ES2748555T3 - Vacuna contra la rinitis equina - Google Patents

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Abstract

Una composición inmunógena que comprende una cepa inactivada del virus de la rinitis equina B (ERBV) que tiene el n.º de referencia de ATCC PTA-11829.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna contra la rinitis equina
Antecedentes de la invención
Las infecciones respiratorias víricas equinas se asocian habitualmente con el movimiento de los caballos y anualmente se registran brotes respiratorios en todo el mundo. La gripe equina 2 (AE2-H3N8), herpesvirus equino 1 y 4 (EHV1/4) y los virus de la rinitis equina A y B (ERAV y ERBV, respectivamente) se encuentran entre los virus más importantes aislados de las vías respiratorias altas durante brotes respiratorios.
En particular, se ha detectado ERAV en la enfermedad respiratoria febril aguda en caballos (Li et al., J. Clin. Microbiol.
35:937-943; 1997). De manera similar, Un estudio reciente en Ontario descubrió que ERBV y ERAV son muy prevalentes en la población de caballos (Díaz-Méndez et al., The Canadian Journal of Veterinary Research 74:271-278; 2010). Los signos clínicos de infección por ERAV son inespecíficos y difíciles de diferenciar de otras infecciones víricas respiratorias, incluyendo infecciones de virus del herpes y gripe equina. Se han identificado cepas no citopáticas de este virus en brotes respiratorios equinos (Li et al., J. Clin. Microbiol. 35:937-943; 1997) lo que dificulta su diagnóstico. Por otro lado, ERAV y ERBV, que son virus de ARN monocatenarios, tienen potencial de mutación, haciendo que la capacidad del sistema inmunitario para proteger a un animal contra la enfermedad provocada por una cepa de ERAV/ERBV dada no esté clara.
Además, Campbell et al 1982 (Vet Microbiol.; 7(6): 535-44) describen la inactivación del herpesvirus equino de tipo 1 (EHV1) y el rinovirus equino de tipo 1 (ERhV1). Asimismo, Kriegshauser et al 2005 (Vet Microbiol.; 106 (3-4): 293-6) describen anticuerpos neutralizantes contra el virus de la rinitis equina A y B en caballos.
Existe la necesidad de métodos y medicamentos para prevenir enfermedades respiratorias o para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con dichas enfermedades, incluyendo los asociados con los virus de la rinitis equina A y B.
Breve sumario de la invención
La presente invención proporciona:
(1) Una composición inmunógena que comprende una cepa inactivada del virus de la rinitis equina B (ERBV) que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829.
(2) La composición inmunógena de (1), dicha composición inmunógena comprende además una o más cepas del Virus de la Rinitis Equina A (ERAV) inactivado.
(3) La composición inmunógena de (1) o (2) en la que la cepa, antes de la inactivación, provoca enfermedad respiratoria detectable en el 100 % de los caballos seronegativos tras la exposición a la cepa.
(4) La composición inmunógena de (1) a (3), en donde dicha composición inmunógena comprende además al menos un antígeno o una cepa inactivada o viva, atenuada del virus del herpes equino y/o una cepa inactivada o viva, atenuada del virus de la gripe equina.
(5) La composición inmunógena de (1) a (4), en donde dicha composición inmunógena comprende además al menos un antígeno de una o más cepas seleccionadas del grupo que consiste en el virus del Nilo Occidental, virus de la encefalomielitis equina oriental, virus de la encefalomielitis equina occidental, virus de la encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico, y combinaciones de los mismos.
(6) La composición inmunógena de (1) a (5) para su uso en un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de síntomas clínicos asociados con o provocados por ERBV en un animal o una manada de animales que comprende la etapa de administrar dicha composición inmunógena a un animal que lo necesite.
(7) La composición inmunógena de (6), en donde la incidencia de síntomas clínicos provocados por uno o más de dichos patógenos en una manada de animales está reducida en comparación con una manada que no recibe dicha composición inmunógena.
(8) La composición inmunógena para el uso de (6), en donde la administración de al menos una dosis de dicha composición inmunógena proporciona una duración de inmunidad de al menos 12 meses contra uno o más de dichos patógenos.
(9) La composición inmunógena para el uso de (6) a (8), en donde dicha composición inmunógena es segura para su uso en potros o caballos de 4 meses de edad o más.
Se desvelan composiciones inmunógenas que comprenden una o más cepas de ERAV inactivado o vivo, atenuado, que cuando están vivas y activas y sin atenuar son virulentas (es decir, al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o incluso 100 % de caballos seronegativos, cuando se exponen a propósito al virus, presentan enfermedad respiratoria observable, en particular secreción nasal y/u ocular), que pueden cultivarse a títulos altos en cultivo para producir una vacuna que pueda inducir títulos altos de anticuerpos en suero contra ERAV cuando se administran, por ejemplo, a un equino, por ejemplo, dando como resultado un título de suero de al menos 1:112 y, preferentemente, al menos 1:200, 1:500, 1:750 o 1:1000. Además, las cepas crecen bien en cultivo y son muy eficaces para producir, por ejemplo, a un título de al menos 106 DICT50/ml, más preferentemente al menos 107 DlCT50/ml, 108 DlCT50/ml o incluso 109 DICTso/ml. De manera similar, también se descubrió que composiciones que comprendían una o más cepas de ERBV inactivado, que cuando están vivas y activas y no atenuadas también son virulentas (como se ha definido anteriormente para ERAV), crecían bien en cultivo, a un título de al menos 106 DICT50/ml, más preferentemente 107 DICT50/ml, 108 DICT50/ml o incluso 109 DICT50/ml, que eran muy eficaces para producir e inducir altos títulos de anticuerpos en suero en animales después de inmunización, por ejemplo, dando como resultado un título de suero de al menos 1:120 y preferentemente al menos 1:200, 1:500, 1:750 o 1:1000. Las composiciones tanto de ERAV como de ERBV, y combinaciones de las mismas, son capaces de reducir la duración, gravedad e incidencia de la enfermedad en un animal tal como un caballo que ha sido inmunizado con las composiciones e infectado posteriormente.
En consecuencia, la presente divulgación proporciona una composición inmunógena que comprende una o más cepas de ERAV o ERBV inactivado o vivo, atenuado, en donde la cepa de ERAV o la cepa de ERBV, antes de la inactivación o atenuación, provoca enfermedad respiratoria detectable en al menos el 50 % de los caballos seronegativos expuestos a la cepa o crece en cultivo celular hasta 106 DICT50/ml o superior o, cuando se usa como vacuna en equinos a una dosis de 106 DICT50 o superior, da como resultado un título de suero de al menos 1:112.
En determinados aspectos de la divulgación, la cepa, cuando está viva y sin atenuar, provoca enfermedad respiratoria detectable (por ejemplo, secreción ocular y/o nasal detectable) en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o incluso 100 % de los caballos seronegativos tras la exposición a la cepa.
La cepa se puede dejar crecer en cultivo celular hasta un título de al menos 106 DICT50/ml, más preferentemente 107 DICT50/ml, 108 DICT50/ml o incluso 109 DICT50/ml. La administración de una composición inmunógena que contiene la cepa da como resultado un título en suero de al menos 1:120 y preferentemente al menos 1:200, 1:500, 1:750 o 1:1000.
En las composiciones inmunógenas de la divulgación, la o las cepas de ERAV o ERBV preferentemente incluyen ERAV/ON/05 (n.° de referencia de ATCC PTA-11828) y/o cepa de ERBV 07-103042 (referencia de ATCC PTA-11829). Además, las composiciones inmunógenas de la divulgación contienen al menos una cepa de ERAV que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una identidad superior al 95 % con la SEQ ID NO: 2 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos con una identidad superior al 95 % con la SEQ ID NO: 3, en donde dicha cepa de ERAV, cuando no está inactivada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras. La composición inmunógena de la divulgación también puede incluir una cepa de ERAV que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ iD NO: 2 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.
Las composiciones inmunógenas de la divulgación también pueden incluir una cepa de ERBV que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una identidad superior al 95 % con el transcrito inverso de la secuencia genómica de la cepa ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos con una identidad superior al 95 % con la poliproteína codificada por el genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829, en donde dicha cepa de ERBv , cuando no está inactivada, está activa para infectar y replicar en células hospedadoras. La cepa de ERBV también puede comprender una secuencia genómica que es la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 o codifica una poliproteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la poliproteína codificada por el genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829.
En un aspecto específico, la composición inmunógena de la divulgación comprende el virus de la rinitis equina A (ERAV) y el virus de la rinitis equina B (ERBV), en donde la cepa de ERAV es ErAV/ON/05 y la cepa de ERBV tiene el n.° de referencia de ATCC pTa -11829.
Además, la divulgación incluye además composiciones inmunógenas multivalentes que comprenden virus o antígenos atenuados vivos o inactivados de virus distintos de ERAV o ERBV que provocan enfermedades en équidos. En particular, la divulgación proporciona composiciones inmunógenas que comprenden, además de ERAV y/o ERBV inactivado o vivo, atenuado, al menos un antígeno o una cepa inactivada o viva, atenuada, del virus del herpes equino (EHV) y, en aspectos particulares, el EHV se selecciona del grupo que consiste en EHV-1 y EHV-4, y una combinación de los mismos, más específicamente, el virus del herpes equino se selecciona del grupo que consiste en EHV-1, EHV-4, cepas depositadas en la ATCC con los n.° de referencia PTA-9525 y PTA-9526, y una combinación de los mismos.
La divulgación proporciona además una composición inmunógena, que, además de la cepa inactiva o viva, atenuada, de ERAV y/o ERBV, al menos una cepa inactivada o viva, atenuada, o al menos un antígeno del virus de la gripe equina. En aspectos específicos, el virus de la gripe equina se selecciona del grupo que consiste en virus de Clado 1, virus de Clado 2, Gripe A/Sudáfrica/2003, Gripe A/equina-2/Ohio/03, Gripe A/equina-2/New Market/2/93, Gripe A/equina-2/Kentucky/95, Gripe A/equina-2/Richmond/1/2007, cepas depositadas en la ATCC con los n.° de referencia PTA-9522, PTA-9523 y PTA-9524, y combinaciones de los mismos. Las composiciones inmunógenas pueden incluir, además de ERAV y/o ERBV inactivado o vivo, atenuado, al menos un antígeno o una cepa inactiva o viva, atenuada, del virus del herpes equino y al menos un antígeno o una cepa inactivada o viva, atenuada, del virus de la gripe equina.
Las composiciones inmunógenas de la divulgación pueden incluir, además de ERAV y/o ERBV inactivado o vivo, atenuado, al menos un virus inactivado o vivo, atenuado, o al menos un antígeno de una o más cepas seleccionadas del grupo que consiste en virus del Nilo Occidental, virus de la encefalomielitis equina oriental, Virus de la encefalomielitis equina occidental, Virus de la encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico, y combinaciones de los mismos. Como alternativa, la composición inmunógena, además de ERAV y/o ERBV inactivado o vivo, atenuado, comprende una o más cepas inactivadas o vivas, atenuadas, o antígenos de cepas de encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental, virus de la encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico. En aspectos específicos, el virus del Nilo Occidental es una de las cepas seleccionadas del grupo que consiste en el de origen equino 2005, depositado en la ATCC con el número de referencia PTA-9409; NAEE159, depositado en el aislado del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos con el número de referencia 405330; NY2002Nassau; NY2002Clinton; NY2002Queens; GA20021; GA20022; TX20021; TX20022; IN2002; NY2003Albany; NY2003Suffolk; NY2003Chatauqua; CO20031; CO20032; TX2003; TX2003Harris4; TX2003Harris6; TX2003Harris7; TX2003Harris10; AZ2004; y TX2004Harris4; y combinaciones de los mismos. En composiciones inmunógenas que comprenden el virus de la encefalomielitis equina occidental, la cepa puede ser la cepa depositada en la ATCC con el número de referencia PTA-9410. En composiciones que comprenden el virus de la encefalomielitis equina venezolana, la cepa puede ser la cepa depositada en la ATCC con el número de referencia PTA-9411. En composiciones inmunógenas que comprenden el virus de la encefalomielitis equina oriental, la cepa puede ser la cepa depositada en la ATCC con el número de referencia PTA-9412. Además, en composiciones inmunógenas que comprenden el virus del herpes equino, la cepa puede seleccionarse del grupo que consiste en las cepas depositadas en la ATCC con los números de referencia PTA-9525 o PTA-9526, y combinaciones de las mismas.
En aspectos específicos de la divulgación, una o más de las cepas en la composición inmunógena están presentes en una cantidad de aproximadamente 1020 DICT50/ml a aproximadamente 10100 DICT50/ml por dosis. La composición puede incluir además un vehículo farmacéutico adecuado, tal como un diluyente, adyuvante, agente antimicrobiano, conservante, agente inactivador o combinación de los mismos. En aspectos particulares, la composición inmunógena comprende un adyuvante, específicamente, HRA-5.
La divulgación proporciona además métodos para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con o causados por el virus de la rinitis equina A o el virus de la rinitis equina B en un animal o una manada de animales que comprenden la etapa de administrar una composición inmunógena que comprende una o más cepas de ERAV o ERBV inactivados o vivos, atenuados, en donde la cepa de ERAV o la cepa de ERBV, antes de la inactivación o atenuación, provoca enfermedad respiratoria detectable en al menos el 50 % de los caballos seronegativos expuestos a la cepa o crece en cultivo celular hasta 106 DICT50/ml o superior o, cuando se usa como vacuna en equinos a una dosis de 106 DICT50 o superior, da como resultado un título de suero de al menos 1:112. En particular, la o las cepas de ERAV o ERBV preferentemente incluyen ERAV/ON/05 (n.° de referencia de ATCC PTA-11828) y/o cepa de ERBV 07-103042 (referencia de ATCC PTA-11829). Además, la cepa de ERAV puede comprender una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una identidad superior al 95 % con la SEQ ID NO: 2 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos con una identidad superior al 95 % con la SEQ ID NO: 3, en donde dicha cepa de ERAV, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras, o la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 2 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. Además, o como alternativa, la cepa de ERBV puede comprender una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una identidad superior al 95 % con el transcrito inverso de la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos con una identidad superior al 95 % con la poliproteína codificada por el genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829, en donde dicha cepa de ERBV, cuando no está inactivada o atenuada, está activa para infectar y replicar en células hospedadoras. La cepa de ERBV también puede comprender una secuencia genómica que es la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 o codifica una poliproteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la poliproteína codificada por el genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829.
Además de proporcionar métodos para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con o provocados por ERAV o ERBV en un animal o una manada de animales, los métodos de la divulgación pueden reducir adicionalmente la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con o causados por uno o más de los patógenos seleccionados del grupo que consiste en el virus del Nilo Occidental, virus de la encefalomielitis equina oriental, virus de la encefalomielitis equina occidental, virus de la encefalomielitis equina venezolana y Clostridium tetani en un animal o una manada de animales mediante la administración de una composición inmunógena de la divulgación. Los métodos de la divulgación también incluyen métodos para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con o provocados por ERAV o ERBV en un animal o una manada de animales además de reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con o provocados por uno o más de los patógenos seleccionados del grupo que consiste en: virus de la encefalomielitis equina oriental, virus de la encefalomielitis equina occidental, virus de la encefalomielitis equina venezolana, virus del herpes equino y Clostridium tetani en un animal o una manada de animales mediante la administración de una composición inmunógena de la divulgación.
La divulgación también proporciona métodos para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con o provocados por ERAV y/o ERBV, así como uno o más de los patógenos seleccionados del grupo que consiste en: virus del Nilo occidental, virus de la encefalomielitis equina oriental, virus de la encefalomielitis equina occidental, virus de la encefalomielitis equina venezolana, virus del herpes equino, virus de la gripe equina y Clostridium tetani en un animal o una manada de animales, que comprende la etapa de administrar una composición inmunógena de la divulgación.
En relación con los métodos de la divulgación, la incidencia de los síntomas clínicos provocados por uno o más de dichos patógenos en una manada de animales se reduce de aproximadamente 10 % - 50 % en comparación con una manada que no recibe la composición inmunógena. Los métodos de la divulgación, en aspectos particulares, proporcionan una duración de la inmunidad de al menos 12 meses contra uno o más de los patógenos presentes en la composición inmunógena. En los métodos de la divulgación, la composición inmunógena se administra a un équido, preferentemente un caballo. El esquema de dosificación puede incluir la administración de la composición inmunógena en una o más dosis. Las dosis para los métodos de la divulgación pueden formularse en formas de dosificación de 0,5 ml a 2,5 ml. Preferentemente, los métodos de la divulgación administran composiciones inmunógenas que son seguras para su uso en potros o caballos de 4 meses de edad o mayores.
La divulgación también proporciona métodos para producir una composición inmunógena que comprende una o más cepas de virus de la rinitis equina A (ERAV) o virus de la rinitis equina B (ERBV) inactivados de la siguiente manera:
a) infectar una línea celular susceptible con ERAV o ERBV;
b) cultivar la línea celular infectada en medios de cultivo hasta que se logre un efecto citopático (CPE);
c) recoger los medios;
d) filtrar los medios para producir un medio filtrado; y
e) poner en contacto los medios filtrados con un agente inactivador para obtener el ERAV o ERBV inactivado.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es una representación gráfica de la proporción de positivos para virus a lo largo del tiempo.
La Fig. 2 es una representación gráfica de la proporción de positivos para capa leucocitaria a lo largo del tiempo.
La Fig. 3 es una representación gráfica de los títulos de neutralización en suero a lo largo del tiempo.
La Fig. 4 es una representación gráfica de las puntuaciones nasales medias a lo largo del tiempo.
La Fig. 5 es una representación gráfica de las puntuaciones oculares medias a lo largo del tiempo.
La Fig. 6 es una alineación de ClustalW de una parte del virus de la rinitis equina A ERAV/ON/05 (parte 5' UTR, SEQ ID NO: 1) con ERAV/PERV-1 (número de referencia: DQ272578 (SEQ ID NO: 14)). Las inserciones de nucleótidos de ERAV/ON/05 se muestran en negrita y las supresiones en sombreado.
La Fig. 7 es un gráfico de medias de puntuación clínica total de grupos de control, infectados y reinfectados del Ejemplo 4.
La Fig. 8 es un gráfico de medias de temperatura corporal de grupos de control, infectados y reinfectados del Ejemplo 4.
La Fig. 9 es una tabla que muestra títulos para virus de la rinitis equina A (ERAV) y el virus de la rinitis equina B (ERBV) en grupos de control, infectados y reinfectados del Ejemplo 4. La prueba de neutralización del virus (VN) se usó para medir títulos de anticuerpos en muestras de suero.
Descripción detallada de la invención
Se desvelan composiciones inmunógenas que comprenden una o más cepas de ERAV inactivado, que cuando están vivas y activas son virulentas (es decir, al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o incluso 100 % de caballos seronegativos, cuando se exponen a propósito al virus, presentan enfermedad respiratoria observable, en particular secreción nasal y/u ocular), que pueden cultivarse a títulos altos en cultivo para producir una vacuna que pueda inducir títulos altos de anticuerpos en suero contra ERAV cuando se administran, por ejemplo, a un equino, por ejemplo, dando como resultado un título de suero de al menos 1:112 y, preferentemente, al menos 1:200, 1:500, 1:750 o 1:1000.
Además, las cepas crecen bien en cultivo y son muy eficaces para producir, por ejemplo, a un título de al menos 106 DICT50/ml, más preferentemente 107 DICT50/ml, 108 DICT50/ml o incluso 109 DICT50/ml. De manera similar, también se descubrió que composiciones que comprendían una o más cepas de ERBV inactivado, que cuando están vivas y activas y no atenuadas también son virulentas (como se ha definido anteriormente para ERAV), crecían bien en cultivo, a un título de al menos 106 DICT50/ml, más preferentemente 107 DICT50/ml, 108 DICT50/ml o incluso 109 DICT50/ml, que eran muy eficaces para producir e inducir altos títulos de anticuerpos en suero en animales después de inmunización, por ejemplo, dando como resultado un título de suero de al menos 1:120 y preferentemente al menos 1:200, 1:500, 1:750 o 1:1000. Las composiciones tanto de ERAV como de ERBV, y combinaciones de las mismas, son capaces de reducir la duración, gravedad e incidencia de la enfermedad en un animal tal como un caballo que ha sido inmunizado con las composiciones e infectado posteriormente.
En un aspecto, se desvela una composición inmunógena que comprende una o más cepas de ERAV y/o ERBV inactivados. Como alternativa, las cepas pueden atenuarse por medios rutinarios y el virus vivo, atenuado, usarse en la composición de vacuna. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una 5' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En determinados aspectos, la cepa de ERAV es ERAv /ON/05 que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11828, depositado en la colección americana de cultivos tipo el 14 de abril de 2011.
En algunas realizaciones de la invención, el ERBV es la cepa 07-103042, que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829, depositado en la colección americana de cultivos tipo el 14 de abril de 2011. En algunos aspectos de la divulgación, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con n.° de referencia de ATCC PTA-11829, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica).
En un aspecto se desvela una composición inmunógena que comprende ERAV y ERBV inactivado (o, como alternativa, vivo, atenuado). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una 5' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, la cepa de ERAV es ErAv /ON/05 (n.° de referencia de ATCC PTA-11828). En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con el n.° de referencia de ATCC PTA-11829, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica).
En un aspecto de la divulgación, junto con la o las cepas inactivadas o vivas, atenuadas, de ERAV y/o ERBV, las composiciones inmunógenas desveladas en el presente documento comprenden además al menos un antígeno o una cepa adicional inactivada o viva, atenuada, del virus del herpes equino (EHV). En algunos aspectos, las composiciones comprenden al menos un antígeno de EHV. En algunos aspectos, el EHV se selecciona del grupo que consiste en EHV-1, EHV-4, cepas depositadas en la ATCC con los n.° de referencia PTA-9525 y PTA-9526, y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una 5' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (n.° de referencia de ATCC PTA-11828). En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con n.° de referencia de ATCC PTA-11829, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica).
En un aspecto de la divulgación, junto con la o las cepas inactivadas (o atenuadas) de ERAV y/o ERBV, las composiciones inmunógenas desveladas en el presente documento comprenden además al menos un antígeno o una cepa adicional inactivada o atenuada del virus de la gripe equina (ElV). En algunos aspectos, las composiciones comprenden al menos un antígeno de ElV. En algunos aspectos, el ElV se selecciona del grupo que consiste en virus de Clado 1, virus de Clado 2, Gripe A/Sudáfrica/2003, Gripe A/equina-2/Ohio/03, Gripe A/equina-2/New Market/2/93, Gripe A/equina-2/Kentucky/95, Gripe A/equina-2/Richmond/1/2007 y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una 5' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (n.° de referencia de ATCC PTA-11828). En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con n.° de referencia de ATCC PTA-11829, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica).
En un aspecto de la divulgación, junto con la o las cepas inactivadas (o vivas, atenuadas) de ERAV y/o ERBV, las composiciones inmunógenas desveladas en el presente documento comprenden además al menos un antígeno o una cepa adicional inactivada o viva, atenuada, del virus de la gripe equina y al menos un antígeno o una cepa adicional inactivada o viva, atenuada, del virus del herpes equino. En algunos aspectos, las composiciones comprenden al menos un antígeno de EHV y al menos un antígeno de EIV. En algunos aspectos, el EHV es EHV-1 o e HV-4 o una combinación de los mismos y el EIV se selecciona del grupo que consiste en virus de Clado 1, virus de Clado 2, Gripe A/Sudáfrica/2003, Gripe A/equina-2/Ohio/03, Gripe A/equina-2/New Market/2/93, Gripe A/equina-2/Kentucky/95, Gripe A/equina-2/Richmond/1/2007 y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una 5' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, la cepa de ERAV es ErAv /On/05 (n.° de referencia de ATCC PTA-11828). En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con n.° de referencia de ATCC PTA-11829, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica).
En un aspecto de la divulgación, junto con la o las cepas inactivadas (o vivas, atenuadas) de ERAV y/o ERBV, las composiciones inmunógenas desveladas en el presente documento comprenden además al menos un antígeno o virus inactivado de una o más cepas adicionales seleccionadas del grupo que consiste en virus de la gripe equina, virus del herpes equino, virus del Nilo occidental, virus de la encefalomielitis equina oriental, virus de la encefalomielitis equina occidental y virus de la encefalomielitis equina venezolana y/o toxoide tetánico, y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una 5' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no esté inactivada ni atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (n.° de referencia de ATCC PTA-11828). En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con n.° de referencia de ATCC PTA-11829, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica).
En un aspecto de la divulgación, junto con la o las cepas inactivadas (o vivas, atenuadas) de ERAV y/o ERBV, las composiciones inmunógenas desveladas en el presente documento comprenden además al menos un virus adicional inactivado o vivo, atenuado, de una cepa seleccionada del grupo que consiste en virus del Nilo Occidental, virus de la encefalomielitis equina oriental, virus de la encefalomielitis equina occidental y virus de la encefalomielitis equina venezolana y/o toxoide tetánico, y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una 5' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, la cepa de ERAV es ErAv /On/05 (n.° de referencia de ATCC PTA-11828). En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con n.° de referencia de ATCC PTA-11829, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica).
En un aspecto, se desvela un método para preparar la composición inmunógena de la presente divulgación. El método comprende en general las etapas de combinar un ERAV y/o ERBV inactivados o vivos, atenuados, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una 5' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (n.° de referencia de ATCC PTA-11828). En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con n.° de referencia de ATCC PTA-11829, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). En algunos aspectos, el método comprende además la etapa de añadir uno o más antígenos de virus equinos adicionales o virus equinos inactivados o vivos, atenuados. En otro aspecto, el método comprende además la etapa de añadir un adyuvante adecuado a la composición.
En un aspecto, se desvela un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de síntomas clínicos asociados con o provocados por ERAV o ERBV en un animal o una manada de animales que comprende administrar una composición inmunógena como se desvela en el presente documento a un animal que lo necesite. En algunos aspectos, el animal es un caballo.
Los aspectos anteriormente mencionados pueden contener además una o más de las siguientes características descritas a continuación.
En un aspecto, se desvela una composición que comprende al menos una cepa de ERAV y/o ERBV inactivados (o, como alternativa, vivos, atenuados) y que contienen además muchos o todos los componentes antigénicos y proteínas relevantes del virus del Nilo Occidental (WNV) patógeno o cepa inactivada o viva, atenuada, de WNV.
En un aspecto, se desvela una composición de vacuna que comprende una o más cepas de ERAV y/o ERBV inactivados (o vivos, atenuados) en combinación con una o más cantidades inmunológicamente eficaces de componentes antigénicos o uno o más cepas inactivadas o vivas, atenuadas, seleccionadas del grupo que consiste en el virus del Nilo Occidental (WNV), encefalomielitis equina venezolana (VEE), encefalomielitis equina oriental (EEE), encefalomielitis equina occidental (WEE), toxoide tetánico (T), virus del herpes equino (EHV), incluyendo tipos 1 y 4, virus de la gripe equina (EIV) y combinaciones de los mismos, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, dichos aspectos incluirán un adyuvante, tal como un carbómero y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otros aspectos, el adyuvante es HRA-5, un carbómero o aceite mineral.
En algunos aspectos de la divulgación, las composiciones también incluyen ERAV y/o ERBV inactivados o vivos, atenuados, en combinación con las siguientes cepas víricas inactivadas o vivas, atenuadas, o antígenos y combinaciones de cepas y antígenos: virus del Nilo occidental; encefalomielitis equina oriental; encefalomielitis equina occidental; encefalomielitis equina venezolana; toxoide tetánico; encefalomielitis equina oriental y encefalomielitis equina occidental; encefalomielitis equina oriental y encefalomielitis equina venezolana; encefalomielitis equina oriental y toxoide tetánico; encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental y encefalomielitis equina venezolana; encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental y toxoide tetánico; encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico; encefalomielitis equina occidental y encefalomielitis equina venezolana; encefalomielitis equina occidental y toxoide tetánico; encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico; encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico; y encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico, o antígenos o componentes antigénicos de los mismos. Una combinación preferida de estas combinaciones especificadas incluye ERAV y/o ERBV en combinación con antígenos o componentes antigénicos de virus inactivados del virus del Nilo Occidental, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico. Otra combinación preferida incluye ERAV y/o ERBV en combinación con antígenos o componentes antigénicos de la encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico. Los ERAV preferidos incluyen ERAV/ON/05 (número de referencia de ATCC pTA-11828), la cepa de ERAV que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una 5' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). La cepa de ERAV también puede comprender una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. El ERBV preferido es una cepa que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829, o que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con n.° de referencia de ATCC PTA-11829, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). En cada combinación especificada, se puede usar un adyuvante o combinación de adyuvantes tal como, HRA-5, carbómero o con carbopol. La cepa NJO de la encefalomielitis equina oriental, la cepa Fleming de la cepa de encefalomielitis equina occidental y la cepa TC-83 de la cepa de encefalomielitis equina venezolana son cepas representativas de estos componentes de vacuna.
Otros aspectos preferidos de la presente divulgación incluyen composiciones inmunógenas preparadas usando cada una de las vacunas de combinación especificadas enumeradas anteriormente y añadiendo antígenos o virus inactivados o atenuados del Herpesvirus equino, preferentemente de tipo 1, tipo 4, (EHV1 y/o EHV4) o combinaciones de los mismos.
Más variaciones adicionales de cada una de las vacunas de combinación especificadas o composiciones inmunógenas enumeradas anteriormente, incluyendo las que incluyen EHV1 y/o EHV4, se pueden realizar añadiendo antígenos o virus inactivados o atenuados del virus de la gripe equina (EIV). Los aspectos preferidos de la divulgación que incorporan el virus de la gripe equina incluyen ERAV y/o ERBV inactivado o vivo, atenuado, y al menos una cepa inactiva o viva, atenuada, de cada uno de w Nv , virus de la gripe equina y toxoide tetánico; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa inactivada o viva, atenuada, de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, toxoide tetánico y encefalomielitis equina oriental; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de w Nv , virus de la gripe equina, toxoide tetánico, encefalomielitis equina oriental y encefalomielitis equina occidental; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, toxoide tetánico, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental; y encefalomielitis equina venezolana; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina y encefalomielitis equina oriental; ERAV y/o ERBV y, al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina y encefalomielitis equina occidental; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina y encefalomielitis equina venezolana; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, encefalomielitis equina oriental y encefalomielitis equina occidental; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, encefalomielitis equina oriental y encefalomielitis equina venezolana; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, encefalomielitis equina occidental y encefalomielitis equina venezolana; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, encefalomielitis equina occidental y toxoide tetánico; ERAV y/o ERBv y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, encefalomielitis equina venezolana, encefalomielitis equina occidental y toxoide tetánico; y ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, encefalomielitis equina venezolana, encefalomielitis equina oriental y toxoide tetánico, en donde las cepas mencionadas anteriormente están inactivadas o vivas, atenuadas. En cada aspecto especificado pueden estar presentes una o más cepas inactivadas o vivas, atenuadas, del virus de la gripe equina. Las cepas preferidas del virus de la gripe equina incluyen gripe A/equina-2/Ohio/03, Gripe A/equina-2/New Market/2/93, Gripe A/equina-2/Kentucky/95 y combinaciones de los mismos. En todas las combinaciones enumeradas anteriormente, se prefiere usar al menos dos cepas inactivadas o vivas, atenuadas, del virus de la gripe equina y se prefiere más usar al menos 3 cepas del virus de la gripe equina.
Los aspectos preferidos de la divulgación que incorpora el virus del herpes equino incluyen: ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, toxoide tetánico y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, toxoide tetánico, encefalomielitis equina oriental y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, toxoide tetánico, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, toxoide tetánico, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental; encefalomielitis equina venezolana y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina y encefalomielitis equina oriental; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, encefalomielitis equina occidental y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, encefalomielitis equina venezolana y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental y ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina venezolana y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBv y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina venezolana y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, encefalomielitis equina occidental, toxoide tetánico y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, encefalomielitis equina venezolana, toxoide tetánico y virus del herpes equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, encefalomielitis equina venezolana, encefalomielitis equina occidental, toxoide tetánico y virus del herpes equino; y ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de la gripe equina, encefalomielitis equina venezolana, encefalomielitis equina oriental, toxoide tetánico y virus del herpes equino, en donde las cepas mencionadas anteriormente están inactivadas o vivas, atenuadas. En todas las combinaciones enumeradas anteriormente, se prefiere usar al menos dos cepas de virus de la gripe equina inactivado o vivo, atenuado, y se prefiere más usar al menos 3 cepas de virus de la gripe equina inactivado o vivo, atenuado. Adicionalmente, en todas las combinaciones anteriores, se prefiere que la "al menos una" cepa del virus del herpes equino se seleccione del grupo que consiste en EHV-1 y EHV-4 inactivados. En algunas formas preferidas, se incluirán cepas tanto inactivadas como vivas,, atenuadas, EHV-1 y EHV-4, en la composición inmunógena. En otras formas preferidas, solo se incluirá EHV-1. En una combinación preferida, la cepa inactivada o viva, atenuada, de ERAV es ERAV/ON/05, una cepa de ERAV que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una 5' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). La cepa de ERAV también puede comprender una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En otras combinaciones preferidas, el ERBV es una cepa que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829, o que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con n.° de referencia de ATCC PTA-11829, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica).
Las composiciones inmunógenas como se desvela en el presente documento pueden administrarse en cualquier dosis inmunógenamente eficaz. En un aspecto preferido, la composición inmunógena se administra como una dosis única. Preferentemente, la dosis tiene un volumen total entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 2,5 ml, más preferentemente entre aproximadamente 0,6 ml y aproximadamente 2,0 ml, incluso más preferentemente entre aproximadamente 0,7 ml y aproximadamente 1,75 ml, aún más preferentemente entre aproximadamente 0,8 ml y aproximadamente 1,5 ml, incluso más preferentemente entre aproximadamente 0,9 ml y aproximadamente 1,25 ml, siendo la más preferida una dosis única de 1,0 ml.
En otro aspecto de la divulgación, se administra la composición inmunógena, administrándose una primera dosis antes de la administración de una segunda dosis (de refuerzo). Preferentemente, la segunda dosis se administra al menos aproximadamente 15 días después de la primera dosis. Más preferentemente, la segunda dosis se administra entre aproximadamente 15 y aproximadamente 28 días después de la primera dosis. Aún más preferentemente, la segunda dosis se administra al menos aproximadamente 17 días después de la primera dosis. Aún más preferentemente, la segunda dosis se administra entre aproximadamente 17 y aproximadamente 25 días después de la primera dosis. Aún más preferentemente, la segunda dosis se administra al menos aproximadamente 19 días después de la primera dosis. Aún más preferentemente, la segunda dosis se administra entre aproximadamente 19 y aproximadamente 23 días después de la primera dosis. Lo más preferentemente, la segunda dosis se administra al menos aproximadamente 21 días después de la primera dosis. En un aspecto preferido, tanto la primera como la segunda dosis de la composición inmunógena están en la misma cantidad. Preferentemente, cada dosis está en las cantidades preferidas especificadas anteriormente, siendo más preferida una dosis de aproximadamente 1 ml para la primera y segunda dosis. Además del régimen de primera y segunda dosis, un aspecto alternativo comprende dosis posteriores adicionales. Por ejemplo, una tercera, cuarta o quinta dosis podría administrarse en estos aspectos. Preferentemente, los regímenes posteriores de tercera, cuarta y quinta dosis se administran en la misma cantidad que la primera dosis, siendo el intervalo temporal entre las dosis coherente con el tiempo entre la primera y la segunda dosis mencionadas anteriormente, aunque el tiempo también puede variar.
En un aspecto de la divulgación, la composición inmunógena se administra en tres dosis. En algunos aspectos, las tres dosis se administran a intervalos de tres semanas.
En un aspecto de la divulgación que comprende ERAV, preferentemente ERAV/ON/05, la cantidad de ERAV en la composición inmunógena es al menos aproximadamente 1020 DICT50/dosis. Más preferentemente, la cantidad de ERAV está entre aproximadamente 1020 DICT50/dosis y aproximadamente 10100 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la cantidad de ERAV es al menos aproximadamente 1025 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la cantidad de ERAV está entre aproximadamente 1025 DICT50/dosis y aproximadamente 1095 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la cantidad de ERAV es al menos aproximadamente 1ü30DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la cantidad de ERAV está entre aproximadamente 1030 DICT50/dosis y aproximadamente 1090 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la cantidad de ERAV es al menos aproximadamente 1035 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la cantidad de ERAV está entre aproximadamente 1035 DICT50/dosis y aproximadamente 1090 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la cantidad de ERAV está entre aproximadamente 1065 DICT50/ dosis y aproximadamente 1085 DICT50/dosis. Más preferentemente, la cantidad de ERAV está entre aproximadamente 1070DICT50/dosis y aproximadamente 1090DICT50/dosis. Los valores de DICT50 de un ERAV inactivado o atenuado o cualquier otra vacuna inactivada o atenuada se refieren en general al contenido vírico en la vacuna final que, sin embargo, es equivalente al contenido vírico calculado para la composición de vacuna antes de la inactivación de su virus. Preferentemente, la composición inmunógena de la presente divulgación estimula anticuerpos neutralizantes de suero contra ERAV en un título de al menos 1:112, 1:300, 1:500, 1:700, 1:900, 1:1000 o 1:1500
En un aspecto de la divulgación que comprende ERBV, preferentemente una cepa que tiene el n.° de referencia de ATCC: pTA-11829, la cantidad de ERBV es al menos aproximadamente 1020 DlCT50/dosis. Más preferentemente, la cantidad de ERBV está entre aproximadamente 1020 DICT50/dosis y aproximadamente 10100 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la cantidad de ERBV es al menos aproximadamente 1025 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la cantidad de ERBV está entre aproximadamente 1025 DICT50/dosis y aproximadamente 1095 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la cantidad de ERBV es al menos aproximadamente 1030 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la cantidad de ERBV está entre aproximadamente 1030 DICT50/dosis y aproximadamente 1090 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la cantidad de ERBV es al menos aproximadamente 1035 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la cantidad de ERBV está entre aproximadamente 1035 DICT50/dosis y aproximadamente 1090 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la cantidad de ERBV está entre aproximadamente 1065 DICT50/dosis y aproximadamente 1085 DICT50/dosis. Más preferentemente, la cantidad de ERBV está entre aproximadamente 1070 DICT50/dosis y aproximadamente 1090 DICT50/dosis. Los valores de DICT50 de un ERBV inactivado o cualquier otra vacuna inactivada se refieren en general al contenido vírico en la vacuna final que, sin embargo, es equivalente al contenido vírico calculado para la composición de vacuna antes de la inactivación de su virus. Preferentemente, la composición inmunógena de la presente divulgación estimula anticuerpos neutralizantes de suero contra ERBV a un título de al menos 1:4 o superior. En algunos aspectos, el título es al menos 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11; 1:12, 1:13, 1:14 o 1:15 o superior. En algunos aspectos, el título es al menos 1:64, 1:256 o 1:512 o superior. En algunos aspectos, el título es al menos 1:1024 o superior. En algunos aspectos, el título es al menos 1:2048, 1:1536, 1:3072, 1:4096, 1:6144, 1:8192, 1:12288 o 1:32769 o superior. En algunos aspectos, el título no es más de 1:300, 1:1050, 1:32000, 1:70000 o 1:140000.
En un aspecto, en cada dosis de un aspecto de la presente divulgación que comprende uno o más antígenos equinos adicionales, la cantidad de encefalomielitis equina oriental o encefalomielitis equina venezolana en cualquier dosis es preferentemente al menos aproximadamente 1055 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la dosis está entre aproximadamente 1055 DICT50/dosis y aproximadamente 1095 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la dosis es de al menos aproximadamente 1060 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la dosis está entre aproximadamente 1060 DICT50/dosis y aproximadamente 1090 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la dosis es de al menos aproximadamente 1065 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la dosis está entre aproximadamente 1065 DICT50/dosis y aproximadamente 1095 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la dosis es de al menos aproximadamente 1070 DICT50/dosis. Lo más preferentemente, la dosis está entre aproximadamente 1067 DICT50/dosis y aproximadamente 1092 DICT50/dosis.
En un aspecto de la divulgación que comprende WNV o antígeno inactivado o destruido, la cantidad de WNV o antígeno es al menos aproximadamente 1020 DICT50/dosis. Más preferentemente, el WNV o antígeno está entre aproximadamente 1020 DICT50/dosis y aproximadamente 10100 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, el WNV o antígeno es al menos aproximadamente 1025 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, el WNV o antígeno está entre aproximadamente 1025 DICT50/dosis y aproximadamente 1095 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, el WNV o antígeno es al menos aproximadamente 1030 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, el WNV o antígeno está entre aproximadamente 1030 DICT50/dosis y aproximadamente 1090 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, el WNV o antígeno es al menos aproximadamente 1035 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, el WNV o antígeno está entre aproximadamente 1035 DICT50/dosis y aproximadamente 1090 DICT50/dosis. Lo más preferentemente, el WNV o antígeno está entre aproximadamente 1070 DICT50/dosis y aproximadamente 1090 DICT50/dosis. Los valores de DICT50 de una vacuna de WNV inactivado o cualquier otra vacuna inactivada se refieren en general al contenido de antígeno en la vacuna final que, sin embargo, es equivalente al contenido de antígeno calculado para la composición de vacuna antes de la inactivación de su antígeno. Preferentemente, la composición inmunógena de la presente divulgación estimula anticuerpos neutralizantes de suero contra WNV a un título de al menos 1:4 o superior. En algunos aspectos, el título es al menos 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11; 1:12, 1:13, 1:14 o 1:15 o superior. En algunos aspectos, el título no es más de 1:300, 1:1050, 1:32000, 1:70000 o 1:140000. En un aspecto preferido, en cada dosis de un aspecto de la presente divulgación que comprende antígeno equino adicional, la cantidad de encefalomielitis equina oriental o encefalomielitis equina venezolana en cualquier dosis es preferentemente al menos aproximadamente 1055 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la dosis está entre aproximadamente 1055 DICT50/dosis y aproximadamente 1095 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la dosis es de al menos aproximadamente 1060 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la dosis está entre aproximadamente 1060 DICT50/dosis y aproximadamente 1090 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la dosis es de al menos aproximadamente 1065 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la dosis está entre aproximadamente 1065 DICT50/dosis y aproximadamente 1095 DICT50/dosis. Aún más preferentemente, la dosis es de al menos aproximadamente 1070 DICT50/dosis. Lo más preferentemente, la dosis está entre aproximadamente 1067 DICT50 y aproximadamente 1092 DICT50/dosis.
Preferentemente, el antígeno de la encefalomielitis equina occidental, cuando está presente en la composición de la presente divulgación, está en una cantidad de al menos aproximadamente 1062 UFP/ml. Aún más preferentemente, la cantidad está entre aproximadamente 1062 UFP/ml y aproximadamente 10102 UFP/ml. Aún más preferentemente, la cantidad es al menos aproximadamente 1067 UFP/ml. Aún más preferentemente, la cantidad está entre aproximadamente 1o65 UFP/ml y aproximadamente 1o97 UFP/ml. Aún más preferentemente, la cantidad es al menos aproximadamente 1072 UFP/ml. Aún más preferentemente, la cantidad está entre aproximadamente 1072 UFP/ml y aproximadamente 1092 UFP/ml. Aún más preferentemente, la cantidad es al menos aproximadamente 1077 UFP/ml siendo entre aproximadamente 1065 UFP/dosis y aproximadamente 1090 UFP/ml la más preferida.
En otro aspecto preferido, la cantidad de toxoide tetánico, si está presente en la composición de la presente divulgación, está en una cantidad de al menos aproximadamente 3 UPC, más preferentemente, entre aproximadamente 3 UPC y aproximadamente 20 UPC, aún más preferentemente, al menos aproximadamente 4 UPC y lo más preferentemente, al menos aproximadamente 5 UPC pero no más de aproximadamente 20 UPC.
En un aspecto alternativo de la divulgación, donde están presentes una o más cepas del virus de la gripe equina, la cantidad de gripe equina presente en la composición está en una cantidad de al menos aproximadamente 1050 DICTso/ml. Más preferentemente, la gripe equina está en una cantidad de entre aproximadamente 1050 DICT5o/ml y aproximadamente 1090 DICT5o/ml y, más preferentemente, al menos aproximadamente 1060 DICT5o/ml. Aún más preferentemente, la cantidad es entre aproximadamente 1060 DICT5o/ml a aproximadamente 1080 DICT5o/ml y, más preferentemente, la cantidad es al menos aproximadamente 1o65 DICT5o/ml. Aún más preferentemente, la cantidad es entre aproximadamente 1o65 DICT5o/ml a aproximadamente 1o75 DICT5o/ml, siendo la cantidad más preferida entre aproximadamente 1o67 DICT5o/ml y aproximadamente 1o73 DICT5o/ml.
En un aspecto de la divulgación que comprende virus del herpes equino, la cantidad de virus del herpes equino en cada dosis es al menos aproximadamente 1o6’° DICT5o/ml. Más preferentemente, el virus del herpes equino está presente en la composición en una cantidad de entre aproximadamente 1o6'° DICT5o/ml y aproximadamente 1o95 DICT5o/ml y, más preferentemente, en una cantidad de aproximadamente 1o7'° DICT5o/ml. Aún más preferentemente, el virus del herpes equino está presente en una cantidad entre aproximadamente 1o75 DICT5o/ml y aproximadamente 1o9,° DICT5o/ml y, más preferentemente, en una cantidad de aproximadamente 1o8'° DICT5o/ml. Aún más preferentemente, el virus del herpes equino está presente en una cantidad de entre aproximadamente 1o8'° DICT5o/ml y aproximadamente 1o9'° DICT5o/ml y, lo más preferentemente, en una cantidad de aproximadamente 1o8,5° DICT5o/ml.
En otro aspecto preferido adicional de la divulgación, se desvela una composición de vacuna que comprende las cepas cronológicamente contemporáneas y epidemiológicamente prevalentes de ERAV y/o ERBV. Preferentemente, la composición comprende ERAV/ON/o5 y/o una cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829. En aspectos específicos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una 5' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con n.° de referencia de ATCC PTA-11829, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). Dicha composición mejorará en general la eficacia de la composición.
La presente divulgación proporciona adicionalmente un método de reducción de la incidencia y/o gravedad de los signos clínicos asociados con, infección por ERAV y/o ERBV en un animal, preferentemente un caballo. Dichos métodos comprenden en general la etapa de administrar una composición de vacuna que comprende una cepa inactivada o viva, atenuada de un ERAv y/o ERBV y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En aspectos particulares, el ERAV es ERAV/ON/o5, o la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una 5' UTR que comprende la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con n.° de referencia de ATCC PTA-11829, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). En algunos aspectos preferidos, un adyuvante, en particular HRA-5, se añade a la composición y, en otras formas preferidas, no se proporciona adyuvante.
En un aspecto preferido alternativo de la divulgación, el método comprende administrar una composición de vacuna que comprende una o más cepas inactivadas o vivas, atenuadas, de ERAV y/o ERBV en combinación con cantidades inmunológicamente eficaces de componentes antigénicos o cepas inactivadas de otros patógenos equinos. Preferentemente, la cepa de ERAV es ErAV/ON/05 (n.° de referencia de ATCC PTA-11828) y la cepa de ERbV tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829. En determinados aspectos de este tipo, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una 5' UTR que comprende la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o viva, atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con n.° de referencia de ATCC PTA-11829, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica).
En algunos aspectos del método de divulgación, los patógenos en combinación con las cepas de ERAV y/o ERBV, se seleccionan del grupo que consiste en antígenos o cepas inactivadas o atenuadas de EHV y EIV y combinaciones de los mismos. En algunos aspectos, los patógenos son antígenos. En algunos aspectos, el EHV es EHV-1 o EHV-4 o una combinación de los mismos. En otros aspectos, el EIV se selecciona del grupo que consiste en virus de Clado 1, virus de Clado 2, Gripe A/Sudáfrica/2003, Gripe A/equina-2/Ohio/03, Gripe A/equina-2/New Market/2/93, Gripe A/equina-2/Kentucky/95, Gripe A/equina-2/Richmond/1/2007 y combinaciones de los mismos.
En otros aspectos más del método de la divulgación, los patógenos en combinación con las cepas de ERAV y/o ERBV, se seleccionan del grupo que consiste en antígenos o cepas inactivadas o atenuadas de WNV, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental y encefalomielitis equina venezolana, y toxoide tetánico, y combinaciones de los mismos, y que son más preferentemente las combinaciones descritas anteriormente. En otro aspecto preferido, la vacuna de la presente divulgación se combina con un adyuvante adecuado y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente divulgación proporciona reducción de la incidencia y/o gravedad de síntomas clínicos asociados con, infección por ERAV y/o ERBV en una manada. Preferentemente, la gravedad y/o incidencia de síntomas clínicos en animales que reciben la composición inmunógena de la presente divulgación se reducen al menos 10 % en comparación con animales que no reciben dicha administración cuando ambos grupos (animales que reciben y animales que no reciben la composición) se provocan con o se exponen a infección por ERAV y/o ERBV. Más preferentemente, la incidencia o gravedad se reduce al menos 20 %, incluso más preferentemente, al menos 30 %, aún más preferentemente, al menos 40 %, incluso más preferentemente, al menos 50 %, aún más preferentemente, al menos 60 %, incluso más preferentemente, al menos 7o %, aún más preferentemente, al menos 80 %, incluso más preferentemente, al menos 90 %, aún más preferentemente, al menos 95 % y, lo más preferentemente, al menos 100 %, en donde los animales que reciben la composición de la presente divulgación no presentan síntomas clínicos o, como alternativa, presentan síntomas clínicos de gravedad reducida. Provechosamente, la presente divulgación también proporciona protección contra cepas heterólogas (en relación con la cepa usada en la composición) de patógenos.
La presente divulgación proporciona además un método para estimular anticuerpos neutralizantes de suero o de hemaglutinación de suero contra un patógeno seleccionado del grupo que consiste en ERAV, ERBV, WNV, WEE, VEE, EEE, EHV, EIV y combinaciones de los mismos mediante la administración de una composición de acuerdo con la presente divulgación descrita en el presente documento. En aspectos particulares, el ERAV es ERAV/ON/05, o la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una 5' UTR que comprende la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERAV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). En algunos aspectos, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe de forma inversa, tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunos aspectos, el ERBV es una cepa que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829. En algunos aspectos, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, es activa para infectar y replicar en células hospedadoras y/o codifica proteínas de ERBV funcionales, o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más de 95 %, más de 96 %, más de 97 %, más de 98 % o más de 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con n.° de referencia de ATCC PTA-11829, conteniendo dicha poliproteína proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección y replicación vírica). Preferentemente, las composiciones de la presente divulgación estimulan anticuerpos neutralizantes de suero contra ERAV y/o ERBV en un título de al menos 1:112, 1:120, 1:300, 1:500, 1:1000 o 1:1024, o superior.
La composición inmunógena de la presente divulgación proporciona una duración prolongada de inmunidad contra todas las cepas presentes en la vacuna. Preferentemente, la duración de la inmunidad contra ERAV y/o ERBV es de al menos 1 mes, más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 2 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 4-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 6­ 24 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses y, lo más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses.
La composición inmunógena de la presente divulgación también proporciona una duración prolongada de inmunidad contra todos los antígenos presentes en la vacuna. Preferentemente, la duración de la inmunidad contra el Nilo Occidental es de al menos 1 mes, más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 2 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 4-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 6-24 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses y, lo más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses.
Preferentemente, la duración de la inmunidad contra EIV es de al menos 1 mes, más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 2 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 4-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 6-24 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses y, lo más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses.
Preferentemente, la duración de la inmunidad contra EHV es de al menos 1 mes, más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 2 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 4-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 6-24 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses y, lo más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses.
Preferentemente, la duración de la inmunidad contra la encefalomielitis equina occidental es de al menos 1 mes, más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 2 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 4-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 6-24 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses y, lo más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses.
Preferentemente, la duración de la inmunidad contra la encefalomielitis equina oriental es de al menos 1 mes, más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 2 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 4-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 6-24 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses y, lo más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses.
Preferentemente, la duración de la inmunidad contra la encefalomielitis equina venezolana es de al menos 1 mes, más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 2 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 4-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 6-24 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses y, lo más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses.
Preferentemente, la duración de la inmunidad contra el toxoide tetánico es de al menos 1 mes, más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 2 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 4-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 6-24 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, incluso más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, aún más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses y, lo más preferentemente, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses.
Preferentemente, la duración de la inmunidad de al menos 12 meses se refiere además a cualquier combinación de antígenos que forman la composición inmunógena de la presente divulgación.
En un aspecto de la divulgación que comprende un ERAV y/o ERBV inactivado (o, como alternativa, atenuado vivo) como se desvela en el presente documento, la composición inmunógena mejora la excreción de ERAV y/o ERBV infecciosos para evitar la propagación del virus a otros animales susceptibles. En algunos aspectos, las composiciones evitan la excreción del virus.
En un aspecto de la divulgación que comprende el antígeno de EIV y/o EHV, como se ha descrito anteriormente, la composición inmunógena mejora la excreción de EIV y/o EHV infecciosos para evitar la propagación del virus a otros animales susceptibles.
En un aspecto, las composiciones de acuerdo con la presente divulgación descritas en el presente documento superan la interferencia de la inmunidad materna adquirida pasivamente y estimulan la inmunidad activa y una reducción en la incidencia o gravedad de signos clínicos de infección por EIV en animales vacunados contra EIV.
En un aspecto de la presente divulgación, una composición inmunógena que comprende ERAV y/o ERBV, VEE, WEE, EEE, tétanos, WNV, rinoneumonitis equina y gripe equina, todos como se describen en el presente documento, demuestra eficacia contra ERAV, ERBV, v Ee , WEE, EEE, tétanos, WNV, rinoneumonitis equina y gripe equina después de la administración de acuerdo con la presente divulgación. Preferentemente, dicha composición incluirá además un adyuvante, preferentemente HRA-5, aceite mineral y/o un carbómero, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En formas preferentes, la composición se administrará en una sola dosis de 1 ml. En algunos aspectos, la composición se administra en dos dosis o preferentemente tres dosis, con cada dosis separada por 1,2, 3 y 4 semanas.
Cada una de las composiciones inmunógenas descritas en el presente documento que incluyen ERAV, en particular ERAV/ON/05 (n.° de referencia de ATCC: PTA-11828) y otras cepas como se han descrito anteriormente, y/o ERBV, en particular una cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829 u otras como también se ha descrito anteriormente, puede administrarse como se describe de modo que reduzcan la incidencia o disminuyan la gravedad de los síntomas clínicos asociados con ERAV y/o ERBV, tales como pirexia, elevaciones de temperatura, aumento de los ruidos pulmonares, linfadenopatía, secreción nasal, secreción ocular, faringitis, edema de las piernas, tos y, en el caso de ERAV, mayor incidencia de aborto en yeguas preñadas. En algunos aspectos, las composiciones disminuyen la cantidad o duración de la secreción nasal u ocular o el tiempo durante el que se presentan dichos síntomas. En algunos aspectos, los animales inoculados con las composiciones no muestran síntomas clínicos de infección por ERAV y/o ERBV una semana o más después de la exposición a ERAV y/o ERBV. En otros aspectos, los animales inoculados con las composiciones no muestran síntomas clínicos de infección por ERAV y/o ERBV cuando se exponen a ERAV y/o ERBV. Los síntomas clínicos de ERAV y ERBV pueden puntuarse según la Tabla 3 en el Ejemplo 2, Tabla 14 en el Ejemplo 4 o Tabla 17 en el Ejemplo 5.
Cada una de las composiciones inmunógenas descritas en el presente documento que incluyen el antígeno de EIV o EIV inactivado y se pueden administrar como se describe de modo que reduzcan la incidencia o disminuyan la gravedad de los síntomas clínicos asociados con el virus de la gripe equina.
La presente divulgación también proporciona un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con el virus del herpes equino, que comprende la etapa de administrar una cualquiera de las composiciones inmunógenas descritas anteriormente que contienen antígeno de EHV o EHV inactivado o atenuado a un animal.
La presente divulgación también proporciona un método para reducir la incidencia de síntomas clínicos asociados con el virus del Nilo Occidental que comprende la etapa de administrar una cualquiera de las composiciones inmunógenas que incluye el antígeno de WNV o WNV inactivado o atenuado, como se describe en el presente documento, a un animal.
La presente divulgación también proporciona un método para reducir la incidencia de síntomas clínicos asociados con el virus de la gripe equina que comprende la etapa de administrar una cualquiera de las composiciones inmunógenas descritas anteriormente, que incluye un antígeno de EIV o EIV inactivado o atenuado, a un animal.
La presente divulgación proporciona además un método para reducir la incidencia de síntomas clínicos asociados con el virus del herpes equino que comprende la etapa de administrar una cualquiera de las composiciones inmunógenas que incluye el antígeno de EHV o EHV inactivado o atenuado, a un animal.
La presente divulgación proporciona un método para reducir la incidencia de infección vírica en una manada que comprende la etapa de administrar una cualquiera de las composiciones inmunógenas descritas anteriormente a un animal, en donde la reducción de la incidencia de infección, en comparación con manadas que no reciben la composición inmunógena, es de aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 % de reducción. En un aspecto, las composiciones desveladas en el presente documento reducen la infección por ERAV en 10 % a 50 %. En otros aspectos, las composiciones desveladas en el presente documento reducen la infección por ERBV en 10 % a 50 %.
La presente divulgación también proporciona un método para reducir la incidencia de síntomas clínicos asociados con el virus de la gripe equina que comprende la etapa de administrar una cualquiera de las composiciones inmunógenas descritas anteriormente a un animal, en donde la reducción de los signos clínicos, en comparación con animales que no reciben la composición inmunógena, es una reducción de al menos 10 % en los signos clínicos.
La presente divulgación proporciona un método para reducir la incidencia y gravedad de los síntomas clínicos de ERAV o ERBV en una manada, en donde los síntomas clínicos se seleccionan del grupo que consiste en pirexia, elevaciones de temperatura, aumento de los ruidos pulmonares, linfadenopatía, secreción nasal, secreción ocular, faringitis, tos, edema de piernas y, en el caso de ERAV, mayor incidencia de aborto en yeguas preñadas.
La presente divulgación proporciona un método para reducir la incidencia y gravedad de los síntomas clínicos de EHV en una manada, en donde los síntomas clínicos se seleccionan del grupo que consiste en enfermedad respiratoria, aborto, complicaciones reproductivas, enfermedad neurológica, enfermedad del sistema nervioso central y combinaciones de los mismos.
La presente divulgación proporciona un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con el virus del herpes equino que comprende la etapa de administrar una cualquiera de las composiciones inmunógenas desveladas en el presente documento, que incluye un antígeno de EHV o EHV inactivado o atenuado, a un animal.
La presente divulgación proporciona un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con el virus de la gripe equina en una manada, que comprende la etapa de administrar una cualquiera de las composiciones inmunógenas desveladas en el presente documento, que incluye un antígeno de EIV o EIV inactivado o atenuado, a un animal.
La presente divulgación proporciona un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con el virus del Nilo occidental en una manada, que comprende la etapa de administrar una cualquiera de las composiciones inmunógenas desveladas en el presente documento, que incluye un antígeno de WNV o WNV inactivado o atenuado, a un animal.
La presente divulgación proporciona un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con encefalomielitis equina oriental en una manada, que comprende la etapa de administrar una cualquiera de las composiciones inmunógenas desveladas en el presente documento que incluye un antígeno de virus de EEE o virus de EEE inactivado o atenuado, a un animal.
La presente divulgación proporciona además un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con encefalomielitis equina occidental en una manada, que comprende la etapa de administrar una cualquiera de las composiciones inmunógenas desveladas en el presente documento, que incluye un antígeno del virus de WEE o un virus de WEE inactivado o atenuado, a un animal.
La presente divulgación proporciona además un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de los síntomas clínicos asociados con encefalomielitis equina venezolana en una manada, que comprende la etapa de administrar una cualquiera de las composiciones inmunógenas desveladas en el presente documento, que incluye un antígeno del virus de VEE o un virus de VEE inactivado atenuado, a un animal.
Los aspectos anteriormente mencionados de la divulgación pueden usarse en una terapia de combinación o como parte de un programa de inmunización en combinación con otros agentes inmunógenos y vacunas. En un aspecto, las composiciones desveladas en el presente documento se usan en combinación con los agentes inmunógenos y las vacunas descritas en el documento WO 2010/025469.
La presente divulgación también proporciona un método para preparar una cualquiera de las composiciones inmunógenas como se ha descrito anteriormente y en el presente documento, que comprende las etapas de combinar un ERAV o ERBV inactivado o vivo, atenuado, con un vehículo farmacéutico adecuado. En formas preferentes, este método comprende además la etapa de añadir uno o más antígenos equinos o virus inactivados o atenuados. Un grupo preferido de antígenos y virus equinos se selecciona del grupo que consiste en virus del Nilo Occidental, encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina venezolana, EHV y EIV, y toxoide tetánico, y combinaciones de los mismos. En algunas formas preferidas, los métodos descritos en el presente documento pueden comprender además una etapa de filtración, en donde el producto final está en una forma más pura.
"Aproximadamente" se refiere a 10 % de la cantidad especificada.
"Animales", como se usa en el presente documento, incluye animales domesticados, incluyendo perros y animales con pezuñas, incluyendo équidos y, específicamente, caballos. En algunos aspectos, el término también se refiere a un ser humano.
Los "adyuvantes", como se usa en el presente documento, pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas, por ejemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), aceite no metabolizable, aceites minerales y/o de plantas/vegetales y/o animales, polímeros, carbómeros, tensioactivos, compuestos orgánicos naturales, extractos vegetales, hidratos de carbono, colesterol, lípidos, emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite en agua, emulsión de agua en aceite en agua, HRA-3 (polímero reticulado de sacárido de ácido acrílico), HRA-3 con aceite de semilla de algodón (CSO) o preferentemente HRA-5 (polímero reticulado de poliol de ácido acrílico). La emulsión puede basarse en particular en aceite de parafina líquida ligero (del tipo de la Farmacopea Europea); aceite isoprenoide tal como escualano o escualeno; aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más en particular aceites vegetales, oleato de etilo, di(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos grasos ramificados o alcoholes, en particular ésteres de ácido isoesteárico. El aceite se usa en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes son preferentemente tensioactivos no iónicos, en particular, ésteres de sorbitano, de manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, que están opcionalmente etoxilados, y bloques de copolímero de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic, especialmente L121. Véase Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.) John Wiley and Sons, NY, págs.
51-94 (1995) y Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997). En un aspecto preferido, el adyuvante está a una concentración de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 %, preferentemente a una concentración de aproximadamente 2 % a 30 %, más preferentemente a una concentración de aproximadamente 5 % a aproximadamente 25 %, aún más preferentemente a una concentración de aproximadamente 7 % a aproximadamente 22 % y lo más preferentemente a una concentración de aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 % en volumen del producto final.
Como se usa en el presente documento, "un vehículo farmacéuticamente aceptable" o "vehículo farmacéutico" incluye todos y cada uno de los excipientes, disolventes, medios de cultivo, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes inactivadores, agentes antimicrobianos, antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardantes de la adsorción y similares. Dichos ingredientes incluyen los que son seguros y apropiados para su uso en aplicaciones veterinarias. En algunos aspectos preferidos, y especialmente los que incluyen composiciones inmunógenas liofilizadas, los agentes estabilizantes para su uso en la presente divulgación incluyen estabilizantes para liofilización o criodesecación.
Los "diluyentes" pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina y sales alcalinas de ácido etilendiaminotetracético, entre otros.
En un aspecto preferido, se prepara la composición inmunógena de la presente divulgación que comprende un conservante y un estabilizante; y, más preferentemente, se prepara la composición inmunógena de la presente divulgación que comprende anfotericina, formaldehído, gentamicina, EDTA, glicerol y combinaciones de los mismos.
Una "composición inmunógena o inmunológica" se refiere a una composición de materia que comprende al menos un antígeno, que induce una respuesta inmunológica en el hospedador de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos a la composición o vacuna de interés. Habitualmente, una "respuesta inmunológica" incluye, pero sin limitación, uno o más de los siguientes efectos: la producción o activación de anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T auxiliares, linfocitos T supresores, y/o linfocitos T citotóxicos y/o linfocitos T gamma-delta, dirigidos específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el hospedador presentará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, de modo que se potencie la resistencia a una nueva infección y/o se reducirá la gravedad clínica de la enfermedad. Dicha protección se demostrará mediante una reducción o falta de signos clínicos normalmente presentados por un hospedador infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o una menor duración o una disminución del título bacteriano en los tejidos o líquidos corporales o excreciones del hospedador infectado.
La expresión "que necesite dicha administración" o "que necesite dicho tratamiento de administración", como se usa en el presente documento significa que la administración/tratamiento está asociado con el refuerzo o la mejora de la salud o cualquier otro efecto medicinal positivo en la salud de los animales que reciben la composición inmunógena de acuerdo con la presente divulgación, tal como reducir la incidencia o la gravedad de una infección o enfermedad vírica.
"Virus de la rinitis equina A (ERAV)" se refiere a un Aphthovirus en la familia Picornaviridae y anteriormente se conocía como rinovirus equino 1. "ERAV" como se usa en el presente documento incluye formas inactivadas. En un aspecto, el ERAV es la cepa ERAV/ON/05 que tiene el número de referencia PTA-11828 depositada el 14 de abril de 2011 en la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo, apartado de correos 1549 Manassas, VA 20108 EE. UU.) de acuerdo con el T ratado de Budapest y que se recuperó del cultivo celular de riñón de conejo 13 (RK-13) de un hisopo nasal de un caballo en Ontario, Canadá en 2005. El ERAV/ON/05 cuando se transcribe de forma inversa y se secuencia tiene la SEQ ID NO: 1 en su región 5' UTR.
La secuencia genómica transcrita inversa de ERAV/ON/05 es la SEQ ID NO: 2.
La poliproteína codificada por la secuencia genómica de ERAV/ON/05 es la SEQ ID NO: 3.
Las cepas de ERAV útiles en las composiciones inmunógenas de la divulgación tienen secuencias de nucleótidos 5' UTR transcritas de forma inversa que tienen más de 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. En algunos aspectos, las cepas de ERAV tienen secuencias genómicas que cuando se transcriben de forma inversa en ADN son más de 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la SEQ ID NO: 2 o tienen secuencias codificantes de poliproteínas que son más de 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la secuencia codificante de poliproteínas en la SEQ ID NO: 2. En algunos aspectos, los ERAV tienen poliproteínas con una secuencia de aminoácidos más de 95 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 3 o a la secuencia de VP1 dentro de la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos más, el ERAV tiene una proteína L, VP2, VP3, VP4, VP0, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C o 3D, que tienen una secuencia de aminoácidos con más de 80 %, más de 90 %, más de 99 % o 100 % de identidad con la misma proteína que se encuentra en la SEQ ID NO: 3. Todas las cepas de ERAV son, cuando no están inactivadas o atenuadas, infecciosas y capaces de replicarse en células hospedadoras.
"Virus de la rinitis equina B (ERBV)" se refiere a un Erbovirus en la familia Picornaviridae y anteriormente se conocía como rinovirus equino 2. "ERBV" como se usa en el presente documento incluye formas inactivadas. En una realización, el ERBv es una cepa depositada en la ATCC que se recuperó del cultivo celular de riñón de conejo 13 (RK-13) de un hisopo nasal de un caballo en Ontario, Canadá (número de referencia de ATCC: PTA-11829) que se depositó en la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo, apartado de correos 1549 Manassas, VA 20108, EE. u U.) el 14 de abril de 2011 según el Tratado de Budapest. Las cepas de ERBV útiles en las composiciones inmunógenas de la divulgación tienen secuencias genómicas que cuando se transcriben de forma inversa en ADN son más de 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas al transcrito inverso de la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829, o tienen secuencias codificantes de poliproteínas que son más de 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la secuencia codificante de poliproteína de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829. En algunos aspectos, las cepas de ERBV útiles tienen poliproteínas con una secuencia de aminoácidos más de 95 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de poliproteína de la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829. En otros aspectos más, el ERBV tiene una proteína L, VP4, VP2, VP3, VP1, 2A, 2B, 2C, 3A (Vpg), 3B, 3Cpro, 3Dpol que tienen una secuencia de aminoácidos con más de 80 %, más de 90 %, más de 99 % o 100 % de identidad con la misma proteína encontrada en la cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829. Todas las cepas de ERBV son, cuando no están inactivadas o atenuadas, infecciosas y capaces de replicarse en células hospedadoras.
La expresión antígeno de "virus del Nilo Occidental" significa, pero sin limitación, los componentes del virión de WNV que son inmunógenos cuando están presentes en un animal, y más en particular componentes proteicos, tales como proteínas de envoltura y no estructurales, del WNV que provocan respuestas inmunitarias humorales o celulares cuando están presentes en un animal. Dichos antígenos pueden incluir ADN, subunidades proteicas, virus vivos modificados y virus inactivado. En formas preferidas de la divulgación, el antígeno o antígenos de WNV comprenden cepas de w Nv inactivadas o destruidas, e incluso más preferentemente, dominante norteamericano.
La expresión "(cepas de) virus del Nilo occidental norteamericano" se refiere a, pero sin limitación, ninguna cepa del virus del Nilo Occidental que se haya descubierto en el continente norteamericano. Preferentemente, una cepa del virus del Nilo occidental norteamericano tiene una identidad de secuencia con la cepa NY99 (n.° de referencia de GenBank AF196835 o secuencia de referencia del NCBI NC_00942.1 de al menos 97 %, incluso más preferentemente, al menos 98 %, aún más preferentemente, al menos 98,5 %, más preferentemente, al menos 99 %, incluso más preferentemente, al menos 99,2 % y, más preferentemente, de al menos 99,4 %. WN02 es un ejemplo representativo de una cepa de WNV que se puede denominar cepa del virus del Nilo occidental dominante norteamericano. Específicamente, las cepas dominantes norteamericanas son las que tienen al menos 1 cambio de nucleótidos que da como resultado un cambio de aminoácidos de los aislados de w N99. La cepa NY99 (n.° de referencia de GenBank AF196835) actúa como una cepa de referencia para determinar si una cepa es dominante norteamericana. Además, estas cepas pueden tener uno o más cambios silenciosos de aminoácidos. En algunos aspectos, el cambio de nucleótidos da como resultado un cambio de aminoácidos en una proteína de envoltura de la cepa y, más preferentemente, el cambio de nucleótidos da como resultado un cambio de aminoácidos de valina a alanina. Preferentemente, este cambio de aminoácidos está asociado con una mayor capacidad de replicación en el hospedador intermedio, en concreto, el mosquito. Más preferentemente, las cepas dominantes norteamericanas incluyen una mutación de U a C (y preferentemente ambas) y una mutación de C a U en las posiciones 1442 y 2466 (en comparación con una cepa norteamericana, por ejemplo, NY 99), respectivamente. Aún más preferentemente, las cepas dominantes norteamericanas incluyen además una mutación en la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína E y la mutación de C a U en la posición 9352 en la secuencia que codifica la proteína NS5 (de nuevo en comparación con una cepa norteamericana, por ejemplo, NY 99). Estas mutaciones preferidas se muestran en el análisis filogenético de los aislados del virus del Nilo occidental norteamericano, 2001-2004: Evidence For the Emergence of a Dominant Genotype, C. Todd Davis, et al., Virology 342, pág. 252-265 (2005). Las cepas del virus del Nilo occidental, para los fines de la presente divulgación, no se limitan a las cepas del virus del Nilo occidental de caballo y equinas, sino que abarcan, sin limitación, las cepas del virus del Nilo occidental de origen aviar, origen asinino, origen porcino, origen humano, origen mamífero y origen equino.
La "identidad de secuencia" como se conoce en la técnica se refiere a una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas, a saber, una secuencia de referencia y una secuencia dada para comparar con la secuencia de referencia. La identidad de secuencia se determina comparando la secuencia dada con la secuencia de referencia después de que las secuencias se hayan alineado de manera óptima para producir el mayor grado de similitud de secuencia, según lo determinado por la coincidencia entre cadenas de dichas secuencias. Tras dicho alineamiento, la identidad de secuencia se determina posición a posición, por ejemplo, las secuencias son "idénticas" en una posición particular si, en esa posición, los nucleótidos o restos de aminoácidos son idénticos. El número total de dichas identidades de posición se divide después por el número total de nucleótidos o restos en la secuencia de referencia para proporcionar el % de identidad de secuencia. La identidad de secuencia puede calcularse fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo, pero sin limitación, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, Nueva York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M. y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York (1991); y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad de secuencia están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad de secuencia están codificados en programas informáticos disponibles públicamente, que determinan la identidad de secuencia entre secuencias dadas. Los ejemplos de dichos programas incluyen, pero sin limitación, el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). El programa BLASTX está disponible públicamente en el Nc BI y otras fuentes (Manual de BLAST, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)). Estos programas alinean de manera óptima las secuencias usando pesos de hueco predeterminados para producir el mayor nivel de identidad de secuencia entre las secuencias dadas y las de referencia. Como ilustración, por un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos, por ejemplo, 85 %, preferentemente 90 %, incluso más preferentemente 95 % de "identidad de secuencia" con una secuencia de nucleótidos de referencia, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido dado es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia polinucleotídica dada puede incluir hasta 15, preferentemente hasta 10, incluso más preferentemente hasta 5 mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, en un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 85 %, preferentemente 90 %, incluso más preferentemente 95 % de identidad con respecto a la secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 15 %, preferentemente 10 %, incluso más preferentemente 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia puede suprimirse o sustituirse con otro nucleótido, o varios nucleótidos hasta 15 %, preferentemente 10 %, incluso más preferentemente 5 % del total de nucleótidos en la secuencia de referencia puede insertarse en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones 5' y 3' terminal de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier sitio entre esas posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. De manera análoga, por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos dada que tiene al menos, por ejemplo, 85 %, preferentemente 90 %, incluso más preferentemente 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, se entiende que la secuencia de aminoácidos dada del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia polipeptídica dada puede incluir hasta 15, preferentemente hasta 10, incluso más preferentemente hasta 5 alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia polipeptídica dada que tenga al menos 85 %, preferentemente 90 %, incluso más preferentemente 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 15 %, preferentemente hasta 10 %, incluso más preferentemente, hasta 5 % de los restos de aminoácidos en la secuencia de referencia pueden suprimirse o sustituirse con otro aminoácido, o varios aminoácidos hasta 15 %, preferentemente hasta 10 %, incluso más preferentemente, hasta 5 % del número total de restos de aminoácidos en la secuencia de referencia puede insertarse en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre los restos en la secuencia de referencia o en el o los grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas. Sin embargo, las sustituciones conservadoras no se incluyen como una coincidencia cuando se determina la identidad de secuencia. En la presente divulgación, se entiende que la SEQ ID NO: 1 (5' UTR) y la SEQ ID NO: 2 son las secuencias de ADN que resultan de la transcripción inversa de la 5' UTR y el genoma completo de ERAV/ON/05, respectivamente. De forma análoga, la SEQ ID NO: 3 se refiere a la secuencia de aminoácidos correspondiente a la poliproteína codificada por la secuencia genómica de ERAV/ON/05. Por tanto, se entiende que el porcentaje de identidad de una cepa de ERAV dada en comparación con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 se refiere a la secuencia de ADN correspondiente resultante de transcripción inversa y secuenciación.
"DICT50" se refiere a la dosis infecciosa de cultivo tisular que infecta al 50 % de las células en un cultivo inoculado con el virus.
Para los fines de la presente invención, los términos "cepa" y "aislado" tienen el mismo significado y se usan indistintamente.
Los "signos clínicos" o "síntomas clínicos" para ERAV y ERBV incluyen, pero sin limitación, pirexia, elevación de temperatura, aumento de los ruidos pulmonares, linfadenopatía, secreción nasal, secreción ocular, y tos y faringitis. Otros signos o síntomas más incluyen anemia, anorexia, linfadenitis de la cabeza y el cuello, edema de las piernas, letargo y dolor. Adicionalmente, los signos clínicos de infecciones por ERAV y/o ERBV pueden incluir los asociados con el virus del herpes equino y el virus de la gripe equina. En un aspecto, los signos clínicos para ERAV incluyen tos, faringitis, pirexia, elevaciones de temperatura, aumento del tamaño de los ganglios linfáticos submandibulares, secreción nasal y secreción ocular. En determinados aspectos, los signos clínicos de ERAV incluyen una mayor incidencia de aborto en yeguas preñadas. En otro aspecto, los signos clínicos para abordar mediante una composición inmunológica desvelada en el presente documento son los de infecciones respiratorias, tales como los provocados por uno o más de ERAV, ERBV, EIV, EHV-1 y EHV-4.
Los "signos clínicos" o "síntomas clínicos" del virus del Nilo Occidental, para los fines de la presente divulgación, incluyen, pero sin limitación, síntomas o lesiones asociados con encefalitis, viremia, anorexia, depresión, fiebre, debilidad, trastornos de la marcha, parálisis de las extremidades posteriores, deficiencia visual, ataxia, deambulación sin rumbo, convulsiones, incapacidad para tragar, coma, debilidad posterior, parálisis, mala coordinación, depresión y comportamiento relacionado, temblores, convulsiones, movimiento de remo de las extremidades, problemas neurológicos, hinchazón del sistema nervioso central, muerte y combinaciones de los mismos. Los signos clínicos presentados por un animal infectado varían dependiendo de la gravedad de la infección.
Los "signos clínicos" o "síntomas clínicos" del virus del herpes equino, para los fines de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, aborto, deficiencias neurológicas, enfermedad respiratoria, deficiencias y fallo del aparato reproductor y síntomas relacionados con el sistema nervioso central. Adicionalmente, los síntomas clínicos de EHV1 incluyen, pero sin limitación, el fenómeno de los potros infectados con EHV1, que presentan complicaciones respiratorias, que transmiten el virus a los miembros mayores de la manada que después presentan deficiencias reproductivas, incluyendo aborto, y deficiencias neurológicas, normalmente presentadas en el sistema nervioso central.
Los "signos clínicos" o "síntomas clínicos" de la encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental y encefalomielitis equina venezolana, para los fines de la presente divulgación son los síntomas que se sabe que normalmente están asociados con la encefalomielitis, incluyendo, pero sin limitación, fiebre, signos nerviosos como sensibilidad al sonido, periodos de emoción e inquietud, lesiones cerebrales, somnolencia, orejas caídas, movimiento en círculos, trastornos de la marcha, parálisis, pérdida de apetito, depresión, presión de la cabeza contra la pared, falta de coordinación, discapacidad a largo plazo, daño cerebral, muerte y combinaciones de los mismos. "Seguridad", como se usa en el presente documento, se refiere a la ausencia de consecuencias adversas en el animal vacunado después de la vacunación, incluyendo, pero sin limitación, posible reversión del virus de la vacuna a virulencia y efectos secundarios clínicamente significativos, tales como enfermedad sistémica persistente o inflamación inaceptable en el sitio de administración de la vacuna.
"Reducción de la incidencia y/o gravedad de los signos clínicos" o "reducción de la incidencia y/o gravedad de los síntomas clínicos", como se indica en el presente documento, significa reducir el número de animales infectados en un grupo, reducir o eliminar el número de animales que presentan signos clínicos de infección o reducir la gravedad de cualquier signo clínico que esté presente en los animales, en comparación con infección de tipo silvestre. Por ejemplo, dichos signos clínicos incluyeron viremia, fiebre, respuesta de anticuerpos, secreción ocular, secreción nasal e histopatología. Preferentemente, estos se reducen en animales que reciben la composición de la presente divulgación en al menos 10 % en comparación con los animales que no reciben la vacunación, que pueden infectarse. Más preferentemente, se reducen los signos clínicos en animales que reciben la composición de la presente divulgación en al menos 20 %, más preferentemente en al menos 30 %, incluso más preferentemente en al menos 40 % e incluso más preferentemente en al menos 50 %.
"Duración de la inmunidad", como se usa en el presente documento, se refiere al número mínimo de días durante los que un animal produce una respuesta inmunógena de manera que el animal sea relativamente inmune a contraer un virus y/o se beneficie de la reducción de la incidencia y/o gravedad de los signos clínicos, como se describe en el presente documento.
Las expresiones "inactivado" y "virus inactivado" se refieren a un virus previamente virulento que se ha calentado o tratado químicamente para inactivar, destruir o modificar de otro modo el virus para eliminar sustancialmente sus propiedades virulentas conservando al mismo tiempo su inmunogenicidad. En un aspecto preferido, los virus inactivados desvelados en el presente documento se inactivan mediante tratamiento con un agente inactivador. Los agentes inactivadores adecuados incluyen beta-propiolactona, etilenimina binaria, glutaraldehído y formaldehído. En algunos aspectos, el agente inactivador es formaldehído.
Se entiende que las expresiones "vacuna" y "composición inmunógena", cuando se usan en el presente documento, se usan indistintamente.
Cualquier cepa o aislado del virus del Nilo occidental se puede usar de acuerdo con la presente divulgación. En un aspecto preferido, el aislado se selecciona entre uno o más de los siguientes: aislado de Nueva York (norteamericano del noreste) (WNNY 99), origen equino, 1999, aislado de Nueva York (norteamericano del noreste) (WN-NY 99), origen corvino, 1999, aislado 292206 del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA 2004), origen asinino, aislado 405330 del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA 2005), origen equino, aislado norteamericano (WN-Texas-2002/2003), aislado costero del sureste de Texas 2002, aislado de México (Tabasco) 2003 y combinaciones de los mismos y, en un aspecto más preferido, el aislado se selecciona entre uno o más de los siguientes: aislado 292206 del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA 2004), origen asinino, aislado 405330 del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA 2005), origen equino, aislado norteamericano (WN-Texas-2002/2003), aislado costero del sureste de Texas 2002, aislado de México (Tabasco) 2003 y combinaciones de los mismos. En un aspecto más preferido, el aislado es el aislado 405330 del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA 2005), origen equino, individualmente o en combinación con uno o más aislados como se ha enumerado anteriormente. En un aspecto adicionalmente preferido, se incluyen los aislados que forman parte de los aislados del virus del Nilo Occidental norteamericanos. En otro aspecto preferido más, se incluyen aislados del virus del Nilo Occidental dominantes norteamericanos. Además de los enumerados anteriormente, los aislados específicos incluyen, pero sin limitación, WN02 y aislados que tienen al menos 1, preferentemente al menos 2 e incluso más preferentemente al menos 3 cambios de nucleótidos que dan como resultado al menos un cambio de aminoácido de los aislados WN NY99 y se son más preferentes cepas con el cambio de aminoácido de valina a alanina en la posición 159 de la proteína de la envoltura. Las cepas dominantes norteamericanas más preferentes incluyen, pero sin limitación: NY2002Nassau, NY2002Clinton, NY2002Queens, GA20021, GA20022, TX20021, TX20022, IN2002, NY2003Albany, NY2003Suffolk, NY2003Chatauqua, CO20031, CO20032, TX2003, TX2003Harris4, TX2003Harris6, TX2003Harris7, TX2003Harris10, AZ2004 y TX2004Harris4, y combinaciones de los mismos. Las cepas del virus del Nilo Occidental útiles en la vacuna o composición inmunógena de la presente divulgación pueden ser cualquier cepa o aislado. En un aspecto preferido, la cepa del virus del Nilo occidental dominante norteamericano usada es E-159 (origen equino) o E-159 (origen asinino). Una cepa representativa de dicha cepa de WNV dominante norteamericana incluye la cepa de origen equino 2005 depositada en la ATCC (n.° de referencia de ATCC: PTA-9409), ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, el 14 de agosto de 2008, según las disposiciones del Tratado de Budapest. Las cepas de gripe equina útiles en la vacuna o composición inmunógena de la presente divulgación pueden ser cualquier cepa o aislado. Las cepas representativas incluyen Equi-2/Ohio/03, depositada con el n.° de referencia de ATCC: PTA-9522, Equi-2/Kentucky/95, depositada con el n.° de referencia de ATCC: PTA-9523 y Equi-2/New Market/2/93, depositada con el n.° de referencia de ATCC: PTA-9524. Los n.° de referencia ATCC de cepas representativas PTA-9522, PTA-9523 y PTA-9524 fueron depositados cada uno en la ATCC en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209 el 23 de septiembre de 2008, según las disposiciones del T ratado de Budapest.
Las cepas de virus del herpes equino ("EHV") útiles en la vacuna o composición inmunógena de la presente divulgación pueden ser cualquier cepa o aislado. Las cepas representativas incluyen EHV Subtipo 1, depositada con el n.° de referencia de ATCC: Pt A-9525 y EHV Subtipo 4, depositada con el n.° de referencia de ATCC: PTA-9526. Los n.° de referencia ATCC de cepas representativas PTA-9525 y PTA-9526 fueron depositados cada uno en la ATCC en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209 el 23 de septiembre de 2008, según las disposiciones del Tratado de Budapest.
Las cepas de encefalomielitis equina occidental útiles en la vacuna o composición inmunógena de la presente divulgación pueden ser cualquier cepa o aislado. Una cepa representativa incluye la cepa Fleming, depositada en la ATCC (n.° de referencia de At CC: Pt A-9410), ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, el 14 de agosto de 2008, según las disposiciones del Tratado de Budapest.
Las cepas de encefalomielitis equina venezolana útiles en la vacuna o composición inmunógena de la presente divulgación pueden ser cualquier cepa o aislado. Una cepa representativa incluye la cepa TC-83, depositada en la ATCC (n.° de referencia de ATCC: PTA-9411), ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, el 14 de agosto de 2008, según las disposiciones del Tratado de Budapest.
Las cepas de encefalomielitis equina oriental útiles en la vacuna o composición inmunógena de la presente divulgación pueden ser cualquier cepa o aislado. Una cepa representativa incluye la cepa NJO, depositada en la ATCC (n.° de referencia de At Cc : Pt A-9412), ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, el 14 de agosto de 2008, según las disposiciones del Tratado de Budapest.
Las cepas de toxoide tetánico útiles en la vacuna o composición inmunógena de la presente divulgación pueden ser cualquier cepa o aislado. Una cepa representativa es la tomada de una semilla maestra de Clostridium tetani del Instituto de Laboratorios del Departamento de Salud Pública de Massachusetts en Boston, Massachusetts.
La vacuna o composición inmunógena como se desvela en el presente documento es segura para su administración en especies susceptibles a ERAV o ERBV, en particular équidos, a cualquier edad. En un aspecto preferido, la presente divulgación es segura para su administración a potros de 12 meses de edad o mayores, más preferentemente, es segura para su administración a potros de 10 meses de edad o mayores, más preferentemente, es segura para su administración a potros de 8 meses o mayores, más preferentemente, es segura para su administración a potros de 6 meses de edad o mayores, más preferentemente, es segura para su administración a potros de 4 meses de edad o mayores, más preferentemente, es segura para su administración a potros de 2 meses de edad o mayores, más preferentemente, es segura para su administración a potros de 1 mes de edad o mayores, incluso más preferentemente, es segura para su administración a potros entre 1 día y 1 mes de edad y, lo más preferentemente, es segura para su administración a potros de 1 día de edad o mayores.
Las composiciones como se desvelan en el presente documento pueden administrarse de cualquier manera convencional. Los ejemplos de métodos de administración incluyen cualquiera que permita el acceso de las células del sistema inmunitario a la composición inmunógena, incluyendo oral, transdérmica/intradérmica, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraocular, intraperitoneal, intrarrectal, intravaginal, intranasal, intragástrica, intratraqueal, intrapulmonar o cualquier combinación de las mismas. En un aspecto preferido, la vacuna se administra por vía parenteral, preferentemente por vía intranasal, por vía subcutánea o por vía intramuscular y, en el aspecto más preferido, la vacuna se administra por vía intramuscular.
En un aspecto, se desvela un método para preparar una composición inmunógena que comprende un ERAV y/o ERAB como se desvela en el presente documento. En un aspecto, el método comprende:
a) infectar una línea celular susceptible con ERAV o ERBV;
b) cultivar la línea celular infectada en medios de cultivo hasta que se logre un efecto citopático (CPE);
c) recoger los medios;
d) filtrar los medios para producir un medio filtrado; y
e) poner en contacto los medios filtrados con un agente inactivador para obtener el ERAV o ERBV inactivado.
En un aspecto de la divulgación, el método comprende proporcionar la cepa ERAV/ON/05 o una cepa de ERBV que tenga el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829. Estas cepas se usan para infectar una línea celular susceptible que tiene propiedades ventajosas de crecimiento y secreción útiles para la preparación de vacunas. Una línea celular susceptible preferida es una línea celular Vero tal como una línea celular Vero76 o E-Vero.
Los medios de cultivo adecuados incluyen E199. Este medio puede complementarse con solución de L-glutamina y un antibiótico tal como solución de sulfato de gentamicina. En algunos aspectos, el medio de cultivo es E199 suplementado con solución de L-glutamina (hasta 2 mM) y solución de sulfato de gentamicina (hasta 30 pg/ml). En algunos aspectos, se recogen líquidos víricos cuando el efecto citopático CPE alcanza 75 % o más. Los medios recogidos se agrupan y filtran, tal como a través de cartuchos de filtro de polipropileno con un tamaño de poro de 5,0 micrómetros. Las cepas se inactivan químicamente, tal como mediante tratamiento con solución de formaldehído al 0,1-0,2 % durante un periodo de tiempo adecuado, por ejemplo de 48 horas a 72 horas, y los líquidos resultantes se concentran. En algunos aspectos, se añaden a continuación conservantes y adyuvantes. Los conservantes adecuados incluyen uno o más de anfotericina B, sulfato de gentamicina y formaldehído. En otros aspectos, el adyuvante es HRA-5. En otros aspectos más, el adyuvante es HRA-3 con aceite de algodón (CSO).
En un aspecto y de acuerdo con los métodos desvelados en el presente documento, se desvela una composición inmunógena que comprende ERAV/ON/05 y/o una cepa de ERBV que tiene el n.° de referencia de ATCC: PTA-11829 y anfotericina B, sulfato de gentamicina, formaldehído y HRA-5 preparados según los métodos desvelados en el presente documento.
Los siguientes ejemplos se exponen a continuación para ilustrar realizaciones específicas de la presente invención. Estos ejemplos son meramente ilustrativos y se entiende que no limitan el alcance o los principios subyacentes de la presente invención.
Ejemplo 1
Este ejemplo ilustra una realización de una composición de virus de la rinitis equina A de acuerdo con la presente divulgación
Materiales y métodos
La cepa del virus de la rinitis equina A ERAV/ON/05 (n.° de referencia de ATCC PTA-11828) se recuperó del cultivo de células de riñón de conejo l3 (RK-13) de un hisopo nasal de un caballo en Ontario, Canadá. El virus se pasó una vez por células E-Vero para producir una reserva maestra de pretitulación alta y después se diluyó con medios de cultivo celular para producir el virus de semilla maestra. La reserva celular maestra es una línea celular E-Vero cultivada y mantenida usando E199 complementado con solución de L-Glutamina (hasta 2 mM) y solución de sulfato de gentamicina (hasta 30 pg/ml). Se produjo ERAV/ON/05 inactivado de acuerdo con el siguiente procedimiento general.
La reserva celular maestra congeladas se descongela a temperatura ambiente (18-26 °C) y se usa para inocular una serie de matraces preesterilizados T-25 cm2 hasta T-150 cm2 o frascos rotatorios PETG preesterilizados de 850 cm2 o 1050 cm2. Las células descongeladas se suspenden en medio de cultivo a una tasa de 0,15 a 0,40 ml por cm2. Las células se incuban a 36-38 °C durante hasta siete días. Los cultivos sembrados a partir de reserva congelada se pueden volver a alimentar con medio para eliminar el sulfóxido de dimetilo residual (DMSO), para eliminar residuos excesivos, para estimular el crecimiento de cultivos que no han alcanzado la confluencia o para mantener la viabilidad de los cultivos confluyentes. Las células se pasan mediante decantado del medio gastado y adición de 1-10 ml (dependiendo del tamaño del recipiente), de solución de tripsina-EDTA al 25 % a cada recipiente. Los recipientes se agitan suavemente hasta que las células se desprenden de la superficie. Las células se retiran de los recipientes mediante aclarado con medio de cultivo y se agrupan entre sí. El intervalo de pases de cultivo celular es de uno a veinte.
Antes de la inoculación, se decantan del medio de cultivo celular las células que tienen al menos 90 % de confluencia. La lámina celular se aclara con 20-50 ml de medio de infección de virus (E199 complementado con solución de L-Glutamina (hasta 2 mM) y solución de sulfato de gentamicina (hasta 30 pg/ml), después se vuelve a alimentar con medios de infección de virus a la tasa de 0,15 a 0,40 ml/cm2. Después se inoculan los recipientes a una Multiplicidad de Infección (MOI) de 0,0005 a 0,005. Los cultivos en frasco rotatorio se incuban a 36-38 °C durante dos a cinco días a 0,2-0,4 rpm.
Durante el periodo de crecimiento, los cultivos se comprueban para determinar el CPE microscópicamente y para determinar la contaminación a gran escala macroscópicamente. Los cultivos inadecuados se descartan después de la esterilización.
Se recogen líquidos de virus cuando el CPE alcanza el 75 % o más. Se hacen girar frascos rotatorios para retirar las células sueltas y los líquidos se agrupan en botellas de vidrio, plástico o PETG estériles de 2-20 l, recipientes de polipropileno estériles de 20 l o tanques de acero inoxidable estériles de 2-200 l apropiados para aclaraciones. Los líquidos agrupados se pueden mantener durante hasta siete días a 2-8 °C antes de la aclaración.
Solo se recogen líquidos de cultivos en monocapa que muestren pruebas de infección vírica. Se desechan los frascos que indiquen contaminación. Se recoge una muestra de líquidos agrupados, aclarados, antes de la inactivación para valoración por DICT50. Pueden usarse líquidos con un título de 1062 DICT50/ml o mayor en la preparación del producto final. Se pueden mezclar múltiples lotes para lograr los títulos mínimos.
Los lotes recogidos se aclaran por filtración usando cartuchos de filtro de polipropileno con un tamaño de poro de 5,0 micrómetros. Los lotes de recogida posteriores a la clarificación pueden almacenarse durante hasta siete días a 28 °C. Los líquidos aclarados se inactivan después con solución de formaldehído, USP, 0,1-0,2 % por volumen, transferido a un recipiente secundario y mantenido a temperatura ambiente (18-26 °C) con agitación durante un mínimo de 48 a 72 horas. Se toma una muestra de líquidos inactivados para la prueba de certeza de inactivación antes de la concentración. El material del lote inactivado se mantiene a 2-8 °C antes de la concentración. Los líquidos de virus inactivados, aclarados, se concentran por un factor de 5X a 50X usando cartuchos de membrana de ultrafiltración de flujo tangencial con valores de corte de peso molecular de no más de 10.000 Dalton PM.
Se pueden añadir varios adyuvantes adecuados a la formulación de vacuna, más preferentemente HRA-5. Otros adyuvantes incluyen HRA-3 con aceite de semilla de algodón (CSO). Se pueden emplear etapas de procesamiento normales tales como mezcla, combinación, microfluidificación y emulsión, del adyuvante y/o los antígenos de virus recogidos con otros ingredientes.
El producto se ensambla después en la formulación final. En un método de procesamiento por lotes en una realización ejemplar, las cantidades necesarias de adyuvante y diluyente MEME se combinan en un recipiente estéril y el pH se ajusta a aproximadamente 6,3-6,7 con hidróxido de sodio. ERAV, sulfato de gentamicina, formaldehído y anfotericina B se añaden uno cada vez durante la mezcla constante. El pH se ajusta a 6,8-7,0 con hidróxido de sodio o ácido clorhídrico y la serie se mezcla durante un mínimo de 18 horas a 2-8 °C. La serie a granel completa se transfiere después a un recipiente de almacenamiento adecuado y se almacena a 2-8 °C. La anfotericina B se puede añadir a una concentración de hasta 2,5 pg/ml del volumen de diluyente como conservante. Se añade sulfato de gentamicina a una concentración de hasta 30 pg/ml del volumen del diluyente como conservante. Se añade formaldehído a una concentración de 0,1 % del volumen de diluyente como conservante. Se añade un adyuvante tal como HRA-5 a una concentración de 10 % v/v del volumen de serie final.
La vacuna se administra mediante inyección hipodérmica normal, con vacunas de refuerzo si se desea.
Ejemplo 2
Esta investigación se llevó a cabo para obtener una evaluación de la eficacia de una vacuna contra el virus de la rinitis equina A para proteger a los caballos de la exposición al virus de la rinitis equina A.
Materiales y métodos
Se preparó una vacuna de ERAV de dosis alta A-9 (1075 DICT50/ml) y dosis baja A-10 (1070 DICT50/ml) según el Ejemplo 1.
Tabla 1: Formulación de vacuna A-9 1 ml :
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Tabla 2: Formulación de vacuna A-10 1 1 ml :
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Se preparó una formulación de 1 ml de placebo V-05 como en las vacunas A-9 y A-10 pero sin el antígeno ERAV/ON/05.
Se dividieron un total de 44 caballos al azar en uno de tres grupos de tratamiento que consisten en un grupo de control de placebo V-05 de 15 caballos, un grupo de dosis baja A-10 de 14 caballos y un grupo de dosis alta A-9 de 15 caballos. Los caballos fueron vacunados con un producto de dosis de 1 ml con h RA-5 como adyuvante para tres dosis totales, con un intervalo de 21 días entre dosis. Los caballos se expusieron posteriormente 21 días después de la tercera vacunación mediante aerosolización intranasal con una dosis de 1070 DICT50/ml de Rinitis A nebulizada durante un periodo de cuatro minutos. Los caballos se evaluaron para determinar signos clínicos de signos de temperatura, exudado nasal, secreción ocular diaria. Se tomó sangre para neutralización de suero (SN) semanalmente.
Virus de exposición
El virus de exposición se produjo en cultivo tisular en células E-Vero. Se determinó que el título del virus de exposición era 1 x 1069 DICT50/ml el día de exposición. El virus de exposición se diluyó en la mañana de la exposición 1:10 con medios de cultivo tisular para efectuar un título de 1 x 1059 DICT50/ml.
Método de exposición intranasal
Sedivet® (clorhidrato de romifidina), un sedante y analgésico, se administró por vía intravenosa a cada caballo antes de la exposición a una dosis de 50 pg/kg de peso corporal. Cada caballo se expuso después a aproximadamente 1062 DICT50 de virus de la rinitis equina A. El virus de exposición se administró por vía intranasal como un aerosol producido por un nebulizador en un AeroMask equino (Trudell Medical International, Ontario, Canadá) mediante el siguiente método.
Se colocaron cuatro mililitros de 1059 DICTso/ml de virus de exposición en el vaso del nebulizador en el dispositivo AeroMask. Se instaló una manguera de presión desde un compresor de aire hasta la toma de entrada del nebulizador. Después se insertó el tubo de salida en la Aero Mask unida a la cabeza del caballo que se exponía y se aplicaron aproximadamente 68,95 kPa (10 psi) de presión de aire a la toma de entrada durante tres minutos. Durante este tiempo, se aerosolizaron aproximadamente dos mililitros de líquido de virus de exposición directamente en las narinas del caballo que se exponía.
Neutralización de suero
En este estudio se empleó una prueba de neutralización de suero de microtitulación convencional. En este estudio se empleó una prueba de neutralización de suero de microtitulación convencional. Todos los sueros se ensayaron en placas de microtitulación de fondo plano estériles usando cinco pocillos por dilución y una serie de diluciones de 8 pocillos para cada uno de los 5 pocillos de ensayo. Cada uno de los 5 pocillos de ensayo contenía 25 pl de dilución de suero mezclada con 25 pl del virus indicador y 150 pl de una suspensión de células eVero recién plantadas que contenía aproximadamente 5 X 104 células. El virus indicador de ensayo usado fue el virus de la rinitis equina de tipo I. Los títulos de anticuerpos neutralizantes en suero se expresan como títulos de DI50 de Reed-Muench.
Para la realización del ensayo, se realizaron diluciones dobles de cada suero de ensayo en una placa de microtitulación de fondo plano estéril usando cinco pocillos repetidos por suero de ensayo y una serie de diluciones de 8 pocillos. Se realizaron diluciones con un instrumento de pipeteo de un solo canal o multicanal de volumen ajustable usando puntas de microtitulación estériles. El volumen de suero añadido a cada uno de los 5 pocillos de la primera fila fue de 50 pl. Todos los otros pocillos contenían 25 pl de DMEM (sin FBS). Después de la dilución en serie por la placa, se descartaron 25 ml de la última fila. Se añadieron 25 pl de una dilución predeterminada del virus indicador a cada pocillo de ensayo. Las placas se mezclaron e incubaron durante una hora a 37 °C en CO2 al 5 %. Al concluir el periodo de incubación, se añadieron 150 pl de una suspensión que contenía 4 x 106/ml de células eVero a cada pocillo de ensayo y control celular. Las placas se incubaron a 37 °C en un incubador de CO2 durante 5 días, momento en el cual las placas se examinaron microscópicamente para detectar el CPE normal del virus de la rinitis equina.
Evaluación de exudado nasal
Todas las observaciones de exudado nasal se realizaron antes de la recogida de los hisopos nasofaríngeos. El día de la exposición y durante 10 días después de la exposición, las fosas nasales y el hocico de cada uno de los 44 caballos vacunados y de control se examinaron y clasificaron usando la descripción de clasificación y puntuación enumerada a continuación.
Las puntuaciones de 0 a 6 se asignaron en función de la gravedad de la enfermedad indicada por cada una de las siguientes clasificaciones:
Tabla 3: Puntuaciones
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Evaluación ocular
La secreción ocular se evaluó diariamente en el momento de la evaluación del exudado nasal. Las puntuaciones de secreción ocular se registraron como 0=normal; 1=secreción ocular leve a moderada y 2=secreción ocular grave.
Aislado vírico nasofaríngeo
En cada día de prueba de observación, se tomaron hisopos profundos en cada fosa nasal de cada caballo vacunado y de control mediante una lanza quirúrgica estéril WECK-Ce lTm (Edward Week and Company, Inc., Research Triangle Park, N.C. 27709) unida a una pipeta de plástico estéril de 27,94 cm (11 pulgadas) de longitud. Tras la recogida, cada una de las dos lanzas quirúrgicas se colocó inmediatamente en un solo tubo que contenía 4 ml de medio de transporte refrigerado (E-199 complementado con gentamicina, L-glutamina, Pen/Strep 2X, anfotericina B 2X).
Para el aislamiento de virus, los tubos se mezclaron, los hisopos se retiraron de manera aséptica y el medio se centrifugó a 1500 rpm durante 10 a 15 minutos para retirar las partículas. El medio se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 pl antes de la inoculación en células de cultivo tisular. Después de la filtración, se añadió 4-6 % de solución estéril de sacarosa al 85 % a cada muestra para congelar a -80 °C con el fin de ensayar todas las muestras simultáneamente.
Para el aislamiento de virus, los tubos se mezclaron, los hisopos se retiraron de manera aséptica y el medio se centrifugó a 1500 rpm durante 10 minutos para retirar las partículas. El medio se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 pl antes de la inoculación en células de cultivo tisular. Se usó un ml del medio de transporte aclarado para inocular una monocapa de dos días de 2 cm2 de células E-Vero cultivadas en una placa de cultivo tisular de 24 pocillos de la que se había retirado de manera aséptica el medio de cultivo. Después de la inoculación, se permitió que el inóculo se adsorbiera en la monocapa celular durante una hora a 37 °C en una incubadora humidificada que contenía una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del periodo de adsorción, se añadió 1 ml adicional de medio de realimentación (E-199 que contenía suero bovino fetal (FBS) al 7 %, L-glutamina 2 mM, gentamicina Pen-Strep 2X y anfotericina B 2X) a cada pocillo. Tras la adición de medios de realimentación, las placas se incubaron después a 37 °C en una incubadora de CO2. Cada pocillo de cultivo tisular de ensayo y control se examinó microscópicamente durante 7 días para detectar signos de efecto citopático (CPE) típico del virus de exposición ERAV. Se subcultivaron pocillos que eran negativos al final del periodo de observación de 7 días en células nuevas y se observaron durante 7 días adicionales.
MÉTODOS DE EVALUACIÓN ESTADÍSTICA
Los datos de todos los caballos vacunados con A-9 o A-10 se combinaron para evaluación estadística. La influencia de la vacunación en la duración de la enfermedad (número de días con puntuaciones nasales >0) se evaluó usando el ensayo de Kruskal-Wallis y Hodges-Lehmann (el procedimiento NPAR1WAY en SAS, SAS Institute, Cary NC). La gravedad de la enfermedad se evaluó comparando el estado máximo de la enfermedad entre los caballos vacunados y los caballos de control. Las puntuaciones nasales se dividieron en <1,5 y >1,5 basándose en la distribución de los resultados. Se estimaron la fracción prevenida (FP) e intervalos de confianza (IC) al 95 %. Las puntuaciones oculares se evaluaron como presentes o ausentes y se estimaron la fracción evitada y los intervalos de confianza al 95 % (el procedimiento FREQ en SAS). Se usó análisis de medidas repetidas apropiado para datos continuos para evaluar el efecto de la vacunación sobre la temperatura corporal y los títulos de neutralización en suero (el procedimiento MIXED en SAS). La proporción de caballos que eran positivos para virus a lo largo del tiempo y positivos para capa leucocitaria se evaluó usando el ensayo exacto de Fisher en cada punto temporal (el procedimiento Freq). Las puntuaciones nasales y oculares se evaluaron mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon en cada punto temporal (el procedimiento NPAR1WAY).
Resultados y conclusiones
AISLAMIENTO DE VIRUS DE HISOPOS NASALES (excreción de virus) y CAPAS LEUCOCITARIAS (viremia)
La proporción de animales que fueron positivos para el virus fue significativamente menor en los grupos vacunados los días 2 a 7 (Tabla 4 posterior y Figura 1) en comparación con el grupo de control (P<0,05).
Tabla 4. Proporción de hisopo nasal positivo para virus a lo largo del tiempo (*P<0,05 frente a control, prueba exacta de Fisher cada día
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continuación
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Los animales positivos para capa leucocitaria fueron menos frecuentes en el grupo vacunado los días 4-7 en comparación con el grupo de control (Tabla 5 posterior y Figura 2).
Tabla 5: Proporción de capa leucocitaria positiva a lo largo del tiempo (*P<0,05 frente a control, prueba exacta de Fisher cada día
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Neutralización de suero
Tabla 6: Sumario de tem eratura cor oral neutralización sérica
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Los valores medios de temperatura corporal (temperatura rectal medida con la sonda de termómetro GSA Electronics calibrada) cada día de exposición siempre estuvieron dentro de los parámetros normales de temperatura corporal. Se encontraron grandes aumentos en los títulos de SN resultantes de la vacunación (véase también Fig. 3) después de la exposición.
Evaluación nasal y ocular
Los rangos medios para puntuaciones nasales fueron menores los días 4 a 10 y los días 12-13 en el grupo vacunado en comparación con el grupo de control (Tabla 7 posterior y Figura 4). Los rangos medios para puntuaciones oculares fueron menores el día 7 en el grupo vacunado en comparación con el grupo de control (véase también Figura 5). Tabla 7: Rango medio para puntuación nasal y ocular a lo largo del tiempo (*P<0,05 frente a control; Prueba de m r n il x n í A- A-1 m in
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continuación
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Duración de la enfermedad: Evaluación de exudado nasal
Tabla 8: Sumario del efecto de la vacunación sobre la duración de la enfermedad (Número de días con puntuación nasal > 0
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Tabla 9: Efecto de la vacunación sobre la duración de la enfermedad (puntuaciones nasales; *significativamente m n r l r n r l m i n l r Kr k l- lli P<
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Se encontró larga duración de la secreción nasal en los controles después de la exposición (Tabla 8, véase también Figura 4). El grupo vacunado mostró una reducción significativa de la duración de la secreción nasal. Los controles experimentaron un mínimo de 8 días de secreción nasal frente a 11 vacunados (38 %) con 1 día o menos. Dos tercios de los vacunados tuvieron menor duración de la secreción nasal que el mínimo de 8 días en el grupo control. La duración fue de la primera a la última observación anómala, incluso si el caballo tuvo días normales entre medias. El número de días que los animales estuvieron enfermos con signos clínicos de enfermedad respiratoria (puntuación nasal > 0) fue significativamente más corto (cambio de 7 días) en el grupo vacunado en comparación con el grupo de control.
Tabla 10: Puntuaciones nasales máximas -Diferencia significativa entre las dos distribuciones de puntuaciones rueba de Kruskal-Wallis P = 00157.
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Tabla 11: Puntuaciones nasales < 15 > 15
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La vacunación también redujo la gravedad de la secreción nasal (puntuación máxima cualquier día después de la exposición). Las puntuaciones nasales máximas se compararon entre los grupos (Tabla 10). La puntuación nasal mínima para los caballos en el grupo control fue de 1,5. Los resultados se dividieron, por tanto, a puntuaciones < 1,5 y > 1,5 para la evaluación de la gravedad de la enfermedad (Tabla 11). La fracción prevenida fue del 48 % con un límite de confianza inferior mayor que 0. La distribución general de las puntuaciones nasales máximas se redujo significativamente con la vacunación (prueba de Kruskal-Wallis, P=0,0157).
Evaluación ocular
Tabla 12: Puntuaciones oculares resentes o^ ausentes
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Ya que solo se han registrado dos valores para las puntuaciones oculares (0 o 2), los resultados se dividieron en presentes o ausentes en un individuo. La fracción prevenida se usó después para evaluar el efecto de la vacunación sobre la presencia de signos oculares. La vacuna redujo significativamente la gravedad de la secreción ocular resultante de la infección con ERAV. Las puntuaciones oculares medias a lo largo del tiempo también se muestran en la Figura 5.
Los datos de este estudio demuestran que la administración de dosis intramusculares del virus inactivado es capaz de inmunizar a un animal a altos niveles de detección de anticuerpos que previenen la enfermedad ocular y reducen la gravedad y duración de la secreción nasal. La vacuna fue muy eficaz en la prevención de cualquier secreción ocular después de la exposición a ERAV. La secreción nasal persistió durante un periodo relativamente largo después de la exposición, mientras que la secreción ocular alcanzó un máximo y disminuyó rápidamente. Por lo tanto, la vacuna mostró una mejora significativa en la secreción nasal durante un periodo prolongado (9 de 10 días consecutivos), mientras que la vacuna redujo significativamente la secreción ocular durante 1 día durante el cual los signos oculares fueron más graves. Además, la vacunación redujo significativamente la excreción del virus nasal durante los seis días sucesivos de excreción vírica máxima y la viremia también se redujo significativamente durante los cuatro días de viremia máxima dentro del periodo de exposición.
No se observaron reacciones adversas inaceptables ni en los sitios de inyección ni por la manifestación de signos de enfermedad sistémica. La vacuna es segura y bien tolerada para su administración en especies susceptibles a rinitis equina A, en particular équidos. Este estudio demuestra por tanto que las inyecciones intramusculares de 3 x 1 ml de las composiciones de ERAV del ejemplo redujeron significativamente la gravedad y la duración de la enfermedad respiratoria provocada por la exposición virulenta a ERAV.
Ejemplo 3
Este ejemplo ilustra la secuenciación y los estudios analíticos llevados a cabo en una cepa del virus de la rinitis equina A como se desvela en el presente documento.
Células y Virus
Se cultivaron células de riñón de conejo 13 (RK-13) (pases 100-160) en la mezcla nutritiva de medio de Eagle modificado por Dulbbeco F12 HAM (Dm Em F12) (Sigma-Aldrich Canada Ltd. Oakville, Ontario) con suero bovino fetal 2-5 % (FBS) (Sigma). El crecimiento celular y la propagación vírica se realizaron en una incubadora de CO2 (5 %) a 37 °C. El aislado de ERAV ER-AV/ON/05 se propagó en células RK-13 y las alícuotas se almacenaron a -70 °C para trabajo posterior. Las monocapas de RK-13 se inocularon a 90 % de confluencia y el ARN se extrajo antes de que se observaran efectos citopáticos (CPE).
Titulación de virus y purificación de placas
Las células RK-13 se cultivaron en placas redondas de 3 cm, usando DMEM F12 con suero de ternera fetal al 2 %. Las células se infectaron a 90 % de confluencia y las placas se incubaron a 37 °C durante 72 horas. Después de 24 horas, se reemplazó el medio y se añadió una capa de agarosa al 0,7 %. Las placas se contaron y registraron cada 24 horas. A las 72 horas se retiró la capa de agarosa y las placas se tiñeron con cristal violeta y se contaron.
Para la purificación de placas, las células RK-13 se infectaron con ERAV/ON/05, se permitió la adsorción durante 45 minutos y el inóculo se retiró y se reemplazó con una capa de agarosa al 0,7 %. Las placas se revisaron cada 12 horas y las placas se clasificaron como pequeñas, medianas y grandes. Se seleccionaron cinco placas de cada tamaño, se recogieron en 300 pl de DMEM F12 y se congelaron a -70 °C. Se propagaron virus de cada tamaño de placa en células RK-13 y se extrajo ARN de las placas pequeñas y grandes para secuenciación del genoma de la UTR 5'.
Cinética de crecimiento vírico
Para estudiar las características de crecimiento de esta cepa, Se infectaron células RK-13 con ERAV/ON/05 y las muestras de sobrenadante se recogieron en diversos momentos para la titulación. Las células RK-13 se cultivaron en placas redondas individuales de 3 cm y se infectaron a 90 % de confluencia. Las placas se incubaron a 37 °C y se tomaron muestras de sobrenadante cada 4 horas comenzando a las 0 horas durante un periodo de 28 horas. Todas las muestras fueron tituladas usando la técnica de unidad de formación de placas (UFP) como se ha descrito anteriormente aquí.
Immunofluorescencia
Las células RK-13 se cultivaron en portaobjetos/cámara de cultivo tisular de vidrio (Miles Scientific, Inc., Naperville, Illinois) y se les inoculó ERAV/ON/05. Veintiocho horas después de la infección, se eliminó el medio de cultivo celular y las células se fijaron en acetona. Los portaobjetos se mantuvieron a 4 °C hasta su procesamiento. Se usaron sueros de caballos infectados experimentalmente como fuente de anticuerpos de ERAV.
Extracción y secuenciación de ARN
Se extrajo ARN de monocapas de células infectadas. Las células se trataron con 1 ml de TRIzol (Invitrogen) 18-20 horas después de la infección y se realizó extracción según las recomendaciones del fabricante. Los sedimentos de ARN se eluyeron en 30 pl de agua sin RNasa y se mantuvieron a -70 °C para su uso posterior. Se sintetizó ADNc de primera cadena usando superscript II (Invitrogen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se llevó a cabo una reacción de PCR de 50 pl usando un conjunto de cebadores con sentido y antisentido. Para secuenciación del genoma, se usó el enfoque de desplazamiento de cebadores y los cebadores se diseñaron basándose en ocho secuencias de ERAV disponibles en GenBank. Las condiciones de PCR fueron: 4 minutos a 94 °C, seguido de 30 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C y 30 segundos a 72 °C con una extensión final a 72 °C durante 10 minutos.
La secuenciación de los extremos 5' y 3' se completó con los kits 5' RACE y 3' RACE (Invitrogen) según lo recomendado por el fabricante. Fueron necesarias varias PCR anidadas para amplificar el extremo 5' UTR.
Análisis de secuencia
La identificación preliminar del virus se completó mediante secuenciación parcial de la proteína estructural VP1 usando cebadores diseñados basándose en otras secuencias disponibles en GenBank.
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Todos los cebadores fueron diseñados en Gene Runner versión 3.05 (Hastings Software Inc.). Las reacciones de secuenciación fueron preparadas y realizadas por la División de Servicios de Laboratorio de la Universidad de Guelph.
Todas las secuencias fueron ensambladas y editadas con EditSeq y SeqMan DNASTAR Lasergene 8 (DNASTAR Inc., Madison, WI, Estados Unidos). Los resultados de secuenciación se introdujeron en el software BLAST [Centro Nacional de Información Biotecnológica, Bethesda, MD (NCBI)] y se compararon con entradas similares en GenBank. Se usó ClustalW2 [Instituto Europeo de Bioinformática, Dublín, Irlanda (EBI)] para alineación de secuencias múltiples y construcción preliminar del árbol filogenético. El árbol filogenético final se creó en MEGA 4.0 usando el método de máxima probabilidad compuesta y la fiabilidad se evaluó mediante muestreo con reposición con 1000 repeticiones. El análisis de las secuencias de nucleótidos se trazó en SimPlot Versión 3.5.1 (Baltimore, MD, Estados Unidos). Para investigar la posibilidad de recombinación vírica entre aislados de ERAV, se completó un análisis Bootscan en SimPlot (Versión 3.5.1) que comparaba las secuencias genómicas de todos los ERAV registrados disponibles en GenBank. Los sitios de escisión de poliproteínas se predijeron basándose en secuencias registradas en GenBank con los números de referencia: DQ272578 y NC003982.
Resultados
Caracterización inicial
La proteína vírica (VP1) del virus se amplificó, se secuenció parcialmente y se comparó con secuencias disponibles en GenBank (números de referencia: NC003982, DQ272577, DQ272128, DQ272127, DQ268580, DQ272578, L43052). Los resultados de esta comparación inicial demostraron una identidad máxima del 95 % con el virus de la rinitis equina A VP1.
Titulación de virus
El aislado de ERAV se propagó inicialmente en cultivo celular y se tituló mediante el método de unidades formadoras de placas. El título de virus de la reserva obtenido fue 5X107 UFP en la titulación inicial. Los experimentos posteriores no mostraron cambios drásticos en el título vírico después de 3 años de congelación inicial. Para los experimentos con animales se empleó el virus de reserva con el título inicial.
CINÉTICA DE CRECIMIENTO
Todas las muestras de sobrenadante se titularon usando la técnica de UFP y los resultados se introdujeron en una hoja de cálculo para construir una curva de crecimiento. Como se ve en otros picornavirus, el aislado de Ontario mostró un aumento del título a las 4 horas después de la infección, llegando a una fase de meseta a las 12 horas después de la infección.
Immunofluorescencia
Las células RK-13 infectadas se visualizaron bajo el microscopio de inmunofluorescencia. Se detectaron señales de fluorescencia verde brillante en el citoplasma de las células infectadas con ERAV en comparación con señales negativas en las células infectadas con simulación.
Purificación de placas
La secuenciación de un fragmento de 426 nucleótidos en la 5' UTR en las placas pequeñas y grandes no mostró diferencias entre los tamaños de las placas a nivel de nucleótidos. Sin embargo, las características morfológicas fueron evidentemente diferentes en cultivos de células RK-13.
Secuenciación completa del genoma
La secuenciación del genoma del aislado de ERAV dio como resultado 7839 nucleótidos de longitud con un contenido de GC de 47 %, incluyendo la cola de poli(A). Se identificaron cuatro repeticiones idénticas (CTGTAGCGTCAGTAAAACGC SEQ ID NO: 13) separadas por 18, 21 y 18 nucleótidos en la 5' UTR. La 5' UTR de ERAV estaba compuesta de 940 nucleótidos con un contenido de GC de 54 %. Una sola poliproteína con 6747 nucleótidos (2248 aminoácidos) compone el genoma vírico con un contenido de GC de 46,8 %. La síntesis inicial de la proteína se detectó en el nucleótido 940 con el codón de inicio AUG y el final en el nucleótido 7686 con el codón de terminación UAA. De forma muy interesante, se identificó una segunda secuencia AUG después del codón de inicio. También se identificó una secuencia AUGAUG posterior de 58 nucleótidos cadena abajo del codón de inicio de la poliproteína. El análisis con Blastx (NCBI) de la poliproteína en este aislado mostró una identidad de nucleótidos de 96 % con respecto a otros ERAV registrados, sin embargo, cuando la secuencia del genoma de longitud completa del aislado de Ontario se alineó y comparó con otras usando ClustalW2 (EBI) y Blastx (NCBI), solo se observó una identidad máxima de 80 %. La composición de aminoácidos mostró una organización y longitud de proteínas (estructurales y no estructurales) idéntica a lo largo de todo el genoma. Estas comparaciones se realizaron con las secuencias señaladas del genoma de PERV-1 y PERV (números de referencia DQ272578 y NC003982).
La 3' UTR estaba compuesta por 110 nucleótidos con un contenido de GC del 24,3 % y una cola poli-A. Las alineaciones de las 5' UTR de todos los ERAV disponibles demostraron un porcentaje de identidad menor, que variaba del 73 % al 81 %. De manera similar, la 3' UTR se analizó por el mismo método y el porcentaje de identidad varió del 75 % al 81 %. Resulta interesante que se identificaron diversas inserciones (1 nucleótido, 2 nucleótidos y 13 nucleótidos) y dos supresiones pequeñas (2 nucleótidos y 3 nucleótidos) en la 5' UTR (Fig. 4). No se observaron otros cambios importantes en todo el genoma.
Análisis del genoma por SimPlot
El análisis de SimPlot mostró una similitud comparable (porcentaje) entre todos los aislados de ERAV en comparación con ERAV/ON/05. Sin embargo, las principales diferencias se identificaron en el nucleótido 1500 (59 % de similitud) y el nucleótido 4700 (65 % de similitud). No obstante, este análisis mostró que la similitud a lo largo del genoma estaba entre 70 % y 82 %. Para investigar más a fondo la gran divergencia en los genomas, se realizó una exploración (Bootscan) para identificar posibles sitios de recombinación. Estos análisis demostraron que el aislado de Ontario no había predicho sitios de recombinación con otros aislados de ERAV. No obstante, cuando se eliminó el aislado de Ontario del análisis, puede haberse producido posible recombinación entre otros aislados de ERAV en el pase.
Análisis
El ERAV no se busca ni recupera habitualmente de casos clínicos durante brotes respiratorios equinos. Por lo tanto, el aislamiento de ERAV de los casos clínicos ha sido fortuito y, en la mayoría de los casos, un desafío. Por estas razones, la tasa de recuperación y secuenciación de estos virus puede ser pequeña.
Durante años anteriores, los virus de la rinitis equina se clasificaron dentro de la familia Picornaviridae, pero no fueron asignados claramente a un género específico. En 1996, Li y colaboradores (Li F, Browning GF, Studdert MJ y Crabb BS. Equine rhinovirus 1 is more closely related to foot-and-mouth disease virus than to other picornaviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 6; 93: 990-995) demostraron que ERAV estaba estrechamente relacionado con el virus de la glosopeda (FMDV) basándose en las características filogenéticas y la secuenciación de nucleótidos. De acuerdo con sus hallazgos y otros (Wutz G, Auer H, Nowotny N, Grosse B, Skern T y Kuechler E. Equine rhinovirus serotypes 1 and 2: relationship to each other and to aphthoviruses and cardioviruses. J Gen Virol 1996, 77: 1719-1730) se ha descubierto que el aislado de ERAV está estrechamente relacionado con los aislados L43052, DQ272578 y NC003982.
El aislado ERAV/ON/05 dio como resultado 7839 nucleótidos que incluyen la 5' UTR, la poliproteína, 3' UTR y la cola de poli-A. En comparación con los aislados de ERAV previamente detectados, el ErAv /ON/05 es una de las secuencias de ERAv más completas detectadas hasta la fecha. La mayoría de las otras secuencias carecen de información de la 5' UTR o son secuencias parciales de proteínas víricas individuales. Los datos de la 5' UTR revelaron la presencia de 3 repeticiones que se han detectado previamente en otros ERAV y que se encuentran habitualmente en el FMDV. Se ha sugerido que estas repeticiones pueden ser necesarias en la formación de las estructuras secundarias halladas en la 5' UTR, el sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). El análisis de identidad mostró que la poliproteína del aislado ERAV/ON/05 porta una secuencia de nucleótidos muy conservada. Como un virus de a Rn , el ERAV es propenso a las mutaciones constantes debido a la falta de corrección de errores por la polimerasa. Esto puede indicar que, a pesar de que este virus de ARN ha estado evolucionando de manera natural y con replicación constante, no se han introducido cambios genómicos significativos desde que se registró su primera secuencia genómica. Es evidente que las proteínas estructurales y no estructurales, que están codificadas dentro de la poliproteína, representan las regiones más conservadas del genoma.
Resulta interesante que la tasa de replicación vírica en cultivo celular fue rápida y eficaz. Se detectó un ciclo completo de replicación vírica en menos de 4 horas, llegando a una fase de meseta en 12 horas. Estas características son típicas de los picornavirus y pueden reflejar la actividad vírica in vivo. Dichas características podrían explicar la gravedad y velocidad de los signos clínicos en algunas infecciones víricas respiratorias equinas. Como se observa en otros virus, tales como poliovirus y FMDV, la presencia de pequeñas supresiones y/o inserciones en la 5' UTR se ha asociado con diferencias en el tamaño de las placas en el cultivo celular y gran virulencia in vivo. Los inventores han descubierto que el aislado ERAV/ON/05 genera diferentes tamaños de placas cuando infecta células RK-13. Para investigar y correlacionar la presencia de estas inserciones y supresiones en la 5' UTR en el aislado ERAV/ON/05, los inventores secuenciaron esta región a partir de virus purificados de placas de diferentes tamaños de placas y no encontraron discrepancias a nivel de nucleótidos. Este hallazgo puede indicar que la diferencia de tamaños de las placas puede deberse a un crecimiento y una replicación característicos de las células RK-13 y quizás no esté asociada con la presencia o ausencia de las secuencias que se encontraron en esta región.
Ejemplo 4
Este ejemplo muestra los resultados de un estudio diseñado para desarrollar un modelo fiable de infección por ERAV para investigar las características clínicas de ERAV/ON/05.
Materiales y métodos
En la primera fase, se infectó un potro de poni con ERAV/ON/05 para ajustar la dosis infecciosa y las técnicas de recogida de muestras. Se diseñó un segundo estudio piloto para comparar animales infectados y de control y para dominar las técnicas de muestreo. El principal estudio de infección se realizó en dos fases debido a la manipulación de animales y las limitaciones temporales del muestreo. Un año después de la primera infección, cuatro ponis previamente infectados fueron seleccionados para un estudio de reinfección basándose en su título de ERAV. Se seleccionaron animales con un título intermedio y alto de ERAV para volver a exponerlos al aislado de Ontario.
Animales experimentales
Se seleccionó un total de 12 yeguas de ponis preñadas y se mantuvo a sus potros para la infección experimental por ERAV. Todas las yeguas y potros se mantuvieron en un grupo separado lejos del establo principal y se tomaron medidas de bioseguridad para prevenir la infección respiratoria vírica. Se tomaron muestras de sangre de todos los potros regularmente y se revisaron periódicamente los títulos de ERAV. Los potros se mantuvieron hasta que alcanzaron los 12 meses de edad. Estos animales no fueron vacunados contra ningún virus respiratorio durante este periodo y se mantuvieron las prácticas generales para garantizar condiciones de vida saludables. Todos los animales fueron desparasitados según el protocolo de manejo del rebaño. La socialización y el manejo de los animales se realizaron con regularidad. Los ponis se entrenaron para la prueba de función pulmonar (PFT). Una vez que los animales estuvieron acondicionados para los experimentos, fueron transportados en grupos a la unidad de aislamiento y aclimatados durante al menos una semana antes de la infección vírica.
Unidad de aislamiento
Todos los ensayos de infección se realizaron en la unidad de aislamiento de animales en el Departamento de Patobiología, en la Universidad de Guelph. Esta unidad de aislamiento contiene puestos individuales que están equipados con temperatura, humedad, flujo de aire e iluminación controlados. El acceso a los puestos estaba restringido a los investigadores y al personal de atención.
Criterios de selección
Todos los potros se manejaron con frecuencia y su estado de salud se verificó periódicamente. Basándose en el estado de salud y los parámetros serológicos, se eligieron los animales que se incluirían en estos experimentos. En ese momento, todos los ponis permanecieron seronegativos para el virus de la rinitis equina A (ERAV), virus de la rinitis equina B (ERBV), herpesvirus equino 1 y 4 (EHV1/4) y virus de la gripe equina 2 (AE2). Incluso aunque se detectaran títulos de anticuerpos AE2 al nacer, se observó una disminución constante durante los primeros 5 meses y no fueron detectables por la prueba de hemólisis radial simple (SRH) a los seis meses de edad. Para el ensayo de infección experimental de ERAV, se seleccionó un poni para utilizar. Posteriormente, se seleccionaron otros dos ponis para un segundo estudio piloto y se seleccionó un grupo de 8 ponis (cuatro infectados y cuatro controles) para el estudio de infección principal. Después de un año desde el primer ensayo de infección, se eligieron 4 ponis con títulos intermedios y altos para ERAV para un ensayo de reinfección.
Inoculo
El aislado de ERAV (ERAV/ON/05) recuperado de un caballo durante un brote respiratorio vírico equino en Ontario 2005 se propagó en células de riñón de conejo 13 (RK-13) y se almacenaron alícuotas a -70 °C para caracterización vírica y experimentos de infección vírica animal.
En resumen, para la preparación del inóculo, el aislado se propagó en células RK-13. Se infectaron placas redondas de 30 ml que contenían monocapas confluentes al 90 % con 500 pl de ERAV/ON/05 y se incubaron en presencia de CO2 (5 %) a 37 °C durante 24-36 horas. Todas las placas se retiraron de la incubadora y se congelaron/descongelaron cuatro veces para provocar ruptura celular y liberación vírica de células intactas. Se agruparon sobrenadantes de todas las placas en un matraz y se centrifugaron a 6000 RPM durante 15 minutos para aclarar y desechar los restos celulares. El sobrenadante aclarado se dividió en alícuotas en viales de 10 ml para usarse como inóculo en los experimentos de infección vírica en animales. Adicionalmente, se separaron alícuotas pequeñas de 1 ml y se guardaron para titulación vírica. El virus se tituló usando el método de unidad formadora de placas (UFP).
Modelo animal
Los ponis fueron elegidos como modelo animal debido a la naturaleza del agente experimental (ERAV), tamaño del animal, disponibilidad y manejo.
Protocolo de infección
Se seleccionaron, entrenaron y usaron ponis de entre 8 y 12 meses de edad en los experimentos de infección. Debido a la gran cantidad de muestras para tomar, estos experimentos se dividieron en cinco secciones (dos estudios piloto, dos experimentos de infección principales y un experimento de reinfección). Durante los estudios piloto, se optimizaron el equipo, manejo de animales, dosis de inóculo, vía de administración y recogida de muestras. El estudio de reinfección se realizó un año después del ensayo de infección inicial. Los ponis en el grupo reinfectado se expusieron a la misma cepa vírica a la misma dosis usada durante la primera infección. Solo se recogieron examen clínico, muestras de sangre para evaluación de títulos e hisopos nasofaríngeos para aislamiento de virus de este grupo.
Mascarilla y nebulización
Para infección vírica, se equipó una AeroMask™ equina de tamaño pequeño con un sello de goma en el extremo de la narina. El tamaño se ajustó dependiendo de la cabeza del poni y no se modificaron las ventanas de respiración. La máscara estaba equipada con un conector de inhalador y una válvula en "T" unidireccional para la nebulización del virus. Se emplearon vasos de nebulizador de 6 ml convencionales para administrar el inóculo. La nebulización se realizó usando un compresor PM14 (Precision Medical Inc. Northampton, PA) con un flujo de gas de 9 LPM (litros por minuto). Este caudal y los vasos de suministro permiten el suministro constante de partículas respirables de más o menos 5 micrómetros. Cada poni se nebulizó durante 45 minutos (tomando un descanso de 5 minutos cada 15 minutos) con 15 ml (volumen total) de inóculo o placebo. Se recogió un hisopo nasofaríngeo por poni después de la infección para garantizar la viabilidad del inóculo cuando se administró. Los ponis que se volvieron a infectar un año después fueron expuestos al virus por el mismo protocolo.
Examen clínico
Todos los ponis fueron evaluados clínicamente de forma regular desde el nacimiento. Antes de los estudios piloto y de infección, todos los ponis fueron evaluados diariamente y durante los experimentos de ensayo dos veces al día durante los primeros 10 días y una vez al día desde el día 11 hasta el día 21 después de la infección. El examen clínico incluyó: Temperatura corporal (temperatura) (grados Celsius), frecuencia cardíaca (fc), frecuencia respiratoria (fr), llenado capilar (llen), movilidad gastrointestinal (gi), ruidos pulmonares (rp), secreción nasal (sn), secreción ocular (so) [presencia o ausencia y características], ganglios linfáticos (gI) [tamaño y características], deambulación y condición física general. El examen físico se realizó aproximadamente a la misma hora en cada poni todos los días, comenzando con los animales de control y pasando al grupo infectado. Cada examen animal tardó aproximadamente 10 minutos cada vez y todos los datos individuales se registraron en un formulario de revisión diaria.
Prueba funcional pulmonar (PFT)
La PFT se llevó a cabo como ha sido descrito previamente por Hare y colaboradores (Hare JE, Viel L. Pulmonary eosinophilia associated with increased airway responsiveness in young racing horses. J Vet Intern Med 1998; 12(3):163-70). La prueba se realizó en todos los ponis de control e infectados antes de la infección (día 0) y los días 1, 7, 14 y 21 después de la infección. En resumen, los días de prueba, los ponis no se alimentaron por la mañana y estaban ligeramente sedados como se ha descrito anteriormente aquí para procedimientos de endoscopia. Se diseñó una mascarilla de goma para ajustarse perfectamente al hocico de los ponis. Un neumotacógrafo n.° 4 (Gould Electronics, Biltholven, Países Bajos) se unió a la mascarilla y se conectó a un conjunto de transductores que convierten las señales de flujo y presión en bucles de respiración que se registran en un ordenador (Pulmonary Mechanics Analyzer, Buxco Electronics Inc, Sharon, CT, Estados Unidos). El flujo se midió mediante neumotacografía y la presión pleural se evaluó mediante un globo esofágico (10 cm de longitud) que se colocó en el tórax medio a través de un tubo esofágico. Se introdujo un volumen total de 3 ml de aire en el globo. La diferencia de presión entre la presión pleural y la presión atmosférica (medida a la altura de las narinas) se consideró la presión transpulmonar (APpl).
Prueba de broncoprovocación
Se llevó a cabo exposición por broncoprovocación como parte de la prueba PFT. Para determinar la hiperreactividad de las vías respiratorias después de la infección por ERAV/ON/05, se expuso a los animales de control e infectados a dosis crecientes de histamina (duplicación de dosis) por nebulización con un compresor PM14 con un flujo de gas de 9 LPM (Precision Medical Inc. Northampton, PA). Los parámetros fisiológicos pulmonares se evaluaron inicialmente mediante la administración de solución salina fisiológica al 0,9 % (medida inicial), seguido de aumento de las dosis de histamina. Después de cada administración (2 minutos), los datos se registraron durante 3 minutos y posteriormente se analizó la fisiología respiratoria. Las dosis de histamina se iniciaron a 0,5 mg/ml y se aumentaron gradualmente hasta un máximo de 32 mg/ml. Se usaron distensibilidad dinámica (Cdin) y APpl como parámetros para interrumpir la nebulización de histamina. Cuando Cdin se redujo en dos tercios o APpl se duplicó durante la administración de histamina, se suspendió la nebulización. Posteriormente la dosis desencadenante de histamina se representó gráficamente y se calculó. Todos los ponis estuvieron ligeramente sedados e inmovilizados físicamente durante estos procedimientos.
Técnicas de muestreo
Extracción de sangre
Se recogieron muestras de sangre de la vena yugular derecha o izquierda. Se recogieron aproximadamente 10 ml de sangre en un tubo de tapón rojo (suero) de cada poni según el programa de recogida de muestras. Adicionalmente, también se recogieron de 3 a 5 ml de sangre para CBC (hemograma completo) y perfil. Todas las muestras se recogieron por la mañana y se procesaron el mismo día.
Las muestras de sangre para separación de suero se mantuvieron a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos y después se centrifugaron a 3000 rpm en una centrífuga de sobremesa. El suero se separó en las 6 horas posteriores al tiempo de recogida y las alícuotas se marcaron y congelaron a -70 °C para su análisis posterior (anticuerpos contra ERAV, ERBV, AE2 y EHV1/4). Las muestras de sangre para CBC y perfil se procesaron el mismo día.
Hisopos nasofaríngeos
Se recogieron hisopos nasofaríngeos para aislamiento de virus los días previos al ensayo de infección y los días 0, 1, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17 y 21. Cada poni fue inmovilizado con un acial y se pasó un hisopo de 30 cm de longitud (Kalayjian Industries, Inc. Signal Hill, California) por la narina derecha o izquierda hasta alcanzar la faringe. Se tomó la muestra girando el hisopo durante aproximadamente 5 a 10 segundos. El hisopo se retiró cuidadosamente y las puntas se cortaron en un vial que contenía 3 ml de medio de transporte de virus (VTM). Los viales que contenían los hisopos se agitaron y se mantuvieron en hielo hasta su procesamiento. Para liberar las partículas víricas y las células unidas a los hisopos, los viales se agitaron en vórtex durante aproximadamente 20 segundos y el medio se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se congeló a -70 °C para su análisis posterior.
Muestreo de orina y heces
Se intentó el aislamiento de virus en muestras de orina y heces antes y después de la infección con ERAV/ON/05. La orina se recogió por la mañana después del examen clínico y/o la limpieza del puesto sosteniendo un vaso de recogida mientras los animales orinaban. Cuando la muestra no se pudo recoger a mano, al animal se le colocó una bolsa recolectora de plástico alrededor de los genitales. Esta bolsa se retiró después de que el animal hubiera orinado y se guardó una alícuota de 10 ml para aislamiento del virus. Las muestras fecales se recogieron a mano de estiércol fresco en el suelo del puesto. Se recogieron aproximadamente 5 ml de estiércol en un vaso de recogida y se añadieron 10 ml de solución salina estéril para disolver la muestra. Las muestras de orina y heces se mantuvieron en hielo hasta su procesamiento.
Endoscopia superior e inferior
Se realizaron broncoscopia y LBA como se ha descrito anteriormente (Hare et al., 1998). Se introdujo un endoscopio de fibra óptica flexible estéril, de 140 cm de longitud con un diámetro externo de 0,8 mm (Olympus, Corp., Tokio, Japón) a través de la narina derecha o izquierda hacia la cavidad nasal hasta el nivel de la laringe. En este momento se evaluó la conformación de las vías respiratorias superiores. A continuación, se introdujo el broncoscopio en la tráquea y se registró la presencia o ausencia de inflamación y/o moco y sus características. Los datos se registraron en la hoja de evaluación diaria y todas las endoscopias se grabaron en video para su análisis posterior.
Biopsias con cepillo faríngeo y traqueal
Para evaluar la replicación vírica en las vías respiratorias superiores e inferiores, se tomó una biopsia con cepillo de la faringe, tráquea media y la carina de animales infectados y de control los días 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14 y 21. Durante el examen endoscópico, se introdujo un cepillo de citología protegido (funda protectora) de 200 cm (Hobbs Medical Inc. Connecticut) a través del canal de biopsia en la ubicación predeterminada de la muestra y se recogió una muestra. Los cepillos se retrajeron en la funda protectora y se retiraron del broncoscopio. Para separar el tejido de muestra del cepillo, este se introdujo en 600 pl de VTM y se agitó en vórtex durante 10 a 20 segundos. Todas las muestras se mantuvieron en hielo y se transportaron al laboratorio para su análisis posterior (aislamiento de virus).
Lavado broncoalveolar (LBA)
En resumen, todos los ponis fueron sedados levemente con Romifidina (0,04 mg/kg, IV) y se introdujo un broncoscopio estéril de 0,8 mm DE (Olympus, Corp., Tokio, Japón) a través de la narina derecha o izquierda en la tráquea hasta la altura de la carina. A medida que se introducía el broncoscopio, se administró una solución de lidocaína caliente al 0,2 % para reducir la tos y el malestar. Una vez que se redujo el reflejo de la tos, se adelantó el broncoscopio y se enclavó en un bronquio terminal proximal. Se administró un total de 250 ml de solución salina estéril caliente a través del canal de biopsia dividido en dos alícuotas. El líquido de LBA se recuperó por succión manual con una jeringa de 60 cm3 a través del canal de biopsia y se colocó en hielo. Se filtró el líquido y se realizaron alícuotas para aislamiento del virus, recuento celular y portaobjetos de cytospin.
Cultivo de muestras clínicas
Las muestras recogidas se transportaron en hielo y se congelaron a -70°C para su inoculación posterior en cultivos celulares.
Se cultivaron células RK-13 (pases 100-160) en la mezcla nutritiva de medio de Eagle modificado por Dulbbeco F12 HAM (DMEM F12) (Sigma-Aldrich Canada Ltd. Oakville, Ontario) con suero de ternera fetal 2-5 % (Sigma). El crecimiento y aislamiento celular se realizaron en una incubadora de CO2 (5 %) a 37 °C. Se cultivaron monocapas de células RK-13 en placas de 6 pocillos hasta una confluencia del 90 % y se infectaron con las muestras clínicas recogidas del ensayo de infección. En resumen, el 90 % del medio de cultivo se eliminó de cada uno de los pocilios y se añadieron a la monocapa 200 j l de la muestra para analizar. Las placas se colocaron en la plataforma basculante durante una hora y se añadieron 3 ml de medio después de transcurrido el tiempo. Las placas se incubaron y verificaron cada 24 horas para detectar efectos citopatógenos (CPE). Si se detectó CpE, se retiró el sobrenadante del pocillo y se congeló para su análisis posterior. Los resultados de la prueba de aislamiento de virus se registraron en una hoja de cálculo. Las placas se verificaron durante hasta 7 días y, si no se desarrolló CPE, se intentó un segundo pase usando 200 j l de sobrenadante del primer pase. Después de un segundo pase, si no se detectó CPE, la muestra se clasificó como negativa. Se guardó sobrenadante de muestras positivas y negativas para confirmar por reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR).
Análisis estadístico
Los resultados de aislamiento de virus y todas las puntuaciones clínicas (Tabla 7) se introdujeron en una hoja de cálculo.
Tabla 14. Sistema de puntuación para infección experimental con ERAV/ON05.
Signo clínico Grado Puntuación
Tos Ninguno 0
Intermitente 1
Frecuente 2
Membranas mucosas Rosa 0
Pálida 1
Auscultación gastrointestinal Normal 0
Anómala 1
Heces/orina Normal 0
Anómala 1
Ruidos pulmonares Normal 0
Ligeramente mayor 1
Aumento notable en todo el tórax 2
Crepitantes y sibilancias 3
Secreción nasal Ninguna 0
Serosa moderada/abundante 1
Mucopurolenta 2
Secreción ocular Ninguna 0
Serosa 1
purulenta 2
Adenitis no palpable 0
palpable (<1 cm) 1
Agrandada (>1 cm) 2
Anorexia Ninguna 0
Leve a moderada 1
Grave 2
Temperamento Vivo, consciente y reactivo 0
Apagado (cabeza baja, 1
desinteresado)
Tiempo de perfusión Normal (2 s) 0
3-4 s 1
5 s 2
Los resultados de aislamiento de virus se clasificaron como positivos o negativos y los resultados se compararon entre los grupos. Para determinar si había una diferencia estadística entre las ubicaciones en el aislamiento de virus (en el grupo infectado), se usó una regresión logística condicional exacta en cada día y sitio. Se usó la misma prueba para determinar si había una diferencia estadística entre los grupos según el día de aislamiento. Se resumieron las puntuaciones clínicas y los totales se analizaron y se compararon entre los grupos.
Se empleó un modelo mixto lineal generalizado para analizar todos los parámetros clínicos. Los factores incluidos en el modelo fueron: poni, tratamiento y tiempo, así como sus interacciones. Ya que los animales se midieron a lo largo del tiempo, se usó el criterio de información de AKAIKE (AIC) para determinar una estructura de error para la autorregresión. Los supuestos del ANOVA se evaluaron mediante análisis residuales exhaustivos. Se realizaron una prueba de Shapro-Wilk, una prueba de Kolmogorov-Smirnov, una prueba de Cramervon Mises y una prueba de Anderson-Darling para evaluar la normalidad general. Los residuos se representaron frente a valores predichos y variables explicativas (poni, tratamiento y tiempo) para buscar patrones que sugirieran valores atípicos, varianza desigual u otros problemas. Si los análisis de residuos indicaron una necesidad de transformación de los datos o los datos se presentaron como un porcentaje, se realizaron análisis en una escala logit o logarítmica. Si la prueba de f general fue significativa, se aplicó una prueba de Dunnett que regresa a la medida inicial dentro de un tratamiento o una prueba de Tukey entre tratamientos y sitios en cada momento.
La respuesta serológica se definió como un aumento cuádruple de los niveles de anticuerpos desde el momento inicial (día 0) hasta cualquiera de los puntos temporales en la recogida de muestras (días 7, 14 o 21).
Se llevó a cabo análisis estadístico en SAS 9.1.3 (SAS institute Inc., 2004, Cary, NC). La significación estadística se estableció en p<0,05.
Resultados
Este estudio fue diseñado para reproducir uniformemente la enfermedad clínica de ERAV en ponis y estudiar sus características in vivo. Los estudios piloto demostraron que ERAV/ON/05 nebulizado fue capaz de provocar enfermedad respiratoria clínica en ponis sanos (edad 10-12 meses). Se indujo inmunosupresión leve en todos los ponis, excepto en los animales reinfectados, para imitar las condiciones naturales en acontecimientos estresantes (por ejemplo, movimiento para ventas, reubicación de campo, programas de vacunación, etc.). Los resultados del estudio de infección principal confirmaron los resultados observados durante los estudios piloto. Los ponis del grupo infectado (n=4) desarrollaron una enfermedad clínica respiratoria que consistió en un aumento de la temperatura corporal, linfadenopatía, aumento de los ruidos pulmonares, aumento de la mucosidad traqueal y aumento de la secreción nasal (Fig. 7-8). Ninguno de estos signos clínicos fue significativamente extremo para necesitar cuidado adicional de los animales o tratamiento de apoyo. Ni la frecuencia respiratoria, ni la frecuencia cardíaca fueron significativamente diferentes entre los grupos. Ninguno de los signos clínicos desarrollados por el grupo infectado se observó en los animales de control (n=4), que permanecieron sanos durante la duración de estos ensayos. El agente etiológico (ERAV) solo se recuperó de ponis en el grupo infectado durante hasta siete días (Tabla 8). Los ponis en el grupo reinfectado (n=4) no desarrollaron signos respiratorios clínicos y permanecieron sanos durante los experimentos. El análisis estadístico de los datos recogidos durante estos ensayos demostró una diferencia significativa entre los animales infectados y de control.
Tabla 15. Sumario de excreción de virus de la rinitis equina A (ERAV). Resultados de aislamiento de virus a partir de
Figure imgf000039_0001
No se registró ni depresión ni pérdida de apetito en ninguno de los grupos. Además la hidratación, micción, defecación y movimientos gastrointestinales se mantuvieron sin cambios en todos los grupos durante los ensayos de infección. No hubo diferencias entre los animales reinfectados y de control en las puntuaciones clínicas y la prueba de aislamiento de virus, ya que no se observó enfermedad clínica en los animales reinfectados y el virus no pudo recuperarse de este grupo.
Hallazgos clínicos
Todos los ponis se consideraron sanos antes de estos experimentos. La exposición a ERAV/ON/05 indujo enfermedad respiratoria clínica en animales infectados en comparación con los controles y los animales reinfectados. Los principales signos clínicos detectables por examen físico fueron pirexia, secreción nasal y linfadenopatía. El examen endoscópico también reveló la presencia de grandes volúmenes de moco e hiperemia en la tráquea media y las vías respiratorias inferiores de los animales infectados.
Temperatura rectal
No se encontraron diferencias significativas en la temperatura rectal diaria entre los grupos antes de la exposición vírica o al placebo. Se identificó un efecto significativo del tratamiento cuando los animales infectados se compararon con los controles y reinfectados (p = 0,002). Cuando la temperatura corporal de los tres grupos se comparó en diferentes momentos, el grupo infectado fue significativamente diferente en comparación con los controles y los animales reinfectados (p = 0,028). El aumento de la temperatura corporal se detectó 24 horas después de la infección solo en los animales infectados y fue significativamente diferente del día 2,5 al día 6 en comparación con los animales de control en los mismos puntos temporales (p = <0,005). El aumento de la temperatura corporal alcanzó un máximo el día 4 con una temperatura corporal media de 38,45 °C (ET=0,15) (p = 0,001) y persistió durante dos días más consecutivos (Fig. 8). No se encontraron diferencias estadísticas cuando las temperaturas corporales de los grupos de control y reinfectados se compararon en diferentes momentos. Los animales en los grupos de control y reinfectados no tuvieron un cambio significativo en la temperatura de su cuerpo al comparar la medida inicial con puntos individuales en el tiempo dentro de los grupos (días 1, 7, 14 y 21).
Ganglios linfáticos
Los ganglios linfáticos submandibulares y retrofaríngeos se examinaron diariamente y se clasificaron como no palpables, palpables y grandes. La palpabilidad o agrandamiento de los ganglios linfáticos solo se registró en los animales infectados y reinfectados. En todos los ponis infectados, el área submandibular se volvió sensible a la palpación el día dos y en la mayoría de los casos persistió durante hasta dos semanas. El tamaño de los ganglios linfáticos submandibulares en los animales infectados varió de 3 a 5 cm de longitud por de 2 a 3 cm de grosor y el análisis de las puntuaciones totales demostró una diferencia estadística entre los grupos (p = <0,0001) (Fig. 7). Resulta interesante que los ganglios linfáticos retrofaríngeos no fueron palpables de manera uniforme en todos los animales infectados, pero se registró un cambio significativo en el tamaño en un poni. Esta linfadenopatía no parecía interferir con el consumo de alimentos o agua y la sensibilidad a la palpación se hizo menos pronunciada a medida que avanzaban los días. Los ganglios linfáticos submandibulares fueron palpables en tres animales de los animales reinfectados con un tamaño promedio de menos de un cm de longitud y 0,5 cm de grosor aproximadamente. Los animales de control no tuvieron cambios detectables en los ganglios linfáticos a la palpación durante los experimentos de infección.
Frecuencia cardíaca y respiratoria
La frecuencia respiratoria (FR) y la frecuencia cardíaca (FC) no fueron significativamente diferentes entre los grupos de tratamiento (P = 0,1) en cualquier punto temporal. En general, la FR y la FC estaban dentro de los parámetros fisiológicos normales y los cambios pequeños solo se asociaron con el manejo y la recogida de muestras. La media de FR más alta entre todos los grupos se identificó el día 0 y la media más baja de todos los grupos se registró el día 21.
Examen endoscópico
En el examen endoscópico, los animales infectados tuvieron un aumento de la cantidad de moco traqueal detectable del primer día que persistió hasta el día 21. Ni los animales de control ni los reinfectados tenían secreciones de moco detectables en el examen endoscópico a lo largo de estos experimentos.
Las características del moco variaron de claro y seroso el día uno a mucoide los días 7-21. Las regiones de moco se distribuyeron uniformemente desde la tráquea superior hasta la bifurcación de la carina. Se observó hiperemia traqueal localizada en todos los animales infectados y en algunos animales de control a lo largo de estos experimentos. La carina en todos los animales infectados estaba embotada y en algunos casos hiperémica a partir del día tres. La sensibilidad al examen endoscópico aumentó notablemente el día siete en animales infectados y se observó broncoconstricción durante el LBA. La secreción nasal varió de leve a moderada en todos los ponis infectados y no estuvo presente en los grupos de control y reinfectados. Se observó secreción nasal serosa durante el examen clínico durante aproximadamente 8 días en los animales infectados comenzando entre 36 y 48 horas después de la infección. Sin embargo, esta secreción no fue un reflejo del moco (características y volumen) observado durante el examen endoscópico. Se observó secreción ocular leve de manera esporádica en los animales infectados.
Serología
Un total de 12 ponis (de 10 a 12 meses de edad) se infectaron con ERAV/ON/05 o placebo por nebulización. Todos los ponis fueron serológicamente negativos para ERAV, ERBV, AE2 y EHV1/4 y en una condición saludable antes de los experimentos de infección. Después de la exposición a ERAV/ON/05 todos los animales infectados (100 %) se seroconvirtieron (aumento cuádruple) a ERAV determinado por la prueba de neutralización del virus (VN) (Fig. 9). Se observó una interacción significativa de tratamiento por día en animales infectados (P = <0,0001). Se encontró una diferencia estadística entre los animales infectados y reinfectados en el inicio y el día 7 (P = <0,001). En el grupo reinfectado no se encontraron diferencias estadísticas cuando los títulos de ERAv los días 7, 14 y 21 se compararon con los valores iniciales.
Los títulos de anticuerpos contra ERAV aumentaron significativamente en animales infectados desde el día 7 y en la mayoría de los casos alcanzaron el máximo el día 14 y se mantuvieron hasta el día 21 (P = <0,001). Por el contrario, todos los animales de control permanecieron seronegativos para ERAV y no se identificaron cambios detectables mediante la prueba de VN. Los animales en todos los grupos no mostraron un aumento en los niveles de anticuerpos o conversión serológica a ningún otro virus respiratorio (ERBV, AE2 y EHV1/4) durante estos experimentos (Fig. 9). Los animales en el grupo reinfectado (n=4) no tuvieron una diferencia significativa en los títulos de anticuerpos contra ERAV entre el inicio y el día 21 después de la infección. Sin embargo, se detectó un pequeño cambio en los niveles de anticuerpos contra ERAV en 3 ponis y un aumento cuádruple en un poni del mismo grupo (Fig. 9).
Aislamiento de virus
Las muestras de hisopo nasofaríngeo, cepillado laríngeo, cepillado traqueal, LBA, fecales y de orina fueron negativas para aislamiento de virus (virus respiratorios equinos) en todos los ponis antes de la infección (Tabla 8). Los hisopos obtenidos de la nasofaringe de animales infectados y de control después de completar la nebulización se cultivaron en células RK-13 y se recuperó ERAV en un primer paso de todos los animales infectados solamente. La RT-PCR usando cebadores que se dirigieron al gen de VP1 confirmó los diagnósticos positivos y negativos de ambos grupos.
Los resultados del aislamiento de virus de los ensayos de infección y reinfección se resumen en la Tabla 8. Una diferencia significativa entre animales infectados, de control y reinfectados se identificaron al comparar el aislamiento de virus entre grupos (P = <0,05). El ERAV solo se recuperó de animales en el grupo infectado en días específicos y áreas específicas del tracto respiratorio (Tabla 8). No se recuperaron otros virus de las muestras recogidas durante estos experimentos. Todos los ponis en el grupo de control fueron negativos en las pruebas de aislamiento de virus a lo largo del estudio. Una interacción de tratamiento por día en animales infectados se detectó por primera vez el día 7 y persistió los días 14 y 21 (P = <0,05).
La ubicación para la recuperación de virus varió desde las vías respiratorias inferiores los días 1, 3 y 5 hasta las vías respiratorias medias y superiores los días 1, 3, 5 y 7. El día uno, se aisló ERAV de la faringe y la carina de todos los ponis del grupo infectado y la tráquea media y l Ba de 3 ponis del mismo grupo. Ningún intento de recuperación de virus de las heces en todos los grupos tuvo éxito. El aislamiento de virus de la orina y el plasma se logró solo en pocas ocasiones (Tabla 8). La recuperación de virus se redujo gradualmente desde el día 1 hasta el día 7 cuando el ERAV se recuperó de manera uniforme de las muestras clínicas. Esta última recuperación vírica se asoció con un aumento en el título de anticuerpos contra ERAV y una reducción de la puntuación de los signos clínicos (Figs. 7 y 9).
Prueba funcional pulmonar (PFT)
La hiperactividad de las vías respiratorias se evaluó basándose en la respuesta fisiológica y clínica a la provocación con histamina. Se representaron gráficamente datos de animales infectados y de control y se calcularon las dosis desencadenantes de histamina. Resulta interesante que los ponis de ambos grupos (infectados y de control) respondieron el día 0 a una dosis baja de histamina (<6 mg de histamina). En general, las dosis desencadenantes de histamina no superaron 13 mg. La reacción clínica de histamina (dependiente de la dosis) se observó como hiperventilación asociada con elevación abdominal y dificultad para respirar. La reacción fisiológica se detectó en la PFT por un descenso del 35 % en la distensibilidad dinámica pulmonar (Cdin) o una duplicación de la presión transpulmonar (APpl) al comparar la administración de solución salina e histamina. Los ponis en el grupo infectado mostraron una pequeña reducción en la dosis desencadenante de histamina del día 0 al día 1. Sin embargo, esto no fue significativamente diferente entre los grupos. Se detectó una diferencia significativa entre infectados y controles el día 21 (P = 0,02).
Recuento diferencial de células de líquido LBA
Se realizaron recuentos diferenciales de células en los portaobjetos cytospin preparados a partir de alícuotas de líquido LBA. No se encontraron diferencias significativas en los recuentos de células entre los caballos en los diferentes grupos de tratamiento antes del ensayo de infección. No se detectó ningún efecto del tratamiento por día en los porcentajes de macrófagos y células epiteliales a lo largo de los experimentos. Se observó un aumento significativo en el número de neutrófilos el día 7 después de la infección en el grupo infectado (P = <0,05). Estos números no fueron significativamente diferentes en los animales control o reinfectados al comparar el valor inicial con los días 7, 14 y 21. Los porcentajes medios de linfocitos, eosinófilos y mastocitos disminuyeron proporcionalmente el día 7 después de la infección en los animales infectados y se detectó una diferencia estadística (P = <0,05). Se observaron células epiteliales ciliadas habitualmente en los portaobjetos de animales infectados y de control, sin embargo, no se detectaron diferencias significativas, excepto en uno de los animales infectados que tuvo un recuento alto el día 7. En general, se detectó una inflamación supurante no séptica con presencia de células epiteliales y células gigantes esporádicas en los ponis infectados. Resulta interesante que no se observaron cambios importantes en el examen citológico en las muestras de los animales reinfectados.
Este estudio demuestra que ERAV/ON/05 indujo enfermedad respiratoria clínica en ponis infectados. La serología demostró que no había otros virus respiratorios presentes durante estos ensayos. La enfermedad se caracteriza por pirexia, secreción nasal, aumento de ruidos pulmonares y aumento del tamaño de ganglios linfáticos submandibulares. Adicionalmente, se detectaron endoscópicamente grandes volúmenes de moco en las vías respiratorias inferiores que persistieron hasta el día 21. El virus se aisló de las vías respiratorias superiores e inferiores hasta el día 7 correspondiente a la aparición de anticuerpos detectables del virus de la rinitis equina A (ERAV). Ninguno de los animales reinfectados desarrolló enfermedad clínica y solo un poni de este grupo tuvo un aumento cuádruple en los títulos de anticuerpos contra ERAV. Los ponis con anticuerpos contra ERAV preexistentes no desarrollaron enfermedad clínica cuando se expusieron al virus.
Ejemplo 5
Este ejemplo ilustra una realización de una composición de virus de la rinitis equina B de acuerdo con la presente invención.
Materiales y métodos
La cepa 07-10342 del virus de la rinitis equina B (n.° de referencia de ATCC PTA-11829) se recuperó del cultivo de células de riñón de conejo 13 (RK-13) de un hisopo nasal de un caballo en Ontario, Canadá. Se produjo 07-10342 inactivado siguiendo el procedimiento general descrito en el Ejemplo 1 para ERAV/ON/05.
Se prepararon las siguientes composiciones que contenían ERBV solo o en combinación con ERAV.
Tabla 16. Gru os de vacunas
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Ocho caballos de cada uno de los grupos de vacunas 1, 2 y 3, se expusieron junto con ocho caballos de control con una dosis de exposición de 1066 DICT50. Estado de enfermedad basado en las puntuaciones de secreción nasal y conjuntivitis como se indica en la Tabla 10. El efecto de la vacunación sobre la duración, gravedad e incidencia de la enfermedad se muestra en las Tablas 17-22.
Tabla 17. Puntuación del estado de la enfermedad
Figure imgf000042_0002
El grupo vacunado mostró una reducción significativa (Tabla 18) en la duración de la secreción nasal, incluso en algunos casos sin signos de enfermedad respiratoria leve.
T l 1 m r í n nf rm r ir ri l m r r
Figure imgf000043_0002
El número de días que los animales estuvieron enfermos con signos clínicos de enfermedad respiratoria (puntuación nasal > 0) fue significativamente más corto en el grupo vacunado en comparación con el grupo de control.
Tabla 19. Efecto de la vacunación sobre la duración de la enfermedad
Figure imgf000043_0003
La inmunización con ERBV también disminuyó la gravedad de la enfermedad con un porcentaje menor de vacunados que los controles que demostraban signos clínicos leves y moderados de enfermedad respiratoria a lo largo del estudio (Tabla 20).
Tabla^ 2 m ri l r l nf rm n l n i n r ir ri máxima
Figure imgf000043_0004
Se descubrió que la inmunización con ERBV reduce significativamente la incidencia de la enfermedad, en 37,5 %, 25 % y 12,5 % en los grupos vacunados 1, 2 y 3, respectivamente (Tablas 21 y 22).
Tabla 21. Efecto de la vacunación sobre la incidencia de la enfermedad (se agruparon estados de enfermedad de l m r r l fin l i n
Figure imgf000043_0001
La vacunación también redujo la excreción de virus de las narinas, lo que indica una enfermedad clínica menor en los caballos vacunados, así como también demuestra la eficacia de la vacuna para prevenir la propagación de la enfermedad infecciosa a otros caballos potencialmente susceptibles (Tabla 22).
Tabla 22 Ini ni ii r l ir l l r l tiempo
Figure imgf000043_0005
continuación
Figure imgf000044_0003
Resultados y análisis
Se descubrió que las vacunas de ERBV inactivadas son capaces de inmunizar a un animal a altos niveles de detección de anticuerpos. Las vacunas redujeron la duración, gravedad e incidencia de la enfermedad en animales inmunizados expuestos a ERBV. La vacunación también redujo la excreción del virus infeccioso de caballos enfermos. No se observaron reacciones adversas inaceptables ni en los sitios de inyección ni por la manifestación de signos de enfermedad sistémica. La vacuna es segura y bien tolerada para su administración en especies susceptibles a rinitis equina B, en particular équidos.
Ejemplo 6
Este ejemplo ilustra un modelo de cobaya para su uso en un ensayo de potencia de liberación.
La vacuna 5 (A/B-1) y la vacuna 6 (A/B-2) se administraron cada una a cobayas (cinco cobayas por vacuna, 0,5 ml por vacunación intramuscular). Se administró una vacuna de refuerzo tres semanas después. Después de 19 días, se tomaron muestras de sangre de los cerdos y se analizó la sangre usando pruebas de neutralización de suero para ERAV y ERBV.
Tabla 23. Vacuna 5 A/B-1 en lote con 1080 A/1075 B con ad uvante de HRA-5
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T abla 24. Vacuna 6 A/B-2 en lote con 1080 A/1075 B con ad uvante de aceite de al odón HRA-3
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Ejemplo 7
Este ejemplo ilustra una evaluación de exposición del virus de la rinitis A después de vacunación con una vacuna de virus muerto contra la rinitis equina A/rinoneumonitis/gripe de 2 dosis y protección contra infección respiratoria por rinitis equina A después de vacunación con la vacuna de virus muerto contra la rinitis A/rinoneumonitis/gripe.
Objetivo
El objetivo de este estudio de vacunación-exposición fue demostrar la eficacia de la rinitis equina A (n.° de referencia de ATCC PTA-11828) para vacuna de virus muerto contra la rinitis equina A/rinoneumonitis/gripe. La variable de resultado primaria usada para evaluar la eficacia de vacunación fue la reducción de la enfermedad respiratoria provocada por el virus de la rinitis equina A.
Material y métodos
La vacuna usada en este estudio es una vacuna contra la rinitis equina A/rinoneumonitis/gripe de la presente invención, vacuna de virus muerto.
A. VIRUS DE LA RINITIS EQUINA A
La cepa original del virus de la rinitis equina A (ERhA V) se obtuvo de la Universidad de Guelph, Laboratorio de sanidad animal, con el número de aislado 04-54188, y se recibió el 9 de septiembre de 2008 según el permiso de importación n.° 106930. El virus se pasó una vez por células E-Vero para producir una reserva premaestra de titulación alta y después se diluyó con medios de cultivo celular para producir el virus de semilla maestra (MSV). El MSV se designa como ERhA V (04-54188), MSV, Lote 091508A diluido, 24 de septiembre de 2008, y el u SdA aprobó su uso para el Establecimiento 597 el 18 de junio de 2010.
El antígeno vírico de la rinitis equina A usada en vacunas evaluadas en este estudio fue un virus MSV+5 producido en el vigésimo pase de células E-Vero aprobadas por APHIS. Después del crecimiento, los líquidos víricos se filtraron, se inactivaron con formalina y se concentraron de acuerdo con el esquema de producción para el código de producto A522.20. Los líquidos víricos inactivados se analizaron para detectar virus vivos residuales después de la inactivación. Los resultados fueron satisfactorios. Se usaron líquidos víricos inactivados para formular la vacuna a un nivel de inclusión de antígeno de 1075 DICT50/ml.
1. Lote de combinación de vacunas experimentales de rinitis 122110
El lote de combinación de vacunas experimentales de rinitis 122110 se formuló basándose en títulos de preinactivación.
La vacuna formulada final contenía los siguientes ingredientes por cada 1 ml de dosis:
Rinitis equina A 1075 DICT50/ml EHV-1 1070 DICT50/ml EHV-4 1065 DICT50/ml Gripe A2/Ohio/03 1070 DICT50/ml Gripe A2/KY/95 1070 DICT50/ml Gripe A2/NewMarket/2/93 1070 DICT50/ml Adyuvante (MVP Laboratories, S.O. n.° 25) 100 pl
Diluyente, que contiene MEM-E c.s.
Gentamicina, 30 pg/ml de volumen de diluyente
Formaldehído, 0,1 % del volumen de diluyente
Anfotericina B, 2,5 pg/ml
B. Caballos Experimentales
1. Descripción de caballos experimentales
Cuarenta (40), de seis a ocho meses de edad, caballos de tiro cruzado comprados a Steve Waagen, Bottineau, Dakota del Norte recibieron un microchip a su llegada a Equine Resources, LLC, Butler, Mo. y fueron asignados a IVP (Producto Veterinario de Investigación) o Producto de Control (CP) basándose en un generador de números aleatorios después de haber sido explorados previamente para títulos de rinitis A de < 1:4.
Durante todo el estudio, los caballos fueron acuartelados en una sola parcela grande con pesebres, bebederos y comederos comunes. Tras la exposición, el personal de laboratorio asignó a cada animal un "código de establo" de 2 dígitos que se unió a un cabestro usado durante todo el periodo de tiempo posterior a la exposición y se usó para identificar caballos cuando se tomaron signos clínicos y muestras cada día. Durante cada día de observación, los caballos fueron acorralados en corrales y procesados aleatoriamente a través de potros de retención individuales. La Tabla 25 resume el diseño de estudio:
Tabla 25: Diseño de estudio
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2. Programa de vacunación/exposición y muestreo
El 28 de enero de 2011 y el 18 de febrero de 2011, se administró lote de combinación de vacunas experimentales de rinitis 122110 por vía intramuscular en un volumen de dosis de 1 ml a cada uno de 20 caballos (grupo vacunado, IVP). Veinte caballos (grupo de control, CP) recibieron una dosis de 1 ml de MEM-E con adyuvante (producto experimental 005) que contenía los excipientes usados en la vacuna del lote 122110 (adyuvante, gentamicina, anfotericina B y formaldehído) pero sin antígenos. Todos los caballos se expusieron mediante aerosolización intranasal del virus virulento de la rinitis equina A el día de estudio 46 (25 días después de la vacunación de refuerzo) el 15 de marzo de 2011. La Tabla 26 muestra el programa de acontecimientos.
T l ^ 2 Pr r m ^ n imi n
Figure imgf000046_0002
continuación
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3. Inoculación por exposición intranasal de caballos
a. Virus de exposición
El lote de virus de exposición de la rinitis equina A 112108A se produjo en cultivo tisular en células E-Vero. Se determinó que el título del virus de exposición era 1 x 1073 DICT50/ml el día de exposición.
b. Método de exposición intranasal
Sedivet® (clorhidrato de romifidina), un sedante y analgésico, se administró por vía intravenosa a cada caballo antes de la exposición a una dosis de 50 pg/kg de peso corporal. El virus de exposición se administró por vía intranasal como un aerosol producido por un nebulizador en un AeroMask equino (Trudell Medical International, Ontario, Canadá) por el siguiente método: Se colocaron cuatro mililitros de 1073 DICT5o/ml de virus de exposición en el vaso del nebulizador en el dispositivo AeroMask. Se instaló una manguera de presión desde un compresor de aire hasta la toma de entrada del nebulizador. Después se insertó el tubo de salida en la AeroMask unida a la cabeza del caballo que se exponía y se aplicaron aproximadamente 68,95 kPa (10 psi) de presión de aire a la toma de entrada durante tres minutos. Durante este tiempo, se aerosolizaron aproximadamente dos mililitros de líquido de virus de exposición directamente en las narinas del caballo que se exponía. El virus de exposición se administró a caballos sin diluir, efectuando una cantidad de exposición de 1 x 1076 DICT50 en una dosis de 2 ml.
C. PARÁMETROS DE EVALUACIÓN ANTES Y DESPUÉS DE LA EXPOSICIÓN
1. Evaluación de exudado nasal
Todas las observaciones de exudado nasal se realizaron antes de la recogida de los hisopos nasofaríngeos. El día de la exposición (D46) y durante 21 días después de la exposición, las fosas nasales y el hocico de cada uno de los 40 caballos vacunados y de control se examinaron y clasificaron usando la descripción de clasificación y puntuación enumerada a continuación.
Las puntuaciones de 0 a 6 se asignaron en función de la gravedad de la enfermedad indicada por cada una de las siguientes clasificaciones:
Figure imgf000047_0001
continuación
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2. Secreción ocular
La secreción ocular se evaluó diariamente en el momento de la evaluación del exudado nasal. Las puntuaciones de secreción ocular se registraron como 0 = normal;
1 = secreción ocular leve a moderada y 2 = secreción ocular grave.
3. Temperatura
Se registraron las temperaturas rectales diarias para cada uno de los 40 caballos vacunados y de control el día de la exposición y durante 21 días después de la exposición por medio de una sonda de termómetro electrónico, calibrado (GSA Electronics). Las temperaturas rectales diarias se registraron en grados Fahrenheit (°F).
4. Aislado vírico nasofaríngeo
En cada día de prueba de observación, se tomaron hisopos profundos en cada fosa nasal de cada caballo vacunado y de control mediante una lanza quirúrgica estéril WECK-CEL® (Edward Weck and Company, Inc., Research Triangle Park, N.C. 27709) unida a una pipeta de plástico estéril de 27,94 cm (11 pulgadas) de longitud. T ras la recogida, cada una de las dos lanzas quirúrgicas se colocó inmediatamente en un solo tubo que contenía 4 ml de medio de transporte refrigerado (E-199 complementado con gentamicina, L-glutamina, Pen/Strep 2X, anfotericina B 2X).
Para el aislamiento de virus, los tubos se mezclaron, los hisopos se retiraron de manera aséptica y el medio se centrifugó a 1500 rpm durante 10 a 15 minutos para retirar las partículas. El medio se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 p antes de la inoculación en células de cultivo tisular. Después de la filtración, se añadió 4-6 % de solución estéril de sacarosa al 85 % a cada muestra para congelar a -80 °C con el fin de ensayar todas las muestras simultáneamente.
El día del ensayo, se usó un ml del medio de transporte descongelado, aclarado, para inocular una monocapa de dos días de 2 cm2 de células E-Vero cultivadas en una placa de cultivo tisular de 24 pocillos de la que se había retirado de manera aséptica el medio de cultivo. Después de la inoculación, se permitió que el inóculo se adsorbiera en la monocapa celular durante al menos una hora a 37 °C en una incubadora humidificada que contenía una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del periodo de adsorción, se añadió 1 ml adicional de medio de realimentación (E-199 que contenía L-glutamina 2 mM, gentamicina Pen-Strep 2X y anfotericina B 2X) a cada pocillo. Tras la adición de medios de realimentación, las placas se incubaron después a 37 °C en una incubadora de CO2. Cada pocillo de cultivo tisular de ensayo y control se examinó microscópicamente durante 7 días para detectar signos de efecto citopático (CPE) típico del virus de exposición de la rinitis equina A. Se subcultivaron pocillos que eran negativos al final del periodo de observación de 7 días en células nuevas y se observaron durante 7 días adicionales.
Métodos de evaluación estadística
Los caballos fueron clasificados en un intervalo del estado de enfermedad respiratoria, diariamente. La clasificación del estado de enfermedad incluyó la combinación de las evaluaciones nasales y oculares. El algoritmo usado se detalla a continuación:
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La influencia de la vacunación en la duración de la enfermedad (número de días con al menos una enfermedad moderada) se evaluó usando la estimación de Hodges-Lehman (exacta) (el procedimiento NPAR1WAY en SAS, SAS Institute, Cary NC).
La gravedad de la enfermedad se evaluó comparando el estado máximo de la enfermedad entre los caballos vacunados y los caballos de placebo. Se calculó la fracción mitigada y los intervalos de confianza (IC, error típico asimétrico) al 95 % (el procedimiento FREQ en SAS).
La temperatura rectal y los títulos de neutralización de suero se analizaron mediante análisis de medidas repetidas apropiadas para datos continuos (temperatura y títulos de SN transformados por log; ANOVA). Se supuso que los títulos de SN eran 0 si el título se señalaba como <4 y 709 si el título se señalaba como >709. Los títulos de SN se transformaron por log antes del análisis. Los resultados de capa leucocitaria e hisopo nasal en cada día se compararon mediante la prueba exacta de Fisher.
Resultados
Un caballo, n.° 39 (grupo IVP) murió el día 62 del estudio. Tras la necropsia en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Misuri, se realizó el diagnóstico de esofagitis, gastritis y faringitis crónica-activa, difusa, necrotizante grave y submucosa enfisematosa, con colonias bacterianas de cocobacilos intralesionales y material vegetal, así como una pleuroneumonía fibrinosupurativa grave difusa del pulmón. La explicación más probable de esta muerte sugiere una ruptura previa de la mucosa, tal como una úlcera mucosa en el cardias del estómago que permitió la siembra de material vegetal en los tejidos conectivos asociados (se adjunta informe de patología).
A. DURACIÓN
La distribución de la duración de la enfermedad (número de días con enfermedad respiratoria moderada o grave) en días se resume en la Tabla 27. La mediana del número de días que se observaron animales en el grupo de placebo con enfermedad fue de 14. En el grupo vacunado, la mediana del número de días con enfermedad fue de 1. La duración de la enfermedad fue significativamente menor en los animales vacunados en comparación con los controles (Tabla 28; P <0,0001).
Tabla 27: Sumario del efecto de la vacunación sobre la duración de la enfermedad (número de días con enfermedad res iratoria moderada o rave
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Tabla 28: Efecto de la vacunación sobre la duración de la enfermedad (número de días con enfermedad respiratoria moderada o rave
Figure imgf000049_0002
Gravedad
La distribución de la gravedad de la enfermedad se resume en la Tabla 29. La gravedad de la enfermedad fue significativamente menor en los caballos vacunados en comparación con los caballos con placebo (Tabla 30; fracción mitigada = 0,7550, IC al 95 % = 0,5518, 0,9582). Los resultados individuales se proporcionan en la Tabla 31.
En la Tabla 31, los valores para el caballo n.° 39 que murió el día 62 del estudio se señalan como 0 del día 62 al 67, pero en el análisis solo se consideran valores >1, por que no afecta al resultado. La duración es de 1 día para este caballo y la puntuación máxima es de 3.
Tabla 2 m ri l r l nf rm n l n i n m xim r i n nasal
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T l Ef l n i n r l r l nf rm
Figure imgf000050_0001
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Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Una composición inmunógena que comprende una cepa inactivada del virus de la rinitis equina B (ERBV) que tiene el n.° de referencia de ATCC PTA-11829.
2. La composición inmunógena según la reivindicación 1, comprendiendo dicha composición inmunógena además una o más cepas de virus inactivado de la rinitis equina A (ERAV).
3. La composición inmunógena de las reivindicaciones 1 o 2 en la que la cepa, antes de la inactivación, provoca enfermedad respiratoria detectable en el 100 % de los caballos seronegativos tras la exposición a la cepa.
4. La composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha composición inmunógena comprende además al menos un antígeno o una cepa inactivada o viva, atenuada del virus del herpes equino y/o una cepa inactivada o viva, atenuada del virus de la gripe equina.
5. La composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha composición inmunógena comprende además al menos un antígeno de una o más cepas seleccionadas del grupo que consiste en virus del Nilo occidental, virus de la encefalomielitis equina oriental, virus de la encefalomielitis equina occidental, virus de la encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico, y combinaciones de los mismos.
6. La composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en un método para reducir la incidencia o disminuir la gravedad de síntomas clínicos asociados con o provocados por ERBV en un animal o una manada de animales que comprende la etapa de administrar dicha composición inmunógena a un animal que lo necesite.
7. La composición inmunógena para su uso según la reivindicación 6, en donde la incidencia de síntomas clínicos provocados por uno o más de dichos patógenos en una manada de animales está reducida en comparación con una manada que no recibe dicha composición inmunógena.
8. La composición inmunógena para su uso según la reivindicación 6, en donde la administración de al menos una dosis de dicha composición inmunógena proporciona una duración de inmunidad de al menos 12 meses contra uno o más de dichos patógenos.
9. La composición inmunógena para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde dicha composición inmunógena es segura para su uso en potros o caballos de 4 meses de edad o mayores.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2829226C (en) 2011-03-14 2023-01-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Equine rhinitis vaccine
WO2016083287A1 (en) * 2014-11-24 2016-06-02 Intervet International B.V. Inactivated equine influenza virus vaccines
US10064930B2 (en) * 2015-01-16 2018-09-04 Boehringer-Ingelheim Vermedica, Inc. Immunogenic compositions and methods for pigeon fever

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2702373B1 (fr) 1993-03-08 1996-06-07 Rhone Merieux Emulsions vaccinales fluides eau-dans-l'huile contenant une huile métabolisable.
AUPN720195A0 (en) 1995-12-18 1996-01-18 University Of Melbourne, The Equine rhinovirus 1 proteins
US7227011B2 (en) 1998-06-04 2007-06-05 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection
US6177082B1 (en) 1998-08-13 2001-01-23 The University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Cold-adapted equine influenza viruses
US7425437B2 (en) 1999-11-26 2008-09-16 Crucell Holland B.V. Vaccines against West Nile Virus
EP1294735A2 (en) 2000-05-26 2003-03-26 Novirio Pharmaceuticals Limited Methods and compositions for treating flaviviruses and pestiviruses
US8496939B2 (en) 2001-02-28 2013-07-30 Intervet International B.V. Injectable water-in-oil emulsions
WO2002072036A2 (en) 2001-03-12 2002-09-19 Yale University Compositions and methods comprising west nile virus polypeptides
US20030104008A1 (en) 2001-04-06 2003-06-05 Loosmore Sheena May Recombinant vaccine against west nile virus
AUPR472501A0 (en) 2001-05-02 2001-05-24 Council Of The Queensland Institute Of Medical Research, The Equine rhinitis a virus antigens
MXPA04000680A (es) 2001-07-27 2004-04-05 Wyeth Corp Vacuna para virus west nile.
MXPA04003692A (es) 2001-10-19 2005-04-08 Acambis Inc Metodos para prevenir y tratar la infeccion por flavivirus en animales.
KR101150584B1 (ko) 2002-11-15 2012-06-27 사노피 파스테르 바이오로직스 씨오 웨스트 나일 바이러스 백신
CA2432738A1 (en) 2003-02-26 2004-08-26 Philippe Despres New dengue and west nile viruses proteins and genes coding the foregoing, and their use in vaccinal, therapeutic and diagnostic applications
US7585621B2 (en) 2003-09-09 2009-09-08 Idexx Laboratories, Inc. Detection of West Nile virus infection and vaccination
US7459163B2 (en) 2004-02-25 2008-12-02 University Of Kansas Infectious DNA as a vaccine against west nile and other flaviviruses
WO2006085983A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 University Of North Carolina At Chapel Hill Viral adjuvants
US7482017B2 (en) 2004-09-09 2009-01-27 Research Development Foundation Flavivirus variants having phenotypic variation and immunogenic compositions thereof
EP1645283A1 (en) 2004-10-08 2006-04-12 Chiron Behring GmbH & Co. KG Combination vaccine
WO2006067122A2 (en) 2004-12-20 2006-06-29 Crucell Holland B.V. Binding molecules capable of neutralizing west nile virus and uses thereof
US7959929B2 (en) 2005-04-21 2011-06-14 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for respiratory disease control in canines
CN101222936A (zh) 2005-06-24 2008-07-16 英特威国际有限公司 灭活的嵌合疫苗和相关的使用方法
US7384642B2 (en) 2005-08-25 2008-06-10 Merial Limited Canine influenza vaccines
US7425336B2 (en) 2005-08-25 2008-09-16 Mevial Limited Canine influenza vaccines
WO2007042884A1 (en) 2005-10-07 2007-04-19 Pfizer Products Inc. Vaccines and methods to treat canine influenza
US7468187B2 (en) 2005-10-18 2008-12-23 Iowa State University Research Foundation, Inc. Canine influenza virus and related compositions and methods of use
EP1945251B1 (en) 2005-11-01 2012-02-08 Intervet International BV Prime boost vaccine for the protection of equines against equine influenza
US7455842B2 (en) 2005-12-05 2008-11-25 University Of Kansas Chimeric West Nile viruses and uses thereof
KR100850545B1 (ko) 2007-10-30 2008-08-05 주식회사 에니멀제네틱스 신규한 개 인플루엔자 바이러스 및 이의 백신
NZ603854A (en) 2008-08-29 2015-03-27 Boehringer Ingelheim Vetmed West nile virus vaccine
CA2829226C (en) 2011-03-14 2023-01-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Equine rhinitis vaccine

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