BR122019023542B1 - Composição imunogênica compreendendo uma ou mais cepas de vírus da rinite equina b (erbv) inativado e seu método de preparação - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a composições imunogênicas contra o vírus da rinite equina, particularmente, o vírus da rinite equina a e b, e métodos para a sua utilização e preparação. as composições imunogênicas, em modalidades suplentes também incluem outros patógenos equinos.

Description

[001] Dividido do BR112013023354-0, depositado em 12.03.2012.

Listagem de Sequência

[002] O pedido de patente contém uma listagem de sequência que foi apresentada em formato ASCII através de EFS-Web e é aqui incorporada por referência na sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 26 de Janeiro de 2012, é nomeada 10-0144-PCT-SEQ.txt e é de 33.877 bytes de tamanho.

Antecedentes da Invenção

[003] Infecções respiratórias virais em equinos são comumente associadas com o movimento dos cavalos e surtos respiratórios anuais são relatados em todo o mundo. Influenza Equina 2 (AE2-H3N8), herpesvírus equino 1 e 4 (EHV1/4), e Vírus da Rinite equina A e B (ERAV e ERBV, respectivamente) estão entre os vírus mais importantes isolados a partir do trato respiratório superior durante os surtos respiratórios.

[004] Em particular, ERAV foi avaliado em doenças respiratórias febris agudas em cavalos (Li et al., J. Clin. Microbiol. 35:937-943; 1997, aqui incorporado por referência). Da mesma forma, um estudo recente em Ontário encontrou ERBV e ERAV como sendo altamente prevalente na população de cavalo (Diaz-Mendez et al., The Canadian Journal of Veterinary Research 74:271-278; 2010, incorporado por referência). Os sinais clínicos de infecção de ERAV são inespecíficos e difíceis de diferenciar de outras infecções virais respiratórias, incluindo a gripe equina e infecções pelo vírus da herpes. As cepas não citopáticas do vírus tem sido identificadas em surtos respiratórios equino (Li et al., J. Clin. Microbiol. 35:937-943; 1997), tornando difícil o seu diagnóstico.Além disso, ERAV e ERBV sendo vírus de RNA de filamento único têm o potencial para a mutação, tornando a capacidade do sistema imune para proteger um animal contra a doença causada por uma determinada cepa não clara de ERAV/ERBV.

[005] Existe a necessidade de métodos e medicamentos para a prevenção de doenças respiratórias ou para reduzir a incidência ou para diminuir a gravidade dos sintomas clínicos associados a essas doenças, incluindo aquelas associadas com vírus da rinite equina A e B.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Os inventores determinaram que as composições imunogênicas compreendendo uma ou mais cepas de ERAV atenuada inativada ou viva, que, quando viva e ativa e não atenuada são virulentas (isto é, pelo menos, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mesmo 100% de cavalos soronegativos, quando propositadamente expostos ao vírus, presente com doença respiratória observável, particularmente secreção nasal e/ou ocular), podem ser cultivadas para titulações elevados em cultura para produzir uma vacina que é capaz de induzir titulações elevados de anticorpos séricos contra ERAV quando administradas, por exemplo, em um equino, por exemplo, resultando em uma titulação sérica de, pelo menos, 1:112, e de preferência, pelo menos, 1:200, 1:500, 1:750 ou 1:1000. Além disso, as cepas crescem bem em cultura e são altamente eficientes para produzir, por exemplo, para uma titulação de pelo menos 106 de TCID50/ml, mais preferivelmente pelo menos 107 de TCID50/ml, 108 de TCID50/ml, ou mesmo 109 de TCID50/mL. Do mesmo modo, as composições que compreendem uma ou mais cepas de ERBV inativado, vivo e que, quando ativo, e não atenuado são também virulentos (como definido acima para ERAV), também foram encontradas crescendo bem em cultura, para uma titulação de pelo menos 106 de TCID50/ml, mais preferivelmente 107 de TCID50/ml, 108 de TCID50//mL ou mesmo 109 de TCID50/ml, para ser altamente eficiente para produzir e para induzir titulações elevados de anticorpos no soro de animais após a imunização, por exemplo, resultando em uma titulação sérica de pelo menos 1:120 e, preferivelmente pelo menos, 1:200, 1:500, 1:750 ou 1:1000. Ambas as composições de ERAV e ERBV e combinações dos mesmos, são capazes de reduzir a duração, gravidade e incidência de doença em um animal tal como um cavalo, que tenha sido imunizado com as composições e subsequentemente desafiado.

[007] Por conseguinte, a presente invenção proporciona uma composição imunogênica que compreende uma ou mais cepas de ERAV ou ERBV atenuado inativado ou vivo, em que a cepa de ERAV ou a cepa de ERBV, antes da inativação ou da atenuação, causa doença respiratória detectável em pelo menos 50% dos cavalos soronegativos expostos à cepa, ou crescem em cultura celular a 106 de TCID50/mL ou superior, ou, quando utilizadas como uma vacina em cavalos com uma dose de 106 de TCID50 ou superior resultam em uma titulação sérica de pelo menos 1:112 .

[008] Em certas modalidades, a cepa, quando não atenuada e viva, causa a doença respiratória detectável (por exemplo, secreção ocular e/ou nasal detectável), em, pelo menos, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mesmo 100% dos cavalos soronegativos após exposição à cepa.

[009] A cepa pode ser cultivada em cultura celular a uma titulação de pelo menos 106 de TCID50/ml, mais preferivelmente 107 de TCID50/ml, 108 de TCID50//ml, ou mesmo 109 de TCID50/mL. A administração de uma composição imunogênica contendo a cepa resulta em uma titulação sérica de pelo menos 1:120 e, preferivelmente pelo menos, 1:200, 1:500, 1:750 ou 1:1000.

[0010] Nas composições imunogênicas da invenção, uma ou mais cepas de ERAV ou ERBV incluem preferivelmente ERAV/ON/05 (No. de Acesso ATCC PTA-11828) e/ou cepa de ERBV 07-103042 (ATCC PTA- 11829). Além disso, as composições imunogênicas da invenção contêm, pelo menos, uma cepa de ERAV que compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem mais do que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2, ou codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos com mais de 95% de identidade com SEQ ID NO: 3, em que a referida cepa de ERAV, quando não inativada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras. A composição imunogênica da invenção pode também incluir uma cepa de ERAV que compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos compreendendo a sequência SEQ ID NO: 2, ou codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[0011] As composições imunogênicas da invenção também podem incluir uma cepa de ERBV que compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem mais do que 95% de identidade com a transcrição reversa da sequência genômica da cepa de ERBV tendo no. de acesso ATCC PTA-11829 ou codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos com mais de 95% de identidade com a poliproteína codificada pelo genoma da cepa de ERBV tendo no. de acesso ATCC PTA-11829, em que a dita cepa de ERBV, quando não inativada, é ativa para infectar e se replicar em células hospedeiras. A cepa de ERBV pode também compreender uma sequência genômica que é a sequência genômica da cepa de ERBV tendo no. de acesso ATCC PTA-11829 ou codifica uma poliproteína que tem a sequência de aminoácidos da poliproteína codificada pelo genoma da cepa de ERBV tendo no. de acesso ATCC PTA-11829.

[0012] Em uma modalidade específica, a composição imunogênica da invenção compreende o Vírus A de Rinite Equina (ERAV) e Vírus B de Rinite Equina (ERBV), em que a cepa de ERAV é ERAV/ON/05 e a cepa de ERBV tem no. de acesso ATCCo. PTA-11829.

[0013] Além disso, a invenção adicionalmente inclui composições imunogênicas multivalentes compreendendo os vírus atenuados vivos ou inativados ou antígenos de outros vírus diferentes ERAV e ERBV que causam a doença em equídeos. Em particular, a invenção proporciona composições imunogênicas que compreendem, além de ERAV e/ou ERBV inativado ou vivo atenuado, pelo menos, um antígeno ou uma cepa inativada ou viva atenuada do vírus da Herpes Equina (EHV), e, em modalidades particulares, o EHV é selecionado a partir do grupo consistindo em EHV-1 e EHV-4, e uma combinação destes, mais especificamente, o vírus da Herpes Equina é selecionado a partir do grupo consistindo em EHV-1, EHV-4, as cepas depositadas com ATCC sob Nos. de acesso PTA-9525 e PTA-9526, e uma combinação dos mesmos.

[0014] A invenção adicionalmente proporciona a composição imunogênica, a qual, além da cepa inativada ou viva atenuada de ERAV e/ou ERBV, pelo menos, uma cepa atenuada inativada ou viva de, pelo menos, um antígeno do vírus da influenza equina. Em modalidades específicas, o vírus da influenza equina é selecionado a partir do grupo consistindo em um vírus Clade 1, vírus Clade 2, Influenza A/sul africana /2003, influenza A/equina-2/Ohio/03, influenza A/equina-2/New Market /2/93, Influenza A/equina-2/Kentucky/95, Influenza A/equina- 2/Richmond/1/2007, cepas depositadas em ATCC sob Nos, de acesso PTA-9522, PTA-9523, e PTA- 9524, e combinações dos mesmos. As composições imunogênicas podem incluir, em adição a ERAV e/ou ERBV inativada ou viva atenuada, pelo menos, um antígeno ou uma cepa atenuada inativada ou viva do vírus da Herpes Equina, e pelo menos um antígeno ou uma cepa atenuada, inativada ou viva do Vírus da Influenza Equina.

[0015] As composições imunogênicas da invenção podem incluir, além de ERAV e/ou ERBV atenuado, inativado ou vivo, pelo menos um vírus atenuado inativado ou vivo ou pelo menos um antígeno de uma ou mais cepas selecionadas a partir do grupo consistindo em vírus do Nilo Ocidental, vírus da encefalomielite equina do leste, vírus da Encefalomielite Equina Ocidental, vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana, e Toxoide Tetânico e combinações dos mesmos. Alternativamente, a composição imunogênica, em adição a ERAV e/ou ERBV atenuado, inativado ou vivo, compreende um ou mais cepas atenuadas, inativadas ou vivas ou antígenos de cepas de encefalomielite equina do leste, Encefalomielite Equina Ocidental, vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana, e Toxoide Tetânico. Em modalidades específicas, o vírus do Nilo Ocidental é uma das cepas selecionadas a partir do grupo consistindo em Horse Origin 2005, depositado na ATCC com o número de acesso PTA-9409; NAEE159, depositado no United States Department of Agriculture Isolate sob o número de acesso 405330; NY2002Nassau; NY2002Clinton; NY2002Queens; GA20021; GA20022; TX20021; TX20022; in2002; NY2003Albany; NY2003Suffolk; NY2003Chatauqua; CO20031; CO20032; TX2003; TX2003Harris4; TX2003Harris6; TX2003Harris7; TX2003Harris10; AZ2004, e TX2004Harris4 e combinação dos mesmos. Nas composições imunogênicas compreendendo vírus da Encefalomielite Equina Ocidental, a cepa pode ser a cepa depositada na ATCC com o número de acesso PTA-9410. Em composições que compreendem o vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana, a cepa pode ser a cepa depositada na ATCC com o número de acesso PTA- 9411. Nas composições imunogênicas compreendendo vírus da Encefalomielite Equina Oriental, a cepa pode ser a cepa depositada na ATCC com o número de acesso PTA-9412. E, em composições imunogênicas compreendendo Vírus da Herpes Equina, a cepa pode ser selecionada a partir do grupo consistindo nas cepas depositadas na ATCC com o Nos. de acesso PTA-9525 ou PTA-9526, e combinações das mesmas.

[0016] Em modalidades específicas, uma ou mais das cepas na composição imunogênica estão presentes em uma quantidade de cerca de 102.0TCID50/mL a cerca de 1010.0TCID50/mL por dose. A composição pode adicionalmente incluir um veículo farmacêutico adequado, tal como um diluente, adjuvante, agente antimicrobiano, conservante, agente de inativação, ou combinação dos mesmos. Em modalidades particulares, a composição imunogênica compreende um adjuvante, mais especificamente, HRA-5.

[0017] A invenção adicionalmente proporciona métodos para reduzir a incidência ou para diminuir a gravidade dos sintomas clínicos associados com ou causados por vírus de rinite equina A ou vírus de rinite equina B em um animal ou em um rebanho de animais compreendendo a etapa de administrar uma composição imunogênica que compreende uma ou mais cepas de ERAV ou ERBV atenuado inativado ou vivo, em que a cepa de ERAV ou a cepa de ERBV, antes da inativação ou da atenuação, causa doença respiratória detectável em pelo menos 50% dos cavalos soronegativos expostos à cepa, ou cresce em cultura celular a 106 de TCID50/mL ou superior, ou, quando utilizada como uma vacina em cavalos com uma dose de 106 de TCID50 ou superior resulta em uma titulação sérica de, pelo menos, 1:112. Em particular, uma ou mais cepas de ERAV ou ERBV incluem preferivelmente ERAV/ON/05 (No. de Acesso ATCC PTA-11828) e/ou cepa de ERBV 07-103042 (ATCC PTA-11829). Além disso, a cepa de ERAV pode compreender uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem mais do que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2, ou codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos com mais de 95% de identidade com a SEQ ID NO: 3, em que a referida cepa de ERAV, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras, ou a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos compreendendo a sequência SEQ ID NO: 2, ou codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3. Além disso, ou alternativamente, a cepa de ERBV pode compreender uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem mais do que 95% de identidade com a transcrição reversa da sequência genômica da cepa de ERBV tendo no. de acesso ATCC PTA-11829 ou codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos com mais de 95% de identidade com a poliproteína codificada pelo genoma da cepa de ERBV tendo no. de acesso ATCC PTA-11829, em que a referida cepa de ERBV, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e se replicar em células hospedeiras. A cepa de ERBV pode também compreender uma sequência genômica que é a sequência genômica da cepa de ERBV tendo no. de acesso ATCC PTA-11829 ou codifica uma poliproteína que tem a sequência de aminoácidos da poliproteína codificada pelo genoma da cepa de ERBV tendo no. de acesso ATCC PTA-11829.

[0018] Além de proporcionar métodos para reduzir a incidência ou diminuir a gravidade dos sintomas clínicos associados com ou causados por ERAV ou ERBV em um animal ou em um rebanho de animais, os métodos da invenção podem adicionalmente reduzir a incidência ou diminuir a gravidade de sintomas clínicos associados com ou causados por um ou mais dos agentes patogênicos selecionados de entre o grupo consistindo em vírus do Nilo Ocidental, Vírus da Encefalomielite Equina Oriental, vírus da Encefalomielite Equina Ocidental, Vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana, e Clostridium tetani, em um animal ou em um rebanho de animais por administração de uma composição imunogênica da invenção. Os métodos da invenção também incluem métodos para reduzir a incidência ou diminuir a gravidade dos sintomas clínicos associados com ou causados por ERAV ou ERBV em um animal ou em um rebanho de animais, juntamente com a redução da incidência ou diminuição da gravidade dos sintomas clínicos associados com ou causados por um ou mais dos agentes patogênicos selecionados de entre o grupo consistindo em: Vírus da Encefalomielite Equina Oriental, vírus da Encefalomielite Equina Ocidental, Vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana, vírus da Herpes Equina, e Clostridium tetani, em um animal ou em um rebanho de animais por administração de uma composição imunogênica da invenção.

[0019] A invenção também proporciona métodos para a redução da incidência ou diminuição da gravidade dos sintomas clínicos associados com ou causados por ERAV e/ou ERBV, bem como um ou vários dos patógenos selecionados de entre o grupo consistindo em: vírus do Nilo Ocidental, Vírus da Encefalomielite Equina Oriental, vírus da Encefalomielite Equina Ocidental, Vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana, vírus da Herpes Equina, vírus da Influenza Equina, e Clostridium tetani, em um animal ou em um rebanho de animais, compreendendo a etapa de administração de uma composição imunogênica da invenção.

[0020] Em conexão com os métodos da invenção, a incidência de sintomas clínicos causados por um ou mais dos referidos agentes patogênicos em um rebanho de animais é reduzida de cerca de 10% - 50%, em comparação com um rebanho que não recebe a composição imunogênica. Os métodos da invenção, em modalidades particulares, proporcionam uma duração de imunidade de pelo menos 12 meses contra um ou mais dos agentes patogênicos presentes na composição imunogênica. Nos métodos da invenção, a composição imunogênica é administrada a um equídeo, de preferência, um cavalo. O regime de dosagem pode incluir a administração da composição imunogênica em uma ou mais doses. As doses para os métodos da invenção podem ser formuladas em de formas de dosagem de 0,5 mL a 2,5 mL. De preferência, os métodos da invenção administram composições imunogênicas, que são seguras para utilização em potros e cavalos de 4 meses de idade ou mais velhos.

[0021] A invenção também proporciona métodos para produzir uma composição imunogênica compreendendo uma ou mais cepas de vírus da Rinite equina A inativado (ERAV) ou Vírus da rinite equina B (ERBV) como se segue: a) infectar uma linhagem celular suscetível a ERAV ou ERBV; b) crescer a linhagem celular infectada em meio de crescimento, até que um efeito citopático (ECP) seja atingido; c) colher os meios; d) filtrar os meios para produzir um meio filtrado e e) colocar em contato os meios filtrados com um agente de inativação para obter o ERAV ou ERBV inativado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0022] Fig. 1 é uma representação gráfica da proporção de virus positivo ao longo do tempo.

[0023] Fig. 2 é uma representação gráfica da proporção de camada de células brancas positivas ao longo do tempo.

[0024] Fig. 3 é uma representação gráfica das titulações de neutralização de soro ao longo do tempo.

[0025] Fig. 4 é uma representação gráfica das pontuações nasais médias ao longo do tempo.

[0026] Fig. 5 é uma representação gráfica das pontuações oculares médias ao longo do tempo.

[0027] Fig. 6 é um alinhamento ClustalW de uma porção de um virus da rinite equino A ERAV/ON/05 (porção UTR 5', SEQ ID NO: 1) com ERAV/PERV-1 (número de acesso: DQ272578 (SEQ ID NO: 14)). Inserções de nucleotídeos ERAV/ON/05 mostradas em negrito e exclusões em sombreamento.

[0028] Fig. 7 é um gráfico de meios de pontuação clínica total de grupos de controle, infectados, e reinfectados do Exemplo 4.

[0029] Fig. 8 é um gráfico de meios de temperatura corporal de grupos de controle, infectados, e reinfectados do Exemplo 4.

[0030] Fig. 9 é uma tabela que mostra as titulações para vírus da rinite equina A (ERAV) e vírus da rinite equina B (ERBV) grupos de controle, infectados, e reinfectados do Exemplo 4. O teste de neutralização de vírus (VN) foi usado para medir as titulações de anticorpos em amostras de soro.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0031] Os inventores determinaram que as composições imunogênicas compreendendo uma ou mais cepas de ERAV inativado, que, quando vivas e ativas são virulentas (isto é, pelo menos, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mesmo 100% de cavalos soronegativos, quando propositadamente expostos ao vírus, apresentam doença respiratória observável, particularmente secreção nasal e/ou ocular), podem ser cultivadas para titulações elevados em cultura para produzir uma vacina que é capaz de induzir titulações elevadas de anticorpos do soro contra ERAV quando administrados, por exemplo, em um equino, por exemplo, resultando em uma titulação sérica, pelo menos, 1:112, e de preferência, pelo menos, 1:200, 1:500, 1:750 ou 1:1000. Além disso, as cepas crescem bem em cultura e são altamente eficientes para produzir, por exemplo, para uma titulação de pelo menos 106 de TCID50/ml, mais preferivelmente 107 de TCID50/ml, 108 de TCID50//ml, ou mesmo 109 de TCID50/mL. Do mesmo modo, as composições que compreendem uma ou mais cepas de ERBV inativado, e que, quando vivo e ativo e não atenuado são também virulentos (como definido acima para ERAV), também foram encontrados crescendo bem em cultura, a uma titulação de pelo menos 106 de TCID50/ml, mais preferivelmente 107 de TCID50/ml, 108 de TCID50//mL ou mesmo 109 de TCID50/ml, para ser altamente eficiente para produzir e para induzir titulações elevados de anticorpos no soro de animais após a imunização, por exemplo, o que resulta em uma titulação sérica de pelo menos 1:120 e, preferivelmente pelo menos, 1:200, 1:500, 1:750 ou 1:1000. Ambas composições de ERAV e ERBV e combinações dos mesmos, são capazes de reduzir a duração, gravidade e incidência de doença em um animal tal como um cavalo, que tenha sido imunizado com as composições e subsequentemente desafiados.

[0032] Em uma modalidade, é proporcionada uma composição imunogênica que compreende uma ou mais cepas de ERAV inativado e/ou ERBV. Alternativamente, as cepas podem ser atenuadas por meio de rotina e o vírus vivo, atenuado usado na composição da vacina. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem uma 5'UTR compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERAV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, que contém as proteínas da poliproteína ERAV funcional (isto é, ativo em infecção e replicação viral). Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica que, quando transcrita de forma reversa, tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou que codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em certas modalidades a cepa de ERAV é ERAV/ON/05 tendo No. acesso ATCC PTA-11828, depositada com a American Type Culture Collection em 14 de abril de 2011, que é aqui incorporada por referência.

[0033] Em algumas modalidades, a cepa é ERBV 07-103042, tendo No. acesso ATCC: PTA-11829, depositada com a American Type Culture Collection em 14 de abril de 2011, que é aqui incorporada por referência. Em algumas modalidades, a cepa de ERBV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos da transcrição reversa do genoma da cepa de ERBV tendo no. de acesso ATCC PTA-11829 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERBV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína tendo uma sequência de aminoácido com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da poliproteína da cepa com o No. de Acesso ATCC PTA-11829, que contém poliproteína com proteínas ERBV funcionais (isto é, ativas em infecção viral e replicação).

[0034] Em uma modalidade é fornecida uma composição imunogênica compreendendo inativada (ou, alternativamente, vivo, atenuado) e ERAV ERBV. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem uma 5'UTR compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e, quando não inativada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERAV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuja poliproteína contém as proteínas ERAV funcionais (isto é, ativa em infecção e replicação viral). Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica que, quando transcrita de forma reversa, tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou que codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a cepa ERAV é ERAV/ON/05 (No. de Acesso ATCC PTA-11828). Em algumas modalidades, o ERBV é uma cepa tendo No. de Acesso ATCC: PTA-11829. Em algumas modalidades, a cepa de ERBV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos da transcrição reversa do genoma da cepa de ERBV tendo No. de Acesso ATCC PTA-11829 e, quando não inativado, está ativo para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERBV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da poliproteína da cepa em ATCC N PTA- 11829, que contém poliproteína funcional proteínas ERBV (isto é, ativa em infecção viral e replicação).

[0035] Em uma modalidade, juntamente com uma ou mais cepas inativadas ou vivas, atenuadas de ERAV e/ou ERBV, as composições imunogênicas aqui proporcionados adicionalmente compreendem, pelo menos, um antígeno ou uma cepa atenuada, inativada ou viva adicional de Vírus da Herpes Equina (MAT). Em algumas modalidades, as composições compreendem pelo menos um antígeno de EHV. Em algumas modalidades o EHV é selecionado a partir do grupo consistindo em EHV-1, EHV-4, cepas depositadas na ATCC com o Nos. de acesso PTA-9525 e PTA-9526, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem uma 5'UTR compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e, quando não inativada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERAV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuja poliproteína contém as proteínas ERAV funcionais (isto é, ativa na infecção e replicação viral). Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica que, quando transcrita de forma reversa, tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou que codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a cepa ERAV é ERAV/ON/05 (No. de Acesso ATCC PTA-11828). Em algumas modalidades, o ERBV é uma cepa tendo No. de Acesso ATCC: PTA- 11829. Em algumas modalidades, a cepa de ERBV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos da transcrição reversa do genoma da cepa de ERBV tendo No. de Acesso ATCC PTA-11829 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERBV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína tendo uma sequência de aminoácido com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da poliproteína da cepa com o No. de Acesso ATCC PTA-11829, cuja poliproteína contém proteínas ERBV funcionais (isto é, ativa em infecção viral e replicação).

[0036] Em uma modalidade, juntamente com as uma ou mais cepas inativadas (ou atenuadas) de ERAV e/ou ERBV, as composições imunogênicas aqui proporcionadas adicionalmente compreendem, pelo menos, um antígeno ou uma cepa atenuada ou inativada adicional de Vírus da Influenza equina (EIV). Em algumas modalidades, as composições compreendem pelo menos um antígeno de EIV. Em algumas modalidades, o WNV é selecionado a partir do grupo consistindo em um vírus Clade 1, vírus Clade 2, Influenza A/Sul-africana/2003, influenza A/equina-2/Ohio/03, Influenza A/equina-2/Novo Mercado/2/93, Influenza A/equina-2/Kentucky/95, Influenza A/equina- 2/Richmond/1/2007 e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem uma 5'UTR compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERAV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuja poliproteína contém as proteínas ERAV funcionais (isto é, ativa em infecção e replicação viral). Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica que, quando transcrita de forma reversa, tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou que codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a cepa ERAV é ERAV/ON/05 (ATCC N PTA-11828). Em algumas modalidades, o ERBV é uma cepa tendo No. de Acesso ATCC: PTA-11829. Em algumas modalidades, a cepa de ERBV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos da transcrição reversa do genoma da cepa de ERBV tendo No. de Acesso ATCC PTA-11829 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERBV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína tendo uma sequência de aminoácido com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da poliproteína da cepa com o No. de Acesso ATCC PTA-11829, cuja poliproteína contém proteínas ERBV funcionais (isto é, ativa em infecção viral e replicação

[0037] Em uma modalidade, juntamente com as uma ou mais cepas inativadas (ou vivas, atenuadas) de ERAV e/ou ERBV, as composições imunogênicas aqui proporcionadas adicionalmente compreendem, pelo menos, um antígeno ou uma cepa atenuada, inativada ou viva adicional de Vírus da influenza equina, e pelo menos um antígeno ou uma cepa atenuada, inativada ou viva adicional de Vírus da Herpes Equina. Em algumas modalidades, as composições compreendem pelo menos um antígeno de EHV e pelo menos um antígeno de EIV. Em algumas modalidades o EHV é EHV-1 ou EHV-4 ou uma sua combinação e o WNV é selecionado a partir do grupo consistindo em um vírus Clade 1, vírus Clade 2, Influenza A/Sul-africana/2003, Influenza A/equina- 2/Ohio/03, Influenza A/equina-2/New Market/2/93, Influenza A/equina- 2/Kentucky/95, Influenza A/equina-2/Richmond/1/2007 e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem uma 5'UTR compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERAV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuja poliproteína contém as proteínas ERAV funcionais (isto é, ativa em infecção e replicação viral). Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica que, quando transcrita de forma reversa, tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou que codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a cepa ERAV é ERAV/ON/05 (No. de Acesso ATCC PTA-11828). Em algumas modalidades, o ERBV é uma cepa tendo No. de Acesso ATCC: PTA-11829. Em algumas modalidades, a cepa de ERBV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos da transcrição reversa do genoma da cepa de ERBV tendo No. de Acesso ATCC PTA-11829 e, quando não inativado, está ativo para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERBV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da poliproteína da cepa com o No. de Acesso ATCC PTA-11829, que contém poliproteína funcional proteínas ERBV (isto é, ativa em infecção viral e replicação).

[0038] Em uma modalidade, juntamente com as uma ou mais cepas inativadas (ou vivas, atenuadas) de ERAV e/ou ERBV, as composições imunogênicas aqui proporcionadas adicionalmente compreendem pelo menos um antígeno ou um vírus inativado de uma ou mais cepas adicionais selecionadas a partir do grupo consistindo em Vírus da Influenza Equina, Vírus da herpes Equina, vírus do Nilo Ocidental, vírus da encefalomielite equina do leste, Vírus da Encefalomielite Equina Ocidental, e vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana, e/ou o Toxoide Tetânico, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem uma 5'UTR compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e, quando não inativada é atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERAV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuja poliproteína contém as proteínas ERAV funcionais (isto é, ativa em infecção e replicação viral). Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica que, quando transcrita de forma reversa, tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou que codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a cepa ERAV é ERAV/ON/05 (No. de Acesso ATCC PTA- 11828). Em algumas modalidades, o ERBV é uma cepa tendo No. de Acesso ATCC: PTA-11829. Em algumas modalidades, a cepa de ERBV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos da transcrição reversa do genoma da cepa de ERBV tendo No. de Acesso ATCC PTA-11829 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERBV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína tendo uma sequência de aminoácido com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da poliproteína da cepa com o No. de Acesso ATCC PTA-11829, cuja poliproteína contém proteínas ERBV funcionais (isto é, ativa em infecção viral e replicação).

[0039] Em uma modalidade, juntamente com as uma ou mais cepas inativadas (ou vivas, atenuadas) de ERAV e/ou ERBV, as composições imunogênicas aqui proporcionadas adicionalmente compreendem pelo menos um vírus inativado ou vivo atenuado adicional selecionado de uma cepa a partir do grupo consistindo em vírus do Nilo Ocidental, Vírus da Encefalomielite Equina Oriental, vírus da Encefalomielite Equina Ocidental, e Vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana, e/ou o Toxoide Tetânico, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem uma 5'UTR compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERAV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuja poliproteína contém as proteínas ERAV funcionais (isto é, ativa em infecção e replicação viral). Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica que, quando transcrita de forma reversa, tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou que codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a cepa ERAV é ERAV/ON/05 (No. de Acesso ATCC PTA- 11828). Em algumas modalidades, o ERBV é uma cepa tendo No. de Acesso ATCC: PTA-11829. Em algumas modalidades, a cepa de ERBV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos da transcrição reversa do genoma da cepa de ERBV tendo No. de Acesso ATCC PTA-11829 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERBV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína tendo uma sequência de aminoácido com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da poliproteína da cepa com o No. de Acesso ATCC PTA-11829, cuja poliproteína contém proteínas ERBV funcionais (isto é, ativa em infecção viral e replicação).

[0040] Em uma modalidade, é fornecido um método de fazer a composição imunogênica da presente invenção. O método compreende geralmente as etapas de combinar um ERAV e/ou ERBV inativado ou vivo, atenuado e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem uma 5'UTR compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERAV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuja poliproteína contém as proteínas ERAV funcionais (isto é, ativa em infecção e replicação viral). Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica que, quando transcrita de forma reversa, tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou que codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a cepa ERAV é ERAV/ON/05 (No. de Acesso ATCC PTA- 11828). Em algumas modalidades, o ERBV é uma cepa tendo No. de Acesso ATCC: PTA-11829. Em algumas modalidades, a cepa de ERBV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos da transcrição reversa do genoma da cepa de ERBV tendo No. de Acesso ATCC PTA-11829 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERBV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína tendo uma sequência de aminoácido com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da poliproteína da cepa com o No. de Acesso ATCC PTA-11829, cuja poliproteína contém proteínas ERBV funcionais (isto é, ativa em infecção viral e replicação). Em algumas modalidades, o método adicionalmente compreende a etapa de adicionar um ou mais antígenos do vírus equino adicional ou vírus equino atenuado inativado ou vivo. Em uma outra modalidade, o método adicionalmente compreende a etapa de adicionar um adjuvante apropriado na composição.

[0041] Em uma modalidade, é fornecido um método para reduzir a incidência ou diminuir a gravidade dos sintomas clínicos associados com ou causados por ERAV ou ERBV em um animal ou em um rebanho de animais que compreende a administração de uma composição imunogênica, tal como aqui descrito a um animal em necessidade da mesma. Em algumas modalidades, o animal é um cavalo.

[0042] As modalidades acima mencionadas podem ainda conter uma ou mais das seguintes características descritas a seguir.

[0043] Em uma modalidade, é fornecida uma composição que compreende pelo menos uma cepa de ERAV e/ou ERBV inativada (ou, alternativamente, viva, atenuada) e conter ainda muitos ou todos os componentes antigênicos relevantes e proteínas de patogenicidade do Vírus do nilo ocidental (WNV), ou uma cepa atenuada inativada ao viva de WNV.

[0044] Em uma modalidade, é fornecida uma composição de vacina compreendendo uma ou mais cepas de ERAV e/ou ERBV inativada (ou viva atenuada) em combinação com uma ou mais quantidades imunologicamente eficazes de componentes antigênicos ou uma ou mais cepas atenuadas inativadas ou vivas, selecionadas a partir do grupo consistindo em vírus do Nilo Ocidental (WNV), Encefalomielite Equina Venezuelana (VEE), encefalomielite equina do leste (EEE), Encefalomielite Equina Ocidental (WEE), Toxoide Tetânico (T), vírus da herpes equina (EHV), incluindo tipos 1 e 4, vírus da influenza equina (EIV), e combinações dos mesmos, juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. De preferência, essas modalidades irão incluir um adjuvante, tal como um carbômero, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outras modalidades, o adjuvante é HRA-5, um carbômero, ou óleo mineral.

[0045] Em algumas modalidades, as composições também incluem ERAV e/ou ERBV atenuado, inativado ou vivo em combinação com as seguintes cepas atenuadas, inativadas ou vivas ou antígenos virais e combinações de cepas e antígenos: Vírus do Nilo Ocidental, encefalomielite equina do leste; Encefalomielite Equina Ocidental; encefalomielite equina venezuela; tétano toxoide, encefalomielite equina do leste e Encefalomielite Equina Ocidental, encefalomielite equina do leste e Encefalomielite Equina Venezuelana, encefalomielite equina do leste e tétano toxoide, encefalomielite equina do leste, Encefalomielite Equina Ocidental, e encefalomielite equina Venezuelana, encefalomielite equina do leste, Encefalomielite Equina Ocidental e tétano toxoide, encefalomielite equina do leste, Encefalomielite Equina Ocidental, Encefalomielite Equina Venezuelana com Toxoide Tetânico; Encefalomielite Equina Ocidental e encefalomielite equina Venezuela; Encefalomielite Equina Ocidental com Toxoide Tetânico; Encefalomielite Equina Ocidental, Encefalomielite Equina Venezuelana, com Toxoide Tetânico, encefalomielite equina Venezuelana com Toxoide Tetânico, e encefalomielite equina do leste, encefalomielite equina Venezuela e Toxoide Tetânico ou antígenos ou componentes antigênicos do mesmo. A combinação preferida dessas combinações especificadas inclui ERAV e/ou ERBV em combinação com antígenos ou componentes antigênicos de vírus inativados do vírus do Nilo Ocidental, encefalomielite equina do leste, Encefalomielite Equina Ocidental, Encefalomielite Equina Venezuelana, com Toxoide Tetânico. Outra combinação preferida inclui ERAV e/ou ERBV em combinação com antígenos ou componentes antigênicos de encefalomielite equina do leste, Encefalomielite Equina Ocidental, Encefalomielite Equina Venezuelana, com Toxoide Tetânico. ERAV preferidos incluem ERAV/ON/05 (No. de Acesso ATCC PTA- 11828), a cepa de ERAV que compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem uma 5'UTR compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, a qual compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERAV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuja poliproteína contém as proteínas ERAV funcionais (isto é, ativa em infecção e replicação viral). A cepa de ERAV pode também compreender uma sequência genômica que, quando transcrita de forma reversa, tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou que codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. ERBV preferida é uma cepa tendo No. de Acesso ATCC PTA- 11829, ou que compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos da transcrição reversa do genoma da cepa de ERBV tendo No. de Acesso ATCC PTA-11829 e, quando não inativada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERBV funcionais, ou que codifica uma poliproteína tendo uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da poliproteína da cepa com No. de Acesso ATCC PTA-11829, cuja poliproteína contém proteínas ERBV funcionais (isto é, ativa em infecção viral e replicação). Em cada uma dessas combinações especificadas, um adjuvante ou combinação de adjuvantes pode ser usado, tais como, HRA-5, carbômero ou com Carbopol. A cepa NJO de encefalomielite equina do leste, a cepa Fleming de Cepa da Encefalomielite Equina Ocidental, e a cepa TC-83 da cepa Encefalomielite Equina Venezuelana são todas cepas representativas desses componentes da vacina.

[0046] Modalidades preferidas adicionais da presente invenção incluem composições imunogênicas feitas usando cada uma das vacinas de combinação específicas listadas acima e adicionando antígenos ou vírus inativados ou atenuados de herpesvírus equino, de preferência do tipo 1, tipo 4, (EHV1 e/ou EHV4) ou combinações dos mesmos.

[0047] Ainda outras variações de cada uma das vacinas de combinação específicas ou composições imunogênicas listadas acima, incluindo aquelas que incluem EHV1 e/ou EHV4 podem ser feitas por adição de antígenos ou de vírus atenuados inativados ou vírus da influenza equina (EIV). Modalidades preferidas que incorporam o vírus da influenza equina incluem inativada ou viva atenuada: ERAV e/ou ERBV e pelo menos uma cepa atenuada inativada ou viva de cada um de WNV, vírus da influenza equina, e Toxoide Tetânico; ERAV e/ou ERBV e pelo menos uma cepa atenuada inativada ou viva de cada um de WNV, Vírus da Influenza Equina, Toxoide Tetânico, e Encefalomielite Equina Oriental; ERAV e/ou ERBV e, pelo menos, uma cepa de cada um de WNV, Vírus da Influenza Equina, Toxoide Tetânico, Encefalomielite Equina Oriental, e Encefalomielite Equina Ocidental; ERAV e/ou ERBV e pelo menos uma cepa de cada um de WNV, Vírus da influenza equina, Toxoide Tetânico, encefalomielite equina do leste, Encefalomielite Equina Ocidental, e encefalomielite equina Venezuelana; ERAV e/ou ERBV e pelo menos uma cepa de cada um de WNV, vírus da influenza equina, Encefalomielite Equina Oriental e; ERAV e/ou ERBV e, pelo menos, uma cepa de cada um de WNV, vírus da influenza equina, Encefalomielite Equina Ocidental e; ERAV e/ou ERBV e, pelo menos, uma cepa de cada de WNV, Vírus da Influenza Equina, e encefalomielite equina Venezuelana; ERAV e/ou ERBV e pelo menos uma cepa de cada um de WNV, Vírus da influenza equina, encefalomielite equina do leste e Encefalomielite Equina Ocidental; ERAV e/ou ERBV e pelo menos uma cepa de cada um de WNV, Vírus da influenza equina, encefalomielite equina do leste, e encefalomielite equina Venezuelana; ERAV e/ou ERBV e pelo menos uma cepa de cada um de WNV, Vírus da influenza equina, Encefalomielite Equina Ocidental, e encefalomielite equina Venezuelana; ERAV e/ou ERBV e, pelo menos, uma cepa de cada um de WNV, Vírus da Influenza equina, Encefalomielite Equina Ocidental, e Toxoide Tetânico; ERAV e/ou ERBV e, pelo menos, uma cepa de cada um de WNV, vírus da influenza equina, Encefalomielite Equina Venezuelana, e Toxoide Tetânico; ERAV e/ou ERBV e, pelo menos, uma cepa de cada um de WNV, vírus da influenza equina, Encefalomielite Equina Venezuelana, Encefalomielite Equina Ocidental, e Toxoide Tetânico, e ERAV e/ou ERBV e, pelo menos, uma cepa de cada um de WNV, Vírus da influenza equina , Encefalomielite Equina Venezuelana, encefalomielite equina do leste, e Toxoide Tetânico, onde as cepas acima atenuadas são inativadas ou vivas. Em cada modalidade específica uma ou mais cepas atenuadas inativadas ou vivas do vírus da influenza equina podem estar presentes. As cepas preferidas de vírus da influenza equina incluem Influenza A/equina-2/Ohio/03, influenza A/equina-2/NovoMercado/2/93, Influenza A/equina-2/Kentucky/95, e combinações dos mesmos. Em todas as combinações indicadas acima, é preferido o uso de pelo menos duas cepas atenuadas inativadas ou viva do vírus da influenza equina e ainda mais preferidas para usar, pelo menos, 3 cepas de vírus da influenza equina.

[0048] Modalidades preferidas que incorporam Vírus da Herpes Equina incluem: ERAV e/ou ERBV e, pelo menos, uma cepa de cada um de WNV, Vírus da Influenza Equina, Toxoide Tetânico, e Vírus da Herpes Equina; ERAV e/ou ERBV e, pelo menos, uma cepa de cada de WNV, Vírus da influenza equina, Toxoide Tetânico, vírus da Encefalomielite Equina do Leste, e Herpes Equina; ERAV e/ou ERBV e pelo menos uma cepa de cada um de WNV, Vírus da Influenza Equina, Toxoide Tetânico, encefalomielite equina do leste, Encefalomielite Equina Ocidental, e Vírus da Herpes Equina; ERAV e/ou ERBV e pelo menos uma cepa de cada um de WNV, Vírus da Influenza Equina, Toxoide Tetânico, encefalomielite equina do leste, Encefalomielite Equina Ocidental, Encefalomielite Equina Venezuelana, e Vírus da Herpes Equina; ERAV e/ou ERBV e pelo menos uma cepa de cada um de WNV, Vírus da Influenza Equina e Encefalomielite Oriental; ERAV e/ou ERBV e pelo menos uma cepa de cada um de WNV, Vírus da Influenza equina, Encefalomielite Equina Ocidental e vírus da Herpes Equina; ERAV e/ou ERBV e pelo menos uma cepa de cada um de WNV, Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina Venezuelana, e Vírus da Herpes Equina; ERAV e/ou ERBV e pelo menos uma cepa de cada um de WNV, Vírus da influenza equina, encefalomielite equina do leste, Encefalomielite Equina Ocidental, e ERAV e/ou ERBV e, pelo menos, uma cepa de cada um de WNV, Vírus da Influenza equina, Encefalomielite Equina Oriental, Encefalomielite Equina Venezuelana, e Vírus da Herpes Equina; ERAV e/ou ERBV e, pelo menos, uma cepa de cada um de WNV, Vírus da influenza equina, Encefalomielite Equina Ocidental, Encefalomielite Equina Venezuelana, e Vírus da Herpes Equina; ERAV e/ou ERBV e pelo menos uma cepa de cada um de WNV, Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina Ocidental, Toxoide Tetânico, e Vírus da Herpes Equina; ERAV e/ou ERBV e, pelo menos, uma cepa de cada um de WNV, Vírus da Influenza Equina, Encefalomielite Equina Venezuelana, Toxoide Tetânico, e Vírus da Herpes Equina; ERAV e/ou ERBV e, pelo menos, uma cepa de cada um de WNV, vírus da influenza equina, Encefalomielite Equina Venezuelana, Encefalomielite Equina Ocidental, Toxoide Tetânico, e Vírus da Herpes Equina, e ERAV e/ou ERBV e pelo menos uma cepa de cada um de WNV, vírus da influenza equina, Encefalomielite Equina Venezuelana, Encefalomielite Equina Oriental, Toxoide Tetânico, e Vírus da Herpes Equina, em que as referidas cepas são atenuadas inativadas ou vivas. Em todas as combinações indicadas acima, é preferível utilizar pelo menos duas cepas do vírus da Influenza Equina atenuado inativado ou vivo e adicionalmente preferido usar, pelo menos, três cepas do vírus da Influenza Equina atenuado inativado ou vivo. Além disso, em todas as combinações acima, a "pelo menos uma" cepa de vírus da Herpes equina é preferido ser selecionado a partir do grupo consistindo em EHV-1 e EHV-4 inativado. Em algumas formas preferidas, ambas as cepas atenuadas, inativadas ou vivas, EHV-1 e EHV-4, serão incluídas na composição imunogênica. Em outras formas preferidas, apenas EHV-1 será incluído. Em uma combinação preferida, a, cepa de ERAV atenuada inativada ou viva é ERAV/ON/05, uma cepa de ERAV que compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem uma 5'UTR compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, a qual compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e, quando não inativada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERAV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais de 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuja poliproteína contém as proteínas ERAV funcionais (isto é, ativa em infecção e replicação viral). A cepa de ERAV pode também compreender uma sequência genômica que, quando transcrita de forma reversa, tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou que codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Nas outras combinações preferidas, o ERBV é uma cepa tendo No. de Acesso ATCC PTA-11828, ou que compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos da transcrição reversa do genoma da cepa de ERBV tendo No. de Acesso ATCC PTA-11828 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERBV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da poliproteína da cepa com o No. de Acesso ATCC PTA-11828, cuja poliproteína contém proteínas ERBV funcionais (isto é, ativa em infecção e replicação viral).

[0049] As composições imunogênicas tal como aqui descritas podem ser administradas em qualquer dose imunogenicamente eficaz. Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica é administrada como uma dose única. De preferência, a dose tem um volume total de entre cerca de 0,5 mL e cerca de 2,5 ml, mais preferivelmente entre cerca de 0,6 mL e cerca de 2,0 ml, ainda mais preferivelmente entre cerca de 0,7 mL e cerca de 1,75 ml, ainda mais preferivelmente entre cerca de 0,8 mL e cerca de 1,5 ml, ainda mais preferivelmente entre cerca de 0,9 mL e cerca de 1,25 mL, com uma dose única de cerca de 1,0 mL sendo a mais preferida.

[0050] Em uma outra modalidade, a composição imunogênica é administrada com a primeira dose sendo administrada antes da administração de uma segunda dose (reforço). De preferência, a segunda dose é administrada pelo menos cerca de 15 dias após a primeira dose. Mais preferivelmente, a segunda dose é administrada de entre cerca de 15 e cerca de 28 dias após a primeira dose. Ainda mais preferivelmente, a segunda dose é administrada pelo menos cerca de 17 dias após a primeira dose. Ainda mais preferivelmente, a segunda dose é administrada de entre cerca de 17 e cerca de 25 dias após a primeira dose. Ainda mais preferivelmente, a segunda dose é administrada pelo menos cerca de 19 dias após a primeira dose. Ainda mais preferivelmente, a segunda dose é administrada de entre cerca de 19 e cerca de 23 dias após a primeira dose. Mais preferivelmente, a segunda dose é administrada pelo menos cerca de 21 dias após a primeira dose. Em uma modalidade preferida, ambas as primeira e segunda doses da composição imunogênica estão na mesma quantidade. De preferência, cada dose está nas quantidades preferidas acima indicadas, com uma dose de cerca de 1 mL para a primeira e segunda dose sendo a mais preferida. Além do primeiro e segundo regime de dosagem, uma modalidade alternativa adicionalmente compreende doses subsequentes. Por exemplo, uma terceira, quarta ou quinta dose, pode ser administrada nestas modalidades. De preferência, o terceiro, quarto e quinto regimes de dose subsequentes, são administrados na mesma quantidade que a primeira dose, com o intervalo de tempo entre as doses sendo consistente com a temporização entre as primeira e segunda doses acima mencionadas, embora a regulação possa também variar.

[0051] Em uma modalidade da composição imunogênica é administrada em três doses. Em algumas modalidades as três doses são administradas em intervalos de três semanas.

[0052] Em uma modalidade que compreende ERAV, preferivelmente ERAV/ON/05, a quantidade de ERAV na composição imunogênica é pelo menos cerca de 102.0TCID50/dose. Mais preferivelmente, a quantidade de ERAV está entre cerca de 102.0TCID50/dose a cerca 1010.0TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de ERAV é pelo menos cerca de 102.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de ERAV está entre cerca de 102.5TCID50/dose a cerca 109.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de ERAV é pelo menos cerca de 103.0TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de ERAV está entre cerca de 103.0TCID50/dose a cerca 109.0TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de ERAV é pelo menos cerca de 103.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de ERAV está entre cerca de 103.5TCID50/dose a cerca 109.0TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de ERAV está entre cerca de 106.5TCID50/dose e cerca 108.5TCID50/dose. Mais preferivelmente, a quantidade de ERAV está entre cerca de 107.0TCID50/dose e cerca 109.0TCID50/dose. Os valores de uma ERAV inativado ou atenuado ou de qualquer outra vacina inativada ou atenuada TCID50, em geral, referem-se ao conteúdo viral na vacina final, que no entanto é equivalente ao conteúdo viral calculado para a composição da vacina antes da sua inativação de vírus. Preferivelmente, a composição imunogênica da invenção estimula anticorpos neutralizantes do soro para ERAV com uma titulação de, pelo menos, 1:112, 1:300, 1:500, 1:700, 1:900, 1:1000, ou 1:1500

[0053] Em uma modalidade que compreende ERBV, de preferência uma cepa tendo No. de Acesso ATCC PTA-11829, a quantidade de ERBV é pelo menos cerca de 102.0TCID50/dose. Mais preferivelmente, a quantidade de ERBV está entre cerca de 102.0TCID50/dose a cerca 1010.0TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de ERBV é pelo menos cerca de 102.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de ERBV está entre cerca de 102.5TCID50/dose a cerca 109.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de ERBV é pelo menos cerca de 103.0TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de ERBV está entre cerca de 103.0TCID50/dose a cerca 109.0TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de ERBV é pelo menos cerca de 103.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de ERBV está entre cerca de 103.5TCID50/dose a cerca 109.0TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de ERBV está entre cerca de 106.5TCID50/dose e cerca 108.5TCID50/dose. Mais preferivelmente, a quantidade de ERBV está entre cerca de 107.0TCID50/dose e cerca 109.0TCID50/dose. Os valores de uma ERBV inativado ou qualquer outra vacina inativada TCID50, em geral, referem- se ao conteúdo viral na vacina final, que no entanto é equivalente ao conteúdo viral calculado para a composição da vacina antes da sua inativação de vírus. Preferivelmente, a composição imunogênica da invenção estimula anticorpos neutralizantes do soro aos ERBV a uma titulação de pelo menos 01:04 ou superior. Em algumas modalidades, a titulação de, pelo menos, 1:5, 1:06, 1:07, 1:08, 1:09, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, ou 1:15 ou superior. Em algumas modalidades, a titulação de, pelo menos, 1:64, 1:256, ou 1:512, ou superior. Em algumas modalidades, a titulação de, pelo menos, 1:1024 ou mais. Em algumas modalidades, a titulação de, pelo menos, 1:2048, 1:1536, 1:3072,1:4096, 1:6144, 1:8192, 1:12288, 1:32769 ou ou superior. Em algumas modalidades, a titulação não é mais do que 1:300, 1:1050, 1:32000, 1:70000, e 1:140000.

[0054] Em uma modalidade, em cada dose de uma modalidade da presente invenção, que compreende um ou mais antígenos adicionais de equinos, a quantidade de Encefalomielite Equina Oriental ou Encefalomielite Equina Venezuelana, em qualquer dose é de preferência pelo menos cerca de 105.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a dose varia entre cerca de 105.5TCID50/dose e cerca 109.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a dose é de pelo menos cerca de 106.0TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a dose varia entre cerca de 106.0TCID50/dose e cerca 109.0TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a dose é de pelo menos cerca de 106.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a dose varia entre cerca de 106.5TCID50/dose e cerca 109.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a dose é de pelo menos cerca de 107.0TCID50/dose. Mais preferivelmente, a dose varia entre cerca de 106.7TCID50 e cerca 109.2TCID50/dose.

[0055] Em uma modalidade que compreende WNV inativado ou morto ou antígeno, a quantidade de antígeno ou de WNV é pelo menos cerca de 102.0TCID50/dose. Mais preferivelmente, o antígeno ou o WNV está entre cerca de 102.0TCID50/dose a cerca 1010.0TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, o antígeno ou o WNV é pelo menos cerca de 102.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, o antígeno ou o WNV está entre cerca de 102.5TCID50/dose a cerca 109.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, o antígeno ou o WNV é pelo menos cerca de 103.0TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, o antígeno ou o WNV está entre cerca de 103.0TCID50/dose a cerca 109.0TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, o antígeno ou o WNV é pelo menos cerca de 103.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, o antígeno ou o WNV está entre cerca de 103.5TCID50/dose a cerca 109.0TCID50/dose. Mais preferivelmente, o antígeno ou o WNV está entre cerca de 107.0TCID50/dose e cerca 109.0TCID50/dose. Os valores TCID50 de uma vacina inativada WNV ou qualquer outra vacina inativada, em geral, referem-se ao teor de antígeno na vacina final, que no entanto é equivalente ao teor de antígeno calculado para a composição de vacina antes da inativação do seu antígeno. Preferivelmente, a composição imunogênica da invenção estimula anticorpos neutralizantes do soro para o WNV a uma titulação de pelo menos 01:04 ou superior. Em algumas modalidades a titulação é, pelo menos, 1:5, 1:06, 1:07, 1:08, 1:09, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, ou 1 : 15 ou superior. Em algumas modalidades, a titulação não é mais do que 1:300, 1:1050, 1:32000, 1:70000, e 1:140000. Em uma modalidade preferida, em cada dose de uma modalidade da presente invenção, que compreende o antígeno equino adicional, a quantidade de Encefalomielite Equina Oriental ou Encefalomielite Equina Venezuelana, em qualquer dose é de preferência pelo menos cerca de 105.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a dose varia entre cerca de 105.5TCID50/dose e cerca 109.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a dose é de pelo menos cerca de 106.0TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a dose varia entre cerca de 106.0TCID50/dose e cerca 109.0TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a dose é de pelo menos cerca de 106.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a dose varia entre cerca de 106.5TCID50/dose e cerca 109.5TCID50/dose. Ainda mais preferivelmente, a dose é de pelo menos cerca de 107.0TCID50/dose. Mais preferivelmente, a dose varia entre cerca de 106.7TCID50 e cerca 109.2TCID50/dose.

[0056] De preferência, o antígeno de Encefalomielite Equina Ocidental, quando presente na composição da presente invenção, está em uma quantidade de pelo menos cerca de 106.2PFU/mL. Ainda mais preferivelmente, a quantidade está entre cerca 106.2PFU/mL e cerca 1010.2PFU/mL. Ainda mais preferivelmente, a quantidade é pelo menos cerca de 106.7PFU/mL. Ainda mais preferivelmente, a quantidade está entre cerca 106.5PFU/mL e cerca 109.7PFU/mL. Ainda mais preferivelmente, a quantidade é pelo menos cerca de 107.2PFU/mL. Ainda mais preferivelmente, a quantidade está entre cerca 107.2PFU/mL e cerca 109.2PFU/mL. Ainda mais preferivelmente, a quantidade é pelo menos cerca de 107.7PFU/mL com entre cerca de 106,5PFU/dose e cerca de 109.0PFU/mL sendo a mais preferida.

[0057] Em uma outra modalidade preferida, a quantidade de Toxoide Tetânico, se presente na composição da presente invenção, está em uma quantidade de pelo menos cerca de 3 CPU, mais preferivelmente, entre cerca de 3 e cerca de 20 CPU, ainda mais preferivelmente , pelo menos cerca de 4 CPU e, mais preferivelmente pelo menos cerca de 5 CPU mas não mais do que cerca de 20 CPU.

[0058] Em uma modalidade alternativa, em que uma ou mais cepas do vírus da influenza equina estiver presente, a quantidade de Influenza Equina presente na composição encontra-se em uma quantidade de pelo menos cerca de 105,0TCID50/mL. Mais preferivelmente, a Influenza Equina está em uma quantidade de entre cerca de 105,0 TCID50/ml e cerca de 109,0 TCID50/mL, e, mais preferivelmente pelo menos cerca de 106,0 TCID50/mL. Ainda mais preferivelmente, a quantidade está entre cerca de 106,0 TCID50/mL e cerca de 108,0 TCID50/mL e, mais preferivelmente, a quantidade é pelo menos cerca de 106,5 TCID50/mL. Ainda mais preferivelmente, a quantidade está entre cerca de 106,5 e cerca de 107,5 TCID50/mL TCID50/ml, com a quantidade mais preferida de entre cerca de 106,7 TCID50/mL a cerca de 107,3 TCID50/mL.

[0059] Em uma modalidade que compreende vírus da Herpes Equina, a quantidade de vírus da Herpes Equina em cada dose é de pelo menos 106,0 TCID50/mL. Mais preferivelmente, Vírus da Herpes Equina está presente na composição em uma quantidade de entre cerca de 106,0 TCID50/mL e cerca de 109,5 TCID50/mL e, mais preferivelmente, em uma quantidade de cerca de 107,0 TCID50/mL. Ainda de maior preferência, Vírus da Herpes Equina está presente em uma quantidade entre cerca de 107,5 TCID50/mL e cerca de 109,0 TCID50/mL e, mais preferivelmente, em uma quantidade de cerca de 108,0 TCID50/mL. Ainda de maior preferência, Vírus da Herpes Equina está presente em uma quantidade de entre cerca de 108,0 TCID50/mL e cerca de 109,0 TCID50/mL e, mais preferivelmente, em uma quantidade de cerca de 108,50 TCID50/mL.

[0060] Em ainda outra modalidade preferida, uma composição de vacina compreendendo as cepas cronologicamente contemporâneas e epidemiologicamente prevalentes de ERAV e/ou ERBV é fornecida. De preferência, a composição compreende ERAV/ON/05 e/ou uma cepa de ERBV tendo No.de Acesso ATCC PTA-11829. Em modalidades específicas, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem uma 5'UTR compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e, quando não inativada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERAV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuja poliproteína contém as proteínas ERAV funcionais (isto é, ativa em infecção e replicação viral). Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica que, quando transcrita de forma reversa, tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou que codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o ERBV é uma cepa tendo No. de Acesso ATCC: PTA-11829. Em algumas modalidades, a cepa de ERBV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos da transcrição reversa do genoma da cepa de ERBV tendo No. de Acesso ATCC PTA-11829 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERBV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína tendo uma sequência de aminoácido com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da poliproteína da cepa com o No. de Acesso ATCC PTA-11829, cuja poliproteína contém proteínas ERBV funcionais (isto é, ativa em infecção viral e replicação). Essa composição será geralmente melhorar a eficácia da composição.

[0061] A presente invenção proporciona adicionalmente um método de redução da incidência e/ou severidade dos sinais clínicos associados com, infecção de ERAV e/ou ERBV em um animal, de preferência um cavalo. Tais métodos incluem geralmente a etapa de administração de uma composição de vacina que compreende, uma cepa atenuada viva ou inativada de um ERAV e/ou ERBV e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em modalidades particulares, o ERAV é ERAV/ON/05, ou a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem uma 5'UTR compreendendo a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e, quando não inativada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERAV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuja poliproteína contém as proteínas ERAV funcionais (isto é, ativa em infecção e replicação viral). Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica que, quando transcrita de forma reversa, tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou que codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o ERBV é uma cepa tendo No. de Acesso ATCC: PTA- 11829. Em algumas modalidades, a cepa de ERBV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos da transcrição reversa do genoma da cepa de ERBV tendo No. de Acesso ATCC PTA-11829 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERBV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína tendo uma sequência de aminoácido com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da poliproteína da cepa com o No. de Acesso ATCC PTA-11829, cuja poliproteína contém proteínas ERBV funcionais (isto é, ativa em infecção viral e replicação). Em algumas modalidades preferidas, um adjuvante, particularmente HRA-5, é adicionado à composição, e em outras formas preferidas, nenhum adjuvante, é fornecido.

[0062] Em uma modalidade preferida alternativa, o método compreende a administração de uma composição de vacina compreendendo uma ou mais cepas atenuadas, inativadas ou viva de ERAV e/ou ERBV em combinação com quantidades imunologicamente eficazes de componentes antigênicos ou cepas inativadas de outros patógenos equinos. Preferivelmente, a cepa ERAV é ERAV/ON/05 (No. de Acesso ATCC PTA-11828) e a cepa ERBV tem No. de Acesso ATCC PTA-11829. Em algumas dessas modalidades, a cepa de ERBV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem uma 5'UTR compreendendo a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e, quando não inativada ou viva, atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERAV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuja poliproteína contém as proteínas ERAV funcionais (isto é, ativa em infecção e replicação viral). Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica que, quando transcrita de forma reversa, tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou que codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o ERBV é uma cepa tendo No. de Acesso ATCC: PTA- 11829. Em algumas modalidades, a cepa de ERBV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos da transcrição reversa do genoma da cepa de ERBV tendo No. de Acesso ATCC PTA-11829 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERBV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína tendo uma sequência de aminoácido com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da poliproteína da cepa com o No. de Acesso ATCC PTA-11829, cuja poliproteína contém proteínas ERBV funcionais (isto é, ativa em infecção viral e replicação).

[0063] Em algumas modalidades do método, os agentes patogênicos, em combinação com a cepas de ERAV e/ou ERBV, são selecionados dentre o grupo consistindo em antígenos ou cepas atenuadas ou inativadas de EHV e WNV e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades os agentes patogênicos são antígenos. Em algumas modalidades EHV é EHV-1 ou EHV-4 ou uma combinação do mesmo. Em outras modalidades, o WNV é selecionado a partir do grupo consistindo em um vírus Clade 1, vírus Clade 2, Influenza A/Sul- africana/2003, influenza A/equina-2/Ohio/03, Influenza A/equina-2/Novo Mercado/2/93, Influenza A/equina-2/Kentucky/95, Influenza A/equina- 2/Richmond/1/2007 e combinações dos mesmos.

[0064] Ainda em outras modalidades do método, os agentes patogênicos, em combinação com as cepas de ERAV e/ou ERBV, são selecionados dentre o grupo consistindo em antígenos ou cepas inativadas ou atenuadas de WNV, Encefalomielite Equina Oriental, Encefalomielite Equina Ocidental e Encefalomielite Equina Venezuelana, e Toxoide Tetânico, e combinações dos mesmos, e mais preferivelmente sendo essas combinações descritas acima. Em uma outra modalidade preferida, a vacina da presente invenção é combinada com um adjuvante adequado e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[0065] A presente invenção proporciona a redução da incidência e/ou severidade dos sintomas clínicos associados com infecção ERAV e/ou ERBV em um rebanho. De preferência, a gravidade e/ou a incidência dos sintomas clínicos em animais que receberam a composição imunogênica da invenção são reduzidos em pelo menos 10% em comparação com os animais que não receberam tal administração, quando ambos os grupos (animais tratados e os animais que não recebem a composição) são desafiados ou expostos a uma infecção por ERAV e/ou ERBV. Mais preferivelmente, a incidência ou a gravidade é reduzida em pelo menos 20%, ainda mais preferivelmente pelo menos 30%, ainda mais preferivelmente pelo menos 40%, ainda mais preferivelmente pelo menos 50%, ainda mais preferivelmente pelo menos 60%, ainda mais preferivelmente pelo menos 70%, ainda mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, e mais preferivelmente pelo menos 100%, em que os animais que receberam a composição da presente invenção não apresentam sintomas clínicos, ou, alternativamente, apresentam sintomas clínicos de gravidade reduzida. Vantajosamente, a presente invenção também fornece proteção contra cepas heterólogas (em relação à cepa utilizada na composição) de agentes patogênicos.

[0066] A presente invenção adicionalmente proporciona um método de estimular os anticorpos neutralizantes do soro ou de hemaglutinação do soro em um agente patogênico selecionado a partir do grupo consistindo em ERAV, ERBV, WNV, WEE, VEE, EEE, EHV, EIV, e combinações dos mesmos, por administração de uma composição de acordo com a presente invenção aqui descrita. Em modalidades particulares, o ERAV é ERAV/ON/05, ou a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem uma 5'UTR compreendendo a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERAV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína que possui uma sequência de aminoácidos com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuja poliproteína contém as proteínas ERAV funcionais (isto é, ativa em infecção e replicação viral). Em algumas modalidades, a cepa de ERAV compreende uma sequência genômica que, quando transcrita de forma reversa, tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou que codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o ERBV é uma cepa tendo No. de Acesso ATCC: PTA- 11829. Em algumas modalidades, a cepa de ERBV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a sequência de nucleotídeos com mais do que 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de nucleotídeos da transcrição reversa do genoma da cepa de ERBV tendo No. de Acesso ATCC PTA-11829 e, quando não inativada ou atenuada, é ativa para infectar e replicar em células hospedeiras e/ou codifica proteínas ERBV funcionais, ou que codifica para uma poliproteína tendo uma sequência de aminoácido com mais de 95%, mais do que 96%, mais do que 97%, mais do que 98% ou mais do que 99% de identidade com a sequência de aminoácidos da poliproteína da cepa com o No. de Acesso ATCC PTA-11829, cuja poliproteína contém proteínas ERBV funcionais (isto é, ativa em infecção viral e replicação). De preferência, as composições da presente invenção estimulam anticorpos neutralizantes do soro para o ERAV e/ou ERBV com uma titulação de, pelo menos, 1:112, 1:120, 1:300, 1:500, 1:1000, ou 1:1024, ou maior.

[0067] A composição imunogênica da presente invenção proporciona uma duração prolongada da imunidade contra todas as cepas presentes na vacina. De preferência, a duração da imunidade contra ERAV e/ou ERBV é pelo menos 1 mês, mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 2 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 3 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 4-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 6-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 7-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração imunidade é de pelo menos 8-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 9-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 10-24 meses, e mais preferivelmente, a duração da imunidade pelo menos 12-24 meses.

[0068] A composição imunogênica da presente invenção também proporciona uma duração prolongada da imunidade contra todos os antígenos presentes na vacina. De preferência, a duração da imunidade contra Nilo Ocidental é pelo menos 1 mês, mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 2 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 3 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é pelo menos 4-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 6-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 7-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é a menos 8-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 9-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 10-24 meses, e mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 12 -24 meses.

[0069] De preferência, a duração da imunidade contra WNV é pelo menos 1 mês, mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 2 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 3 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 4-24 meses, a ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 6-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 7-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é pelo menos 8-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 9-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 10-24 meses, e mais preferivelmente, a duração da imunidade é a menos 12-24 meses.

[0070] De preferência, a duração da imunidade contra EHV é pelo menos 1 mês, mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 2 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 3 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 4-24 meses, a ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 6-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 7-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é pelo menos 8-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 9-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 10-24 meses, e mais preferivelmente, a duração da imunidade é a menos 12-24 meses.

[0071] De preferência, a duração da imunidade contra a Encefalomielite Equina Ocidental é pelo menos 1 mês, mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 2 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 3 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 4-24 meses, a ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 6-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 7-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 8-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 9-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 10-24 meses, e mais preferivelmente, a duração da imunidade é pelo menos 12-24 meses.

[0072] De preferência, a duração da imunidade contra a Encefalomielite Equina Oriental é pelo menos 1 mês, mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 2 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 3 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 4-24 meses, a ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 6-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 7-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 8-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 9-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 10-24 meses, e mais preferivelmente, a duração da imunidade é pelo menos 12-24 meses.

[0073] De preferência, a duração da imunidade contra a Encefalomielite Equina Venezuelana é pelo menos 1 mês, mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 2 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 3 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 4-24 meses, a ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 6-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 7-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 8-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 9-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 10-24 meses, e mais preferivelmente, a duração da imunidade é pelo menos 12-24 meses.

[0074] De preferência, a duração da imunidade contra o Toxoide Tetânico é de pelo menos 1 mês, mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 2 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 3 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 4-24 meses, a ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 6-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 7-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração imunidade é de pelo menos 8-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 9-24 meses, ainda mais preferivelmente, a duração da imunidade é de pelo menos 10-24 meses, e mais preferivelmente, a duração da imunidade pelo menos 12-24 meses.

[0075] De preferência, a duração da imunidade de pelo menos 12 meses também se refere a qualquer combinação de antígenos que formam a composição imunogênica da presente invenção.

[0076] Em uma modalidade que compreende um ERAV e/ou ERBV inativado (ou, alternativamente vivo atenuado) como aqui descrito, a composição imunogênica melhora projeção de ERAV e/ou ERBV infeccioso para prevenir a propagação do vírus a outros animais suscetíveis. Em algumas modalidades, as composições impedem a projeção do vírus.

[0077] Em uma modalidade contendo antígeno WNV e/ou EHV,como descrito acima, a composição imunogênica melhora projeção de EHV ou WNV infeccioso para prevenir a propagação do vírus a outros animais suscetíveis.

[0078] Em uma modalidade, as composições de acordo com a presente invenção descrita aqui ultrapassam a interferência da imunidade maternal adquirida passivamente e estimulam a imunidade ativa e uma redução na incidência ou severidade dos sinais clínicos de infecção de WNV nos animais vacinados contra EIV.

[0079] Em uma modalidade da presente invenção, uma composição imunogênica compreendendo ERAV e/ou ERBV, VEE, WEE, EEE, tétano, WNV, rinopneumonite equina e influenza equina, todos como aqui descritos, demonstram a eficácia contra ERAV, ERBV, VEE, WEE, EEE, tétano, WNV, influenza equina e rinopneumonite equina após a administração, de acordo com a presente invenção. De preferência, uma tal composição irá incluir ainda um adjuvante, de preferência HRA- 5, óleo mineral e/ou um carbômero, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em formas preferidas, a composição irá ser administrada em uma única dose de 1 ml. Em algumas modalidades a composição é administrada em duas doses ou, preferivelmente, três doses, com cada dose separada por 1, 2, 3, e 4 semanas.

[0080] Cada uma das composições imunogênicas aqui descritas que incluem ERAV, particularmente ERAV/ON/05 (No. de Acesso ATCC: PTA-11828) e outras cepas, como descrito supra, e/ou ERBV, em particular uma cepa de ERBV tendo no. de acesso ATCC PTA- 11829, ou outros como também descritos supra, podem ser administrados como descrito de tal forma que eles reduzem a incidência de, ou diminuem a gravidade dos sintomas clínicos associados com ERAV e/ou ERBV, tais como pirexia, aumentos de temperatura, sons pulmonares aumentados, linfadenopatia, secreção nasal, secreção ocular, faringite, edema das pernas, tosse, e no caso de ERAV, aumento da incidência de aborto em éguas grávidas. Em alguns aspectos, as composições diminuem a quantidade ou comprimento de secreção nasal ou ocular ou a duração de tempo em que tais sintomas são apresentados. Em alguns aspectos, os animais inoculados com as composições não apresentam sintomas clínicos de infecção de ERAV e/ou ERBV uma semana ou mais após a exposição ao ERAV e/ou ERBV. Em outros aspectos, os animais inoculados com as composições não apresentam sintomas clínicos de Infecção de ERAV e/ou ERBV quando expostos a ERAV e/ou ERBV. Os sintomas clínicos de ERAV e ERBV podem ser marcados, como de acordo com a Tabela 3 do Exemplo 2, Tabela 14 no Exemplo 4, ou na Tabela 17 no Exemplo 5.

[0081] Cada uma das composições imunogênicas aqui descritas que incluem antígeno WNV ou WNV inativado e podem ser administradas conforme descrito de tal forma que elas reduzem a incidência de, ou diminuem a gravidade dos sintomas clínicos associados à infecção pelo Vírus da Influenza Equina.

[0082] A presente invenção também proporciona um método para reduzir a incidência ou diminuir a gravidade dos sintomas clínicos associados com vírus da Herpes Equina compreendendo a etapa de administrar qualquer um dos compostos imunogênicos descritos acima contendo o antígeno de EHV ou EHV inativado ou atenuado em uma animal.

[0083] A presente invenção também proporciona um método para a redução da incidência dos sintomas clínicos associados a vírus do Nilo Ocidental, compreendendo a etapa de administrar qualquer uma das composições imunogênicas que inclui o antígeno WNV ou WNV inativado ou atenuado, tal como aqui descrito, a um animal.

[0084] A presente invenção também proporciona um método para a redução da incidência dos sintomas clínicos associados com vírus da influenza equina compreendendo a etapa de administrar qualquer uma das composições imunogênicas acima descritas, que inclui um antígeno WNV ou EIV inativado ou atenuado, a um animal.

[0085] A presente invenção adicionalmente proporciona um método para reduzir a incidência dos sintomas clínicos associados com vírus da Herpes Equina compreendendo a etapa de administrar qualquer uma das composições imunogênicas acima descritas, que inclui um antígeno de EHV ou EHV inativado ou atenuado, a um animal.

[0086] A presente invenção proporciona um método de redução da incidência de infecção viral em um rebanho que compreende a etapa de administrar qualquer uma das composições imunogênicas acima descritas a um animal, em que a redução da incidência da infecção, em comparação com os rebanhos que não recebem a composição imunogênica, é de cerca de 10% de redução a cerca de 50%. Em uma modalidade, as composições aqui proporcionadas reduzem a infecção de ERAV em 10% a 50%. Em outras modalidades, as composições aqui proporcionadas reduzem a infecção de ERBV em 10% a 50%.

[0087] A presente invenção também proporciona um método de redução da incidência dos sintomas clínicos associados com vírus da influenza equina compreendendo a etapa de administrar qualquer uma das composições imunogênicas acima descritas a um animal, em que a redução nos sinais clínicos em comparação com os animais que não recebem a composição imunogênica, é pelo menos uma redução de 10% nos sinais clínicos.

[0088] A presente invenção proporciona um método para reduzir a incidência e gravidade dos sintomas clínicos de ERAV ou ERBV em um rebanho, em que os sintomas clínicos são selecionados a partir do grupo consistindo em pirexia, aumentos de temperatura, sons pulmonares aumentados, linfadenopatia, secreção nasal, secreção ocular, faringite, tosse, edema de pernas, e no caso de ERAV, aumento da incidência de aborto em éguas grávidas.

[0089] A presente invenção proporciona um método para reduzir a incidência e gravidade dos sintomas clínicos de EHV em uma rebanho, em que os sintomas clínicos são selecionados a partir do grupo consistindo em doença respiratória, aborto, complicações reprodutivas, doenças neurológicas, doença do sistema nervoso central, e combinações dos mesmos.

[0090] A presente invenção proporciona um método para reduzir a incidência ou diminuir a gravidade dos sintomas clínicos associados com vírus da Herpes Equina compreendendo a etapa de administrar qualquer uma das composições imunogênicas aqui descritas, que incluem um antígeno de EHV ou EHV inativado ou atenuado, a um animal.

[0091] A presente invenção proporciona um método para reduzir a incidência ou diminuir a gravidade dos sintomas clínicos associados com vírus da influenza equina em um rebanho, compreendendo a etapa de administrar qualquer uma das composições imunogênicas aqui descritas, que inclui um antígeno EIV ou EIV inativado ou atenuado, a um animal.

[0092] A presente invenção proporciona um método para reduzir a incidência ou diminuir a gravidade dos sintomas clínicos associados a vírus do Nilo Ocidental, em um rebanho, compreendendo a etapa de administrar qualquer uma das composições imunogênicas aqui descritas, que inclui um antígeno WNV ou WNV inativado ou atenuado, a um animal.

[0093] A presente invenção proporciona um método para reduzir a incidência ou diminuir a gravidade dos sintomas clínicos associados com Encefalomielite Equina Oriental, em um rebanho, compreendendo a etapa de administrar qualquer uma das composições imunogênicas aqui descritas, que inclui um antígeno do vírus de EEE ou vírus de EEE inativado ou atenuado, a um animal.

[0094] A presente invenção adicionalmente proporciona um método para reduzir a incidência ou diminuir a gravidade dos sintomas clínicos associados com Encefalomielite Equina Ocidental em um rebanho, compreendendo a etapa de administrar qualquer uma das composições imunogênicas aqui descritas, que inclui um antígeno do vírus WEE ou o vírus WEE inativado ou atenuado, a um animal.

[0095] A presente invenção adicionalmente proporciona um método para reduzir a incidência ou diminuir a gravidade dos sintomas clínicos associados com Encefalomielite Equina Venezuelana em um rebanho, compreendendo a etapa de administrar qualquer uma das composições imunogênicas aqui descrito, que inclui um antígeno do vírus VEE ou um vírus de VEE inativado atenuado, a um animal.

[0096] As modalidades acima mencionadas podem ser utilizadas em uma terapia de combinação ou como parte de um programa de imunização em combinação com outros agentes imunogênicos e vacinas. Em uma modalidade, as composições aqui proporcionadas são utilizadas em combinação com os agentes imunogênicos e vacinas descritos no documento WO 2010/025469, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[0097] A presente invenção também proporciona um método de fabricação de qualquer uma das composições imunogênicas tal como descrito acima e aqui, que compreende as etapas de combinar um ERAV ou ERBV inativado ou vivo, atenuado com um veículo farmacêutico adequado. Em formas preferidas, este método adicionalmente compreende a etapa de adição de um ou mais antígenos de equino ou vírus inativados ou atenuados. Um grupo preferido de vírus e antígenos equinos é selecionado dentre o grupo consistindo em vírus do Nilo Ocidental, Encefalomielite Equina Ocidental, Encefalomielite Equina Oriental, Encefalomielite Equina Venezuelana, EHV, e EIV, e Toxoide Tetânico, e combinações dos mesmos. Em algumas formas preferidas, os métodos aqui descritos podem adicionalmente incluir uma etapa de filtração, em que o produto final esteja em uma forma mais pura.

[0098] "Cerca de" refere-se a +10% da quantidade especificada.

[0099] "Animais" como aqui utilizado incluem animais domésticos,incluindo cães e animais de cascos, incluindo os equídeos e, especificamente, cavalos. Em algumas modalidades, o termo refere-se também a um ser humano.

[00100] "Adjuvantes", tal como aqui utilizado, pode incluir hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, saponinas, por exemplo, Quil A, QS- 21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), óleos não metabolizados, óleos minerais e/ou planta/vegetal e/ou animal, polímeros, carbômeros, surfactantes, compostos orgânicos naturais, extratos de plantas, hidratos de carbono, lipídeos, colesterol, emulsão de óleo-em-água, emulsão de água em óleo, emulsão de água-em-óleo-em-água, HRA-3 (polímero reticulado de cacarídeo de ácido acrílico), HRA-3 com óleo de semente de algodão (CSO), ou, preferivelmente, HRA-5 (polímero reticulado de poliol de ácido acrílico). A emulsão pode ser baseada, em particular, em óleo de parafina líquida leve (tipo Farmacopeia europeia); óleo isoprenoide tais como esqualano ou esqualeno, óleo resultante da oligomerizão de alcenos, em particular de isobuteno ou de deceno; ésteres de ácidos ou de álcoois lineares contendo um grupo alquila, e mais particularmente os óleos vegetais, oleato de etila, di (caprilato/caprato) de propileno-glicol, tri (caprilato/caprato) de glicerila ou dioleato de propileno glicol, ésteres de ácidos graxos ramificados ou álcoois, em particular ésteres de ácido isoesteárico. O óleo é usado em combinação com emulsionantes para formar a emulsão. Os emulsionantes são de preferência surfactantes não iônicos, em particular os ésteres de sorbitano, de manida (por exemplo, oleato de anidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenoglicol e de ácido oleico, isoesteárico, hidroxiesteárico ou ricinoleico, que são opcionalmente etoxilados, e blocos de copolímeros de polioxipropileno- polioxietileno, em particular os produtos plurônicos, especialmente L121. Vide Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.) John Wiley and Sons, NY, pp51- 94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997). Em uma modalidade preferida, o adjuvante está em uma concentração de cerca de 0,01 a cerca de 50%, de preferência a uma concentração de cerca de 2% a 30%, mais preferivelmente a uma concentração de cerca de 5% a cerca de 25%, ainda mais preferivelmente a uma concentração de cerca de 7% a cerca de 22%, e mais preferivelmente a uma concentração de cerca de 10% a cerca de 20% em volume do produto final.

[00101] Tal como aqui utilizado, "um veículo farmaceuticamente aceitável" ou "veículo farmacêutico" inclui qualquer e todos os solventes, excipientes, meios de crescimento, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes de inativação, antimicrobianos, agentes antifúngicos e antibacterianos, agentes isotônicos, agentes de retardamento da adsorção e afins. Tais ingredientes incluem aqueles que são seguros e adequados para utilização em aplicações veterinárias. Em algumas modalidades preferidas, e especialmente aquelas que incluem composições imunogênicas liofilizadas, agentes de estabilização para utilização na presente invenção incluem estabilizadores de liofilização ou secagem por congelamento.

[00102] "Diluentes" podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol, e semelhantes. Agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose, entre outros. Estabilizadores incluem albumina sais alcalino de ácido etilendiamintetracético, entre outros.

[00103] Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica da presente invenção é preparada compreendendo um conservante e um estabilizador, e, mais preferivelmente, a composição imunogênica da presente invenção é preparada compreendendo anfotericina, formaldeído, gentamicina, EDTA, glicerol e combinações dos mesmos.

[00104] Uma "composição imunogênica ou imunológica" refere-se a uma composição de matéria que compreende pelo menos um antígeno, que provoca uma resposta imunológica no hospedeiro de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpos à composição ou vacina de interesse. Geralmente, uma "resposta imunológica" inclui, mas não está limitada a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção ou ativação de anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas e/ou células gama- delta T, direcionadas especificamente a um antígeno ou antígenos incluído na composição ou vacina de interesse. De preferência, o hospedeiro irá exibir uma resposta imune terapêutica ou protetora de tal modo que a resistência à infecção nova será aumentada e/ou a gravidade clínica da doença reduzida. Essa proteção pode ser demonstrada por qualquer uma redução ou falta de sinais clínicos normalmente exibidos por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e/ou uma duração reduzida ou titulação bacteriana nos tecidos ou fluidos corporais ou excreções do hospedeiro infectado.

[00105] O termo "com necessidade de tal administração" ou "em necessidade de tal tratamento de administração", tal como aqui utilizado, significa que a administração/tratamento está associado com o reforço ou melhoria na saúde ou qualquer outro efeito medicamentoso positivo na saúde dos animais que recebem a composição imunogênica, de acordo com a presente invenção, tal como a redução da incidência ou gravidade da infecção ou doença viral.

[00106] "Vírus da Rinite Equina A (ERAV)" refere-se a um Aftovírus na família Picornaviridae, e era conhecido anteriormente como rinovírus Equino 1. "ERAV", tal como aqui utilizado, inclui formas inativadas. Em uma modalidade, o ERAV é a cepa de ERAV/ON/05 tendo número de acesso PTA-11829 depositado em 14 de abril de 2011, com o ATCC (American Type Culture Collection, PO Box 1549 Manassas, VA 20108 EUA), de acordo com o Tratado de Budapeste, e que foi recuperado cultura celular de rim de coelho 13 (RK-13) a partir de uma secreção nasal de um cavalo, em Ontário, Canadá, em 2005. O ERAV/ON/05 quando transcrito reversamente e sequenciado tem SEQ ID NO: 1 na sua região 5' UTR.

[00107] A sequência genômica transcrita reversa de ERAV/ON/05 é SEQ ID NO: 2.

[00108] A poliproteína codificada pela sequência genômica de ERAV/ON/05 é SEQ ID NO: 3.

[00109] As cepas ERAV úteis nas composições imunogênicas da invenção têm sequências de nucleotídeo 5'UTR transcritas reversas que têm mais de 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, as cepas ERAV têm sequências genômicas que, quando transcritas de forma reversa em DNA são mais do que 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ ID NO: 2 ou têm sequências de codificação de poliproteína que são mais de 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à sequência de codificação de poliproteína em SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o ERAV têm poliproteínas com uma sequência de aminoácidos mais de 95%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ ID NO: 3 ou a sequência VP1 dentro de SEQ ID NO: 3. Ainda em outras modalidades, o ERAV tem uma proteína L, VP2, VP3, VP4, VP0, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C ou 3D, que têm uma sequência de aminoácidos com mais de 80%, mais do que 90%, mais do que 99%, ou 100% de identidade com a mesma proteína encontrada na SEQ ID NO: 3. Todas as cepas de ERAV são, quando não inativadas ou atenuadas, infecciosas, e capaz de se replicar em células hospedeiras.

[00110] "Vírus da Rinite Equina B (ERBV)" refere-se a um Erbovirus na família Picornaviridae, e era conhecido anteriormente como rinovírus Equino 2. "ERBV", tal como aqui utilizado, inclui formas inativadas. Em uma modalidade, o ERBV é uma cepa depositada com ATCC que foi recuperada de cultura celular de rim de coelho 13 (RK-13), a partir de uma secreção nasal de um cavalo, em Ontário, Canadá (No. de Acesso ATCC PTA-11828) que foi depositada com ATCC (American Type Culture Collection, P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108 EUA) em 14 de abril de 2011 sob o Tratado de Budapeste. As cepas de ERBV úteis nas composições imunogênicas da invenção têm sequências genômicas que, quando transcritas de forma reversa em DNA são mais de 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idênticas à transcrição reversa da sequência genômica da cepa de ERBV tendo No. de Acesso ATCC PTA-11829, ou têm sequências de codificação de poliproteína que são mais do que 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à sequência de codificação da poliproteína da cepa de ERBV tendo No. de Acesso ATCC PTA- 11829. Em algumas modalidades, as cepas de ERBV úteis na invenção têm poliproteínas, com uma sequência de aminoácidos de mais do que 95%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à sequência da poliproteína da cepa de ERBV tendo no. de acesso ATCCPTA- 11829. Ainda em outras modalidades, o ERBV tem uma proteína L, VP4, VP2, VP3, VP1, 2A, 2B, 2C, 3A (Vpg), 3B, 3Cpro, 3Dpol que têm uma sequência de aminoácidos com mais de 80%, mais do que 90%, mais do que 99%, ou 100% de identidade com a mesma proteína encontrada na cepa de ERBV tendo No. de Acesso ATCC PTA-11829. Todas as cepas de ERBV são, quando não inativada ou atenuada, infecciosa, e capazes de se replicar em células hospedeiras.

[00111] O termo antígenos de "vírus do Nilo Ocidental", significa, mas não fica limitado aos componentes do vírion WNV que são imunogênicos quando presentes em um animal, e mais particularmente, componentes proteicos, tais como proteínas de envelope e não estruturais, do WNV que provocam respostas imunes humorais ou celulares, quando presentes em um animal. Tais antígenos podem incluir DNA, subunidades de proteína, vírus vivo modificado e vírus inativado. Em formas preferidas da invenção, o antígeno ou antígenos de WNV compreendem cepas de WNV inativadas ou mortas, e ainda mais preferivelmente, Norte Americanas dominantes.

[00112] O termo "(Cepas) do Vírus do Nilo Ocidental Norte Americana" refere-se, mas não está limitada a qualquer cepa de vírus do Nilo Ocidental, que já foi descoberto no continente norte-americano. Preferivelmente, uma cepa de vírus do Nilo ocidental norte-americano tem uma identidade de sequência com a cepa NY99 (acesso GenBank no. AF196835 ou NCBI sequência de referência NC_00942.1 de pelo menos 97%, ainda mais preferivelmente pelo menos 98%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 98,5%, mais preferivelmente pelo menos 99%, ainda mais preferivelmente pelo menos 99,2%, e, ainda mais preferivelmente de pelo menos 99,4%. WN02 é um exemplo representativo de uma cepa de WNV que pode ser referida como uma cepa do Vírus do Nilo Ocidental Norte-americano Dominante. Especificamente, as cepas norte-americanas dominantes são aquelas que possuem pelo menos uma alteração de nucleotídeos resultando em uma alteração de aminoácido a partir de isolados WN99. Cepa NY99 (acesso GenBank no. AF196835), que serve como uma cepa de referência para determinar se uma cepa é Norte Americana Dominante. Além disso, estas cepas podem ter uma ou mais mudanças de aminoácidos silenciosas. Em algumas modalidades, a alteração de nucleotídeos resulta em uma mudança de aminoácidos em uma proteína envelope da cepa e, mais preferivelmente, a alteração de nucleotídeos resulta em uma alteração de aminoácidos de valina para alanina. Preferivelmente, esta alteração de aminoácido está associada com uma maior capacidade de se replicar no hospedeiro intermediário, a saber, o mosquito. Mais preferivelmente, as cepas norte-americanas dominantes incluem ou (e de preferência ambos) uma mutação U para C e uma mutação de C para U nas posições 1442 e 2466 (em comparação com uma cepa da América do Norte, por exemplo, NY, 99), respectivamente. Ainda mais preferivelmente, as cepas norte- americanas dominantes incluem ainda uma mutação na sequência de nucleotídeos que codifica a proteína E e a mutação C para U na posição 9352 na sequência que codifica a proteína NS5 (novamente em comparação com uma cepa da América do Norte, por exemplo, 99 NY). Estas mutações preferidas são mostradas Análises Filogenéticas de Isolados do Vírus Ocidental Norte-Americano, 2001-2004: Evidence For the Emergence of a Dominant Genotype, C. Todd Davis, et. al, Virology 342, p. 252-265 (2005), o ensino e o conteúdo do qual estão aqui incorporados por referência. Cepas do vírus do Nilo Ocidental, mas abrangem, embora não se limitem a estas cepas de vírus do Nilo Ocidental de origem pássaro, origem de burro, origem suína, origem humana, origem animal mamífero e origem equina.

[00113] "Identidade de sequência", como é conhecida na técnica refere-se a uma relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas ou duas ou mais sequências polinucleotídicas, isto é, uma sequência de referência e uma dada sequência a ser comparada com a sequência de referência. A identidade de sequência é determinada por comparação da dada sequência com a sequência de referência, após as sequências serem alinhadas idealmente para produzir o maior grau de semelhança de sequências, tal como determinado pela combinação entre sequência de tais sequências. Mediante tal alinhamento, identidade de sequência é determinada em uma base de posição por posição, por exemplo, as sequências são "idênticas" em uma determinada posição, se nessa posição, os nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos são idênticos. O número total de tais identidades de posição é então dividido pelo número total de nucleotídeos ou resíduos na sequência de referência, para dar a% de identidade de sequência. A identidade de sequência pode ser prontamente calculada por métodos conhecidos, incluindo, mas não limitado a, os descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), cujos ensinamentos são aqui incorporados por referência. Os métodos preferidos para determinar a identidade de sequência são projetados para dar a maior combinação entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade de sequência são codificados em programas de computador de acesso público, que determinam a identidade de sequência entre as dadas sequências. Exemplos de tais programas incluem, mas não estão limitados a, o pacote de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). O programa BLASTX está disponível ao público a partir de NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), cujos ensinamentos são aqui incorporados por referência). Estes programas alinham idealmente sequências utilizando ponderações de intervalo padrão, a fim de produzir o maior nível de identidade de sequência entre a dada sequência e as sequências de referência. Como uma ilustração, por um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos, por exemplo, 85%, preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 95% de "identidade de sequência" com uma sequência de nucleotídeos de referência, pretende-se que a sequência de nucleotídeos do dado polinucleotídeo seja idêntica à sequência de referência exceto que a dada sequência de polinucleotídeo pode incluir até 15, preferivelmente até 10, ainda mais preferivelmente até 5 pontos de mutação por cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de referência. Em outras palavras, em um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85%, preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 95% de identidade em relação à sequência de nucleotídeos de referência, até 15%, preferivelmente 10%, ainda mais preferivelmente 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser suprimidos ou substituídos por outros nucleotídeos, ou um número de nucleotídeos até 15%, preferivelmente 10%, ainda mais preferivelmente de 5% dos nucleotídeos totais na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições 5' ou posições 3' da sequência de nucleotídeos de referência ou em qualquer lugar entre os terminais dessas posições terminais, intercaladas quer individualmente entre os nucleotídeos na sequência de referência quer em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. Analogamente, por um polipeptídeo tendo uma determinada sequência de aminoácidos tendo pelo menos, por exemplo, 85%, preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 95% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos de referência, pretende-se que uma dada sequência de aminoácidos do polipeptídeo seja idêntica à sequência de referência exceto que a dada sequência de polipeptídeo pode incluir até 15, preferivelmente até 10, ainda mais preferivelmente até 5 mudanças de aminoácidos por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de referência. Em outras palavras, para se obter uma dada sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 95% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos de referência, até 15%, preferivelmente até 10%, mesmo mais preferivelmente até 5% dos resíduos de aminoácidos na sequência de referência podem ser suprimidos ou substituídos por outro aminoácido, ou um número de aminoácidos até 15%, preferivelmente até 10%, mesmo mais preferivelmente até 5% do número total de resíduos de aminoácidos na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas mudanças da sequência de referência podem ocorrer nas posições amino ou carbóxi terminais da sequência de aminoácidos de referência ou em qualquer lugar entre aquelas posições terminais, intercaladas quer individualmente entre os resíduos na sequência de referência quer em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. Preferivelmente, as posições de resíduos que não são idênticas diferem por substituições de aminoácidos conservativos. No entanto, as substituições conservadoras não estão incluídas como uma combinação ao determinar a identidade de sequência. Na presente descrição, deve ser entendido que SEQ ID NO: 1 (UTR 5') e SEQ ID NO: 2 são as sequências de DNA que resultam da transcrição reversa de UTR 5' e a totalidade do genoma de ERAV/ON/05, respectivamente. Da mesma forma, SEQ ID: 3 refere-se à sequência de aminoácidos correspondente à poliproteína codificada pela sequência genômica de ERAV/ON/05. A percentagem de identidade de uma determinada cepa de ERAV em comparação com a SEQ ID NO:. 1 ou SEQ ID NO: 2, assim, significa assim referir-se à sequência de DNA correspondente, resultante da transcrição reversa e sequenciamento.

[00114] "TCID50" refere-se a dose infecciosa de cultura de tecido que infecta 50% de células em uma cultura inoculada com o vírus.

[00115] Para os fins da presente invenção, o termo "cepa" e "isolado" têm o mesmo significado e são utilizados de forma intercambiável.

[00116] "Sinais clínicos" ou "sintomas clínicos" para ERAV e ERBV incluem, mas não estão limitados a pirexia, elevação da temperatura, aumento dos sons pulmonares, linfadenopatia, secreção nasal, secreção ocular e tosse e faringite. Ainda outros sinais ou sintomas incluem anemia, anorexia, linfadenite da cabeça e do pescoço, edema das patas, letargia, e dor. Além disso, os sinais clínicos de Infecções de ERAV e/ou ERBV podem incluir aquelas associadas com o vírus da herpes equina e vírus da Influenza Equina. Em uma modalidade os sinais clínicos para ERAV incluem tosse, faringite, febre, elevações de temperatura, aumento do tamanho dos linfonodos submandibulares, secreção nasal, secreção ocular. Em certas modalidades, os sinais clínicos de ERAV incluem um aumento da incidência de aborto em éguas grávidas. Em uma outra modalidade, os sinais clínicos a serem tratados por uma composição imunológica aqui descrita são infecções respiratórias, tais como aquelas causadas por um ou mais de ERAV, ERBV, EIV, EHV-1 e EHV-4.

[00117] "Sinais clínicos" ou "sintomas clínicos" do Vírus do Nilo Ocidental, para fins desta invenção, incluem, mas não estão limitados a, sintomas ou lesões associadas com encefalite, viremia, anorexia, depressão, febre, fraqueza, andar anormal, paralisia de membros posteriores, visão prejudicada, ataxia, andar sem rumo, convulsões, incapacidade de engolir, coma, fraqueza posterior, paralisia, falta de coordenação, depressão e comportamento relacionado, tremores, convulsões, coordenação dos membros, problemas neurológicos, inchaço do sistema nervoso central, morte, e combinações dos mesmos. Os sinais clínicos apresentados por um animal infectado variam dependendo da gravidade da infecção.

[00118] "Sinais Clínicos" ou "sintomas clínicos" do vírus da Herpes Equina, para efeitos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, aborto, deficiências neurológicas, doenças respiratórias, deficiências e falhas do sistema reprodutivo, e sintomas relacionados com o sistema nervoso central. Além disso, os sintomas clínicos de EHV1 incluem, mas não estão limitados a, fenômeno de potros infectados com EHV1, exibindo complicações respiratórias, transmissão do vírus a membros mais velhos do rebanho, que, em seguida, exibem deficiências reprodutivas, incluindo aborto, e deficiências neurológicas, normalmente exibidas no sistema nervoso central.

[00119] "Sinais Clínicos" ou "sintomas clínicos" da Encefalomielite Equina Oriental, Encefalomielite Equina Ocidental, Encefalomielite Equina Venezuelana e, para os fins da presente invenção são os sintomas normalmente conhecidos como sendo associados com encefalomielite, incluindo, mas não se limitando a febre, sinais nervosos como a sensibilidade ao som, períodos de excitação e agitação, lesões cerebrais, sonolência, orelhas caídas, circulação, marcha anormal, paralisia, perda de apetite, depressão, pressão da cabeça, falta de coordenação, deficiência a longo prazo, dano cerebral, morte, e combinações dos mesmos. "Segurança", tal como aqui utilizado, refere- se à ausência de efeitos adversos no animal vacinado após a vacinação, incluindo, mas não limitado a, potencial de reversão para virulência do vírus da vacina e efeitos colaterais clinicamente significativos, tais como a doença sistêmica persistente ou inflamação inaceitável no local de administração da vacina.

[00120] "Redução da incidência e/ou severidade dos sinais clínicos" ou "redução da incidência e/ou severidade dos sintomas clínicos", tal como aqui referido, significa reduzir o número de animais infectados no grupo, reduzindo ou eliminando o número de animais que exibem sinais clínicos de infecção, ou reduzindo a gravidade de quaisquer sinais clínicos que se encontram presentes nos animais, em comparação com a infecção do tipo selvagem. Por exemplo, tais sinais clínicos incluíam viremia, febre, resposta imune, secreção ocular, secreção nasal, e histopatologia. De preferência, estes são reduzidos em animais que receberam a composição da presente invenção em pelo menos 10% em comparação com os animais que não receberam a vacina que podem ser infectados. Mais preferivelmente, os sinais clínicos são reduzidos nos animais que receberam a composição da presente invenção em pelo menos 20%, mais preferivelmente em pelo menos 30%, ainda mais preferivelmente em pelo menos 40% e ainda mais preferivelmente em pelo menos 50%.

[00121] "Duração da imunidade", como aqui utilizado, refere-se ao número mínimo de dias, durante o qual o animal produz uma resposta imunogênica de tal modo que o animal será relativamente imune a um vírus e/ou benefício da redução da incidência e/ou a severidade dos sinais clínicos, como aqui descrito.

[00122] O termo "inativado" e "vírus inativado" refere-se a um vírus virulento que previamente tenha sido aquecido ou tratado quimicamente para inativar, matar, ou de outro modo modificar o vírus para eliminar substancialmente as propriedades virulentas do mesmo, mantendo a sua imunogenicidade. Em uma modalidade preferida, o vírus inativado aqui descrito é inativado por tratamento com um agente de inativação. Agentes de inativação adequados incluem beta-propiolactona, etilenoimina binária, glutaraldenida e formaldeído. Em algumas modalidades, o agente de inativação é formaldeído.

[00123] Os termos "vacina" e "composição imunogênica", quando aqui utilizados, são feitos para serem usados alternadamente.

[00124] Qualquer cepa de vírus do Nilo Ocidental (s) ou isolado (s) pode ser utilizada de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade preferida, o isolado é selecionado entre um ou mais dos seguintes: Nova Iorque (Nordeste da América do Norte) Isolado (WN- NY 99), Origem de cavalo, 1999, Nova Iorque (Nordeste da América do Norte) Isolado (WN-NY 99), Origem de cabra, 1999, Departamento dos Estados Unidos de Isolado Agrícola 292206 (USDA 2004), Origem de macaco, Departamento dos Estados Unidos de Isolado Agrícola 405330 (USDA 2005), Origem de cavalo, Isolado norte-americano (WN-Texas- 2002/2003), Isolado da Costa Sudoeste do Texas 2002, México (Tabasco) Isolado 2003, e combinações dos mesmos, e em modalidades mais preferidas o isolado é selecionado a partir de uma ou mais dos seguintes: Departamento dos Estados Unidos de Isolado Agrícola 292206 (USDA 2004), Origem de macaco, Departamento dos Estados Unidos de Isolado Agrícola 405330 (USDA 2005), Origem de cavalo, Isolado Norte-americano (WN-Texas-2002/2003), Isolado da Costa Sudeste do Texas 2002, México (Tabasco) Isolado 2003, e combinações dos mesmos. Em uma modalidade mais preferida, o isolado é Departamento dos Estados Unidos de Isolado Agrícola 405330 (USDA 2005), Origem de macaco singularmente ou em combinação com um ou mais isolados como listados acima. Em uma modalidade adicionalmente preferida, os isolados que fazem parte dos isolados do vírus do Nilo do Ocidental Norte Americano estão incluídos. Em outra modalidade preferida os isolados do vírus do Nilo Ocidental Norte Americanos Dominantes estão incluídos. Além dos listados acima, isolados específicos incluem, mas não estão limitados a, WN02 e isolados que possuem pelo menos 1, de preferência pelo menos 2, e ainda mais preferivelmente pelo menos 3 mudanças de nucleotídeos que resultam em, pelo menos, uma alteração de aminoácido a partir dos isolados NY99 de WN e, mais preferidos são as cepas com a mudança de aminoácido de valina para alanina na posição 159 da proteína envelope. Cepas norte-americanas dominantes mais preferidas incluem, mas não estão limitadas a: NY2002Nassau, NY2002Clinton, NY2002Queens, GA20021, GA20022, TX20021, TX20022, in2002,NY2003Albany, NY2003Suffolk, NY2003Chatauqua, CO20031, CO20032, TX2003, TX2003Harris4, TX2003Harris6, TX2003Harris7, TX2003Harris10, AZ2004, e TX2004Harris4, e combinações dos mesmos. As cepas do vírus do Nilo Ocidental úteis na vacina ou composição imunogênica da presente invenção podem ser qualquer cepa ou isolado. Em uma modalidade preferida, a cepa do vírus do Nilo Ocidental dominante Norte americana utilizada é ou E-159 (Origem de cavalo) ou E-159 (Origem de asno). Uma cepa representativa de tal uma cepa de WNV Dominante norte-americana inclui a cepa de origem de cavalo 2005 depositada com o ATCC (No. de Acesso ATCC PTA-9409), localizado em 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, em 14 de agosto de 2008, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste. Cepas de influenza equina úteis na vacina ou composição imunogênica da presente invenção podem ser qualquer cepa ou isolado. Cepas representativas incluem Equi-2/Ohio/03, depositado como No. de Acesso ATCC PTA-9522, Equi-2/Kentucky/95, depositado como No. de Acesso ATCC PTA-9523, e Equi-2/New Market/2/93, depositado como No. de Acesso ATCC PTA-9524. Cepas representativas Nos. de Acesso ATCC PTA-9522, PTA-9523, e PTA- 9524 foram cada uma depositadas com ATCC em 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209 em 23 de setembro de 2008, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste.

[00125] Cepas Vírus da Herpes Equina ("EHV") úteis na vacina ou composição imunogênica da presente invenção podem ser qualquer cepa ou isolado. Cepas de Encefalomielite Equina do Oeste úteis na vacina ou composição imunogênica da presente invenção podem ser qualquer cepa ou isolado. A cepa representativa inclui a Cepa Fleming, depositada com a ATCC (No. de Acesso ATCC PTA-9410), localizada em 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, em 14 de agosto de 2008, nos termos do Tratado de Budapeste.

[00126] Cepas de Encefalite Equina Venezuelana úteis na vacina ou composição imunogênica da presente invenção podem ser qualquer cepa ou isolado. A cepa representativa inclui a cepa TC-83, depositada com o ATCC (No. de Acesso ATCC PTA-9411), localizada em 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, em 14 de agosto de 2008, sob as disposições de Budapeste Tratado.

[00127] Cepas de Encefalomielite Equina do Oriente úteis na vacina ou composição imunogênica da presente invenção podem ser qualquer cepa ou isolado. A cepa representativa inclui a cepa NJO, depositada com o ATCC (No. de Acesso ATCC PTA-9412), localizada em 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, em 14 de agosto de 2008, nos termos do Tratado de Budapeste.

[00128] Cepas de Tétano Toxoide úteis na vacina ou composição imunogênica da presente invenção podem ser qualquer cepa ou isolado. A cepa representativa é aquela tomada a partir de uma semente mestre de Clostridium tetani do Departamento de Massachusetts do Instituto de Saúde Pública de Laboratórios em Boston, Massachusetts.

[00129] A composição imunogênica ou vacina tal como aqui descrito é segura para administração em espécies sensíveis a ERAV ou ERBV, particularmente equídeos, em qualquer idade. Em uma modalidade preferida, a presente invenção é segura para administração a potros de 12 meses de idade ou mais, mais preferivelmente, é segura para administração a potros de 10 meses de idade ou mais, mais preferivelmente, é segura para administração a 8 meses potros ou mais, mais preferivelmente, é segura para administração a potros de 6 meses de idade ou mais, mais preferivelmente, é segura para administração a potros de 4 meses de idade ou mais, mais preferivelmente, é segura para administração a potros de 2 meses de idade ou mais, mais preferivelmente, é segura para administração a potros 1 mês de idade ou mais, ainda mais preferivelmente, é segura para administração a potros entre 1 dia e 1 mês de idade, e, mais preferivelmente, é seguro para administração a potros um dia de idade ou mais.

[00130] As composições, tal como aqui descritas podem ser administradas em qualquer forma convencional. Exemplos de métodos de administração incluem qualquer um que fornecer acesso por células do sistema imune à composição imunogênica incluindo oral, transdérmica/intradérmica, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraocular, intraperitoneal, intrarretal, intravaginal, intranasal, por via gástrica, intratraqueal, intrapulmonarial, ou qualquer combinação. Em uma modalidade preferida, a vacina é administrada por via parentérica, de preferência por via intranasal, subcutânea, ou intramuscular, e na modalidade mais preferida, a vacina é administrada por via intramuscular.

[00131] Em uma modalidade, é fornecido um método para a preparação e composição imunogênica compreendendo um ERAV e/ou ERAB, tal como aqui descrito. Em uma modalidade, o método compreende: a) infectar uma linhagem celular suscetível com ERAV ou ERBV; b) crescer a linhagem celular infectada em meio de crescimento, até que um efeito citopático (ECP) seja atingido; c) colher o meio; d) filtrar o meio para produzir um meio filtrado e e) colocar em contato o meio filtrado com um agente de inativação para obter o ERAV ou ERBV inativado.

[00132] Em uma modalidade, o método compreende fornecer cepa de ERAV/ON/05 ou uma cepa de ERBV tendo no. de acesso ATCC PTA-11829. Estas cepas são utilizadas para infectar uma linhagem celular suscetível tendo crescimento vantajoso e propriedades de secreção úteis para a preparação da vacina. Uma linhagem celular preferida suscetível é uma linhagem celular Vero, tal como uma linhagem celular Vero76 ou E-Vero .

[00133] Meios de crescimento adequados incluem E199. Este meio pode ser suplementado com uma solução de L-glutamina e um antibiótico tal como a solução de sulfato de gentamicina. Em algumas modalidades o meio de crescimento E199 é suplementado com uma solução de L-glutamina (até 2 mM), e uma solução de sulfato de gentamicina (até 30 μg/ml). Em algumas modalidades, os fluídos virais são colhidos quando o efeito citopático CPE atinge 75% ou mais. Os meios colhidos foram reunidos e filtrados, tais como através de cartuchos de filtro de polipropileno classificado como 5,0 mícron de tamanho de poro. As cepas são inativadas quimicamente tal como por tratamento com uma solução de formaldeído de 0,1-0,2% ao longo de um período de tempo adequado, por exemplo, 48 horas a 72 horas e os fluidos resultantes são concentrados. Em algumas modalidades, os conservantes e os adjuvantes são em seguida adicionados. Conservantes adequados incluem um ou mais de Anfotericina B, sulfato de gentamicina, e formaldeído. Em outras modalidades, o adjuvante é HRA-5. Em ainda outras modalidades, o adjuvante é HRA-3 com óleo de semente de algodão (CSO).

[00134] Em uma modalidade e de acordo com os métodos aqui descritos, é fornecida uma composição imunogênica compreendendo ERAV/ON/05 e/ou uma cepa de ERBV tendo no. de acesso ATCC PTA- 11829 e Anfotericina B, sulfato de gentamicina, formaldeído, e HRA-5 preparado de acordo com os métodos aqui descritos.

Exemplos

[00135] Os exemplos a seguir são apresentados para ilustrar modalidades específicas da presente invenção. Estes exemplos são meramente ilustrativos e não pretendem limitar o âmbito ou os princípios subjacentes da presente invenção.

Exemplo 1

[00136] Este exemplo ilustra uma modalidade de uma composição do vírus da rinite equina A de acordo com a presente invenção.

Materiais e Métodos

[00137] Cepa do vírus da Rinite Equina A ERAV/ON/05 (No. de Acesso ATCC PTA 11828) foi recuperado de Cultura celular de rim de coelho13 (RK-13) a partir de uma secreção nasal de um cavalo em Ontário no Canadá. O vírus foi passado uma vez em células E-Vero para produzir um estoque mestre elevado pré-titulado, e foi então diluído com meio de cultura celular para produzir o banco de virus mestre. Banco de células mestre é uma linhagem celular E-Vero cultivada e mantida utilizando E199 suplementado com solução de L-Glutamina (até 2 mM) e uma solução de sulfato de gentamicina (até 30 μg/mL). ERAV/ON/05 inativada foi produzido de acordo com o seguinte procedimento geral.

[00138] O banco de células mestre congelado é descongelado à temperatura ambiente (18-26°C) e utilizado para inocular uma faixa de frascos T-25 cm2 pré-esterilizado a T-150 cm2 ou garrafas cilíndricas PETG de 850 cm2 ou 1.050 cm2 pré-esterilizadas. As células descongeladas são suspensas em meio de crescimento a uma taxa de 0,15 a 0,40 ml por cm2. As células são incubadas a 36-38°C durante até sete dias. As culturas plantadas a partir de estoque congelado podem ser realimentadas com meio para remover o dimetil sulfóxido (DMSO) residual, para remover os detritos excessivos, para estimular o crescimento de culturas que não tenham atingido a confluência, ou para manter a viabilidade das culturas confluentes. As células são passadas por meio de decantação do meio gasto e adicionando 1-10 ml (dependendo do tamanho do recipiente), de 25% de solução de tripsina- EDTA em cada recipiente. Os frascos são agitados suavemente até que as células atolem na superfície. As células são removidas dos frascos, por lavagem com meio de crescimento e agrupadas em conjunto. A faixa de passagens de culturas celulares é de um a vinte.

[00139] Antes da inoculação, o meio de crescimento celular foi decantado a partir de células que são pelo menos 90% confluentes. A camada celular é lavada com 20-50 mL de meio de infecção pelo vírus (E199 suplementado com solução de L-Glutamina (até 2 mM) e uma solução de sulfato de gentamicina (até 30 μg/mL), em seguida, realimentada com meio de infecção do vírus a uma taxa de 0,15 a 0,40 ml/cm2. Frascos são então inoculados com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,0005 a 0,005. Culturas de garrafas cilíndricas foram incubadas a 36-38°C durante dois a cinco dias a 0,2-0,4 rpm.

[00140] Durante o período de crescimento, as culturas são verificadas quanto à CPE microscopicamente e por contaminação grosseira macroscopicamente. Culturas inadequadas são descartadas depois da esterilização.

[00141] Fluidos virais são colhidos quando CPE atinge 75% ou mais. Garrafas cilíndricas são giradas para remover as células soltas e fluidos são agrupados em garrafas estéreis de 2-20 L de vidro, plástico ou PETG, recipientes de polipropileno estéreis de 20 L ou tanques de aço inoxidável estéreis de 2-200 L apropriados para clarificação. Fluidos combinados podem ser mantidos por até sete dias a 2-8°C antes de clarificação.

[00142] Apenas fluidos das culturas em monocamada mostrando evidência de infecção viral são colhidos. Garrafas indicando contaminação são descartadas. Uma amostra de fluidos clarificados agrupados é recolhida antes da inativação por titulação por TCID50. Fluidos com uma titulação de 106,2 TCID50/mL ou maior podem ser utilizados na preparação de produto final. Vários lotes podem ser combinados para atingir as titulações mínimas.

[00143] Lotes colhidos são clarificados por filtração usando cartuchos de filtro de polipropileno classificado com 5,0 mícron de tamanho de poros. Lotes de colheita pós-clarificados podem ser armazenados por até sete dias a 2-8°C. Fluidos clarificados são então inativados com solução de formaldeído USP, 0,1-0,2%, em volume, transferido para um recipiente secundário, e mantido à temperatura ambiente (18-26°C) com agitação, durante um mínimo de 48 a 72 horas. Uma amostra de fluidos inativados é feita para o teste de garantia de inativação antes de concentração. Material de lote inativado é mantido a 2-8°C antes da concentração. Fluidos virais inativados, clarificados são concentrados em um fator de 5X a 50X usando cartuchos de membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial com taxas de corte de peso molecular de não mais de 10.000 Dalton MW.

[00144] Um número de adjuvantes adequados pode ser adicionado à formulação de vacina, mais preferivelmente HRA-5. Outros adjuvantes incluem HRA-3 com óleo de semente de algodão (CSO). Etapas de processamento típicas podem ser empregues, tais como mistura, mistura, microfluidização e emulsificação, do adjuvante e/ou os antígenos do vírus colhidos com outros ingredientes.

[00145] O produto é, então, montado para a formulação final. Em um método de batelada em uma modalidade exemplar, as quantidades requeridas de adjuvante e diluente MEME são combinadas em um recipiente estéril, e o pH é ajustado para aproximadamente 6,3-6,7 com hidróxido de sódio. ERAV, sulfato de gentamicina, formaldeído, e Anfotericina B são adicionados um de cada vez durante a mistura constante. O pH é ajustado para 6,8-7,0 com hidróxido de sódio ou ácido clorídrico e a série é misturada durante um mínimo de 18 horas a 2-8°C. O volume de série completo é então transferido para um recipiente de armazenamento adequado e armazenado a 2-8°C. Anfotericina B pode ser adicionado a uma concentração de até 2,5 μg/mL do volume do diluente como um conservante. Sulfato de gentamicina é adicionado a uma concentração de até 30 μg/mL do volume de diluente como um conservante, formaldeído é adicionado em uma concentração de 0,1% do volume de diluente como um conservante. Um adjuvante tal como HRA-5 é adicionado a uma concentração de 10% v/v do volume final de série.

[00146] A vacina é dada por injeção hipodérmica típica, com doses de reforço, se desejado.

Exemplo 2

[00147] Esta investigação foi realizada para obter uma avaliação da eficácia de uma vacina do vírus da Rinite Equina A para proteger cavalos de desafio com um vírus da Rinite Equina.

Materiais e Métodos

[00148] Uma dose elevada de A-9 (107,5 TCID50/mL) e dose baixa de A-10 (107,0 TCID50/mL) de vacina de ERAV foram preparadas de acordo com o Exemplo 1.Tabela 1: Formulação de vacina A-9 (1 mL):

Tabela 2: Formulação de vacina A-10 1 (1 mL): ERAV/ON/05 107 .. 0 TCID50/mL

[00149] Uma formulação com 1 mL de placebo V-05 foi preparada ta como nas vacinas A-9 e A-10, mas sem o antígeno ERAV/ON/05.

[00150] Um total de 44 cavalos foi dividido aleatoriamente em três grupos de tratamento, compostos por um grupo de controle com placebo V-05 de 15 cavalos, um grupo de baixa dose de A-10 de 14 cavalos, e um grupo de alta dose A-9 de 15 cavalos. Os cavalos foram vacinados com uma dose de 1 ml de produto com adjuvante com HRA-5 durante três doses totais, com um intervalo de 21 dias entre as doses. Cavalos foram posteriormente desafiados 21 dias após a terceira vacinação por aerossol intranasal com uma dose de Rinite A nebulizada de 107,0 TCID50/mL por um período de quatro minutos. Os cavalos foram avaliados para sinais clínicos de sinais de temperatura, secreção nasal, secreção ocular diárias. Sangue pata neutralização sérica (SN) foi tomado semanalmente.

Vírus de Desafio

[00151] O vírus de desafio foi produzido em cultura de tecido em células E-Vero. A titulação do vírus de desafio foi determinada como sendo 1 x 106,9 TCID50/mL no dia do desafio. Vírus de desafio foi diluído na manhã do desafio 1: 10 com os meios de cultura de tecido para efetuar uma titulação de 1 x 105,9 TCID50/mL.

Método de Desafio Intranasal

[00152] Sedivet ® (cloridrato de romifidina), um sedativo e analgésico, foi administrado por via intravenosa a cada animal antes do desafio com uma dose de 50 μg/kg de peso corporal. Cada cavalo foi então desafiado com cerca de 106,2 TCID50 de um vírus de rinite equina. O vírus de desafio foi administrado por via intranasal, como um aerossol produzido por um nebulizador em um Equino AeroMask (Trudell International Medical, Ontário, Canadá), pelo seguinte método.

[00153] Quatro mililitros de 105,9 TCID50/mL de vírus de desafio foram colocados no copo nebulizador no dispositivo AeroMask. Um tubo de pressão foi montado a partir de um compressor de ar para a porta de entrada do nebulizador. O tubo de saída foi então inserido no Aero Mask ligado à cabeça do cavalo sendo desafiado e cerca de 68,95 kPade pressão de ar foi aplicado à porta de entrada por três minutos. Durante este tempo, cerca de dois mililitros de fluido de vírus de desafio foi aerossolizados diretamente nas narinas do cavalo sendo desafiado.

Neutralização Sérica

[00154] Um teste de neutralização sérica de microtitulação padrão foi utilizado neste estudo. Um teste de neutralização sérica padrão de microtitulação foi utilizado neste estudo. Todos os soros foram testados em placas de microtitulação de fundo plano estéreis, utilizando cinco poços por diluição e uma série de diluição de 8 poços para cada um dos cinco poços de teste. Cada um dos cinco poços de teste continha 25 μl da diluição de soro misturado com 25 μl do vírus indicador e 150 μl de uma suspensão de células recém plantadas eVero contendo aproximadamente 5 x 104 células. O vírus indicador de teste utilizado foi Vírus da Rinite Equina Tipo I. As titulações de anticorpos neutralizantes no soro são expressas como titulações de Reed-Muench ID50.

[00155] Para a realização do ensaio, diluições de duas vezes de cada soro de teste foram realizadas em uma placa de microtitulação de fundo plano estéril utilizando cinco poços replicados por soro de teste e uma série de diluição de 8 poços. As diluições foram feitas com um volume ajustável único ou instrumento de pipetagem multicanal de 5 poços usando pontas de microtitulação estéreis. O volume de soro adicionado a cada um dos 5 poços da primeira linha foi de 50 μl. Todos os outros poços continham 25 μl de DMEM (sem FBS). Após diluição em série da placa, 25 ml foi descartado da última linha. 25 μl de uma diluição predeterminada do vírus indicador foi adicionada a cada poço de teste. As placas foram então misturadas e incubadas durante uma hora a 37°C em 5% de CO2. Na conclusão do período de incubação, 150 μl de uma suspensão contendo 4 x 106/mL de células eVero foi adicionado a cada teste e poço de controle de célula. As placas foram incubadas a 37°C em uma incubadora de CO2, durante 5 dias, momento em que as placas foram examinadas microscopicamente para CPE típica de vírus da rinite equina.

Avaliação de Exsudado Nasal

[00156] Todas as observações de exsudado nasal foram feitas antes da coleta de secreções de nasofaringe. No Dia do Desafio e por 10 dias após o desafio, as passagens nasais e focinho de cada um dos 44 cavalos vacinados e de controle foram analisadas e classificadas de acordo com a classificação e descrição de pontuação abaixo.

[00157] As classes de pontuação de 0 a 6, foram atribuídas com base na gravidade da doença indicada por cada uma das seguintes classificações:Tabela 3: Grades de pontuação

Avaliação Ocular

[00158] Secreção ocular foi avaliada diariamente, no momento da avaliação do exsudado nasal. Pontuações de secreção ocular foram registradas como 0 = normal, 1 = secreção ocular leve a moderada e 2 = secreção ocular grave.

Isolamento Viral Nasofaringeal

[00159] Em cada dia de teste de observação cada passagem nasal de cada cavalo vacinado e de controle foi limpa profundamente por meio de uma lança cirúrgica WECK-CELTM estéril (Edward Weck and Company, Inc., Research Triangle Park, NC 27709) anexada a uma pipeta de plástico estéril de 11 polegadas de comprimento. Na coleta, cada uma das duas lanças cirúrgicas foi imediatamente colocada em um tubo contendo 4 mL de meio de transporte refrigerado (E-199 suplementado com gentamicina, L-glutamina, 2X Pen/Strep, 2X Anfotericina B).

[00160] Para o isolamento de vírus, os tubos foram misturados, os secreções removidas assepticamente, e o meio centrifugado a 1500 rpm durante 10 a 15 minutos para remover partículas. O meio foi filtrado através de um filtro de seringa de 0,2 μL antes da inoculação em células de cultura de tecidos. Após filtração, 4-6% de solução de sacarose 85% estéril foi adicionado a cada amostra para congelamento a -80°C a fim de que todas as amostras sejam testadas simultaneamente.

[00161] Para o isolamento de vírus, os tubos foram misturados, as secreções removidas assepticamente e o meio centrifugado a 1500 rpm durante 10 minutos para remover partículas. O meio foi filtrado através de um filtro de seringa de 0,2 μL antes da inoculação das células de cultura de tecidos. Um mL do meio de transporte clarificado foi usado para inocular uma monocamada de 2 cm2 dois dias depois em células E-Vero cultivadas em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços a partir da qual o meio de crescimento foi removido assepticamente. Após a inoculação, o inóculo foi deixado adsorver sobre a monocamada de células, durante uma hora a 37°C em uma incubadora com uma atmosfera úmida contendo 5% de CO2. Após o período de adsorção, um adicional de 1 mL de meio de realimentação (E-199 contendo 7% de soro fetal bovino (FBS), 2mM de L-glutamina, gentamicina 2X Pen-Strep e 2X Anfotericina B) foi adicionado a cada poço. Após a adição de meios de realimentação as placas foram então incubadas a 37°C em uma incubadora de CO2. Cada poço de cultura de tecidos de teste e de controle também foi examinado microscopicamente durante 7 dias para sinais de efeito citopático (CPE) típico do vírus de desafio ERAV. Poços que eram negativos no final do período de observação de 7 dias foram subcultivados para células frescas e observados durante 7 dias adicionais.

MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DE ESTATÍSTICA

[00162] Os dados de todos os cavalos vacinados com A-9 ou A-10 foram combinados para a avaliação de estatística. A influência da vacinação sobre a duração da doença (número de dias com pontuações nasais > 0) foi avaliada pelo teste de Kruskal-Wallis e teste de Hodges- Lehmann (o procedimento NPAR1WAY em SAS, SAS Institute, Cary NC). A gravidade da doença foi avaliada comparando o status máximo da doença entre os cavalos vacinados e os cavalos de controle. Pontuações nasais foram dicotomizadas para <1,5 e > 1,5 com base na distribuição de resultados. A fração prevenida (PF) e intervalo de confiança de 95% (IC) foram estimados. Pontuações oculares foram avaliadas como presente ou ausente e a fração prevenida e intervalos de confiança de 95% foram estimados (o procedimento FREQ em SAS). Análises medidas repetidas apropriadas para dados contínuos foram utilizadas para avaliar o efeito da vacinação sobre a temperatura corporal e as titulações de neutralização sérica (o procedimento MIXED em SAS). A proporção de cavalos que eram positivos ao vírus ao longo do tempo e positivos à camada de células brancas ao longo do tempo foi avaliada pelo teste exato de Fisher em cada momento (o procedimento Freq). Pontuações nasal e ocular foram avaliadas pelo teste da soma de classificação de Wilcoxon em cada momento (o procedimento NPAR1WAY).

Resultados e Conclusões

[00163] ISOLAMENTO DE VÍRUS DE SECREÇÕES NASAIS (disseminação do vírus) e CAMADA DE CÉLULAS BRANCAS (viremia)

[00164] A proporção de animais que foram positivos ao vírus foi significativamente menor nos grupos vacinados nos dias 2 a 7 (Tabela 4 abaixo e na Figura 1) em relação ao grupo de controle (P <0,05).Tabela 4. Proporção de vírus na secreção nasal positivo ao longo do tempo (* P <0,05 versus controle, teste exato de Fisher, em cada dia)

[00165] Animais positivos para camada de células brancas foram menos frequentes no grupo vacinado nos dias 4-7 quando comparados com o grupo de controle (Tabela 5 e Figura 2). Tabela 5: Proporção de Camada de células brancas positivas ao longo do tempo (* P <0,05 versus controle, teste exato de Fisher, em cada dia)

Neutralização sérica Tabela 6: Resumo da temperatura corporal e neutralização sérica

[00166] Os valores de temperatura corpórea (temperatura retal medida com sonda de termômetro calibrado GSA Eletrônica) em cada dia de desafio sempre estavam sempre dentro dos parâmetros normais de temperatura corporal. Grandes aumentos em titulações SN resultantes da vacinação foram encontrados (vide também a Fig. 3.) seguinte a desafio.

Avaliação Nasal e Ocular

[00167] Classificações médias para pontuações nasais foram mais baixas nos dias 4 e 10, e dias 12-13 no grupo vacinado em comparação com o grupo de controle (Tabela 7, a seguir e na Figura 4). As pontuações médias para as pontuações oculares foram menores no dia 7 no grupo de vacinados, em comparação com o grupo de controle (vide também a Figura 5). Tabela 7: Classificação média para pontuação nasal e ocular ao longo do tempo (* P <0,05 versus controle, teste de soma de classificação de Wilcoxon, em cada dia, A-9 e A-10 combinada).

Duração da Doença: Avaliação de Exsudato Nasa Tabela 8: Resumo do efeito da vacinação sobre a duração da doença (Número de dias com pontuação nasal > 0)

Tabela 9: Efeito da vacinação sobre a duração da doença (pontuações nasais; * significativamente menor do que grupo de controle pelo teste de Kruskal-Wallis, P < 0,05)

[00168] Longa duração da secreção nasal nos controles foi encontrada seguinte a desafio (Tabela 8, vide também a Figura 4). Grupos vacinados apresentaram uma redução significativa na duração de secreção nasal. Controles experimentaram um mínimo de 8 dias de secreção nasal vs 11 vacinados (38%), com um dia ou menos. Dois terços dos animais vacinados tinham duração mais curta da secreção nasal do que o mínimo de 8 dias no grupo de controle. Duração foi da primeira a última observação anormal, mesmo se cavalo tivesse dias normais entre. O número de dias em que os animais estavam doentes com sinais clínicos de doença respiratória nasal (pontuação > 0) foi significativamente menor (deslocamento de 7 dias) no grupo vacinado em comparação com o grupo de controle. Tabela 10: Pontuações Nasais Máximas - Diferença significante entre as duas distribuições de pontuações (Kruskal-Wallis, P = 0,0157).

Tabela 11: Pontuações Nasais (< 1,5 e > 1.5)

[00169] A vacinação também reduziu a severidade da secreção nasal (pontuação máxima em qualquer dia após o desafio). Contagens máximas nasais foram comparadas entre os grupos (Tabela 10). A pontuação mínima nasal para cavalos no grupo de controle foi de 1,5. Os resultados foram assim dicotomizados para pontuações < 1,5 e > 1,5 para a avaliação da gravidade da doença (Tabela 11). A fração evitada foi 48%, com um limite inferior de confiança maior que 0. A distribuição global da pontuação máxima nasal foi significativamente reduzida pela vacinação (Kruskal-Wallis, P = 0,0157). Avaliação Ocular Tabela 12: Pontuações Oculares (presente ou ausente)

[00170] Uma vez que apenas dois valores foram relatados para pontuações oculares (0 ou 2), os resultados foram dicotomizados em presente ou ausente dentro de um indivíduo. A fração evitada foi então utilizada para avaliar o efeito da vacinação na presença de sinais oculares. A vacina reduziu significativamente a gravidade da secreção ocular resultante da infecção com ERAV. Pontuações oculares médias ao longo do tempo também são mostradas na Figura 5.

[00171] Os dados do presente estudo demonstram que a administração de doses intramusculares do vírus inativado é capaz de imunizar um animal em níveis elevados de detecção de anticorpos que impedem a doença ocular e reduzir a severidade e duração da secreção nasal. Vacina foi altamente eficaz na prevenção de qualquer secreção ocular seguinte desafio com ERAV. Secreção nasal persistiu por um período relativamente longo após o desafio, quando atingiu o pico de secreção ocular e diminuiu rapidamente. Assim, a vacina mostrou uma melhoria significativa na secreção nasal durante um período prolongado (9 de 10 dias consecutivos), ao passo que a vacina reduziu significativamente a secreção ocular durante 1 dia, durante o qual os sinais oculares foram mais severos. Além disso, a vacinação reduziu significativamente projeção do vírus nasal ao longo dos sucessivos seis dias de pico de excreção viral, viremia e também foi significativamente reduzida durante os quatro dias de pico de viremia durante o período de desafio.

[00172] Nenhuma reação adversa inaceitável, quer nos locais de injeção ou por manifestação de sinais de doença sistêmica foi observada. A vacina é segura e bem tolerada para a administração em espécie sensível a rinite equina, particularmente equídeos. Este estudo demonstra que a injeções intramusculares de 3 x 1 mL das composições de ERAV do exemplo reduziram significativamente a severidade e duração da doença respiratória causada por desafio virulento ERAV.

Exemplo 3

[00173] Este exemplo ilustra sequenciamento e estudos analíticos realizados em uma cepa do vírus da rinite equina, tal como aqui descrito. Células e Vírus

[00174] Células renais de coelho 13 (RK-13) (100-160passagens) foram cultivadas em mistura de nutriente em meio eagle modificado da Dulbbeco F12 HAM (DMEM F12) (Sigma-Aldrich Canada Ltd. Oakville, Ontário), com 2-5% de soro bovino fetal (FBS) (Sigma). O crescimento celular e a propagação viral foram realizados em uma incubadora de CO2 (5%) a 37°C. O isolado de ERAV ERAV/ON/05 foi propagado em células RK-13 e alíquotas foram conservadas a -70°C durante trabalho posterior. Monocamadas RK-13 foram inoculadas a 90% de confluência e o RNA foi extraído antes de efeitos citopáticos (CPE) serem observados.

Titulação do Vírus e Purificação de Placa

[00175] Células RK-13 foram cultivadas em pratos redondos de 3 cm, utilizando meio DMEM F12 com 2% de soro fetal bovino. As células foram infectadas com 90% de confluência e as placas foram incubadas a 37°C durante 72 horas. Após 24 horas, o meio foi substituído e uma camada de agarose a 0,7% foi adicionada. As placas foram contadas e registradas a cada 24 horas. Às 72 horas, a camada de agarose foi removida e as placas foram coradas com violeta de cristal e contadas.

[00176] Para purificação de placas células RK-13 foram infectadas com ERAV/ON/05, adsorção foi permitida durante 45 minutos e o inóculo foi removido e substituído por uma camada de agarose a 0,7%. As placas foram verificadas a cada 12 horas e as placas foram classificadas como pequenas, médias e grandes. Foram selecionadas cinco placas de cada tamanho, colocadas em 300 μL de meio DMEM F12, e congelada a -70°C. Vírus de cada tamanho de placa foram propagados em células RK-13 e RNA foi extraído das pequenas e grandes placas para sequenciamento do genoma da UTR 5' .

Cinéticas de Crescimento Viral

[00177] Para estudo das características de crescimento desta cepa, células RK-13 foram infectadas com ERAV/ON/05 e amostras de sobrenadante foram coletadas em vários momentos para titulação. Células RK-13 foram cultivadas em placas redondas individuais de 3 cm e infectadas em 90% de confluência. As placas foram incubadas a 37°C e amostras de sobrenadante foram tiradas a cada 4 horas, com início à 0 hora, durante um período de 28 horas. Todas as amostras foram tituladas utilizando a técnica de unidades formadoras de placa (UFP), como anteriormente descrito aqui.

Imunofluorescência

[00178] Células RK-13 foram cultivadas em uma câmara/lâminas de cultura de tecido de vidro (Miles Scientific, Inc., Naperville, Illinois), e inoculadas com ERAV/ON/05. Vinte e oito horas após a infecção, o meio de cultura celular foi removido e as células foram fixadas em acetona. As lâminas foram mantidas a 4°C até processamento. Os soros de cavalos infectados experimentalmente foram usados como uma fonte de anticorpos de ERAV.

Extração de RNA e Sequenciamento

[00179] O RNA foi extraído a partir de monocamadas de células infectadas. As células foram tratadas com 1 mL de TRIzol (Invitrogen), 18-20 horas após a infecção e a extração foi realizada de acordo com as recomendações do fabricante. Péletes de RNA foram eluídos em 30 μL de água livre de RNase e mantidos a -70°C para uso posterior. A primeira cadeia de cDNA foi sintetizado utilizando sobrescrito lI (Invitrogen), seguindo as recomendações do fabricante. Uma reação de PCR de 50μl foi realizada utilizando um conjunto de iniciadores de sentido e antissentido. Para o sequenciamento do genoma, foi utilizada a abordagem primer walking, e iniciadores foram desenhados com base em oito sequências ERAV disponíveis no GenBank. As condições de PCR foram: 4 minutos a 94°C, seguido por 30 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 55°C e 30 segundos a 72°C com uma extensão final a 72°C durante 10 minutos.

[00180] O sequenciamento da extremidade 5' e 3' foram preenchidos com o kit 5' RACE e 3' RACE (Invitrogen), tal como recomendado pelo fabricante. Vários PCRs aninhados foram necessários para amplificar a extremidade 5' UTR final.

Análise de Sequência

[00181] A identificação preliminar do vírus foi concluída através de sequenciamento parcial da proteína VP1 estrutural utilizando iniciadores desenhados com base em outras sequências disponíveis no GenBank. Tabela 13: Iniciadores utilizados para amplificar algumas das regiões ERAV.

[00182] Todos os iniciadores foram desenhados em Gene Runner versão 3.05 (Hastings Software Inc.). Reações de sequenciamento foram criadas e executadas pela Divisão de Serviços de Laboratório da Universidade de Guelph.

[00183] Todas as sequências foram montadas e editadas com EditSeq e SeqMan DNASTAR Lasergene 8 (DNASTAR Inc., Madison, WI, EUA). Resultados de sequenciamento foram inseridos no software BLAST [Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia, Bethesda, MD (NCBI)] e em comparação com entradas semelhantes sobre GenBank. ClustalW2 [Instituto Europeu de Bioinformática, Dublin, Irlanda (EBI)] foi usado para vários alinhamentos de sequências e construção preliminar da árvore filogenética. A árvore filogenética final foi criada em MEGA 4.0 usando o método da máxima probabilidade composta e a confiabilidade foi avaliada por “bootstrapping” com 1000 replicações. Análises das sequências de nucleotídeos foram colocadas em SimPlot Versão 3.5.1 (Baltimore, MD, EUA). A fim de investigar a possibilidade de recombinação viral entre isolados de ERAV, concluiu- se a análise BootScan em SimPlot (versão 3.5.1) comparando as sequências genômicas de todo ERAV informado disponível no GenBank. Sítios de clivagem poliproteicos foram previstos com base em sequências relatadas no GenBank com números de adesão: DQ272578 e NC003982.

Resultados Caracterização Inicial

[00184] A proteína viral (VP1) do vírus foi amplificada, parcialmente sequenciada e comparada com sequências disponíveis no GenBank (número de acesso: NC003982, DQ272577, DQ272128, DQ272127, DQ268580, DQ272578, L43052). Os resultados desta comparação inicial demonstraram uma identidade máxima de 95% com o vírus da rinite equina A VP1.

Titulação viral

[00185] O isolado de ERAV foi inicialmente propagado em cultura celular e titulado pelo método da unidade de formação de placa. A titulação viral de estoque foi obtida 5X107 UFP na titulação inicial. Experimentos posteriores não mostraram mudanças dramáticas na titulação viral após 3 anos de congelamento inicial. Para experimentos com animais foi empregado o vírus de estoque com a titulação inicial. CINÉTICAS DE CRESCIMENTO

[00186] Todas as amostras de sobrenadante foram tituladas utilizando a técnica de PFU e os resultados foram introduzidos em uma folha de propagação para a construção de uma curva de crescimento. Como visto em outros picornavírus, o isolado de Ontario mostrou um aumento na titulação de 4 horas após a infecção, atingindo um patamar de 12 horas pós-infecção.

Imunofluorescência

[00187] Células RK-13 infectadas foram visualizadas com o microscópio de imunofluorescência. Sinais de fluorescência verde claro foram detectados no citoplasma das células infectadas com ERAV comparado aos sinais negativos nas células infectadas simuladas.

Purificação de Placas

[00188] O sequenciamento de um fragmento de 426 nucleotídeos na 5' UTR nas placas pequenos e grandes não mostrou nenhuma diferença entre os tamanhos de placa ao nível dos nucleotídeos. Contudo, as características morfológicas eram evidentemente diferentes em culturas celulares de RK-13.

Sequenciamento do Genoma Completo

[00189] O sequenciamento do genoma do isolado de ERAV resultou em 7839 nucleotídeos de comprimento, com um teor de GC de 47%, incluindo a cauda poli(A). Quatro repetições CTGTAGCGTCAGTAAAACGC idênticas (SEQ ID NO: 13), separadas por 18, 21 e 18 nucleotídeos foram identificadas na UTR 5'. A UTR 5' de ERAV era composta por 940 nucleotídeos com um teor de GC de 54%. Uma única poliproteína com 6747 nucleotídeos (2248 aminoácidos) compõe o genoma viral com um teor de GC de 46,8%. A síntese de partida da proteína foi detectada no nucleotídeo 940 com o códon de partida AUG e a terminação no nucleotídeo 7686 com o codão de paragem UAA. De grande interesse, uma segunda sequência AUG foi identificada após o códon de iniciação. Uma sequência AUGAUG subsequente também foi identificada de 58 nucleotídeos a jusante do codão de iniciação da poliproteína. Análise com blastx (NCBI) da poliproteína neste isolado mostrou uma identidade de nucleotídeos de 96% com relação ao outro ERAV relatado, no entanto, quando a sequência do genoma de comprimento completo do isolado de Ontario foi alinhada e comparada com os outras usando ClustalW2 (EBI) e Blastx (NCBI), apenas uma identidade máxima de 80% foi observada. A composição de aminoácidos mostrou uma organização de proteína idêntica (estrutural e não estrutural) e comprimento ao longo de todo o genoma. Estas comparações foram feitas com sequências genômicas reportadas por PERV-1 e PERV (números de acesso DQ272578 e NC003982).

[00190] A UTR 3' era composta por 110 nucleotídeos com um teor de GC de 24,3%, e uma cauda poli-A. Alinhamentos da UTR 5' de todo o ERAV disponível demonstraram uma identidade percentual mais baixa, variando de 73% a 81%. Da mesma forma, a UTR 3' foi analisada pelo mesmo método e a percentagem de identidade variou entre 75% a 81%. É interessante notar que foram identificadas várias inserções (1 nucleotídeo, 2 nucleotídeos e 13 nucleotídeos) e duas pequenas deleções (2 nucleotídeos, e 3 nucleotídeos) na UTR 5' (Fig. 4). Não há outras mudanças importantes observadas ao longo de todo o genoma.

Análise do Genoma Simplot

[00191] Análise SimPlot mostrou uma semelhança comparável (em porcentagem) entre todos os isolados de ERAV quando comparada com ERAV/ON/05. No entanto, as maiores disparidades foram identificadas no nucleotídeo 1500 (59% de similaridade) e nucleotídeo 4700 (65% de similaridade). No entanto, este estudo mostrou que a semelhança ao longo do genoma foi entre 70% e 82%. Para investigar melhor a grande divergência nos genomas, uma varredura (BootScan) para identificar possíveis locais de recombinação foi realizada. Estas análises mostraram que o isolado de Ontario não previu sítios de recombinação com outros isolados de ERAV. No entanto, quando o isolado de Ontário foi retirado da análise, possível recombinação entre outros isolados de ERAV pode ter acontecido na passagem.

Discussão

[00192] ERAV não é rotineiramente procurado e se recuperou de casos clínicos durante surtos respiratórios equinos. Portanto isolamento de ERAV de casos clínicos foi incidental e na maioria dos casos, um desafio. Por essas razões, a taxa de recuperação desse vírus e sequenciamento pode ser pequena.

[00193] Nos anos anteriores, o vírus da rinite equina foi classificado dentro da família Picornaviridae, mas não foi claramente atribuído a um gênero específico. Em 1996, Li e colaboradores ((Li F, Browning GF, Studdert MJ, and Crabb BS. Equine rhinovirus 1 is more closely related to foot-and-mouth disease virus than to other picornaviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 6; 93:990-995) demonstraram que ERAV estava intimamente relacionado com o vírus da doença do pé e da boca (FMDV) com base nas características filogenéticas e sequenciamento de nucleotídeos. De acordo com suas descobertas e outras (Wutz G, Auer H, Nowotny N, Grosse B, Skern T and Kuechler E. Equine rhinovirus serotypes 1 and 2: relationship to each other and to aphthoviruses and cardioviruses. J Gen Virol 1996, 77:1719-1730) o isolado de ERAV foi encontrado estando estreitamente relacionado com os isolados L43052, DQ272578 e NC003982.

[00194] O isolado de ERAV/ON/05 resultou em 7839 nucleotídeos, incluindo a 5' UTR, a poliproteína, 3' UTR e a cauda poli-A. Em comparação com os isolados de ERAV previamente relatados, o ERAV/ON/05 é uma das mais completas sequências de ERAV relatadas até hoje. A maioria das outras sequências faltam alguma informação da 5' UTR ou sequências parciais de proteínas virais individuais. Dados da UTR 5', revelaram a presença de três repetições que foram previamente reportadas em outros ERAV e comumente encontradas no vírus da febre aftosa. Tem sido sugerido que estas repetições podem ser necessárias para a formação de estruturas secundárias encontradas na UTR 5', o sítio de entrada de ribossoma interno (IRES). A análise de identidade mostrou que a poliproteína de isolado de ERAV/ON/05 tem uma sequência nucleotídica altamente conservada. Tal como um vírus de RNA, ERAV é propenso a mutações constantes, devido à falta de correção pela polimerase. Isso pode indicar que, mesmo que este vírus de RNA tenha estado sob evolução natural e replicação constante nenhuma mudança genômica significativa foi introduzida desde a sua primeira sequência genômica foi relatada. É evidente que as proteínas estruturais e não estruturais, que são codificadas na poliproteína, representam as regiões mais conservadas no genoma.

[00195] Interessantemente, a taxa de replicação viral em cultura celular foi rápida e eficiente. Um ciclo completo de replicação viral foi detectado em menos de 4 horas, atingindo um patamar em 12 horas. Estas características são típicas de picornavírus e podem refletir na atividade viral in vivo. Tais características podem explicar a gravidade e a velocidade de sinais clínicos em algumas infecções virais respiratórias equinas. Como observado em outros vírus, tais como o poliovírus e vírus da febre aftosa, a presença de pequenas deleções e/ou inserções na 5'UTR foi associada com as diferenças no tamanho da placa em cultura celular e virulência excessiva in vivo. Descobriu-se que o isolado de ERAV/ON/05 gera diferentes tamanhos de placas quando infecta células RK-13. Para investigar e correlacionar a presença dessas inserções e deleções na UTR 5' do isolado de ERAV/ON/05, esta região foi sequenciada a partir de vírus purificados de placas de diferentes tamanhos, e não encontrou-se nenhuma diferença ao nível dos nucleotídeos. Este resultado pode indicar que a diferença de tamanho de placa pode ser devido a um crescimento e replicação característica das células RK-13 e, talvez, não relacionado com a presença ou ausência das sequências encontradas nesta região.

Exemplo 4

[00196] Este exemplo mostra os resultados de um estudo destinado a desenvolver um modelo de infecção de ERAV confiável para investigar as características clínicas de ERAV/ON/05.

Materiais e Métodos

[00197] Na primeira fase um potro de pônei foi infectado com ERAV/ON/05 para ajustar a dose infecciosa e técnicas de coleta de amostras. Um segundo estudo piloto foi desenhado para comparar os animais infectados e de controle, e dominar técnicas de amostragem. O estudo de infecção principal foi realizado em duas fases, devido ao manuseio de animais e restrições de amostragem de tempo. Um ano após a primeira infecção, quatro pôneis previamente infectados foram selecionados para um estudo de reinfecção com base na sua titulação para ERAV. Animais com uma titulação intermediária e elevada de ERAV foram selecionados para serem re-expostos ao isolado de Ontario.

Animais Experimentais

[00198] Um total de 12 pôneis grávidas foi selecionado e seus potros foram mantidos para a infecção experimental de ERAV. Todas as éguas e potros foram mantidos em um grupo separado, longe do celeiro principal e as medidas de biossegurança foram postas em prática para prevenir a infecção respiratória viral. Amostras de sangue de todos os potros foram tomadas regularmente e titulações para ERAV foram verificadas periodicamente. As crias foram mantidas até elas alcançarem 12 meses de idade. Estes animais não foram vacinados contra todos os vírus respiratórios durante este período e práticas gerais foram mantidas para assegurar condições de vida saudáveis. Todos os animais foram desvermifugados de acordo com o protocolo de sobrevivência do rebanho. Todos os animais foram socializados e tratamento foi realizado regularmente. Pôneis foram treinados para o teste de função pulmonar (TFP). Uma vez que os animais foram condicionados durante as experiências, eles foram transportados em grupos para a unidade de isolamento e aclimatados durante pelo menos uma semana antes da infecção viral.

Unidade de Isolamento

[00199] Todos os ensaios de infecção foram realizados na unidade de isolamento de animais no Departamento de Patobiologia, na Universidade de Guelph. Esta unidade de isolamento contém baias individuais, que são equipadas com controle de temperatura, umidade, ventilação e iluminação. Acesso às baias foi restrito aos pesquisadores e pessoal de cuidados.

Os critérios de seleção

[00200] Todos os potros foram tratados com frequência, e o estado de saúde foi verificado periodicamente. Com base no estado de saúde e os parâmetros sorológicos, os animais a serem incluídos nesses experimentos foram escolhidos. Naquela época, todos os pôneis permaneceram soronegativos para vírus da rinite equina A (ERAV), vírus da rinite equina B (ERBV), herpesvírus equino 1 e 4 (EHV1/4), e Vírus da Influenza Equina 2 (AE2). Mesmo achando que titulações de anticorpos AE2 foram detectadas no nascimento, constante diminuição foi observada durante os primeiros 5 meses e não foi detectada pelo teste de hemólise radial simples (HRS), em seis meses de idade. Para o ensaio da infecção experimental de ERAV, um cavalo foi selecionado para ser utilizado. Posteriormente, outros dois cavalos foram selecionados para um segundo estudo piloto, e um grupo de oito pôneis (quatro controles e quatro infectados) foram selecionados para o estudo da infecção principal. Depois de um ano a partir da primeira triagem de infecção, 4 pôneis com titulações intermediárias e altas para ERAV foram escolhidos para uma triage< de reinfecção.

Inóculo

[00201] Isolado de ERAV (ERAV/ON/05) recuperado de um cavalo, durante um surto respiratório viral em Ontário, em 2005, foi propagado em células de rim de coelho 13 (RK-13) e as alíquotas foramarmazenadas a -70°C durante caracterização viral e experimentos de infecção viral em animais.

[00202] Resumidamente, para a preparação do inóculo, o isolado foi propagado em células RK-13. Placas redondas de 30 ml contendo 90% de monocamadas confluentes foram infectadas com 500 μL de ERAV/ON/05 e incubadas na presença de CO2 (5%) a 37°C durante 2436 horas. Todos os pratos foram retirados da incubadora e congelamento/descongelamento quatro vezes para provocar a ruptura da célula e liberação viral a partir de células intactas. Os sobrenadantes de todos os pratos foram reunidos em um só frasco e centrifugados a 6000 rpm durante 15 minutos para clarificar e descartar os detritos celulares. O sobrenadante clarificado foi aliquotado em 10 ml de frascos a serem utilizados como inóculo em experiências com animais de infecção viral. Além disso, pequenas alíquotas de 1 ml foram separadas e mantidas para titulação viral. O vírus foi titulado utilizando o método da unidade de formação de placa (UFP).

Modelo animal

[00203] Pôneis foram escolhidos como modelo animal devido à natureza do agente experimental (ERAV), tamanho do animal, disponibilidade e manipulação.

Protocolo de infecção

[00204] Foram selecionados pôneis entre 8 e 12 meses de idade, treinados e utilizados nos experimentos de infecção. Devido ao grande número de amostras a serem tomadas, esses experimentos foram divididos em cinco seções (dois estudos piloto, dois experimentos de infecção principal, e um experimento de reinfecção). Durante os estudos piloto, equipamentos, manejo dos animais, dose de inóculo, via de administração, e a coleta das amostras foram otimizados. O estudo de reinfecção foi realizado um ano após a infecção experimental inicial. Pôneis no grupo reinfectado foram expostos à mesma cepa viral na mesma dose utilizada durante a primeira infecção. Apenas o exame clínico, coleta de sangue para avaliação de titulações e secreções de nasofaringe para isolamento do vírus foram coletadas a partir deste grupo.

Máscara facial e nebulização

[00205] Para a infecção viral, um AeroMask ® equina pequeno foi equipado com um selo de borracha no final da narina. Tamanho foi ajustado de acordo com a cabeça do cavalo e as janelas de respiração não foram modificadas. A máscara foi equipada com um conector inalador e uma válvula em forma de "T" para nebulização do vírus. Copos nebulizadores de 6 ml convencionais foram utilizados para entregar o inóculo. A nebulização foi realizada usando um compressor de PM14 (Precision Medical Inc. Northampton, PA), com um fluxo de gás de 9 LPM (litros por minuto). Esta taxa de fluxo e copos de entrega permitem a entrega consistente de partículas respiráveis de mais ou menos 5 mícrons. Cada cavalo foi nebulizado durante 45 minutos (tendo um intervalo de 5 minutos, a cada 15 minutos) com 15 mL (volume total) de qualquer inóculo ou placebo. Uma secreção de nasofaringe por pônei foi coletada após a infecção para assegurar a viabilidade do inóculo quando entregue. Pôneis que foram reinfectados no último ano foram expostos ao vírus pelo mesmo protocolo.

O exame clínico

[00206] Todos os pôneis foram avaliados clinicamente em uma base regular, desde o nascimento. Antes do estudo piloto e de infecção, todos os cavalos foram avaliadas diariamente durante os experimentos e ensaiados duas vezes por dia durante os primeiros 10 dias e uma vez por dia desde o dia 11 até ao dia 21 pós-infecção. O exame clínico incluiu: temperatura corporal (temp) (graus Celsius), frequência cardíaca (FC), frequência respiratória (FR), enchimento capilar (ref), motilidade gastrointestinal (GI), sons pulmonares (ls), secreção nasal (nd), secreção ocular (od) [presença ou ausência de características], linfonodos (ln) [tamanho e características], locomoção e condição física geral. O exame físico foi realizado em torno do mesmo tempo em cada pônei todos os dias, começando com os animais do grupo de controle e passando para o grupo infectado. Cerca de 10 minutos foram gastos em cada exame de animais todos os tempos e todos os dados individuais foram gravados em um formulário de verificação diária.

Teste de função pulmonar (TFP)

[00207] O PFT foi realizado como anteriormente descrito por Hare e colaboradores (Hare JE, Viel L. Pulmonary eosinophilia associated with increased airway responsiveness in young racing horses. J Vet Intern Med 1998;12(3):163-70)). O teste foi realizado em todos os cavalos de controle e infectados antes da infecção (dia 0) e nos dias 1, 7, 14 e 21 pós-infecção. Resumidamente, no dia do teste, pôneis estavam fora de alimentação na manhã e foram ligeiramente sedados conforme anteriormente aqui descrito para os procedimentos de endoscopia. A máscara de borracha foi formada para caber confortavelmente no focinho dos pôneis. Um pneumotachograp # 4 (Gould Electronics, Biltholven, Holanda) foi acoplado à máscara facial, e ligado a um conjunto de transdutores que convertem os sinais de pressão e fluxo de ar expirado em voltas que são registrados em um computador (Analisador de Mecânica Pulmonar, Buxco Electronics Inc, Sharon, CT, EUA). O fluxo foi medido ao nível pneumotachograp e a pressão pleural foi avaliada por um balão esofágico (10 cm de comprimento), que foi colocado no meio do tórax através de tubos esofágicos. Um volume total de 3 ml de ar foram introduzidos no balão. A diferença de pressão entre a pressão pleural e a pressão atmosférica (medidas ao nível de narina) foi considerada como a pressão transpulmonar (ΔPpl).

Teste de broncoprovocação

[00208] Desafio de broncoprovocação foi realizado como parte do teste PFT. Para determinar a hiper-reatividade das vias aéreas após a infecção de ERAV/ON/05, animais de controle e infectados foram expostos a doses crescentes de histamina (dose de duplicação) por nebulização com um compressor PM14 com um fluxo de gás de 9 LPM (Precision Medical Inc. Northampton, PA). Parâmetros fisiológicos pulmonares foram avaliados inicialmente por administração de uma solução salina fisiológica a 0,9% (linha de base), seguido por aumento de doses de histamina. Após cada administração (2 minutos), os dados foram registrados por 3 minutos e fisiologia respiratória foi analisada mais tarde. Doses de histamina foram iniciadas com 0,5 mg/ml e foram gradualmente aumentadas para um máximo de 32 mg/ml. Complacência dinâmica (Cdyn) e ΔPpl foram utilizados como parâmetros para interromper a nebulização com histamina. Quando Cdyn foi reduzido em dois terços ou ΔPpl foi duplicado durante a administração de histamina, a nebulização foi suspensa. Dose de histamina foi mais tarde calculada e traçada. Todos os pôneis foram levemente sedados e contidos fisicamente durante estes procedimentos.

Técnicas de amostragem Coleta de sangue

[00209] As amostras de sangue foram coletadas a partir de qualquer veia jugular direita ou esquerda. Cerca de 10 ml de sangue foram coletados em um tubo de tampa vermelha (soro) de cada pônei de acordo com o cronograma de coleta da amostra. Além disso, de 3 a 5 ml de sangue também foram coletados para CBC (hemograma completo) e perfil. Todas as amostras foram coletadas nas primeiras horas da manhã e processadas no mesmo dia.

[00210] As amostras de sangue para a separação do soro foram mantidas à temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos e depois centrifugadas a 3000 rpm em uma mesa de centrífuga. O soro foi separado dentro de 6 horas a partir do tempo de coleta e as alíquotas foram etiquetadas e congeladas a -70°C para análise posterior (anticorpos para ERAV, ERBV, AE2, e EHV1/4). As amostras de sangue para hemograma e perfil foram processadas no mesmo dia.

Secreção de nasofaringe

[00211] Secreções de nasofaringe foram coletadas para isolamento do vírus em dias anteriores à triagem da infecção e nos dias 0, 1, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17 e 21. Cada pônei foi contido com uma focinheira e uma secreção de comprimento de 30 cm (Kalayjian Industries, Inc. Signal Hill, Califórnia) foi aprovada em qualquer narina direita ou esquerda até chegar à faringe. Raspagem foi executada pela rotação do exsudado para cerca de 5 a 10 segundos. O exsudado foi removido cuidadosamente, e as pontas foram cortadas em um frasco contendo 3 ml de meio de transporte de vírus (VTM). Os frascos contendo as secreções foram abalados e mantidos em gelo até o processamento. Para liberar as partículas virais e as células ligadas aos esfregaços, os frascos foram agitados durante cerca de 20 segundos, e o meio foi transferido para um tubo de Eppendorf de 1,5 mL e congelado a -70°C durante análise posterior.

Amostragem de urina e fecal

[00212] Isolamento do vírus foi tentado em amostras de urina e de fezes de pré e pós-infecção com ERAV/ON/05. A urina foi coletada pela manhã, após exame clínico e/ou limpeza, mantendo um copo de coleta, enquanto os animais foram urinar. Quando a amostra não pode ser recolhida à mão, o animal foi equipado com um saco de coleta de plástico ao redor dos órgãos genitais. Este saco foi removido depois que o animal urinou e uma alíquota de 10 ml foi guardada para o isolamento do vírus. Amostras de fezes foram coletadas manualmente de esterco fresco no chão da baia. Cerca de 5 ml de adubo foram coletados dentro de um copo de coletada e 10 mL de solução salina estéril foram adicionados para dissolver a amostra. As amostras de urina e de fezes foram mantidas em gelo até ser transformadas.

Endoscopia digestiva Superior e Inferior

[00213] Broncoscopia e BAL foram realizados como anteriormente descrito (Hare et al., 1998). Um endoscópio de fibra ótica flexível estéril, 140 cm de comprimento com um OD de 0,8 mm (Olympus Corp, Tóquio, Japão) foi avançado pela narina direita ou esquerda para dentro da cavidade nasal ao nível da laringe. Neste ponto, a conformação VAS foi avaliada. Depois, o broncoscópio foi avançado para a traqueia e na presença ou ausência de inflamação e/ou muco e as características da mesma foram registradas. Os dados foram registrados na ficha de avaliação diária e todas as endoscopias foram gravadas em vídeo para posterior análise.

Biópsias por escovação da faringe e traqueia

[00214] A fim de avaliar a replicação viral nas vias respiratórias superiores e inferiores, uma biópsia por escovação foi tomada da faringe, traqueia média, e carina de animais infectados e de controle nos dias 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, e 21. Durante o exame de endoscopia, escovas citológicas guardadas de 200 centímetros (luva protetora) (Hobbs Medical Inc. Connecticut) foi avançada através do canal de biópsia no local da amostra predeterminado e uma amostra foi coletada. Escovas foram retraídas para dentro da manga protetora e retiradas do broncoscópio. Para remover o tecido da amostra da escova, esta foi colocada em 600 μL de VTM ou vórtex realizado durante 10 a 20 segundos. Todas as amostras foram mantidas em gelo e transportadas para o laboratório para posterior análise (isolamento do vírus).

Lavado bronco-alveolar (BAL)

[00215] Em resumo, todos os pôneis foram levemente sedados com romifidina (0,04 mg/kg, IV) e um broncoscópio estéril OD de 0,8 mm (Olympus Corp, Tóquio, Japão) foi avançado pela narina direita ou esquerda para dentro da traqueia para ao nível de carina. Como o broncoscópio foi avançado, uma solução de lidocaína aquecida a 0,2% foi administrada para reduzir a tosse e angústia. Uma vez que o reflexo da tosse foi reduzido o broncoscópio foi avançado e encravado em um brônquio terminal proximal. Um total de 250 mL de solução salina aquecida estéril foi administrada através do canal de biopsia dividido em duas alíquotas. LBA foi recuperada por aspiração manual com uma seringa de 60 cc por meio do canal de biópsia e colocada em gelo. O líquido foi filtrado e alíquotas para isolamento do vírus, contagem de células, e as lâminas de citospina foram feitas.

Cultura de amostras clínicas

[00216] Amostras coletadas foram transportadas em gelo e congeladas a -70°C para posterior inoculação em culturas de células.

[00217] As células RK-13 (100-160 passagens) foram cultivadas em istura de nutrientes de Meio Eagles Modificado da Dulbbeco HAM F12 (DMEM F12) (Sigma-Aldrich Canada Ltd. Oakville, Ontario) com soro fetal de vitela a 2-5% (Sigma). O crescimento das células e isolamento foi realizado em incubadora de CO2 (5%) a 37°C. Monocamadas de células RK-13 foram cultivadas em placas de 6 poços até uma confluência de 90% e infectadas com as amostras clínicas com o ensaio de infecção. Em resumo, 90% do meio de cultura foi removido de cada um dos poços e 200 mL da amostra a ser testada foram adicionados à monocamada. As placas foram colocadas na plataforma oscilante durante uma hora e 3 mL de meio foram adicionados depois do tempo decorrido. As placas foram incubadas e verificadas a cada 24 horas para efeitos citopatogênicos (CPE). Se CPE foi detectado, o sobrenadante foi removido do poço e congelado para análise posterior. Os resultados do teste de isolamento do vírus foram registrados em uma planilha. As placas foram verificadas durante até 7 dias e se CPE não foi desenvolvido, uma segunda passagem foi tentada usando 200 μl de sobrenadante a partir da primeira passagem. Após uma segunda passagem, se CPE não foi detectado a amostra foi classificada como negativa. Sobrenadante de amostras positivas e negativas foi salvo de ser confirmado por reação em cadeia da polimerase transcriptase reversa RT-PCR).

Análise estatística

[00218] Os resultados do isolamento do vírus e todos os resultados clínicos (Tabela 7) foram inseridos em uma planilha.Tabela 14: Sistema de pontuação para infecção experimental com ERAV/ON05

[00219] Resultados do isolamento do vírus foram classificados como positivos ou negativos e os resultados foram comparados entre os grupos. Para determinar se houve diferença estatística entre os locais de isolamento do vírus (no grupo infectado) uma regressão logística exata foi usada em cada dia e local. O mesmo teste foi utilizado para determinar se existia uma diferença estatística entre os grupos de acordo com o dia do isolamento. Pontuações clínicas foram resumidas e os totais foram analisados e comparados entre os grupos.

[00220] Um modelo misto linear generalizado foi utilizado para analisar todos os parâmetros clínicos. Fatores incluídos no modelo foram: pônei, tratamento e tempo, bem como interações dos mesmos. Como os animais foram medidos ao longo do tempo, foi utilizado o critério de Akaike (AIC), para determinar uma estrutura de erro para a autorregressão. Os pressupostos da ANOVA foram avaliados por análises residuais abrangentes. Um teste de Shapro-Wilk, um teste de Kolmogorov-Smirnov, um teste de Cramer-von Mises, e um teste de Anderson-Darling foram conduzidos para avaliar a normalidade total. Resíduos foram esquematizados contra os valores previstos e as variáveis explicativas (pônei, tratamento e tempo) para procurar padrões que sugerem que os outliers, variância desigual ou outros problemas. Se as análises residuais sugeriram a necessidade de transformação de dados ou dados foram apresentados como uma porcentagem, as análises foram feitas em uma escala logit ou log. Se o teste geral f foi significativo, um teste de Dunnetts foi aplicado voltando à linha de base dentro de um tratamento ou um teste de Tukey entre os tratamentos e os sítios cada vez que foi aplicado.

[00221] Resposta serológica foi definida como um aumento de quatro vezes nos níveis de anticorpos da linha de base (dia 0) para qualquer um dos pontos de tempo de coleta de amostras (dias 7, 14, ou 21). A análise estatística foi realizada em SAS 9.1.3 (SAS Institute Inc., 2004, Cary, NC). A significância estatística foi fixada em P <0,05.

Resultados

[00222] Este estudo foi desenhado para reproduzir de forma consistente doença clínica de ERAV em pôneis e estudar suas características in vivo. Estudos piloto mostraram que ERAV/ON/05 nebulizado foi capaz de causar doença respiratória clínica em pôneis saudáveis (10-12 meses de idade). Imunossupressão leve foi induzida em todos os pôneis, exceto nos animais reinfectados para imitar as condições naturais em eventos estressantes (por exemplo, movimento para vendas, transferência de campo, programas de vacinação, etc.). Os resultados do estudo de infecção principal confirmaram os resultados obtidos durante os estudos piloto. Pôneis no grupo infectado (n = 4) desenvolveram a doença clínica respiratória que consistiu no aumento da temperatura corporal, linfadenopatia, aumento de sons pulmonares, aumento do muco traqueal, e o aumento da secreção nasal (Figura 7-8). Nenhum desses sinais clínicos foi significativamente extremo de exigir cuidados adicionais com os animais ou tratamento de suporte. Nem a frequência respiratória, nem frequência cardíaca foram significativamente diferentes entre os grupos. Nenhum dos sinais clínicos desenvolvidos pelo grupo infectado foram observados nos animais de controle (n = 4), que se mantiveram saudáveis ao longo da extensão desses estudos. O agente etiológico (ERAV), apenas foi recuperado a partir de cavalos no grupo infectado durante até sete dias (Tabela 8). Pôneis no grupo reinfectado (n = 4) não desenvolveram sinais clínicos respiratórios e permaneceram saudáveis durante os experimentos. A análise estatística dos dados coletados durante estes ensaios demonstrou uma diferença significativa entre animais infectados e de controle. Tabela 15. Resumo de projeção de vírus da Rinite Equina A (ERAV). Os resultados de isolamento do vírus a partir de amostras coletadas durante a infecção experimental de ERAV/ON/05.

+ Vírus foi recuperado a partir da amostra clínica em cultura celular (células RK-13) - Vírus não foi recuperado a partir da amostra clínica BAL Lavagem broncoalveolar

[00223] Nem depressão, nem perda de apetite, foi registrada em nenhum dos grupos. Além da hidratação, micção, defecação, e movimentos gastrointestinal mantiveram-se inalterados em todos os grupos, durante os ensaios de infecção. Não houve diferença entre os animais reinfectados e de controle sobre a pontuação clínica e teste de isolamento de vírus, uma vez que não foi observada doença clínica nos animais reinfectados e o vírus não pôde ser recuperado a partir deste grupo.

Descobertas clínicas

[00224] Todos os pôneis foram considerados saudáveis antes destes experimentos. Exposição de ERAV/ON/05 induziu doença respiratória clínica em animais infectados, em comparação com os animais de controles e reinfectados. Os principais sinais clínicos detectáveis pelo exame físico foram febre, secreção nasal e linfadenopatia. O exame endoscópico também revelou a presença de grandes volumes de muco e hiperemia, na traqueia média e vias aéreas inferiores dos animais infectados.

Temperatura retal

[00225] Nenhuma diferença significativa foi encontrada na temperatura retal diária entre os grupos antes da exposição viral ou placebo. Um efeito significativo do tratamento foi identificado, quando os animais foram infectados em comparação com controles e reinfectados (p = 0,002). Quando a temperatura do corpo dos três grupos foi comparada em diferentes tempos, o grupo infectado foi significativamente diferente, em comparação com os animais de controle e reinfectados (p = 0,028). O aumento da temperatura corporal foi detectado 24 horas pós-infecção, apenas nos animais infectados e foi significativamente diferente do dia 2,5 ao dia 6, quando comparado com animais de controle nos mesmos pontos de tempo (p = <0,005). O aumento da temperatura corporal colhida no dia 4 com uma temperatura corporal média de 38,45°C (SE = 0,15) (p = 0,001), e persistiu durante mais dois dias consecutivos (Fig. 8). Nenhuma diferença estatística foi encontrada quando a temperatura corporal dos grupos de controle e reinfectados foi comparada em momentos diferentes. Os animais nos grupos de controle e reinfectados não tiveram uma alteração significativa na temperatura do seu corpo, quando comparando aos pontos individuais em momentos dentro dos grupos (dias 1, 7, 14 e 21). Linfonodos

[00226] Linfonodos submandibular e retrofaríngeo foram examinados diariamente e classificados como não palpáveis, palpáveis e ampliados. Palpabilidade ou alargamento dos gânglios linfáticos só foi registrado nos animais infectados e reinfectados. Em todos os pôneis infectados, região submandibular tornou-se sensível à palpação no segundo dia e, na maioria dos casos, persiste durante até duas semanas. O tamanho dos gânglios linfáticos submandibulares nos animais infectados variou de 3 a 5 cm de comprimento por 2 a 3 cm de espessura, bem como a análise das pontuações totais demonstraram diferença estatística entre os grupos (p = <0,0001) (Fig.7) .Curiosamente, os nodos linfáticos retrofaringeanos não foram consistentemente palpáveis em todos os animais infectados, mas uma mudança significativa no tamanho foi registrada em um pônei. Esta linfadenopatia não pareceu interferir com o consumo de alimentos ou de água e a sensibilidade à palpação tornou-se menos pronunciada conforme os dias progrediram. Nódulos linfáticos submandibulares eram palpáveis em três animais do grupo dos animais reinfectados com um tamanho médio de menos de um centímetro de comprimento e 0,5 cm de espessura, aproximadamente. Os animais de controle não tinham mudanças de linfonodos detectáveis na palpação durante as experiências de infecção.

Frequência Cardíaca e respiratória

[00227] A frequência respiratória (FR) e meios de frequência cardíaca (FC) não foram significativamente diferentes entre os grupos de tratamento (P = 0,1) em todos os pontos temporais. Em geral, RR e RH estavam dentro dos parâmetros fisiológicos normais e pequenas mudanças só foram associadas com a manipulação e coleta de amostras. A média mais elevada de RR entre todos os grupos foi identificada no dia 0 e a menor média de todos os grupos foi registrada no dia 21.

Exame endoscópico

[00228] No exame endoscópico, os animais infectados apresentaram um aumento na quantidade de muco traqueal detectável no dia um que persistiu até ao dia 21. Nem os animais de controle, nem os reinfectados tinham secreções mucosas detectáveis ao exame endoscópico ao longo destes experimentos.

[00229] Características do muco variaram de clara e serosa no primeiro dia de muco nos dias 7-21. Manchas de muco foram consistentemente distribuídas a partir da traqueia superior para a bifurcação da carina. Hiperemia traqueal localizada foi observada em todos os animais infectados e em alguns animais de controle ao longo desses experimentos. A carena em todos os animais infectados foi reduzida e em alguns casos hiperaêmia começando no dia três. Sensibilidade para exame endoscópico foi visivelmente aumentada em sete dias em animais infectados e foi observado broncoespasmo durante BAL. Secreção nasal variou de leve a moderada em todos os pôneis infectados e não estava presente no grupo de controle e reinfectado. Secreção nasal serosa foi observada durante o exame clínico durante cerca de 8 dias em que os animais infectados com início entre 36 e 48 horas pós-infecção. No entanto, esta secreção não foi um reflexo do muco (características e volume) observado durante o exame endoscópico. Secreção ocular leve foi observada de forma inconsistente nos animais infectados.

Sorologia

[00230] Um total de 12 pôneis (com idade de 10 a 12 meses) foram infectados com ERAV/ON/05 ou placebo por nebulização. Todos os pôneis eram sorologicamente negativos para ERAV, ERBV, AE2 e EHV1/4 e em uma condição saudável antes dos experimentos de infecção. Após a exposição ao ERAV/ON/05 todos os animais infectados (100%) soroconvertidos (quatro vezes de aumento) para ERAV determinados pelo teste de neutralização de vírus (VN) (fig. 9). Um tratamento significativo por interação diária foi observado em animais infectados (P = <0,0001). A diferença estatística entre animais infectados e reinfectados foi encontrada na linha de base e no dia 7 (P = <0,001). No grupo reinfectado, não foram encontradas diferenças estatísticas quando as titulações para ERAV nos dias 7, 14 e 21 foram comparadas de volta com a linha de base.

[00231] As titulações de anticorpos contra ERAV eram significativamente elevadas em animais infectados, a partir do dia 7 e, na maioria dos casos, um pico no dia 14 e mantido até o dia 21 (P = <0,001). Em contraste, todos os animais de controle permaneceram soronegativos para ERAV e não há mudanças detectáveis identificadas pelo teste de NV. Os animais em todos os grupos não mostraram um aumento dos níveis de anticorpos ou conversão serológica para quaisquer outros vírus respiratórios (ERBV, AE2, e EHV1/4) durante estes experimentos (Fig. 9). Os animais do grupo reinfectado (n = 4) não têm uma diferença significativa nas titulações de anticorpos para ERAV entre a linha de base e o dia 21 pós-infecção. No entanto, uma pequena mudança nos níveis de anticorpos para ERAV foi detectada em três pôneis e um aumento de quatro vezes em um pônei a partir do mesmo grupo (Fig. 9).

Isolamento do vírus

[00232] Enxugamento de nasofaringe, escovação de laringe, escovação de traqueia, LBA, amostras de fezes e urina foram negativos para isolamento do vírus (vírus respiratório equino) em todos os pôneis antes da infecção (Tabela 8). Exsudados obtidos da nasofaringe de animais infectados e de controle após a conclusão nebulização foram cultivados em células RK-13 e ERAV foi recuperado em uma primeira passagem a partir de todos os animais infectados. RT-PCR utilizando iniciadores que miraram o gene VP1 confirmou os diagnósticos positivos e negativos de ambos os grupos.

[00233] Resultados do isolamento do vírus de ensaios de infecção e reinfecção estão resumidos na Tabela 8. Uma diferença significativa entre animais infectados, de controle e reinfectados foi identificada comparando o isolamento do vírus entre os grupos (P = <0,05). ERAV só foi recuperado a partir de animais no grupo infectado nos dias específicos e áreas específicas do trato respiratório (Tabela 8). Nenhum outro vírus foi recuperado a partir de amostras coletadas durante as experiências de teses. Todos os pôneis no grupo de controle foram negativos nos testes de isolamento de vírus ao longo do estudo. Um tratamento por interação diária em animais infectados, foi detectado pela primeira vez no dia 7 e persistiram nos dias 14 e 21 (P = <0,05).

[00234] Localização para a recuperação do vírus variou de vias aéreas inferiores, nos dias 1, 3 e 5 para vias aéreas médias e superiores, nos dias 1, 3, 5 e 7. No dia um ERAV foi isolado da faringe e da carena de todos os pôneis no grupo infectado e da traqueia média e BAL de 3 pôneis a partir do mesmo grupo. Todas as tentativas para a recuperação do vírus a partir de fezes de todos os grupos foram bem sucedidas. O isolamento do vírus a partir de urina e de plasma foi obtido apenas em raras ocasiões (Tabela 8). Recuperação do vírus foi diminuída gradativamente desde o dia 1 até ao dia 7, quando ERAV foi consistentemente recuperado a partir de amostras clínicas. Esta última recuperação viral foi associada com um aumento na titulação de anticorpos para ERAV e uma diminuição dos sinais de pontuação clínica (Figs. 7 e 9).

Teste de função pulmonar (TFP)

[00235] A hiperatividade das vias aéreas foi avaliada com base na resposta fisiológica e clínica à provocação de histamina. Dados provenientes de animais infectados e de controle foram esquematizados e as doses de histamina desencadeantes foram calculadas. Curiosamente, pôneis de ambos os grupos infectados (e controle) no dia 0 responderam a uma dose baixa de histamina (<6 mg de histamina). Em geral, as doses de histamina desencadeantes não irão além de 13 mg. A reação de histamina clínica (dependente de dose) foi observada como hiperventilação associada com uma elevação abdominal e dificuldade de respiração. A reação fisiológica foi detectada no PFT por uma queda de 35% na complacência dinâmica do pulmão (Cdyn) ou uma duplicação da pressão transpulmonar (ΔPpl) quando se comparada à administração de solução salina e histamina. Pôneis no grupo infectado mostraram uma pequena redução da dose de histamina desencadeante do dia 0 ao dia 1. No entanto, isso não foi significativamente diferente entre os grupos. Uma diferença significativa entre os controles e infectados foi detectada no dia 21 (P = 0,02).

Contagem diferencial de células de fluidos BAL

[00236] Contagem de células diferenciais foi realizada nas lâminas de citospin preparadas a partir de alíquotas de LBA. Não houve diferenças significativas nas contagens de células entre os cavalos nos diferentes grupos de tratamento antes da triagem de infecção. Nenhum tratamento por efeito do dia foi detectado no macrófago e percentagens de células epiteliais ao longo dos experimentos. Um aumento significativo no número de neutrófilos foi observado no dia 7 após a infecção no grupo infectado (P = <0,05). Estes números não foram significativamente diferentes nos animais de controle ou reinfectados quando comparados com linha de base nos dias 7, 14 e 21. As percentagens médias de linfócitos, eosinófilos e mastócitos foram proporcionalmente reduzidas no dia 7 pós-infecção em animais infectados e uma diferença estatística significativa foi detectada (P = <0,05). Células epiteliais ciliadas foram frequentemente observadas nas lâminas de animais infectados e de controle, no entanto, não foram detectadas diferenças significativas, exceto em um dos animais infectados que tinham uma contagem elevada no dia 7. Em geral, uma inflamação supurativa não séptica com a presença de células epiteliais e células gigantes esporádicas foi detectada nos pôneis infectados. Curiosamente, nenhuma grande mudança do exame citológico foi observada nas amostras a partir dos animais reinfectados.

[00237] Este estudo demonstra que ERAV/ON/05 induziu doença respiratória clínica em pôneis infectados. A sorologia demonstrou que nenhuma outra virose respiratória estive presente durante estes ensaios. A doença é caracterizada por febre, secreção nasal, aumento de sons pulmonares, e aumento de tamanho de nódulos linfáticos submandibulares. Além disso, grandes quantidades de muco foram detectadas por endoscopia nas vias aéreas inferiores, que persistiram até o dia 21. O vírus foi isolado a partir da parte inferior e superior das vias aéreas até o dia 7 correspondente ao aparecimento detectável de anticorpos do vírus da rinite equina A (ERAV). Nenhum dos animais reinfectados desenvolveu a doença clínica e apenas um pônei deste grupo apresentou um aumento de quatro vezes nas titulações de anticorpos para ERAV. Pôneis com anticorpos de ERAV preexistentes não desenvolveram a doença clínica quando expostos ao vírus.

Exemplo 5

[00238] Este exemplo ilustra uma modalidade de uma composição de Vírus da Rinite Equina B de acordo com a presente invenção.

Materiais e Métodos

[00239] Cepa do vírus da Rinite Equina B 07-10342 (No de Acesso ATCC PTA-11829) foi recuperado de cultura celular de rim de coelho13 (RK-13) a partir de uma secreção nasal de um cavalo em Ontário no Canadá. 07-10342 inativado foi produzido seguindo o procedimento geral descrito no Exemplo 1 para ERAV/ON/05.

[00240] As seguintes composições contendo ERBV sozinho ou em combinação com ERAV foram preparadas. Tabela 16. Grupos de Vacina

[00241] Oito cavalos de cada um dos grupos de vacina 1, 2 e 3, foram desafiados junto com oito cavalos de controle com a dose de desafio 106,6 TCID50. Estado de doença com base em secreção nasal e pontuações de conjuntivite, como indicado na Tabela 10. Efeito da vacinação sobre a duração, gravidade e a incidência da doença é apresentado nas Tabelas 17-22. Tabela 17. Pontuação de estado da doença

[00242] O grupo vacinado apresentou uma redução significativa (Tabela 18) na duração da secreção nasal, incluindo em alguns casos, nenhum sinal de doença respiratória leve. Tabela 18. Número de dias com doença respiratória leve, moderada ou grave

[00243] O número de dias que os animais estavam doentes com sinais clínicos de doença respiratória nasal (pontuação> 0) foi significativamente menor no grupo vacinado comparado ao grupo de controle. Tabela 19. Efeito da vacinação sobre a duração da doença

*Significantemente abaixo do que o grupo de controle por teste de Kruskal-Wallis (P>0,05)

[00244] A imunização com ERBV também diminuiu a severidade da doença com um percentual menor de vacinações do que nos controles, demonstrando sinais clínicos leves e moderados da doença respiratória ao longo do estudo (Tabela 20). Tabela 20. Resumo da gravidade da doença com base na pontuação respiratória maxima

[00245] A imunização com ERBV foi encontrad a para reduzir significativamente a incidência de doenças, em 37,5%, 25%, e 12,5% nos grupos vacinados, 1, 2, e 3, respectivamente (Tabelas 21 e 22). Tabela 21. Efeito da vacinação na incidência da doença (estados de doença leve a moderada foram reunidos para os fins desta avaliação)

[00246] A vacinação também reduziu a projeção d e vírus a partir das narinas, indicando doença clínica menor nos cavalos vacinados, bem como demonstra a eficácia da vacina em prevenir a disseminação da doença infecciosa em outros cavalos potencialmente suscetíveis (Tabela 22). Tabela 22. Incidência de vírus positivo ao longo do tempo

Resultados e Discussão

[00247] Vacinas de ERBV inativado foram encontradas para serem capazes de imunizar um animal, para altos níveis de detecção de anticorpo. As vacinas reduziram a duração, gravidade e incidência da doença nos animais imunizados, desafiados com ERBV. A vacinação também reduziu a projeção de vírus infecciosos de cavalos doentes. Nenhuma reação adversa inaceitável, quer nos locais de injeção ou por manifestação de sinais de doença sistêmica foi observada. As vacinas são seguras e bem toleradas para a administração em espécies equinas sensíveis a rinite B, particularmente equídeos.

Exemplo 6

[00248] Este exemplo ilustra um modelo de cobaia para utilização em um ensaio de potência de liberação.

[00249] Vacina 5 (A/B-1) e Vacina 6 (A/B-2) foram, cada uma administradas a cobaias (cinco cobaias por vacina, 0,5 mL por vacinação intramuscular). Um tiro de vacinação de reforço foi administrado três semanas depois. Após 19 dias, os animais foram sangrados e o sangue foi analisado por meio de testes de neutralização sérica para ERAV e ERBV.Tabela 23. Vacina 5 (A/B-1) em batelada com 108,0 A/107.5 B, com adjuvante HRA-5

Tabela 24. Vacina 6 (A/B-2) em batelada com 108,0 A/107.5 B, com HRA- 3 + adjuvante de óleo de algodão

Exemplo 7

[00250] Este exemplo ilustra uma avaliação de desafio de vírus da Rinite A após vacinação com uma 2 dose vacina de Rinite equina A/rinopneumonite/vírus morto da influenza e proteção contra uma infecção respiratória da rinite equina A após vacinação com vacina com rinite A/rinopneumonite/vírus da Influenza morto .

Objetivo

[00251] O objetivo deste estudo de vacinação - desafio foi demonstrar a eficácia da vacina Rinite Equina A (No. de Acesso ATCC PTA 11828) para Rinite Equina A/rinopneumonite/vírus morto da Influenza. O desfecho primário utilizado para avaliar a eficácia da vacinação foi redução de doença respiratória causada por vírus de rinite equina A .

Material e Métodos

[00252] A vacina utilizada no presente estudo é uma vacina de rinite equino A/rinopneumonite/Influenza da presente invenção, vacina de Vírus Morto.

A. VÍRUS DA RINITE EQUINA A

[00253] A cepa do vírus da Rinite Equina original A (ERHA V) foi obtido a partir da Universidade de Guelph, Laboratório de Saúde Animal, como Isolado número 04-54188, e foi recebida em 9 de setembro de 2008, sob Import Permit No. 106.930. O vírus foi passado uma vez em células E-Vero tituladas para produzir um estoque pré-mestre altamente titulado e foi então diluído com meio de cultura celular para produzir o ”seed virus" mestre (MSV). O MSV é designado como ERhA V (0454188), MSV, lote, 091508A-diluído, 24Sept08, e foi aprovado para uso em Estabelecimento 597 pelo USDA em 18 de junho de 2010.

[00254] O antígeno viral da Rinite Equina A utilizado em vacinas avaliadas neste estudo era um vírus MSV 5 produzido na vigésima passagem das células E-Vero aprovadas por APHIS. Após o crescimento, os fluidos virais foram filtrados, formalina inativada, e concentrada de acordo com o esquema geral de produção de código de produto A522.20. Os fluidos virais inativados foram testados para vírus vivo residual após inativação. Os resultados foram satisfatórios. Fluidos virais inativados foram usados para formular a vacina a um nível de inclusão de antígeno de 107,5 TCID50/mL.1. Combo Rinite da Vacina Experimental Lote 122110

[00255] Combo da Rinite da vacina experimental Lote 122110 foi formulado com base em titulações de pré-inativação.

[00256] A vacina formulada final continha os seguintes ingredientes por dose de 1 ml:

B. Cavalos Experimentais 1. Descrição de Cavalos Experimentais

[00257] Quarenta (40) cavalos cross-draft de seis a oito meses de idade, adquiridos de Steve Waagen, Bottineau, Dakota do Norte foram microchipados ao chegarem em Equine Resources, LLC, Butler, Missouri e foram atribuídos a IVP (Investigational Veterinary Products) ou a Controle de Produto (CP) com base no gerador de números aleatórios depois de terem sido pré-selecionados para uma das titulações de rinite A < 01:04.

[00258] Durante todo o estudo, os cavalos foram alojados em um único campo grande com recipientes de alimentação comuns, bebedouros e suportes de feno. Após desafio, a cada animal foi atribuído um "código de celeiro" de dois dígitos pelo pessoal de laboratório que foi anexado a um cabresto usado durante todo o período pós-desafio e usado para identificar os cavalos quando os sinais clínicos e as amostras fossem tomadas a cada dia. Durante todos os dias de observação, os cavalos foram encurralados em propriedades e trabalhados de forma aleatória através de rampas de restrição individuais.Tabela 25 resume o projeto do estudo: Tabela 25: Projeto de Estudo

2. Vacinação/Desafio e Calendário de amostragem

[00259] Em 28 de Janeiro de 2011 e 18 de fevereiro de 2011, o Combo da Rinite de vacina experimental Lote 122110 foi administrado por via intramuscular, em um volume de dose de 1 ml em cada um dos 20 cavalos (grupo de vacinação, IVP). Vinte cavalos (grupo de controle, CP) receberam 1 mL de dose de adjuvante MEM-E (produto experimental 005) contendo os excipientes utilizados no Lote 122110 da vacina (adjuvante, gentamicina, anfotericina B e formaldeído) mas nenhum antígeno. Todos os cavalos foram desafiados por aerossol intranasal de vírus da Rinite Equina A virulento no Dia do Estudos 46 (25 dias após a vacinação de reforço) em 15 de março de 2011. Tabela 26 mostra o calendário de eventos. Tabela 26: Calendário de Eventos:

3. Inoculação de Desafio Intranasal de Cavalos a. Vírus de Desafio

[00260] O vírus de desafio da Rinite Equina A lote 112108A foi produzido em cultura de tecidos de células E-Vero. A titulação do vírus de desafio foi determinada como sendo 1 x 107,3 TCID50/mL no dia do desafio.

b. Método de Desafio Intranasal

[00261] Sedivet ® (cloridrato de romifidina), um sedativo e analgésico, foi administrado por via intravenosa a cada animal antes do desafio com uma dose de 50 μg/kg de peso corporal. O vírus de desafio foi administrado por via intranasal, como um aerossol produzido por um nebulizador em um AeroMask Equino (Trudell International Medical, Ontário, Canadá), mediante o seguinte método: Quatro mililitros de 107,3 TCID50/mL de vírus de desafio foram colocados no copo do nebulizador no dispositivo AeroMask. Um tubo de pressão foi montado a partir de um compressor de ar para a porta de entrada do nebulizador. O tubo de saída foi então inserido no AeroMask ligado à cabeça do cavalo sendo desafiado e cerca de 68,95 kPade pressão de ar foi aplicado à porta de entrada por três minutos. Durante este tempo, cerca de dois mililitros de fluido de vírus de desafio foi aerossolizado diretamente nas narinas do cavalo sendo desafiados. Vírus de desafio foi administrado aos cavalos não diluído, efetuando uma quantidade de desafio de 1 x 107,6 TCID50 em uma dose de 2 ml.

C. PARÂMETROS DE AVALIAÇÃO PRÉ E PÓS-DESAFIO 1. Avaliação de Exsudado nasal

[00262] Todas as observações de exsudado nasal foram feitas antes da coleta de exsudados de nasofaringe. No Dia do Desafio (D46) e 21 dias após o desafio, as passagens nasais e focinho de cada um dos 40 cavalos de controle e de vacinação foram analisadas e classificadas de acordo com a classificação e descrição de pontuação abaixo.

[00263] Os graus de pontuação de 0 a 6 foram atribuídos com base na gravidade da doença indicada por cada uma das seguintes classificações:

2. Secreção Ocular

[00264] Secreção ocular foi avaliada diariamente, no momento da avaliação do exsudado nasal. Pontuações de secreção ocular foram registradas como 0 = normal;

[00265] 1 = secreção ocular leve a moderada e 2 = secreção ocular grave.

3. Temperatura

[00266] Temperaturas retais diária foram registradas para cada um dos 40 cavalos de vacinação e de controle no Dia do Desafio e por 21 dias após o desafio, por meio de uma sonda de termômetro eletrônico calibrado (GSA Electronics). As temperaturas retais foram diariamente registradas em graus centígrados (°C).

4. Isolamento Viral Nasofaringeal

[00267] Em cada dia de teste de observação cada passagem nasal de cada cavalo vacinado e de controle foi limpa profundamente por meio de uma lança cirúrgica estéril WECK-CEL ® (Edward Weck and Company, Inc., Research Triangle Park, NC 27709) acoplada a um pipeta de plástico estéril longa de 11 polegadas. Na coleta, cada uma das duas lanças cirúrgicas foi imediatamente colocada em um tubo contendo 4 mL de meio de transporte refrigerado (E-199 suplementado com gentamicina, L-glutamina, 2X Pen/Strep, 2X Anfotericina B).

[00268] Para o isolamento de vírus, os tubos foram misturados, os exsudados removidos assepticamente, e o meio centrifugado a 1500 rpm durante 10 a 15 minutos para remover partículas. O meio foi filtrado através de um filtro de seringa de 0,2 μ antes da inoculação das células de cultura de tecidos. Após filtração, 4-6% de solução de sacarose estéril a 85% foi adicionado a cada amostra para o congelamento a - 80°C a fim de que todas as amostras fossem testadas simultaneamente.

[00269] No dia do ensaio, um mL do meio de transporte clarificado descongelado foi usado para inocular uma monocamada de células E- Vero de 2 cm2 de dois dias de idade cultivadas em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços, da qual o meio de crescimento foi assepticamente removido. Após a inoculação, o inóculo foi deixado adsorver sobre a monocamada de células durante pelo menos uma hora a 37°C em uma incubadora com uma atmosfera úmida contendo 5% de CO2. Após o período de adsorção, um adicional de 1 mL de meio de realimentação (E-199 contendo 2 mM de L-glutamina, gentamicina 2X Pen-Strep e 2X Anfotericina B) foi adicionado a cada poço. Após a adição de meios de realimentação as placas foram então incubadas a 37°C em uma incubadora de CO2. Cada cultura de tecidos de teste e de controle também foi examinada microscopicamente durante 7 dias para sinais de efeito citopático (CPE) típicos dos vírus de desafio de rinite equina A. Poços que eram negativas no final do período de observação de 7 dias foram subcultivados para células frescas e observados durante 7 dias adicionais.

Métodos de Avaliação Estatística

[00270] Os cavalos foram classificados com uma faixa de estado de doença respiratória, em uma base diária. A classificação para o estado da doença incluía combinar as avaliações nasal e ocular. O algoritmo usado é detalhado abaixo:

[00271] A influência da vacinação sobre a duração da doença (número de dias com doença pelo menos moderada) foi avaliada usando a estimativa (exato) de Hodges-Lehman (o procedimento Npar1way em SAS, SAS Institute, Cary NC).

[00272] A gravidade da doença foi avaliada comparando o estado máximo da doença entre os cavalos vacinados e os cavalos placebos. A fração mitigada e intervalos de confiança de 95% (CI, erro padrão assimétrico) foram calculados (o procedimento FREQ em SAS).

[00273] A temperatura retal e as titulações de neutralização sérica foram analisadas por análise de medidas repetidas apropriadas para dados contínuos (temperatura e titulações SN transformadas em log; ANOVA). Titulações SN foram assumidas como 0 se a titulação foi avaliada como < 4 709 e se a titulação foi avaliada como > 709. Titulações SN foram transformadas em log antes da análise. Resultados de camada de células brancas e exsudados nasais em cada dia foram comparados pelo teste exato de Fisher.

Resultados

[00274] Um cavalo, n° 39 (grupo IVP) morreu no dia 62 do estudo. Após a necropsia na Universidade de Missouri Faculdade de Medicina Veterinária, foi feito o diagnóstico de esofagite submucosa emfisematosa crônico-ativa, difusa, necrosante, gastrite e faringite com colônias bacterianas de cocobacilos intralesionais e material vegetal, bem como uma pleuropneumonia fibrinosupurativa grave difusa do pulmão. A explicação mais provável para esta morte sugere uma violação da mucosa anterior, tal como uma úlcera da mucosa na cárdia do estômago, o que permitiu a semeadura de material vegetal nos tecidos conjuntivos associados (relatório da patologia em anexo).

A. DURAÇÃO

[00275] A distribuição da duração da doença (Número de dias com doença respiratória moderada ou grave) em dias está resumida na Tabela 27. O número médio de dias de animais do grupo de placebo foi observado com doença foi de 14. No grupo vacinado, o número médio de dias com doença era de 1. A duração da doença foi significativamente inferior nos animais vacinados quando comparados com os de controles (Tabela 28, P <0,0001).Tabela 27: Resumo do efeito da vacinação sobre a duração da doença (Número de dias com doença respiratória moderada ou grave)

Tabela 28: Efeito d a vacinação sobre a duração d a doença (Número de dias com doença respiratória moderada ou grave)

Severidade

[00276] A distribuição da severidade da doença está resumida na Tabela 29. A severidade da doença foi significativamente menor nos cavalos vacinados, em comparação com os cavalos com placebo (Tabela 30; fração mitigada = 0.7550, IC = 0,5518, 0,9582 a 95%). Resultados individuais são apresentados na Tabela 31.

[00277] Na Tabela 31, os valores de cavalo # 39, que morreu no dia 62 do estudo são apresentados como 0 a partir do Dia 62 a 67, mas na análise apenas os valores > 1 são considerados, por conseguinte, não afetando o resultado. A duração é de 1 dia para o cavalo e a pontuação máxima é de 3. Tabela 29: Resumo da severidade da doença com base na pontuação máxima de secreção nasal

Tabela 30: Efeito da vacinação sobre a gravidade da doença

[00278] Significativamente menor do que o grupo placebo por teste de soma de classificação de Wilcoxon (P <0,05). Tabela 31: Resultados de animais individuais (regiões sombreadas denotam duração de doença moderada a grave)

B. TEMPERATURA RETAL

[00279] Os resultados da análise estatística estão resumidos na Tabela 32. A vacina pela interação diária foi estatisticamente significativa. Dentro de dias, análises são fornecidas na Tabela 33 (apêndice). Nos dias 3, 4 e 5, os cavalos no grupo vacinado tiveram temperaturas estatisticamente significativamente mais baixas do que aqueles no grupo de placebo. No Dia 20, os cavalos no grupo vacinado tiveram temperaturas significativamente maiores do que aqueles no grupo de placebo. No entanto, em todos os dias, qualquer uma das diferenças entre os grupos de tratamento não foram clinicamente significativas e apenas um cavalo (# 39) teve uma temperatura retal maior do que 39°C (102 ° F) em qualquer dia de estudo de desafio.Tabela 32: Resumo do efeito da vacinação na temperatura retal e titulações de neutralização sérica

1. Titulações de Neutralização Sérica

[00280] Os resultados da análise estatística estão resumidos na Tabela 32. Nos Dias 46 e 53, os cavalos no grupo vacinado apresentaram titulações significativamente mais elevadas do que aqueles no grupo de placebo. No Dia 67, os cavalos no grupo vacinado foram significativamente mais baixos do que aqueles no grupo de placebo.

Discussão

[00281] Este estudo foi conduzido para demonstrar a eficácia do componente de vírus da Rinite Equina A de uma vacina de vírus de rinite equina A inativado em combinação com vírus de herpesvírus equino tipo 1 e 4 e influenza equina. A vacinação foi dada em um formato de 2 doses, e o desafio de vírus da Rinite Equina A virulento foi realizado 25 dias após a vacinação de reforço. Cavalos vacinados e de controle tratados com placebo foram avaliados para verificar o efeito da vacinação na redução da severidade e duração da doença respiratória clínica. Os sinais clínicos, secreções nasais e camada de células brancas foram avaliados diariamente quanto à evidência de doença de rinite equina A e presença do vírus nos cavalos desafiados.

[00282] Os resultados deste estudo de desafio mostram uma redução estatisticamente significativa e clinicamente importante tanto da gravidade e quanto da duração da doença respiratória em vacinados após desafio. Como confirmado por análise de fração mitigada de pontuações de doenças respiratórias em cavalos vacinados com o IVP em comparação com os cavalos vacinados com o produto de controle, sinais moderados/graves de doença respiratória foram reduzidos de 75,5% (95% de intervalo de confiança 96% para 55%). Duração de doença moderada/grave também foi significativamente reduzida em 11 dias em cavalos vacinados, em comparação com cavalos de controle (intervalo de confiança de 95% duração da doença mais curta 14 dias a 8 dias). Além disso, a vacinação reduziu significativamente projeção vírus nasal ao longo dos sucessivos 5 dias de pico de projeção viral, e viremia também foi significativamente reduzida durante os 4 dias de pico de viremia durante o período de desafio. É importante ressaltar que o vírus foi recuperado a partir de amostras de camada de células brancas de cavalos de controle de um total de 54 vezes ao longo de 5 dias de estudo, em comparação com apenas 8 dias totais de viremia ao longo de 4 dias de estudo em cavalos vacinados.

Conclusões

[00283] Os dados deste estudo demonstram claramente que 2 x 1 ml de doses intramusculares de Vacina com vírus morto de Rinite Equina A/rinopneumonite/Influenza (Código do Produto TBD, não licenciado), administradas em intervalos de 21 dias entre as doses para cavalos, reduziram significativamente a severidade e a duração de doença respiratória causada por desafio virulento de rinite Equina A.

[00284] Os resultados do estudo ilustram o uso da vacina para a imunização de cavalos de seis meses de idade ou mais contra a doença respiratória causada pelo vírus da Rinite Equina A. Esses dados também estabelecem Vacina Lote 122110 como uma vacina de referência aceitável para testes de potência de séries subsequentes de rinite equina A/rinopneumonite/Vacina Influenza, vírus morto e vacina de Rinite Equina A, vírus morto (Código do Produto 1.522,21, não licenciado).

Claims (14)

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais cepas de Vírus da Rinite Equina B (ERBV) inativado.

2. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a cepa de ERBV cresce em cultura celular a 106 de TCID50/mL ou superior, ou, quando utilizada como uma vacina em cavalos com uma dose de 106 de TCID50 ou superior resulta em uma titulação sérica de pelo menos 1:112.

3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma ou mais cepas de vírus da Rinite Equina A (ERAV).

4. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a cepa de ERAV compreendendo uma sequência genômica cuja transcrição reversa tem a SEQ ID NO: 2, ou codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, em que a referida cepa de ERAV, antes de inativação ou atenuação, é ativa para infectar e se replicar em células hospedeiras.

5. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a cepa de ERBV compreende uma sequência genômica cuja transcrição reversa é a transcrição reversa da sequência genômica da cepa de ERBV tendo no. de acesso ATCC PTA-11829 ou codifica uma poliproteína com uma sequência de aminoácidos da poliproteína codificada pelo genoma da cepa de ERBV tendo no. de acesso ATCC PTA-11829, em que a dita cepa de ERBV, antes de inativação ou atenuação, é ativa para infectar e se replicar em células hospedeiras.

6. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a cepa de ERBV é a cepa 07-103042 (no. de acesso ATCC PTA-11829).

7. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é para uso na redução da incidência ou diminuição da gravidade dos sintomas clínicos associados com ou causados por ERBV em um animal ou em um rebanho de animais em necessidade da mesma.

8. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizada pelo fato de que é para uso na redução da incidência ou diminuição da gravidade dos sintomas clínicos associados com ou causados por ERAV.

9. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizada pelo fato de que a incidência de sintomas clínicos causados por um ou mais dos referidos agentes patogênicos em um rebanho de animais é reduzida, em comparação com um rebanho que não recebe a referida composição imunogênica.

10. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que a administração de pelo menos uma dose da referida composição imunogênica fornece uma duração de imunidade de pelo menos 12 meses contra um ou mais dos referidos agentes patogênicos.

11. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizada pelo fato de que a referida composição imunogênica é segura para uso em potros e cavalos de 4 meses de idade ou mais velhos.

12. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é para uso como um medicamento.

13. Método para produzir uma composição imunogênica, compreendendo uma ou mais cepas de ERAV ou ERBV inativado, caracterizado pelo fato de que compreende: a) infectar uma linhagem celular suscetível com ERBV; b) crescer a linhagem celular infectada em meio de crescimento, até que um efeito citopático (ECP) seja atingido; c) colher os meios; d) filtrar os meios para produzir um meio filtrado e e) colocar em contato os meios filtrados com um agente de inativação para obter o ERBV inativado.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o ERBV é a cepa 07-103042C No. de Acesso ATCC PTA-11829.

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