MX2013010125A

MX2013010125A - Vacuna de rinitis equina.

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Publication number: MX2013010125A
Application number: MX2013010125A
Authority: MX
Inventors: Phillip Wayne Hayes; Kristina J Hennessy; Laurent Viel; Andres Diaz-Mendez
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmed
Priority date: 2011-03-14
Filing date: 2012-03-12
Publication date: 2013-10-07
Also published as: NZ708320A; EP2686012B1; BR112013023354A2; ES2748555T3; BR122019023542B1; AU2012229192A1; AU2012229192B2; CA3018230A1; US9187730B2; EP2686012A2; CA2829226A1; EP2772266B1; TW201300537A; AU2017201526A1; AU2017201526B2; MA35303B1; EP2772266A1; NZ614147A; AU2017201526C1; CA2829226C

Abstract

La presente proporciona composiciones inmunógenas contra virus de rinitis equina, en particular virus de rinitis equina A y B y métodos para su uso y su preparación. Las composiciones inmunógenas, en modalidades alternativas, también incluyen otros agentes patógenos de equinos.

Description

VACUNA DE RINITIS EQUINA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las infecciones respiratorias virales equinas se asocian comúnmente con el movimiento de caballos y en todo el mundo se informa acerca de brotes de enfermedades respiratorias. La gripe equina 2 (AE2-H3N8) , el herpes virus equino 1 y 4 (EHV1/4) y los virus de rinitis equina A y B (ERAV y ERBV, respectivamente) están entre los virus más importantes aislado del tracto respiratorio superior durante los brotes de enfermedades respiratorias.

En particular, se informó del ERAV en la enfermedad respiratoria acuda febril en caballos (Li et al., J. Clin. icrobiol. 35:937-943; 1997, incorporada por referencia). De modo similar, un reciente estudio en Ontario halló que ERBV y ERAV eran muy prevalentes en la población equina (Díaz-Méndez et al., The Canadian Journal of Veterinary Research 74:271-278; 2010, incorporada por referencia). Los signos clínicos de una infección por ERAV son no específicos y son difíciles para diferenciar de otras infecciones virales respiratorias, incluyendo infecciones de gripe y herpes virus equinos. Las cepas no citopáticas de este virus fueron iden ificadas en brotes de enfermedades respiratorias en equinos (Li et al., J. Clin. Microbiol. 35:937-943; 1997) siendo un desafío la diagnosis. Más aún, ERAV y ERBV, siendo virus de ARN Ref.:243124 monocatenarios , tienen el potencial para mutación, no quedando clara la capacidad del sistema inmune de proteger a un animal contra la enfermedad causada por una una cepa dada de ERAV/ERBV.

Hay una necesidad de métodos y medicamentos para evitar enfermedades respiratorias o para reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados con estas enfermedades, incluyendo aquellas asociadas con virus de rinitis equina A y B.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los inventores determinaron que las composiciones inmunógenas que comprenden una o varias cepas de ERAV inactivados o vivos, atenuados, que son virulentos cuando están vivos y activos y no atenuados (es decir, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o incluso 100% de caballos seronegativos , cuando se exponen a propósito al virus, presenta una enfermedad respiratoria observable, en particular descarga nasal y/o ocular) , se pueden criar hasta altos títulos en cultivo para obtener una vacuna que es capaz de inducir altos títulos de anticuerpos séricos contra ERAV cuando se administra, por ejemplo, a un equino, por ejemplo que resulta en un título sérico de al menos 1:112 y con preferencia, al menos 1:200, 1:500, 1:750 o 1:1000. Además, las cepas crecen bien en cultivo y son altamente eficientes para producir, por ejemplo, un título de al menos 106 TCID50/mL, con mayor preferencia, al menos 107 TCID50/mL, 108 TCID50/mL o incluso 109 TCID50/mL. De modo similar, también se halló que las composiciones que comprenden una o varias cepas de ERBV inactivados, cuando están vivos y activos y no están atenuados, también son virulentos (tal como se definió con anterioridad para ERAV) crecen bien en cultivo, a un título de al menos 106 TCID50/mL, con mayor preferencia, 107 TCID50/mL, 108 TCID50/mL o incluso 109 TCID50/mL, para ser altamente eficientes para producir y para inducir altos títulos de anticuerpos séricos en animales después de la inmunización, por ejemplo, que resulta en un título sérico de al menos 1:120 y con preferencia, al menos 1:200, 1:500, 1:750 o 1:1000. Tanto las composiciones de ERAV y ERBV como sus combinaciones, son capaces de reducir la duración, la gravedad y la incidencia de enfermedad en un animal tales como un caballo que fue inmunizado con las composiciones y posteriormente estimulado.

Conforme a ello, la presente invención proporciona una composición inmunógena que comprende una o varias cepas de ERAV o ERBV atenuados inactivos o vivos, en donde la cepa de ERAV o la cepa de ERBV, antes de la inactivación o atenuación, causa una enfermedad respiratoria detectable en al menos 50% de caballos seronegativos expuestos a la cepa o crecidos en cultivo celular a 106 TCID50/mL o más, o, cuando se usa como una vacuna en equinos en una dosis de 106 TCID50 o más da como resultado una titulación sérica de al menos 1:112.

En ciertas modalidades, la cepa, cuando está viva y no atenuada, causa una enfermedad respiratoria detectable (por ejemplo, descarga detectable ocular y/o nasal) en al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o incluso 100% de caballos seronegativos después de la exposición a la cepa.

La cepa se puede cultivar en cultivo celular hasta un titulo de al menos 106 TCID50/mL, con mayor preferencia, 107 TCID50/mL, 108 TCID50/mL o incluso 109 TCID50/mL. La administración de una composición inmunógena que contiene la cepa da como resultado una titulación sérica de al menos 1:120 y con preferencia, de al menos 1:200, 1 -.500, 1:750 o 1:1000.

En las composiciones inmunógenas de la invención, una o varias cepas de ERAV o ERB incluyen, con preferencia, ERAV/ON/05 (número de acceso de ATCC PTA-11828) y/o cepa de ERBV 07-103042 (acceso a ATCC PTA-11829) . Además, las composiciones inmunógenas de la invención contienen al menos una cepa de ERAV que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene más del 95% de identidad con la SEQ ID NO : 2 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos con más del 95% de identidad con la SEQ ID NO: 3, en donde la cepa de ERAV, si no está inactivada, se activa para infectar y replicarse en células huésped. La composición inmunógena de la invención también puede incluir una cepa de ERAV que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO : 2 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Las composiciones inmunógenas de la invención también pueden incluir una cepa de ERBV que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene más del 95% de identidad con el transcrito inverso de la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene número de acceso ATCC PTA- 11829 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos con más del 95% de identidad con la poliproteína codificada por el genoma de la cepa de ERBV que tiene número de acceso ATCC PTA-11829, en donde la cepa ERBV, si no está inactivada, se activa para infectar y replicarse en células huésped. La cepa de ERBV también puede comprender una secuencia genómica que es la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene número de acceso ATCC PTA-11829 o codifica una poliproteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la poliproteína codificada por el genoma de la cepa de ERBV que tiene número de acceso ATCC PTA-11829.

En una modalidad específica, la composición inmunógena de la invención comprende el virus de rinitis equina A (ERAV, por sus siglas en inglés) y virus de rinitis equina B (ERBV por sus siglas en inglés) , en donde la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 y la cepa de ERBV has número de acceso de ATCC PTA-11829.

Además, la invención también incluye composiciones inmunógenas multivalentes que comprenden virus o antígenos inactivados o vivos atenuados de virus distintos de ERAV o ERBV que causan enfermedad en Equidae . En particular, la invención proporciona composiciones inmunógenas que comprenden, además de ERAV y/o ERBV inactivados o vivos, atenuados, al menos un antígeno o una cepa inactivada o viva, atenuada de herpes virus equino (EHV por sus siglas en inglés) , y, en modalidades particulares, el EHV está seleccionado del grupo que consiste en EHV-1 y EHV-4 y una combinación de ellos, más específicamente, el herpes virus equino está seleccionado del grupo que consiste en EHV-1, EHV-4, cepas depositadas bajo los números de acceso ATCC PTA-9525 y PTA-9526 y una combinación de ellos.

La invención también proporciona una composición inmunógena que, además de la cepa inactivada o viva, atenuada de ERAV y/o ERBV, es al menos una cepa inactivada o viva, atenuada de o al menos un antígeno de virus de gripe equina. En algunas modalidades, el virus de gripe equina está seleccionado del grupo que consiste en virus Clade 1, virus Clade 2, gripe A/Sudáfrica/2003 , gripe A/equino-2/Ohio/03 , gripe A/equino-2/New Market/2/93, gripe A/equino- 2/Kentucky/95 , gripe A/equino-2/Richmond/l/2007, cepas depositadas bajo los números de acceso ATCC PTA-9522, PTA-9523 y PTA-9524 y sus combinaciones. Las composiciones inmunógenas pueden incluir, además de ERAV y/o ERBV inactivados o vivos, atenuados, al menos un antígeno o una cepa inactivada o viva, atenuada de herpes virus equino y al menos un antígeno o una cepa inactivada o viva, atenuada de virus de gripe equina.

Las composiciones inmunógenas de la invención pueden incluir, además de ERAV y/o ERBV inactivados o vivos, atenuados, al menos un virus inactivado o vivo, atenuado o al menos un antígeno de una o varias cepas seleccionados del grupo que consiste en virus del Nilo occidental, virus de encefalomielitis equina oriental, virus de encefalomielitis equina occidental, virus de encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico y sus combinaciones. De modo alternativo, la composición inmunógena, además de ERAV y/o ERBV inactivados o vivos, atenuados, comprende una o varias cepas inactivadas o vivas, atenuadas o antígenos de cepas de encef lomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental, virus de encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico. En algunas modalidades, el virus del Nilo occidental es uno de las cepas seleccionados del grupo que consiste en Horse Origin 2005, depositado con el número de acceso ATCC PTA-9409; NAEE159, depositado en el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos aislado según el número de acceso 405330; NY2002Nassau; NY2002Clinton; NY2002Queens ; GA20021; GA20022; TX20021; TX20022; IN2002; NY2003Albany; NY2003Suffolk; NY2003Chatauqua ; CO20031; CO20032; TX2003; TX2003Harris4; TX2003Harris6 ; TX2003Harris7 ; TX2003HarrislO ; AZ2004; y TX2004Harris4 ; y combinación de ellos. En composiciones inmunógenas que comprenden virus de encefalomielitis equina occidental, la cepa puede ser la cepa depositada con el número de acceso ATCC PTA-9410. En las composiciones que comprenden virus de encefalomielitis equina venezolana, la cepa puede ser la cepa depositada con el número de acceso ATCC PTA-9411. En composiciones inmunógenas que comprenden virus de encefalomielitis equina oriental, la cepa puede ser la cepa depositada con el número de acceso ATCC PTA-9412. Y en composiciones inmunógenas que comprenden herpes virus equino, la cepa puede estar seleccionada del grupo que consiste en las cepas depositadas con los números de acceso ATCC PTA-9525 o PTA-9526 y sus combinaciones.

En algunas modalidades, una o varias de las cepas en la composición inmunógena están presentes en una cantidad de aproximadamente 102, °TCID50/mL a aproximadamente 1010'0TCID5o/mL por dosis. La composición también puede incluir un portador farmacéuticamente apropiado, tales como un diluyente, adyuvante, agente antimicrobiano, conservante, agente inactivante o combinación de ellos. En modalidades particulares, la composición inmunógena comprende un adyuvante, específicamente, HRA-5.

La invención también proporciona métodos para reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados o causados por el virus de rinitis equina A o virus de rinitis equina B en un animal o un rebaño de animales que comprende la etapa de administración de una composición inmunógena que comprende una o varias cepas de ERAV o ERBV atenuados inactivos o vivos, en donde la cepa de ERAV o la cepa de ERBV, antes de la inactivación o atenuación, causa una enfermedad respiratoria detectable en al menos el 50% de caballos seronegativos expuestos a la cepa o crecidos en cultivo celular a 106 TCID50/mL o más, o, cuando se usa como una vacuna en equinos en una dosis de 106 TCID50 o más da como resultado una titulación sérica de al menos 1:112. En particular, la una o varias cepas de ERAV o ERBV incluyen, con preferencia, ERAV/ON/05 (número de acceso de ATCC PTA-11828) y/o cepa de ERBV 07-103042 (acceso a ATCC PTA-11829) . Además, la cepa de ERAV puede comprender una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene más del 95% de identidad con la SEQ ID NO: 2 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos con más del 95% de identidad con la SEQ ID NO: 3, en donde la cepa de ERAV, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped o la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 2 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Además o de forma alternativa, la cepa de ERBV puede comprender una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene más del 95% de identidad con el transcrito inverso de la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene número de acceso ATCC PTA-11829 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos con más del 95% de identidad con la poliproteína codificada por el genoma de la cepa de ERBV que tiene número de acceso ATCC PTA-11829, en donde la cepa ERBV, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped. La cepa de ERBV también puede comprender una secuencia genómica que es la secuencia genómica de la cepa de ERBV qué tiene número de acceso ATCC PTA-11829 o codifica una poliproteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la poliproteína codificada por el genoma de la cepa de ERBV que tiene número de acceso ATCC PTA-11829.

Además de proporcionar métodos para reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados o causados por ERAV o ERBV en un animal o un rebaño de animales, los métodos de la invención también pueden reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados o causados por uno o varios de los agentes patógenos seleccionados del grupo que consiste en virus del Nilo occidental, virus de encefalomielitis equina oriental, virus de encefalomielitis equina occidental, virus de encefalomielitis equina venezolana y Clostridium tetani en un animal o un rebaño de animales por administración de una composición inmunógena de la invención. Los métodos de la invención también incluyen métodos de reducción de la incidencia o reducción de la gravedad de síntomas clínicos asociados o causados por ERAV o ERBV en un animal o un rebaño de animales junto con la reducción de la incidencia o reducción de la gravedad de síntomas clínicos asociados o causados por uno o varios de los agentes patógenos seleccionados del grupo que consiste en: virus de encefalomielitis equina oriental, virus de encefalomielitis equina occidental, virus de encefalomielitis equina venezolana, herpes virus equino y Clostridium tetani en un animal o un rebaño de animales por administración de una composición inmunógena de la invención.

La invención también proporciona métodos para reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados o causados por ERAV y/o ERBV as well as uno o varios de los agentes patógenos seleccionados del grupo que consiste en: virus del Nilo occidental, virus de encefalomielitis equina oriental, virus de encefalomielitis equina occidental, virus de encefalomielitis equina venezolana, herpes virus equino, virus de gripe equina y Clostridium tetani en un animal o un rebaño de animales, que comprende la etapa de administración de una composición inmunógena de la invención.

En conexión con los métodos de la invención, la incidencia de síntomas clínicos causados por uno o varios de los agentes patógenos en un rebaño de animales se reduce de aproximadamente 10% - 50% en comparación con un rebaño que no recibe la composición inmunógena . Los métodos de la invención, en modalidades particulares, proporcionan una duración de inmunidad de al menos 12 meses contra uno o varios de los agentes patógenos presentes en la composición inmunógena. En los métodos de la invención, la composición inmunógena se administra a un Equidae, con preferencia, un caballo. El esquema de posología puede incluir la administración de la composición inmunógena en una o varias dosis. Las dosis para los métodos de la invención se pueden formular en 0,5 mL a 2,5 mL de formas de dosificación. Con preferencia, los métodos de la invención administran composiciones inmunógenas que son seguras para usar en potros o caballos de 4 meses de edad o mayores.

La invención también proporciona métodos para producir una composición inmunógena que comprende una o varias cepas de virus de rinitis equina A inactivado (ERAV) o virus de rinitis equina B (ERBV) de la siguiente manera: infectar una línea celular susceptible con ERAV o ERBV; cultivar la línea celular infectada en medio de crecimiento hasta obtener un efecto citopático (CPE) ; cosechar el medio; filtrar el medio para obtener un medio filtrado; y poner el medio filtrado en contacto con un agente inactivante para obtener el ERAV o ERBV inactivado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1 es una representación gráfica de la proporción de virus positivo a través del tiempo.

Fig. 2 es una representación gráfica de la proporción de capa leucocitaria positiva a través del tiempo.

Fig. 3 es una representación gráfica de los títulos de neutralización séricos a través del tiempo.

Fig. 4 es una representación gráfica de los puntajes nasales medios a través del tiempo.

Fig. 5 es una representación gráfica de los puntajes oculares medios a través del tiempo.

Fig. 6 es una alineación ClustalW de una porción de virus de rinitis equina A ERAV/ON/05 (porción 5' UTR, SEQ ID NO: 1) con ERAV/PERV-1 (número de acceso: DQ272578 (SEQ ID NO: 14)). Inserciones de nucleótidos ERAV/ON/05 mostradas en negrita y las supresiones mostradas en sombreado.

Fig. 7 es un gráfico de puntaje clínico total promedio de grupos de control, infectados y reinfectados del Ejemplo 4.

Fig. 8 es un gráfico de temperatura corporal promedio de grupos de control, infectados y reinfectados del Ejemplo 4.

Fig. 9 es una Tabla que muestra títulos de virus de rinitis equina A (ERAV) y virus de rinitis equina B (ERBV) en grupos de control, infectados y reinfectados del Ejemplo 4. El ensayo de neutralización de virus (VN) se usó para medir títulos de anticuerpos en muestras séricas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los inventores determinaron que las composiciones inmunógenas que comprenden una o varias cepas de ERAV inactivados, que, cuando están vivas y activas, son virulentas (es decir, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o incluso 100% de caballos seronegativos , cuando se exponen a propósito al virus, presentes con una enfermedad respiratoria observable, en particular descarga nasal y/o ocular) , se pueden criar hasta altos títulos en cultivo para obtener una vacuna que es capaz de inducir altos títulos de anticuerpos séricos contra ERAV cuando se administra, por ejemplo, a un equino, por ejemplo que resulta en un título sérico de al menos 1:112 y con preferencia, al menos 1:200, 1:500, 1:750 o 1:1000. Además, las cepas crecidas bien en cultivo y son altamente eficientes para producir, por ejemplo, un título de al menos 106 TCID50/mL, con mayor preferencia, 107 TCID5o/mL, 108 TCID50/mL o incluso 109 TCID50/mL. De modo similar, también se halló que las composiciones que comprenden una o varias cepas de ERBV inactivado, cuando están vivas y activas y no están atenuadas, también son virulentas (tal como se definió con anterioridad para ERAV) , crecen bien en cultivo, a un título de al menos 106 TCID50/mL, con mayor preferencia, 107 TCIDso/mL, 108 TCID50/mL o incluso 109 TCID50/mL, para ser altamente eficiente para producir e inducir altos títulos de anticuerpos séricos en animales después de la inmunización, por ejemplo, que resulta en un título sérico de al menos 1:120 y con preferencia, al menos 1:200, 1:500, 1:750 o 1:1000. Tanto las composiciones de ERAV y ERBV como sus combinaciones, son capaces de reducir la duración, la gravedad y la incidencia de enfermedad en un animal tales como un caballo que fue inmunizado con las composiciones y posteriormente estimulado.

En una modalidad, se proporciona una composición inmunógena que comprende una o varias cepas de ERAV inactivados y/o ERBV. De modo alternativo, las cepas se pueden atenuar por medios de rutina y los virus atenuados vivos se pueden usar en la composición de vacuna. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene un 5'UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe inversamente, tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En ciertas modalidades, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 que tiene el número de acceso de ATCC PTA- 11828, depositado en la American Type Culture Collection el 14 de abril de 2011, que se incorpora en la presente por referencia.

En algunas modalidades, el ERBV es cepa 07-103042, que tiene el número de acceso a ATCC PTA-11829, depositado en la American Type Culture Collection el 14 de abril de 2011, que se incorpora en la presente por referencia. En algunas modalidades, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con número de acceso de ATCC PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) .

En una modalidad se proporciona una composición inmunógena que comprende ERAV y ERBV inactivados (o, de forma alternativa, vivos, atenuados). En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene un 5'UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe inversamente, tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (número de acceso de ATCC PTA-11828) . En algunas modalidades, el ERBV es una cepa que tiene el número de acceso a ATCC PTA-11829. En algunas modalidades, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con acceso a ATCC PTA- 11829 , cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) .

En una modalidad, junto con una o varias cepas inactivadas o vivas atenuadas de ERAV y/o ERBV, las composiciones inmunógenas proporcionadas en la presente también comprenden al menos un antígeno o una cepa adicional inactivada o viva atenuada de herpes virus equino (EHV) . En algunas modalidades , las composiciones comprenden al menos un antígeno de EHV. En algunas modalidades, el EHV está seleccionado del grupo que consiste en EHV-1, EHV-4, cepas depositadas bajo los números de acceso ATCC PTA-9525 y PTA-9526 y sus combinaciones. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene un 5 ' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe inversamente, tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 3. En algunas modalidades, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (número de acceso de ATCC PTA-11828) . En algunas modalidades, el ERBV es una cepa que tiene el número de acceso a ATCC PTA-11829. En algunas modalidades, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con número de acceso de ATCC PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) .

En una modalidad, junto con una o varias cepas inactivadas (o atenuadas) de ERAV y/o ERBV, las composiciones inmunógenas proporcionadas en la presente también comprenden al menos un antígeno o una cepa adicional inactivada o atenuada de virus de gripe equina (EIV, por sus siglas en inglés ) . En algunas modalidades, las composiciones comprenden al menos un antígeno de EIV. En algunas modalidades, el EIV está seleccionado del grupo que consiste ß? virus Clade 1, virus Clade 2, gripe A/Sudáfrica/2003 , gripe A/equino-2/Ohio/03 , gripe A/equino-2/New Market/2/93 , gripe A/equino-2/Kentucky/95 , gripe A/equino- 2/Richmond/l/2007 y sus combinaciones. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene un 5'UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicacion) . En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe inversamente, tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (acceso a ATCC No . PTA- 11828 ) . En algunas modalidades, el ERBV es una cepa que tiene el número de acceso a ATCC PTA-11829.

En algunas modalidades, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA- 11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con número de acceso de ATCC PTA- 11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación En una modalidad, junto con una o varias cepas • inactivadas (o vivas, atenuadas) de ERAV y/o ERBV, las composiciones inmunógenas proporcionadas en la presente también comprenden al menos un antígeno o una cepa adicional inactivada o viva atenuada de virus de gripe equina y al menos un antígeno o una cepa adicional inactivada o viva atenuada de herpes virus equino. En algunas modalidades, las composiciones comprenden al menos un antígeno de EHV y al menos un antígeno de EIV. En algunas modalidades, el EHV es EHV-1 o EHV-4 o una combinación de ellos y el EIV está seleccionado del grupo que consiste en virus Clade 1, virus Clade 2, gripe A/Sudáfrica/2003 , gripe A/equino-2/Ohio/03 , gripe A/equino-2/New Market/2/93, gripe A/equino-2/Kentucky/95 , gripe A/equino-2/Richmond/l/2007 y sus combinaciones. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene un 5 ' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe inversamente, tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (número de acceso de ATCC PTA- 11828) .

En algunas modalidades, el ERBV es una cepa que tiene el número de acceso a ATCC PTA-11829. En algunas modalidades, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con número de acceso de ATCC PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) .

En una modalidad, junto con una o varias cepas inactivadas (o vivas, atenuadas) de ERAV y/o ERBV, las composiciones inmunógenas proporcionadas en la presente también comprenden al menos un antígeno o virus inactivado de una o varias cepas adicionales seleccionadas del grupo que consiste en virus de gripe equina, herpes virus equino, virus del Nilo occidental, virus de encefalomielitis equina oriental, virus de encefalomielitis equina occidental y virus de encefalomielitis equina venezolana, y/o toxoide tetánico y sus combinaciones. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene un 5 ' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada está atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe inversamente, tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (número de acceso de ATCC PTA-11828) . En algunas modalidades, el ERBV es una cepa que tiene el número de acceso a ATCC PTA-11829. En algunas modalidades, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA- 11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con número de acceso de ATCC PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicacion) .

En una modalidad, junto con una o varias cepas inactivadas (o vivas, atenuadas) de ERAV y/o ERBV, las composiciones inmunógenas proporcionadas en la presente también comprenden al menos un virus inactivado o vivo, atenuado adicional de una cepa seleccionado del grupo que consiste en virus del Nilo occidental, virus de encefalomielitis equina oriental, virus de encefalomielitis equina occidental y virus de encefalomielitis equina venezolana, y/o toxoide tetánico y sus combinaciones. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene un 5 ' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe inversamente, tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (número de acceso de ATCC PTA-11828) . En algunas modalidades, el ERBV es una cepa que tiene el número de acceso a ATCC PTA-11829. En algunas modalidades, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con número de acceso de ATCC PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) .

En una modalidad, se proporciona un método de preparación de la composición inmunógena de la presente invención. El método en general comprende las etapas de combinación de un ERAV y/o ERBV inactivado o vivo, atenuado y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene un 5 ' UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe inversamente, tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (número de acceso de ATCC PTA-11828) . En algunas modalidades, el ERBV es una cepa que tiene el número de acceso a ATCC PTA-11829. En algunas modalidades, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con número de acceso de ATCC PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . En algunas modalidades, el método también comprende la etapa de adición de uno o varios antígenos de virus equinos adicionales o virus equinos inactivados o vivos, atenuados. En otra modalidad, el método también comprende la etapa de adición de un adyuvante apropiado a la composición.

En una modalidad, se proporciona un método para reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados o causados por ERAV o EBV en un animal o un rebaño de animales que comprende la administración de una composición inmunógena tal como se describe en la presente a un animal que lo necesita. En algunas modalidades, el animal es un caballo.

Las modalidades antes mencionadas también pueden contener una o varias de las siguientes características descritas más abajo.

En una modalidad, se proporciona una composición que comprende al menos una cepa de ERAV y/o ERBV inactivados (o, de forma alternativa, vivos, atenuados) y que también contiene varios o todos componentes antigénicos relevantes y proteínas de virus patógenos del Nilo occidental (W V, por sus siglas en inglés) o una cepa inactivada o viva, atenuada de WNV.

En una modalidad, se proporciona una composición de vacuna que comprende una o varias cepas de ERAV y/o ERBV inactivados (o vivos, atenuados) en combinación con una o varias cantidades inmunológicamente efectivas de componentes antigénicos o una o varias cepas inactivadas o vivas, atenuadas seleccionadas del grupo que consiste en virus del Nilo occidental (WNV, por sus siglas en inglés) , encefalomielitis equina venezolana (VEE, por sus siglas en inglés) , encefalomielitis equina oriental (EEE, por sus siglas en inglés) , encef lomielitis equina occidental (WEE, por sus siglas en inglés) , toxoide tetánico (T) , herpes virus equinos (EHV, por sus siglas en inglés) que incluyen los tipos 1 y 4, virus de gripe equina (EIV, por sus siglas en inglés) y sus combinaciones, junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Con preferencia, tales modalidades incluirán un adyuvante, tales como un carbómero y un portador farmacéuticamente aceptable. En otras modalidades, el adyuvante es HRA-5, un carbómero o petróleo.

En algunas modalidades, las composiciones también incluyen ERAV y/o ERBV inactivados o vivos, atenuados en combinación con las siguientes cepas virales o antígenos inactivados o vivos, atenuados y combinaciones de cepas y antígenos: virus del Nilo occidental; encefalomielitis equina oriental; encefalomielitis equina occidental; encefalomielitis equina venezolana; toxoide tetánico; encefalomielitis equina oriental y encefalomielitis equina occidental; encefalomielitis equina oriental y encefalomielitis equina venezolana; encefalomielitis equina oriental y toxoide tetánico; encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental y encefalomielitis equina venezolana; encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental y toxoide tetánico; encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico; encefalomielitis equina occidental y encefalomielitis equina venezolana; encefalomielitis equina occidental y toxoide tetánico; encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico; encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico; y encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico o sus antígenos o componentes antigénicos. Una combinación preferida de estas combinaciones especificadas incluye ERAV y/o. ERBV en combinación con antígenos o componentes antigénicos de virus inactivos de virus del Nilo occidental, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico. Otra combinación preferida incluye ERAV y/o ERBV en combinación con antígenos o componentes antigénicos de encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico. ERAV preferidos incluyen ERAV/ON/05 (número de acceso de ATCC PTA-11828) , cepa de ERAV que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene un 5'UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de- ERAV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . La cepa de ERAV también puede comprender una secuencia genómica que, cuando se transcribe inversamente, tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. El ERBV preferido es una cepa que tiene el número de acceso a ATCC PTA- 11829 o que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con número de acceso de ATCC PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . En cada una de tal combinación especificada, un adyuvante o combinación de adyuvantes se puede usar como tal, HRA-5, carbómero o con carbopol . La cepa de NJO de encefalomielitis equina oriental, la cepa Fleming de cepa de encefalomielitis equina occidental y la cepa TC-83 de la cepa encefalomielitis equina venezolana son todas cepas representativas de estos componentes dé vacuna.

Otras modalidades preferidas de la presente invención incluyen composiciones inmunógenas hechas usando cada una de las vacunas combinadas especificadas enumeradas con anterioridad y añadiendo antígenos o virus inactivados o atenuados de herpes virus equino, con preferencia, de tipo 1, de tipo 4 (EHV1 y/o EHV4) o sus combinaciones.

Otras variaciones más de cada una de las vacunas combinadas especificadas o composiciones inmunógenas enumeradas con anterioridad, incluyendo aquellas que incluyen EHV1 y/o EHV4 se pueden preparar añadiendo antígenos o virus inactivados o atenuados de virus de la gripe equina (EIV) . Las modalidades preferidas que incorporan virus de la gripe equina incluyen inactivados o vivos, atenuados: ERAV y/o ERBV y al menos una cepa inactivada o viva, atenuada de cada uno de WNV, virus de gripe equina y toxoide tetánico; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa inactivada o viva, atenuada de cada uno de WNV, virus de gripe equina, toxoide tetánico y encefalomielitis equina oriental; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, toxoide tetánico, encefalomielitis equina oriental y encefalomielitis equina occidental; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, toxoide tetánico, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental; y encefalomielitis equina venezolana; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina y encefalomielitis equina oriental; ERAV y/o ERBV y, al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina y encefalomielitis equina occidental; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina y encefalomielitis equina venezolana; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, encefalomielitis equina oriental y encefalomielitis equina occidental; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, encefalomielitis equina oriental y encefalomielitis equina venezolana; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, encefalomielitis equina occidental y encefalomielitis equina venezolana; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, encefalomielitis equina occidental y toxoide tetánico; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de W V, virus de gripe equina, encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, encefalomielitis equina venezolana, encefalomielitis equina occidental y toxoide tetánico; y ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, encefalomielitis equina venezolana, encefalomielitis equina oriental y toxoide tetánico, en donde las cepas antes mencionadas son inactivadas o vivas, atenuadas. En cada modalidad especificada, una o varias cepas inactivadas o vivas, atenuadas de virus de gripe equina pueden estar presentes . Las cepas preferidas de virus de gripe equina incluyen gripe A/equino-2/Ohio/03, gripe A/equino-2/New arket/2/93, gripe A/equino-2/Kentucky/95 y sus combinaciones. En todas las combinaciones enumeradas con anterioridad, se prefiere usar al menos dos cepas inactivadas o vivas, atenuadas de virus de gripe equina y con mayor preferencia aún, usar al menos 3 cepas de virus de gripe equina.

Las modalidades preferidas que incorporan herpes virus equino incluyen: ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, toxoide tetánico y herpes virus equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, toxoide tetánico, encefalomielitis equina oriental y herpes virus equino; ERAV y o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, toxoide tetánico, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental y herpes virus equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, toxoide tetánico, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental; encefalomielitis equina venezolana y herpes virus equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina y encefalomielitis equina oriental; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, encefalomielitis equina occidental y herpes virus equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, encefalomielitis equina venezolana y herpes virus equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental y ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina venezolana y herpes virus equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina venezolana y herpes virus equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, encefalomielitis equina occidental, toxoide tetánico y herpes virus equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, encefalomielitis equina venezolana, toxoide tetánico y herpes virus equino; ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de W V, virus de gripe equina, encefalomielitis equina venezolana, encefalomielitis equina occidental, toxoide tetánico y herpes virus equino; y ERAV y/o ERBV y al menos una cepa de cada uno de WNV, virus de gripe equina, encefalomielitis equina venezolana, encefalomielitis equina oriental, toxoide tetánico y herpes virus equino, en donde las cepas antes mencionadas son inactivadas o vivas, atenuadas. En todas las combinaciones enumeradas con anterioridad, se prefiere usar al menos dos cepas de inactivados o vivos, atenuados virus de gripe equina y con mayor preferencia aún, usar al menos 3 cepas de inactivados o vivos, atenuados virus de gripe equina. Además, en todas las combinaciones anteriores, se prefiere seleccionar la "al menos una" cepa de herpes virus equino del grupo que consiste en EHV-1 y EHV-4 inactivados. En algunas formas preferidas, las dos cepas inactivadas o vivas, atenuadas, EHV-1 y EHV-4, estarán incluidas en la composición inmunógena. En otras formas preferidas, EHV-1 será incluido. En una combinación preferida, la cepa de ERAV inactivados o vivos, atenuados es ERAV/ON/05, una cepa de ERAV que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene un 5'UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, que comprende un secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . La cepa de ERAV también puede comprender una secuencia genómica que, cuando se transcribe inversamente, tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En otras combinaciones preferidas, el ERBV es una cepa que tiene el número de acceso a ATCC PTA- 11828 o que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA- 11828 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con número de acceso de ATCC PTA-11828, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) .

Las composiciones inmunógenas tal como se describen en la presente se pueden administrar en cualquier dosis inmunógenamente efectiva. En una modalidad preferida, la composición inmunógena se administra como una dosis individual. Con preferencia, la dosis tiene un volumen total de entre aproximadamente 0,5 mL y aproximadamente 2,5 mL, con mayor preferencia, de entre aproximadamente 0,6 mL y aproximadamente 2,0 mL, con mayor preferencia aún, de entre aproximadamente 0,7 mL y aproximadamente 1,75 mL, con mayor preferencia aún, de entre aproximadamente 0,8 mL y aproximadamente 1,5 mL, con mayor preferencia aún, de entre aproximadamente 0,9 mL y aproximadamente 1,25 mL, prefiriendo una dosis individual de aproximadamente 1,0 mL la más preferida.

En otra modalidad, la composición inmunógena se administra con una primera dosis administrada antes de la administración de una segunda dosis (refuerzo) . Con preferencia, la segunda dosis se administra al menos aproximadamente 15 días después de la primera dosis. Con mayor preferencia, la segunda dosis se administra de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 28 días después de la primera dosis. Con mayor preferencia aún, la segunda dosis se administra al menos aproximadamente 17 días después de la primera dosis. Con mayor preferencia aún, la segunda dosis se administra de entre aproximadamente 17 y aproximadamente 25 días después de la primera dosis. Con mayor preferencia aún, la segunda dosis se administra al menos aproximadamente 19 días después de la primera dosis. Con mayor preferencia aún, la segunda dosis se administra de entre aproximadamente 19 y aproximadamente 23 días después de la primera dosis. Con máxima preferencia, la segunda dosis se administra al menos aproximadamente 21 días después de la primera dosis. En una modalidad preferida, tanto la primera como la segunda dosis de la composición inmunógena están en la misma cantidad. Con preferencia, cada dosis está en las cantidades preferidas especificadas con anterioridad, prefiriendo más una dosis de aproximadamente 1 mL para la primera y la segunda dosis. Además del régimen de la primera y la segunda dosis, una modalidad alternativa comprende otras dosis posteriores. Por ejemplo, se pueden administrar una tercera, cuarta o quinta dosis en estas modalidades. Con preferencia, los posteriores regímenes de tercera, cuarta y quinta dosis se administran en la misma cantidad que la primera dosis, siendo el marco temporal entre las dosis consistente con el tiempo entre la primera y la segunda dosis mencionadas con anterioridad, a pesar de que el tiempo también puede variar.

En una modalidad la composición inmunógena se administra en tres dosis. En algunas modalidades, las tres dosis se administran a intervalos de tres semanas.

En una modalidad que comprende ERAV, con preferencia, ERAV/ON/05, la cantidad de ERAV en la composición inmunógena es al menos de aproximadamente 102,0TCIDs0/dosis . Con mayor preferencia, la cantidad de ERAV es de entre aproximadamente 102,0TCID5o/dosis a aproximadamente 1010' °TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la cantidad de ERAV es de al menos aproximadamente 102,5TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la cantidad de ERAV es de entre aproximadamente l02'5TCID50/dosis a aproximadamente 109,5TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la cantidad de ERAV es al menos aproximadamente 103,0TCID5o/dosis . Con mayor preferencia aún, la cantidad de ERAV es de entre aproximadamente 103,0TCID5o/dosis a aproximadamente 109, °TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la cantidad de ERAV es al menos aproximadamente 103' TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la cantidad de ERAV es de entre aproximadamente 103'5TCID50/dosis a aproximadamente 109,0TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la cantidad de ERAV es de entre aproximadamente 106,5TCID50/dosis y aproximadamente 108'5TCIDSo/dosis . Con mayor preferencia, la cantidad de ERAV es de entre aproximadamente 107, °TCID50/dosis y aproximadamente 109'°TCID50/dosis . Los valores de TCID50 de un ERAV inactivado o atenuado o cualquier otra vacuna inactivada o atenuada se refieren en general al contenido viral en la vacuna final que, sin embargo, es equivalente al contenido viral calculado para la composición de vacuna antes de la inactivación de su virus. Con preferencia, la composición inmunógena de la presente invención estimula la neutralización sérica de anticuerpos en ERAV en un título de al menos 1:112, 1:300, 1:500, 1:700, 1:900, 1:1000 O 1:1500 En una modalidad que comprende ERBV, con preferencia, una cepa que tiene número de acceso a ATCC PTA-11829, la cantidad de ERBV es al menos de aproximadamente 102,0TCID5o/dosis . Con mayor preferencia, la cantidad de ERBV es de entre aproximadamente 102'0TCID50/dosis a aproximadamente 1010' °TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la cantidad de ERBV es al menos de aproximadamente 102,5TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la cantidad de ERBV es de entre aproximadamente 102,5TCID50/dosis a aproximadamente 109' 5TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la cantidad de ERBV es al menos de aproximadamente 103'0TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la cantidad de ERBV es de entre aproximadamente 103,0TCID50/dosis a aproximadamente 109'°TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la cantidad de ERBV es al menos aproximadamente 103,5TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la cantidad de ERBV es de entre aproximadamente 103,5TCID50/dosis a aproximadamente 109'°TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la cantidad de ERBV es de entre aproximadamente 106,5TCID50/dosis y aproximadamente 108,5TCID50/dosis . Con mayor preferencia, la cantidad de ERBV es de entre aproximadamente 107' °TCID50/dosis y aproximadamente 109'0TCID50/dosis . Los valores de TCID50 de un ERBV inactivado o cualquier otra vacuna inactivada se refieren en general al contenido viral en la vacuna final que, sin embargo, es equivalente al contenido viral calculado para la composición de vacuna antes de la inactivación de su virus. Con preferencia, la composición inmunógena de la presente invención estimula la neutralización sérica de anticuerpos a ERBV en un título de al menos 1:4 o más. En algunas modalidades, el título es de al menos 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11; 1:12, 1:13, 1:14 o 1:15 O más. En algunas modalidades, el título es al menos de 1:64, 1:256 o 1:512 o más. En algunas modalidades, el título es al menos de 1:1024 o más. En algunas modalidades, el título es al menos de 1:2048, 1:1536, 1:3072, 1:4096, 1:6144, 1:8192, 1:12288 o 1:32769 o más. En algunas modalidades, el título es no más de 1:300, 1:1050, 1:32000, 1:70000 o 1:140000.

En una modalidad, en cada dosis de una modalidad de la presente invención que comprende uno o varios antígenos equinos adicionales, la cantidad de encefalomielitis equina oriental o encefalomielitis equina venezolana en cualquier dosis es, con preferencia, de al menos aproximadamente 105' 5TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la dosis es de entre aproximadamente 105,5TCID50/dosis y aproximadamente 109,5TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la dosis es de al menos aproximadamente 106' °TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la dosis es de entre aproximadamente 106' °TCID50/dosis y aproximadamente 109' °TCIDs0/dosis . Con mayor preferencia aún, la dosis es de al menos aproximadamente 106, 5TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la dosis es de entre aproximadamente 106'5TCID50/dosis y aproximadamente 109'5TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la dosis es de al menos aproximadamente 107'0TCID50/dosis . Con máxima preferencia, la dosis es de entre aproximadamente 106,7TCID50 y aproximadamente 109,2TCID50/dosis .

En una modalidad que comprende WNV o antígeno inactivado o muerto, la cantidad de WNV o antígeno es de al menos aproximadamente 102,0TCID50/dosis . Con mayor preferencia, el WNV o antígeno es de entre aproximadamente 102, °TCIDS0/dosis a aproximadamente 1010'0TCID5o/dosis . Con mayor preferencia aún, el WNV o antígeno es al menos aproximadamente 102,5TCID5o/dosis . Con mayor preferencia aún, el WNV o antígeno es de entre aproximadamente 102,5TCID50/dosis a aproximadamente 109' 5TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, el WNV o antígeno es al menos aproximadamente 103'°TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, el WNV o antígeno es de entre aproximadamente 103'°TCID5o/dosis a aproximadamente 109,0TCID5o/dosis . Con mayor preferencia aún, el WNV o antígeno es al menos aproximadamente 103'5TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, el WNV o antígeno es de entre aproximadamente 103,5TCID50/dosis a aproximadamente i09'°TCID5o/dosis . Con máxima preferencia, el WNV o antígeno es de entre aproximadamente 107,0TCID5o/dosis y aproximadamente 109'°TCID50/dosis . Los valores de TCID50 de una vacuna de WNV inactivada o cualquier otra vacuna inactivada se refieren en general al contenido de antígeno en la vacuna final que, sin embargo, es equivalente al contenido de antígeno calculado para la composición de vacuna antes de la inactivación de su antígeno. Con preferencia, la composición inmunógena de la presente invención estimula la neutralización sérica de anticuerpos a WNV en un título de al menos 1:4 o más. En algunas modalidades, el título es de al menos 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11; 1:12, 1:13, 1:14 o 1:15 o más. En algunas modalidades, el título es no más de 1:300, 1:1050, 1:32000, 1:70000 o 1:140000. En una modalidad preferida, en cada dosis de una modalidad de la presente invención que comprende antígeno equino adicional, la cantidad de encefalomielitis equina oriental o encefalomielitis equina venezolana en cualquier dosis es, con preferencia, de al menos aproximadamente 105,5TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la dosis es de entre aproximadamente 105,5TCID50/dosis y aproximadamente 109' 5TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la dosis es de al menos aproximadamente 106,0TCID5o/dosis . Con mayor preferencia aún, la dosis es de entre aproximadamente 106,0TCID50/dosis y aproximadamente 109' °TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la dosis es de al menos aproximadamente l06,5TCID50/dosis . Con mayor preferencia aún, la dosis es de entre aproximadamente 106,5TCID50/dosis y aproximadamente 109,5TCID5o/dosis . Con mayor preferencia aún, la dosis es de al menos aproximadamente 107' °TCID50/dosis . Con máxima preferencia, la dosis es de entre aproximadamente 106,7TCID50 y aproximadamente 109,2TCID50/dosis .

Con preferencia, el antígeno de encefalomielitis equina occidental, cuando está presente en la composición de la presente invención, está en una cantidad de al menos aproximadamente 106,2PFU/mL. Con mayor preferencia aún, la cantidad es de entre aproximadamente 106,2PFU/mL y aproximadamente 1010,2PFU/mL. Con mayor preferencia aún, la cantidad es de al menos aproximadamente 106,7PFU/mL. Con mayor preferencia aún, la cantidad es de entre aproximadamente 106,5PFU/mL y aproximadamente 109,7PFU/mL. Con mayor preferencia aún, la cantidad es de al menos aproximadamente 107,2PFU/mL. Con mayor preferencia aún, la cantidad es de entre aproximadamente 10 ,2PFU/mL y aproximadamente 109,2PFU/mL. Con mayor preferencia aún, la cantidad es al menos aproximadamente 107,7PFU/mL, siendo entre aproximadamente 106,5 PFU/dosis y aproximadamente 109,0PFU/mL la más preferida.

En otra modalidad preferida, la cantidad de toxoide tetánico, si está presente en la composición de la presente invención, está en una cantidad de al menos aproximadamente 3 CPU, con mayor preferencia, de entre aproximadamente 3 CPU y aproximadamente 20 CPU, con mayor preferencia aún, al menos aproximadamente 4 CPU y con máxima preferencia, de al menos aproximadamente 5 CPU pero no más de aproximadamente 20 CPU.

En una modalidad alternativa, cuando está presente una o varias cepas de virus de gripe equina, la cantidad de gripe equina presente en la composición está en una cantidad de al menos aproximadamente 105,0 TCID50/mL. Con mayor preferencia, la gripe equina está en una cantidad de entre aproximadamente 105,0 TCID50/mL a aproximadamente 109,0 TCID50/mL, y, con mayor preferencia, al menos aproximadamente 106,0 TCID50/mL. Con mayor preferencia aún, la cantidad es de entre aproximadamente 106,0 TCID50/mL a aproximadamente 108,0 TCID50/mL y, con mayor preferencia, la cantidad es de al menos aproximadamente 106'5 TCID50/mL. Con mayor preferencia aún, la cantidad es de entre aproximadamente 106'5 TCID50/mL a aproximadamente 107'5 TCID50/mL, siendo la cantidad más preferida entre aproximadamente 106,7 TCID50/mL a aproximadamente 107'3 TCID50/mL.

En una modalidad que comprende herpes virus equino, la cantidad de herpes virus equino en cada dosis es de al menos aproximadamente 106,0 TCID50/mL. Con mayor preferencia, el herpes virus equino está presente en la composición en una cantidad de entre aproximadamente 106,0 TCID50/mL a aproximadamente 109'5 TCID50/mL y, con mayor preferencia, en una cantidad de aproximadamente 107,0 TCID50/mL. Con mayor preferencia aún, el herpes virus equino está presente en una cantidad de entre aproximadamente 107,5 TCID50/mL a aproximadamente 109'0 TCID50/mL y, con mayor preferencia, en una cantidad de aproximadamente 108,0 TCID50/mL. Con mayor preferencia aún, el herpes virus equino está presente en una cantidad de de entre aproximadamente 108,0 TCID50/mL a aproximadamente 109,0 TCID50/mL y, con máxima preferencia, en una cantidad de aproximadamente io8,50 TCID50/mL.

En otra modalidad preferida, se provee una composición de vacuna que comprende las cepas de ERAV y/o ERBV cronológicamente contemporáneas y epidemiológicamente prevalentes . Con preferencia, la composición comprende ERAV/ON/05 y/o una cepa de ERBV que tiene el número de acceso a ATCC PTA-11829. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene un 5'UTR que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe inversamente, tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, el ERBV es una cepa que tiene el número de acceso a ATCC PTA-11829. En algunas modalidades, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con número de acceso de ATCC PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . Tal composición mejorará en general la eficacia de la composición.

La presente invención proporciona además un método de reducción de la incidencia y/o gravedad de los signos clínicos asociados con la infección por ERAV y/o ERBV en un animal, con preferencia, un caballo. Estos métodos en general comprenden la etapa de administración de una composición de vacuna que comprende una cepa inactivada o viva, atenuada de un ERAV y/o ERBV y un portador farmacéuticamente aceptable. En modalidades particulares, el ERAV es ERAV/ON/05 o la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene un 5'UTR que, comprende SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe inversamente, tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, el ERBV es una cepa que tiene el número de acceso a ATCC PTA-11829. En algunas modalidades, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con número de acceso de ATCC PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . En algunas modalidades preferidas, se añade un adyuvante, en particular HRA-5, a la composición y en otras formas preferidas, no se proporciona adyuvante.

En una modalidad preferida alternativa, el método comprende la administración de una composición de vacuna que comprende una o varias cepas inactivadas o vivas, atenuadas de ERAV y/o ERBV en combinación con cantidades inmunológicamente efectivas de componentes antigénicos o cepas inactivadas de otros agentes patógenos equinos. Con preferencia, la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 (número de acceso de ATCC PTA-11828) y la cepa de ERBV tiene el número de acceso a ATCC PTA-11829. En algunas de tales modalidades, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene un 5'UTR que comprende SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y, cuando no están inactivados o vivos, atenuados, son activos para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe inversamente, tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, el ERBV es una cepa que tiene el número de acceso a ATCC PTA-11829. En algunas modalidades, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con número de acceso de ATCC PTA-11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) .

En algunas modalidades del método, los agentes patógenos en combinación con las cepas de ERAV y/o ERBV, están seleccionados del grupo que consiste en antígenos o cepas inactivadas o atenuadas de EHV y EIV y sus combinaciones . En algunas modalidades, los agentes patógenos son antígenos. En algunas modalidades, el EHV es EHV-1 o EHV-4 o una combinación de ellos. En otras modalidades el EIV está seleccionado del grupo que consiste en virus Clade 1, virus Clade 2, gripe A/Sudáfrica/2003 , gripe A/equino-2/Ohio/03 , gripe A/equino-2/New Market/2/93, gripe A/equino-2/Kentucky/95 , gripe A/equino-2/Richmond/l/2007 y sus combinaciones .

En otras modalidades más del método, los agentes patógenos en combinación con las cepas de ERAV y/o ERBV, están seleccionados del grupo que consiste en antígenos o cepas inactivadas o atenuadas de WNV, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental y encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico y sus combinaciones siendo de mayor preferencia aquellas combinaciones descritas con anterioridad. En otra modalidad preferida, la vacuna de la presente invención se combina con un adyuvante apropiado y/o portador farmacéuticamente aceptable .

La presente invención proporciona la reducción de la incidencia y/o la gravedad de síntomas clínicos asociados con la infección de ERAV y/o ERBV en un rebaño. Con preferencia, la gravedad y/o incidencia de síntomas clínicos en animales que reciben la composición inmunógena de la presente invención se redicen al menos el 10% en comparación con animales que no reciben tal administración cuando ambos grupos (animales que reciben y animales que no reciben la composición) se estimulan o se exponen a la infección por ERAV y/o ERBV. Con mayor preferencia, la incidencia o la gravedad se reduce al menos 20%, con mayor preferencia aún, al menos 30%, con mayor preferencia aún, al menos 40%, con mayor preferencia aún, al menos 50%, con mayor preferencia aún, al menos 60%, con mayor preferencia aún, al menos 70%, con mayor preferencia aún, al menos 80%, con mayor preferencia aún, al menos 90%, con mayor preferencia aún, al menos 95% y con máxima preferencia, al menos 100%, en donde los animales que reciben la composición de la presente invención no exhiben síntomas clínicos o de forma alternativa exhiben síntomas clínicos de gravedad reducida. Ventajosamente, la presente invención también proporciona protección de cepas heterologas (respecto de la cepa usada en la composición) de agentes patógenos.

La presente invención también proporciona un método de estimulación de neutralización sérica o hemaglutinación sérica de anticuerpos a un agente patógeno seleccionado del grupo que consiste en ERAV, ERBV, WNV, WEE, VEE, EEE, EHV, EIV y sus combinaciones por administración de una composición de conformidad con la presente invención descrita en la presente. En modalidades particulares, elERAV es ERAV/ON/05 o la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene un 5'UTR que comprende SEQ ID NO : 1. En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERAV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, cuya poliproteína contiene proteínas de ERAV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . En algunas modalidades, la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica que, cuando se transcribe inversamente, tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o que codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, el ERBV es una cepa que tiene el número de acceso a ATCC PTA-11829. En algunas modalidades, la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos del transcrito inverso del genoma de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11829 y, cuando no está inactivada o atenuada, se activa para infectar y replicarse en células huésped y/o codifica proteínas de ERBV funcionales o que codifica una poliproteína que tiene una secuencia de aminoácidos con más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98% o más del 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la poliproteína de la cepa con número de acceso de ATCC PTA- 11829, cuya poliproteína contiene proteínas de ERBV funcionales (es decir, activas en infección viral y replicación) . Con preferencia, las composiciones de la presente invención estimulan la neutralización sérica de anticuerpos a ERAV y/o ERBV en un título de al menos 1:112, 1:120, 1:300, 1:500, 1:1000 o 1:1024 o más.

La composición inmunógena de la presente invención proporciona una duración extendida de inmunidad contra todas las cepas presentes en la vacuna. Con preferencia, la duración de la inmunidad contra ERAV y/o ERBV es de al menos un mes, con mayor preferencia, la duración de la inmunidad es de al menos dos meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 4-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 6-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses y con máxima preferencia, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses.

La composición inmunógena de la presente invención también proporciona una duración extendida de inmunidad contra todos los antígenos presentes en la vacuna. Con preferencia, la duración de la inmunidad contra el virus del Nilo Occidental es de al menos un mes, con mayor preferencia, la duración de la inmunidad es de al menos dos meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 4-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 6-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses y con máxima preferencia, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses .

Con preferencia, la duración de la inmunidad contra EIV es de al menos un mes, con mayor preferencia, la duración de la inmunidad es de al menos dos meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 4- 24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 6 -24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses y con máxima preferencia, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses.

Con preferencia, la duración de la inmunidad contra EHV es de al menos un mes, con mayor preferencia, la duración de la inmunidad es de al menos dos meses, con mayor preferencia aún, . la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 4- 24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 6 -24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses y con máxima preferencia, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses. con preferencia, la duración de la inmunidad contra encefalomielitis equina occidental es de al menos un mes, con mayor preferencia, la duración de la inmunidad es de al menos dos meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 4- 24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 6 -24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses y con máxima preferencia, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses.

Con preferencia, la duración de la inmunidad contra encefalomielitis equina oriental es de al menos un mes, con mayor preferencia, la duración de la inmunidad es de al menos dos meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 4- 24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 6 -24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de ai menos 9-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses y con máxima preferencia, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses.

Con preferencia, la duración de la inmunidad contra encefalomielitis equina venezolana es de al menos un mes, con mayor preferencia, la duración de la inmunidad es de al menos dos meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 4- 24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 6 -24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad" es de al menos 10-24 meses y con máxima preferencia, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses .

Con preferencia, la duración de la inmunidad contra toxoide tetánico es de al menos un mes, con mayor preferencia, la duración de la inmunidad es de al menos dos meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 3 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 4- 24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 6 -24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 7-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 8-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 9-24 meses, con mayor preferencia aún, la duración de la inmunidad es de al menos 10-24 meses y con máxima preferencia, la duración de la inmunidad es de al menos 12-24 meses.

Con preferencia, la duración de la inmunidad de al menos 12 meses también se refiere a cualquier combinación de antígenos que forman la composición inmunógena de la presente invención.

En una modalidad que comprende un ERAV y/o ERBV inactivado (o, de forma alternativa vivo atenuado) tal como se describe en la presente, la composición inmunógena mejora la muda de ERAV y/o ERBV infecciosos para evitar la dispersión del virus a otros animales susceptibles. En algunas modalidades, las composiciones evitan la muda del virus.

En una modalidad que comprende antígeno de EIV y/o EHV, tal como se describió con anterioridad, la composición inmunógena mejora la muda de EIV o EHV infecciosos para evitar la dispersión del virus a otros animales susceptibles.

En una modalidad, las composiciones de conformidad con la presente invención descritas en la presente superan la interferencia de inmunidad materna pasivamente adquirida y estimulan la inmunidad activa y una reducción en la incidencia o la gravedad de signos clínicos de infección de EIV en animales vacunados contra EIV.

En una modalidad de la presente invención, una composición inmunógena que comprende ERAV y/o ERBV, VEE, WEE, EEE, tétanos, W V, rinopneumonitis equina y gripe equina, tal como se describen en al presente, demustra la eficacia contra ERAV, ERBV, VEE, WEE, EEE, tétanos, WNV, rinopneumonitis equina y gripe equina después de la administración de conformidad con la presente invención. Con preferencia, tal composición incluirá también un adyuvante, con preferencia, HRA-5, petróleo y/o un carbómero y un portador farmacéuticamente aceptable. En formas preferidas, la composición se administrará en una monodosis de 1 mL. En algunas modalidades, la composición se administra en dos dosis o con preferencia, tres dosis, cada dosis separada por 1 , 2 , 3 y 4 semanas .

Cada una de las composiciones inmunógenas descritas en la presente que incluyen ERAV, en particular ERAV/ON/05 (números de acceso a ATCC: PTA-11828) y otras cepas tal como se describieron con anterioridad, y/o ERBV, en particular una cepa de ERBV con número de acceso a ATCC PTA-11829 u otras tal como se describieron también más arriba, se pueden administrar tal como se describió para reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados con ERAV y/o ERBV, tales como pirexia, elevaciones en la temperatura, mayores ruidos pulmonares, linofoadenopatía, descarga nasal, descarga ocular, faringitis, edema de extremidades, tos y en el caso de ERAV, mayor incidencia de aborto en yeguas preñadas. En algunos aspectos, las composiciones reducen la cantidad o la longitud de la descarga nasal u ocular o la duración del tiempo que presentan tales síntomas. En algunos aspectos, los animales inoculados con las composiciones no muestran síntomas clínicos de infección de ERAV y/o ERBV una semana o más tiempo después de la exposición a ERAV y/o ERBV. En otros aspectos, los animales inoculados con las composiciones no muestran síntomas clínicos de infección de ERAV y/o ERBV cuando se exponen a ERAV y/o ERBV. Los síntomas clínicos de ERAV y ERBV se pueden calificar de conformidad con la Tabla 3 en el Ejemplo 2, Tabla 14 en el Ejemplo 4 o la Tabla 17 en el Ejemplo 5.

Cada una de las composiciones inmunógenas descritas en la presente que incluyen antígeno EIV o EIV inactivado y se pueden administrar tal como se describe, de modo que reduzcan la incidencia o reduzcan la gravedad de los síntomas clínicos asociados con el virus de gripe equina.

La presente invención también proporciona un método para reducir la incidencia o la reducción de la gravedad de síntomas clínicos asociados con herpes virus equino que comprende la etapa de administración de cualquiera de las composiciones inmunógenas como se describió con anterioridad que contienen antígeno de EHV o EHV inactivado o atenuado a un animal .

La presente invención también proporciona un método para reducir la incidencia de síntomas clínicos asociados con virus del Nilo occidental que comprende la etapa de administración de cualquiera de las composiciones inmunógenas que incluyen antígeno de WNV o WNV inactivado o atenuado, tal como se describió en la presente, a un animal.

La presente invención también proporciona un método para reducir la incidencia de síntomas clínicos asociados con virus de gripe equina que comprende la etapa de administración de cualquiera de las composiciones inmunógenas como se describió con anterioridad, que incluyen un antígeno de EIV o EIV inactivado o atenuado, a un animal.

La presente invención también proporciona un método para reducir la incidencia de síntomas clínicos asociados con herpes virus equino que comprende la etapa de administración de cualquiera de las composiciones inmunógenas como se describió con anterioridad que incluyen un antígeno de EHV o EHV inactivado o atenuado, a un animal.

La presente invención proporciona un método de reducción de la incidencia de infección viral en un rebaño que comprende la etapa de administración de cualquiera de las composiciones inmunógenas como se describió con anterioridad a un animal, en donde la reducción de incidencia de infección, en comparación con rebaños que no reciben la composición inmunógena, es de aproximadamente 10% a aproximadamente 50% de reducción. En una modalidad, las composiciones provistas en la presente reducen la infección por ERAV del 10% al 50%. En otras modalidades, las composiciones provistas en la presente reducen la infección por ERBV del 10% al 50%.

La presente invención también proporciona un método de reducción de la incidencia de síntomas clínicos asociados con virus de gripe equina que comprende la etapa de administración de cualquiera de las composiciones inmunógenas como se describió con anterioridad a un animal, en donde la reducción en signos clínicos, en comparación con animales que no recibe la composición inmunógena, es al menos una reducción del 10% en signos clínicos.

La presente invención proporciona un método de reducción de la incidencia y la gravedad de síntomas clínicos de ERAV o ERBV en un rebaño, en donde los síntomas clínicos están seleccionados del grupo que consiste en pirexia, aumentos de temperatura, mayores ruidos pulmonares, linfoadenopatía, descarga nasal, descarga ocular, faringitis, tos, edema de extremidades y en el caso de ERAV, mayor incidencia de aborto en yeguas preñadas .

La presente invención proporciona un método de reducción de la incidencia y la gravedad de síntomas clínicos de EHV en un rebaño, en donde los síntomas clínicos están seleccionados ¿el grupo que consiste en enfermedad respiratoria, aborto, complicaciones reproductivas, enfermedad neurológica, enfermedad del sistema nervioso central y sus combinaciones.

La presente invención proporciona un método para reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados con herpes virus equino que comprende la etapa de administración de cualquiera de las composiciones inmunógenas como se describe en la presente, que incluye un antígeno de EHV o EHV inactivado o atenuado, a un animal.

La presente invención proporciona un método para reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados con virus de gripe equina en un rebaño, que comprende la etapa de administración de cualquiera de las composiciones inmunógenas como se describe en la presente, que incluyen un antígeno de EIV o EIV inactivado o atenuado, a un animal.

La presente invención proporciona un método para reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados con virus del Nilo occidental en un rebaño, que comprende la etapa de administración de cualquiera de las composiciones inmunógenas como se describe en la presente, que incluyen un antígeno de WNV o WNV inactivado o atenuado, a un animal .

La presente invención proporciona un método para reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados con encefalomielitis equina oriental en un rebaño, qUe comprende la etapa de administración de cualquiera de las composiciones inmunógenas como se describe en la presente que incluyen un antígeno de virus EEE o un virus EEE inactivado o atenuado, a un animal.

La presente invención también proporciona un método para reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados con encefalomielitis equina occidental en un rebaño, que comprende la etapa de administración de cualquiera de las composiciones inmunógenas como se describe en la presente, que incluyen un antígeno de virus WEE o un virus WEE inactivado o atenuado, a un animal.

La presente invención también proporciona un método para reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados con encefalomielitis equina venezolana en un rebaño, que comprende la etapa de administración de cualquiera de las composiciones inmunógenas como se describe en la presente, que incluye un antígeno de virus VEE o un virus VEE inactivado o atenuado, a un animal.

Las modalidades antes mencionadas se pueden usar en una terapia combinada o como parte de un programa de inmunización en combinación con otros agentes inmunógenas y vacunas. En una modalidad, las composiciones provistas en la presente se usan en combinación con los agentes inmunogénicos y vacunas descritos en el documento WO 2010/025469, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.

La presente invención también proporciona un método de preparación de cualquiera de las composiciones inmunógenas tal como se describió con anterioridad y en la presente, que comprende las etapas de combinación de un ERAV o ERBV atenuado inactivo o vivo con un portador farmacéuticamente apropiado. En formas preferidas, este método también comprende la etapa de adición de uno o varios antígenos de virus equinos o virus inactivado o atenuados. Un grupo preferido de antígenos y virus de equinos está seleccionado del grupo que consiste en virus del Nilo occidental, encefalomielitis equina occidental, encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina venezolana, EHV y EIV y toxoide tetánico y sus combinaciones. En algunas formas preferidas, los métodos descritos en la presente también pueden comprender una etapa de filtración, en donde el producto final está en una forma más pura.

"Aproximadamente" se refiere a +10% de la cantidad especificada .

"Animales" tal como se usa en la presente incluye animales domesticados incluyendo perros y animales con pezuñas incluyendo equinos y específicamente, caballos. En algunas modalidades, el término también se refiere a un ser humano.

"Adyuvantes", tal como se usa en la presente, pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas, por ejemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA) , GPI-0100 (Galénica Pharmaceuticals , Inc., Birmingham, AL), aceite no metabolizable, aceites minerales y/o vegetales y/o animales, polímeros, carbómeros, tensioactivos , compuestos orgánicos naturales, extractos vegetales, carbohidratos, colesterol, lípidos, emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite en agua, emulsión de agua en aceite en agua, HRA-3 (polímero reticulado sacárido de ácido acrílico) , HRA-3 con aceite de semillas de algodón (CSO, por sus siglas en inglés) o con preferencia, HRA-5 (polímero reticulado de poliol y ácido acrílico) . La emulsión puede estar basada en particular en aceite parafínico líquido liviano (tipo European Pharmacopeia) ; aceite isoprenoide tales como escualano o escualeno; aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; ésteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más en particular aceites vegetales, oleato de etilo, di- (caprilato/caprato) de propilenglicol, tri- (caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos o alcoholes grasos ramificados, en particular ésteres de ácido isoesteárico . El aceite se usa en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes son, con preferencia, tensioactivos no iónicos, en particular ésteres de sorbitano, de mannuros (por ejemplo oleato de anhidromannitol) , de glicol, de poliglicerol , de propilenglicol y de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, que son copolímeros de bloque opcionalmente etoxilados y de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic, en especial L121. Ver Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull , D. E. S.) John Wiley and Sons, NY, pp 51-94 (1995) y Todd et al., Vacuna 15:564-570 (1997). En una modalidad preferida el adyuvante está en una concentración de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50%, con preferencia, a una concentración de aproximadamente 2% a 30%, con mayor preferencia, a una concentración de aproximadamente 5% a aproximadamente 25%, con mayor preferencia aún, a una concentración de aproximadamente 7% a aproximadamente 22% y con máxima preferencia, a una concentración de aproximadamente 10% a aproximadamente 20% el volumen de producto final.

Tal como se usa en la presente, "un portador farmacéuticamente aceptable" o "portador farmacéutico" incluye cualquiera y todos los excipientes, solventes, medios de crecimiento, medios de dispersión, revestimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes inactivantes , agentes antimicrobianos, antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos, agentes retardadores de la adsorción, y similares. Estos ingredientes incluyen aquellos que son seguros y apropiados para usar en aplicaciones veterinarias. En algunas modalidades preferidas y en especial aquellas que incluyen composiciones inmunógenas liofilizadas , los agentes estabilizantes para usar en la presente invención incluyen estabilizantes para liofilización.

"Diluyentes" pueden incluir agua, solución fisiológica, dextrosa, etanol, glicerol, y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina y sales alcalinas de ácido etilendiamintetracético entre otros.

En una modalidad preferida, se prepara la composición inmunógena de la presente invención que comprende un conservante y un estabilizante; y, con mayor preferencia, se prepara la composición inmunógena de la presente invención que comprende anfotericina, formaldehído, gentamicina, EDTA, glicerol y sus combinaciones.

Una "composición inmunógena o inmunológica" se refiere a una composición de materia que comprende al menos un antígeno que produce una respuesta inmunológica en el huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpo a la composición o vacuna de interés. Usualmente, una "respuesta inmunológica" incluye, pero sin limitación, uno o varios de los siguientes efectos: la producción o activación de anticuerpos, células B, células T helper, células T supresoras, y/o células T citotóxicas y/o células T gamma-delta T, dirigida específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Con preferencia, el huésped desplegará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora de modo que la resistencia de una nueva infección se mejorará y/o la gravedad clínica de la enfermedad se reducirá. Esta protección se demostrará ya sea por reducción o falta de signos clínicos normalmente mostrados por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o una duración reducida o título bacteriano en los tejidos o fluidos corporales del huésped infectado.

La expresión "que necesita de la administración" o "que necesita de tal tratamiento de administración" tal como se usa en la presente implica que la administración / tratamiento está asociado con el refuerzo o mejora de salud o cualquier otro efecto medicinal positivo sobre la salud de los animales que reciben la composición inmunógena de conformidad con la presente invención, tales como reducción de la incidencia o la gravedad de una infección o enfermedad viral .

"Virus de rinitis equina A (ERAV) " se refiere a un Apht.hovi.rus en la familia Picornaviridae y se conocía previamente como rinovirus equino 1. "ERAV" tal como se usa en la presente incluye formas inactivadas . En una modalidad, el ERAV es cepa ERAV/ON/05 que tiene el número de acceso PTA-11829 depositada el 14 de abril de 2011 con ATCC (American Type Culture Collection, P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108 Estados Unidos) de conformidad con el Tratado de Budapest y que se recuperó de cultivo de células de Riñon de conejo- 13 (RK-13, por sus siglas en inglés) de un hisopo nasal de un caballo en Ontario, Canadá, en 2005. El ERAV/ON/05 si se transcribe inversamente y se secuencia tiene la SEQ ID NO: 1 en su región 5' UTR.

La secuencia genómica transcripta inversa de ERAV/ON/05 es SEQ ID NO: 2.

La poliproteína codifica por la secuencia genómica de ERAV/ON/05 es SEQ ID NO : 3.

Las cepas de ERAV de utilidad en las composiciones inmunógenas de la invención tienen secuencias de nucleótidos 5'UTR de transcripción inversa que tienen más del 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:l. En algunas modalidades, las cepas de ERAV tienen secuencias genómicas que, cuando se transcriben inversamente en ADN, son más del 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idénticas a la SEQ ID NO : 2 o tienen secuencias que codifican poliproteínas que son más del 97%, 98%, 99% o 100% idénticas a la secuencia codificante de poliproteínas en SEQ ID NO : 2. En algunas modalidades, el ERAV tiene poliproteínas con una secuencia de aminoácidos más del 95%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticas a SEQ ID NO : 3 o a la secuencia de VP1 dentro de SEQ ID NO: 3. En otras modalidades más, el ERAV tiene una proteína L, VP2 , VP3 , VP4 , VP0, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C o 3D, que tienen una secuencia de aminoácidos con más del 80%, más del 90%, más del 99% o 100% de identidad con la misma proteína hallada en la SEQ ID NO : 3. Todas las cepas de ERAV, cuando no están inactivadas o atenuadas, son infectivas y capaces de replicarse en células huésped.

"Virus de rinitis equina B (ERBV) " se refiere a un Erbovirus en la familia Picornaviridae y se conocía previamente como rinovirus equino 2. "ERBV" tal como se usa en la presente incluye formas inactivadas. En una modalidad, el ERBV es una cepa depositada con ATCC que se recuperó de cultivo celular de Riñon de conejo- 13 (RK-13, por sus siglas en inglés) de un hiposo nasal de un caballo en Ontario, Canadá (número de acceso a ATCC PTA- 11828) que se depositó con ATCC (American Type Culture Collection, P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108 Estados Unidos) el 14 de abril de 2011 según el Tratado de Budapest. Las cepas de ERBV de utilidad en las composiciones inmunógenas de la invención tienen secuencias genómicas que, cuando se transcriben inversamente en ADN, son más del 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idénticas al transcrito inverso de la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11829 o tienen secuencias codificantes de poliproteínas que son más del 97%, 98%, 99% o 100% idénticas a la secuencia codificante de la poliproteína de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11829. En algunas modalidades, las cepas de ERBV de utilidad en la invención tienen poliproteínas con una secuencia de aminoácidos más del 95%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de poliproteínas de la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11829. En otras otras modalidades, el ERBV tiene una proteína L, VP4, VP2, VP3, VP1, 2A, 2B, 2C, 3A (Vpg) , 3B, 3Cpro, 3Dpol que tienen una secuencia de aminoácidos con más del 80%, más del 90%, más del 99% o 100% de identidad con la misma proteína hallada en la cepa de ERBV que tiene el número de acceso de ATCC PTA-11829. Todas las cepas de ERBV, cuando no están inactivadas o atenuadas, son infecciosas y capaces de replicarse en células huésped.

La expresión antígeno de "virus del Nilo occidental" implica, pero sin limitación, los componentes del virión de NV que son inmunogénicos cuando están presentes en un animal y más en particular componentes de proteínas, tales como proteínas de envoltura y proteínas no estructurales, de WNV que provocan respuestas inmunes humorales o celulares cuando están presentes en un animal. Estos antígenos pueden incluir ADN, subunidades proteicas, virus vivos modificados y virus inactivados. En formas preferidas de la invención, el antígeno o antígenos de WNV comprenden cepas inactivadas o muertas y con mayor preferencia aún, cepas de WNV dominantes norteamericanas .

La expresión " (cepas) del virus del Nilo occidental norteamericanas" se refiere, pero sin limitación, a cualquier cepa de virus del Nilo occidental que se haya descubierto en el continente norteamericano. Con preferencia, una cepa del virus del Nilo occidental norteamericana tiene una identidad de secuencia con la cepa NY99 (número de acceso a GenBank AF196835 o secuencia de referencia NCBI NC_00942,1 de al menos 97%, con mayor preferencia aún, al menos 98%, con mayor preferencia aún, al menos 98,5%, con mayor preferencia, al menos 99%, con mayor preferencia aún, al menos 99,2%, y, con máxima preferencia, de al menos 99,4%. WN02 es un ejemplo representativo de una cepa de WNV que se puede referir a una cepa dominante de virus del Nilo occidental norteamericana. Específicamente, las cepas dominantes norteamericanas son aquellas que tienen al menos 1 cambio de nucleótido resultante en un cambio de aminoácido de los aislados de WN99. La cepa NY99 (número de acceso a GenBank AF196835) sirve como una cepa de referencia para determinar si una cepa es dominante norteamericana. Además, estas cepas pueden tener uno o varios cambios de aminoácidos silenciosos. En algunas modalidades, el cambio de nucleótido resulta en un cambio de aminoácido en una proteína de envoltura de la cepa y, con mayor preferencia, el cambio de nucleótido resulta en un cambio de aminoácido de valina a alanina. Con preferencia, su cambio de aminoácido está asociado con una mayor capacidad de replicarse en el huésped intermediario, a saber, el mosquito.

Con mayor preferencia, las cepas dominantes norteamericanas incluyen (y con preferencia, ambas) una mutación U a C y una mutación C a U en las posiciones 1442 y 2466 (en comparación con una cepa norteamericana, por ejemplo, NY 99) , respectivamente. Con mayor preferencia aún, las cepas dominantes norteamericanas también incluyen una mutación en la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína E y la mutación C a U en la posición 9352 en la secuencia que codifica la proteína NS5 (nuevamente en comparación con una cepa norteamericana, por ejemplo, NY 99) . Estas mutaciones preferidas se muestran en el análisis filogenético de aislados de virus del Nilo occidental norteamericanos, 2001-2004: Evidence For the Emergence of a Dominant Genotype, C. Todd Davis, et. al, Virology 342, p. 252-265 (2005), cuya enseñanza y contenido se incorpora en la presente por referencia. Las cepas de virus del Nilo occidental, a los fines de la presente invención, no están limitadas a cepas de virus del Nilo occidental de caballos y equinos pero comprenden, pero sin limitación, aquellas cepas de virus del Nilo occidental de origen ave, origen burro, origen cerdo, origen humano, origen mamífero y origen equino.

"Identidad de secuencia" tal como se conoce en el arte se refiere a una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos , a saber, una secuencia de referencia y una secuencia dada para comparar con la secuencia de referencia. La identidad de secuencia se determina al comparar la secuencia dada con la secuencia de referencia después de alinear óptimamente las secuencias para producir el máximo grado de similitud de secuencias, tal como se determina por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. Después de tal alineación, la identidad de secuencia se comprueba sobre una base de posición por posición, por ejemplo, las secuencias son "idénticas" en una posición particular si, en esa posición, los nucleótidos o residuos de aminoácidos son idénticos. La cantidad total de tales identidades de posiciones se divide luego por la cantidad total de nucleótidos o residuos en la secuencia de referencia para dar % de identidad de secuencia. La identidad de secuencia se puede calcular con facilidad por medio de métodos conocidos, incluyendo, pero sin limitación, aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. N. , ed. , Oxford University Press, New York (1988) , Biocomputing : Informatics and Genorae Projects, Smith, D. W., ed. , Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G . , eds . , Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G . , Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991) ; y Carillo, H. y Lipman, D . , SIAM J. Applied Mat . , 48: 1073 (1988), cuyas enseñanzas se incorporan en la presente por referencia. Los métodos preferidos para determinar la identidad de secuencia se diseñan para dar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad de secuencia se codifican en programas de computación disponibles al público que determinan la identidad de secuencia entre secuencias dadas. Los ejemplos de tales programas incluyen, pero sin limitación, el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12 (1) -.387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). El programa BLASTX está disponible al público de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), cuyas enseñanzas se incorporan en la presente por referencia) . Estos programas alinean óptimamente secuencias usando pesos de brechas por defecto a fin de producir el mayor nivel de identidad de secuencia entre las secuencias dada y de referencia. Como ilustración, por polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos, por ejemplo, 85%, con preferencia, 90%, con mayor preferencia aún, 95% de "identidad de secuencia" con una secuencia de nucleótidos de referencia, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido dado es idéntica a la secuencia de referencia excepto porque la secuencia de polinucleotidos dada puede incluir hasta 15, con preferencia, hasta 10, con mayor preferencia aún, hasta 5 mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia. En otras palabras, en un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 85%, con preferencia, 90%, con mayor preferencia aún, 95% de identidad respecto de la secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 15%, con preferencia, 10%, con mayor preferencia aún, 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia puede ser suprimida o sustituida con otro nucleótido o una cantidad de nucleótidos de hasta el 15%, con preferencia, 10%, con mayor preferencia aún, 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia puede ser insertada en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia se pueden producir en las posiciones terminales 51 o 31 de la secuencia de nucleótidos de referencia o en otro lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o varios grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. De forma análoga, por polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos, por ejemplo, 85%, con preferencia, 90%, con mayor preferencia aún, 95% identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, se entiende que la secuencia de aminoácidos dada del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia excepto porque la secuencia de polipéptidos dada puede incluir hasta 15, con preferencia, hasta 10, con mayor preferencia aún, hasta 5 alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia de polipéptidos dada con al menos 85%, con preferencia, 90%, con mayor preferencia aún, 95% identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 15%, con preferencia, hasta 10%, con mayor preferencia aún, hasta 5% de los residuos de aminoácido en la secuencia de referencia se pueden suprimir o sustituir con otro aminoácido o una cantidad de aminoácidos de hasta 15%, con preferencia, hasta 10%, con mayor preferencia aún, hasta 5% de la cantidad total de residuos de aminoácido en la secuencia de referencia pueden ser insertadas en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre aquellas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Con preferencia, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren por sustituciones conservativas de aminoácidos. Sin embargo, las sustituciones conservativas no están incluidas como una coincidencia cuando se determina la identidad de secuencia. En la presente descripción, se entiende que la SEQ ID N0:1 (5' UTR) y SEQ ID NO : 2 son las secuencias de ADN que resultan de la transcripción inversa de 5' UTR y todo el genoma de ERAV/ON/05, respectivamente. Del mismo modo, la SEQ ID NO: 3 se refiere a la secuencia de aminoácidos correspondiente a la poliproteína codificada por la secuencia genómica de ERAV/ON/05. La identidad en porcentaje de una cepa dada de ERAV en comparación con la SEQ ID N0:1 o SEQ ID NO: 2 se refiere así a la correspondiente secuencia de ADN resultante de la transcripción inversa y secuenciacion.

"TCID50" se refiere a una dosis infecciosa de cultivo tisular que infecta el 50% de células en un cultivo inoculado con el virus.

A los fines de la presente invención, los términos "cepa" y "aislado" tienen el mismo significado y se usan de modo indistinto.

"Signos clínicos" o "síntomas clínicos" para ERAV y ERBV incluyen pero sin limitación pirexia, aumento de temperatura, mayores ruidos pulmonares, linfoadenopatía, descarga nasal, descarga ocular y tos y faringitis. Otros signos o síntomas más incluyen anemia, anorexia, linfoadenitis de cabeza y cuello, edema de las extremidades, letargía y dolor. Además, los signos clínicos de infecciones de ERAV y/o ERBV pueden incluir aquellos asociados con herpes virus equino y virus de gripe equina. En una modalidad, los signos clínicos para ERAV incluyen tos, faringitis, pirexia, aumentos de temperatura, mayor tamaño de nodo linfático submandibular, descarga nasal y descarga ocular. En ciertas modalidades, los signos clínicos de ERAV incluyen una mayor incidencia de aborto en yeguas preñadas. En otra modalidad, los signos clínicos dirigidos por una composición inmunológica revelada en la presente son aquellos de infecciones respiratorias, tales como las causadas por uno o varios de ERAV, ERBV, EIV, EHV-1 y EHV-4.

"Signos clínicos" o "síntomas clínicos" de virus del Nilo occidental, a los fines de esta invención, incluyen, pero sin limitación, síntomas o lesiones asociados con encefalitis, viremia, anorexia, depresión, fiebre, debilidad, modo de andar anormal, parálisis de las extremidades traseras, visión alterada, ataxia, vagar sin rumbo, convulsiones, incapacidad para tragar, coma, posterior debilidad, parálisis, baja coordinación, depresión y comportamiento relacionado, temblores, convulsiones, batimiento de las extremidades, problemas neurológicos , hinchazón del sistema nervioso central, muerte y sus combinaciones. Los signos clínicos exhibidos por un animal infectado varía según la gravedad de la infección.

"Signos clínicos" o "síntomas clínicos" de herpes virus equino, a los fines de esta invención incluyen, pero sin limitación, aborto, deficiencias neurológicas , enfermedad respiratoria, deficiencias del sistema reproductivo e insuficiencia y síntomas relacionados con el sistema nervioso central. Además, los síntomas clínicos de EHV1 incluyen, pero sin limitación, el fenómeno de potros infectados con EHV1, que exhiben complicaciones respiratorias, pasando el virus a miembros más viejos de la manada quienes luego exhiben deficiencias reproductivas, incluyendo aborto y deficiencias neurológicas, normalmente presentes en el sistema nervioso central.

"Signos clínicos" o "síntomas clínicos" de encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental y encefalomielitis equina venezolana, a los fines de la presente invención son aquellos síntomas normalmente conocidos por estar asociados con encefalomielitis, incluyendo, pero sin limitación fiebre, signos de nerviosismo tales como sensibilidad al sonido, períodos de excitación e inquietud, lesiones cerebrales, modorra, orejas caídas, dar vueltas, modo de andar anormal, parálisis, falta de apetito, depresión, presión en la cabeza, falta de coordinación, incapacidad a largo plazo, daño cerebral, muerte y sus combinaciones. "Seguridad" tal como se usa en la presente, se refiere a la ausencia de consecuencias adversas en el animal vacunado después de la vacunación, incluyendo, pero sin limitación, reversión potencial de virus de vacuna a virulencia y efectos colaterales clínicamente significativos, tales como enfermedad sistémica persistente o inflamación inaceptable en el sitio de la administración de la vacuna.

"Reducción de la incidencia y/o la gravedad de signos clínicos" o "reducción en la incidencia y/o la gravedad de síntomas clínicos", tal como se menciona en la presente, implica reducir la cantidad de animales infectados en un grupo, reducción o eliminación de la cantidad de animales que exhiben signos clínicos de infección o reducción de la gravedad de cualquier signo clínico que está presente en los animales, en comparación con la infección de tipo salvaje. Por ejemplo, estos signos clínicos incluyen viremia, fiebre, respuesta a anticuerpos, descarga ocular, descarga nasal y histopatología . Con preferencia, se reducen en animales que reciben la composición de la presente invención en al menos el 10% en comparación con animales que no reciben la vacuna que pueden infectarse. Con mayor preferencia, los signos clínicos se reducen en animales que reciben la composición de la presente invención en al menos el 20%, con mayor preferencia, en al menos el 30%, con mayor preferencia aún, en al menos el 40% y con mayor preferencia aún, en al menos el 50%.

"Duración de la inmunidad" , tal como se usa en la presente, se refiere a la cantidad mínima de días durante los cuales un animal produce una respuesta inmunógena de modo tal que el animal será relativamente inmune de contraer un virus y o el beneficio de la reducción de incidencia y/o la gravedad de signos clínicos, tal como se describió en la presente .

La expresión "inactivado" y "virus inactivado" se refiere a un virus previamente virulento que se calentó o se trató químicamente para inactivar, matar o modificar de otra forma el virus para eliminar sustancialmente sus propiedades virulentas mientras mantiene su inmunogenicidad . En una modalidad preferida, los virus inactivos revelados en la presente están inactivados por tratamiento con un agente inactivante. Los agentes inactivantes apropiados incluyen beta-propiolactona, etileneimina binaria, glutaraldehído y formaldehído . En algunas modalidades, el agente inactivante es formaldehído.

Las expresiones "vacuna" y "composición inmunógena" , cuando se usan en la presente, implican que se usan de forma indistinta.

Cualquier cepa o aislado de virus del Nilo occidental se puede usar de conformidad con la presente invención. En una modalidad preferida, el aislado está seleccionado de uno o varios de los siguientes: aislado de New York (Northeastern North American) (WN-NY 99) , Horse Origin, 1999, aislado de New York (Northeastern North American) (WN-NY 99) , Crow Origin, 1999, United States Department of Agriculture Isolate 292206 (USDA 2004) , Donkey Origin, United States Department of Agriculture Isolate 405330 (USDA 2005) , Horse Origin, North American Isolate (W -Texas-2002/2003) , Southeast Texas Coastal Isolate 2002, México (Tabasco) Isolate 2003 y sus combinaciones y en una modalidad más preferida, el aislado está seleccionado de uno de los siguientes: United States Department of Agriculture Isolate 292206 (USDA 2004), Donkey Origin, United States Department of Agriculture Isolate 405330 (USDA 2005) , Horse Origin, North American Isolate (WN-Texas-2002/2003) , Southeast Texas Coastal Isolate 2002, México (Tabasco) Isolate 2003 y sus combinaciones. En una modalidad de máxima preferencia, el aislado es United States Department of Agriculture Isolate 405330 (USDA 2005) , Horse Origin de modo singular o en combinación con uno o varios aislados enumerados con anterioridad. En una modalidad preferida adicional, se incluyen estos aislados que son parte de los aislados de virus del Nilo occidental norteamericano. En otra modalidad preferida, se incluyen aislados dominantes del virus del Nilo occidental norteamericano. Además de los enumerados con anterioridad, los aislados específicos incluyen, pero sin limitación, WN02 y aislados que tienen al menos 1, con preferencia, al menos 2 y con mayor preferencia aún, al menos 3 cambios de nucleótido que resultan en al menos un cambio de aminoácido de los aislados N NY99 y con máxima preferencia, se prefieren cepas con el cambio de aminoácido de valina a alanina en la posición 159 de la proteína de envoltura. Con máxima preferencia, las cepas dominantes norteamericanas incluyen, pero sin limitación: NY2002Nassau, NY2002Clinton, NY2002Queens , GA20021, GA20022, TX20021, TX20022, IN2002, NY2003Alban , NY2003Suffolk, NY2003Chatauqua, CO20031, CO20032, TX2003, TX2003Harris4 , TX2003Harris6, TX2003Harris7 , TX2003HarrislO , AZ2004 y TX2004Harris4 y sus combinaciones. Las cepas de virus del Nilo occidental de utilidad en la vacuna o composición inmunógena de la presente invención pueden ser cualquier cepa o aislado. En una modalidad preferida, la cepa de virus dominante del Nilo occidental norteamericana usada es E-159 (Horse Origin) o E-159 (Donkey Origin) . Una cepa representativa de tal cepa de NV dominante norteamericana incluye la cepa Horse Origin 2005 depositada en ATCC (número de acceso a ATCC PTA-9409) , ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, el 14 de agosto de 2008, bajo las reglamentaciones del Tratado de Budapest. Las cepas de gripe equina de utilidad en la vacuna o composición inmunógena de la presente invención pueden ser cualquier cepa o aislado. Las cepas representativas incluyen Equi-2/Ohio/03 , depositadas con número de acceso a ATCC PTA-9522, Equi-2/ entucky/95 , depositadas con número de acceso a ATCC PTA-9523 y Equi-2/New Market/2/93, depositadas con número de acceso a ATCC PTA-9524. Las cepas representativas con números de acceso a ATCC PTA-9522, PTA-9523 y PTA-9524 se depositaron cada una con ATCC en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209 el 23 de septiembre de 2008, según las reglamentaciones del' Tratado de Budapest.

Las cepas de herpes virus equino ("EHV") de utilidad en la vacuna o composición inmunógena de la presente invención pueden ser cualquier cepa o aislado. Las cepas representativas incluyen EHV subtipo 1, depositada con número de acceso a ATCC PTA-9525 y EHV subtipo 4, depositada con número de acceso a ATCC PTA-9526. Las cepas representativas con números de acceso a ATCC PTA-9525 y PTA-9526 se depositaron cada una con ATCC en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209 el 23 de septiembre de 2008, según las reglamentaciones del Tratado de Budapest.

Las cepas de encefalomielitis equina occidental de utilidad en la vacuna o composición inmunógena de la presente invención pueden ser cualquier cepa o aislado. Una cepa representativa incluye la cepa Fleming, depositada con ATCC (número de acceso a ATCC PTA-9410) , ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, el 14 de agosto de 2008, según las reglamentaciones del Tratado de Budapest.

Las cepas de encefalomielitis equina venezolana de utilidad en la vacuna o composición inmunógena de la presente invención pueden ser cualquier cepa o aislado. Una cepa representativa incluye la cepa TC-83, depositada en ATCC (número de acceso a ATCC PTA-9411) , ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, el 14 de agosto de 2008, según las reglamentaciones del Tratado de Budapest .

Las cepas de encefalomielitis equina oriental de utilidad en la vacuna o composición inmunógena de la presente invención pueden ser cualquier cepa o aislado. Una cepa representativa incluye la cepa NJO, depositada en ATCC (número de acceso a ATCC PTA-9412) , ubicada en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, el 14 de agosto de 2008, según las reglamentaciones del Tratado de Budapest .

Las cepas de toxoide tetánico de utilidad en la vacuna o composición inmunógena de la presente invención pueden ser cualquier cepa o aislado. Una cepa representativa es aquella tomada de una semilla maestra de Clostridium tetani de The Massachusetts Department of Public Health Institute of Laboratories en Boston, Massachusetts.

La vacuna o composición inmunógena tal como se describe en la presente es segura para la administración en especies susceptibles de ERAV o ERBV, en particular equidae, de cualquier edad. En una modalidad preferida, la presente invención es segura para la administración a potros 12 meses de edad o más viejos, con mayor preferencia, es segura para la administración a potros 10 meses de edad o más viejos, con mayor preferencia, es segura para la administración a potros 8 meses o más viejos, con mayor preferencia, es segura para la administración a potros 6 meses de edad o más viejos, con mayor preferencia, es segura para la administración a potros de 4 meses de edad o mayores, con mayor preferencia, es segura para la administración a potros 2 meses de edad o más viejos, con mayor preferencia, es segura para la administración a potros de 1 mes de edad o más viejos, con mayor preferencia aún, es segura para la administración a potros entre 1 día y 1 mes de edad y, con máxima preferencia, es segura para la administración a potros de 1 día de edad o más viejos.

Las composiciones tal como se describe en la presente se pueden administrar de cualquier forma convencional. Los ejemplos de métodos de administración incluyen cualquiera de permita el acceso por las células del sistema inmune a la composición inmunógena que incluye la administración oral, transdérmica/intradérmica, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraocular, intraperitoneal , intrarrectal , intravaginal , intranasal , intragástrica, intratraqueal , intrapulmonar o cualquier combinación de ellas. En una modalidad preferida, la vacuna se administra por vía parenteral, con preferencia, por vía intranasal, subcutánea o intramuscular y en la modalidad de máxima preferencia, la vacuna se administra por vía intramuscular.

En una modalidad, se proporciona un método para preparar la composición inmunógena que comprende un ERAV y/o ERBV tal como se describe en la presente. En una modalidad, el método comprende : infectar una línea celular susceptible con ERAV o ERBV; cultivar la línea celular infectada en medio de crecimiento hasta obtener un efecto citopático (CPE, por sus siglas en inglés) ; cosechar el medio; filtrar el medio para obtener un medio filtrado; y poner el medio filtrado en contacto con un agente inactivante para obtener el ERAV o ERBV inactivado.

En una modalidad, el método comprende proporcionar una cepa de ERAV/ON/05 o una cepa de ERBV con número de acceso a ATCC PTA-11829. Estas cepas se usan para infectar una línea celular susceptible de tener propiedades de crecimiento y secreción ventajosas de utilidad para la preparación de vacunas. Una línea celular susceptible preferida es una línea celular Vero como una línea celular Vero76 o E-Vero.

Los medios de crecimiento apropiados incluyen E199. Estos medios se pueden suplementar con solución de L-glutamina y un antibiótico tales como solución de sulfato de gentamicina. En algunas modalidades, el medio de crecimiento es E199 suplementado con solución de L-glutamina (hasta 2 mM) y solución de sulfato de gentamicina (hasta 30 g/mL) . En algunas modalidades, los fluidos virales se recolectan cuando el efecto citopático de CPE alcanza el 75% o más. Los medios recolectados se reúnen y se filtran como a través de cartuchos filtrantes de polipropileno con un tamaño de poro de 5,0 micrones. Las cepas están químicamente inactivadas como por tratamiento con solución al 0,1-0,2% de formaldehído en un período de tiempo apropiado, por ejemplo 48 horas a 72 horas y los fluidos resultantes son concentrados. En algunas modalidades, los conservantes y adyuvantes se añaden a continuación. Los conservantes apropiados incluyen uno o varios de anfotericina B, sulfato de gentamicina y formaldehído. En otras modalidades, el adyuvante es HRA-5. En otras modalidades más, el adyuvante es HRA-3 con aceite de semillas de algodón (CSO) .

En una modalidad y de conformidad con los métodos revelados en la presente, se proporciona una composición inmunógena que comprende ERAV/ON/05 y/o una cepa de ERBV con el número de acceso a ATCC PTA-11829 y anfotericina B, sulfato de gentamicina, formaldehído y HRA-5 preparada de conformidad con los métodos revelados en la presente.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se establecen más abajo para ilustrar algunas modalidades de la presente invención. Estos ejemplos son meramente ilustrativos y se entiende que no limitan el alcance o los principios subyacentes de la presente invención.

Ejemplo 1 Este ejemplo ilustra una modalidad de una composición de virus de rinitis equina A de conformidad con la presente invención.

Materiales y métodos La cepa de virus de rinitis equina A ERAV/ON/05 (número de acceso de ATCC PTA-11828) se recuperó de cultivo celular de Riñon de conejo-13 (RK-13) de un hiposo nasal de un caballo en Ontario, Canadá. El virus se pasó una vez en células E-Vero para producir un ganado maestro pretitulado alto y luego se diluyó con medio de cultivo celular para producir el virus Master Seed. El Master Cell Stock es una línea celular E-Vero crecida y mantenida usando E199 suplementado con solución de L-Glutamina (hasta 2 mM) y solución de sulfato de Gentamicina (hasta 30 g/mL) . Se produjo ERAV/ON/05 inactivado de conformidad con el siguiente procedimiento general .

Se descongeló Master Cell Stock congelado a temperatura ambiente (18-26 °C) y se usó para inocular un intervalo de recipientes T-25 cm2 hasta T-150 cm2 preesterilizados o botellas de 850 cm2 o 1050 cm2 PETG preesterilizadas . Las células descongeladas se suspenden en medio de cultivo a una tasa de 0,15 a 0,40 mL por cm2. Las células se incuban a 36-38 °C durante siete días. Los cultivos plantados de ganado congelado se pueden realimentar con medio para eliminar el dimetilsulfóxido residual (DMSO) , para eliminar los restos excesivos, para estimular el crecimiento de cultivos que no alcanzaron confluencia o para mantener la viabilidad de cultivos confluentes. Las células se pasan por decantación del medio y se añaden 1-10 mL (según el tamaño del envase) , de solución al 25% de tripsina-EDTA a cada recipiente. Los recipientes se agitan moderadamente hasta que las células se desprenden de la superficie. Las células se eliminan de los recipientes enjuagando con medio de crecimiento y se reúnen. El intervalo de los pasajes de cultivo celular es uno a veinte.

Antes de inocular, el medio de cultivo celular se decanta de células que eran al menos 90% confluentes. La hoja celular se enjuaga con 20-50 mL de medio de infección viral (E199 suplementado con solución de L-Glutamina (hasta 2 mM) y solución de sulfato de Gentamicina (hasta 30 g/mL) , luego se realimenta con medio de infección viral a una tasa de 0,15 a 0,40 mL/cm2. Los recipientes luego se. inoculan en una multiplicidad de infecciones (MOI) de 0,0005 a 0,005. Los cultivos en botellas se incuban a 36-38 °C durante dos o cinco días a 0,2-0,4 rpm.

Durante el período de crecimiento, los cultivos se controlan en cuanto a CPE microscópicamente y en cuanto a la contaminación general macroscópicamente. Los cultivos inapropiados se descartan después de su esterilización.

Los fluidos virales se recolectan cuando CPE alcanza 75% o más. Las botellas se arremolinan para eliminar las células sueltas y los fluidos se reúnen en botellas estériles de 2-20 L de vidrio, de plástico o de PETG, recipientes estériles de 20 L de polipropileno o tanques de 2-200 L estériles de acero inoxidable apropiados para clarificación. Los fluidos reunidos se pueden mantener durante siete a 2-8 °C antes de clarificar.

Sólo los fluidos de cultivos monocapa que muestran evidencia de infección viral son recolectados . Las botellas que indican contaminación se descartan. Una muestra de fluidos reunidos clarificados se recolecta antes de inactivación para titulación por TCID50. Los fluidos con un título de 106,2 TCID50/mL o más se pueden usar en la preparación del producto final. Se pueden mezclar múltiples lotes para lograr los títulos mínimos.

Los lotes recolectados se clarifican por filtración usando cartuchos de filtro de polipropileno con un tamaño de poro de 5,0 micrones . Los lotes recolectados clarificados luego se pueden almacenar durante siete días a 2-8 °C. Los fluidos clarificados se inactivan luego con solución de formaldehído, USP, 0,1-0,2% en volumen, se transfieren a un recipiente secundario y se mantienen a temperatura ambiente (18-26 °C) con agitación durante un mínimo de 48 a 72 horas. una muestra de fluidos inactivados se toma para asegurar la inactivación antes de concentrar. El material de lote inactivado se mantiene a 2-8 °C antes de concentrar. Los fluidos virales inactivados clarificados se concentran en un factor de 5X o 50X usando cartuchos de membrana de ultrafiltración de flujo transversal con tasas de corte de peso molecular de no más de 10,000 Dalton MW.

Se puede añadir una cantidad de adyuvantes apropiados a la formulación de vacuna, con máxima preferencia, HRA-5. Otros adyuvantes incluyen HRA-3 con aceite de semillas de algodón (CSO) . Se pueden emplear las etapas de procesamiento típicas tales como mezclado, combinación, microfluidización y emulsificación del adyuvante y/o los antígenos virales recolectados con otros ingredientes.

El producto luego se reúne en una formulación final. En un método discontinuo, en una modalidad de ejemplo, las cantidades requeridas de adyuvante y diluyente MEME se combinan en un recipiente estéril y el pH se ajusta hasta aproximadamente 6,3-6,7 con hidróxido de sodio. ERAV, sulfato de gentamicina, formaldehído y anfotericina B se añaden de una vez durante mezcla constante. El pH se ajusta a 6,8-7,0 con hidróxido de .sodio o ácido clorhídrico y la serie se mezcla durante un mínimo de 18 horas a 2-8 °C. La serie a granel completa luego se transfiere a un recipiente de almacenamiento apropiado y se almacena at 2-8 °C. Se puede añadir anfotericina B a una concentración de hasta 2,5 g/mL del volumen de diluyente como un conservante. Se añade sulfato de gentamicina a una concentración de hasta 30 ug/mL del volumen de diluyente como un conservante. Formaldehído se añade a una concentración del 0,1% del volumen de diluyente como un conservante. Un adyuvante tales como HRA-5 se añade a una concentración de 10% v/v del volumen serial final.

La vacuna se da por inyección hipodérmica típica, con vacunas de refuerzo si se desea.

Ejemplo 2 Esta investigación se llevó a cabo para obtener una evaluación de la eficacia de una vacuna de virus de rinitis equina A para proteger caballos de la estimulación con el virus de rinitis equina A.

Materiales y métodos Se prepararon vacuna ERAV A- 9 en altas dosis (107,5 TCIDso/mL) y A-10 en bajas dosis (107'° TCID5c/mL) de conformidad con el Ejemplo 1.

Tabla 1: formulación de vacuna A-9 (1 mL) : Tabla 2: formulación de vacuna A-10 1 (1 mL) : Se preparó una formulación de V-05 placebo de 1 mL como en las vacunas A-9 y A-10 pero sin antígeno ERAV/ON/05.

Un total de 44 caballos se dividieron al azar en uno de tres grupos de tratamiento que consistían en grupo control con placebo de 15 caballos V-05, un grupo de baja dosis de 14 caballos A-10 y un grupo de dosis alta de 15 caballos A-9. Los caballos se vacunaron con un producto en 1 mL de dosis con adyuvante con HRA-5 para tres dosis totales, con un intervalo de 21 días entre las dosis. Los caballos se estimularon posteriormente 21 días después de la tercera vacunación por pulverización intranasal con una dosis de rinitis A nebulizada a 107,0 TCID50/mL durante un período de cuatro minutos. Los caballos fueron evaluados en cuanto a signos clínicos de temperatura, exudado nasal, descarga ocular a diario. Se extrajo sangre semanalmente para neutralización sérica (SN, por sus siglas en inglés) .

Virus estimulante El virus estimulante se produjo en cultivo tisular en células E-Vero. El título del virus de estimulación se determinó en 1 x 106'9 TCID50/mL el día de la estimulación. El virus de estimulación se diluyó en la mañana de la estimulación 1: 10 con medio de cultivo tisular para efectuar un título de 1 x 105,9 TCID50/mL.

Método de estimulación intranasal Se administró Sedivet® (clorhidrato de romifidina) , un sedante y analgésico, por vía intravenosa a cada caballo antes de la estimulación a una dosis de 50 ug/kg de peso corporal. Cada caballo se estimuló luego con aproximadamente io6'2 TCID50 de virus de rinitis equina A. El virus estimulante se administró por vía intranasal como un aerosol producido por un nebulizador en una Equine AeroMask (Trudell Medical International, Ontario, Canadá) por medio del siguiente método. 4 mililitros de 105'9 TCID50/mL de virus de estimulación se colocan en un recipiente nebulizador en la aerocámara. Se fijó una manguera a presión desde un compresor de aire con el puerto de entrada del nebulizador. El tubo de salida se insertó luego en la aerocámara unida con la cabeza del caballo estimulada y se aplicó aproximadamente 10 psi de presión de aire al puerto de entrada durante tres minutos. Durante este tiempo, se pulverizaron aproximadamente dos mililitros de fluido estimulante viral directamente en la nariz del caballo estimulado.

Neutralización sérica Se empleó en este estudio un ensayo de neutralización sérica de microtitulación estándar. En este estudio, se utilizó un ensayo de neutralización sérica de microtitulación estándar. En este estudio, se utilizó un ensayo de neutralización sérica de microtitulación estándar. Todos los sueros se analizaron en placas de microtitulación de fondo plano estériles usando cinco cavidades por dilución y una serie de dilución de 8 cavidades para cada una de las 5 cavidades de ensayo. Cada una de las 5 cavidades de ensayo contenía 25 µ? de suero de dilución mezclado con 25 µ? del virus indicador y 150 µ? de una suspensión celular eVero recientemente sembrada que contenía aproximadamente 5 X 104 células . El virus indicador de ensayo usado fue el virus de la rinitis equina tipo I. Los títulos de anticuerpo de neutralización sérica se expresan como títulos Reed-Muench ID50.

Para la modalidad del ensayo, se realizaron 2 diluciones para cada suero de ensayo en una placa de microtitulación de fondo plano estéril usando 5 cavidades de replicación por suero de ensayo y 1 serie de dilución de 8 cavidades. Las diluciones se realizaron con un instrumento de pipeteo con un solo canal o con varios canales usando puntas de microtitulación estériles. El volumen de suero agregado a cada una de las 5 cavidades de la primera fila fue de 50 µ? . Todas las otras cavidades contenían 25 µ? de DMEM (sin FBS) . Después de la dilución en serie en la parte inferior de la placa, se desecharon 25 mi de la última fila. Se agregaron 25 µ? de una dilución predeterminada del virus indicador a cada cavidad de ensayo. Las placas luego se mezclaron y se incubaron durante una hora a 37 °C en C02 al 5 %. Una vez terminado el período de incubación, se agregaron 150 µ? de una suspensión que contenía 4 x 106 /mi de células Vero a cada cavidad de control celular y de ensayo. Las placas se incubaron a 37 °C en un incubador de C02 durante 5 días, en cuyo momento, se examinaron microscópicamente placas para determinar la presencia CPE típicos del virus de la rinitis equina .

Evaluación de exudado nasal Todas las observaciones del exudado nasal se realizaron antes de la recolección de hiposos nasofaríngeos. El día de la estimulación y 10 días después de la estimulación, se examinaron los pasajes nasales y el hocico de cada uno de los 44 caballos vacunados y de control y se calificaron usando la descripción de clasificación y puntaje enumerada más abajo.

Los grados de puntaje de 0 a 6 se asignaron sobre la base de la gravedad de la enfermedad indicada por cada una de las siguientes clasificaciones: Tabla 3: Grados de puntaje Evaluación ocular La descarga ocular se evaluó a diario en el momento de la evaluación de exudado nasal. Los puntajes de descarga ocular se registraron como 0 = normal; 1 = descarga ocular suave a moderada y 2 = descarga ocular severa.

Aislamiento viral nasofaríngeo En cada día de ensayo de observación, se limpió profundamente cada pasaje nasal de cada caballo vacunado y de control por medio de una lanza quirúrgica estéril WECK-CELTM (Edward Weck and Company, Inc., Research Triangle Park, N.C. 27709) unida a una pipeta plástica estéril de 11 pulgadas de largo. Al recolectar, cada una de las dos lanzas quirúrgicas se colocó de inmediato en un tubo individual que contenía 4 mL de medio de transporte enfriado rápidamente (E-199 suplementado con gentamicina, L-glutamina, 2X Pen/estrep, 2X anfotericina B) .

Para el aislamiento del virus, se mezclaron los tubos, los hisopos se eliminaron asépticamente y el medio se centrifugó a 1500 rpm durante 10 a 15 minutos para retirar los particulados. El medio se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 L antes de la inoculación en células de cultivo tisular. Después de filtrar, se añadió 4-6% de solución estéril al 85% de sacarosa a cada muestra para congelar a -80 °C, a fin de que todas las muestras se ensayaran concurrentemente.

Para aislar los virus, los tubos se mezclaron, los hisopos se eliminaron asépticamente y el medio se centrifugó a 1500 rpm durante 10 minutos para retirar los particulados. El medio se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 µ?? antes de la inoculación en células de cultivo tisular. 1 mL del medio de transporte clarificado se usó para inocular una monocapa de 2 cm2 de dos días de edad de células E-Vero crecidas en una placa de cultivo tisular de 24 cavidades de la que el medio de cultivo se había eliminado asépticamente. Después de la inoculación, el inoculo se dejó adsorber en la monocapa celular durante una hora a 37 °C en una incubadora humectada que contenía 5% de atmósfera de C02. Después del período de adsorción, se añadió 1 mL adicional el medio de realimentación (E-199 con 7% de suero fetal bovino (FBS) , 2 mM de L-glutamina, Gentamicina 2X Pen-estrep y 2X anfotericina B) a cada cavidad. Después de la adición del medio de realimentación, las placas se incubaron luego a 37 °C en una incubadora de C02. Cada cavidad de cultivo celular de ensayo y de control se examinó microscópicamente durante 7 días en cuanto a signos de efecto citopático (CPE) típico del virus de estimulación ERAV. Las cavidades que eran negativas al final del período de observación de 7 días se subcultivaron en células frescas y se observaron durante otros 7 días.

Métodos de evaluación Estadística Los datos de todos los caballos vacunados con A- 9 o A-10 se combinaron para evaluación estadística. La influencia de la vacunación sobre la duración de la enfermedad (cantidad de días con puntajes nasales > 0) se evaluó usando el ensayo de Kruskal-Wallis y Hodges-Lehmann (el procedimiento NPARIWAY en SAS , SAS Institute, Cary NC) . La gravedad de la enfermedad se evaluó comparando el estado de enfermedad máximo entre los caballos vacunados y los caballos de control. Los puntajes nasales se dicotomizaron a <_ 1,5 y > 1,5 en base a la distribución de resultados. La fracción evitada (PF, por sus siglas en inglés) y los intervalos del 95% de confianza (CI) fueron estimados. Se evaluaron puntajes oculares como presentes o ausentes y la fracción evitada y los intervalos del 95% de confianza fueron estimados (el procedimiento FREQ en SAS) . Se usó análisis de mediciones repetidas apropiadas para datos continuos para evaluar el efecto de la vacunación sobre la temperatura corporal y los títulos de neutralización sérica (procedimiento mixto en SAS) . La proporción de caballos que eran virus positivos en el tiempo y capa leucocitaria positiva en el tiempo se evaluó usando la prueba exacta de Fisher en cada punto temporal (el procedimiento Freq) . Se evaluaron puntajes nasales y oculares por ensayo de suma de intervalo de Wilcoxon en cada punto temporal (el procedimiento NPARIWAY) .

Resultados y conclusiones AISLAMIENTO VIRAL DE HIPOSOS NASALES (esparcimiento de virus) y CAPAS LEUCOCITARIAS (viremia) La proporción de animales que eran virus positivos era significativamente menor en los grupos vacunados los días 2 a 7 (Tabla 4 de abajo y Figura 1) en comparación con el grupo control (P<0,05).

Tabla 4. Proporción de virus positivo de hisopo nasal en el tiempo (* P<0,05 versus control, ensayo exacto de Fisher cada día) Los animales de capa leucocitaria positivos eran menos frecuentes en el grupo vacunado los días 4-7 en comparación con el grupo control (Tabla 5 siguiente y Figura 2) .

Tabla 5: Proporción de capa leucocitaria positivos en el tiempo (* P<0,05 versus control, ensayo exacto de Fisher cada día) Neutralización sérica Tabla 6: Síntesis de la temperatura corporal y la neutralización sérica Los valores de temperatura corporal medios (temperatura rectal medida co sonda de termómetro calibrado GSA Electronics) en cada día de estimulación estaban siempre dentro de los parámetros normales de temperatura corporales. Se hallaron mayores aumentos en los títulos SN resultantes de la vacunación (ver también la Fig. 3) después de la estimulación.

Evaluación nasal y ocular Los promedios para puntajes nasales eran inferiores en los días 4 a 10 y los días 12-13 en el grupo vacunado en comparación con el grupo de control (Tabla 7 siguiente y Figura 4) . Los promedios para puntajes oculares eran inferiores el día 7 en el grupo vacunado en comparación con el grupo de control (ver también la Figura 5) .

Tabla 7: Intervalo medio para puntaje nasal y ocular a través del tiempo (*P<0,05 versus control; ensayo de suma de intervalos de ilcoxon cada día, A-9 y A- 10 combinados) .

Duración de la enfermedad: evaluación del exudado nasal Tabla 8: Síntesis del efecto de vacunación durante la enfermedad (cantidad de días con puntaje nasal > 0) Tabla 9: Efecto de vacunación durante la enfermedad (puntaje nasales; *significativamente menor que el grupo de control por ensayo de Kruskal-Wallis P<0,05) La duración prolongada de descarga nasal en controles se halló después de la estimulación (Tabla 8, ver también Figura 4) . El grupo vacunado mostró una significativa reducción de la duración de la descarga nasal. Los controles expe imentaron un mínimo de 8 días de descarga nasal vs 11 vacunados (38%) con 1 día o menos. Dos tercios de vacunados tenía menor duración de descarga nasal que el mínimo de 8 días en el grupo de control. La duración era de la observación normal primera a última, incluso se un caballo tenía días normales entre medio. La cantidad de días en los que los animales estaban enfermos con signos clínicos de enfermedad respiratoria (puntaje nasal > 0) era significativamente más corta (desplazamiento de 7 días) en el grupo vacunado en comparación con el grupo de control .

Tabla 10: Máximos puntajes nasales - Significativa diferencia entre las dos distribuciones de puntajes (ensayo de Kruskal -Wall is , P = 0,0157).

La vacunación también redujo la gravedad de descarga nasal (puntaje máximo cualquier día posterior a la estimulación) . Se compararon los máximos puntajes nasales entre grupos (Tabla 10) . El puntaje nasal mínimo para caballos en el grupo de control era de 1,5. Los resultados se dicotomizaron así en puntajes < 1,5 y > 1,5 para la evaluación de la gravedad de la enfermedad (Tabla 11) . La fracción evitada era del 48% con un menor límite de confianza mayor de 0. La distribución general de los puntajes nasales máximos se redujo significativamente por vacunación (ensayo de Kruskal-Wallis , P = 0,0157).

Evaluación ocular Tabla 12: Puntajes oculares (presentes o ausentes) Como sólo se informaron dos valores para los puntajes oculares (0 ó 2) , los resultados se dicotomizaron a presentes o ausentes dentro de un individuo. La fracción evitada se usó luego para evaluar el efecto de la vacunación en presencia de signos oculares. La vacuna redujo significativamente la gravedad de descarga ocular resultante de la infección con ERAV. Los puntajes oculares medios en el tiempo también se muestran en la Figura 5.

Los datos de este estudio demuestran que la administración de dosis intramusculares del virus inactivado es capaz de inmunizar un animal a altos niveles de detección de anticuerpos que previene la enfermedad ocular y reduce la gravedad y la duración de la descarga nasal. La vacuna era muy efectiva para prevenir cualquier descarga ocular después de la estimulación con ERAV. La descarga nasal persistió durante un período relativamente largo después de la estimulación, mientras que la descarga ocular tuvo un pico y rápidamente bajó. Así, la vacuna mostró una mejora significativa en la descarga nasal durante un período prolongado (9 de 10 días consecutivos) , mientras que la vacuna redujo significativamente la descarga ocular durante 1 día, durante la cual los signos oculares eran en su mayoría severos. Además, la vacunación redujo significativamente el esparcimiento de virus nasales a lo largo de los seis días sucesivos de esparcimiento viral pico y la viremia también se redujo significativamente durante el cuarto día de viremia pico dentro del período de estimulación.

No se observaron reacciones adversas inaceptables ya sea en los sitios de inyección o por manifestación de signos de enfermedad sistémica. La vacuna es segura y se tolera bien para administrar en especies susceptibles a rinitis equina A, en particular equidae. Este estudio demuestra así que 3 x 1 mL de inyecciones intramusculares de las composiciones ERAV del ejemplo redujo significativamente la gravedad y la duración de la enfermedad respiratoria causada por estimulación virulenta de ERAV.

Ejemplo 3 Este ejemplo ilustra estudios de secuenciación y análisis llevados a cabo en una cepa de virus de rinitis equina A tal como se describe en la presente.

Células y virus Se cultivaron células Riñon de conejo-13 (RK-13) (pasajes 100-160) en mezcla nutriente de medio Eagle modificado con Dulbbeco F12 HAM (DMEM F12) ( Sigma-Aldrich Canadá Ltd. Oakville, Ontario) con 2-5% de suero fetal congelaron a -70 °C . Los virus de cada tamaño de placa se propagaron en células RK-13 y se extrajo el ARN de placas pequeñas y grandes para secuenciación genómica de 5' UTR.

Cinética de crecimiento viral Para estudiar las características de crecimiento de esta cepa, se infectaron células RK-13 con ERAV/ON/05 y las muestras de sobrenadante se recolectaron en diversos momentos para titulación. Se cultivaron células RK-13 en placas redondas de 3 cm individuales y se infectaron con una confluencia del 90%. Las placas se incubaron a 37 °C y muestras de sobrenadante se extrajeron cada 4 horas a partir de 0 horas durante un período de 28 horas. Todas las muestras se titularon usando la técnica de unidad formadora de placa (PFU, por sus siglas en inglés) tal como se describió previamente aquí .

Inmunoflúoresceneia Células RK-13 se cultivaron en cámara/portaobjetos de cultivo celular de vidrio (Miles Scientific, Inc., Naperville, Illinois) y se inocularon con ERAV/ON/05. 28 horas después de la infección el medio de cultivo celular se removió y las células se fijaron en acetona. Los portaobjetos se mantuvieron a 4 °C hasta procesamiento. Se usaron sueros de caballos experimentalmente infectados como una fuente de anticuerpos ERAV.

Extracción de ARN y secuenciación Se extrajo ARN de monocapas de células infectadas. Las células se trataron con 1 mL de TRIzol (Invitrogen) 18-20 horas después de la infección y la extracción se llevó a cabo de conformidad con las recomendaciones del fabricante. Los pellets de ARN se eluyeron en 30 µL de agua libre de ARNAsa y se mantuvieron a -70 °C para un uso posterior. Se sintetizó cADN monocaternario usando Superscript II (Invitrogen) según las recomendaciones del fabricante. 50 de reacción PCR se llevó a cabo usando un grupo de cebadores con sentido y antisentido. Para la secuenciación genómica, se usó enfoque de caminata de cebadores y los cebadores se diseñaron en base a ocho secuencias ERAV disponibles en GenBank. Las condiciones de PCR eran: 4 minutos a 94 °C, seguido de 30 ciclos de 30 segundos a 94 C, 30 segundos a 55 °C y 30 segundos a 72 °C con una extensión final a 72 °C durante 10 minutos.

La secuenciación de los extremos 5' y 3' se completaron con los kits 5' RACE y 3' RACE (Invitrogen) tal como recomienda el fabricante. Se requirieron varias PCR anidadas para amplificar el extremo 5' UTR.

Análisis de secuencia La identificación preliminar de los virus se completó por secuenciación parcial de la proteína estructural VP1 usando cebadores diseñados en base otras secuencias disponibles en GenBank.

Tabla 13 : Cebadores usados para amplificar algunas de las regiones de ERAV.

Todos los cebadores se diseñaron en Gene Runner versión 3.05 (Hastings Software Inc.). Se realizaron reacciones de secuenciación en el Laboratory Services División en la Universidad de Guelf.

Todas las secuencias se reunieron y se editaron con EditSeq y SeqMan DNASTAR Lasergene 8 (DNASTAR Inc., Madison, I, Estados Unidos) . Los resultados de secuenciación se ingresaron en el software BLAST [National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD (NCBI)] y en comparación con similares entradas en GenBank. ClustalW2 [European Bioinformatics institute, Dublín, Irlanda (EBI)] se usó para una múltiple alineación de secuencias y construcción preliminar del árbol filogenético . El árbol filogenético final se creó en MEGA 4.0 usando el método de máxima probabilidad de compuesto y la conflabilidad se evaluó por bootstrapping con 1000 replicaciones . Se gráfico el análisis de las secuencias de nucleótidos en SimPlot Versión 3.5.1 (Baltimore, MD, Estados Unidos) . A fin de investigar la posibilidad de recombinación viral entre aislados de ERAV, completamos un análisis por Bootscan en SimPlot (Versión 3.5.1) comparando las secuencias genómicas de todos los ERAV informados disponibles en GenBank. Los sitios de clivaje de poliproteínas se pronosticaron en base a secuencias informadas en GenBank con número de accesos: DQ272578 y NC003982.

Resultados Caracterización inicial La proteína viral (VP1) del virus se amplificó, se secuenció parcialmente y en comparación con secuencias disponibles en GenBank (número de accesos: NC003982, DQ272577, DQ272128, DQ272127, DQ268580, DQ272578, L43052) . Los resultados de esta comparación inicial demostró un máximo de identidad del 95% con virus de rinitis equina A VP1.

Titulación viral El aislado de ERAV se propagó inicialmente en cultivo celular y se tituló por el método de unidad de formación de placas. El título de virus madre obtenido era 5X107 PFU en la titulación inicial . Los posteriores experimentos no mostraron cambios dramáticos en título viral después de 3 años de congelamiento inicial. Para experimentos animales, se empleó el virus madre con el título inicial.

CINÉTICA DE CRECIMIENTO Todas las muestras de sobrenadante se titularon usando la técnica PFU y los resultados se ingresaron en una hoja de datos para construir una curva de crecimiento. Tal como se ve en otros picornavirus , el aislado de Ontario mostró un mayor título alas 4 horas después de la infección, alcanzando una meseta a 12 horas después de la infección.

Inmunofluorescencia Las células RK-13 infectadas se visualizaron bajo microscopio de inmunofluorescencia . Se detectaron señales de fluorescencia verde fuerte en el citoplasma de células infectadas por ERAV en comparación con señales negativas en células infectadas simuladas.

Purificación de placas La secuenciacion de un fragmento de 426 nucleótidos en 5' UTR en placas pequeñas y grandes no mostró una diferencia entre los tamaños de placa en el nivel de nucleótido. Sin embargo, las características morfológicas eran evidentemente diferentes en cultivos de células RK-13.

Secuenciación genómica total La secuenciación genómica de aislado de ERAV resultó en 7839 nucleótidos de longitud con un contenido de GC de 47% incluyendo poli (A) tail. Cuatro repeticiones idénticas (CTGTAGCGTCAGTAAAACGC SEQ ID NO: 13) separadas por 18, 21 y 18 nucleótidos se identificaron en 5' UTR. El ERAV 5' UTR estaba compuesto por 940 nucleótidos con un contenido del 54% GC. Una única poliproteína con 6747 nucleótidos (2248 aminoácidos) compone el genoma viral con un contenido del 46,8% GC . La síntesis inicial proteica se detectó en nucleótido 940 con el codón de inicio AUG y el final en el nucleótido 7686 con el codón de detención UAA. De gran interés, una segunda secuencia AUG se identificó después del codón de inicio. Una posterior secuencia AUGAUG también identificó 58 nucleótidos corriente debajo del codón de inicio de poliproteína. El análisis con Blastx (NCBI) de la poliproteína en este aislado mostró una identidad del 96% de nucleótido con respecto a otro ERAV informada, sin embargo, cuando se aisló la secuencia genómica de longitud total del aislado Ontario y en comparación con otros usando Clustal 2 (EBI) y Blastx (NCBI) , sólo se observó una identidad máxima del 80 %. La composición de aminoácido mostró una proteína de organización idéntica (estructural y no estructural) y longitud a lo largo de todo el genoma. Estas comparaciones se realizaron con secuencias genómicas informadas én PERV-1 y PERV (número de accesos DQ272578 y NC003982) . 3' UTR estaba compuesto por 110 nucleótidos con un contenido del 24,3 % GC y un poli-A tail. Las alineaciones de 5' UTR de todos los ERAV disponibles demostraron un porcentaje de menor identidad, variando del 73% al 81%. De modo similar, 3' UTR se analizó por el mismo método y el porcentaje de identidad variaba del 75% al 81%. De forma interesante, se identificaron diversas inserciones (1-nucleótido, 2 -nucleótidos y 13 -nucleótidos ) y dos pequeñas supresiones ( 2 -nucleótidos y 3 -nucleótidos ) en 5' UTR (Fig. 4) . No se observaron mayores cambios a lo largo del genoma entero.

Análisis SimPlot de genoma El análisis SimPlot mostró una similitud comparable (porcentaje) entre todos los aislados de ERAV en comparación con ERAV/ON/05. Sin embargo, las mayores disparidades se identificaron en el nucleótido 1500 (59% de similitud) y nucleótido 4700 (65% de similitud) . Sin embargo, este análisis mostró que la similitud a lo largo del genoma era de entre 70% y 82%. Para seguir investigando la mayor divergencia en los genomas, se realizó un barrido (Bootscan) para identificar posibles sitios de recombinación. Estos análisis demostraron que el aislado Ontario no tenía sitios de recombinación pronosticados con otros aislados de ERAV. Sin embargo, cuando el aislado Ontario se eliminó del análisis, se podría haber efectuado una posible recombinación entre otros aislados de ERAV en el pasaje.

Comentario ERAV no se investigó de forma rutinaria y se recuperó de casos clínicos durante los brotes de enfermedades respiratorias en equinos. Por ello, el aislamiento de ERAV de casos clínicos fue incidental y en la mayoría de los casos, una estimulación. Por estas razones, la tasa de recuperación y secuenciación de estos virus puede ser pequeña.

Durante años anteriores, los virus de rinitis equina se clasificaron dentro de la familia Picornaviridae, pero no estaban claramente asignados a un género específico. En 1996, Li y colaboradores (Li F, Browning GF, Studdert MJ y Crabb BS . Equine rhinovirus 1 is more closely related to foot-and-mouth disease virus than to other picornaviruses . Proc Nati Acad Sci U S A. 1996 6; 93:990-995) demostraron que el ERAV estaba íntimamente relacionado con el virus de la enfermedad de patas y boca (FMDV, por sus siglas en inglés) en base a las características filogenéticas y secuenciación de nucleótidos. Aceptando sus hallazgos y otros (Wutz G, Auer H, Nowotny N, Grosse B, Skern T y Kuechler E. Equine rhinovirus serotypes 1 y 2: relationship to each other and to aphthoviruses and cardioviruses . J Gen Virol 1996, 77:1719-1730) , se halló que el aislado de ERAV está íntimamente relacionado con aislados L43052, DQ272578 y NC003982.

El aislado de ERAV/ON/05 dio como resultado 7839 nucleótidos que incluyen 5' UTR, la poliproteína, 3' UTR y poli-A tail. En comparación con los aislados de ERAV previamente mencionados, el ERAV/ON/05 es una de las secuencias de ERAV más completas hasta la fecha. La mayoría de las demás secuencias carecen de información proveniente de 5' UTR o son secuencias parciales de proteínas virales individuales. Los datos provenientes de 5' UTR revelaron la presencia de 3 repeticiones informadas previamente en otros ERAV y comúnmente hallados en FMDV. Se sugirió que estas repeticiones se puedan requerir en la formación de estructuras secundarias halladas en 5' UTR, el sitio de entrada interno ribosomal (IRES) . El análisis de identidad mostró que la poliproteína del aislado ERAV/ON/05 lleva una secuencia de nucleótidos altamente conservada. Como un virus de ARN, el ERAV tiende a constantes mutaciones debido a la falta de verificación por parte de la polimerasa. Esto puede indicar que, incluso a pesar de que este virus de ARN estaba en evolución natural y constante replicación no significativa, se han introducido cambios genómicos cuando se informó acerca de su primera secuencia genómica. Es evidente que las proteínas estructurales y no estructurales que son codificadas dentro de la poliproteína, representan las regiones más conservadas en el genoma.

De forma interesante, la tasa de replicación viral en cultivo celular era rápida y eficaz. Se detectó un ciclo completo de replicación viral en menos de 4 horas, alcanzando una meseta en 12 horas. Estas características son típicas de picornavirus y pueden reflejar la actividad viral in vivo. Estas características pueden explicar la gravedad y la velocidad de signos clínicos en algunas infecciones virales respiratorias en equinos. Tal como se observa en otros virus, tales como poliovirus y FMDV, la presencia de pequeñas supresiones y/o inserciones en 5'UTR se asoció a diferencias en el tamaño de placa en cultivo celular y virulencia in vivo. Hallamos que el aislado de ERAV/ON/05 genera diferentes tamaños de placa cuando se infecta con células RK-13. Para investigar y correlacionar la presencia de estas inserciones y supresiones en 5' UTR en el aislado ERAV/ON/05, secuenciamos esta región de virus purificados en placa de diferentes tamaños de placa y no hallamos discrepancias en el nivel de nucleótidos. Este hallazgo puede indicar que la diferencia de tamaño de placa puede deberse a una característica de crecimiento y replicación de células RK-13 y quizá no está asociado a la presencia o ausencia de las secuencias halladas en esta región.

Ejemplo 4 Este ejemplo muestra resultados de un estudio diseñado para desarrollar un modelo confiable de infección por ERAV para investigar las características clínicas de ERAV/ON/05.

Materiales y métodos En la primera fase se infectó un potro de poní con ERAV/ON/05 para -ajustar la dosis infecciosa y muéstrear las técnicas de recolección. Se diseñó un segundo estudio piloto para comparar animales infectados y de control y para manejar técnicas de muestreo. El estudio principal de infección se realizó en dos fases debido a la manipulación de animales y limitaciones en el tiempo de muestreo. Un año después de la primera infección, se seleccionaron cuatro ponis previamente infectados para un estudio de reinfección en base a su título a ERAV. Se seleccionaron los animales con un intermediario y un alto título de ERAV para ser reexpuestos a aislado Ontario.

Animales experimentales Se seleccionaron un total de 12 hembras de poni preñadas y sus potros se mantuvieron para una infección experimental por ERAV. Todas las hembras y potros se mantuvieron en un grupo separado del granero principal y se colocaron mediciones de bioseguridad en lugar para evitar una infección respiratoria viral. Se extrajeron muestras de sangre de todos los potros de forma regular y se controlaron los títulos de ERAV de forma periódica. Los potros se mantuvieron hasta los 12 meses de edad. Estos animales no se vacunaron contra ningún virus respiratorio durante este período y se mantuvieron prácticas generales para asegurar condiciones de vida saludable. Todos los animales se desparasitaron de conformidad con el protocolo de manejo de rebaños. Se realizó la socialización y el manejo de animales de forma regular.

Los ponis se capacitaron para un ensayo de la función pulmonar (PFT, por sus siglas en inglés) . Una vez acondicionados los animales para los experimentos, se transportaron en grupos a la unidad de aislamiento y se aclimataron durante al menos una semana antes de la infección viral .

Unidad de aislamiento Todos los ensayos de infección se realizaron en la unidad de aislamiento animal en el Departamento de Patobiología , en la Universidad de Guelf. Esta unidad de aislamiento contiene establos individuales que están equipados con temperatura controlada, humedad, corriente de aire y luz. El acceso a los establos estaba restringido a los investigadores y personal de cuidados.

Criterios de selección Todos los potros se manejaron con frecuencia y se controló el estado de salud periódicamente . Sobre la base del estado de salud y los parámetros serológicos, se seleccionaron los animales para incluir en estos experimentos. En este tiempo, todos los ponis quedaron seronegativos a los virus de rinitis equina A (ERAV) , virus de rinitis equina B (ERBV) , herpes virus de equinos 1 y 4 (EHVl/4) y virus de gripe equina 2 (AE2) . A pesar de que se detectaron de nacimiento títulos de anticuerpos AE2 , se observó un estado reducido durante los primeros 5 meses y no era detectable por ensayo de hemólisis radial individual (SRH) a los seis meses de edad. Para el ensayo experimental de infección por ERAV, se seleccionó un poni para usar. Posteriormente, otros dos ponis se seleccionaron para un segundo estudio piloto y se seleccionó un grupo de 8 ponis (cuatro infectados y cuatro controles) para el estudio de infección principales. Después de un año del primer ensayo de infección, se seleccionaron 4 ponis con títulos intermedios y altos de ERAV para un ensayo de reinfección.

Inoculo El aislado de ERAV (ERAV/ON/05) recuperado de un caballo durante un brote de enfermedad respiratoria equina viral en Ontario 2005 se propagó en células Rabbit kidney-13 (RK-13) y se almacenaron alícuotas a -70 °C para caracterización viral y experimentos de infección viral animal.

En breve, para la preparación del inoculo, el aislado se propagó en células RK-13. Se infectaron platos redondos de 30 mL con monocapas 90% confluentes con 500 \xh de ERAV/ON/05 y se incubaron en presencia de C02 (5%) a 37 °C durante 24-36 horas. Todos los platos se eliminaron de la incubadora y se congelaron/descongelaron cuatro veces para provocar la ruptura celular y la liberación viral de células intactas. Los sobrenadantes de todos los platos se reunieron en un recipiente y se centrifugaron a 6000 RPMS durante 15 minutos para clarificar y descartar los desechos celulares. El sobrenadante clarificado se alicuotó en viales de 10 mL para usar como un inoculo en experimentos de infección viral en animales. Además, se separaron pequeñas alícuotas de 1 mL y se mantuvieron para titulación viral. El virus se tituló usando el método de unidad formadora de placas (PFU) .

Modelo animal Se seleccionaron ponis como un modelo animal debido a la naturaleza del agente experimental (ERAV) , tamaño del animal, disponibilidad y manejo.

Protocolo de infecciones Los ponis de entre 8 y 12 meses de edad fueron seleccionados, entrenados y usados en los experimentos sobre infección. Debido a la gran cantidad de muestras que se deben tomar, estos experimentos se dividieron en cinco secciones (dos estudios piloto, dos experimentos de infección principales, y un experimento de re-infección). Durante los estudios piloto, se optimizó el equipo, la manipulación de los animales, la dosis de inoculo, la vía de administración y la recolección de muestras. El estudio de re-infección se realizó un año después del ensayo de infección inicial. Los ponis del grupo re- infectado fueron expuestos a la misma cepa viral en la misma dosis usada durante la primera infección. De este grupo sólo se realizó el examen clínico, la recolección de muestras de sangre para evaluaciones de títulos e hisopados nasofaríngeos para aislación de virus.

Máscara facial y nebulización Para la infección viral, se colocó una Equine AeroMask™ de tamaño pequeño con sello de goma en el extremo de las narinas . El tamaño se ajustó según la cabeza del poni , y las ventanas de respiración no fueron modificadas. La máscara se equipó con un conector inhalador y una válvula "T" de una vía para nebulización de virus. Se usaron copas nebulizadoras convencionales de 6 mi para administrar el inoculo. La nebulización se llevó a cabo usando un compresor PM14 (Precisión Medical Inc. Northampton, PA) con una velocidad de gas de 9 LPM (litros por minuto) . Esta velocidad de flujo y estas copas de administración permiten la administración consistente de partículas respirables de más o menos 5 micrones. Cada poni fue nebulizado durante 45 minutos (con un descanso de 5 minutos cada 15 minutos) con 15 mi (volumen total) de inoculo o placebo. Se realizó un hisopado nasofaríngeo por poni post- infección para asegurar la viabilidad del inoculo cuando era administrado. Los ponis que fueron re- infectados un año después fueron expuestos al virus según el mismo protocolo.

Examen clínico Todos los ponis fueron evaluados clínicamente de manera regular desde su nacimiento. Antes de los estudios piloto y de infección, todos los ponis fueron evaluados diariamente y durante los experimentos de ensayo dos veces por día durante los primeros 10 días y una vez por día desde el día 11 hasta el día 21 post-infección. El examen clínico incluyó: temperatura corporal (temp) (grados Celsius) , frecuencia cardíaca (hr) , frecuencia respiratoria (rr) , recambio capilar (ref ) , motilidad gastrointestinal (gi) , sonidos pulmonares (ls) , descarga nasal (nd) , descarga ocular (od) [presencia o ausencia y características] , ganglios linfáticos (ln) [tamaño y características], deambulación, y estado de salud general. El examen físico se realizó a aproximadamente la misma hora en cada poni todos los días, comenzando con los animales de control y pasando luego al grupo infectado. Se tardó aproximadamente 10 minutos en el examen de cada animal cada una de las veces, y todos los datos individuales fueron registrados en un formulario de chequeo diario.

Prueba de la función pulmonar (PFT) La PFT se llevó a cabo como describió previamente Haré y sus colaboradores (Haré JE, Viel L. Pulmonary eosinophilia associated with increased airway responsiveness in young racing horses. J" Vet Intern Med 1998 ; 12 (3 ): 163 -70) . La prueba se realizó en todos los ponis de control e infectados antes de la infección (día 0) y los días 1, 7, 14 y 21 postinfección. Brevemente, el día de la prueba, los ponis no fueron alimentados por la mañana y fueron levemente sedados como se describió previamente aquí para los procedimientos de endoscopía. Se usó una mascara facial de goma que se ajustara bien al hocico de los ponis. Se adosó un neumotacógrafo N° 4 (Gould Electronics, Biltholven, Holanda) a la máscara facial y se conectó a una serie de transductores que convierten el flujo y las señales de presión en bucles de respiración que son registrados en una computadora (Pulmonary Mechanics Analyzer, Buxco Electronics Inc, Sharon, CT, EE.UU.) . El flujo se midió a nivel del neumotacógrafo, y la presión pleural fue evaluada con un balón esofágico (de 10 cm de largo) que se colocó en el tórax medio a través de una vía esofágica. Se introdujo un volumen total de 3 mi de aire en el balón. La diferencia de presión entre la presión pleural y la presión atmosférica (medida a nivel de las narinas) se consideró la presión transpulmonar (????) .

Prueba de broncoprovocacion La prueba de broncoprovocacion se realizó como parte de la evaluación de PFT. Con el fin de determinar la hiperresponsividad de las vías aéreas luego de la infección ERAV/ON/05, los animales de control e infectados fueron expuestos a dosis crecientes de histamina (dosis doble) por nebulización con un compresor P 14 con un flujo de gas de 9 LPM (Precisión Medical Inc. Northampton, PA) . Los parámetros fisiológicos pulmonares fueron evaluados inicialmente administrando solución salina fisiológica al 0,9% (condición basal) , seguida por dosis crecientes de histamina. Luego de cada administración (2 minutos) , se registraton los datos durante 3 minutos y luego se analizó la fisiología respiratoria. Las dosis de histamina se iniciaron a razón de 0,5 mg/ml y aumentaron gradualmente hasta un máximo de 32 mg/ml. Se usó cumplimiento dinámico (Cdin) y ???? como parámetros para discontinuar la nebulización de histamina. Cuando Cdin disminuía en dos tercios o ???? se duplicaba durante la administración de histamina, se suspendía la nebulización. Luego se gráfico y se suspendió la dosis desencadenante de histamina. Todos los ponis fueron levemente sedados y físicamente restringidos durante estos procedimientos .

Técnicas de muéstreo Recolección de sangre Las muestras de sangre fueron extraídas de la vena yugular derecha o izquierda. Se extrajeron aproximadamente 10 mi de sangre con un tubo de parte superior roja (suero) de cada poni de conformidad con un programa para la recolección de muestras. Adicionalmente , también se recolectaron de 3 a 5 mi de sangre para el CBC (complete blood count, recuento completo de la sangre) y perfil. Todas las muestras fueron extraídas en horas de mañana, y fueron procesadas en el mismo día.

Las muestras de sangre para la separación del suero fueron mantenidas a temperatura ambiente durante por lo menos 30 minutos, y seguidamente se sometieron a centrifugación a 3,000 rpm en una centrifugadora de mesa. Se separó el suero dentro de las seis horas de haberse hecho la extracción, y se etiquetaron las alícuotas, congelándoselas a -70° C para su análisis ulterior (anticuerpos con respecto a ERAV, ERBV, AE2 , y EHVl/4) . Las muestras de sangre para CBC y perfil fueron procesadas en el mismo día.

Hisopado nasofaríngeo Se recolectaron hisopos nasofaríngeos para aislar el virus, en los días interiores al ensayo viral y en los días 0, 1, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17 y 21. Cada poní fui restringido con un cabestro (muzzle switch) , y se hizo pasar un trozo de algodón de 30 cm de longitud (Kalayjian Industries, Inc. Signal Hill, California) a través de sea la fosa nasal derecha o izquierda hasta que llegó a la faringe. Se llevó a cabo el algodonado haciendo rotar el algodón durante aproximadamente 5 a 10 segundos. Se retiró el algodón con cuidado, y las puntas fueron recortadas en una ampolleta que contenía 3 mi de VTM (virus transport médium, medio para el transporte de virus) . Las ampolletas que contenían los algodones fueron sacudidos y mantenidos sobre hielo hasta su procesamiento. Para liberar las partículas virales y las células fijadas a los algodones, se sometieron las ampolletas a un vórtice durante aproximadamente 20 segundos, y se transfirió el medio a un tubo de Eppendorf de aproximadamente 1,5 mL, y se congeló a -70 °C para análisis ulterior.

Recolección de muestras de orina y materia fecal Se intentó aislar el virus a partir de muestras de orina y de materia fecal antes y después de la infección con ERAV/ON/05. Se recolectó la orina en la mañana después de examen clínico y/o limpieza del establo sosteniendo una copa de recolección mientras los animales estaban orinando. Cuando no fue posible recolectar la muestra a mano, se colocó una bolsa de recolección de material plástico alrededor de los genitales del animal. Se retiró esta bolsa después de que el animal hubo orinado y se conservó una alícuota de 10 mL para la aislación del virus. Se recolectaron muestras fecales a mano del estiércol fresco situado sobre el piso del establo. Se recolectaron aproximadamente 5 mL de estiércol en una copa de recolección, y se añadieron 10 mi de solución salina estéril para disolver la muestra. Las muestras de orina y de materias fecales fueron conservadas sobre hielo hasta su procesamiento .

Endoscopia superior e inferior Se llevaron a cabo la broncoscopía y BAL como anteriormente descrito (Haré et al., 1998). Se hizo avanzar un endoscopio de fibra óptica, flexible y estéril, de 140 cm de longitud con un diámetro externo de 0.8 mm (Olympus, Corp., Tokyo, Japan) a través de la fosa nasal derecha o izquierda en la cavidad nasal, hasta nivel de faringe. En este punto se evaluó la conformación de las vías aéreas superiores. Se hizo avanzar el broncoscopio en la tráquea y se registró la presencia o ausencia de inflamación y/o de mucus y sus características. Se registran los datos sobre una planilla de evaluación diaria, y se registraron en video todas las endoscopías, para su análisis ulterior.

Biopsias de cepillado faríngeo y traqueal A efectos de evaluar la replicación viral en las vías aéreas superior e inferior, se tomó una biopsia de cepillo de la faringe, sección media de la tráquea, y de la quilla de los animales infectados y de control, en los días 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, y 21. Durante el examen endoscópico, se hizo avanzar un cepillo de citología de 200 cm (funda protectora) (Hobbs Medical Inc. Connecticut) a través del canal de biopsia en la ubicación predeterminada para la muestra, y se recolectó una muestra. Los cepillos fueron retraídos en su funda protectora, y retiradas del broncoscopio. Para remover el tejido muestreado del cepillo, se lo colocó en 600 ?? de VTM y se sometió a vértice durante 10 a 20 segundos. Todas las muestras fueron mantenidas sobre hielo y transportadas hacia el laboratorio para análisis ulterior (aislación del virus) .

BAL (Bronchoalveolar lavage, lavado bronquioalveolar) En pocas palabras, todos los ponis fueron suavemente sedados con Romifidina una vez redujo reflejo de la hoja, avanzar otro (0.04 mg/kg, IV) y se hizo avanzar un broncoscopio estéril de 0,8 mm de OD (Olympus, Corp., Tokyo, Japón) a través de la fosa nasal derecha o izquierda en la tráquea hasta nivel de la quilla. A medida que se hizo avanzar el broncoscopio, se administró una solución tibia de lidocaína al 0,2% a efectos de reducir la tos y la angustia (distress) . Una vez que se redujo el reflejo de la tos, se hizo avanzar el broncoscopio y se lo acuñó en un bronquio terminal proximal . Se administró un total de 250 mi de solución salina estéril tibia a través del canal de la biopsia, dividida en dos alícuotas. Se recuperó el fluido de BAL mediante succión manual para lo cual se utilizó una jeringa de 60 cm3 a través del canal de biopsia, y se colocó sobre hielo. Se filtró el fluido y se prepararon alícuotas para la inflación del virus, conteo de células y portaobjetos de citospina.

Cultivo de muestras clínicas Las muestras recolectadas fueron transportadas sobre hielo y congeladas al -70 °C para su inoculación posterior en cultivo de células.

Unas células RK-13 (pasajes 100-160) fueron cultivadas en una mezcla de nutrientes del medio modificado de Dulbecco F12 HAM (DMEM F12) (Sigma-Aldrich Canadá Ltd. Oakville, Ontario) con suero fetal de ternera a 2- 5 % (Sigma) . El cultivo de las células y la aislación fueron llevados a cabo en una incubadora de C02 (5%) a 37 °C. Se cultivaron 13 monocapas de células en placas de seis cavidades hasta una confluencia del 90%, y se las infectó con las muestras clínicas recolectadas del ensayo de infección. En pocas palabras, se retiró el 90% del medio de cultivo para cada una de las cavidades, y se añadieron 200 µ del espécimen, a la monocapa. Las placas fueron colocadas sobre una plataforma mecedora durante una hora, y se añadieron 3 mL de medio, después de transcurrido el tiempo. Las placas fueron incubadas y verificadas cada 24 horas para establecer los efectos cito patogénicos (CPE) . Si se detectó CPE, se retiró el material sobrenadante de la cavidad, y se congeló para su análisis ulterior. Los resultados para la aislación del virus fue registrada en una planilla. Se verifican las placas durante siete días si no se desarrolló el CPE, se intentó un segundo paso mediante la utilización de 200 µL de material sobrenadante del primer paso. Después de un segundo paso si no se detectó CPE, la muestra fue clasificada como negativo. Se recuperó el material sobrenadante de las muestras positivas y negativas para su confirmación por RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) .

Análisis estadístico Los resultados de la aislación del virus y todos los puntajes clínicos (Tabla 7) fueron ingresados en una planilla .

Tabla 14 . Sistema de puntaje para infección experimental RAV/ON05.

Signo clásico grado Puntaje Tos Ninguna 0 Intermitente 1 Frecuente 2 Membranas mucosas Rosado 0 Pálido 1 Auscultación Normal 0 gastrointestinal Anormal 1 Heces/Orina Normal 0 Anormal 1 Sonidos pulmonares Normal 0 Ligeramente incrementados 1 Marcado incremento a través 2 del techo Crepitaciones y estornudos 3 Descarga nasal Ninguna 0 Moderada/seroso serio 1 Mucopurulento 2 Descarga ocular Ninguna 0 Serosa 1 purulenta 2 Adenitis no palpable 0 palpable (<1 cm) 1 Agrandada (>1 cm) 2 Anorexia Ninguna 0 Templada a moderada 1 Severa 2 Temperamento Vivaz, alerta y responsivo 0 Indiferente (cabeza baja, 1 desinteresado ) Tiempo de perfusión Normal (2s) 0 3-4s 1 5s 2 Los resultados de aislación del virus fueron categorizados como positivos y negativos, y se comparan los resultados entre los grupos. Para determinar si había una diferencia estadística entre las ubicaciones sobre la aislación del virus (en el grupo infectado) , se utilizó una regresión logística condicional exacta para cada día y cada sitio. Se utilizó el mismo test para determinar si había una diferencia estadística entre grupos, en función del día de la aislación. Se le subieron los puntajes clínicos, y se analizaron los totales, y se los comparó entre los grupos.

Se empleó un modelo mixto generalizado lineal para analizar todos los parámetros clínicos. Los factores incluidos en el modelo fueron: poni, tratamiento, y tiempo, así como también sus interacciones. Ya que los animales fueron medidos a lo largo del tiempo, se utilizó el criterio de información (AIC, por sus siglas en inglés) de AKAIKE para determinar una estructura de errores para la autoregresión . Las suposiciones del ANOVA fueron evaluados mediante análisis residuales amplios. Se llevó a cabo una prueba de Shapro- ilk, una prueba de Kolmogorov-Smirnov, una prueba de Cramer-von Mises y una prueba de Anderson-Darling para evaluar la normalidad global. Los residuales fueron graficados en función de ios valores predichos y de variables explicativas (poni, tratamiento y tiempo) en busca de patrones que sugieran outliers, una varianza desigual u otros problemas. Si los análisis residuales sugirieron la necesidad de una transformación de los datos, o si los datos se presentaban en forma porcentual, se efectuaron análisis sobre una escala logit o log. Si la prueba f global era significativo, se aplicó una prueba de Dunnetts de retroceso en la línea de base dentro de una prueba de tratamiento o una prueba de tukey entre tratamientos y sitios en cada momento.

Se definió la respuesta serológica como un incremento del cuadruplo en los niveles de anticuerpo a partir de la línea de base (día 0) a cualquiera de los instantes de tiempo en la recolección de las muestras (días 7, 14 ó 21) .

Se llevaron a cabo análisis estadísticos en SAS 9.1.3 (SAS Institute Inc., 2004, Cary, NC) . La significancia estadística se ajustó en P < 0,05.

Resultados Se diseñó este estudio para reproducir de manera instante la enfermedad clínica de ERAV en ponis y para estudiar sus características in vivo Los estudios piloto demostraron que el ERAV/ON/05 nebulizado era capaz de causar una enfermedad respiratoria clínica en ponis sanos (edad: 10-12 mese) . Se indujo una inmunosupresión templada en todos los ponis excepto en los animales reinfectados efectos de simular condiciones naturales bajo acontecimientos estresantes (por ejemplo, movimiento para ventas, reubicación en el campo, programas de vacunación, etc.). Los resultados de estudio de infección principal confirmaron los resultados observados durante los estudios piloto. Los ponis en el grupo infectado (n=4) desarrollaron enfermedades respiratorias clínicas que consistieron en una mayor temperatura corporal, linfadenopatía, mayores sonidos pulmonares, más mucus traqueal, y mayor descarga nasal (Fig. 7-8) . Ninguno de estros signos significadamente extremo para requerir un cuidado adicional del animal ni un tratamiento de soporte. Ni la frecuencia respiratoria, ni la frecuencia cardiaca fueron significativamente diferentes entre los grupos. Ninguno de los signos clínicos desarrollados por el grupo infectado fue observado en los animales de control (n=4) , que permanecieron sanos a los largo de estas pruebas. El agente etiológico (E AV) fue solamente recuperado de ponis en el grupo infectado durante hasta siete días (Tabla 8) . Los ponis en el grupo reinfectado ((n=4) no desarrollaron signos respiratorios clínicos y permanecieron sanos a lo largo de los experimentos. El análisis estadístico de los datos reunidos durante estas pruebas demostró una diferencia significativa entre los animales infectados y de control.

Tabla 15. Síntesis de esparcido de virus de rinitis equina A (ERAV) . Resultados de aislamiento de virus de muestras recolectadas durante la infección experimental con ERAV/ON/05.

El virus se recuperó de una muestra clínica en cultivo celular (células RK-13) El virus no se recuperó de la muestra clínica lavaje broncoalveolar Ni depresión ni pérdida de apetito se registró en grupo alguno. Así como la hidratación, la micción, la defecación y los movimientos gastrointestinales quedaron sin cambio alguno en todos los grupos durante los ensayos de infección. No había diferencia entre animales reinfectados y de control en los puntajes clínicos y el ensayo de aislamiento de virus, dado que no se observó una enfermedad clínica en los animales reinfectados y el virus no se pudo recuperar de este grupo.

Hallazgos clínicos Todos los ponis se consideraron sanos antes de estos experimentos. La exposición de ERAV/ON/05 indujo enfermedad respiratoria clínica en animales infectados en comparación con controles y animales reinfectados . Los signos clínicos principales detectables por examinación física eran pirexia, descarga nasal y linfoadenopatía . La examinción endoscópica también reveló la presencia de grandes volúmenes de moco e hiperemia en la tráquea media y las vías aéreas inferiores de los animales infectados .

Temperatura rectal No se hallaron significativas diferencias en la temperatura rectal diaria entre los grupos antes de la exposición viral o a placebo. Se identificó un efecto de tratamiento significativo cuando los animales infectados se compararon con controles y animales reinfectados (p = 0,002) . Cuando la temperatura corporal de los tres grupos se comparó en distintos momentos, el grupo infectado era significativamente diferente en comparación con controles y animales reinfectados (p = 0, 028) . Se detectó una temperatura corporal mayor 24 horas después de la infección sólo en los animales infectados y era significativamente diferente del día 2,5 al día 6 cuando se compara con animales de control en los mismos puntos temporales (p = <0,005) . La temperatura corporal aumentó con picos el día 4 con una temperatura corporal media de 38,45 °C (SE = 0,15) (p = 0,001) y persistió durante dos días consecutivos más (Fig. 8) . No se halló una diferencia estadística cuando las temperaturas corporales de los grupos de control y reinfectado se compararon en diferentes momentos. Los animales en los grupos de control y reinfectado no tenían un cambio significativo en su temperatura corporal cuando se compararon con la línea de base en puntos individuales dentro de los grupos (días 1, 7, 14 y 21) .

Nodos linfáticos Se examinaron a diario nodos linfáticos submandibulares y retro aríngeos y se clasificaron como no palpables, palpables y agrandados. La palpabilidad o el agrandamiento de los nodos linfáticos sólo se registró en los animales infectados y reinfectados . En todos los ponis infectados, el área submandibular se volvió sensible a la palpación el día dos y en la mayoría de los casos persistió durante dos semanas. El tamaño de los nodos linfáticos submandibulares en los animales infectados variaba de 3 a 5 cm de longitud por 2 a 3 cm de espesor y el análisis de los puntajes totales demostraron una diferencia estadística entre los grupos (p = <,0001) (Fig. 7). De modo interesante, los nodos linfáticos retrofaríngeos no eran consistentemente palpables en todos los animales infectados, pero se registró un cambio significativo de tamaño en un poni . Esta linfoadenopatía no pareció interferir con el consumo de comida o de agua y la sensibilidad a la palpación se volvió menos pronunciada al progresar los días. Los nodos linfáticos submandibulares eran palpables en tres animales de los animales reinfectados con un tamaño promedio de menos de un cm de largo y 0,5 cm de espesor aproximadamente. Los animales de control no tenían cambios detectables de los nodos linfáticos en la palpación a lo largo de los experimentos de infección.

Frecuencia cardíaca y respiratoria La frecuencia respiratoria (R, por sus siglas en inglés R) y la frecuencia cardíaca (HR, por sus siglas en inglés) no eran significativamente diferentes entre los grupos de tratamiento (P = 0,1) en los puntos temporales. En general RR y HR estaban dentro de los parámetros fisiológicos normales y los pequeños cambios estaban sólo asociados con la manipulación y la recolección de la muestra. La mayor RR entre todos los grupos se identificó el día 0 y el promedio más bajo de todos los grupos se registró el día 21.

Examen endoscopico Al ser sometidos a un examen endoscopico, los animales infectados presentaron una cantidad incrementada de mucus traqueal detectable en el día uno, que persistió hasta el día 2. Ninguno de los animales, ni los de control ni los reinfectados , había tenido una secreción mucosa detectable en el examen endoscopico a lo largo de estos experimentos.

Las características del mucus variaron entre límpido y de tipo seroso en el día uno hasta los días 7- 21. Los parches de mucus estaban constantemente distribuidos desde la traquea superior hasta la bifurcación de la quilla. Se observó una hiperemia traqueal localizada en todos los animales infectados y en algunos animales de control, a lo largo de estos experimentos. La quilla en todos los animales infectados era roma y en algunos casos hiperémica, empezando en el día tres. La sensibilidad al examen endoscópico se incrementó de manera notable en el día siete sobre los animales infectados, y se observó una broncoconstricción durante el BAL. La descarga nasal variaba de templada a moderada en todos los ponis infectados, y no se hallaba presente en el control ni en los grupos reinfectados . Se observó una descarga nasal durante el examen clínico durante aproximadamente ocho días sólo en los animales infectados, empezando entre 36 y 48 horas después de la infección. Sin embargo, estas descargas no era una reflexión del mucus (características y volumen) observado durante el examen endoscópico. Se observó una descarga ocular templada de manera no constante en los animales infectados.

Serología Un total de 12 ponis (edad de 10 a 12 meses) fue infectado con ERAV/ON/05 o placebo mediante nebulización. Todos los ponis eran serológicamente negativos frente a ERAV, ERBV, AE2, y EHV1/4 y se hallaban en una condición saludable antes de los experimentos de infección. Después de la exposición a ERAV/ON/05 todos los animales infectados (100%) se seroconvertieron (incremento del cuádruple) a ERAV, determinado mediante el ensayo de neutralización del virus prueba (VN) (Fig. 9) . Se observó una interacción significativa al tratamiento por día, en los animales infectados (P = <0.000.1) . Se encontró una diferencia estadística entre los animales infectados y reinfectados en la línea de base y en el Día 7 (P = <0.001) . En el grupo reinfectado no se hallaron diferencias estadísticas cuando las titulaciones frente al ERAV en los días 7, 14, y 21 fueron comparadas hacia atrás con la línea de base.

Las titulaciones del anticuerpo contra ERAV fueron significativamente elevadas en los animales infectados desde el día 7 y en la mayoría de los casos hubo un pico en el día 14 que se mantuvo hasta el día 21 (P = <0,001) . En cambio, todos los animales de control siguieron siendo seronegativos a ERAV y no se identificaron cambios detectables mediante la prueba de VN. Los animales en todos los grupos no presentaron un incremento en los niveles de anticuerpo ni una conversión serológica frente a ninguno de los otros virus respiratorios (ERBV, AE2, y EHVl/4) durante estos experimentos (Fig. 9) . Los animales en el grupo reinfectado (n=4) no tuvieron una diferencia significativa en las titulaciones de anticuerpo con respecto a ERAV entre la línea de base y el día 21 post - infección . Sin embargo, se detectó un pequeño cambio en los niveles de anticuerpo con respecto a ERAV en 3 ponis un incremento del cuádruple en un poni del mismo grupo (Fig. 9) .

Aislamiento del virus Los algodonados nasofaríngeos, cepillado laríngeo, cepillado traqueal, BAL, muestras fecales y de orina fueron negativos en cuanto a la aislación del virus (virus respiratorios equinos) en todos los ponis antes de la infección (Tabla 8) . Los algodones obtenidos de la zona nasofaríngea de los animales infectados y de control después de haberse completado la extracción, fueron cultivados en células RK-13, y se recuperó del ERAV en ocasión del primer paso, de todos los animales infectados solamente. Los RT-PCR basados en cebadores que habían apuntado al gen VP1 confirmaron los diagnósticos positivos y negativos de ambos grupos.

En la Tabla 8 se han resumido los resultados de la aislación del virus de los ensayos de infección y reinfección. Se identificó una diferencia significativa entre los animales de control, infectados y re infectados , cuando se comparó la aislación del virus entre los grupos (P = < 0,05) . Se recuperó ERAV solamente de los animales en el grupo infectado en días específicos y en áreas específicas del tracto respiratorio (Tabla 8) . No se recuperó ningún otro virus de muestras recolectadas durante estos experimentos. Todos los ponis en el grupo de control fueron negativos frente a las pruebas de aislación del virus, a lo largo del estudio. Se detectó una interacción por día del tratamiento sobre los animales infectados recién en el 7, y persistió en los días 14 y 21 (P = < 0,05).

La ubicación para la recuperación del virus varió desde las vías aéreas inferiores en los días 1, 3, y 5 y las vías aéreas media y superior en los días 1, 3, 5, y 7. En el día uno, se aisló un ERAV de la faringe y quilla de todos los ponis en el grupo infectado y de la tráquea media y de 3 ponis del mismo grupo. Ninguna de las tentativas por recuperar el virus a partir de las heces en todos los grupos tuvo éxito. La aislación del virus a partir de orina y plasma pudo lograrse solamente en pocos ocasiones (Tabla 8) . La recuperación del virus diminuyó gradualmente desde el día 1 hasta el día 7 cuando se retiró el ERAV de manera constante de las muestras clínicas. La última recuperación viral estaba asociada con un incremento en la titulación de anticuerpo con respecto a ERAV y una disminución del puntaje de los signos clínicos (Figs. 7 y 9) .

Test de la función pulmonar (PFT) Se evaluó la hiperactividad de las vías aéreas sobre la base de la respuesta fisiológica y clínica frente a la provocación de histaraina. Los datos tomados de animales infectados y de control fueron graficados, y se calcularon las dosis de histamina disparadoras. Es interesante observar que los ponis de ambos grupos (infectados y de control) respondieron en el día 0 a una baja dosis de histamina (<6 mg de histamina) . En conjunto, las dosis de histamina disparadoras no fueron más allá de los 13 mg. La reacción clínica a la histamina (función de la dosis) se observó como hiperventilación asociada con elevación abdominal y dificultad para respirar. La reacción fisiológica se detectó en él PFT en forma de una caída del 35% del cumplimiento dinámico de los pulmones (Cdyn) o en una duplicación de la presión transpulmonar (????) cuando se comparó la administración de solución salinas y de histamina. Los ponis en el grupo infectado mostraron una pequeña reducción en la dosis disparadora de histamina desde el día 0 al día 1. Sin embargo, esto no fue significativamente diferente entre los grupos. Se detectó una diferencia significativa entre los animales infectados y de control en el día 21 (P = 0,02) .

Conteos diferenciales de células en el fluido BAL Se llevaron a cabo conteos diferenciales de células en los portaobjetos de citospina preparados a partir de alícuotas de fluido de BAL. No se hallaron diferencias significativas en los conteos de células entre caballos en los diferentes grupos de tratamiento antes del ensayo de infección. No se detectó ningún efecto en el tratamiento por día sobre los porcentaje de células macrofagas y epiteliales a lo largo de los experimentos. Se observó un incremento significativa en la cantidad de los neutrófilos en el día 7 post-infección en el grupo infectado (P = <0.05) . Estos números no fueron significativamente diferentes sobre los animales del control o reinfectados cuando se comparó la línea de base conocidas 7, 14, y 21. Los porcentajes medios de linfocitos, eosinófilos, y mastocitos disminuyeron de manera proporcional en el día 7 post-infección en los animales infectados, y se observó una diferencia estadística (p = <0.05). Se observaron comúnmente células epiteliales ciliadas en los portaobjetos tomados de animales infectados y de control; sin embargo, no se detectaron diferencias significativas, salvo en uno de los animales infectados que tenía un elevado conteo en el día 7. En general, se detectó una información supurativa no séptica con la presencia de células epiteliales y células gigantes esporádicas, en los ponis infectados. Es interesante observar que no se observaron cambios mayores en el examen citológico en las muestras tomadas de los animales reinfectados.

Este estudio demuestra que el ERAV/ON/05 indujo una enfermedad respiratoria clínica en los ponis infectados. La serología demostró que no había otros virus respiratorios presentes durante estos ensayos. La enfermedad se caracteriza por pirexia, descarga nasal, sonidos pulmonares incrementados, y mayor tamaño de los nodulos linfáticos submandibulares . Adicionalmente , se detectaron vía endoscópica grandes volúmenes de mucus en las vías aéreas inferiores, que persistieron hasta el día 21. Se aisló el virus de las vías aéreas inferior y superior hasta el día 7 lo que correspondió con la aparición de anticuerpos de ERAV detectables. Ninguno de los animales reinfectados desarrolló una enfermedad clínica, y solamente un poni de este grupo tuvo un incremento del cuádruple en las titulaciones de anticuerpo con respecto a ERAV. Los ponis con anticuerpos ERAV de existentes no desarrollaron una enfermedad clínica cuando sólo se expuso al virus .

Ejemplo 5 Este ejemplo ilustra una modalidad de una composición de virus de rinitis equina B de conformidad con la presente invención .

Materiales y métodos La cepa del virus de rinitis equina B 07-10342 (acceso a ATCC PTA-11829) se recuperó de cultivo celular de Riñon de conejo-13 (RK-13) de un hiposo nasal de un caballo en Ontario, Canadá. Se produjo 07 - 10342 inactivado según el procedimiento general descrito en el Ejemplo 1 para ERAV/ON/05.

Se prepararon las siguientes composiciones que contienen ERBV solo o en combinación con ERAV.

Tabla 16. Grupos de vacunas Ocho caballos de cada uno de los grupos de vacuna 1 , 2 y 3 se estimularon junto con ocho caballos de control con una dosis de estimulación 106,6 TCID50. El estado patológico es en base a los puntajes de descarga nasal y conjuntivitis tal como se indica en la Tabla 10. El efecto de la vacunación sobre la duración, la gravedad y la incidencia de la enfermedad se muestra en las Tablas 17-22.

Tabla 17. Puntaje del estado patológico El grupo vacunado mostró una reducción significativa (Tabla 18) en la duración de la descarga nasal no incluyendo en algunos casos ningún signo de enfermedad respiratoria suave .

Tabla 18. Cantidad de días con enfermedad respiratoria suave, moderada o severa La cantidad de días en que los animales estaban enfermos con signos clínicos de enfermedad respiratoria (puntaje nasal > 0) era significativamente más corta en el grupo vacunado que en el grupo de control.

Tabla 19. Efecto de la vacunación sobre la duración enfermedad •Significativamente menor que el grupo de control por el ensayo de Kruskal-Wallis (P<0,05) La inmunización con ERBV también redujo la gravedad de la enfermedad con un menor porcentaje de vacunados que los controles que demuestran signos clínicos de enfermedad respiratoria suaves y moderados a lo largo del estudio (Tabla 20) .

Tabla 20. Síntesis de la gravedad de la enfermedad en base al máximo puntaje respiratorio Se halló que la inmunización con ERBV reduce significativamente la incidencia de la enfermedad, en un 37,5%, 25% y 12,5% en grupos vacunados 1, 2 y 3 , respectivamente (Tablas 21 y 22) .

Tabla 21. Efecto de la vacunación sobre la incidencia de la enfermedad (estados patolóqicos suave y moderado se La vacunación también redujo la dispersión del virus de las fosas nasales que indica una menor enfermedad clínica en los caballos vacunados, así como demuestran la efectividad de la vacuna en la prevención de la difusión de la enfermedad infecciosa a otros caballos potencialmente susceptibles (Tabla 22) .

Tabla 22. Incidencia de virus positivos en el tiempo Resultados y discusión Se halló que las vacunas de ERBV inactivados son capaces de inmunizar a un animal a altos niveles de detección de anticuerpos. Las vacunas redujeron la duración, la gravedad y la incidencia de la enfermedad en animales inmunizados estimulados con ERBV. La vacunación también redujo la dispersión de virus infecciosos de caballos enfermos. No se observaron reacciones adversas inaceptables en los sitios de inyección o por manifestación de signos de enfermedad sistémica. Las vacunas son seguras y bien toleradas para administración en especies susceptibles a rinitis equina A, en particular equidae .

Ej emplo 6 Este ejemplo ilustra un modelo de conejillo de Indias para usar en un ensayo de potencia de liberación.

Se administraron Vacuna 5 (A/B-l) y Vacuna 6 (A/B-2) a conejillos de Indias (cinco conejillos de Indias por vacuna, 0,5 mL por vacuna intramuscular) . Se administró una vacuna de refuerzo tres semanas después. Después de 19 días, los conejillos de Indias se desangraron y la sangre se analizó usando ensayos de neutralización sérica para ERAV y ERBV.

Tabla 23. Vacuna 5 (A/B-l) en lotes con 108'0 A/107'5 B, con adyuvante HRA-5 Tabla 24. Vacuna 6 (A/B-2) en lotes con 108'0 A/107'5 B, con HRA-3 + adyuvante de aceite de semillas de algodón Ejemplo 7 Este ejemplo ilustra una evaluación de estimulación de virus de rinitis A después de la vacunación con una vacuna de virus muertos en 2 dosis de rinitis equina A/rinopneumonitis/gripe y protección contra infección respiratoria por rinitis equina A después de la vacunación con vacuna de virus muertos de rinitis A/rinopneumonitis/gripe.

Obj etivo El objetivo de este estudio de estimulación-vacunación consistía en demostrar la eficacia de rinitis equina A (N.° de acceso de ATCC PTA-11828) de vacunas de virus muertos de rinitis equina A/rinopneumonitis/gripe. La variable primaria de resultados usada para evaluar la eficacia de la vacunación era la reducción de la enfermedad respiratoria causada por virus de rinitis equina A.

Material y métodos La vacuna usada en este estudio es una vacuna de virus muerto de rinitis equina A/rinopneumonitis/gripe de la presente invención.

A. VIRUS DE RINITIS EQUINA A Se obtuvo la cepa original de virus de rinitis equina A (ERhA V) de la University of Guelf, Animal Health Laboratory, como número de aislado 04-54188 y se recibió el 9 de septiembre de 2008 bajo permiso de importación N.° 106930. El virus se pasó una vez en células E-Vero para producir un premaster stock de título alto y luego se diluyó con medio de cultivo celular para producir el Virus de Semilla Maestra (MSV, por sus siglas en inglés) . El MSV se denominó ERhA V (04-54188), MSV, Lote 091508A diluido, 24 de de septiembre de 08 y se aprobó para usar para Establishment 597 de USDA el 18 de junio de 2010.

El antígeno viral de rinitis equina A usado en vacunas evaluado en este estudio era un virus MSV+5 producido en el pasaje 20 de APHIS de células E-Vero aprobadas. Después del crecimiento, los fluidos virales se filtraron, se inactivaron de formalina y se concentraron de conformidad con Outline of Production for Product Code A522.20. Los fluidos virales inactivados se evaluaron en cuanto de los virus vivos residuales después de inactivación. Los resultados eran satis actorios. Los fluidos virales inactivados se usaron para formular la vacuna en un nivel de inclusión de antígenos de 107,5 TCID50/mL. 1. Lote combinado experimental de vacuna de rinitis 122110 El Lote combinado experimental de vacuna de rinitis 122110 se formuló en base a títulos de preinactivación .

La vacuna final formulada contenía los siguientes ingredientes por 1 mL de dosis: rinitis equina A 107,5 TCIDso/mL EHV-1 1070 TCID50 mL EHV-4 1065 TCID50/mL gripe A2/Ohio/03 107,0 TCID50/mL gripe A2/KY/95 107,0 TCID50 mL gripe A2/NewMarket/2/93 107,0 TCIDso mL Adyuvante ( VP Laboratories, S.O. #25) 100 µ?_ Diluyente, con MEM-E c. s.

Gentamicina, 30 pg/mL de volumen de diluyente Formaldehído, 0,1% de volumen de diluyente anfotericina B, 2,5 ug/mL B. Caballos experimentales 1. Descripción de caballos experimentales (40) caballos de seis a ocho meses de edad cruzados adquiridos de Steve Waagen, Bottineau, Dakota del Norte, se microcipearon después de llegar de Equine Resources, LLC, Butler, Mo. y se asignaron a IVP ( Investigational Veterinary Product) o Control Product (CP) sobre la base de un generador de números aleatorios después de controlarlos en cuanto a títulos de rinitis A de = 1:4.

Durante todo el estudio, los caballos se alojaron en un corral grande y único con comida común, bebederos y estantes de heno. Después de la estimulación, a cada animal se asignó un código de barras de 2 dígitos por personal de laboratorio que se fijó a una soga a lo largo del período después de la estimulación y se usó para identificar caballos cuando los signos clínicos y las muestras se extrajeron cada día. Durante cada día de observación, los caballos se dejaron en corrales y trabajaron aleatoriamente a través de tolvas individuales de restricción.

La Tabla 25 resume el diseño del estudio: Tabla 25: diseño del estudio 2. Vacunación / estimulación y programa de muestreo El 28 de enero de 2011 y el 18 de febrero de 2011, se administró vacuna experimental de rinitis lote combinado 122110 por vía intramuscular en un volumen de dosis de 1 mL a cada uno de 20 caballos (grupo vacunado, IVP). 20 caballos (grupo de control, CP) recibieron una dosis de 1 mL de MEM-E con adyuvante (producto experimental 005) con los excipientes usados en la vacuna de Lote 122110 (adyuvante, gentamicina, anfotericina B y formaldehído) pero ningún antígeno. Todos los caballos fueron estimulados por aerosolización intranasal de virus virulento de rinitis equina A en el Día de estudio 46 (25 días después de la vacunación de refuerzo) el 15 de marzo de 2011. La Tabla 26 muestra el programa de eventos.

Tabla 26: Programa de eventos: Inoculación intranasal de estimulación de caballos Virus de estimulación El virus de estimulación de rinitis equina A lote 112108a se produjo en cultivo tisular en células E-Vero. El título del virus de estimulación se determinó en 1 x 107'3 TCID50/mL el día de la estimulación. b. Método de estimulación intranasal Sedivet® (clorhidrato de romifidina) , un sedante y analgésico, se administró por vía intravenosa a cada • caballo antes de la estimulación en una dosis de 50 Ug/kg de peso corporal. El virus de estimulación se administró por vía intranasal como un aerosol producido por un nebulizador en una Equine AeroMask (Trudell Medical International, Ontario, Canadá) por medio del siguiente método: cuatro mililitros de 107'3 TCID50/mL de virus de estimulación se colocaron en el nebulizador en el AeroMask. Se fijó una manguera de presión desde un compresor de aire a un puerto de entrada del nebulizador. El tubo de salida se insertó luego a la AeroMask unida con la cabeza del caballo en estimulación y se aplicaron aproximadamente 10 psi de presión de aire a puerto de entrada durante tres minutos. Durante este tiempo, se nebulizaron aproximadamente dos mililitros de fluido de virus de estimulación directamente en las ventanas nasales del caballo en estimulación. El virus de estimulación se administró a caballos sin diluir, efectuando una cantidad de estimulación de 1 x 107'6 TCID50 en una dosis de 2 mL.

C. PARÁMETROS DE EVALUACIÓN ANTES Y DESPUÉS DE LA ESTIMULACIÓN 1. Evaluación del exudado nasal Todas las observaciones de exudado nasal se realizaron antes de colectar los hisopos nasofaríngeos. El día de la estimulación (D46) y 21 días después de la estimulación, se examinaron los pasajes nasales y los hocicos de cada uno de los 40 caballos vacunados y de control y se clasificaron usando la descripción de clasificación y puntaje enumerada más abajo.

Los puntajes 0 a 6 se asignaron sobre la base de la gravedad de la enfermedad indicada por cada una de las siguientes clasificaciones: 2. Descarga ocular La descarga ocular se evaluó a diario al momento de la evaluación del exudado nasal. Los puntajes de descarga ocular se registraron como 0 = normal; 1= descarga ocular suave a moderada y 2 descarga ocular severa. 3. Temperatura Las temperaturas rectales diarias se registraron para cada uno de los 40 caballos vacunados y de control el día de la estimulación y 21 días después de la estimulación por medio de una sonda con termómetro electrónico calibrado (GSA Electronics) . Las temperaturas rectales diarias se registraron en grados Fahrenheit (°F). 4. Aislamiento viral nasofaríngeo En cada día de ensayo de observación, se limpió en cada pasaje nasal de cada caballo vacunado y de control profundamente por medio de una lanza quirúrgica WECK-CEL® (Edward Weck and Company, Inc., Research Triangle Park, N.C. 27709) unida a una pipeta de plástico estéril de 11 pulgadas de largo. Al recolectar, cada una de las dos lanzas quirúrgicas se colocó de inmediato en un tubo individual con 4 mL de medio de transporte enfriado rápidamente (E-199 suplementado con gentamicina, L-glutamina, 2X Pen/estrep, 2X anfotericina B) .

Para aislar el virus, los tubos se mezclaron, los hisopos se eliminaron asépticamente y el medio se centrifugó a 1500 rpm durante 10 a 15 minutos para retirar los particulados. El medio se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 µ antes de la inoculación en células de cultivo tisular. Después de filtrar, se añadió 4-6% de solución estéril al 85% de sacarosa a cada muestra para congelar a -80 °C, a fin de que todas las muestras se ensayaran concurrentemente .

El día del ensayo, 1 mL del medio de transporte clarificado descongelado se usó para inocular una monocapa de 2 cm2 de dos días de edad de células E-Vero cultivadas en una placa de cultivo tisular de 24 cavidades de la que el medio de cultivo se había eliminado asépticamente. Después de la inoculación, el inoculo se dejó adsorber en la monocapa celular durante al menos una hora a 37 °C en una incubadora humectada que contenía 5% de atmósfera de C02. Después del período de adsorción, se añadió 1 mL adicional de medio de realimentación (E-199 con 2 mM de L-glutamina, Gentamicina 2X Pen-estrep y 2X anfotericina B) a cada cavidad. Después de la adición del medio de realimentación, las placas se incubaron luego a 37 °C en una incubadora de C02. Cada cavidad de cultivo celular de ensayo y de control se examinó microscópicamente durante 7 días en cuanto a signos de efecto citopático (CPE) típico de la estimulación viral de rinitis equina A. Las cavidades que eran negativas al final del período de observación de 7 días se subcultivaron en células frescas y se observaron durante otros 7 días .

Métodos de evaluación estadística Los caballos se clasificaron en un intervalo de estado de enfermedades respiratorias, sobre una base diaria. La clasificación del estado patológico incluía la combinación de las evaluaciones nasal y ocular. El algoritmo usad se detalla más abajo: La influencia de la vacunación sobre la duración de la enfermedad (cantidad de días con al menos enfermedad moderada) se evaluó usando la estimación de Hodges-Lehman (exacta) (procedimiento NPAR1WAY en SAS, SAS Institute, Cary NC) .

La gravedad de la enfermedad se evaluó comparando el estado patológico máximo entre los caballos vacunados y los caballos de placebo. La fracción mitigada y los intervalos de confianza 95% (CI, error estándar asimétrico) se calcularon (procedimiento FREQ en SAS) .

La temperatura rectal y los títulos de neutralización sérica se analizaron por análisis de mediciones repetidas apropiadas para datos continuos (títulos de temperatura y títulos SN log transformados; ANOVA) . Se asumió que los títulos SN eran de 0 si el título se informó como < 4 y 709 si el título se informó como > 709. Los títulos SN se transformaron en log antes del análisis. Los resultados de la capa leucocitaria e hisopo nasal de cada día se compararon usando la prueba exacta de Fisher.

Resultados Un caballo, #39 (grupo IVP) murió el Día 62 del estudio. Después de la necropsia en la Universidad de Missouri College of Veterinary Medicine, se realizó el diagnóstico de esofaguitis, gastritis y faringitis crónica-activa, difusa, severa necrotizantes y enfisematosa submucosa con colonias bacterianas intralesionales de coccobacilos y material vegetal, así como una pleuroneumonía pulmonar difusa severa fibrinosupurativa . La explicación más probable de esta muerte sugiere un desgarramiento mucosal previo, tales como una úlcera mucosa en el cardio estomacal que permitió la siembra del material vegetal en los tejidos conectivos asociados (informe patológico adjunto) .

A. DURACIÓN La distribución de la duración de la enfermedad (cantidad de días con enfermedad respiratoria moderada o severa) en días se resume en la Tabla 27. La cantidad media de días en el grupo placebo en que se observaron animales con enfermedad era 14. En el grupo vacunado, la cantidad media de días con enfermedad era 1. La duración de la enfermedad era significativamente menor en los animales vacunados en comparación con los controles (Tabla 28; P < 0,0001).

Tabla 27: Síntesis del efecto de vacunación en la duración de la enfermedad (cantidad de días con enfermedad respiratoria moderada o severa) Tabla 28: Efecto de la vacunación sobre la duración de la enfermedad (cantidad de días con enfermedad respiratoria moderada o severa) Gravedad La distribución de la gravedad de la enfermedad se resume en la Tabla 29. La gravedad de la enfermedad era significativamente menor en los caballos vacunados en comparación con los caballos de placebo (Tabla 30; fracción mitigada = 0,7550, 95% CI = 0,5518, 0,9582). Resultados individuales se proporcionan en la Tabla 31.

En la Tabla 31, los valores para el caballo #39 que murió el Día 62 del estudio se informaron como 0 del Día 62 a 67, pero en el análisis sólo se consideran valores > 1, no afectando por eso el resultado. La duración es 1 día para este caballo y el puntaje máximo es 3.

Tabla 29: Síntesis de la gravedad de la enfermedad en base al puntaje máximo de descarga nasal Tabla 30: Efecto de la vacunación sobre la gravedad enfermedad 'Significativamente menor que el grupo placebo por el ensayo de suma de intervalos de Wilcoxon (P < 0,05).

Tabla 31: Resultados de animales individuales (regiones sombreadas denotan duración de enfermedad moderada a severa. 5 15 Tabla 31 (Continuación) : Resultados de animales individuales (regiones sombreadas denotan duración de enfermedad moderada a severa.

B. TEMPERATURA RECTAL Los resultados del análisis estadístico se resumen en la Tabla 32. La vacuna por interacción diaria era estadísticamente significativa. Dentro de los días, se proporcionan análisis en la Tabla 33 (apéndice) . Los Días 3, 4 y 5, los caballos en el grupo vacunado tenían temperaturas estadística y signi icativamente inferiores q las del grupo de placebo. El Día 20, los caballos en el grupo vacunado tenía temperaturas significativamente mayores que las del grupo de placebo. Sin embargo, en todos los días ninguna diferencia entre los grupos de tratamiento fueron clínicamente significativas y sólo un caballo (#39) tenía una temperatura rectal de más de 102 °F (39°C) en el día del estudio de estimulación.

Tabla 32: Síntesis del efecto de la vacunación sobre la temperatura rectal y títulos de neutralización sérica 1. Títulos de neutralización sérica Los resultados de los análisis estadísticos se resumen en la Tabla 32. Los Días 46 y 53, los caballos en el grupo vacunado tenían títulos significativamente superiores a los del grupo de placebo. El día 67, los caballos en el grupo vacunado tenían títulos significativamente inferiores a los del grupo de placebo.

Discusión Este estudio se realizó para demostrar la eficacia del componente viral de rinitis equina A de una vacuna de virus inactivados de rinitis equina A en combinación con herpes virus equino inactivados de tipos 1 y 4 y virus de gripe equina. La vacunación se dio en un formato de dos dosis y la estimulación de virus virulentos de rinitis equina A se realizó 25 días después de la vacunación de refuerzo. Los caballos de control tratados con vacuna y placebo se evaluaron para investigar el efecto de la vacunación sobre la reducción de la gravedad y la duración de la enfermedad respiratoria clínica. Signos clínicos, hisopos nasales y capas leucocitarias se evaluaron a diario en cuanto a la evidencia de enfermedad de rinitis equina A y presencia de virus en los caballos estimulados.

Los resultados de este estudio de estimulación muestran una reducción estadísticamente significativa y clínicamente importante tanto de la gravedad como de la duración de la enfermedad respiratoria en vacunados después de la estimulación. Tal como se confirma por medio del análisis de fracción mitigada de puntajes de enfermedad respiratoria en caballos vacunados con IVP en comparación con caballos vacunados con el producto de control, se redujeron los signos moderados/severos de enfermedad respiratoria en el 75,5% (Intervalo de confianza 95% 96% al 55%) . La duración de la enfermedad moderada/severa también se redujo significativamente en 11 días en caballos vacunados en comparación con caballos de control (Intervalo de confianza 95% 14 días a 8 días más corta la enfermedad) . Además, la difusión de virus nasales reducidos significativamente a lo largo de 5 días sucesivos de dispersión viral pico y viremia también se había reducido significativamente durante los 4 días de viremia pico dentro del período de estimulación. De forma importante, el virus se recuperó de muestras de capa leucocitaria de caballos de control un total de 54 veces en 5 días de estudio en comparación con sólo 8 días en total de viremia en 4 días de estudio en caballos vacunados.

Conclusiones Los datos de este estudio demuestran claramente que 2 x 1 mL de dosis intramusculares de vacuna de virus muertos de rinitis equina A/rinopneumonitis/gripe (código de producto TBD, sin licencia) , administrados en intervalos de 21 días entre dosis a caballos, reducían significativamente la gravedad y la duración de la enfermedad respiratoria causada por estimulación virulenta de rinitis equina A.

Los resultados del estudio ilustran el uso de esta vacuna para la inmunización de caballos de seis meses de edad o más viejos contra enfermedad respiratoria causada por virus de rinitis equina A. Estos datos también establecen la vacuna de lote 122110 como una vacuna de referencia aceptable para ensayo de potencia de series posteriores de vacuna con virus muertos de rinitis equina A/rinopneumonitis/ gripe vacuna y vacuna de virus muertos de rinitis equina A (código de producto 1522.21, sin licencia).

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una composición inmunógena caracterizada porque comprende una o varias cepas de inactivados o vivos, atenuados el virus de rinitis equina A (ERAV) o virus de rinitis equina B (ERBV) , en donde la cepa de ERAV o la cepa de ERBV, antes de la inactivación o atenuación, causa una enfermedad respiratoria detectable en al menos el 50% de caballos seronegativos expuestos a la cepa, o crecidos en cultivo celular a 106 TCID50/mL o más, o cuando se usa como una vacuna en equinos en una dosis de 106 TCID50 o más da como resultado una titulación sérica de al menos 1:112.

2. Una composición inmunógena caracterizada porque comprende una cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene más del 95% de identidad con la SEQ ID NO : 2 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos con más del 95% de identidad con la SEQ ID NO: 3, en donde la cepa, antes de la inactivación o atenuación, se activa para infectar y replicarse en células huésped.

3. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 2 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

4. Una composición inmunógena caracterizada porque comprende una cepa de ERBV que comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene más del 95% de identidad con el transcrito inverso de la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene número de acceso ATCC PTA- 11829 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos con más del 95% de identidad con la poliproteína codificada por el genoma de la cepa de ERBV que tiene número de acceso ATCC PTA-11829, en donde la cepa ERBV, antes de la inactivación o atenuación, se activa para infectar y replicarse en células huésped.

5. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica que es la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene número de acceso ATCC PTA- 11829 o codifica una poliproteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la poliproteína codificada por el genoma de la cepa de ERBV que tiene número de acceso ATCC PTA-11829.

6. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la cepa de ERAV o ERBV está inactivada.

7. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la cepa de ERAV o ERBV es una cepa viva o atenuada .

8. La composición inmunógena de conformidad con las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque la cepa, antes de la inactivación o atenuación, causa una enfermedad respiratoria detectable en el 100% de caballos seronegativos después de la exposición a la cepa.

9. La composición inmunógena de conformidad con las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque la cepa, antes de la inactivación, crece en cultivo celular a al menos 108 TCID50/mL.

10. La composición inmunógena de conformidad con las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque la cepa da como resultado una titulación sérica de al menos 1:1000.

11. La composición inmunógena de conformidad con las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque una cepa de ERAV o ERBV es ERAV/ON/05 (número de acceso de ATCC PTA-11828) o cepa de ERBV 07-103042 (acceso a ATCC PTA-11829) .

12. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene más del 95% de identidad con la SEQ ID NO: 2 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos con más del 95% de identidad con la SEQ ID NO: 3, en donde la cepa de ERAV, antes de la inactivación o atenuación, se activa para infectar y replicarse en células huésped.

13. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la cepa de ERAV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 2 o codifica una poliproteína con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

14. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica cuyo transcrito inverso tiene más del 95% de identidad con el transcrito inverso de la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene número de acceso ATCC PTA-11829 o codifica una poliproteína que tiene la secuencia de aminoácidos con más del 95% de identidad con la poliproteína codificada por el genoma de la cepa de ERBV que tiene número de acceso ATCC PTA-11829, en donde la cepa de ERBV, antes de la inactivación o atenuación, se activa para infectar y replicarse en células huésped.

15. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la cepa de ERBV comprende una secuencia genómica que es la secuencia genómica de la cepa de ERBV que tiene número de acceso ATCC PTA-11829 o codifica una poliproteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la poliproteína codificada por el genoma de la cepa de ERBV que tiene número de acceso ATCC PTA-11829.

16. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende ERAV y ERBV, en donde la cepa de ERAV es ERAV/ON/05 y la cepa de ERBV tiene número de acceso de ATCC PTA-11829.

17. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada porque comprende al menos un antígeno o una cepa inactivada o viva, atenuada de herpes virus equino.

18. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el herpes virus equino está seleccionado del grupo que consiste en EHV-1 y EHV-4 y una combinación de ellos.

19. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el herpes virus equino está seleccionado del grupo que consiste en. EHV-1, EHV-4, cepas depositadas bajo los números de acceso ATCC PTA-9525 y PTA-9526 y una combinación de ellos.

20. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizada porque comprende al menos un antígeno de herpes virus equino.

21. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizada porque la composición inmunógena comprende al menos un antígeno o una cepa inactivada o viva, atenuada de virus de gripe equina.

22. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el virus de gripe equina está seleccionado del grupo que consiste en virus Clade 1, virus Clade 2, gripe A/Sudáfrica/2003 , gripe A/equino-2/Ohio/03 , gripe A/equino-2/New Market/2/93 , gripe A/equino-2/Kentucky/95 , gripe A/equino-2/Richmond/1/2007, cepas depositadas bajo los números de acceso ATCC PTA-9522, PTA-9523 y PTA-9524 y sus combinaciones.

23. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 22, caracterizada porque comprende al menos un antígeno de virus de gripe equina .

24. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizada porque la composición inmunógena comprende al menos un antígeno o una cepa inactivada o viva, atenuada de herpes virus equino y al menos un antígeno o una cepa inactivada o viva, atenuada de virus de gripe equina.

25. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el herpes virus equino es EHV-1 o EHV-4 o una combinación de ellos.

26. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizada porque la composición inmunógena también comprende al menos un antígeno de una o varias cepas seleccionados del grupo que consiste en virus del Nilo occidental, virus de encefalomielitis equina oriental, virus de encefalomielitis equina occidental, virus de encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico y sus combinaciones.

27. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizada porque la composición inmunógena comprende al menos una cepa inactivada o viva, atenuada seleccionados del grupo que consiste en virus del Nilo occidental, virus de encefalomielitis equina oriental, virus de encefalomielitis equina occidental, virus de encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico y sus combinaciones.

28. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizada porque la composición inmunógena comprende una o varias cepas inactivadas o vivas, atenuadas de encefalomielitis equina oriental, encefalomielitis equina occidental, virus de encefalomielitis equina venezolana y toxoide tetánico.

29. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizada porque la composición inmunógena comprende una o varias cepas inactivadas o vivas, atenuadas de virus de encefalomielitis equina oriental, virus de encefalomielitis equina occidental, virus de encefalomielitis equina venezolana, virus de gripe equina, herpes virus equino y toxoide tetánico.

30. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 27, caracterizada porque el virus del Nilo occidental es una de las cepas seleccionadas del grupo que consiste en Horse Origin 2005, depositado con el número de acceso ATCC PTA-9409; NAEE159, depósito en el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos aislado con el número de acceso 405330; NY2002Nassau; NY2002Clinton; NY2002Queens ; GA20021; GA20022; TX20021; TX20022; IN2002; NY2003Albany; NY2003Suffolk; NY2003Chatauqua; CO20031; CO20032; TX2003; TX2003Harris4 ; TX2003Harris6; TX2003Harris7 ; TX2003HarrislO ; AZ2004; y TX2004Harris4 ; y combinación de ellos.

31. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, caracterizada porque el virus de encefalomielitis equina occidental es la cepa depositada con el número de acceso ATCC PTA-9410.

32. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, caracterizada porque el virus de encefalomielitis equina venezolana es la cepa depositada con el número de acceso ATCC PTA-9411.

33. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, caracterizada porque el virus de encefalomielitis equina oriental es la cepa depositada con el número de acceso ATCC PTA-9412.

34. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 29, caracterizada porque el herpes virus equino está seleccionado del grupo que consiste en las cepas depositadas con los números de acceso ATCC PTA-9525 o PTA-9526 y sus combinaciones.

35. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, caracterizada porque cualquiera de las cepas están presentes en una cantidad de aproximadamente 102,0TCID5o/mL - 1010,0TCID50/mL por dosis .

36. La composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, caracterizada porque la composición inmunógena también comprende un portador farmacéuticamente apropiado.

37. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el portador farmacéutico apropiado está seleccionado del grupo que consiste en un diluyente, adyuvante, agente antimicrobiano, conservante, agente inactivante y sus combinaciones.

38. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el adyuvante es HRA- 5.

39. Un método para reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados o causados por ERAV o ERBV en un animal o un rebaño de animales, caracterizado porque comprende la etapa de administración de la composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38 a un animal que lo necesita.

40. Un método para reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados o causados por ERAV y/o ERBV y, uno o varios de los agentes patógenos seleccionados del grupo que consiste en virus del Nilo occidental, virus de encefalomielitis equina oriental, virus de encefalomielitis equina occidental, virus de encefalomielitis equina venezolana y Clostridium tetani en un animal o un rebaño de animales, caracterizado porque comprende la etapa de administración de la composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38 a un animal que lo necesita.

41. Un método para reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados o causados por ERAV y/o ERBV y, uno o varios de los agentes patógenos seleccionados del grupo que consiste en: virus de encefalomielitis equina oriental, virus de encefalomielitis equina occidental, virus de encefalomielitis equina venezolana, herpes virus equino y Clostridium tetani en un animal o un rebaño de animales, caracterizado porque comprende la etapa de administración de la composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38 a un animal que lo necesita.

42. Un método para reducir la incidencia o reducir la gravedad de síntomas clínicos asociados o causados por ERAV y/o ERBV y uno o varios de los agentes patógenos seleccionados del grupo que consiste en: virus del Nilo occidental, virus de encefalomielitis equina oriental, virus de encefalomielitis equina occidental, virus de encefalomielitis equina venezolana, herpes virus equino, virus de gripe equina y Clostridium tetani en un animal o un rebaño de animales, caracterizado porque comprende la etapa de administración de la composición inmunógena de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38 a un animal que lo necesita.

43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 42, caracterizado porque la incidencia de síntomas clínicos causados por uno o varios de els agentes patógenos en un rebaño de animales se reduce en comparación con un rebaño que no recibe la composición inmunógena.

44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 42, caracterizado porque la administración de al menos una dosis de la composición inmunógena proporciona una duración de inmunidad de al menos 12 meses contra uno o varios de els agentes patógenos.

45. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 44, caracterizado porque el animal es un caballo.

46. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 45, caracterizado porque cualquiera de las cepas están presentes en una cantidad de aproximadamente 102'°TCID5o/mL _ io10' °TCID50/mL por dosis.

47. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 46, caracterizado porque la composición inmunógena también comprende un portador farmacéuticamente apropiado :

48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el portador farmacéutico apropiado está seleccionado del grupo que consiste en un diluyente, adyuvante, agente antimicrobiano, conservante, agente inactivante y sus combinaciones.

49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el adyuvante es HRA-5.

50. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 49, caracterizado porque la composición inmunógena se administra en una o varias dosis.

51. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 50, caracterizado porque una dosis de la composición inmunógena se formula en una forma de dosis de 0 , 5 mL a 2,5 mL .

52. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 51, caracterizado porque la composición inmunógena es segura para usar en potros o caballos de 4 meses de edad o mayores.

53. Un método para producir una composición inmunógena que comprende una o varias cepas de ERAV inactivados o ERBV, caracterizado porque comprende: a) infectar una línea celular susceptible con ERAV o ERBV; b) cultivar la línea celular infectada en medio de crecimiento hasta obtener un efecto citopático (CPE) ; c) cosechar el medio; d) filtrar el medio para obtener un medio filtrado; y e) poner el medio filtrado en contacto con un agente inactivante para obtener el ERAV o ERBV inactivado.

54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque además comprende la adición de un adyuvante y uno o varios conservantes.

55. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque comprende infectar células con ERAV y ERBV.

56. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el ERAV es ERAV/ON/05 (número de acceso de ATCC PTA-11828) y el ERBV es cepa 07-103042C , número de acceso ATCC PTA-11829.

57. Una composición inmunógena caracterizado porque comprende ERAV/ON/05 y/o una cepa de ERBV que tiene número de acceso ATCC PTA-11829 y anfotericina B, sulfato de gentamicina, formaldehído y HRA-5.