irimunodiagnós ico, o para propósitos demostrativos, la célula puede ser una célula humana o no humana cultivada in vitro. Como se utiliza en la presente, una "vacuna" o una ¦"composición para vacunar a un sujeto" especifica para un patógeno particular, significa una preparación, que, cuando es adzainistrada a un sujeto, conduce a una respuesta inmunogénica en un sujeto. Como se utiliza en la presente, una respuesta "inmunogénica" es una que confiere en el sujeto inmunidad protectora contra el patógeno. Sin desear que sea enlazada por la teoría, se cree que una respuesta inmunogénica puede surgir de la generación de anticuerpos neutralizantes (es decir, una respuesta inmune humoral) o de células citotóxicas del sistema inmune (es decir, una respuesta inmune celular) o ambas. Como se utiliza en la presente, un "antigeno inmunogénico" es un antigeno que induce una respuesta inmunogénica cuando es introducida en un sujeto, o cuando es sintetizado dentro de las células de un huésped o un sujeto. Como se utiliza en la presente, una "cantidad efectiva" de una vacuna o composición de vacunación en una cantidad que, cuando es administrada de un sujeto, es suficiente para conferir inmunidad protectora en el sujeto. Históricamente, una vacuna se ha éntendido que contiene como un principio activo uno o más componentes o estructuras moleculares más especificas que comprenden el patógeno, especialmente su superficie. Tales estructuras pueden incluir componentes de superficie tales como proteínas, carbohidratos complejos y/o lipidos complejos que comúnmente son encontrados en organismos patogénicos . Como se utiliza en la presente, sin embargo, se va a dar énfasis de que los Lérminos "vacuna" o "-composición para vacunar un sujeto" se extienden al significado convencional resumido en el párrafo anterior. Como se utiliza en la presente, estos términos también se refieren a la TU de la presente invención o a composiciones que contienen la TU. La TU induce la biosintesis de uno o más productos de gen especificados, codificados por la TU dentro de las células del sujeto, en donde los productos de gen son antigenos especificados de un patógeno. Los antigenos biosintéticos luego sirven como un inmunógeno. Como ya se mencionó, la TU y por lo tanto la vacuna, puede ser cualquier ácido nucleico que codifica los antigenos inmunogénicos especificados. En una modalidad preferida de esta invención, la TU de la vacuna es DNA. La TU puede incluir un plásmido o vector que incorpora genes adicionales o secuencias particulares para la conveniencia del trabajador experto en los campos de biología molecular, biología celular e inmunología viral (Ver Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Current Protocols in Molecular Biology, Ausu el y colaboradores, John Wiley and Sons, New York 1987 (actualizado trimestralmente) , que son incorporadas en la presente por referencia) . La moléculas de TU de la presente invención comprenden ácidos nucleicos, o derivados de ácidos nucleicos, que tienen secuencias de nucleótidos qu~: codifican los productos de gen específicos relacionados con los antigenos de . flavi irus tales como, pero no limitados a WNV, JEV, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla y SLEV. Aunque cualquier ácido nucleico puede servir como una TU, en una modalidad importante, la TU es DNA. Alternativamente, los ácidos nucleicos pueden ser moléculas de RNA. Ellos también pueden ser cualquiera de varios derivados de DNA o RNA que tienen un esqueleto principal de enlaces de fosfodiéster que se han modificado químicamente para incrementar la estabilidad de la TU como un agente farmacéutico. Las modificaciones asi contempladas, incluyen, pero no están limitadas a, derivados de fosforotioato o derivados de fosfonato. Estos y otros ejemplos de derivados son bien conocidos para aquellas personas expertas en el campo de la química de ácidos nucleicos. El genoma del JEV se ha caracterizado y secuenciado (Figuras 1 y 2) . La proteina estructural M es expresada como una porción de la poliproteina que incluye una secuencia pre-M (pr) . Esta secuencia pr, inmediatamente amino terminal a la secuencia de proteina M, previene los problemas de conformación en el procesamiento de la poliproteina . En particular, la presencia de la secuencia pr es importante en prevenir el mal plegamiento de la proteina E. Asi, la presencia de prM permite el ensamble de las partículas de ^JEV. Una vez que el virión o partícula—es formado, la secuencia pr puede ser segmentada- de la proteina M para producir partículas de virus maduras que contienen las proteínas M, aunque la segmentación de la proteina prM para producir proteínas M no es necesaria para producir partículas infecciosas . Las secuencias de prM de muchos flavivirus relacionados, diferentes son segmentadas a solo un bajo grado, pero los flavivirus por si mismos son no obstante, infecciosos. Ejemplos de tales flavivirus relacionados con estructuras y funciones genómicas similares incluyen, pero no están limitados a, WNV, YFV, virus del dengue y SLEV. En una modalidad, la TU que codifica las proteínas M y E flavivirales en la presente invención es DNA. De acuerdo con la discusión en el párrafo anterior, este DNA comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteina M, que comprende la secuencia pre-M, y una secuencia de nucleótidos que codifica la proteina E. De esta manera, los productos de gen propuestos se habilitan para formar partículas subvirales dentro de la célula. La secuencia pre-M luego puede ser segmentada de una manera análoga a aquella que surge con respecto a los viriones repletos. Para funcionar efectivamente in vivo como una vacuna, es ventajoso incluir dentro de la TU una secuencia de control que tiene el efecto de aumentar o promover la transcripción de la secuencias de nucleótidos que codifican los antigenos. El uso de tales promotores -es bien conocido para aquellos expertos -en los campos de biologia molecular, biología celular e inmunología viral (Ver Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y colaboradores John Wiley and Sons, New York 1987 (actualizado trimestralmente) . Cuando la TU es utilizada como una vacuna en un huésped mamífero, el promotor a ser empleado es de preferencia uno que opera efectivamente en las células mamiferas. Tal promotor es dispuesto con respecto a las secuencias de codificación de las' cuales la transcripción puede ser promovida, a una posición en la cual puede operablemente promover tal transcripción. En una modalidad significante de la presente invención, este promotor es el promotor temprano de citomegalovirus . Además, en una modalidad preferida adicional de la invención, las secuencias de codificación son seguidas, en el ácido nucleico de TU, por una secuencia de terminador (Sambrook y colaboradores) . Modalidades particulares de la invención se refieren a células tanto procarióticas como eucarióticas . Muchas secuencias de promotor se conocen que son útiles en células ya sea procarióticas o eucarióticas (Ver Sambrook y colaboradores) . Los ácidos nucleicos de la invención además pueden incluir secuencias de DNA. conocidas para aquellos expertos en la técnica, para actuar como elementos inmunoestimuladores . Ejemplos de tales elementos incluyen, pero no están limitados a, ciertas porciones CpG en el DNA bacteriano (Sato y colaboradores, Science 273:352-354 (1996); Klinman y colaboradores, Vaccine 17:19-25 (1998)). La preparación de la TU de la invención es fácilmente realizada por métodos bien conocidos para los trabajadores expertos en el campo de la biología molecular. los procedimientos involucrados son expuestos, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 2nd Ed., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cois Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 y Current Protocols in Molecular Bioloqy . Ausubel y colaboradores, John Wiley and Sons, New York 1987 (actualizado trimestralmente) . La molécula de RNA flaviviral puede ser aislada de una muestra de virus vivo por métodos ampliamente conocidos entre los virologistas familiarizados con los flavi irus, por ejemplo, y con otros grupos de virus también. Los métodos utilizados con JEV son resumidos en Kuno y colaboradores (J. Virol. 72:73-83 (1998)). El RNA es utilizado como un patrón para la síntesis de cDNA utilizando transcriptasa inversa. Del cDNA, un fragmento que contiene la región de codificación de pre-M hasta E (Figura 2) es obtenido mediante la digestión con nucleasas de restricción conocidas para segmentar el cDNA apropiadamente para proporcionar tales fragmentos. Ejemplos de la digestión de r stricción de JEV son proporcionados en Nitayaphan y colaboradores (1990) y Konis i y colaboradores (1991) . La incorporación de los promotores, tal como el promotor de citomegalovirus, las secuencias para promover la traducción eficiente, tal como la secuencia Kozak, y de la señal de poliadenilación, es del mismo modo bien conocida para aquellos expertos practicantes en la biología molecular y la ingeniería de DNA recombinante (Kozak, Mol. Cell. Biology 9:5134-5142 (1989); Azevedo y colaboradores, Braz. J. Med. Biol. Res 32:147-153 (1999)). Cuando se prepara un ácido nucleico que comprende una TU que contiene las secuencias de codificación deseadas y las secuencias de control, éste se puede obtener en cantidades más grandes por métodos que amplifican los ácidos nucleicos. Tales métodos son ampliamente conocidos para los trabajadores expertos en la biologia molecular y la ingeniería de DNA recombinante. Ejemplos de estos métodos incluyen la incorporación del ácido nucleico en un plásmido para la replicación mediante el cultivo en una célula, tal como una célula procariótica y la cosecha del plásmido después de completar el cultivo, asi como la amplificación del ácido nucleico por métodos tales como PCR y otros protocolos de amplificación, como son bien conocidos en la técnica. Estos ejemplos no se proponen para limitar las maneras en las cuales se puede obtener el ácido nucleico que contiene la TU. Las moléculas-d - ácido nucleico que contienen TU de la presente invención pueden ser introducidas en las células apropiadas de muchas maneras bien conocidas para aquellos trabajadores expertos en los campos de biología molecular e inmunología viral. A manera de ejemplo, estos incluyen, pero no están limitados a, la incorporación en un plásmido o vector de ácido nucleico similar que es tomado por las células, o la encapsulación dentro de estructuras de lipido vesiculares tales como liposomas, especialmente liposomas que comprenden lipidos catiónicos, o la adsorción a partículas que son incorporadas a la célula por endocitosis. En general, una célula de esta invención es una célula procariótica o eucariótica que comprende una TU, o en la cual se ha introducido una TU. La TU de la presente invención induce la biosintesis intracelular de los antigenos prM/M y E codificados. Una célula adecuada es una que tiene la capacidad para la biosintesis de los productos de gen, como una consecuencia de la introducción del ácido nucleico. En modalidades particulares de la invención, una célula adecuada es una que responde a una secuencia de control y a una secuencia de terminador, si la hay, que puede ser incluida dentro de - la TU. Para responder a este punto, tal célula contiene dentro de ésta, componentes que interactúan con una secuencia de control y con un terminador y actúan para llevar a cabo las funciones de promoción y terminación respectivas. Cuando la célula es cultivada . la— v tro, ésta puede ser un procariote, un eucariote de una sola célula o una célula eucariote multicelular. En modalidades particulares de la presente invención, la célula es una célula mamifera. En estos casos, los productos de gen de proteina prM/M y E sintetizados son disponibles para el uso en aplicaciones analíticas o de diagnóstico, que incluyen la preparación del antigeno para el uso como una vacuna o en ensayos de inmunodiagnóstico, o para propósitos demostrativos . En algunas circunstancias, tales como cuando la célula es una célula mamifera cultivada, los antigenos prM/M y E son secretados en la forma de particulas subvirales. Estos son agregados de las proteínas prM/M y E que se asemejan al virus vivo en la morfología ultraestructural de la superficie y las propiedades inmunogénicas. Puesto que la TU de la invención no incluye el resto del genoma flaviviral, sin embargo, no hay capsid incorporado, y más importantemente, nada de NA viral infeccioso.
En otra modalidad importante de esta invención, la célula es un componente celular natural del sujeto a quién la TU se ha administrado como una vacuna. La TU, cuando es administrada al sujeto, es tomada por las células del sujeto. Las células del sujeto tienen la capacidad para responder a cualquiera de las secuencias de promotor, y terminador, si está presente. En cualquier caso, la TU induce a las células del sujeto a sintetizar los productos de gen prM/M y E flavivirales . Sin desear que sea restringida por las consideraciones teóricas, se cree que las células del sujeto producen partículas subvirales in vivo que consisten de los antigenos prM/M y E, justo como se ha encontrado que surge con las células mamiferas cultivadas in vitro. Tales partículas subvirales, se cree, que sirven como el inmunógeno in vivo, estimulando el sistema inmune del sujeto a generar respuestas inmunológicas que confieren inmunidad protectora sobre el sujeto. Nuevamente, sin desear que sea limitada por la teoría, la inmunidad protectora resultante puede surgir de ya sea la inmunidad humoral o celular, es decir, via cualquier mecanismo restringido MHC de clase II o clase I, respectivamente, o por ambos mecanismos. De acuerdo con la invención, los sujetos son inmunizados contra la infección por los flavivirus, tales como JEV, YFV, virus del dengue, SLEV, WNV u otros flavivirus al administrar a estos una cantidad efectiva de un ácido nucleico que comprende TU que codifica los antigenos prM y/o E. El ácido nucleico, después de que es incorporado en las células del sujeto, conduce a las síntesis de los antigenos prM/M y/o E flavi irales . Para administrar la -TU al sujeto, ésta es incorporada en una composición que comprende un portador farmacéuticamente aceptable. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material que no es biológicamente o de otra manera indeseable, es decir, el material puede ser administrado a un sujeto junto con el material inmunogénico (es decir, los antigenos de proteina de flavi irus recombinantes o porciones de los mismos) sin ocasionar cualquiera de los efectos biológicos indeseables o la interacción de una manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la vacuna en la cual está contenida. Ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables, o componentes de los mismos, incluyen agua, solución salina fisiológica y soluciones reguladoras fisiológicas comunes (para ejemplos adicionales, ver Arnon, R. (Ed) Synthetic Vaccines J: pp. 83-92, CRC Press, Inc., Boca Ratón, Florida, 1987) . Se entiende por aquellos expertos en la técnica que el valor critico en la descripción de una dosis de vacunación es la cantidad total de inmunógeno necesaria para producir una respuesta protectora en un huésped que es sujeto a la enfermedad infecciosa ocasionada por la infección por flavi irus virulento o de tipo silvestre. El número y volumen de dosis utilizadas pueden ser variados y son determinadas por el practicante basado en tales parámetros como, edad, peso, género, especie, tipo de vacuna a ser administrada, modo de administración, co*idición general del~sujeto, etc., asi como otros factores importantes reconocidos por aquellos expertos en la técnica. La TÜ puede ser administrada a un sujeto oralmente, parenteralmente (por ejemplo intravenosamente), por inyección intramuscular, por inyección intraperitoneal, transdér ica-mente, extracorporalmente, intranasalmente, tópicamente o similar. El suministro también puede ser directamente a cualquier área del sistema respiratorio (por ejemplo pulmones) via la entubación. La cantidad exacta de la TU requerida variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, edad, peso y condición ¦ general del sujeto, la inmunogenicidad de la vacuna utilizada, la cepa o especie de flavivirus contra la cual el sujeto está siendo inmunizado, el modo de administración y similares. Asi, no es posible especificar una cantidad exacta para cada modalidad de la presente invención. Sin embargo, una cantidad apropiada puede ser determinada por un experto ordinario en la técnica utilizando la experimentación de rutina solamente, dadas las enseñanzas en la presente, y que está disponible en la técnica. La administración parenter l de la vacuna de la presente invención, si es utilizada, es generalmente caracterizada por inyección. Los materiales inyectables pueden ser preparados en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones liquidas, formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en liquido antes de la inyección, o como emulsiones. Un procedimiento más recientemente revisado para la administración parenteral involucra el uso de un sistema de liberación lenta o de liberación sostenida tal que una dosificación constante es mantenida. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No, 3,610,795, la cual es incorporada por referencia en la presente . Para composiciones sólidas, los portadores sólidos no tóxicos, convencionales, incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sucrosa, carbonato de magnesio y similares. Las composiciones farmacéuticamente administrables, liquidas pueden ser, por ejemplo, preparadas al disolver, dispersar, etc. un compuesto activo como es descrito en la presente y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un excipiente, tal como, por ejemplo agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares, para formar de esta manera una solución o suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica a ser administrada también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes reguladores del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitan, acetato sódico de trietanola ina, oleato de trietanolamina, etc. Métodos actuales de preparación de tales formas de dosificación son conocidos, o serán evidentes, para aquellos expertos en esta técnica; por ejemplo, ver Remington' s Pharmaceutical Sciences (Martin, E. . (ed.), última edición, Mack Publiching Co., Easton, PA) . En una modalidad, la TU de esta invención puede se administrada al sujeto mediante el uso del suministro de gen in vivo mediado por electrotransferencia, en donde inmediatamente después de la administración de la TU al sujeto, se aplican pulsos eléctricos transcutáneos al sujeto, proporcionando mayor eficiencia y reproductibilidad de la transferencia de ácido nucleico in vivo al tejido en el sujeto (Mir y colaboradores, Proc. JVat. Acad. Sci USA 96 : 4262-4267 ( 1999 ) ) . En los métodos de la presente invención que describen la inmunización de un sujeto al administrar una vacuna de esta invención a un sujeto, la eficacia de la inmunización puede ser inspeccionada de acuerdo con los protocolos clinicos bien conocidos en la técnica para inspeccionar el estado inmune de un sujeto. Una cantidad efectiva de una composición de vacunación es fácilmente determinada por aquellos expertos en la técnica, para ser una cantidad que, cuando es administrada a un sujeto, confiere inmunidad protectora al sujeto. Para emprender tal determinación, la persona experta puede estimar la habilidad para inducir anticuerpos específicos de prM/M y E .flavivirales y/o linfocitos T citotóxicos específicos de prM/M y E flavivirales presentes en la sangre de un sujeto a quien la vacuna se ha administrado. También se puede determinar el nivel de inmunidad protectora conferida en un sujeto experimental mediante la estimulación con el flavivirus vivo correspondiente a la composición antigénica utilizada para inmunizar al sujeto experimental. Tales experimentos de estimulación son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. En general, para inmunizar a un sujeto contra la infección por WNV, JEV, YFV, virus del dengue, SLEV, u otros flavivirus de acuerdo con la presente invención, y el reconocimiento de que las TUs empleadas en tales métodos pueden tener diferentes tamaños generales, se pueden utilizar dosis que varían de aproximadamente 0.1 pg/kg de peso del cuerpo a aproximadamente 50 pg/kg de peso del cuerpo. Inesperadamente se ha encontrado que una TU de la presente invención, que es un DNA, confiere inmunidad protectora a un nivel de efectividad de aproximadamente 100% después de la administración de solamente una sola dosis efectiva de la TU por inyección i.m. o por electrotransferencia. Esto está en contraste a muchos métodos de inmunización llevados a cabo utilizando vacunas convencionales (como es descrito anteriormente), que requieren una o más vacunaciones de refuerzo y que no pueden conferir inmunidad protectora a una efectividad cercana al 100%. Además, se ha encontrado inesperadamente que la inmunidad protectora puede ser transmitida de un sujeto hembra vacunado a la descendencia del sujeto. Una proporción significante de ratones neonatales se mostró que es protegida contra la estimulación viral, después de que las madres fueron vacunadas utilizando el D A de TU de la invención. Sin desear que sea limitada por la teoría, se sabe que la inmunidad pasiva puede ser conferida en mamíferos neonatales debido a la presencia en la leche maternal de anticuerpos neutralizantes específicos para varios patógenos. Es posible que la inmunidad protectora contra JEV encontrada dentro de los neonatos sea transmitida a estos de esta manera. En otra modalidad de la invención, la TU codifica una secuencia de señal de una proteina estructural de un primer flavivirus y un antígeno de flavivirus inmunogénico de un segundo flavivirus. Así, en una modalidad, por ejemplo, la secuencia de señal de la proteina estructural de un primer flavivirus es reemplazada por una secuencia de señal de la proteina estructural de un segundo flavivirus, que da por resultado el plegamiento apropiado del polipéptido naciente, el procesamiento apropiado en un huésped y/o el plegamiento apropiado de la proteina procesada. En otra modalidad de la invención, la TU puede codificar un antigeno de flavivirus inmunogénico, en donde el antigeno comprende la secuencia de uno o más de un flavivirus- La secuencia de señal puede ser un péptido de señal mejorada. La mejora de las secuencias de señal, o la selección de secuencias de señal más óptimas, puede ser realizada mediante la aplicación de los principios y las técnicas enseñadas en el Ejemplo 18 y las referencias citadas en el mismo, cada una de las cuales son incorporadas en la presente por referencia para la expresión de las enseñanzas en cada una relacionadas con la selección, identificación y diseño de secuencias de señal con propiedades y funciones deseadas. Generalmente, estas propiedades y funciones deseadas incluirán una alta probabilidad de secuencia de señal. En otra modalidad de la invención, más de una TU o una TU que codifica un antigeno de flavivirus inmunogénico de más de un flavivirus, son incluidas en una sola composición. Asi, en una modalidad, por ejemplo, una TU puede codificar un polipéptido o polipéptidos nacientes que son procesados en proteínas de más de un flavivirus. De preferencia, las proteínas procesadas forman partículas subvirales que producen una respuesta inmunológica contra las proteínas. Las partículas subvirales pueden ser formadas de proteínas procesadas derivadas de la secuencia del mismo flavi irus, una combinación de flavivirus, o proteínas de flavivirus quiméricas. Las vacunas de combinación, que comprenden más de un TU o una TU que codifica un antígeno de flavivirus inmunogénico de más de un flavivirus, pueden ser adaptadas para el uso en regiones geográficas particulares mediante la inclusión de proteínas de flavivirus endémicos a la región o de otra manera probablemente a ser encontrados. Por ejemplo, una vacuna para Asia tropical y subtropical puede incluir TU(s) que codifica proteínas de las vacunas del virus de cuatro serotipos de DEN, WN y JE. De manera similar, vacunas útiles para Africa y América Latina podrían incluir TU(s) que codifican proteínas de los virus de cuatro serotipos de DEN, WN y YF y los virus de cuatro serotipos de DEN, Rocío y YF, respectivamente .- En otra modalidad, la TU codifica una secuencia de señal de una proteína estructural de un primer flavivirus y un antígeno de flavivirus quimérico inmunogénico que incluye la secuencia de aminoácidos de más de un flavivirus. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal del virus de encefalitis japonés. El antigeno de flavivirus quimérico puede incluir la secuencia de un antigeno de virus de encefalitis japonés. En ciertas modalidades, el antigeno quimérico es una proteina E. La porción carboxi terminal de la proteina E puede ser la secuencia de la proteina E del virus de encefalitis japonés. La porción carboxi terminal puede ser,' por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o 75% de la proteina E quimérica. En una modalidad preferida, la TU codifica una secuencia de señal de una proteina estructural del virus de encefalitis japonés, una proteina prM de un virus del dengue y una proteína E quimérica que contiene la secuencia de tanto el virus de encefalitis japonés como el virus del dengue. La proteina quimérica puede ser una proteína E en donde la porción carboxi terminal comprende la secuencia del virus de encefalitis japonés. Ejemplos de TUs incluyen secuencias de ácidos nucleicos mostradas en SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 6 que pueden dirigir la síntesis de los antígenos de flavivirus tales como aquellos mostrados en SEQ ID NO:45 y SEQ ID NO:47. La presente invención además proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden los polipéptidos de esta invención en un portador farmacéuticamente aceptable para el uso con una vacuna de proteína. Los antigenos producidos de las unidades de transcripción de la presente invención se pueden utilizar para producir respuestas inmunes efectivas en un sujeto. Los antigenos para este propósito pueden comprender la proteina prM- de flavi irus, proteina M de flavi irus, proteina E de flavi irus o cualquier combinación de las mismas, incluyéndose fragmentos inmunogénicos de las proteínas. Una modalidad particularmente preferida es el uso del RA descrito en la presente. Una modalidad además preferida es una proteina quimérica que comprende la secuencia de señal de un flavivirus y la(s) proteina (s) estructural (es) de uno o más flavivirus diferentes. En una modalidad particularmente preferida, la secuencia de señal del antigeno es la secuencia de señal del virus de encefalitis japonés. En otras modalidades preferidas, la secuencia de señal es un péptido de señal mejorado. La mejora de las secuencias de señal, o la selección de secuencias de señal más óptimas, puede ser realizada mediante la aplicación de los principios y las técnicas enseñadas en el Ejemplo 18 y las referencias citadas en el mismo, cada una de las cuales son incorporadas en la presente por referencia para la expresión de las enseñanzas en cada una relacionadas con la selección, identificación y diseño de secuencias de señal con propiedades y funciones deseadas. Generalmente, estas propiedades y funciones deseadas incluirán una alta probabilidad de secuencia de señal . En otras modalidades, la vacuna de proteina de esta invención además comprende un adyuvante adecuado. Como se utiliza en la presente,- un "adyuvante" es un potenciador o aumentador de la respuesta inmune. El término "adecuado" se propone para incluir cualquier sustancia que puede ser utilizada en combinación con el inmunógeno de vacuna (es decir, proceina prM de flavivirus, proteina M de flavi irus, protaina E de flavivirus, o cualquier combinación de las mismas) para aumentar la respuesta inmune, sin producir reacciones adversas en el sujeto vacunado. Las cantidades ¦ efectivas de un adyuvante especifico pueden ser fácilmente determinadas para optimizar el efecto de potenciación del adyuvante sobre la respuesta inmune de un sujeto vacunado. En una modalidad preferida, la inclusión de adyuvante de las vacunas de esta invención es un proceso de 2 etapas, utilizando primero una solución de hidróxido de aluminio al 2% y luego un aceite mineral. En modalidades especificas, los adyuvantes adecuados pueden ser seleccionados del siguiente grupo: aceite mineral, vegetal o de pescado con emulsiones de agua, adyuvante de Freund incompleto, J5 de E. coli, sulfato de dextrano, óxido de hierro, alginato de sodio, Bacto- Adjuvant, ciertos polímeros sintéticos tal como Carbopol (BF Foodrich Company, Cleveland, Ohio) , poli-aminoácidos y co- polimeros de aminoácidos, saponina, carragenina, REGRESIN (Vetrepharm, Athens, GA) , AVRIDINE (N, N-dioctadecil-N' , N' - bis (2-hidroxietil)~propanodiamina) , polímeros de mañano ß (1,4) enlazados, polidispersados de cadena larga, interdispersados por grupos O-acetilados (por ejemplo, ACEMANNAN) , extractos de pared celular altamente purificados, desproteinizados, derivados de la sepa no patogénica de la especie Mycobacterium (por ejemplo EQUIMUNE, Vetrepharm Research Inc., Athens GA) , monooleato de Manita, aceite de parafina y dipeptidc de muramilo. En otro aspecto, esta invención proporciona un método para inmunizar sujetos con cantidades inmunogénicas de la vacuna de proteina de la invención para producir una respuesta inmune efectiva en el sujeto. La inmunización puede ser llevada a cabo oralmente, parenteralmente, intranasalmente, intratraquealmente, intramuscularmente, intramamariamente, subcutáneamente, intravenosamente y/o intradérmicamente. La vacuna que contiene la proteina prM de flavivirus, proteina M de flavivirus y/o la proteina E de flavivirus puede ser administrada por inyección, por inhalación, por ingestión, o por infusión. Una sola dosis puede ser dada y/o dosis repetidas de las preparaciones de vacuna, es decir, "refuerzos", pueden ser administradas en intervalos de tiempo periódicos para aumentar la respuesta inmune inicial o después de un periodo largo de tiempo desde la última dosis. El intervalo de tiempo entre las vacunaciones puede variar, dependiendo de la edad y la condición del sujeto.
El término "cantidad inmunogénica" significa vina cantidad de un inmunógeno, o una porción de la misma, que es suficiente para inducir una respuesta inmune en un sujeto vacunado y que protege al sujeto contra la enfermedad ocasionada por las infecciones de flavi irus de tipo silvestre o virulento en la exposición al mismo, o que tiene un efecto terapéutico^ o co ercialmente beneficioso que disminuye el efecto de la infección por fiavivirus sobre el sujeto vacunado. La invención además proporciona un anticuerpo producido en respuesta a la inmunización por el antigeno de esta invención. Los anticuerpos de la presente invención pueden incluir anticuerpos policlonales y monoclonales que pueden ser moléculas de inmonoglobulina intactas, moléculas de inmonoglobulina quiméricas, "anticuerpos humanizados" o fragmentos Fab o F(ab')2- Tales anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pueden ser producidos por técnicas bien conocidas en la técnica que incluyen aquellas descritas en Harlow y Lañe (Antibodies: A Laboratory Manual. Coild Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Y, 1989) y Kohler y colaboradores (Jfeuure 256:495-97, 1975) y las patentes norteamericanas Nos. 5,545,806, 5,569,825 y 5, 625, 126, incorporadas en la presente por referencia. Los anticuerpos pueden ser. de cualquier isotipo IgG, igA, IgD, IgE e IgM. La presente invención también puede incluir anticuerpos de una sola cadena (ScFv) , que comprende dominios H y VL enlazados y que retienen la conformación y la actividad de enlace especifica del idiotipo nativo del anticuerpo. Tales anticuerpos de una sola cadena son bien conocidos en la técnica y pueden ser producidos por métodos estándares (ver, por ejemplo, Alvarez y colaboradoras, Hum. Gene. Thex. 8:229-242 (1997)) . Los anticuerpos pueden ser producidos contra los antigenos de esta invención, que son sintetizados de secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos inmunogénicas de los antigenos prM, M y/o E de uno o más flavivirus y la secuencia de señal de un flavivirus diferente (por ejemplo, JEV) . Los péptidos inmunogénicos sintetizados del uso de estas construcciones quiméricas fácilmente pueden ser identificados mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica para identificar regiones inmunogénicas en una secuencia de aminoácidos y utilizados para producir los anticuerpos de esta invención. Las condiciones mediante las cuales puede formarse un complejo de antigeno/anticuerpo, asi como los ensayos para la detección de la formación de un complejo de antigeno/anticuerpo y la cuantificación de la proteina detectada, son estándares en la técnica. Tales ensayos pueden incluir, pero no están limitados a, manchado de Western, inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, inmunocitoquimica, inmunohistoquimica, clasificación de células activada por fluorescencia (FACS), hibridización in situ por fluorescencia (FISH), ensayos inmunomagnéticos, ELISA, ELISPOT (Coligan y colaboradores, eds. 1995. Current Protocols in Immunology. Wiley, New York) , ensayos de aglutinación, ensayos de floculación, lavado de células, etc., como son bien conocidos para la persona experta. Como se utiliza en la presente, el término "enlazado" significa el enlace bien caracterizado del anticuerpo al antigeno así como otra asociación no aleatoria de un antígeno. "Específicamente enlazado" como se utiliza en la presente describe un anticuerpo u otro ligando que no reacciona cruzadamente de manera sustancial con cualquier antígeno diferente a uno especificado, que en este caso, es un antígeno de esta invención. El anticuerpo o ligando de esta invención puede ser enlazado a un sustrato, (por ejemplo, cuentas, tubos, platinas, placas, hojas de nitrocelulosa, etc.) o conjugado con una porción detectable o tanto enlazado como conjugado. Las porciones detectables contempladas para la presente invención puede incluir, pero no están limitadas a, una porción inmunofluorescente (por ejemplo, fluoresceína, rodamina), una porción radioactiva (por ejemplo, 3ZP, 125I, S), una porción de enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina) , una porción de oro coloidal y una porción de biotina. Tales técnicas de conjugación son estándares en la técnica (por ejemplo Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); Yang y colaboradores Nature 382:319-324 (1996)). •La presente invención además proporciona un método para detectar el anticuerpo de flavivirus en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con el antigeno de flavivirus de la presente invención, bajo condiciones mediante las cuales puede formarse un complejo de antigeno/anticuerpo; y detectar la formación del complejo, para de esta manera detectar el anticuerpo de flavivirus en la muestra. La presente invención además proporciona un método para detectar el antigenó de flavivirus en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo de esta invención bajo condiciones mediante las cuales puede formarse un complejo de antigeno/anticuerpo; y detectar la formación del complejo, para de esta manera detectar el antigeno de flavivirus en la muestra. El método para detectar el antigeno de flavivirus en una muestra puede ser realizado, por ejemplo, al poner en contacto una muestra de fluido o de tejido de un sujeto con un anticuerpo de esta invención y al detectar el enlace del anticuerpo al antigeno. Se contempla que el antigeno estará sobre un virión de flavivirus intacto, será una proteina codificada por flavivirus mostrada sobre la superficie de una célula infectada por flavivirus que expresa el antigeno, o será un fragmento del antígeno. Una muestra de fluido de este método puede comprender cualquier fluido biológico que podria contener el antigeno o una célula que contiene el antigeno, tal como fluido cerebroespinal, sangre, bilis, plasma, suero, saliva y orina. Otros ejemplos posibles de fluidos corporales incluyen esputo, moco y similares. El método para detectar el anticuerpo de flavivirus en una muestra puede ser realizado, por ejemplo, al poner en contacto una muestra de fluido o tejido de un sujeto con un antigeno de esta invención y al detectar el enlace del antigeno al anticuerpo. Una muestra de fluido de este método puede comprender cualquier fluido biológico que podria contener el anticuerpo, tal como fluido cerebroespinal, sangre, bilis, plasma, suero, saliva y orina. Otros ejemplos posibles de fluidos corporales incluyen esputo, moco y similares . Los inmunoensa os de enzima tales como los ensayos de inmunofluorescencia (IFA), ensayos inmunosorbentes enlazados de enzima (ELISA) y el inmunomanchado pueden ser fácilmente adaptados para realizar la detección de los anticuerpos de flavivirus de acuerdo con los métodos de esta invención. Un método de ELISA efectivo para la detección de los anticuerpos, por ejemplo puede ser como sigue: (1) enlazar el antigeno a un sustrato; (2) poner en contacto el antigeno- enlazado con una muestra de fluido o tejido que contiene el anticuerpo; (3) poner en contacto lo anterior con un anticuerpo secundario enlazado a una porción detectable que reactiva con el anticuerpo enlajado (por ejemplo, enzima de peroxidasa de rábano picante o enzima de fosfatasa alcalina); (4) poner en contacto lo anterior con el sustrato para la enzima; (5) poner en contacto lo anterior con un reactivo de color y (6) observar/medir el cambio o desarrollo de colo . Otra técnica inmunológica que puede ser útil en la detección de anticuerpos de. flavivirus, utiliza anticuerpos monoclonales (Mabs) para la detección de anticuerpos específicamente reactivos con antigenos de flavivirus en un ensayo de inhibición competitivo. Brevemente, la muestra se pone en contacto con antigeno de esta invención que es enlazado a un sustrato (por ejemplo, una placa de 96 cavidades de ELISA) . La muestra en exceso es completamente quitada lavando. Un anticuerpo monoclonal marcado (por ejemplo, enlazado con enzima, fluorescente, radioactivo, etc.), luego se pone en contacto con cualquiera de los complejos" de antigeno-anticuerpo previamente formados y la cantidad de enlace de anticuerpos monoclonales es medida. La cantidad de inhibición del enlace de anticuerpo monoclonal es medida con relación a un control (sin anticuerpo) que permite la detección y la medición del anticuerpo en la muestra . El grado de inhibición de anticuerpo monoclonal puede ser un ensayo muy especifico para detectar una variedad o cepa de flavi irus particular, cuanto es basado sobre la especificidad de enlace de anticuerpo monoclonal para una variedad o cepa particular de flavivirus. Los Mabs también pueden ser utilizados para dirigir la detección de los antigenos de flavi irus en células, por ejemplo, por ensayo de inmunofluorescencia (IFA) de acuerdo con los métodos estándares. Como un ejemplo adicional, una prueba de microaglutinación se puede utilizar para evitar la presencia de anticuerpos de flav virus en una muestra. Brevemente, cuentas de látex, glóbulos rojos de la sangre u otras particulas aglutinables son recubiertas con el antigeno de esta invención y mezcladas con una muestra, de tal manera que los anticuerpos de la muestra que son específicamente reactivos en el antigeno se reticulan con el antigeno, ocasionando aglutinación. Los complejos de antigeno-anticuerpo aglutinados forman un precipitado, visible a simple vista o medible por el espectrofotómetro. En una modificación de la prueba anterior, los anticuerpos de esta invención pueden ser enlazados a las particulas aglutinables y el antigeno en la muestra de esta manera es detectado.
La presente invención además proporciona un método para diagnosticar una infección por flavivirus en un sujeto, que comprende poner en contacto una muestra del sujeto con el antigeno de esta invención bajo condiciones mediante las cuales puede formarse un complejo de antigeno/anticuerpo; y detectar la formación del complejo de antigeno/anticuerpo, para de esta manera diagnosticar una infección por flavivirus en un sujeto. La presente invención además proporciona un método para diagnosticar una infección por flavivirus en un sujeto, que comprende poner en contacto una muestra del sujeto con el anticuerpo de esta invención bajo condiciones mediante las cuales puede formarse un complejo de antigeno/anticuerpo; y detectar la formación del complejo de antigeno/anticuerpo, para de esta manera diagnosticar una infección por flavivirus en un sujeto. En los métodos de diagnóstico enseñados en la presente, el antigeno de esta invención puede ser enlazado a un sustrato y puesto en contacto con una muestra de fluido tal como sangre, suero, orina o saliva. Esta muestra puede ser tomada directamente del paciente o en una forma parcialmente purificada. De esta manera, los anticuerpos específicos para el antigeno (el anticuerpo primario) específicamente reaccionarán con el antigeno enlazado. Después, un anticuerpo secundario enlazado a, o marcado con, una porción detectable puede ser adicionado para aumentar la detección del anticuerpo. primario. Generalmente, el anticuerpo secundario u otro ligando, que es reactivo, ya sea específicamente con un diferente epítope del antígeno o no específicamente con el ligando o anticuerpo reaccionado, será seleccionado por su habilidad para reaccionar con múltiples - sitios sobre el anticuerpo primario. Así, por ejemplo, varias moléculas del anticuerpo secundario pueden reaccionar con cada anticuerpo primario, haciendo más detectable el anticuerpo primario. La porción detectable permite la detección visual de un precipitado o un cambio de color, la detección visual por microscopía, o la detección automatizada por espectrometría, medición radiométrica o similar. Ejemplos de porciones detectables incluyen fluoresceína y rodamina (para la microscopía por fluorescencia) , peroxidasa de rábano picante (para ya sea la microscopía de luz o electrónica y la detección bioquímica) biotina- estreptavidina (para la microscopía de luz o electrónica) y fosfatasa alcalina (para la detección bioquímica por cambio de color) . Modalidades particulares de la presente invención son expuestas en los ejemplos que siguen. Estos ejemplos no se proponen para limitar el alcance de la invención como es descrita en esta especificación.
Ejemplos Métodos generales utilizando técnicas de biología molecular y técnicas de DNA recombinante, relacionados con la preparación y la expresión de las moléculas de TU de ácido nucleico de la invención son expuestos en, por ejemplo, Current Protocola- in Molecular Biology, Ausubel y colaboradores, John Wiley and Sons, New York 1987 (actualizado trimestralmente), y Molecular Cloning : A Laboratory Manuel 2nd'Ed., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Ejemplo 1. Preparación de plásmidos recombinantes que contienen la unidad de transcripción que codifica los antigenos prM y E de JEV. RNA genómico se extrajo de 150 de la semilla de virus JEV cepa SA 14 cultivada del cerebro de ratón utilizando un kit QlAam ^ Viral RNA (Qiagen, Santa Clarita, CA) . RNA, adsorbido sobre una membrana de sílice, se eluyó en 80 ^L de agua libre de nucleasa, y se utilizó como un patrón para la amplificación de las secuencias de codificación del gen prM y E de JEV. Secuencias cebadoras se obtuvieron del trabajo de Nitayaphan y colaboradores {Virology 177:541-553 (1990)). Un solo fragmento de cDNA que contiene la región de nucleótidos genómica 389-2478 se amplificó por la reacción de cadena de polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR) . Los sitios de restricción Kpnl y Xbal, la secuencia de enlace ribosomal Kozak consensual y el sitio de iniciación de traducción se diseñaron en el 5' terminal del cDNA mediante el amplimero 14DV389 {secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:l; secuencia de aminoácidos, SEQ ID N0:2) . Un codón de terminación de traducción en la estructura, seguido por un sitio de restricción Notl, se introdujo en el 3' terminal del cDNA por el amplimero cl4DV2453 (SEQ ID NO:3) (Figura 2). La RT-PCR en un tubo se realizó utilizando un kit Titán RT-PCR (Boehringer annheim, Indianapolis, IN) - 10 µ?? de RNA. viral se mezcló con 1 µ? cada .uno de 14DV389 (50 µ?) y C14DV2453 (50 µ?) y 18 µ?, de agua libre de nucleasa y la mezcla se calentó a 85°C durante 5 min y luego se enfrió a 4°C. 75 ¡íL de la mezcla de reacción [20 µ?· de solución reguladora 5x, 2 µ?· de mezcla de dNTP (10 mM cada uno), 5 íiL de ditiotreitol (0.1 mM) , 0.5 pL de Rnasin" (40 ?/µ?,, Boehringer Mannheim), 2 µ?, de mezcla de polimerasa y 45.5 µ?, de agua libre de nucleasa] s adicionó y la RT-PCR se realizó como sigue: 1 ciclo (50°C durante 30 min, 94°C durante 3 minutos, 50°C durante 30 s, 68°C durante 2.5 min), 9 ciclos (94eC durante 30 s, 50eC durante 30 s, 68°C durante 2.5 min), 20 ciclos (94°C durante 30 s, 50°C durante 30 s, 68 °C durante 2.5 min en el primer ciclo, con un incremento de 5 s por ciclo después) y una extensión final a 68 °C durante 15 mins. El producto de RT-PCR se purificó mediante un kit QlAquick** PCR Purification (Qiagen) y se eluyó con 50 µ? de Tris-HCl 1 mM, pH 7.5.
Todas las construcciones de vector y los análisis se llevaron a cabo al utilizar técnicas estándares (Sambrook y colaboradores, - 1989) . El cDNA amplificado por RT-PCR, digerido con las nucleasas Kpnl y Noti, se insertó en el sitio Kpnl-Notl del vector de plásmido de expresión eucariótica (pCDNA3, Invitrogen, Carlsbad, CA) . Lr.s células con XLl-Blue de Escherichia colí competentes por electroporación (Stratagene, La Jolla, CA) se transformaron por electroporación (Gene Pulser1^, Bio-Rad, Hercules, CA) y se colocaron sobre placas de agar LB que contienen 100 g/mL de carbenicilina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) . Los clones se recolectaron y se inocularon en 3 mL de caldo LB que contiene 100 g/mL de carbenicilina. El DNA de plásmido se extrajo de un cultivo de 14 h utilizando un Kit QIAprepm Spin Miniprep (Qiagen) . La secuenciación de DNA automatizada se realizó como es recomendado (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Forter City, CA) . Ambas hebras del cDNA se secuenciaron y se mostraron que son idénticas para la secuencia para la cepa SA14 original (Nitayaphan y colaboradores, 1990) . El fragmento del plásmido pCDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) del nucleótido (nt) 1289 a nt 3455, que contiene fl ori, SV40 ori, el gen de resistencia a neomicina, y los elementos SV40 poli (A) se suprimió mediante la digestión con PvuII y luego se ligó para generar el plásmido pCBamp. El vector pCIBamp, que contiene un inserción de intrón quimérica en el sitio Ncol/Kpnl del pCBamp se construyó al extirpar la secuencia de intrón de pCI (Promega, Madison, WI) mediante la digestión con Ncol y Kpnl. El fragmento de 566-bp resultante se clonó en pCBamp mediante la digestión con Ncol-Kpnl para reemplazar su fragmento de 289-bp. La Figura 3 representa las relaciones entre los plásmidos pCDA3, pCBamp y pCIBamp. Los plásmidos que contienen la unidad de transcripción que codifica las proteinas prM y E de JEV se prepararon a partir de estos plásmidos. El fragmento de cDNa que contiene las regiones de codificación prM y E de JEV en el plásmido recombinante pCDJE2-7 (secuencia de nucleótidos, SEQ ID NO:10; secuencia de aminoácidos SEQ ID N0:11), derivado del vector pCD A3, se extirpó mediante la digestión con Notl y Kpnl o Xbal y se clonó en el sitio Kpnl-Notl de pCBamp, PCIBamp, pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) , o pREP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) , o en el sitio Spel-Notl del vector de expresión pRc/RSV (Invitrogen, Carlsbad, CA) para crear pCBJES14 (secuencia de nucleótidos, SEQ ID NO: 17; secuencia de aminoácidos, SEQ ID N0:18), pCIBJES14, pCEJE, pREFE, y pRCJE, respectivamente. Ambas hebras del cDNA de los clones de cada plásmido se secuenciaron y los clones recombinantes con la secuencia de nucleótidos correcta se identificaron. El DNA de plásmido para uso en la transformación in vitro de células mamiferas o los experimentos de inmunización de ratón, se purificó mediante la cromatografía de intercambio aniónico utilizando un Kit EndoFreeMR Plasmid Maxi Qiagen) . Ejemplo 2. Evaluación de las proteínas prM y E de JEV expresadas por varios plásmidos recombinantes utilizando un ensayo de anticuerpo inmunofluorescente indirecto. La expresión de los productos de gen específicos de JEV por los diversos plásmidos de expresión recombinantes se evaluó en líneas de células transientemente transfectadas de COS-1, COS-7 y SV-T2 (ATCC, Rockville MD; 1650-CRL, 1651-CRL y 163.1-CCL, respectivamente) por el ensayo de anticuerpo inmunofluorescente indirecto (IFA) . La línea de células SV-T2 se excluyó de la prueba adicional puesto que un resultado preliminar mostró que solamente 1-2% de las células SV-T2 transformadas fueron positivas al antígeno de JEV. Para la transformación, las células fueron cultivadas a 75% de confluencia en los matraces de cultivo de 150 cm2, tripsinizadas y resuspendidas a 4°C en solución salina regulada con fosfato (PBS) a una cuenta de células finales de 5 x 106 por mL. 10 µ? de D A de plásmido se electroporó en 300 µL de suspensión de células utilizando un BioRad Gene Pulse™ (Bio-Rad) ajustado a 150 V, 960 µ? y resistencia de 100 O. Cinco minutos después de la electroporación, las células se diluyeron con 25 mL de medio fresco y se sembraron en un matraz de 75 cm2. 48 h después de la transformación, el medio se retiró de las células y las células se tripsinizaron y resuspendieron en" 5 mL de PBS con suero de cabra normal al 3%. Alícuotas de 10 ji se mancharon sobre platinas, se secaron con aire y se fijaron con acetona a -20 °C durante 20 minutos. El IFA se realizó con células transformadas con plásmido, fijadas con acetona, utilizando inmunoglobulina G antiratón de cabra conjugada con isotiocianato de fluoresceina (Sigma Chemical Co.) y HIAF de JEV. Para determinar la influencia de varios promotores y elementos de poli (A) sobre la expresión de la proteina prM y E de JEV, lineas de células COS-1 y COS-7 se transformaron transientemente mediante una cantidad igual de DNA de plásmido pCDJE2-7 (SEQ ID NO:10), pCEJE, pREJE, o pRCJE. Antigenos de JEV se expresaron en ambas lineas de células transformadas por todos los cuatro plásmidos reco binantes, confirmando de esta manera que el promotor CMV o RSV (virus de sarcoma rous) y los elementos BGH o SV40 poli (A) fueron funcionalmente activos. Sin embargo, el porcentaje de células transformadas y el nivel de antigenos de JEV expresados, como es determinado por el número de células positivas de IFA y la intensidad de IFA, respectivamente, difirieron grandemente entre los diversos plásmidos (Tabla 1) . Un porcentaje significativamente alto de células COS-1 transformadas por pCDJE2-7 (SEQ ID NO:10), pCBJEl-14 (SEQ ID NO:17) y pCIBJESl4 expresaron los antigenos de JEV, y el nivel de las proteínas expresadas fue compatible con las células infectadas por JEV. Las células transfectadas con los vectores pCEJE, pREJE, o pRCJE, por otra parte, tuvieron un alto porcentaje de células que expresan antígeno, así como baja intensidad de fluorescencia, indicando débil expresión de los antígenos. Para averiguar si la expresión aumentada de las proteínas de JEV por pCDJE2-7 (SEQ ID NO: 10) fue influenciada por el origen de replicación eucariótico codificado por SV40, se construyó el plásmido pCBJEl-14 (SEQ ID NO: 17) de modo que se suprimió un fragmento de 2166-bp, que contiene fl ori, SV40 ori, el gen de resistencia a neomicina y los elementos poli (a) SV40 del pCDJE2-7. Un intrón quimérico luego se insertó en pCBJEl-14 para generar pCIBJESl4. El plásmido pClBJES14 se utilizó para determinar si la expresión de las proteínas de JEV podría ser aumentada por la secuencia del intrón. Después de la transformación, las células que albergan ambos de los vectores pCBJEl-14 y PCIBJES14 expresaron un nivel de antígenos de JEV similar a aquel observado con pCDJE2-7 (Tabla 1) . Este resultado indica que la expresión de los antígenos prM y E de JEV por los vectores reco binantes es influenciada solamente por los elementos reguladores de transcripción. Ni el origen de replicación eucariótico ni la secuencia de intrón aumentaron la expresión del antígeno de JEV en las células utilizadas. Los vectores que contienen el promotor CMV y BGH poli (A) (Figura 3) fueron seleccionados para el análisis adicional. Ejemplo 3. Selección de una línea de células estable, transformada in vatro que expresa constitutivamente productos de gen específicos de JEV. Las células COS-1 se transformaron con 10 pg de DNA de pCDJE2-7 por electroporación, como es descrito en el ejemplo previo. Después de una incubación de 24 hr en medio de cultivo no selectivo, las células se trataron con neomicina (0.5 mg/niL, Sigma Chemical Co.). Las colonias resistentes a neomicina, que pueden ser visibles después de 2-3 semanas, se clonaron mediante la dilución limitada en medio que contiene neomicina. La expresión de los productos de gen de JEV codificados por el vector se clasificó inicialmente por IFA utilizando HIAF de JEV. Un clon positivo de JEV-IFA (JE-4B) y un clon negativo (JE-5A) se seleccionaron para el análisis adicional y se mantuvieron en el medio que contiene 200 g plL de neomicina. La autenticidad de la proteína E de JEV expresada por el clon JE-4B se demostró mediante el mapeo del epítope por IFA utilizando un panel de anticuerpos monoclonales (Mab) de murino específicos de E de JEV (Kimura-Kuroda y colaboradores, J. Virol 45:124-132 (1983); Kimura-Kuroda y colaboradores, J. Gen. Virol, 67:2663-2672 (1986); Zhang y colaboradores, J. Med. Virol. 29:133-138 (1989); y Roehrig y colaboradores, Virol 128:118-126 (1983)). El HIAF de JEV y el suero de ratón normal se utilizaron como controles de anticuerpo positivos y negativos, respectivamente. Cuatro Mabs específicos de JEV, específicos del subgrupo de seis flavivirus y reactivos con el grupo de dos flavivirus reaccionaron similarmente con el clon 4B de las células COS-1 infectadas con JEV (Tabla 2) . Ejemplo 4. Propiedades antigénicas y detección inmunológica de partículas subvirales secretadas por la linea de células COS-1 con JE-4B. a. Preparación de partículas subvirales. Las células COS-1 con JE-4B se cultivaron y se mantuvieron en el medio que contiene 200 pg/mL .de neomicina. El medio cultivado se cosechó rutinariamente y se almacenó a 4°C, y se renovó dos veces cada semana y las células se dividieron en 1:5 cada 7-10 días. El medio de cultivo se clarificó por centrifugación a 10,000 rpm durante 30 minutos en un rotor Sorvall F16/250 a 4°C, y se centrifugaron adicionalmente durante 4 hr a 39,000 rpm en un rotor sorvall TH641 a 4°C a través de una almohadilla de sucrosa al 5% (p/p, preparada con Tris HC1 10 mM, pH 7.5, NaCl 100 mM (solución reguladora de TN) ) . La pelotilla que contiene partículas subvirales se resuspendió en solución reguladora de TN y se almacenó a 4°C. Alternativamente, se adicionó PEG-8000 al 7% o 10% (p/v) al medio de cultivo clarificado. La mezcla se agitó a 4°C durante al menos 2 hr, y las partículas precipitadas se recolectaron por centrifugación a 10,000 rpm durante 30 minutos . El precipitado se resuspendió en solución reguladora de TN y se almacenó e 4°C. Las partículas subvirales se purificaron de ambas preparaciones precipitadas con PEG y foriucídas en pelotilla por la centrifugación zonal de proporción en un gradiente de sucrosa continuo de 5-25% en TN a 38,000 rpm a 4°C durante 90 minutos. Fracciones de 1-mL se recolectaron de la parte superior del gradiente, se probaron por ELISA de captura de antigeno (ver enseguida) y las fracciones positivas se cargaron en un gradiente de sucrosa al 25-50% en TN. Esto se centrifugó durante la noche en una centrifugación de densidad de equilibrio a 35,000 rpm a 4°C. Fracciones de 0.9-mL de los gradientes de equilibrio se recolectaron del fondo. Ellas se probaron por la ELISA de captura de antígeno y se estimaron para la actividad de aglutinación (HA) a pH 6.6. Una alícuota de 100 µ? de cada fracción se pesó precisamente para determinar su densidad. Las fracciones positivas de ELISA se acumularon y se formaron en pelotillas de 39,000 rpm a 4o durante 3-4 hr y la pelotilla se resuspendió en solución reguladora de TN. ELISA de captura de antigeno y títulos de HA se determinaron sobre las muestras formadas en pelotilla. El sobrenadante de células COS-1 infectadas con JEV también se sometió a protocolos de purificación similares, como es detallado anteriormente y se utilizó como un control positivo para el análisis de gradiente. Los viriones de JE también se purificaron de células C6/36 infectadas 5-6 dias después de la infección por sedimentación en un gradiente de equilibrio de glicerol/tartrato. b. Manchados de Western de- partículas subvirales. Muestras purificadas en gradiente de las partículas subvirales se mezclaron con la solución reguladora de la muestra de electroforesis y se corrieron en geles de poliacrilamida que contienen dodecil sulfato de sodio al 10 o 12.5% (SDS-PAGE) como es descrito por Laemmli {Nature 277:680-685 (1970)). Las proteínas se transíifieron a una membrana de nitrocelulosa y se detectaron inmunoquimicamente con HIAF de JEV policlonal, E-Mab 4G2 anti-E reactivo cruzadamente de flavivirus (Henchal y colaboradores, üzner. J. Trop. Med. Hyg. 31:830-836 (1982)), o suero hiperinraune de péptido anti-prM de ratón (JM01) . La Figura 4 muestra una comparación de las proteinas M y E producidas por las células COS-1 con JE-4B y C6/36 infectadas con JEV. Algo de reactividad no especifica para la proteina E se observó en el fluido ascitico de ratón normal y el suero antipéptido Jmol. Las proteínas idénticas en tamaño a M y E se secretaron en las partículas subvirales y podrían ser detectadas por el Mab 4G2 especifico de E y el antisuero JM01 especifico de prM, respectivamente. c. Detección por gradiente de densidad de partículas subvirales de JEV en el medio de cultivo. Para ELISA, el anticuerpo de captura de antigeno (4G2) se diluyó en solución reguladora de carbonato de sodio 0.1 M, pH 9.6, y se utilizó para recubrir placas microtitulo de 96 cavidades (I mulon II, Dynatech. Chantilly, VA) mediante la incubación durante la noche a 4°C. Después del bloqueo con suero de cabra normal al 3% en PBS, muestras diluidas en serie dos veces se adicionaron a la placa recubierta con 4G2 y se incubaron 1.5 horas a 37 °C. El antigeno capturado se detectó mediante el 6B6C-1 Mag conjugado con peroxidasa de rábano picante y se incubó durante 1 hora a 37 °C. La actividad enzimática sobre la fase sólida luego se detectó con T B (3,3' ,5,5' -tetrametilbencidina) -ELISA (Life Techlologies, Grand Island, NY) . Aproximadamente 500 mL del medio de cultivo de células de 15 X matraces de 150 ' cm2 de células JE-4B se recolectaron cuatro dias después de que las células se sembraron. Las particulas subvirales precipitadas con PEG se resuspendxeron en 2 mL de solución reguladora de TN, pH 7.5; una alícuota de 0.7 mL de esta pelotilla resuspendida se cargó sobre un gradiente de sucrosa al 5-25%. Tritón x-100, que rompe las particulas subvirales, se adicionó a otra alícuota de 0.7 mL a una concentración final del 0.1% y esto se cargó en un gradiente de sucrosa al 5-25% preparado en solución reguladora de TN que contiene Tritón X-100 al 0.1%. Una banda opaca definida se observó aproximadamente 2.5 cm desde la parte de -arriba del gradiente que contiene Tritón X-100, pero no en el gradiente sin detergente. Fracciones (1 mli) se recolectaron de la parte superior al fondo para cada gradiente (Figura 5) . Cada fracción recolectada se analizó mediante ELISA de captura de antigeno. El antigeno se detectó en las fracciones 4-6, indicando una característica de sedimentación relativamente rápida de las partículas subvirales. El tratamiento de precipitado con PEG del medio de cultivo JE-4B con Tritón X-100 desplazó la posición del material reactivo con ELISA a la parte superior del gradiente. Así el tratamiento con Tritón X-100 produce sólo moléculas de lenta sedimentación. Un descubrimiento similar fue reportado por Konishi y colaboradores (Virol. 188:714-720 (1992)). Estos resultados muestran que las partículas subvirales que sedimentan rápidamente, que contienen prM/M y E, podrían ser rotas por el tratamiento con detergente. La actividad de hemaglutinación (HA) se determinó en el rango de pH de 6.1 a 7.0 por el método de Clarke y Casáis (Aner. J. Trop. Med. Hyg. 7:561-573 (1958)). La partícula subviral secretada por las células JE-4B y la partícula viriónica producida por las células COS-1 infectadas con JEV tuvo un perfil de HA similar con el pH óptimo determinado que es de 6.6.
Ejemplo 5. Comparación de la respuesta inmune en ratones vacunados con vacuna de ácido nucleico de pCDJE2-7 de la invención y la vacuna de JEV comercial. Grupos de cinco ratones exogámicos ICR, hembras de 3 semanas se inyectaron intramuscularmente en los cuadriceps izquierdo y derecho con 100 g de plásmido pCDJE2-7 en 100 µ?. de <3¾0 o se les dieron dosis de JE-VAX (fabricado por la Research Foundation f r Microbial Disease of Osaka University y distribuido por Connaught Laboratories, Switfwater, PA. ) subcutáneamente que son un quinto de la dosis dada a humanos. El plásmido pCDNA3/CAT (Invitrogen) , que codifica y expresa una proteina no relacionada, se utilizó como el control de vacunación negativo. Excepto para un grupo de ratones vacunados con pCDJE2-7, todos los animales se reforzaron 3 semanas después con una dosis adicional de plásmido o JE-VAX. Los ratones se sangraron desde el seno retroorbital en 3, 6, 9, 23, 40 y 60 semanas después de la inoculación. Los titulos de anticuerpo de JEV se determinaron mediante el ensayo inmunosorbente enlazado de enzima (ELISA) contra JEV purificado o mediante las pruebas de neutralización de reducción en placa (PRNT) (Roehrig y colaboradores, Virol 171:49-60 (1989); y Hunt y Calisher, Amer. J. Txop. Med. Hyg. 28:740-749 (1979)). La vacuna de ácido nucleico pCDJE2-7 y JE-VAX proporcionaron 100% de seroconversión dentro de tres semanas después de la primera vacunación en todos los tres grupos de ratones (Tabla 3). El ELISA de «JEV y los títulos de anticuerpo de PRNT alcanzaron el nivel más alto en las semana 6 y la semana 9, respectivamente, después de la inmunización. Los ratones que reciben una dosis de vacuna de DNA tuvieron respuestas de anticuerpos similares como aquellos que reciben doo dosis. Los títulos de anticuerpo de ELISA comparables se mantuvieron en grupos vacunados con DNA hasta 60 semanas, después de lo cual se terminó el experimento. Sin embargo, sólo uno de cuatro ratones en el grupo JE-YAX fue positivo de anticuerpo JEV en 60 semanas después de la inoculación. El grupo de control pCDNA3/CAT no tuvo algún anticuerpo de JEV medible. Estos resultados demuestran que una sola dosis de vacuna de ácido nucleico específico de JEV es más efectiva en mantener el anticuerpo de JEV en los ratones que la vacuna JE-VAX aprobada por la FDA, comercial. Ejemplo 6. Comparación de varias construcciones de vacuna de ácido nucleico de la invención y la vacuna de JEV comercial para la efectividad de vacunación en diferentes edades. Un nivel similar de proteína de JEV fue expresado por las células COS-1 transformadas por ya sea pCDJE2-7, pCBJEl-14 o pCIBJES14. La inducción del anticuerpo de JEV por estas construcciones de ácido nucleico fue comparada con la vacuna comercial JE-VAX en dos edades diferentes en la vacunación. Ratones exogámicos ICR de 3 días (sexo mezclado) o de 3 semanas (hembra), 10 por grupo, se vacunaron intramuscularmente con 50 o 100 de DNA de plásmido, o subcutáneamente con dosis de JE-VAX que son un décimo o un quinto de la dosis dada a humanos. Muestras de suero se recolectaron en 3 y 7 semanas después de la inmunización y se probaron a una dilución de 1:1600 por ELISA utilizando JEV purificado como un antigeno. Los resultados son mostrados en la Tabla 4. El plásmido pCBJEl-14 proporcionó el grado más alto de seroconversión, es decir, el titulo de anticuerpo mayor que 1:1600, obteniendo 80-100% en ambas edades de vacunación. La administración de pCDJE2-7 o pCIBJESl4 proporcionó la seroconversión moderada por 7 semanas cuando ratones de 3 dias de edad se vacunaron (60% para cada uno) pero seroconversión más débil (40% y 10%, respectivamente) cuando es medida 3 semanas después de la vacunación. Cuando estos plásmidos se administraron en la edad de 3 semanas, sin embargo, las seroconversiones de 90% o 100% se alcanzaron en tanto 3 semanas y 7 semanas después de la vacunación. En contraste, la vacuna comercial, JE-VAX, no confirió seroconversión cuando se administró en 3 dias de edad, y 100% cuando se dió en 3 semanas de edad. Asi, las TU' s de ácido nucleico para prM y E de JEV proporcionaron un grado de seroconversión mejor que una dosis muy alta de la vacuna comercial, e inesperadamente alta seroconversión en animales tanto jóvenes como más maduros. »5 Ejemplo 7. Inmunidad protectora conferida por la vacuna de ácido nucleico de la invención. Grupos vacunados de tres dias de edad del Ejemplo 6 se estimularon 7 semanas después de la vacunación por la inyección intraperitoneal de 50,000 pfu/100 L de la cepa SA14 de JEV adaptada de ratón y se observaron durante 3 semanas. 1C0% de protección se obtuvo en grupos que recibieron varias construcciones de vacuna que contiene TU de ácido nucleico por hasta 21 dias (Tabla 5) . En contraste, 60% de los ratones vacunados con JE-VAX, asi como 70% de los controles negativos vacunados con pCDNA3/CAT, no sobreviven a la estimulación con el virus por 21 dias . Estos resultados indican que la TU' s de ácido nucleico de la invención confieren protección inesperadamente efectiva en ratones vacunados. Esto sugiere la posibilidad de emplear la vacuna de ácido nucleico de la invención como una vacuna de niños para humanos. En contraste, JE-VAX, la vacuna humana inactivada actualmente utilizada, no aparece para ser efectiva en animales jóvenes. Ejemplo 8. Protección pasiva de ratones neonatales correlacionada con el titulo de anticuerpo maternal. Ratones ICR hembras de edad de 3 semanas se vacunaron con ya sea una dosis o dos dosis espaciadas dos dias del DNA de plásmido pCDJE2-7, a 100 g/100 ]xL, o con dos dosis de JE-VAX que fueron un quinto de la dosis dada a humanos . El grupo de control negativo recibió dos dosis de 100 ¿ig/lOO µ?? del plásmido pCDNA-3/CAT. La protección pasiva por el anticuerpo maternal se evaluó en crias que resultan de apareamientos de hembras experimentales con ratones machos no inmunizados que ocurrieron nueve semanas después de la primera vacunación o 6 semanas después de la segunda vacunación. Las crias se estimularon entre 3-15 días después del nacimiento por administración intraperitoneal de 5,000 pfu/VOO L del virus SAI4 adaptado a ratón y se observaron brevemente por 3 semanas (Tabla 6) . Las proporciones de supervivencia se correlacionaron con los títulos de anticuerpo neutralizante maternales. 100% de las crias amamantadas por las madres con un PR T de 1:80 sobrevivieron a la infección viral, mientras que ninguna de las crias de la madre de control sobrevivieron (Tabla 6) . La protección parcial de 45% y 75% se observó en crías de más edad que se amamantaron por las madres con un título de PRNT de 1:20 y 1:40, respectivamente. Las proporciones de supervivencia también se correlacionaron con la duración de tiempo que las crías fueron amamantadas por la madre inmune. Como es indicado precisamente, crías de 13-15 días de edad tuvieron altas proporciones de supervivencia. Ninguna de las crías de 3-4 días de edad, sin embargo, sobrevivieron a la estimulación por el virus cuando la madre tuvo un título de PRNT de 1:20 o 1:40. Así el anticuerpo maternal proporciona inmunidad protectora de parcial a completa a la descendencia. Además, el anticuerpo de JEV fue detectado por ELISA en los sueros de 97% (29/30) de las crias pos-estimuladas . Los ratones se inocularon intramuscularmente con 1 o 2, dosis de 100 de DNA de plásmido, o subcutáneamente con dos, 1/5 de dosis humana de vacuna JE-VA . Los sueros se recolectaron 9 semanas después de la vacunación para la prueba de PRNT antes del apaream ento con el macho no inmune. Ejemplo 9. Preparación de plásmidos recombinantes que contienen la unidad de transcripción que codifica los antigenos prM y E de WNV. El RNA genómico se extrajo de 150 uL del medio de cultivo de células Vero infectado con la cepa NY 99-6480, una cepa aislada del brote en Nueva York en 1999, utilizando el Kit QIAarnp" Viral RNA (Qiagen, Santa Clarita, CA) . El RNA extraido fue eluido y suspendido en 80 µ? de agua libre de nucleasa y se utilizó como un patrón para la amplificación de la secuencia de codificación del gen prM y E de WNV. Secuencias cebadoras se obtuvieron del trabajo de Lanciotti y colaboradores {Science 286:2333-2337 (1999)). Un fragmento de cDNA que contiene la región de nucleótidos genómica se amplificó por la reacción de cadena de polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR) . Los sitios de restricción BsmBI y KasI se diseñaron en el 5' terminal del cDNA al utilizar el amplimero WN466 (secuencia de nucleótidos, SEQ ID NO:12) . Un codón de terminación de traducción en la estructura, seguido por un sitio de restricción Notl se introdujo en el 3' terminal de cDNA al utilizar el amplimero CWN2444 {SEQ ID N0:13) . El producto de RT-PCR se purificó mediante un Kit OIAquick^ PCR Purification (Qiagen) . El amplicón de doble hebra producido mediante el USJ de los dos amplimeros anteriores (SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13) se digirió con las enzimas KasI y Notl para generar un fragmento de DNA de 998 bp (nt-1470 a 2468) que se insertó en los sitios KasI y Notl de un vector pCBJESS para formar un plásmido intermediario, pCBINT. El pCBJESS se derivó del plásmido pCBamp, que contuvo el promotor de gen temprano de citomegalovirus y el elemento de control de traducción y un elemento de secuencia de señal de JE diseñado (Chang y colaboradores, J. Viro!. 74:4244-4252 (2000)). El elemento de la secuencia de señal de JE comprende la secuencia de señal de JE (SEQ ID NO: 14) . El amplicón de cDNA se digirió subsecuentemente con las enzimas BsmBI y KasI y el fragmento de 1003 bp restante (nt-466 a 1470) se insertó en el sitio KasI de pCBINT para formar pCBWN (secuencia de ácidos nucleicos, SEQ ID NO: 15; secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO: 16). La secuenciación de DNA automatizada utilizando un ABI prism 377 Sequencer (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA) se utilizó para confirmar que el plásmido recombinante tuvo una secuencia de prM y E correcta como es definida por Lanciotti y colaboradores {Science 286:2333-2337 (1999)). El DNA de plásmido para el uso en la transformación in vitro de células mamiferas o experimentos de inmunización en ratones se purificó mediante la cromatografía de intercambio aniónico como es descrito en el Ejemplo 1. Ejemplo 10. Caracterización inmunoquimica y evaluación de las proteínas prM y E de WNV expresadas por pCBW . Productos de gen específicos de WNV codificados por el plásmido pCBWN se expresaron en las células COS-1. Las células fueron electroporadas y transformadas con el plásmido pCBWN de acuerdo con Chang y colaboradores (J. Virol. 74:4244-4252 (2000)). Las células electroporadas fueron sembradas en matraces de cultivo de 75 cm2 o en un disco de cultivo de tejido de 12 cavidades que contiene una funda estéril/cavidad. Todos los matraces y las placas de 12 cavidades de mantuvieron en una incubadora a 37°C, C02 al 5%. Cuarenta horas después de la elect oporación, las fundas que contienen las células adherentes se retiraron de las cavidades, se lavaron brevemente con PBS, se fijaron con acetona durante 2 minutos a temperatura ambiente y se dejaron secar con aire. La expresión de proteina se detectó utilizando el ensayo de anticuerpo de inmunofluorescencia indirecta (IFA) como es descrito en el Ejemplo 2. El anticuerpo monoclonal ( ab) 4G2 específico de la proteína E de flavi irus, fluido ascitico hiperinmune de ratón de WNV" (HIAF) y suero de ratón normal (NMS) a una dilución de 1:200 en PBS se utilizaron como el anticuerpo primario para detectar la expresión de proteina (Henchal y colaboradores, A . J. Txop. Mod. Hyg. 31:830-836 (1982)). El medio de cultivo de tejido se cosechó 40 y 80 horas después de la electroporación. La ELISA de captura de antigeno (Ag-captura) se utilizó para detectar el antigeno del virus de WN secretado en el medio de cultivo de células COS-1 transientemente transformadas. El Mab 4G2 y el Mab 6B6C-1 conjugado con peroxidasa de rábano picante se utilizaron para capturar los antigenos de virus de "WN y detectar el antigeno capturado, respectivamente (Chang y colaboradores, J. Vírol. 74:4244-4452 (2000); Henchal y colaboradores, Jm. J. Trop. Med. Hyg. 31:830-836 (1983); Roehrig y colaboradores, Virology 128:118-126 (1983)). El antigeno del virus de WN en el medio se concentró por precipitación con polietilenglicol (PEG)-8000 al 10% . El precipitante se resuspendió en solución reguladora de TNE (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, pH 7.5), se clarificó por centrifugación y se almacenó a 4°C. Alternativamente, el precipitante se resuspendió en una solución reguladora de liofilización (TRIZMA 0.1 M y albúmina de suero bovino al 0.4% en solución reguladora de solución salina de borato, pH 9.0), se liofilizó y se almacenó a 4°C.
Las preparaciones liofilizadas se utilizaron como el antigeno para la evaluación en MAC- e indirecta IgG ELISAS. La proteina especifica del virus de WN se detectó por IFA sobre las células COS-1 transienteme te transformadas. Las proteínas E, prM y M expresadas en estas células se secretaron en el medio de cultivo. El antigeno del virus de WN concentrado por la precipitación de PEG se extrajo con etanol al 7.0% para retirar el PEG residual (Aizawa y colaboradores, Appl. Enviro. Micro. 39:54-57 (1980)). Los antigenos extraídos con etanol y los viriones de WN purificados en gradiente se analizaron sobre un NuPAGE, Gel Bis-Tris de gradiente al 4-12% en un Excel Plus Electrop oresis Apparatus (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) y seguido por el electromanchado sobre membranas de nitrocelulosa utilizando una Excel Plus Blot Unit (Invitrogen Corp.). Las proteínas especificas del virus de WN producidas por las células COS-1 transientemente transformadas se detectaron por el HIAF del ratón especifico del virus de WN o por el Mab 4G2 reactivo de la proteina E de flavivirus en un análisis de manchado de Western, utilizando NMS como un control de suero negativo. Las proteínas mostraron reactividad similar y pesos moleculares idénticos a las proteínas E, prM y de virión purificadas en gradiente, correspondientes, derivadas del cerebro de ratón lactante (SMB) infectado con virus de WN.
En el análisis del NRA como un antigeno para ELISA de diagnóstico, un frasquito de NRA liofilizado, que representa el antigeno cosechado de 40 mi de fluido de cultivo de tejido, se reconstituyó en 1.0 mi de agua destilada y se comparó con el antigeno de cerebro de ratón lactante (SMB) infectado por el virus de WN reconstituido, proporcionado como liofilizado como extractos de sucrosa-acetona inactivados con ß-propiolactona (Clarke y colaboradores, Am. J. Trop. Med. Hyg. 7:561-573 (1958)). Todas las proteínas recombinantes prM, M y E, tuvieron una reactividad similar a aquella de las proteínas E, prM y M de virión purificadas en gradiente. Muestras humanas codificadas se probaron concurrentemente con los antigenos en la misma prueba en la etapa de desarrollo. Los protocolos de MAC- e IgG ELISA empleados fueron idénticos a los métodos publicados (Johnson y colaboradores, J. Clin. Microbiol. 38:1827-1831 (2000); Martin y colaboradores, J. Clin Microbiol. 38:1823-1826. (2000) ) . Muestras de suero humano se obtuvieron del banco de suero en la instalación de los solicitantes, que consiste de muestras enviadas al DVBID para la prueba de confirmación del virus de WN durante el brote de 1999. En estas pruebas, se realizó una clasificación MAC- e IgG ELISA en una dilución de muestra de 1:400. Las muestras que producen relaciones OD positivas/negativas (P/N) entre 2 y 3 se consideraron positivas sospechosas. Las muestras de suero sospechosas se sometieron a la confirmación como positivas por tanto la titulación de punto final de ELISA como por la prueba de neutralización de reducción en placa (PR ) . Todas las muestras que producen relaciones de OD de P/N mayor que 3.0 se consideraron positivas sin la prueba confirmatoria adicional . Un grupo reactivo de flavivirus que emplea ELISA de Ag-captura, anti-E Mab, 4G2 y 6B6C-1, se utilizó para detectar la NRA secretada en el fluido de cultivo de las células COS-1 transformadas con pCBWN. El antigeno podria ser detectado en el medio un dia después de la transformación; y el titulo de ELISA máximo (1:32-1:64) en el fluido de cultivo sin concentración adicional se observó entre el dia dos y el dia cuatro. NRA se concentró mediante la precipitación con PEG, se resuspendió en una solución reguladora de liofilización y se liofilizó para la preservación. Para el desarrollo de la prueba de diagnóstico, un frasquito de NRA liofilizado se reconstituyó con 1.0 mi de agua destilada y se tituló en el MAC o indirecta igG ELISA utilizando suero humano de referencia positiva y negativa del virus de WN (Johnson y colaboradores, J. Clin. Microbiol. 38:1827-1831 (2000); Martin y colaboradores, J. Clin. Microbiol. 38:1823-1826 (2000)). Las diluciones 1:320 y 1:160 del NRA se encontraron que son las concentraciones óptimas para el uso en MAC- e IgG ELISA, respectivamente. Estas diluciones dieron por resultado una relación de OD450 P/N de 4.19 y 4.54, respectivamente/ para la prueba MAC- e IgG. Los antigenos SMB del virus de WN producidos por las cepas NY-6480 y EglOl se utilizaron en dilución 1:320 y 1:640 para MAC-ELISA y.1:120 y 1:320 para IgG I.LISA, respectivamente. Los antigenos de control negativos, precipitados con PEG del medio de cultivo de las células COS-1 normales y el antigeno SMB normal, se utilizaron en las mismas diluciones como para antigeno NRA y SMB respectivos. Muestras de suero humano, diluidas a 1:400, se probaron concurrentemente por triplicado con los antigenos de control negativos y específicos del virus. Para que el resultado de la prueba positivo sea válido, el OD450 para el suero de prueba reaccionado con el antigeno viral (P) tiene que ser por lo menos dos veces más grande que el valor de densidad de óptica correspondiente del mismo suero reaccionado con el antigeno de control negativo (N) . La reactividad de NRA y NY-06480, EglOl, SMBs de virus de SLE se compararon por las MAC- e IgG ELISAs utilizando 21 muestras de suero humano codificadas. De las 21 muestras, 19 tuvieron resultados similares en todos los tres antígenos (8 negativos y 11 positivos sospechosos o positivos) . Dieciocho muestras también se probaron por separado utilizando el antígeno SMB de SLE. Solamente tres de las 13 muestras positivas Eg-101-SMB fueron positivas en la MAC-ELISA de SLE (Tabla 1) . Ninguna de las muestras negativas del antigeno WN fue positiva por el MAC-ELISA de SLE. Este resultado confirmó una observación previa de que el IgM del virus anti-WN no reacciona cruzadamente de manera significante con otros flavi irus (Tardei y colaboradores, J. Clin. Microblol. 38-2232-2239 (1S 0) ) y fue especifica para diagnosticar la infecció por virus de WN aguda sin considerar si el antigeno NRA o SMB se utilizó en la prueba. Todas las muestras también se procuraron concurrentemente por la IgG ELISA indirecta. Diez de 21 muestras fueron positivas utilizando cualquiera de los tres antigenos. Las dos muestras de suero discrepantes (7 y 9) ambas del mismo paciente, recolectadas en el dia 4 y 44 después del inicio de la enfermedad respectivamente, fueron IgM negativas con el antigeno NRA y SMB NY e IgM-positiva utilizando el antigeno Eg-101 SMB en la prueba inicial. Para investigar estas dos muestras discordantes adicionalmente, seis muestras secuencialmente recolectadas de este paciente se volvieron a probar por las MAC- e IgG ELISAS de punto final. Un incremento en serie mayor que 32 veces mostrado en el titulo de MAC-ELISA entre el dia 3 y el dia 15 podría ser demostrado con todos los antigenos utilizados. El fluido cerebroespinal recolectado en el dia 9 después del inicio de la enfermedad también confirmó que este paciente en realidad fue infectado por el WN poco antes de la toma de la muestra.
El fluido cerebroespinal tuvo lectura de IgM P/N de .13.71 y 2.04 contra los antigenos Eg-101- y SLE-SMB respectivamente. Las muestras del dia 31 y el dia 44 fueron negativas (<1:400) al utilizar el antigeno NY-SMB pero positivas al utilizar NRA. y EglOl-SMB. Los t tulos de IgG compatibles se observaron con todos los tres antigenos utilizados en la prueba. Ejemplo 11. Evaluación de la respuesta inmune en animales vacunados con pCBWN. Grupos de diez, ratones ICR hembras de tres semanas se utilizaron en el estudio. Los ratones se inyectaron intramuscularmente (i.m.) con una sola dosis de pCBWN o un DNA de plásmido que expresa proteina fluorescente (pEGFP) (Clonetech, San Francisco, CA. ) . El DNA del plásmido pCBWN se purificó de las células XL-1 azul con los Kits EndoFree Plasmid Giga (Qiagen) y se resuspendió en PBS, pH 7.5, a una concentración de 1.0 g l. Los ratones que recibieron 100 .q de pEGFP se utilizaron como controles no vacunados. Los ratones se inyectaron con el plásmido pCBWN a una dosis de 100, 10, 1.0 o 0.1 |¡g en un volumen de 100 µ?. Los grupos que recibieron 10, 1.0 o 0.1 pg de pCBWN se vacunaron por el protocolo de suministro de gen dn vivo mediado por electrotransferencia utilizando el electroporador de onda cuadrada EMC-830 (Genetronics Inc. San Diego, CA. ) . El protocolo de electrotransferencia fue basado en el método de Mir y colaboradores, (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:4262-4267 (1999)). Inmediatamente después de la inyección de DNA, pulsos eléctricos transcutáneos se aplicaron por dos electrodos de placa de acero inoxidable, colocados 4.5-5.5 mm de separación en cada lado de la pierna. El contacto eléctrico con la piel de la pierna se aseguró al humectar completamente la pierna con PBS . Se aplicaron dos conjuntos de cuatro pulsos de 40 volts/mm de 25 mseg de duración con un intervalo de 200 mseg entre los pulsos. La polaridad del electrodo se invirtió entre el conjunto de pulsos para aumentar la eficiencia de la electrotransferencia. Los ratones se sangraron cada 3 semanas después de la inyección. La respuesta al anticuerpo especifico del virus de WN se evaluó mediante ELISA de AG-captura y la prueba de neutralización de reducción en placa (PRNT) . Sueros individuales se probaron por IgG-ELISA, y sueros acumulados de 10 ratones de cada grupo se analizaron por PRNT. Todos los ratones vacunados con pCBWN tuvieron títulos de IgG ELISA que varían de 1:640 a 1:1280 tres' semanas después de la vacunación. Los sueros acumulados recolectados en tres y seis semanas tuvieron un titulo de anticuerpo Nt de 1:80. Ninguna de las muestras de suero de los ratones de control pEGFP mostraron algún titulo de ELISA o Nt al virus WN. Para determinar si la vacunación i.m. individual de pCBWN podria proteger a los ratones de la infección por virus de WN, los ratones se estimularon con el virus NY-6480 ya sea por inyección intrapéritoneal o por la exposición a la picadura de mosquitos Culex infectados por el virus. La mitad de los grupos de ratones se estimularon intraperitonealmente (ip) en 6 semanas después de la vacunación con 1, 000 LD50 (1,025 PFU/100 µ?) del virus NY99-6480. Los ratones restantes fueron cada uno expuestos a las picaduras de tres mosquitos Ci-lex tritaenior ynchus que se han infectado con el virus NY99-6 80 7 dias antes del experimento de estimulación. Los mosquitos se dejaron alimentar sobre los ratones hasta que ellos engordaron completamente. Los ratones se observaron dos veces al dia por tres semanas después de la estimulación. Fue evidente que la presencia de los anticuerpos Nt se correlacionó con la inmunidad protectora, puesto que todos los ratones inmunizados con el virus de WN permanecieron sanos después de la estimulación con el virus, mientras que todos los ratones de control desarrollaron sintonías de infección de CNS 4-6 dias después de la estimulación con el virus y murieron en un promedio de 6.9 y 7.4 dias después de la estimulación intraperitoneal o' con mosquito infectivo, respectivamente. En el grupo vacunado, los sueros acumulados recolectados tres semanas después de la estimulación con el virus (9 semanas después de la inmunización) tuvieron título de anticuerpo Nt de 1:640 o 1:320. Los sueros de ratón vacunado acumulados reaccionaron solamente con la proteína E en el análisis de manchado de Western. Grupos de diez ratones se inmunizaron con 10.0 a 0.1 pg de pCBWN por animal mediante el uso de electrotransferencia. Todos los grupos que recibieron pCBWN fueron protegidos completamente de la estimulación por el virus. En 6 semanas después de la. inmunización todos los grupos de ratones de electrotransferencia tuvieron el titulo Nt de menos de cuatro veces diferentes que los animales que reciben 10D g de pCBWN o la inyección i.m. convencionales sin electrotransferencia . Ambos de estos resultados muestran la evidencia de que la inmunización efectiva sugiere que el protocolo de electrotransferencia aumenta la inmunogenicidad y la eficacia protectora de la vacuna de DNA de la invención (cuando es llevada a cabo como es descrito en (Mir y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 96:4262-4267 (1999))). Yeguas y caballos castrados de reproducción mezclada de varias edades, utilizados en este estudio, se mostraron que son negativos al anticuerpo del virus WN y del virus SLE por ELISA y PRNT. Cuatro caballos se inyectaron 1.m. con una sola dosis (1,000 jLig/1,000 µ? en PBS, pH 7.5) del plásmido pCBWN. Muestras de suero se recolectaron un dia si y otro no durante 38 dias antes de la estimulación con el virus, y la respuesta al anticuerpo especifico del virus de WN se evalúo por MAC- o IgG ELISA y PRNT. Dos dias antes de la estimulación con el virus, 12 caballos (4 vacunados y 8 de control) se reubicaron en un edificio de contención de nivel de bioseguridad (BSL)-3 en la Colorado State Uni ersity. Los ocho caballos de control no vacunados fueron el subconjunto de un estudio que fue diseñado para investigar la patogénesis inducida por el virus de WN e caballos y el potencial de los caballos para servir como huéspedes de amplificación. Los caballos fueron cada uno estimulados por la picadura de 14 o 15 mosquitos Aedes albopictus que se han infectado por el virus NY99-6425 o BC787 12 dias antes de la estimulación del caballo. Los mosquitos se dejaron alimentar sobre los caballos durante un periodo de 10 minutos . Los caballos se examinaron para los signos de enfermedad dos veces al dia. Se registró la temperatura del cuerpo, y muestras de suero se recolectaron dos veces al dia de los dias 0 (dia de la infección) a 10, luego una vez diariamente hasta el dia 14. Se registraron diariamente el pulso y la respiración después de la estimulación. Las muestras de suero recolectadas se probaron mediante la titulación con placa para la detección de viremia y por MAC- o IgG ELISA y PRNT para la respuesta al anticuerpo. No se observó reacción sistémica o local en algún caballo vacunado. Sueros de caballos individuales se probaron por PRNT. Los caballos vacunados desarrollaron anticuerpo Nt mayor que o igual a 1:5 entre los dias 14 y 31. Los títulos de punto final para los caballos vacunados #5, #6, #7, y #8 en el dia 37 (dos dias antes de la estimulación con los mosquitos) fueron 1:40, 1:5, 1:20 y 1:20, respectivamente. Los caballos vacunados con el plásmido pCBWN permanecieron sanos después de la estimulación con el virus. Ninguno de estos desarrolló una viremia detectable o fiebre de los dias 1 a 14. Todos los caballos de control no vacunados llegaron a ser infectados con el virus WN después de la exposición a las picaduras de mosquitos infectados. Siete de los ocho caballos no vacunados desarrollaron viremia que apareció durante los primeros 6 dias después de la estimulación con el virus . Los caballos virémicos desarrollaron anticuerpo Nt entre el dia 7 y el dia 9 después de la estimulación con el virus . El único caballo del estudio completo que muestra signos clínicos de enfermedad fue el caballo #11, que se mostró febril y mostró signos neurológicos que inician 8 dias después de la infección. Este caballo progresó a enfermedad clínica severa dentro de 24 horas y fue sacrificado sin dolor en el dia 9. Cuatro caballos representantes, #9, 10, 14 y 15, que presentan viremia por los 0, 2, 4 o 6 dias, fueron seleccionados y utilizados como ejemplos en este ejemplo. Los títulos de virus variaron de 101·0 PFU/ml de suero (en el caballo #10), el nivel más bajo detectable en el ensayo de los solicitantes, a 102- /ml (en el caballo #9) . El caballo # 14 no desarrolló una viremia detectable durante el periodo de prueba, sin embargo, este caballo fue infectado por el virus, como es evidenciado por el anticuerpo Nt detectado después del dia 12. La respuesta, al anticuerpo Nt anamnéstica no se observó en caballos vacunados como es evidenciado por el incremento gradual en el titulo Nt durante el experimento. El anticuerpo Nt preexistente en el caballo vacunado antes de la estimulación con mosquitos podria suprimir la infección y replicación del virus inicial. Sin la replicación del virus, el antigeno del virus estimulado proporcionado por los mosquitos infectados puede no contener una masa de antigenos suficiente para estimular la respuesta inmune anamnéstica en el caballo vacunado. Todos los caballos vacunados fueron sacrificados en 14 dias después de la estimulación con el virus. No se observaron lesiones patológicas e histopatológicas grandes indicativas de la infección viral con WN. Ejemplo 12. Preparación de plásmidos recombinantes que contienen secuencias de codificación para las proteínas prM y E del virus de fiebre amarilla (YFV) o virus de encefalitis de St. Louis (SLEV) . Una estrategia similar para construir el plásmido recombinante pCDJE2-7 se utilizó para preparar los plásmidos recombinantes de YFV y SLEV. El RNA genómico se extrajo de 150 de siembras de virus de la cepa TRI-788379 de YFV o la cepa 78V-6507 de SLE utilizando el Kit QlAampMR Viral RNA (Qiagen, Santa Clarita, CA. ) . El RNA viral se utilizó como un patrón para la amplificación de las regiones de codificación del gen prM y E de YFV o SLEV. Los cebadores YFDV389 (secuencia de nucleótidos, SEQ ID NO: 4; secuencia de amino ácidos, SEQ ID NO:5), cYFDV2452 (SEQ ID NO:6), SLEDV410 (secuencia de nucleótidos, SEQ ID NO:7 secuencia de amino ácidos, SEQ ID NO:8) y CSLEDV2449 (SEQ ID NO: 9) se utilizaron para generar los ácidos nucleicos recombinantes correspondientes, como es descrito anteriormente para la preparación de los plásmidos recombinantes de JEV y WNV. El cDNA amplificado por RT-PCR, digerido con las enzimas Kpnl y Not , se insertó en el sitio Kpnl-Notl de un vector de plásmido de expresión eucariótxco, pCDNA3 (Invitrogen) . Ambas hebras del cDNA se secuenciaron y se verificaron para la identidad con las secuencias de la cepa TRI-788379 de YFV o la cepa 78V-6507 de SLEV. Los plásmidos recombinantes pCDYF2 y pCDSLE4-3, que contuvieron las secuencias de nucleótidos de las regiones de codificación prM y E para YFV o SLEV, respectivamente, se purificaron utilizando un Kit EndoFree* Plasmid Maxi (Qiagen) , y se utilizaron para la transformación in vitro o la inmunización de ratón. Los antigenos específicos de YFV o SLEV se expresaron en las células COS-1 transformadas por pCDYF2 o pCDSLE4-3, respectivamente. El nivel de proteínas expresadas fue similar a un control de células COS-1 infectadas con YFV o con SLEV. Como en el modelo de JEV, se obtuvieron líneas de células COS-1 transformadas por los vectores que llevan genes para los antígenos virales que constitutivamente expresan las proteínas antigénicas de YFV o SLEV. El mapeo del epitope por IFA utilizando un panel de Mabs específico de E de YFV o SLEV indicó que la p¿oteína E auténtica fue expresada por las células C05-1 transformadas con pCDYF2 o pCDSLE4-3. Un estudio preliminar indicó que 100% de los ratones ICR hembras de tres semanas fueron seroconvertidos después de la inoculación intramuscular con una sola dosis de 100 g 100 ¡ÍL del plásmido pCDSLE4-3 en agua desionizada. Ejemplo 13. Preparación de plásmidos recombinantes que contienen secuencias de codificación para los antigenos de prM y E del virus de encefalitis de St. Louis con la secuencia de señal de JEV. RNA genómico se extrajo de 150 µL de un medio de cultivo de células Vero infectado con la cepa MSI-7 del virus de encefalitis de St. Louis utilizando el Kit QIAamp"11 Viral RNA (Qiagen, Santa Clarita, CA) . El RNA extraído fue eluído y suspendido en 80 µ? de agua libre de nucleasa, y utilizado como un patrón para la amplificación de las secuencias de codificación del gen prM y E del virus de encefalitis de St. Louis. Las secuencias cebadoras se obtuvieron del trabajo de Trent y colaboradores {Virology 156:293-304 (1987)). Un fragmento de cDNA que contiene la región de nucleótidos genómica se amplificó por la reacción de cadena de polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR) . El sitio de restricción Afel fue diseñado en el 5' terminal del cDNA al utilizar el amplimero SLE463 (SEQ ID NO:30) . Un codón de terminación de traducción en la estructura, seguido por un sitio de restricción Notl fue introducido en el 3' terminal del cDNA por utilizar el amplimaro CSLE2447 (SEQ ID NO: 31). El producto de RT-PCR se purificó por un Kit QIAquick* PCR Purification (Qiagen) . El amplicón de doble hebra, producido por el uso de los dos amplimeros anteriores (SEQ ID NO:30 y SEQ ID NO:31), se digirió con las enzimas Afel y Notl para generar un fragmento 2004 de DNA (463 a 2 66nt) y se insertó en los sitios Afel - y NctI de un vector pCBJESS-M para formar pCBSLE (secuencia de nucleótidos, SEQ ID N0:21; secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO: 22) . El pCBJESS-M se derivó del plásmido pCBamp, que contuvo el promotor de gen temprano de citomegalovirus y el elemento de control de traducción y un elemento de secuencia de señal de JE modificado, diseñado (SEQ ID NO:27). El elemento de secuencia de señal de JE comprende la secuencia de señal de JE modificada en la posición -4 (Cys a Gly) y -2 (Gly a Ser) en el plásmido pCBJESS original. La secuenciación de DNA automatizada utilizando un ABI prism 377 Sequencer (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA) se utilizó para confirmar que el plásmido reco binante tuvo una secuencia de prM y E correcta como es definida por Trent y colaboradores {Vizoloby 156:293-304 (1987) ) . Ejemplo 14. Preparación de plásmidos recombinantes que contienen secuencias de codificación para las proteinas prM y E del virus de la- fiebre amarilla (YFV) con la secuencia de señal de JEV. El RNA genómico se extrajo de 150 µ?? del medio de cultivo de células Vero infectado con la cepa 17D-213 del virus de fiebre amarilla utilizando el Kit QIAamp" Viral RNA (Qiagen, Santa Clarita, CA) . El RNA extraido fue eluido y suspendido en 80 µ? de agua libre de nucleasa y utilizado como un patrón para la amplificación de las secuencias de codificación del gen prM y E del virus de la fiebre amarilla. Las secuencias cebadoras se obtuvieron del trabajo de dos Santos y colaboradores (Virus Research 35:35-41 (1995)). Un fragmento de cDNA que contiene la región de nucleótidos genómica se amplificó por la reacción de cadena de polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR) . El sitio de restricción Afel se diseñó en el 5' terminal del cDNA al utilizar el amplimero YF482 (SEQ ID NO:28) . Un codón de terminación de traducción en la estructura, seguido por un sitio de restricción Notl se introdujo en el 3' terminal del cDNA al utilizar el amplimero cYF2433 (SEQ ID NO:29) . El producto de RT-PCR se purificó por un Kit QIAquick** PCR Purification (Qiagen) .
El amplicón de doble hebra, producido por el uso de dos amplimeros anteriores (SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:29), se digirió con las enzimas Afel y Notl para generar un fragmento 1971 de DNA (482 a 2452 nt) y se insertó en los sitios Afel y Notl de un vector pCBJESS-M para formar pCBYF (secuencia de nucleótidos, SEQ ID NO: 23; secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO: 24) . El pCBJESS-M se derivó del plásmido pCBamp, que contuvo el promotor de gen temprano de citomegalovirus y el elemento de control de traducción y un elemento de secuencia de señal de JE diseñado (SEQ ID NO:27) . El elemento de secuencia de señal de JE comprende la secuencia de señal JE modificada en la posición -4 (Cys a Gly) y -2 (Gly a Ser) de JESS en el plásmido de pCBJESS. La secuenciación de DNA automatizada utilizando un ABI prism 377 Sequencer (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA) se utilizó para confirmar que el plásmido recombinante tuvo una secuencia de prM y E correcta como es definida por dos Santos y colaboradores (Virus Research 35:35-41 (1995)). Ejemplo 15. Preparación de plásmidos recombinantes que contienen secuencias de codificación para los antigenos prM y E del virus de Powassan con la secuencia de señal de JEV. El RNA genómico se extrajo de 150 ¿iL del medio de cultivo de células Vero infectado con la cepa LB del virus de Powassan utilizando el Kit QIAamp^ Viral RNA (Qiagen, Sant Clarita, CA) - El RNA extraído fue eluido y suspendido en 80 µ?. de agua libre de nucleasa y se utilizó como un patrón para la amplificación de las secuencias de codificación del gen prM y E del virus de Powassan. Las secuencias cebadoras se obtuvieron del trabajo de Mandl y colaboradores [Viiology 134:173-184 (1993)). Un fragmento de cDNA que contiene la región de nucleótidos genómica se amplificó por la reacción de cadena de polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR) . El sitio de restricción Afel se diseñó en el 5' terminal del cDNA al utilizar el amplimero PO 454 (SEQ ID NO:25) . Un codón de terminación de traducción en la estructura, seguido por un sitio de restricción Notl se introdujo en el 3' terminal del cDNA al utilizar el amplimero CPOW2417 (SEQ ID NO:26) . El producto de RT-PCR se purificó mediante un Kit Qiaquick" PCR Purification (Qiagen) . El amplicón de doble hebra, producido por el uso de los dos amplimeros anteriores (SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:26), se dirigió con las enzimas Afel y Notl para generar un fragmento de 1983 bp de DNA (454 a 2436 nt), y se insertó en los sitios Afel y Notl de un vector pCBJESS-M para formar pCBPOW (secuencia de nucleótidos, SEQ ID NO: 19; secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO:20).. El pCBJESS-M se derivó del plásmido pCBamp, que contuvo el promotor de gen temprano de citomegalovirus y el elemento de control de traducción y un elemento de secuencia de señal de JE diseñado (SEQ ID NO: 27) .
El elemento de secuencia de señal de JE comprende la secuencia de señal de JE modificada en la posición -4 (Cys a Gly) y -2 (Gly a Ser) de JESS en el plásmido pCBJESS . La secuenciación de DNA automatizada utilizando un ABI prism 377 Sequencer (Applied Biosystems/Perkin Elroer, Foster City, CA) se utilizó para confirmar que el plásmido recom inante tuvo una secuencia de prM y E correcta como es definida por Mandl y colaboradores (Vírology 194:173-184, (1993) ) . Ejemplo 16. Preparación de plásmidos que contienen secuencias de codificación para las proteínas estructurales del dengue serotipo 2. Procedimientos tales como aquellos llevados a cabo para otros flavivirus (ver los Ejemplos 1, 9 y 12-15) pueden ser seguidos para preparar vectores que incluyen TU' s de ácido nucleico para los antigenos del dengue serotipo 2. De acuerdo con los ejemplos, los amplímeros utilizados para la construcción de los vectores pueden ser seleccionados para diseñar la secuencia de señal del virus de dengue normal o pueden ser seleccionados para diseñar una secuencia de señal de otro flavivirus, tal como la secuencia de señal del virus de encefalitis japonés modificado. Un plásmido que contiene la región de gen del dengue serotipo 2 de prM a E puede ser construido- Los genes de prM y E del dengue serotipo 2 (Deubel y colaboradores, Virology 155:365-377 (1986); Gruenberg y colaboradores, \ Gen. Virol 69:1301-1398 (1988); Hahn y colaboradores, ViTology 162:167-180 (1988)) pueden ser ligados en un plásmido tal como pCDNA3, y luego extirpados y clonados en vectores tales como pCBamp, pCEP4, pREP4, o pRc/RSV (suministrados por Invitrogen, Carlsbad, CA) para permitir la expresión. Si es necesario, una secuencia especifica del virus del dengue serotipo 2 codificada en una secuencia de cDNA puede ser amplificada utilizando un procedimiento tal como la reacción de cadena de polimerasa (PCR) . Alternativamente, si el RNA viral es la fuente de la región de gen, una secuencia de DNA puede ser amplificada por un procedimiento de RT-PCR. Un fragmento de DNA que incluye un codón de iniciación en el extremo 5' , y un codón de terminación en el extremo 3' puede ser clonado en un vector de expresión en un sitio especifico de nucleasa de restricción apropiado, de tal manera que el promotor temprano inmediato (IE) de citomegalovirus (CMV) , un codón de iniciación y un terminador, son operablemente enlazados a la secuencia del virus del dengue serotipo 2. Ejemplo 17. Vacunación de ratones utilizando una vacuna de DNA de dengue serotipo 2. La vacuna de TU de ácido nucleico de dengue serotipo 2 que codifica la región de gen prM a E preparada en el Ejemplo 16 puede ser suspendida en un portador farmacéutico adecuado, tal como agua para inyecci n o solución salina fisiológica regulada e inyecta ni intramuscularmente en grupos de ratones destetados . Los grupos de control reciben una preparación de plásmido comparable que carece de los genes específicos del dengue serotipo 2. La generación de anticuerpos específicos del dengue serotipo 2 y/o las células citotóxicas del sistema inmune especificas del dengue serotipo 2, puede ser estimada en intervalos fijados después, por ejemplo en intervalos de cada semana. En aproximadamente dos a cuatro meses después de la administración de la vacuna de TU de ácido nucleico, los ratones pueden ser estimulados con el virus del dengue serotipo 2. Los niveles de viremia pueden ser estimados en intervalos apropiados después, tal como cada segundo dia. La protección pasiva por el anticuerpo maternal puede ser estimada como es indicado en el Ejemplo 8. Ejemplo 18. Diseño y construcción de Péptidos de Señal Mejorados. Los péptidos de señal pueden determinar la translocalización y la orientación de la proteina insertada, por consiguiente, la topología de las proteínas prM y E. La característica más común de los péptidos de señal de eucariotes, consiste de un estiramiento de 8 a 12 aminoácidos hidrofóbicos llamado la región h (von Heijne, "Signal sequences. The limits of variation" J. Mol. Biol. 184: 99-105 (1985)). La región entre el iniciador Met y la región h, que es conocida como la región n, usualmente tiene de uno a cines aminoácidos, y normalmente lleva aminoácidos positivamen cargados. Entre la región h y el sitio de segmentación está la región c, que consiste de tres a siete residuos de aminoácidos polares pero principalmente no cargados. Durante la síntesis de la poliproteina viral, la modulación del sitio de segmentación de señalasa de una conformación críptica a segmentable en la unión de las proteínas C y prM depende de la remoción previa de la proteina C por el complejo de proteasa viral, NS2B/NS3 (Lobigs, "Flavivirus premembrane protein cleavage and spike heterodimer secretion require the function of the viral proteinase NS3", Proc. Nati. Acad. Sci. U S A. 90: 6218-6222 (1993)). Asi, es critico considerar la efectividad de la secuencia de señal viral cuando las proteínas prM y E van a ser expresadas solamente por un plásmido de expresión. Las diferencias del péptido de señal en varias construcciones de plásmidos pueden tener en cuenta, por lo menos en parte, la diferencia en la translocalización de la proteina, la presentación del sitio de segmentación y la topología correcta, de esta manera la secreción de prM y E y la formación de VLP. La modulación u optimización de estos atributos puede ser mejorada por la selección o uso de secuencias de señal con propiedades que imparten las características deseadas. Esto se puede realizar mediante el uso de programas de computadora de instrucción en máquirts utilizando, por ejemplo, un modelo Markov oculto (H entrenado en eucariotes (ver Henxik Nielsen y colaboradores, "Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model", In Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, California, pp. 122-130 {1998); Nielsen y colaboradores, "Machine learning approaches to the prediction of signal peptides and other protein sorting signáis", Protein Engineering 12: 3-9 (1999); Nielsen y colaboradores, "A neural network method for identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites", Int. J. N&ural Sys. 8: 581-599 (1997); "From sequence to sorting: Prediction of signal peptides", Henrik Nielsen, Ph.D. thesis. Defended at Department of Biochemistry, Stockholm University, Sweden (Mayo 25 1999); cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia, particularmente para la enseñanza relacionada con la optimización de secuencias de señal utilizando algoritmos habilitados en computadora) . Un ejemplo del tipo de programa utilizado es aquel encontrado en htt : //www. cbs .dtu . dk/services/SiqnalP-2.0/ en la fecha del 3 de abril del 2002. El HMM descrito en lo referido y las referencias incorporadas se aplicó para calcular la probabilidad del péptido de señal de las secuencias de péptido de señal prM en diferentes construcciones de plásmidos (Tabla 7). Las búsquedas co SignalP-HM correctamente predijeron los sitios de segmentación de peptidasa de señal en todas las construcciones. Sin embargo, se observaron diferencias considerables en la probabilidad de segmentación (que varia" entre 0.164 y 1.000) y en la probabilidad del péptido de señal (que varia entre 0.165 a 1.00) (Tabla 7). Esto no es sorprendente, ya que el sitio de segmentación y la probabilidad del péptido de señal se conocen que también son influenciados por los aminoácidos positivamente cargados en la región n, la longitud del aminoácido hidrofóbico en la región h y la composición de aminoácidos en la región c en las construcciones (Chang y colaboradores, "Flavivirus DNA. vaccines: current status and potential", Armáis of NY Acad. Sci . 951:272-285 (2001); Sakaguchi y colaboradores, "Functions of Signal and Signal-Anchor Sequences are Determined by the Balance Between the Hydrophobic Segment and the N-Terminal Charge", Proc. Na tl í Acad. Sci. USA 89: 16-19 (1992)). Tres construcciones de plásmido del virus de JE, cada una derivada de diferentes cepas del virus de JE, mostraron diferentes potenciales de vacuna (Lin y colaboradores, "DNA immunization with Japanese encephalitis virus nonstructural protein NSI elicits protective immunity in mice", J. Vi rol . 72: 191-200 (1998); Konishi colaboradores, "Induction of protective immunity again¿ Japanese encephalitis in mice by i munization with a plasmid encoding Japanese encephalitis virus premembrane and envelope genes", J. Virol, 72: 4925-4930 (1998); Chang y colaboradores, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis i.i mice", J. Virol. 74: 4244-4252 (2000)). Las secuencias del péptido de señal en estas construcciones son diferentes en la longitud de la región n que puede o no puede contener aminoácidos cargados (Tabla 7) . La región n que contiene aminoácidos positivamente cargados forma una vuelta corta en el lado citoplásmico que ocasiona que la región h (hélice de transmembrana) sea insertada en una orientación de cola, exponiendo el sitio de segmentación de señalasa. En el estudio de los solicitantes, las VLPs secretadas que contienen las proteínas prM/M y E podrían ser purificadas del medio de cultivo de la linea de células transformadas pCDJE2-7, JE4B, o las células COS-1 transientemente transformadas con pCBJEl-1 . Las VLPs purificadas en gradiente y los viriones tienen propiedades inmunológicas y bioquímicas idénticas. La eficiencia de procesamiento de la proteina prM a M madura, la marca de contraste de la morfogénesis del flavivirus, también es similar entre las VLPs y las partículas viriónicas. Asi, las proteínas prM y E expresadas por pCDJE2-7 y pCDJEl-14 pueo---" ser expresadas como proteínas de transmembrana del tipo I ÷ la orientación similar a aquella del virión prM y E (Chang y colaboradores, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice", J. Virol. 74: 4244-4252 (2000)). En contraste, la proteina prM del pcDNA3JEME podria ser expresada como una proteina de membrana del tipo II con su región h de transmembrana insertada en. una orientación de cabeza debido a la ausencia de aminoácidos positivamente cargados en su región n (Konishi y colaboradores, "Induction of protective immunity against Japanese encephalitis in mice by immunÍ2ation with a plasmid encoding Japanese encephalitis virus premembrane and envelope genes", J. Virol. 72: 4925-4930 (1998)). La síntesis de la proteina eficiente en combinación con la proteina expresada que tiene la topología correcta, particularmente de la prM y E expresadas, puede aumentar la formación y secreción de VLP, y asi promover la inmunogenicidad de la vacuna de DNA (Chang y colaboradores, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice", J. Virol. 74: 4244-4252 (2000)). El uso de cálculos basados en computadora, como es descrito en lo anterior, se ha aplicado para optimizar el diseño del plásmido de expresión. En particular, el poc predictivo del programa SignalP-HMM se aplicó para diseñar plásmido de expresión del virus de WN (Tabla 2) (Davis y colaboradores, "West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays", J. Virol. 75: 4040-4047 (2001)). El plásmido pCBWN consiste de una versión corta del péptido de señal del virus de JE seguido por la secuencia del gen prM-E del virus de WN. El potencial de vacuna de esta construcción fue ampliamente demostrado, ya que una sola inyección i.m. de DNA de pCBWN no solamente indujo una inmunidad protectora sino también previno la infección por el virus de WN en ratones y caballos. Como es discutido más antes, y como es demostrado en los Ejemplos 13-15, la secuencia de señal codificada por el virus, del mismo virus como las regiones de codificación del antigeno, no es necesariamente el péptido de señal óptimo disponible. Además, la secuencia de señal no modificada no es necesariamente óptima. Por ejemplo, el péptido de señal codificado en el plásmido pCBJEl-14 puede ser mejorado, como es medido por la probabilidad de la secuencia de señal por el acortamiento de la región n, por la alteración de la secuencia de la región c, o por la combinación de ambas modificaciones (Figura 6) . A manera de ilustración, una versión acortada del péptido de señal del virus de JE se utilizado para la expresión de los genes prM y E del virus c WN como es descrito en la presente y en los artículos incorporados en la presente por referencia para la enseñanza (Davis y colaboradores, "West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays", J. Virol. 75: 4040-4047 (2001)). Estudios de titulación de dosis mediante la única inoculación i.m. indicaron que el pCBWN fue por lo menos 2-4 veces más inmunogénico que el pCBJEl-14 en ratones . Ejemplo 19. Vacunas multivalentes . También pueden ser producidas vacunas multivalentes y/o de combinación diseñadas para inmunizar contra múltiples flavivirus. En la preparación de una vacuna multivalente, se preparan componentes de vacuna monovalente que incluyen elementos relacionados con los patógenos de interés, tal como YF, diferentes serotipos de los virus de DEN, JE, WN, SLE y TBE (RSSE y CEE) o cualquier otra combinación de flavivirus. El diseño y la producción de construcciones de DNA como es descrito en los otros ejemplos y en la especificación, son llevados a cabo como es descrito. Se pueden hacer combinaciones de vacunas apropiadas para proporcionar vacunas multivalentes o de combinación protectoras contra múltiples patógenos. Los datos preliminares del grupo de 1 solicitantes han demostrado que la inyección i.m. de ls vacunas de DNA de pCBJEl-14 y pCBWN combinadas indujo anticuerpos Nt específicos del virus de JE y del virus de WN en ratones (Tabla -8). Cada componente monovalente, aún si es construido utilizando reguladores de transcripción y de traducción idénticos, de preferencia debe ser probado en un sistema de modelo análogo para asegurar su potencial de vacuna. Un cóctel de vacunas de combinación luego puede ser formulado. Estos cócteles de vacunas pueden ser adaptados específicamente para regiones geográficas particulares. Por ejemplo, un cóctel de vacunas para Asia tropical y subtropical debe incluir cuatro serotipos de las vacunas del virus de DEN, WN y JE. De manera similar, cócteles de vacunas útiles para África y Latino América deben incluir cuatro serotipos de vacunas del virus de DEN, WN y YF y cuatro serotipos de vacunas del virus de DEN, Roclo - y YF, respectivamente. Ejemplo 20. Preparación y prueba de vacunas del virus del Dengue recombinante del tipo 2. a. Sumario del ejemplo. Se construyó una serie de plásmidos que codifican las proteínas de premembrana (prM) y envoltura (E) del virus del dengue tipo 2 (DEN-2) . Estos plásmidos incluyeron una construcción de prM-E de DEN-2 auténtica (pCBD2-14-6) (SEQ ID NO: 2) que codifica la proteina descrita por SEQ ID NO: 3, una construcción quimérica de 90% de DEN-2 E-10% del virus de encefalitis japonés (JE) E (pCB9D2-U-4-3) (SEQ ID NO:44) que codifica la proteina descrita por la SEQ ID NO: 45 y una construcción quimérica de 80% de DEN-2 E-20% de JE E (pCB8D2-2J-2-9-1) (SEQ ID NO:46) que codifica la proteina descrita por la SEQ ID NO: 7. La reactividad del anticuerpo monoclonal (MAb) indicó que todos los tres plásmidos expresaron epitopes de proteina E que reaccionaron con un panel de anticuerpos del dominio 1, 2 y 3. Sin embargo, solamente la construcción pCB8D2-2J-2-9-1 (SEQ ID NO: 6) secretó altos niveles de prM, M. (prM madura) y E en el medio de las células COS-1 transformadas con el plásmido . La mayor porción de la proteina prM y E expresada por la células COS-1 transformadas con el plásmido pCBD2-14-6 (SEQ ID NO: 42) y por las células COS-1 transformadas con el plásmido pCB9D2-4-3 (SEQ ID NO: 4) permaneció enlazada a la membrana. El reemplazo del 20% de la secuencia que codifica la proteina E de DEN-2 E con la secuencia que codifica la secuencia de proteina E de JE correspondiente no tuvo efecto en la reactividad de los Mftbs. En la prueba, grupos de ratones recibieron dos inmunizaciones intramusculares de plásmidos seleccionados en las semanas 0 y 3, y la respuesta inmune se evaluó al determinar la neutralización especifica y el anticuerpo de ELISA. El plásmido que expresa prM y E secretadas, que puede formar partículas subvirales (SVPs), fue superior a otras construcciones en estimular una respuesta de anticuerpo.
Noventa por ciento de títulos de neutralización que varian de 1:40 a > 1:1000 se observaron de las 7 de 9 muestras de suero de ratones inmunizados con pCB8D2-2J-2-9-l . b. Importancia del virus de DEN-2 y las vacunas. La fiebre del dengue (DEN) es una infección aguda que surge en áreas subtropicales y tropicales. Es una de las enfermedades flavxvirales más importantes de los humanos. Como se mencionó más antes, existen cuatro serotipos de DEN distintos (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN- ) del virus del dengue. La infección con cualquiera de estos es usualmente ya sea asintomática o solamente ocasiona una enfermedad febril autolimitada conocida como fiebre del dengue (DF) . Sin embargo, en un pequeño porcentaje de casos, la infección por el virus del dengue da por resultado una enfermedad mucho más seria, fiebre hemorrágica por el dengue amenazante de la vida o síndrome de choque por el dengue (DHF/DSS) . Así, mientras que existen aproximadamente 100 millones de casos de la DF relativamente leve, mundial, anualmente que son de preocupación limitada, existe también un estimado de 500,000 casos de DHF/DSS hospitalizados, reportados anualmente. Para proteger contra esta enfermedad, una vacuna de DEN segura y efectiva contra todos los cuatro serotipos es requerida para la administración a niños y adultos no inmunes en las regiones endémicas y epidémicas de DEN. Las vacunas seguras deben minimizar el riesgo potencial de serias infecciones por los virus virulentos. Tales virus virulentos- pueden surgir por la reversión o recombinación del gen de algunos tipos de vacunas derivadas de virus de vacuna atenuados. Tales casos surgieron en la campaña de erradicación de poliovirus (Guillot y colaboradores, "Natural Genetic Exchanges_ bet eeü Vaccine and Wild Poliovirus Strains in Hu ans", J. Virol. 74: 8434-8443 (2Q00); Liu y colaboradores, "Molecular Evolution of a Type 1 ild-Vaccine Poliovirus Recombinant during idespread Circulation in China", J. Vlrolf 74: 11153-11161 (2000)). Además, la secuenciación genómica de una cepa americana de virus de la fiebre amarilla, TRINID79A, demuestra que existe similitud extensiva entre esta cepa y el virus de vacuna de la fiebre amarilla atenuado, FNV (Chang y colaboradores, "Nucleotide sequence varxation of the envelope protein gene identifies two distinct genotypes of yellow fever virus", J. Virol. 69: 5773-5780 (1995); Pisano y colaboradores, "Complete nucleotide sequence and phylogeny of an American strain of yellow fever virus, TRINID79A'?, Arch. Virol. 144: 1837-1843 (1999)). Mientras que no es conclusivo en y por si misma, la similitud fuertemente sugiere que TRINID79A es derivado del virus de la vacuna de FNV. El uso de vacunas basadas en DNA es un procedimiento de inmunización novedoso y prometedor para el desarrollo de vacunas para flavivirus (como es descrito en la presente, en Chang y colaboradores, "Flavivirus DNA vaccines: current status and potential", Ann. NY Acad. Sci. 951:272-285 (2001), y en referencias citadas en la misma). En este ejemplo, un número de vacunas de DEN-2 se produjeron y la respuesta inmune en los ratones después de la inmunización i.m. de las construcciones de DEN-2, se correlacionaron con la eficiencia de la secreción de prM/M y E. Una construcción que condujo a la secreción de cantidades significantes de los antigenos prM/M y E se mostró que es capaz de estimular altos títulos de anticuerpos de neutralización en ratones vacunados con el plásmido. c. Materiales y métodos. i. Cultivo de células y cepas de virus. Las células COS-1 (ATCC, Manassas, YA; 1650-CRL) se cultivaron a 37 °C con CO2 al 5% en medio esencial mínimo de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, GIBCO, Grand Island, NY) suplementado con suero de bovino fetal inacti ado con calor al 10% (FBS, Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT), piruvato de sodio lmM, aminoácidos no esenciales lmM, 30 ml/litro de NaHC03 al 7.5%, 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg ml de estreptomicina. Las células Vero y C6/36 se cultivaron bajo las mismas condiciones utilizadas para las células COS-1. El virus de Den-2, cepa 16681, se utilizó para la clonación de cDNA, ELISA de IgG y la prueba de neutralización de reducción en placa ( PRNT) . El virus se propagó en el cultivo de células C6/36. El virus utilizado para los estudios inmunológicos o bioquímicos se purificó mediante la precipitación con polietilenglicol al 7% (PEG-8000; Fisher Scientific, Fair La , NJ) seguido por la ultracentrifugación en los gradientes de glicerol al 30%-tartrato de potasio al 45% (Obijeski y colaboradores, "Segmented genome and nucleocapsid of La Crosse virus", J. Virol. 20:664-675 (1976) ) . ii. Construcción del plásmido. El RNA genómico se extrajo de 150 µ? del medio de cultivo de células C6/36 infectado con la cepa 16681 de DEN-2 utilizando el Kit QIAamp* Viral RNA (Qiagen, Santa Clarita, CA. ) - El RNA extraído se resuspendió en 80 µ? de agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC, Sigma, ST. Louis, MO) y luego se utilizó como un patrón en la amplificación de transcriptasa inversa-PCR (RT-PCR) de los genes prM y E del virus de DEN-2. Las secuencias cebadoras (Tabla 9) se diseñaron basadas en las secuencias publicadas (Gadkari y colaboradores, "Critical evalúation of Kyasanur Forest disease virus neutralizing antibodies found in bats (un reporte preliminar) ", Iridian J. Med. Res. 64: 64-67 (1976); Kinney y colaboradores "Construction of infectious cDNA clones for dengue 2 virus: strain 16681 and its attenuated vaccine derivative, strain PDK-53", Virology 230: 300-308 (1997)). El sitio de reconocimiento y segmentación para la enzima de restricción KasI se incorporó en el 5r terminal del amplicón de cDNA. Un codó de terminación en la estructura, seguido por un sitio de restricción Notl, se introdujo en el 3' terminal del amplicón de cDNA. El amplicón de cDNA del virus de DEN-2 se digirió con las enzimas KasI y Notl, y luego se insertó en los sitios KasI y Notl de un vector pCBJESS para formar el plásmido de 100% de DEN-2 E pCBD2-14-6 (SEQ ID NO: 2) . Para construir los plásmidos de 90% y 80% de DEN-2 E, el plásmido de 100% de DEN-2, pCBD2-14-6 (SEQ ID NO:42) y el plásmido de JE, pCBJEl-14 (SEQ ID NO: 17), se utilizaron como los patrones de PCR para amplificar la secuencia de DNA de DEN-2 y JE, respectivamente. Conjuntos de cebadores utilizados en las reacciones de amplificación para obtener los fragmentos del gen de DEN-2 y JE son litados en la Tabla 9. Los sitios de cebado T7 y SP6 son encontrados en el plásmido pCBamp, derivado del plásmido pCDNA-3 original (Invitrogen, Carlsbad, CA) , y se puede utilizar como sea deseado o como sea requerido. Los fragmentos de DNA amplificados con PCR para el gen de proteina E de 90% de DEN-2-10% de JE se digirieron con la endonucleasa de restricción BxtXI, se ligaron utilizando ligasa de DNA T4, se digirieron con la enzima KasI y Notl, y se insertaron en los sitios KasI y Notl del vector pCBJESS para obtener el plásmido pCB9D2-lJ-4-3 (SEQ ID NO: 4). Los fragmentos de DNA amplificados por PCR para el gen E de 80% de DEN-2-20% de JE se digirieron con Bs BI, se ligaron con ligasa de DNA de T4, se digirieron con la enzima Kasl y Notl y se insertaron en los sitios Kasl y Notl del vector pCBJESS para obtener el plásmido pCB8D2-2J-2-9-l (SEQ ID NO:46) - Representaciones esquemáticas de las tres construcciones de plásmido son mostradas en la Figura 7. las regiones de unión de la proteina E de 90% de DEN-2-10% de JE y la proteina E de 80% de DEN-2-20% de JE, respectivamente son mostradas en la Tabla 9. La secuenciación de DNA automatizada se realizó en un ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA) de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante. Los plásmidos recombinantes con las secuencias prM y E correctas se identificaron utilizando el análisis de secuencia. iii . Expresión transiente del antlgeno recombinante de DEN-2 en células CQS-1 por electroporación. Las células COS-1 se electroporaron por separado con cada plásmido de DEN-2 o el control de plásmido de expresión de proteina fluorescente verde (pEGFP, Clonetech, San Francisco, CA) utilizando el protocolo descrito en otra parte en los ejemplos y en Chang y colaboradores, (VA single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice", J.
Virol. 74: 4244-4252 (2000)). Las células electroporadas se sembraron sobre matraces . de cultivo de 75 cm2, y se mantuvieron a 37°C y CO2 al 5%. Seis horas después de la electroporación el medio de crecimiento se reemplazó con un medio de mantenimiento que contiene suero de bovino fetal al 2%. El medio de cultivo de tejido y las células se cosecharon por separado 48 horas después de la electroporación para la caracterización del antigeno. iv. Mapeo del epitope utilizando anticuerpos monoclonales específicos de E de DEN-2. Cuarenta y ocho horas después de la electroporación, las células adherentes fueron tripsinizadas, resuspendidas en PBS que contiene suero de cabra al 5%, manchadas en una placa de manchas de 12 cavidades y secadas con aire. Las células adheridas a la placa de manchas se fijaron con acetona durante 10 minutos a -20°C y se dejaron secar con aire. Los anticuerpos monoclonales (Mab) específicos de la proteina E se utilizaron para detectar la expresión de proteina mediante el ensayo de anticuerpo de inmunofluorescencia indirecta (IFA), como es descrito previamente (Tabla 10; Chang y colaboradores, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice", J. Virol. 74: 4244-4252 (2000)). v. Caracterización del antigeno de virus de DEN-2 recombinante. El medio de cultivo de tejido se cosechó 48 horas después de la electroporación. ELISA de captura de antigeno (Ag-captura) se. utilizó para detectar el antigeno de virus de DEN-2 secretado en el medio de cultivo de las células COS-1 transientemente transformadas. El Mab 4G2 y el MAb 6B6C-1 conjugado con pe oxidasa de rábano picante, se utilizaron para capturar los antigenos del virus de DEN y detectar el antigeno capturado, respectivamente (Chang y colaboradores, " single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in ice", J. Virol. 74: 4244-4252 (2000); Hunt y colaboradores, MA recombinant particulate antigen of Japanese encephalitis virus produced in stably-transformed cells is an effective noninfectious antigen and subunit immunogen", J. Virol. Methods. 97: 133-149 (2001)). Cuarenta y ocho horas después de la electroporación, las células transformadas para cada plásmido fueron tripsinizadas y resuspendidas en PBS como alícuotas que contienen 5 x 106 células. Estas muestras de células se procesaron para la extracción de proteina de membrana utilizando el kit de reactivo de extracción de proteina de membrana mamaria Mem-PER (Pierce, Rockford, IL) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. Las proteínas tanto hidrofóbicas como hidrofilicas son aisladas. Este procedimiento se desarrollo par el enriquecimiento de la proteina de membrana integral encontrada en la fase hidrofóbica. Las fracciones tanto hidrofóbicas como hidrofilicas fueron analizadas por ELISA de Ag-captura para el antigeno recombinante de DEN-2. El antigeno recombinante en el medio se concentró por precipitación con polietilenglicol (PEG) -8000 al 10%. El precipitante se resuspendió en solución reguladora de TNE (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, pH 7.5) a 1/100= del volumen original, se clarificó por centrifugación y se almacenó a 4.°C. El antigeno recombinante concentrado por la precipitación con PEG y resuspendido en la solución reguladora de TNE se extrajo con etanol al 4.0% para retirar el PEG residual (Hunt y colaboradores, "A recombinant particulate antigen of Japanese encephalitis virus produced in stably-transformed cells is an effective noninfectious antigen and subunit immunogen", J. Virol. Methods. 97: 133-149(2001)). Los antigenos extraídos con etanol, las proteínas de membrana hidrofóbica de las células transformadas y los viriones de DEN-2 purificados en gradiente, se analizaron sobre un gel de gradiente de Bis-Tris de 4-12%, en NuPAGE, en un Excel Plus Electrophoresis Apparatus* (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) , seguido por el electromanchado sobre membranas de nitrocelulosa utilizando una Excel Plus Blot Unit (Invitrogen Corp.). La proteina especifica del virus de DEN-2 se detectó por el manchado de western utilizando Mabs 1A6A-8 (especifico de E) y 1A2A-1 (especifico de capsid) específicos del virus de DEN-2, asi como el antisuero de conejo especifico para prM de DEN-2 y suero de ratón especifico para un péptido compuesto de 1-34 aminoácidos de la proteina M de DEN-2, y el fluido ascitico de ratón normal se utilizó como el control negativo (Murray y colaboradores, "Processing of the dengue viru¿ type 2 proteins prM y C-prM", J. Gen. Virol. 74 (Pt 2): 175-182 (1993); Roehrig y colaboradores, "Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus, Jamaica", Virology 246: 317-328 (1998)). iv. Vacunación del ratón. Grupos de diez ratones exogámicos ÍCR hembras de tres semanas se utilizaron en el estudio. Los ratones se inyectaron i.m. con pCBD2-14-6, PCB9D2-1J-4-3, pCB8D2-2J-2-9-1 o pEGFP en la semana 0 y la semana 3 en una dosis de 100 g en un volumen de 100 µ? por ratón. El DNA de plásmido se purificó de las células azules XL-l con EndoFree Plasmic Giga KitsMR (Qiagen) y se resuspendió en PBS, pH 7.5, a una concentración de 1.0 µg µl. Los ratones que recibieron 100 µg de pEGFP se utilizaron como controles vacunados con plásmido. Los ratones se sangraron cada 3 semanas después de la inyección, y la respuesta del anticuerpo especifico del virus de DEN-2 se evaluó mediante el uso de ELISA indirecta y PRNT. vii. Pruebas serológicas. Muestras de suero de pre-y pos-vacunación se probaron para la habilidad de enlace del anticuerpo al virión de DEN-2 purificado por ELISA, para la neutralización (Nt) del anticuerpo por PRNT, y para los anticuerpos que reconocen las proteínas del virus de DEN-2 purificadas por el manchado de Western. El PRNT se realizó con células Vero, como es descrito previamente (Chang y colaboradores, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevente Japanese enceph^litis in mice", J. Vizol. 74: 4244-4252 (2000)), utilizando el virus de DEN-2 (cepa 16681) y el virus de JE (cepa Nakayama) . Los puntos finales se determinaron en un nivel de reducción de placa al 90% (Hunt y colaboradores, MA recombinant particulate antigen of Japanese encephalitis virus produced in stably-transformed cells is an effective noninfectious antigen and subunit immunogen", J. Virol. Methods. 97: 133-149(2001)). d. Resultados i. Expresión transiente del antlgeno recombinante del virus de DEN--2. La expresión de los genes prM y E del virus de DEN-2 o un gen E quimérico de una combinación de secuencias de virus de DEN-2 y de JE (80% DEN-20% JE o 90% DEN-10% JE) se realizó por transformaciones separadas de cada uno de los tres plásmidos de DNA de DEN-2 recombinantes en células COS-1. El diseño del plásmido básico fue basado en resultados de estudios previos con plásmidos recombinantes del virus de JE y del virus de WN en el cual las células transformadas con el plásmido expresaron, y secretaron proteínas virales auténticas en el fluido de cultivo de células (Chang y colaboradores, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice", J. Virol. 74: 4244-4252 (2000)); Davis y colaboradores, "West Nile virus recombinant DNA vaccine protects nr-use and horse from virus challenge and expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked immunosorbent assays", J. Virol. 75: 4040-4047 (2001)). La expresión transiente de las proteínas recombinantes de Den-2 fue inicialmente estimada por la ELISA de Ag-captura de sobrenadantes del cultivo de células y por IFA de células COS-1 transformadas, fijadas por acetona (Chang y colaboradores, "A single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japanese encephalitis in mice", J. Virol. 74: 4244-4252 (2000)). El punto de la expresión óptima del antígeno se determinó que es 48 horas después de la electroporación. ii. Mapeo del epitope de la proteina E expresada por las células COS-1 transientemente transformadas. La proteina de DEN-2 expresada por cada uno de los plásmidos recombinantes se evaluó por IFA utilizando un panel de MAbs murino con reactividad conocida al virus de DEN-2 (Tabla 10; Henchal y colaboradores, "Epitopic analysis of antigenic determinants on the surface of dengue-2 virions using monoclonal antibodies", Am. J. Trop. Med. Eyg. 34: 162-169 (1985); Roehrig y colaboradores, "Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of t e dengue 2 virus, Jamaica", Vlr logy 246: 317-328 (1998)). El panel de MAb incluyó anticuerpos reactivos con cada uno de los tres dominios antigénicos de la proteina E de los flavxvirus asi como las proteínas prM y C (Mandl y colaboradores, "Antigenic structure of the favivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model", J. Virol. 63:564-571 (1989); Rey y colaboradores, "The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution", Nature 375: 291-298 (1995)). Los MAbs específicos para los Dominios 2 y 3 antigénicos del flavivirus mostraron reactividad cualitativa casi idéntica con el virus de DEN-2 y cada una de las tres proteínas expresadas por el plásmido. Uno de los MAbs específicos del Dominio 1, 1B4C-2, también mostró un patrón de reactividad similar con todas las proteínas expresadas. Sin embargo, dos de los MAbs específicos del Dominio 1, 2B3A-1 y 9A4D-1, fueron mucho menos reactivos con la proteina E expresada por los plásmidos pCBD2-14-6 y pCB9D2-U-4-3 como es mostrado por la titulación de punto final (valores entre paréntesis, Tabla 10) . La comparación de los títulos de punto final reveló la expresión deficiente aparente de los epitopes C3 y C4 en las construcciones que contienen 100% de DEN-2 E y 90% de DEN-2 E-10% de JE E- MAb 2H2, específico para prM, tuvo la misma reactividad con el antígeno expresado por todos los tres plásmidos. Anti-C MAb 1A2A-1 reaccionó bien con el virus de DEN-2 y tuvo reactividad no específica de bajo nivel con las proteínas virales expresadas por el plásmido, que incluyó prM y E, pero no C. iii. Comparación de la proteina secretada y la proteína enlazada a la membrana producida por cada uno de los tres plásmidos recombinantes de DEN-2. Cantidades similares de fluido de cultivo de células se cosecharon de las células COS-1, 48 horas después de la transformación para cada plásmido de DEN-2 recombinante . El antígeno recombinante secretado, encontrado en el fluido de cultivo se concentró 100 veces por la precipitación con PEG, seguido por la extracción con etanol para retirar el PEG que interfirió con el análisis subsecuente mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida . La cantidad relativa de antígeno secretado expresado por cada plásmido se determinó por el análisis de ELISA de Ag-captura de ambas preparaciones de fluido de cultivo de células precipitadas con PEG y extraídas con etanol (Tabla 11) . El antígeno secretado se detectó solamente de las células transfectadas con pCB8D2-2J-2-9-l (SEQ ID NO: 34), que contuvo los genes 80% de DEN-2 E y 20% de JE E. Los plásmidos recombinantes que contienen cualquiera de los genes de 100 % de DEN-2 E o 90% de DEN-2 E-10% de JE E no produjeron antigeno detectable por ELISA en el fluido de cultivo, a pesar de los esfuerzos para concentrar la proteina expresada . El análisis de manchado de Western también se utilizó para evaluar la producción del antigeno secretado por cada uno de los plásmidos recombinantes de DEN-2. Para propósitos de comparación, volúmenes equivalentes del sobrenadante de cultivo de células extraido con etanol, precipitado con PEG, se corrieron en geles de gradiente de ' NuPAGE, se electromancharon con nitrocelulosa y se analizaron utilizando MAbs o antisueros policlonales capaces de reaccionar con todas las proteínas estructurales de DEN-2 (Figura 8A) . El análisis de manchado de Western mostró mayor sensibilidad en la detección del antígeno recombinante que la ELISA de Ag-captura, puesto que las proteínas específicas de DEN-2 se detectaron en el fluido de cultivo de dos de los plásmidos, pCB8D2-2J-2-9-l y pCB9D2-U-4-3 (SEQ ID NO: 6 y 44, respectivamente) . El plásmido pCB8D2-2J-2-9-l (SEQ ID NO: 46) expresó la cantidad "más grande de antígeno secretado que se mostró que está compuesto de las proteínas E, prM y M. Relativamente menos antígeno secretado se produjo por pCB9D2- 1J-4-3 (SEQ ID NO: 44) y niveles escasamente detectables se encontraron para la preparación de pCBD2-14-6 (SEQ ID NO:42), que apareció para contener proteína E relativamente menos expresada, especialmente si la reactividad no específica del MA especifico de E, 1A6A-8, sobre el pEGFP de control se tomó en consideración (Figura 8A, franjas a, b para 14-6 y GFP) . Puesto que E, prM y M son las proteinas asociadas con la membrana por toda su síntesis intracelular, cualquier estimación de la expresión de estas proteínas por los tres plásmidos de DEN-2 recor±>inantes, debe incluir una evaluación de las preparaciones de membrana celular de las células transformadas con el plásmido. El kit de Reactivo de Extracción de Proteína de Membrana Mamí fera Mem-PER (Pierce) se utilizó para aislar las proteínas de membrana integral de un número equivalente de células transformadas por cada uno de los plásmidos recombinantes . Las proteínas hidrofóbicas se separaron de las proteínas hidrofílicas por la partición de fases . El análisis preliminar por la ELISA de Ag-captura indicó que la fracción de proteína hidrofílica no fue reactiva; sin embargo, las fracciones de proteína hidrofóbica de las células COS-1 transformadas con cada uno de los plásmidos de DEN-2 recombinantes tuvo títulos similares en las pruebas de ELISA (Tabla 11) . Estos resultados indicaron que el antígeno recombinante codificado por todos los tres plásmidos se expresó después de la transformación, pero que los antígenos recombinantes expresados no fueron todos secretados al mismo nivel. La confirmación de los resultados de la Ag-captura para las fracciones de proteina hidrofóbica, se realizó por el manchado de western (Figura 8B) . Volúmenes equivalentes de fracciones de proteina hidrofóbica de cada una de las células transformadas por el plásmido se diluyeron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida para reducir la banda la distorsión de la franja. El inmunomanchado con Mtós específicos de E, prM, C y M o los antisueros policlonales demostraron que todos los tres plásmidos de DEN-2 recombinantes indujeron la producción de cantidades similares de antigeno recombinante compuesto de E y prM. Nada de proteina M fue detectada, ya sea debido a que no fue procesada del prM o debido a que los niveles fueron demasiados bajos para ser detectados. A pesar de los esfuerzos para reducir la distorsión de la banda, altos niveles de detergente en las muestras de proteina hidrofóbica aparentemente ocasionaron que E y prM corran en una manera ligeramente aberrante (más lenta migración) comparada con las muestras sin tales concentraciones altas de detergentes ¦ (comparar la migración de E y prM en las Figuras 8A y 8B) . iv. Comparación de la respuesta inmune en los ratones vacunados con tres plásmidos de DNA recombinantes de DEN-2. Ratones ICR de tres semanas se inmunizaron mediante la inyección i.m. con 100 g de pCB8D2-2J-2-9-l (SEQ ID NO:46), pCB9D2-lJ-4-3 (SEQ ID NO:44), pCBD2-14-6 (SEQ ID NO:42), O pEGFP en las semanas O y 3. Los ratones se sangraron 3/ 6 y 9 semanas de la inmunización primaria- Los sueros individuales y acumulados se probaron por ELISA indirecta, utilizando diluciones de clasificación de 1:100 y 1:400 en 3 y 6 semanas después de la vacunación y las titulaciones de punto final en 9 semanas después de la vacunación. Sueros de nueve semanas también se probaron por PRNT con ambos virus de DEN-2 y JE. Los resultados de ELISA mostraron que después de una inmunización (sueros de 3 semanas), a todos los ratones que se les dió pCB8D2-2J-2-9-l se han seroconvertido, mientras que solamente 50% de los ratones vacunados con pCB9D2-U-4-3 y 20% de ratones vacunados con pCBD2-14-6 reaccionaron con el virus de DEN-2 (Tabla 12) . Mediante la posvacunación de 9 semanas, todos los ratones vacunados con pCB8D2-2J-2-9-1 o pCBD2-lJ-4-3 demostraron reactividad de ELISA anti-DEN-2; sin embargo, los titulos promedio geométricos difirieron significativamente (titulos de 1:20,000 contra 1:708, respectivamente) . Solamente 40% de los ratones inmunizados con pCBD2-14-6 tuvieron titulos. de ELISA anti-DEN-2 mayores que 1:100. Un manchado de western de suero acumulado de 9 semanas de ratones inmunizados con pCB8D2-2J-2-9-l en el virus de DEN-2 purificado, mostraron que la respuesta inmunodominante fue para la glicoproteina E. También se detectó ligera reactividad a prM y M. Más significativamente, en términos de la evaluación del potencial de vacuna de los tres plásmidos de DEN-2, la inducción del anticuerpo neutralizante del virus en 7 de 9 ratones - inmunizados con pCB8D2-2J-2-9-l (SEQ ID NO: 46), se observó basada en un punto final de reducción de placa del 90% (Tabla 10) . Sin embargo, si se utiliza un punto final de neutralización del 50%, entonces todos los 9 de los 9 sueros tienen títulos PRNT de 3 1:40. Títulos de neutralización del 90% variaron de 1:40 a > 1:1000 para los 7 sueros con actividad neutralizante. Ninguno de los ratones inmunizados con pCB9D2-U-4~3 produjeron anticuerpo neutralizante, y solamente 1 de los 10 sueros de los ratones vacunados con pCBD2-14-6 neutralizó el virus, pero a un titulo de solamente 1:8. Puesto que dos de los plásmidos recombinantes, específicamente pCB9D2-U-4-3 (SEQ ID NO: 44) y pCB8D2-2J-2-9-1 (SEQ ID NO: 6), contuvieron secuencias del gen E del virus de JE, todos los sueros también se evaluaron para la presencia de la actividad neutralizante del virus de JE. Sin embargo, nada de tal actividad se detectó en el punto final de neutralización del 90% para los ratones en cualquiera de los grupos de inmunización. Sin ser sorprendente, los ratones inmunizados con el plásmido de control pEGFP no mostraron reactividad a cualquiera de los virus de DEN-2 o JE. e. Discusión. Las mismas etapas utilizadas más antes para las vacunas de JE y de WN se utilizaron inicialmente para construir un plásmido de DEN-2 recombinante, pCBD2-14-6 (SEQ ID NO: 2), que consiste de la región auténtica del gen prM y E de DEN-2. El mapeo antigénico de las proteínas de ???-2, expresadas por las células COS-1 transformadas por este plásmido, utilizando un panel de MAb por IFA, indicó que la proteina prM y E tuvo una intensidad fluorescente compatible y una reactividad de MAb similar como las células infectadas por el virus (Tabla 10) . Sin embargo, estas células COS-1 transformadas por el plásmido que codifica una región auténtica de prM y E de DEN-2 no lograron secretar antigeno de DEN-2 detectable en el fluido de cultivo (como es medido por ELISA de captura de antigeno) . Además, la vacunación utilizando el plásmido que codifica una región auténtica de prM y E de DEN-2 no logró estimular el anticuerpo neutralizante del virus anti DEN-2 en ratones inmunizados i.m. (Tabla 13). De manera interesante, la transformación de las células por pCBD2-14-6 dió por resultado un manchado fluorescente globular puntuado que sugirió que el C-terminal de la proteina E del DEN-2 puede contribuir a esa señal de retención de membrana de la proteina. Este patrón de manchado de IFA no se observó en cualquiera de las células transformadas con la construcción de JE o WN (chang y colaboradores, WA single intramuscular injection of recombinant plasmid DNA induces protective immunity and prevents Japánese encephalitis in ice", J.
Virol. 74: 4244-4252 (2000)); Davis y colaboradores, "West Nile virus recombinant DN vaccine protects mouse and horse from virus challenge and exprésses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme-linked inmunosorbent assays", J. Virol. 75: 4040-4047 (2001)). Por lo tanto, en vista de la observación hecha de acuerdo con las enseñanzas de la presente solicitud, dos plásmidos adicionales, pCB9D2-U-4-3 (SEQ ID NO: 44) y pCB8D2-2J-2-9-1 (SEQ ID NO: 6), en los cuales la manipulación apropiada de la secuencia de DNA se hizo para 10% o 20% de E C-terminal del DEN-2 que es reemplazada con la región correspondiente de la proteina E del virus de JE, respectivamente. La efectividad relativa de las diferentes construcciones en la estimulación del anticuerpo de ELISA anti-DEN-2 detectable en ratones vacunados, es mostrada en la Tabla 13. Estos resultados son consistentes con el modelo de que interacciones entre prM y E pueden influenciar el proceso de ensamble y secreción de partícula. El soporte para este modelo se puede encontrar en un estudio del virus de encefalitis portado por garrapatas que putativamente sugiere que las interacciones entre la prM y el ectodominio de E están involucradas en el transporte intracelular mediado por prM del prM-E, asi, la secreción de las partículas similares del virus (Allison y colaboradores, "Mapping of functional elements in the stem-anchor región of tick-borne encephalitis virus envelope protein E", J. Virol. 73: 5605-5612 (1999)). En el presente ejemplo, el reemplazo de una porción C-terminal de la proteina E de DEN-2 con la proteina E de JE, correspondiente a TBE Hlpred a TM2, dio por resultado la secreción de la proteina prM de DEN-2 y la proteina E quimérica. Sin embargo, en contraste, el reeisplazo de ?? y TM2, en TBE, ocasionó solamente una mejora menor en la secreción del antigeno. La mayor porción de la proteina prM y E expresada por cualquier COS-1 transformada por el plásmido pCBD2-14-6 y pCB9D2-4-3 permaneció enlazada a la membrana (Tabla 13) . Estos resultados indicaron que una secuencia de retención de membrana no identificada está localizada en la región de tronco C-terminal de la proteina E de DEN-2. La sustitución de esta región de tronco C-terminal con la secuencia del virus de JE retira o hace inefectiva esta secuencia de retención. Ha sido averiguado por otros que la proteina prM es esencial para mantener la conformación apropiada y la secreción de la proteina E durante la maduración de prM-E (Aberle y colaboradores, "A DNA immunization model study ith constructs expressing the tick-borne encephalitis virus envelope protein E in different physical forms", J. Immunol. 163: 6756-6751 (1999). Allison y colaboradores, "Synthesis and secretion of recombinant tick-borne encephalitis virus protein E in soluble and particulate form", J. Virol. 69: 5816-5820 (1995) . Además, también se ha demostrado que el ectodominio de la proteina E interactúa con prM. Esta interacción se ha estimado que involucra la secuencia de aminoácidos dentro de los residuos de aminoácidos 200-327 de E en el virus de encefalitis de Murray Valley (Guirakhoo y colaboradores, "The Murria Valley encephalitis virus prM protein confers acid resistance to virus partióles and the expression of epitopes within the R2 domain of E glycoprotein", Virology 191: 921-931 (1992)). Las interacciones apropiadas de prM y E y la integridad retenida de la estructura de la proteina É son probablemente mantenidas en la proteina expresada por todas las tres construcciones de DEN-2, por lo menos en cuanto a como son requeridas para la inmunoreactividad. Además, el reemplazado del 20% de E del C-terminal en el pCB8D2-2J-2-9-l dio por resultado una proteina que mantuvo 395 aminoácidos de la E auténtica del DEN-2. Cualquier modificación de tal clase se espera que tenga influencia mínima en las interacciones de E y prM-E y su influencia en la naturaleza antigénica de la proteina E quimérica. Como el reemplazo de la región C-terminal de la E de DEN-2 con la secuencia de fijación al tronco JE no tuvo efecto en la reactividad de MAbs (Tabla 10), la retención de la secuencia de DEN-2 asi reemplazada solamente puede ser opcional en alcanzar una respuesta inmunológica especifica del DEN-2.
Previamente, se ha mostrado que una construcción de plásmido que codifica una partícula subviral secretada de la proteina prM y E del virus de encefalitis portado por garrapatas fue superior, en términos del grado y la funcionalidad de la respuesta del anticuerpo y en términos de la respuesta a la estimulación del virus, a otras construcciones que codificaron el dimero E soluble C-terminalmente truncado que fue secretado, . E de longitud completa que no fue secretada, o una E truncada que no fue eficientemente secretada (Aberle y colaboradores, "A DNA immunization model study with constructs expressing the tick-borne encephalitis virus envelope protein E in different physical forms", J. Immunol. 163: 6756-6751 (1999)). Sin embargo, aqui los solicitantes han demostrado que la potencia de vacuna del DNA del DEN-2 está correlacionada con la secreción de prM/M y E (Tabla 13) . La morfología y el carácter fisico de la prM y E secretadas no se demostraron en este estudio. Sin embargo, la rpM y E, secretadas por la construcción pCB8D2-2J-2-9-l, probablemente forma una partícula de similitud viral. Se cree que la presentación de múltiples antigenos protectores sobre la superficie de la partícula mejora la potencia de vacuna de esta construcción. Intentos previos para el desarrollo de la vacuna de DNA del virus de DEN-2 han dado por resultado grados variables de éxito (Kochel y colaboradores, "Inoculation of plasmids expressing t e dengue-2 envelope gene elicit neutralizing antibodies in mice", Vaccine 15: 547-552 (1997); Konishi y colaboradores, "A DNA vaccine expressing dengue type 2 virus premembrane and envelope genes induces neutralizing antibody and meraory B cells in mice", Vaccine 18: 1133-1139 (2000)). Para mejorar el nivel de efectividad, se han adoptado diferentes estrategias. Por ejemplo, se ha utilizado la coinmunización de la porción CpG inmunoestimuladora que contiene el plásmido pUCl9, plásmido que expresa GM-CSF murino en el régimen de vacuna, o que reemplaza el aminoácido 43 C-terminal de E con la secuencia de retención de membrana asociada con el lisosoma que mejoró la respuesta del anticuerpo a la vacuna de DEN-2 (Porter y colaboradores, "Protective efficacy of a dengue 2 DNA vaccine in mice and the effect of CpG immuno-stimulatory motifs on antibody responses", Arch. Virol. 143: 997-1003 (1998); Raviprakash y colaboradores, "Synergistic Neutralizing Antibody Response to a Dengue Virus Type 2 DNA Vaccine by Incorporation of Lysosome-Associated embrane Protein Sequences and Use of Plasmad Expressing GM-CSF", Vizology 290: 74-82 (2001)). Porciones CpG no metiladas directamente activan los macrófagos, las células exterminadoras naturales y los linfocitos para secretar citocinas y quimiocinas, y soportan el desarrollo de las respuestas inmunes mediadas por la citocinas Thl (Manders y colaboradores, "Immunology of DNA vaccines : CpG motifs and antigen presentation", Inflamm. Res. 49: 199-205 (2000)). Sin embargo, la inclusión de la CpG podria desviar el perfil de citocina del huésped y de esta manera contribuir a tanto el desarrollo de los desórdenes autoinmunes específicos del órgano mediados por Th-1 como interferir con la homeostasis inmune (Smith y colaboradores, "The regulation of DNA. vaccines", Curr. Opin. Biotech. 12: 299-303 (2001))- También existe evidencia en los ratones de que los niveles en exceso de citocina, aunque incrementan la respuesta de ciertas células T-ayudantes, pueden disminuir o suspender la respuesta de otros actores en la respuesta inmune, conduciendo a la inmunosupresión generalizada o la inflamación crónica (Robertson y colaboradores, "Assuring the quality, safety, and efficacy of DNA vaccines", Mol. Biotechnol. 17: 143-149 (2001)). Correspondientemente, la seguridad y eficacia de la inmunización de DNA de flavivirus podria ser beneficiada por la manipulación de un plásmido de expresión para aumentar la transcripción y traducción y la dirección de las proteínas de prM y E para la secreción que promueve el procesamiento y el ensamble correctos de la poliproteina (Chang y colaboradores, "Flavivirus DNA vaccines: current status and potential", Ann. NY Acad. Sci. 951: 272-285 (2001)). Mejoras futuras podrían ser enfocadas en aumentar la captación de DNA por las células que presentan antigeno o por las células del músculo (Rodríguez y colaboradores, "Enhancing DNA iinmunization", Virology 268 233-238(2000)).
Tabla 1. Expresión transiente de la3 proteinas prM y E de JE por varios plásmidos recombinantas en dos lineas de células transfe idas.
Intensidad de Vector Plásmido IFA/porcentaje de recoinbinante células positivas de antigeno* Promotor Intrón Poli (A) ORI COS-1 COS-7 pCDNA3 CMV No BGH SV40 pCDJE2-7 3+/40 3+/35 pCBamp CMV No BGH No pCBJEl-14 3+/45 nd pClBamp CMV Si BGH No PC1BJES14 3+/39 1 nd pCEP CMV No SV40 OriP pCEJE 2+/4 2+/3 pREP4 RSV No SV40 OriP pREJE 1+/3 1+/2 '. pRe/RSV RSV No BGH SV40 pRCJE 1+/3 1+/3 pCDNA3 CMV No BGH SV40 pCDNA3/CAT - - *Varias líneas de células se transformaron con pCDNA3/CAT (control negativo), pCDJE2-7, pCBJEl-14, pClBJES14, pCEJEm pREJE, o pRCJE . Las células son tripsinizadas 48 horas después y probadas por un ensayo de anticuerpo inmunofluorescente indirecto (IFA) con HIAF específico del virus de JE. Los datos son presentados como la intensidad (escala de 1+ a 4+) y el porcentaje de células positivas de IFA- Las células transformadas con pCDNA3/CAT se utilizaron como el control negativo.
Tabla 2. Caracterización de las proteinas expresadas por un clon (JE-4B) establemente transformado con pCDJE2-7 de las células COS-1 con los anticuerpos reactivos al virus de JE.
Anti-JEV 4+ 3+ Anti-WEE — — PBS - - Tabla 3. Persistencia de la respuesta inmune en ratones inmunizados con pCDJE2-7 o con la vacuna JE-VEX. Los ratones se inocularon con un 1 o 2, dosis de 100 de DNA de plásmido, o 1/5 de dosis humana de la vacuna JE-VAX. Los sueros son recolectados para la prueba antes de la segunda inmunización. *Titulos de suero individuales.
Tabla 4. La proporción seroposltxva en por ciento dependiente de la edad en ratones después de la vacunación con varias vacunas de JEV. 3 dias de edad 3 semanas de edad 3 semanas pV 7 semanas PV 3 semanas PV 7 semanas PV JE-VAX 0 0 100 100 PCDNA3/CAT 0 0 0 0 pCDJE2-7 40 60 90 90 PC1BJES14 10 60 80 100 pCBJEl-14 80 100 100 100 Tabla 5. Protección de la estimulación con el JEV en ratones de 8 semanas de edad después de la vacunación en 3 dias de edad con varias vacunas de JEV.
Seroconversión Proporción de supervivencia en los Vacuna en la pre- dias después de la estimulación (%) estimulación 6 7 8 9 21 con JEV JE-VAX 0 100 100 60 40 40 pCDNA3/CAT . 0 100 80 30 30 30 pCDJE2-7 60 100 100 100 100 100 PC1BJES14 60 100 100 100 100 100 pCBJEl-14 100 100 100 100 100 100 Tabla 6. Evaluación de la habilidad del anticuerpo maternal de los ratones hembra vacunados con JEV-ácido nucleico para proteger a sus crias de la encefalitis de JBV fatal.
Los ratones se inocularon intramuscularmente con 1 o 2, dosis de 100 ig de DNA de plásmido, o subcutáneamente con dos, 1/5 de dosis humana de la vacuna JE-VAX. Los sueros se recolectaron 9 semanas después de la vacunación para la prueba de PRNT antes del apareamiento con el macho no inmune.
No. de supervivientes/total para cada carnada. Número de animales positivos al anticuerpo por ELISA de JEV (Título = 1:400) /No. de supervivientes; los sueros se recolectaron para la prueba 12 semanas después de la estimulación.
Tabla 7. Característica de los p ptidos de señal y su vacuna de potenciales entre las construcciones de vacuna de DNA de flavi irus Probabilidad* de Péptido de seÁal Plásmido Secuencia de péptido de señal que SP AP . Sitio C Protocolo de precede a la proteína prM inmunización/protección o pSLEl ?LDTINR PS KRGGTRSLLGLAALIGLASS/LQLLSTYQ3G ( SEQ ID NO:32) 0.702 0.292 0.352 im x 2/Parclal pJME 0.998 0.000 0.778 im x 2/Parcial MWLAS1AWIACAGA/M LSNFQGK(SEQ ID NO:33) 15 pCJEME MNBGSIMWLASLAWIACAGA/MKLSNFQGKtSEQ ID NO: 34) 0.985 Ó.012 0.785 im x 2/100% pCBJEl-14 MG^QNraGGN GSIMWLASLAVVIACAGA/ KLSNFQGK(SEQ ID NO:35) 0.791 0.199 0.623 im x 1/100% pcDNA3prM-E MSK RGGSBTSVLMVI FMLIGFAAA/LKLSNFQGK ( SEQ ID NO: 36) 0.721 0.277 0.622 im x 4/Parcial gg x 2-4/100% pCBWN MGKRSAGSIMWLASLAWIACAGA/VTLSNFQG iSEQ ID NO:37) 0.976 0.024 0.526 im x 1/100% pl012D2ME MNVIJ¾GFR »IGRHLNILNRRRRTAGMIIMLI PTVMA/ FHLTTRNGE ( SEQ ID NO:38)0.165 0.778 0.164 id X 2/Ninguna SV-PE MVGLQ RGKRRSATDWMSWLLVI LLGMTLA/A VRKKRGD( SEQ ID NO: 39) 0.943 0.056 0.899 im o gg x 2/100% I pW G7077- MGWLLWVLLGV LA/ATVRKBRGD( SEQ ID NO: 40) 1.000 0.000 0.912 gg x 2/100% RSSE pWRG7077- MSWLLVITLLGMTlA/ATVRKERGD( SEQ ID NO:41) 0.999 0.000 0.821 gg x 2/100% CEE * el programa SignalP HMMM se aplicó para calcular las probabilidades de péptido de señal (SP) , péptido fijador (AP) y sitio de segmentación de señalasa (sitio C) . Se utilizaron códigos de un solo aminoácido, y los aminoácidos cargados fueron resaltados por letras en negritas-subrayadas. El sitio de segmentación de señalasa que separa SP y prM es indicado por "/". Las vacunas de DNA se inocularon por el método intramuscular (im), intradérraico (id), o de disparo de gen (gg) .
Tabla 8. Respuestas del anticuerpo neutralizante (Nt) ¦ en ratones inmunizados con diferentes dosis de las vacunas de DKA. de virus de WN y de JE combinadas. pCBWN + pCDJEl-14 Control pCB Dosis por plásmido (pg) 10C + 100 40 + 40 20 + 20 10 + 10 100 Porcentaje de ratones con Nt: Virus de WN/virus de JE: 100 / 100 100 / 70 70 / 0 60 /0 0 / 0 Rango del titulo de P NT90: Virus de WN: 1:320-1:80 1:80-1:20 1:80-<1:10 1:20-<1:10 <1:10 Virus de JE: 1:40-1:10 1:10-<1:10 <1:10 <1:10 <1:10 Grupos de diez ratones exogámicos ICR hembras de tres semanas de edad, se inyectaron i.m. con una sola dosis de DNAs de plásmido combinados como es indicado. Las muestras de suero recolectadas 12 semanas después de la inmunización, se analizaron por la prueba de neutralización de reducción en placa (PRNT) . Los títulos de punto final contra el virus de JE y de WN se calcularon basados en 90% de reducción de placa utilizando el virus de JE (cepa SA-14) y virus de West Nile (cepa NY-6480), respectivamente.
Tabla 9. Oligonucleótidos utilizados para construir los plásmidos de expresión de prM-E del virus de DEN-2 , y la región de unión del DEN-2 quimérico y JE E indicado . 100% DEN-2 prM-E: [ D2 8SI- 38* V Tf¾ ¾ AGGOGCCl CCATITAACXlACACGTAA (SB0IPN0 8) CD2NOÜ-2402 S* TCGAGCGGCGGCTCAACTAATTAGCXXnGCACCATGkCtC (SE01DNO:4¾ 90% DEN-2 E & 19% JE E: ~~ ~T7 5' CTTATCGAAATTAATACGACrCACrATAOQ (SEQ ID NO50) CD23stXI-224 5' ATAGATTGCTC<^AACACT7TGCTGG (SEQIDNO:51) JE-2281 5' ACTa^TAGOAAAAGCCGTTCACC (SEQ ID NO.52) CSP6 5*GCGAGCTCTAGCATrTAGGTGACACATAG (SEQ ID NO.S3) 90-lOUmón : Leu BJS Gbi Val Phe Gtj Gly Ala Phe Arg Thr (S£QH)NO:55) CTC CAC CAA GTG TTT GGT GGT GCC TTC AGA ACA (SEQ ID NCfc54) 80% DEN-2 E & 20% JEE: ~T7 5- CITATCOAAATTAATACGACTCACTATAGG (SEQ ID ?s.56) : CD2BíroBI-20 7 51 GAATTC£7£^ACTTCClTrOT (SEQ ID NO:57) JEBsmBl-2175 y OGAATTCCTC7tX-GAAGCACOCIOGGCAAOO (SEO ID NCh58¾ CSP6 5" QCGAOCTCTAGCA TTAGGTGACACTATAG 3' (SEQ ID Ck59) DEN-2** *JE 80-20Unión : A«n Trp Lya Lys Gly Ser Thr Leu Gly Lyi Ala (SEQ ?) NCH61) AACTGG TTT AAGAAA GGA AGC ACG CTG GGC GCC (SEQ H) NO¡60) Los sitios de enzima de restricción codificados en oligonucleótidos fueron resaltados por las letras en negritas, en cursiva y subrayadas.
Tabla 10. Caracterización de los epitopes de glicoproteina de DEN-2 E expresados por los plásmidos de DEN-2 recombinantes como es determinado por el ensayo de anticuerpo fluorescente indirecto (IFA) .
Anticuerpo Controles8 Construcción de plásmído" MAb Dominio PRNTd Células Células pCBD2-14-6 pCB9D2-U-4-3 pCB8D2-2J-2 (Epitope)" Antigénicoc infectadas normales con DEN-2 4G2 (Al) 2 +/- 4+ 4+ 4+ 4+ 4E5 (A2) 2 Si 3+ 3-4+ 3-4+ 2-3+ 1B7 (A5) 2 Si 3-4+ 4+ 4+ 2-3+ 1B4C-2 (Cl) 1 No 3-4+(8000) 2-3+(4000) 2-3+(4000) 2-3+(8000) 2B3A-1 (C3) 1 No 3-4+(=3200) 3+(100) 2+(100) 2-3+(=3200) 9A4D-MC4) 1 No 3-4+ 2-3+(400) l-3+(400) 3+(=12800) 3H5(B2) 3 Si 4+ 4+ 4+ 4+ 10A4D-2(B3) 3 Si 2-3+ 3-4+ 3-4+ 2-3+ 1A1D-2(B4) 3 Si 4+ 3-4+ 4+ 3-4+ 9D12-6 Si 2-4+ 2-3+ 2-3+ 3-4+ 2H2 prM No 4+ 4+ 3-4+ 3-4+ 1A2A-1 Capsid No 2-3+ 1+ 2+ 1-2+ "Los sustratos de IFA fueron células COS-1 fijadas con acetona, ya sea infectadas con DEN-2 16681, controles no infectados, o transformadas con un plásmido recombinante de DEN-2. bLos anticuerpos monoclonales se utilizaron a una dilución óptima predeterminada basada en la reactividad con el virus de DEN-2 16681. Para algunos Abs. los títulos de punto final, mostrados entre paréntesis, son reportados y para otros, solo valores cualitativos son reportados basados en una escala de 1+ a 4+, con 3-4+ considerado positivo, 2+ ambiguo y 1+ negativo. cDominios antigénicos basados en la E-glicoproteina del virus de TBE (Mandl y colaboradores, "Antigenic structure of the flav virus envelope protein E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model", J. Virol. 63: 564-571 (1989); Rey y colaboradores, "The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution", Wature 375: 291-298 (1995)). dActividad de neutralización de reducción en placa a una dilución de 1:100 de fluido ascitico, utilizando un punto final de reducción en placa de 90%, excepto para 4G2 y 9D12-6, para el cual es reportado un punto final de neutralización del 50% (Henchal y colaboradores, "Epitopic analysis of antigenic determinants on the surface of dengue-2 virions using monoclonal antibodies", Ara. J. Trop. Afed. Hyg. 34: 162-169 (1985); Roehrig y colaboradores, "Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus, Jamaica", Virology 246: 317-328 (1998)).
Tabla 11. Detección de la proteina recombinante de DEN-2 enlazada a la membrana y secretada, por ELISA de captura de antigeno. ' Plásmido Tipo de muestra Titulo de ELISA de punto final pCBD2-14-6 Fluido de cultivo precipitado con PEGa pCBD2-14-6 Fluido de cultivo extraído con etanol, precipitado con PEGb pCBD2-14-6 Preparación de la proteina de membrana hidrofóbica0 pCB9D2-U-4-3 Fluido de cultivo precipitado con PEGa PCB9D2-1J-4-3 Fluido de cultivo extraído con etanol, precipitado con PEGb PCB9D2-1J-4-3 Preparación de la proteina de membrana hidrofóbica0 PCB8D2-2J-2-9-1 Fluido de cultivo precipitado con PEGa PCB8D2-2J-2-9-1 Fluido de cultivo extraído con etanol, precipitado con PEG pCB8D2-2J-2-9-l . Preparación de la proteina 1:80 de membrana hidrofóbica0 pEGFP Fluido de cultivo <1:10 precipitado con PEGa pEGFP Fluido de cultivo <1:10 extraido con etanol, precipitado con PEGb pEGFP Preparación de la proteina <1:10 de membrana hidrofóbicac aEl sobrenadante del cultivo de las células transformadas con plásmido se precipitó con polietilenglicol (PEG) al 10% y se resuspendió en 1/1002 de volumen original. bEl sobrenadante del cultivo precipitado con PEG se extrajo con etanol al 4% para retirar el PEG y la pelotilla se resuspendió en 1/5 del volumen extraido. cLas fracciones de la membrana hidrofóbica se prepararon como es descrito en Materiales y Métodos.
Tabla 12. Inmunoganlcidad de tres plásmldos reconiblnantes de DEN-2 en ratones ICR. ELISA sobre el virus DEN-2 PRNT sobre el PRNT sobre el Clasificación 3 Casificación 6 virus de DEN- virus de JE* semanas, p.v.c semanas, p.v.° 2» Titulo de punto final 9 Titulo de Titulo de DNA de plásmido" Ratón # 1:100 1:400 1:100 1:400 semanas, p.v. punto final 9 punto final 9 semanas, p.v. semanas, p.v. pCB8D2-2J-2-9-l Acumulación NDd ND + + ' 64,000 ND ND 1,2,4,-10 1 ¦H + + + 6 .000 >1000 <2 2 + + + + 32,000 >1000 <2 4 + + + + 16,000 200 <2 5 + + + + 4,000 <10 <2 6 + + + + 16,000 200 <2 7 + - + + 64,000 100 <2 8 + - + + 8,000 40 <2 9 + + + 6, 400 <2 <4 10 + + + + 64,000 >1000 <2 PCB9D2-1J-4-3 Acumulación ND ND + + 1,000 ND <2e 1-10 1 - - + - 400 <10 ND 2 + - 200 <10 ND 3 + + + 4, 000 <2 =4 4 + - + - 200 <10 ND 5 - - + + 400 <10 ND 6 + + + + 4, 000 <2 2 7 - +/- - - 100 <10 ND 8 - - - _ 200 <10 ND 9 + - + - 4,000 <2 <2 10 - - + + 4, 000 <2 <2 pCBD2-14-6 Acumulación ND ND + 200 <2f <29 1-10 1 - _ _ 400 <10 ND 2,3,6-9 - - - <100 ND ND 4 + + + + 1,000 <2 <2 5 - - + - 2,000 8 <2 10 + - - - <100 ND ND PEGFP Acumulación - ND - ND <100 <2 <2 1-10 aPRNT, prueba de neutralización de reducción en placa, punto final de neutralización del 90%. bLos ratones se inmunizaron intramuscularmente con 100 pg de DNA de plásmido en las semanas 0 y 3. cLas clasificaciones de ELISA utilizaron sueros diluidos 1:100 y 1:400. dND, no hecho. "Acumulación, 1,2,4,5,7,8. Acumulación, 2,3,6-10. Acumulación, 1-3,6-10.
Tabla 13.Sumario de las características de tres plásmidos recombinantes de DEN-2. aCaracterísticas de manchado del ensayo de anticuerp fluorescente indirecto (IFA), + o -, y patrón difuso globular. bTítulo de ELISA anti-DEN-2 de suero de ratones inmunizados con los plásmidos recombinantes. Los sueros se recolectaron 9 semanas después de la vacunación (semanas 0 y 3) . Se muestra el número de ratones con el título de =1 :100/número total de ratones, que incluye el título de ELISA de punto final de la muestra de suero acumulada. cNumero de ratones con títulos de neutralización de reducción en placa (PRNT, reducción 90%) 1 : 10/número total de ratones. Los sueros se recolectaron 9 semanas después de la vacunación. dDe los 7 ratones con anticuerpo neutralizante, 3 ratones tuvieron títulos de PRNT de >1:1000, 3 tuvieron títulos de =1:100<1 rlOOO, y uno tuvo un titulo de 1:40.

Claims (43)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende una unidad de transcripción que codifica una secuencia de señal de una proteina estructural de un primer flavivirus y un antigeno de flavivirus inmunogénico de un segundo flavivirus, en donde la unidad de transcripción dirige la síntesis del antigeno.
  2. 2. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de señal es una secuencia de señal del virus de encefalitis japonés.
  3. 3. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación i, caracterizado porgue el antigeno de flavivirus inmunogénico es de un flavivirus seleccionado del grupo que consiste de virus de la fiebre amarilla, virus del dengue serotipo 1, virus del dengue serotipo 2, virus del dengue serotipo 3, virus del dengue serotipo 4, virus de encefalitis japonés, virus de Po assan y virus de West Nile.
  4. 4. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la unidad de transcripción codifica una secuencia de señal del virus de encefalitis japonés y una proteina M y una proteina E del virus de West Nile.
  5. 5. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la unidad de transcripción codifica una secuencia de señal del virus de encefalitis japonés y una proteína M y una proteína E del virus de la fiebre amarilla.
  6. 6. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la unidad de transcripción codifica una secuencia de señal del virus de encefalitis japonés y una proteína M y u a proteína E del virus de encefalitis de St. Louis.
  7. 7. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la unidad de transcripción codifica una secuencia de señal del virus de encefalitis japonés y una proteína y una proteína E del virus de Powassan.
  8. 8. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno es seleccionado el grupo que consiste de una proteína M de un flavivirus, una proteína E de un flavivirus, tanto una proteína M como una proteína E de un flavivirus, una porción de una proteína M de un flavivirus, una porción de una proteína E de un flavivirus, y tanto una porción de una proteína M de un flavivirus como una porción de una proteína E de un flavivirus, o cualquier combinación de las mismas.
  9. 9. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el antígeno es tanto la proteína M como la proteína E de un flavivirus.
  10. 10. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico es DNA.
  11. 11. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:23.
  12. 12. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la unidad de transcripción comprende una secuencia de control dispuesta apropiadamente tal que operablemente controla la síntesis del antigeno.
  13. 13. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia de control es el promotor temprano inmediato de citomegalovirus.
  14. 14. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia consensual Kozak localizada en un sitio de inicio de traducción para un polipéptido que comprende el antigeno codificado por la TU.
  15. 15. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la unidad de transcripción comprende un terminador poli-A.
  16. 16. Una célula, caracterizada porque comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1.
  17. 17. Una composición, caracterizada porque comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable .
  18. 18.. Un método para inmunizar un sujeto contra la infección por un flavivirus, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de la composición de la reivindicación 17.
  19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el antigeno de flavivirus es de un flavivirus seleccionado del grupo que consiste de virus de la fiebre amarilla, virus del dengue serotipo 1, virus del dengue serotipo 2, virus del dengue serotipo 3, virus del dengue serotipo 4, virus de encefalitis japonés, virus de Powassan y virus de West Nile.
  20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el antigeno es seleccionado el grupo que consiste de una proteina M de un flavivirus, una proteina E de un flavivirus, tanto una proteina M como una proteina E de un flavivirus, una porción de una proteina M de un flavivirus, una porción de una proteina E de un flavivirus, y tanto una porción de una proteina M de un flavivirus como una porción de una proteina E de un flavivirus, o cualquier combinación de las mismas .
  21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el antigeno es tanto proteina M como la proteina E de un flavivirus, y en donde una célula dentro del cuerpo el sujeto, después de que incorpora el ácido nucleico dentro de ésta, secreta partículas subvirales que comprenden la proteina M y la proteina E.
  22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la unidad de transcripción codifica una secuencia de señal del virus de encefalitis japonés y una proteina M y una proteina E del virus de West Nile.
  23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la unidad de transcripción codifica una secuencia de señal del virus de encefalitis japonés y una proteina M y una proteina E del virus de la fiebre amarilla .
  24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la unidad de transcripción codifica una secuencia de señal del virus de encefalitis japonés y una proteina M y una proteina E del virus de encefalitis de St. Louis .
  25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la unidad de transcripción codifica una secuencia de señal del virus de encefalitis japonés y una proteina M y una proteina E del virus de Powassan.
  26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende administrar la composición al sujeto en una sola dosis.
  27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la composición es administrada por medio de una ruta parenteral.
  28. 28. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antigeno es un antigeno del virus de encefalitis de St. Louis.
  29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el antigeno es un antigeno del virus de encefalitis de St. Louis.
  30. 30. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antigeno es un antigeno del virus de encefalitis japonés.
  31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el antigeno es un antigeno del virus de encefalitis japonés.
  32. 32. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antigeno es un antigeno del virus de la fiebre amarilla.
  33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el antigeno es un antigeno del virus de la fiebre amarilla.
  34. 34. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antigeno es un antigeno del virus del dengue.
  35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el antigeno es un antigeno del virus del dengue.
  36. 36. El ácido nucleico . de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antigeno es un antigeno del virus de West Nile.
  37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el antigeno es un antigeno del virus de West Nile.
  38. 38. Un antigeno, caracterizado porque es producido del ácido nucleico de la reivindicación 1.
  39. 39. Un método para detectar un anticuerpo de flavi irus en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto la muestra con el antigeno de la reivindicación 38, bajo condiciones mediante las cuales puede formarse un complejo de antigeno/anticuerpo; y (b) detectar la formación del complejo de antigeno/anticuerpo, para de esta manera detectar un antigeno de flavivirus en una muestra.
  40. 40. Un anticuerpo, caracterizado porque es producido en respuesta a la inmunización por el antigeno de la reivindicación 38.
  41. 41. Un método para detectar un antigeno de flavivirus en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto la muestra con el anticuerpo de la reivindicación 40, bajo condiciones mediante las cuales puede formarse un complejo de antigeno/anticuerpo; y (b) detectar la formación del complejo de antigeno/anticuerpo, para de esta manera detectar un antigeno de flavivirus en una muestra.
  42. 42. Un método para diagnosticar una infección por flavi irus en un sujeto, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con el antigeno de la reivindicación 38, bajo condiciones mediante las cuales puede" formarse un complejo de antigeno/anticuerpo; y (b) detectar la formación del complejo de antigeno/anticuerpo, para de esta manera diagnosticar una infección por flavivirus en un sujeto.
  43. 43. Un método para diagnosticar una infección por flavi irus en un sujeto, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una muestra del sujeto con el anticuerpo de la reivindicación 40, bajo condiciones mediante las cuales puede formarse un complejo de antigeno/anticuerpo; y (b) detectar la formación del complejo de antigeno/anticuerpo, para de esta manera diagnosticar una infección por flavivirus en un sujeto.
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